WO2015093041A1 - 培養容器、リンパ球の培養方法、培養容器の製造方法、及び固相化装置 - Google Patents
培養容器、リンパ球の培養方法、培養容器の製造方法、及び固相化装置 Download PDFInfo
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Abstract
リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０～３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されていることを特徴とする培養容器。この培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、培養容器における固相化面が底面になるように培養容器を配置してリンパ球を活性化させ、次いで培養容器を反転し、培養容器における非固相化面が底面になるように培養容器を配置してリンパ球を増幅させる。また、このような蛋白質が固相化された培養容器は、培養容器に蛋白質の溶解している液滴を注入し、液滴を培養容器の内面上の一部又は全部に移動させて製造することができる。
Description
本発明は、細胞の培養技術に関し、特にリンパ球を培養するための培養容器、及びリンパ球の培養方法、蛋白質を固相化した培養容器の製造方法、及び固相化装置に関する。
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムからなる培養バッグに細胞と培養液を封入して、細胞を閉鎖系で大量培養することが行われている。
このような状況において、ガス透過性フィルムからなる培養バッグに細胞と培養液を封入して、細胞を閉鎖系で大量培養することが行われている。
ところで、リンパ球を増殖させるためには、最初にリンパ球を活性化させる必要がある。このため、抗ＣＤ３抗体が固相化された基材上でリンパ球を活性化し、その後に活性化したリンパ球を培養バッグに封入して増殖が行われていた。
このとき、一般に、図８に示すように、リンパ球の活性化のために抗ＣＤ３抗体が底面に固相化されたフラスコが用いられ、リンパ球が活性化された後に、培養バッグに移し替えて、リンパ球の培養が行われていた。その理由は、リンパ球は、増殖のために抗ＣＤ３抗体による刺激を必要とする一方で、抗ＣＤ３抗体による刺激を受け続けると増殖しにくくなるという性質を持っているからである。このため、リンパ球が活性化した後は、抗ＣＤ３抗体が固相化されていない容器で、培養を行う必要があった。
このとき、一般に、図８に示すように、リンパ球の活性化のために抗ＣＤ３抗体が底面に固相化されたフラスコが用いられ、リンパ球が活性化された後に、培養バッグに移し替えて、リンパ球の培養が行われていた。その理由は、リンパ球は、増殖のために抗ＣＤ３抗体による刺激を必要とする一方で、抗ＣＤ３抗体による刺激を受け続けると増殖しにくくなるという性質を持っているからである。このため、リンパ球が活性化した後は、抗ＣＤ３抗体が固相化されていない容器で、培養を行う必要があった。
リンパ球を活性化させるための培養容器としては、例えば特許文献１に記載の閉鎖系細胞培養容器などを挙げることができる。この閉鎖系細胞培養容器は、容器内の全面に抗ＣＤ３抗体が固相化されており（段落００４８，００５７）、リンパ球を効率的に活性化させることが可能になっている。
また、リンパ球の活性化は、上記の通り、一般的に抗ＣＤ３抗体を用いて行われる。すなわち、抗ＣＤ３抗体が固相化された容器内でリンパ球の活性化が行われ、その後、抗ＣＤ３抗体が固相化されていない培養バッグに、活性化したリンパ球を封入して、リンパ球の増殖が行われていた。
このため、リンパ球の活性化に先立って、リンパ球の活性化のために用いる容器内に、抗ＣＤ３抗体を固相化（コーティング）する必要があった。
このため、リンパ球の活性化に先立って、リンパ球の活性化のために用いる容器内に、抗ＣＤ３抗体を固相化（コーティング）する必要があった。
従来の固相化の方法としては、一般的に、フラスコ内の底面を、抗ＣＤ３抗体を含む溶液に浸して静置した後、その溶液を除去することにより、抗ＣＤ３抗体の固相化が行われていた。
具体的には、例えば特許文献２には、抗ＣＤ３抗体をフラスコ内の底面に均一に浸し、一晩冷蔵庫で保存後、抗ＣＤ３抗体を抜き取って、抗体固相化フラスコを調製することが記載されている（段落００３５～００３６，図１）。
また、特許文献１には、抗ＣＤ３抗体を溶解した溶解液を容器の収容部に封入し、所定時間静置することで、抗ＣＤ３抗体を容器のフィルム表面に固相化することが記載されている（段落００１５，図１）。
具体的には、例えば特許文献２には、抗ＣＤ３抗体をフラスコ内の底面に均一に浸し、一晩冷蔵庫で保存後、抗ＣＤ３抗体を抜き取って、抗体固相化フラスコを調製することが記載されている（段落００３５～００３６，図１）。
また、特許文献１には、抗ＣＤ３抗体を溶解した溶解液を容器の収容部に封入し、所定時間静置することで、抗ＣＤ３抗体を容器のフィルム表面に固相化することが記載されている（段落００１５，図１）。
しかしながら、特許文献１に記載の閉鎖系細胞培養容器のみを用いてリンパ球の培養を行う場合、リンパ球が活性化した後も抗ＣＤ３抗体による刺激を受け続けるため、リンパ球が過剰刺激を受けて増殖が抑制されてしまう。このため、リンパ球を大量に効率的に培養するためには、この閉鎖系細胞培養容器を活性化専用容器として用い、細胞の増殖は別個の培養容器で行うことが望ましい。
したがって、この従来の技術では、リンパ球を大量に効率的に培養する場合には、活性化された細胞の移し替えの煩雑性や、コンタミネーションのリスクが生じるという問題があった。
したがって、この従来の技術では、リンパ球を大量に効率的に培養する場合には、活性化された細胞の移し替えの煩雑性や、コンタミネーションのリスクが生じるという問題があった。
そこで、本発明者らは鋭意研究し、リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗ＣＤ３抗体を固相化し、固相化面と非固相化面とを備えたものを開発した。そして、固相化面が底面になるように培養容器を配置して、リンパ球の活性化を行い、その後、非固相化面が底面になるように培養容器を配置して、リンパ球の増殖を行うことにより、単一の容器内で、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことを可能とすることに成功した。
すなわち、本発明は、単一の培養容器により、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことが可能な培養容器、及びリンパ球の培養方法の提供を目的とする。
すなわち、本発明は、単一の培養容器により、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことが可能な培養容器、及びリンパ球の培養方法の提供を目的とする。
また、特許文献１，２に記載の従来の固相化方法では、抗体を十分に固相化させるのに、長い静止時間を要するという問題があった。
さらに、従来の方法では、大半の抗体が容器内に吸着せずに溶液中に残存するため、固相化量に比べて多量の抗体を使用しなければならないという問題があった。例えば、後述するように、従来の方法により抗体を封入した容器を１時間静止した場合、容器内に吸着する抗体は、１０％程度であり、残りの約９０％が、容器に固相化されることなく廃棄されてしまうという問題があった。
さらに、従来の方法では、大半の抗体が容器内に吸着せずに溶液中に残存するため、固相化量に比べて多量の抗体を使用しなければならないという問題があった。例えば、後述するように、従来の方法により抗体を封入した容器を１時間静止した場合、容器内に吸着する抗体は、１０％程度であり、残りの約９０％が、容器に固相化されることなく廃棄されてしまうという問題があった。
ここで、抗体などの蛋白質は熱に弱く、高温で吸着させるとその機能が失われるため、容器に固相化することが難しい材料である。一方、少量の蛋白質を用いて、短時間で必要量の固相化を実現することが望ましい。また、抗体は一般に高価であることから、無駄に廃棄される量を低減させることが望ましい。
そこで、本発明者らは鋭意研究し、容器内に蛋白質溶液の液滴を気体と共に封入し、この液滴を容器内面上で移動させることで、液滴の気液界面に集中する蛋白質分子が効率的に容器に吸着することを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、蛋白質を容器内面に固相化するにあたり、蛋白質溶液の液滴を、気体と共に容器内に封入し、該液滴を容器内面上で移動させることで、蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置の提供を目的とする。
すなわち、本発明は、蛋白質を容器内面に固相化するにあたり、蛋白質溶液の液滴を、気体と共に容器内に封入し、該液滴を容器内面上で移動させることで、蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置の提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、前記固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０～３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されている構成としてある。
また、本発明のリンパ球の培養方法は、前記培養容器を用いたリンパ球の培養方法であって、前記培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、前記培養容器における前記固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を活性化させる活性化工程と、前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる増殖工程とを有する方法としてある。
また、本発明の培養容器の製造方法は、蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入し、前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる方法としてある。
また、本発明の固相化装置は、蛋白質を培養容器の内面に固相化する固相化装置であって、蛋白質の溶解している液滴、及び、培養容器を載置する積載台と、積載台を動かして、培養容器内の液滴を、培養容器の内面上で移動させる駆動手段と、を備えた構成としてある。
また、本発明の固相化装置は、蛋白質を培養容器の内面に固相化する固相化装置であって、蛋白質の溶解している液滴、及び、培養容器を載置する積載台と、積載台を動かして、培養容器内の液滴を、培養容器の内面上で移動させる駆動手段と、を備えた構成としてある。
本発明によれば、単一の培養容器のみで、専用の培養装置等を用いることなくリンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことができる。このため、抗体によるリンパ球への過剰刺激を防ぐための移し替えの煩雑性、及びコンタミネーションのリスクを排除することが可能となる。また、本発明によれば、蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置を提供することが可能となる。
以下、本発明の培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施形態について、詳細に説明する。まず、本発明の培養容器の一実施形態について、図１を参照して説明する。同図には、培養容器を積載台（図示していない）に載置して上方から見た概略図、及び側面から見た概略図が示されている。
［培養容器］
図１に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体２０を固相化した固相化面１１（図１の容器内の底面）となっている。また、容器内面のもう一方が、抗体２０を固相化していない非固相化面１２（図１の容器内の上面）となっている。なお、培養容器１０には、チューブ１３が備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。同図の例ではチューブ１３は培養容器１０に１本備えられているが、２本以上備えられていても良い。
図１に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体２０を固相化した固相化面１１（図１の容器内の底面）となっている。また、容器内面のもう一方が、抗体２０を固相化していない非固相化面１２（図１の容器内の上面）となっている。なお、培養容器１０には、チューブ１３が備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。同図の例ではチューブ１３は培養容器１０に１本備えられているが、２本以上備えられていても良い。
培養容器１０は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて、袋状（バック型）に形成されている。このような培養容器１０の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
固相化面１１に固相化する抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体を用いることが好ましい。リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化され、増殖させることができる。
固相化面１１に固相化する抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体を用いることが好ましい。リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化され、増殖させることができる。
固相化面１１における抗体２０の固相化の濃度は、１０～３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０～４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
抗体２０の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。また、抗体２０の固相化の濃度を４０ｎｇ／ｃｍ２より大きくしても、リンパ球の増殖効率に大きな差異がなく、抗体を過剰に使用することにより容器のコストが増すためである。
抗体２０の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。また、抗体２０の固相化の濃度を４０ｎｇ／ｃｍ２より大きくしても、リンパ球の増殖効率に大きな差異がなく、抗体を過剰に使用することにより容器のコストが増すためである。
固相化面１１における抗ＣＤ３抗体の最密充填濃度は、３００ｎｇ／ｃｍ２であり、この濃度範囲までであれば、リンパ球を十分に活性化させて、その後にリンパ球を効率的に増殖させることができる。一方、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度が３００ｎｇ／ｃｍ２を超えると、培養容器１０内の培養液中に抗ＣＤ３抗体が浮遊して、リンパ球に過剰な刺激を与える場合があるため、好ましくない。
本実施形態の培養容器１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ状の培養容器１０を製造する。培養容器１０は、図１に示すように、チューブ１３を取り付けて製造される。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ状の培養容器１０を製造する。培養容器１０は、図１に示すように、チューブ１３を取り付けて製造される。
次に、培養容器１０を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、抗体２０を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養容器１０を揺動することなどによって、培養容器１０内の底面上で緩衝液の液滴を移動させ、緩衝液に含まれる抗体２０を、培養容器１０内の底面上に付着させる。これにより、培養容器１０内の底面のみに抗体２０を付着させて、固相化面１１を形成する。このとき、培養容器１０内の上面は、抗体２０が付着されていない非固相化面１２として形成される。
次に、本実施形態の培養容器１０の保管形態について説明する。
本実施形態の培養容器１０は、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態で保持して保管されることが好ましい。
すなわち、培養容器１０を、固相化面１１と非固相化面１２とが接触した形態で、１．６ｋｇの荷重下で、２時間、３７℃で保持した場合、図２に示すように、約２割の抗体２０が、固相化面１１から非固相化面１２へ裏移りした。このように非固相化面１２へ移動した抗体２０は、リンパ球の活性化の後、増殖を行う際に、リンパ球に過剰刺激を与えて増殖率を低下させる要因となり得る。したがって、固相化面１１から非固相化面１２への抗体２０の移動は、できるだけ抑制することが好ましい。
本実施形態の培養容器１０は、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態で保持して保管されることが好ましい。
すなわち、培養容器１０を、固相化面１１と非固相化面１２とが接触した形態で、１．６ｋｇの荷重下で、２時間、３７℃で保持した場合、図２に示すように、約２割の抗体２０が、固相化面１１から非固相化面１２へ裏移りした。このように非固相化面１２へ移動した抗体２０は、リンパ球の活性化の後、増殖を行う際に、リンパ球に過剰刺激を与えて増殖率を低下させる要因となり得る。したがって、固相化面１１から非固相化面１２への抗体２０の移動は、できるだけ抑制することが好ましい。
そこで、本実施形態の培養容器１０を保管するにあたっては、培養容器１０に所定量の気体を封入して、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態を保持させることが好ましい。
具体的には、封入する気体の量は、培養容器１０内の底面積１ｃｍ２当たり０．０１～４ｍｌとすることが好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、固相化面１１と非固相化面１２とが接触することを防止することが可能となる。
封入する気体としては、特に限定されないが、不活性ガスとすることが好ましく、空気や窒素ガス等を用いることができる。このような気体を、例えば気体供給装置により、チューブ１３を介して培養容器１０に注入することができる。
具体的には、封入する気体の量は、培養容器１０内の底面積１ｃｍ２当たり０．０１～４ｍｌとすることが好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、固相化面１１と非固相化面１２とが接触することを防止することが可能となる。
封入する気体としては、特に限定されないが、不活性ガスとすることが好ましく、空気や窒素ガス等を用いることができる。このような気体を、例えば気体供給装置により、チューブ１３を介して培養容器１０に注入することができる。
本実施形態の培養容器１０の具体的な保管形態としては、図３Ａに示すように、剛性のある外装容器６０により培養容器１０の形状を保持させることが好ましい。このような外装容器６０を用いて培養容器１０を保管する場合、少量の気体を培養容器１０に封入するだけで、培養容器１０を抗体２０の裏移りがないように保管することができる。
また、図３Ｂに示すように、培養容器１０を気体で膨満な状態にして梱包容器７０により保管することも好ましい。このようにすれば、複数個の培養容器１０を簡易に梱包して、抗体２０の裏移りがないように保管することができる。
また、図３Ｂに示すように、培養容器１０を気体で膨満な状態にして梱包容器７０により保管することも好ましい。このようにすれば、複数個の培養容器１０を簡易に梱包して、抗体２０の裏移りがないように保管することができる。
以上説明したように、本実施形態の培養容器１０は、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体２０が固相化され、固相化面１１と非固相化面１２とを備えたものとなっている。また、培養容器１０に封入されたリンパ球は、容器内の底部に集まる。
このため、リンパ球の活性化にあたっては、培養容器１０を固相化面１１が底面になるように用い、リンパ球の増殖にあたっては、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように用いることで、抗体２０によるリンパ球の過剰刺激を防止でき、単一の容器内で、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことができる。その結果、煩雑な移し替えや、コンタミネーションのリスクを排除することが可能となっている。また、活性化から増殖の工程の移行は、容器を反転するという単純な操作であるため、専用の装置等を用いることなく簡便に行うことが可能となっている。
また、本実施形態の培養容器１０に所定量の気体を封入して、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態を保持させることで、リンパ球への過剰刺激防止効果を低減させることなく、培養容器１０を保管することが可能となる。
このため、リンパ球の活性化にあたっては、培養容器１０を固相化面１１が底面になるように用い、リンパ球の増殖にあたっては、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように用いることで、抗体２０によるリンパ球の過剰刺激を防止でき、単一の容器内で、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことができる。その結果、煩雑な移し替えや、コンタミネーションのリスクを排除することが可能となっている。また、活性化から増殖の工程の移行は、容器を反転するという単純な操作であるため、専用の装置等を用いることなく簡便に行うことが可能となっている。
また、本実施形態の培養容器１０に所定量の気体を封入して、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態を保持させることで、リンパ球への過剰刺激防止効果を低減させることなく、培養容器１０を保管することが可能となる。
なお、従来のリンパ球の活性化に用いられるフラスコは、底面にのみ抗ＣＤ３抗体が固相化されており、これによって、リンパ球を活性化させることが可能になっている。しかしながら、フラスコは単一容器でリンパ球の活性化後の増殖工程に用いることはできない。その理由は、フラスコでは面積当たりの細胞数を適切な密度に維持できなくなるという問題があるためである。すなわち、リンパ球は活性化後に増殖するため、培養面積を拡大する必要がある。本実施形態であれば、例えば培養容器の一部をクリップ又はローラで仕切り、細胞の増殖に合わせてクリップ又はローラを移動又は除去すること等によって培養面積を拡大することは可能であるが、フラスコでは行えないため、フラスコは、リンパ球の活性化には用いられるものの、増殖には適さない。
［リンパ球の培養方法（第一実施形態）］
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第一実施形態について、図４を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、及び（２）増殖工程を有している。
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第一実施形態について、図４を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、及び（２）増殖工程を有している。
（１）活性化工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程は、培養容器１０にリンパ球３０及び培養液４０を封入し、固相化面１１が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を活性化させる工程である。
上述した通り、固相化面１１には、抗体２０が固相化されており、この抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体が好適に用いられる。
リンパ球３０の種類は、特に限定されず、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び単核球等を培養対象とすることができる。
培養液４０は、リンパ球３０の培養に一般的に用いられるものを使用することができ、例えばインターロイキン－２が添加された培養液などを好適に用いることができる。
この活性化工程において、培養容器１０内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体により、受容体分子のＣＤ３が刺激されて活性化される。
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程は、培養容器１０にリンパ球３０及び培養液４０を封入し、固相化面１１が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を活性化させる工程である。
上述した通り、固相化面１１には、抗体２０が固相化されており、この抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体が好適に用いられる。
リンパ球３０の種類は、特に限定されず、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び単核球等を培養対象とすることができる。
培養液４０は、リンパ球３０の培養に一般的に用いられるものを使用することができ、例えばインターロイキン－２が添加された培養液などを好適に用いることができる。
この活性化工程において、培養容器１０内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体により、受容体分子のＣＤ３が刺激されて活性化される。
（２）増殖工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における増殖工程は、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる工程である。
このように培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養容器１０内における非固相化面１２側で培養することが可能になる。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球３０が抗ＣＤ３抗体から過剰刺激を受けた場合に生じる増殖効率の低下を防止することが可能になっている。
本実施形態のリンパ球の培養方法における増殖工程は、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる工程である。
このように培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養容器１０内における非固相化面１２側で培養することが可能になる。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球３０が抗ＣＤ３抗体から過剰刺激を受けた場合に生じる増殖効率の低下を防止することが可能になっている。
［リンパ球の培養方法（第二実施形態）］
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第二実施形態について、図５を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、（２）第一増殖工程、（３）容積拡大工程、及び（４）第二増殖工程を有している。
すなわち、本実施形態のリンパ球の培養方法は、増殖工程の途中に容積拡大工程を有しており、これによって、リンパ球の増殖効率を第一実施形態に比較してさらに向上させることが可能となっている。そこで、本実施形態では、増殖工程を上記（２）～（４）の３つの工程に細分化して説明する。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第二実施形態について、図５を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、（２）第一増殖工程、（３）容積拡大工程、及び（４）第二増殖工程を有している。
すなわち、本実施形態のリンパ球の培養方法は、増殖工程の途中に容積拡大工程を有しており、これによって、リンパ球の増殖効率を第一実施形態に比較してさらに向上させることが可能となっている。そこで、本実施形態では、増殖工程を上記（２）～（４）の３つの工程に細分化して説明する。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
（１）活性化工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程では、まず培養容器１０を、仕切り部材５０を用いて仕切ることにより、培養部１０－１と、拡張可能部１０－２とに区分けする。
培養部１０－１は、リンパ球３０及び培養液４０を封入し、リンパ球３０の活性化を行う室である。
拡張可能部１０－２は、リンパ球３０及び培養液４０が封入されていない室であり、リンパ球３０の増殖に伴って培養部１０－１を拡張するための空間として用いられる。
培養部１０－１と拡張可能部１０－２の間を、リンパ球３０及び培養液４０は通過できない。
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程では、まず培養容器１０を、仕切り部材５０を用いて仕切ることにより、培養部１０－１と、拡張可能部１０－２とに区分けする。
培養部１０－１は、リンパ球３０及び培養液４０を封入し、リンパ球３０の活性化を行う室である。
拡張可能部１０－２は、リンパ球３０及び培養液４０が封入されていない室であり、リンパ球３０の増殖に伴って培養部１０－１を拡張するための空間として用いられる。
培養部１０－１と拡張可能部１０－２の間を、リンパ球３０及び培養液４０は通過できない。
ここで、一般に、細胞には、培養初期において一定以上の細胞密度がないと増殖しにくいという性質がある。このため、培養部１０－１の容積を、培養初期には小さく、その後に大きくなるように調整することが好ましい。
また、図５では、仕切り部材５０としてクリップを用いて培養容器１０を仕切り、後にこのクリップを外して、培養容器１０内の全体を培養部１０－１とする工程が示されているが、培養容器１０の仕切り方はこれに限定されない。例えば、仕切り部材５０としてローラを用い、培養部１０－１を連続的に変更可能にしてもよく、培養部１０－１を任意の大きさに複数回変更することも可能である。
また、図５では、仕切り部材５０としてクリップを用いて培養容器１０を仕切り、後にこのクリップを外して、培養容器１０内の全体を培養部１０－１とする工程が示されているが、培養容器１０の仕切り方はこれに限定されない。例えば、仕切り部材５０としてローラを用い、培養部１０－１を連続的に変更可能にしてもよく、培養部１０－１を任意の大きさに複数回変更することも可能である。
次に、培養容器１０における培養部１０－１にリンパ球３０と培養液４０を封入し、培養部１０－１における固相化面１１が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を活性化させる。
この活性化工程において、培養部１０－１内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体によって活性化される。
この活性化工程において、培養部１０－１内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体によって活性化される。
（２）第一増殖工程
次に、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる。
すなわち、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養部１０－１における非固相化面１２側で培養することが可能になり、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球を単一の容器内で効率的に増殖させることが可能になっている。
次に、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる。
すなわち、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養部１０－１における非固相化面１２側で培養することが可能になり、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球を単一の容器内で効率的に増殖させることが可能になっている。
（３）容積拡大工程
容積拡大工程は、仕切り部材５０を移動又は除去することにより、培養部１０－１の容積を拡張する工程である。
これによって、培養部１０－１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整することが可能になる。したがって、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることが可能となる。
容積拡大工程は、仕切り部材５０を移動又は除去することにより、培養部１０－１の容積を拡張する工程である。
これによって、培養部１０－１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整することが可能になる。したがって、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることが可能となる。
（４）第二増殖工程
第二増殖工程は、培養容器１０における培養部１０－１を拡張した状態で、リンパ球３０の培養を引き続き行う工程である。このとき、培養容器１０は、非固相化面１２が底面になるように配置されたままの状態である。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖でき、かつ培養部１０－１内におけるリンパ球３０の密度が高すぎることにより、リンパ球３０の増殖効率が低下することを、防止することが可能となる。
なお、仕切り部材５０として複数のクリップやローラを用い、（３）と（４）を複数回繰り返して、培養部１０－１の容積の拡大を段階的に行うことも可能である。
第二増殖工程は、培養容器１０における培養部１０－１を拡張した状態で、リンパ球３０の培養を引き続き行う工程である。このとき、培養容器１０は、非固相化面１２が底面になるように配置されたままの状態である。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖でき、かつ培養部１０－１内におけるリンパ球３０の密度が高すぎることにより、リンパ球３０の増殖効率が低下することを、防止することが可能となる。
なお、仕切り部材５０として複数のクリップやローラを用い、（３）と（４）を複数回繰り返して、培養部１０－１の容積の拡大を段階的に行うことも可能である。
以上説明したように、本発明の実施形態に係るリンパ球の培養方法によれば、本発明の実施形態に係る培養容器１０を用いて、固相化面１１が底面になるように配置してリンパ球３０の活性化を行い、その後、非固相化面１２が底面になるように配置してリンパ球３０の増殖を行うことができる。
このため、リンパ球３０が抗体２０によって過剰刺激を受けることを防止でき、単一の容器内で、リンパ球３０の活性化と増殖を効率的に行うことが可能となっている。
また、培養容器１０における培養部１０－１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整し、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることも可能である。
このため、リンパ球３０が抗体２０によって過剰刺激を受けることを防止でき、単一の容器内で、リンパ球３０の活性化と増殖を効率的に行うことが可能となっている。
また、培養容器１０における培養部１０－１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整し、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることも可能である。
次に、本発明の培養容器の製造方法、及び固相化装置の一実施形態について、詳細に説明する。
［培養容器の製造方法］
本実施形態の培養容器の製造方法は、蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、培養容器に、蛋白質の溶解している液滴（ドロップ）を注入し、液滴を、培養容器の内面上の一部又は全部に移動させることを特徴とする。
最初に、本実施形態の培養容器の製造方法における、培養容器の内面に蛋白質を効率的に固相化させることを可能にする原理について、図９を参照して説明する。
本実施形態の培養容器の製造方法は、蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、培養容器に、蛋白質の溶解している液滴（ドロップ）を注入し、液滴を、培養容器の内面上の一部又は全部に移動させることを特徴とする。
最初に、本実施形態の培養容器の製造方法における、培養容器の内面に蛋白質を効率的に固相化させることを可能にする原理について、図９を参照して説明する。
蛋白質の溶解している溶液を静置させると、蛋白質は、その溶液の気液界面に吸着するという性質を有している（BUNSEKI KAGAKU Vol.59,No.6.pp.437-445(2010)）。そこで、本実施形態の培養容器の製造方法では、蛋白質の溶解している液滴を基材上で移動させ、気液界面に集中する蛋白質分子を積極的に基材に接触させている。
このように、液滴を容器内で転がして、容器内において気液界面を移動させることで、気・液・材の境界線上で、蛋白質が基材に吸着する。蛋白質が基材に吸着すると、新たに生じた気液界面に、液滴中の蛋白質が吸着する。そして、液滴が容器内面上で移動すると、蛋白質濃度の高い気液界面と、容器内面との接触によって、蛋白質が高確率で容器内面に吸着する。
これによって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、蛋白質を容器内面に効率的に固相化することが可能になっている。
また、例えば容器の底面のみに蛋白質を固相化させる場合には、容器の上面への蛋白質の吸着による蛋白質のロスを防止することも可能となる。
このように、液滴を容器内で転がして、容器内において気液界面を移動させることで、気・液・材の境界線上で、蛋白質が基材に吸着する。蛋白質が基材に吸着すると、新たに生じた気液界面に、液滴中の蛋白質が吸着する。そして、液滴が容器内面上で移動すると、蛋白質濃度の高い気液界面と、容器内面との接触によって、蛋白質が高確率で容器内面に吸着する。
これによって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、蛋白質を容器内面に効率的に固相化することが可能になっている。
また、例えば容器の底面のみに蛋白質を固相化させる場合には、容器の上面への蛋白質の吸着による蛋白質のロスを防止することも可能となる。
本実施形態において、培養容器は、細胞培養において用いられる容器全般を意味し、細胞の活性化、及び／又は、細胞の増殖に用いられる容器を含む。
本実施形態における培養容器の形態は、特に限定されず、軟包材からなる袋状の培養バッグや、ガラスやポリスチレン製のフラスコなどを好適に用いることができる。
例えば、容器内面に対向する容器壁を有する培養バッグを好適に用いることができ、この培養バッグの内面の片方又は両方の面における一部又は全部に蛋白質を固相化させて、本実施形態における培養容器を製造することができる。
本実施形態における培養容器の形態は、特に限定されず、軟包材からなる袋状の培養バッグや、ガラスやポリスチレン製のフラスコなどを好適に用いることができる。
例えば、容器内面に対向する容器壁を有する培養バッグを好適に用いることができ、この培養バッグの内面の片方又は両方の面における一部又は全部に蛋白質を固相化させて、本実施形態における培養容器を製造することができる。
具体的には、図１０に示すように、培養バッグ１００における対向する内面の一方を、蛋白質２００を固相化した固相化面１１０（図１０の容器内底面）とし、培養バッグ内面のもう一方を、蛋白質２００を固相化していない非固相化面１２０（図１０の容器内上面）とすることができる。
なお、培養バッグ１００には、チューブ１３０が備えられ、このチューブ１３０を介して、培養バッグ１００内に蛋白質の溶解している液滴と気体を導入したり、あるいは除去したりすることができる。同図の例では、チューブ１３０は、培養バッグ１００に２本備えられているが、１本又は３本以上備えられていても良い。
なお、培養バッグ１００には、チューブ１３０が備えられ、このチューブ１３０を介して、培養バッグ１００内に蛋白質の溶解している液滴と気体を導入したり、あるいは除去したりすることができる。同図の例では、チューブ１３０は、培養バッグ１００に２本備えられているが、１本又は３本以上備えられていても良い。
また、培養バッグ１００は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて形成することが好ましい。このような培養バッグ１００の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
本実施形態において、培養バッグ１００に固相化する蛋白質２００としては、特に限定されず、例えば抗ＣＤ３抗体などの抗体や、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどの細胞接着性タンパクを用いることができる。抗ＣＤ３抗体は、リンパ球を活性化させるために好適に用いられる。また、細胞接着性タンパクは、培養基材上に接着性細胞を効率良く接着させるために好適に用いられる。
蛋白質２００として抗ＣＤ３抗体を固相化する場合、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度は、１０～３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましい。抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。一方、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度が３００ｎｇ／ｃｍ２を超えると、培養バッグ１００内の培養液中に抗ＣＤ３抗体が浮遊して、リンパ球に過剰な刺激を与える場合があるため、好ましくない。
蛋白質２００として抗ＣＤ３抗体を固相化する場合、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度は、１０～３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましい。抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。一方、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度が３００ｎｇ／ｃｍ２を超えると、培養バッグ１００内の培養液中に抗ＣＤ３抗体が浮遊して、リンパ球に過剰な刺激を与える場合があるため、好ましくない。
本実施形態における蛋白質を溶解させる液滴としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液を好適に用いることができる。
また、本実施形態における蛋白質の溶解している液滴の大きさ（液滴量）を、１ｃｃ～２０ｃｃとすることが好ましい。培養バッグ１００の内面を液滴が移動するときに、液滴と内面との間に摩擦力が働くため、液滴の大きさが小さすぎると、適切に移動できないためである。また、液滴が大きすぎると、液滴中の蛋白質濃度が低下し、また液滴の体積当たりの気液界面の面積が減少するため、吸着効率が低下する。このような観点から、液滴の大きさを、１ｃｃ～１０ｃｃとすることがより好ましく、１ｃｃ～５ｃｃとすることがさらに好ましく、２ｃｃ前後とすることが一層好ましい。
また、本実施形態における蛋白質の溶解している液滴の大きさ（液滴量）を、１ｃｃ～２０ｃｃとすることが好ましい。培養バッグ１００の内面を液滴が移動するときに、液滴と内面との間に摩擦力が働くため、液滴の大きさが小さすぎると、適切に移動できないためである。また、液滴が大きすぎると、液滴中の蛋白質濃度が低下し、また液滴の体積当たりの気液界面の面積が減少するため、吸着効率が低下する。このような観点から、液滴の大きさを、１ｃｃ～１０ｃｃとすることがより好ましく、１ｃｃ～５ｃｃとすることがさらに好ましく、２ｃｃ前後とすることが一層好ましい。
本実施形態において、培養バッグ１００に封入する気体としては、特に限定されないが、不活性ガスとすることが好ましく、空気や窒素ガス等を用いることができる。このような気体を、例えば気体供給装置により、チューブ１３０を介して培養バッグ１００に注入することができる。
また、培養バッグ１００に封入する気体の量は、培養バッグ１００内の底面積１ｃｍ２当たり０．１～４ｍｌとすることがより好ましく、１～３ｍｌとすることが一層好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、培養バッグ１００の内面における対向する容器壁が接触することを防止できるため、培養バッグ１００内で、蛋白質２００の溶解している液滴を、効率的に移動させることが可能である。
また、培養バッグ１００に封入する気体の量は、培養バッグ１００内の底面積１ｃｍ２当たり０．１～４ｍｌとすることがより好ましく、１～３ｍｌとすることが一層好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、培養バッグ１００の内面における対向する容器壁が接触することを防止できるため、培養バッグ１００内で、蛋白質２００の溶解している液滴を、効率的に移動させることが可能である。
培養バッグ１００は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから培養バッグ１００を製造する。培養バッグ１００は、図１０に示すように、チューブ１３０を取り付けて製造される。
次に、培養バッグ１００を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、蛋白質２００を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養バッグ１００を揺動することなどによって、培養バッグ１００内の底面上で緩衝液の液滴を移動させる。これにより、緩衝液に含まれる蛋白質２００を、培養バッグ１００内の底面上に付着させて、蛋白質２００が固相化された培養バッグ１００を得ることができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから培養バッグ１００を製造する。培養バッグ１００は、図１０に示すように、チューブ１３０を取り付けて製造される。
次に、培養バッグ１００を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、蛋白質２００を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養バッグ１００を揺動することなどによって、培養バッグ１００内の底面上で緩衝液の液滴を移動させる。これにより、緩衝液に含まれる蛋白質２００を、培養バッグ１００内の底面上に付着させて、蛋白質２００が固相化された培養バッグ１００を得ることができる。
［固相化装置］
次に、本実施形態の培養容器の製造方法において好適に用いることができる本実施形態の固相化装置、及びこの固相化装置において用いられる保持部材について、図１１～図１５を参照して説明する。図１１は、固相化装置の平面図を示し、図１２は、同正面図を示している。図１３は、固相化装置による固相化の様子を示している。図１４は、保持手段の正面図及び側面図を示し、図１５は、保持手段の使用形態を示している。
次に、本実施形態の培養容器の製造方法において好適に用いることができる本実施形態の固相化装置、及びこの固相化装置において用いられる保持部材について、図１１～図１５を参照して説明する。図１１は、固相化装置の平面図を示し、図１２は、同正面図を示している。図１３は、固相化装置による固相化の様子を示している。図１４は、保持手段の正面図及び側面図を示し、図１５は、保持手段の使用形態を示している。
図１１において、下側が固相化装置３００の正面側を、上側が固相化装置３００の背面側を、左側が固相化装置３００の左側を、右側が固相化装置３００の右側を、それぞれ示している。また、同図において、左右方向（後述する積載台の長手方向）をＸ軸方向、上下方向（同積載台の短手方向）をＹ軸方向としている。
固相化装置３００は、Ｘ軸方向移動用支持台３１０と、Ｙ軸方向移動用支持台３６０とを備えている。培養バッグ１００は、蛋白質の溶解している液滴、及び、所定量の気体を封入して、Ｙ軸方向移動用支持台３６０に載置される。これらＸ軸方向移動用支持台３１０とＹ軸方向移動用支持台３６０とは、一体的に運動する。以下、Ｘ軸方向移動用支持台３１０とＹ軸方向移動用支持台３６０とを総称して積載台と称する場合がある。
固相化装置３００は、Ｘ軸方向移動用支持台３１０と、Ｙ軸方向移動用支持台３６０とを備えている。培養バッグ１００は、蛋白質の溶解している液滴、及び、所定量の気体を封入して、Ｙ軸方向移動用支持台３６０に載置される。これらＸ軸方向移動用支持台３１０とＹ軸方向移動用支持台３６０とは、一体的に運動する。以下、Ｘ軸方向移動用支持台３１０とＹ軸方向移動用支持台３６０とを総称して積載台と称する場合がある。
Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、基台４００に固定されて立設する二つの支持柱３２０により、長手方向の中央において正面側及び背面側の両側で支持されている。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、Ｘ軸方向移動用ギアボックス３４０を介して、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３０（長手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＸ軸方向移動用サーボモータ３３０を駆動することで、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、Ｙ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、左右にいわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１００内を左端から右端まで左右に往復運動することができる。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、Ｘ軸方向移動用ギアボックス３４０を介して、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３０（長手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＸ軸方向移動用サーボモータ３３０を駆動することで、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、Ｙ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、Ｘ軸方向移動用支持台３１０は、左右にいわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１００内を左端から右端まで左右に往復運動することができる。
このとき、Ｘ軸方向移動用支持台３１０の回転運動の角度は、水平方向に対して、例えば－１０°～＋１０°の範囲とすることができる。なお、図１１，１２において、左側が高くなる場合をマイナス（－）、右側が高くなる場合をプラス（＋）とする。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１０の回転運動の速度は、培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴が、例えば５ｍ／分～１５ｍ／分の速度で、培養バッグ１００内を移動する速度とすることができる。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１０の回転運動の速度は、培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴が、例えば５ｍ／分～１５ｍ／分の速度で、培養バッグ１００内を移動する速度とすることができる。
Ｙ軸原点リミット検出センサ３５０は、Ｙ軸の原点及びリミットを検出するために用いられる。
Ｙ軸方向移動用支持台３６０は、Ｘ軸方向移動用支持台３１０の左右端部に立設する二つの支持部により、短手方向の中央において左側及び右側の両側で支持されている。
また、Ｙ軸方向移動用支持台３６０は、Ｙ軸方向移動用ギアボックス３８０を介して、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７０（短手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＹ軸方向移動用サーボモータ３７０を駆動することで、Ｙ軸方向移動用支持台３６０は、Ｘ軸方向移動用支持台３１０と共に、Ｘ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、積載台は、左右に（図１１では上下に）いわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１００内を下端から上端まで移動することができる。
また、Ｙ軸方向移動用支持台３６０は、Ｙ軸方向移動用ギアボックス３８０を介して、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７０（短手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＹ軸方向移動用サーボモータ３７０を駆動することで、Ｙ軸方向移動用支持台３６０は、Ｘ軸方向移動用支持台３１０と共に、Ｘ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、積載台は、左右に（図１１では上下に）いわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１００内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１００内を下端から上端まで移動することができる。
このとき、Ｙ軸方向移動用支持台３６０の回転運動の角度は、水平方向に対して、例えば－５０°～＋５０°の範囲とすることができる。なお、図１１において、正面側が高くなる場合をマイナス（－）、背面側が高くなる場合をプラス（＋）とする。
また、Ｙ軸方向への液滴の移動は、液滴の大きさ以下の距離ずつ行うことが望ましい。このように液滴をＹ軸方向に移動させ、かつＸ軸方向に培養バッグ１００内を左端から右端まで移動させることで、液滴を培養バッグ１００内の底面全体に移動でき、液滴に含まれる蛋白質を培養バッグ１００に効率的に吸着させることが可能となる。
また、Ｙ軸方向への液滴の移動は、液滴の大きさ以下の距離ずつ行うことが望ましい。このように液滴をＹ軸方向に移動させ、かつＸ軸方向に培養バッグ１００内を左端から右端まで移動させることで、液滴を培養バッグ１００内の底面全体に移動でき、液滴に含まれる蛋白質を培養バッグ１００に効率的に吸着させることが可能となる。
Ｘ軸原点リミット検出センサ３９０は、Ｘ軸の原点及びリミットを検出するために用いられる。
次に、本実施形態の固相化装置３００を用いた培養バッグ１００の製造方法について説明する。
まず、培養バッグ１００を積載台に載置して、所定量の空気を封入し、続いて蛋白質の溶解している液滴を注入する。次いで、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７０を駆動させて、図１３に示すように、積載台をＸ軸方向を中心軸として、正面側に回転移動させ、液滴を培養バッグ１００内の正面側端部に移動させる。
次に、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３０を駆動させて、積載台をＹ軸方向を中心軸として左右に回転運動させて、液滴を培養バッグ１００内において、左端及び右端間で左右に移動させる。
まず、培養バッグ１００を積載台に載置して、所定量の空気を封入し、続いて蛋白質の溶解している液滴を注入する。次いで、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７０を駆動させて、図１３に示すように、積載台をＸ軸方向を中心軸として、正面側に回転移動させ、液滴を培養バッグ１００内の正面側端部に移動させる。
次に、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３０を駆動させて、積載台をＹ軸方向を中心軸として左右に回転運動させて、液滴を培養バッグ１００内において、左端及び右端間で左右に移動させる。
次に、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７０を駆動させて、積載台を背面側にわずかに回転移動させて、液滴を背面側に向けて少し移動させ、次いで、再度Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３０を駆動させて、積載台を左右に回転運動させて、液滴を培養バッグ１００内において、左端及び右端間で左右に移動させる。以上の動作を、液滴が培養バッグ１００内の背面側端部に移動して、左端及び右端間で左右に移動するまで繰り返し行う。
このように、固相化装置３００を用いて、培養バッグ１００内に蛋白質を吸着させることによって、蛋白質の固相化の効率を一層高めることが可能となる。
なお、本実施形態の固相化装置３００は、培養バッグ１００のみならず、フラスコやその他の容器に蛋白質を固相化する場合にも好適に用いることが可能である。
なお、本実施形態の固相化装置３００は、培養バッグ１００のみならず、フラスコやその他の容器に蛋白質を固相化する場合にも好適に用いることが可能である。
次に、本実施形態の固相化装置において用いられる保持部材について説明する。
保持部材は、培養容器の底面が半円筒形状を形成するように培養容器を保持するための部材であり、積載台に固定され、又は、積載台と一体に形成される。
図１４に示すように、保持部材５００は、本体部５１０、上蓋部５２０、及び押圧部５３０を備えている。
本体部５１０は、培養バッグ１００を湾曲させて保持するための半円筒形状の凹部５１０－１を備えている。この凹部５１０－１を覆って上蓋部５２０が本体部５１０に取り付けられる。本体部５１０への上蓋部５２０の取り付け方法は特に限定されず、例えばネジ止めを行うことができる。
保持部材は、培養容器の底面が半円筒形状を形成するように培養容器を保持するための部材であり、積載台に固定され、又は、積載台と一体に形成される。
図１４に示すように、保持部材５００は、本体部５１０、上蓋部５２０、及び押圧部５３０を備えている。
本体部５１０は、培養バッグ１００を湾曲させて保持するための半円筒形状の凹部５１０－１を備えている。この凹部５１０－１を覆って上蓋部５２０が本体部５１０に取り付けられる。本体部５１０への上蓋部５２０の取り付け方法は特に限定されず、例えばネジ止めを行うことができる。
上蓋部５２０には、培養バッグ１００を外面から押圧するための押圧部５３０が取り付けられている。この押圧部５３０を下方に移動させることで、本体部５１０の凹部５１０－１に配置された培養バッグ１００を押圧し、培養バッグ１００の底面を半円筒形状に安定させることができる。
上蓋部５２０への押圧部５３０の取り付けは、押圧部５３０を下方に移動させて、培養バッグ１００を押圧できれば特に限定されないが、例えば上蓋部５２０と押圧部５３０とをネジ係合させて行うことができる。
上蓋部５２０への押圧部５３０の取り付けは、押圧部５３０を下方に移動させて、培養バッグ１００を押圧できれば特に限定されないが、例えば上蓋部５２０と押圧部５３０とをネジ係合させて行うことができる。
また、押圧部５３０の形状は、図１４に示すような棒状に限定されず、その他の形状にしてもよい。例えば、押圧部５３０の下方先端部を枝分かれさせたり、あるいは下方を曲面とする半球状にしたりすることにより、培養バッグ１００の底面を一層安定して半円筒形状に維持することも好ましい。
また、図１４では、上蓋部５２０に３個の押圧部５３０を取り付けた状態を示しているが、押圧部５３０の取り付け個数は特に限定されず、１，２個、又は４個以上であっても良い。
また、図１４では、上蓋部５２０に３個の押圧部５３０を取り付けた状態を示しているが、押圧部５３０の取り付け個数は特に限定されず、１，２個、又は４個以上であっても良い。
図１５は、保持部材５００の使用形態を示しており、保持部材５００に培養バッグ１００を保持させる様子を表している。
まず、保持部材５００の本体部５１０の凹部５１０－１に培養バッグ１００を配置する。このとき、培養バッグ１００の底面が、凹部５１０－１に沿って、曲面をなすように配置させる。
次に、本体部５１０に上蓋部５２０を取り付け、押圧部５３０を下方に移動させる。これによって、培養バッグ１００の底面を半円筒形状に維持することができる。
まず、保持部材５００の本体部５１０の凹部５１０－１に培養バッグ１００を配置する。このとき、培養バッグ１００の底面が、凹部５１０－１に沿って、曲面をなすように配置させる。
次に、本体部５１０に上蓋部５２０を取り付け、押圧部５３０を下方に移動させる。これによって、培養バッグ１００の底面を半円筒形状に維持することができる。
保持部材５００は、凹部５１０－１の半円筒形状の中心軸の方向が、積載台の長手方向と同じ方向になるように、固相化装置３００の積載台に固定して用いられる。また、保持部材５００を、このような位置関係で積載台と一体的に形成してもよい。
このような保持部材５００に、培養バッグ１００の底面を半円筒形状に維持して保持させ、培養バッグ１００内における液滴をＹ軸方向に移動させると、液滴は、常に保持部材５００における凹部５１０－１の最下部に位置するため、液滴のＹ軸方向の移動を精密に制御することが可能となる。
このような保持部材５００に、培養バッグ１００の底面を半円筒形状に維持して保持させ、培養バッグ１００内における液滴をＹ軸方向に移動させると、液滴は、常に保持部材５００における凹部５１０－１の最下部に位置するため、液滴のＹ軸方向の移動を精密に制御することが可能となる。
以上説明したように、本発明の培養容器の製造方法によれば、蛋白質を培養容器内面に効率的に固相化することができ、固相化に要する時間を短縮できると共に、培養容器への吸着率を向上でき、少量の蛋白質で必要量の固相化を行うことが可能となる。このため、固相化されずに廃棄される蛋白質量を低減することが可能となる。また、本実施形態の固相化装置を用いることで、蛋白質の固相化の効率をより一層高めることが可能である。さらに、保持部材を用いることで、液滴の移動をより精密に制御でき、蛋白質の固相化の効率をさらに一層高めることが可能となる。
以下、本発明の実施形態に係る培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施例及び比較例について、図６及び図７を参照して説明する。図６は、実施例及び比較例を表す模式図であり、図７は、実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。なお、図６は、実施例と比較例の相違を示すためものであり、培養部の容積の拡張は省略している。
［実験１：培養容器の製造］
（実施例１）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製し、このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
（実施例１）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製し、このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。このとき、リン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の片方（固相化面）のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成し、培養容器を製造した。
なお、この培養容器を２個製造して、一方を固相化濃度の測定に用い、他方をリンパ球の培養試験に供した。これは、その他の実施例及び比較例についても同様である。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成し、培養容器を製造した。
なお、この培養容器を２個製造して、一方を固相化濃度の測定に用い、他方をリンパ球の培養試験に供した。これは、その他の実施例及び比較例についても同様である。
固相化濃度の測定は、以下のように行った。
まず、培養容器内の液を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで吸着濃度を算出した。
まず、培養容器内の液を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで吸着濃度を算出した。
実施例１の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
実施例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、４０ｎｇ／ｃｍ２であった。
実施例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、４０ｎｇ／ｃｍ２であった。
（実施例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。その他については、実施例１と同様の処理を行って、実施例２の培養容器を製造した。
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。その他については、実施例１と同様の処理を行って、実施例２の培養容器を製造した。
実施例２の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
実施例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、１１ｎｇ／ｃｍ２であった。
実施例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、１１ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例１）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例１の培養容器を製造した。
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例１の培養容器を製造した。
比較例１の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
比較例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、容器内面の抗ＣＤ３抗体の濃度は、２５ｎｇ／ｃｍ２であった。
比較例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、容器内面の抗ＣＤ３抗体の濃度は、２５ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。このとき、リン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の片方（固相化面）のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成した。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例２の培養容器を製造した。
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。このとき、リン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の片方（固相化面）のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成した。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例２の培養容器を製造した。
比較例２の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
比較例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、８ｎｇ／ｃｍ２であった。
比較例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、８ｎｇ／ｃｍ２であった。
［実験２：リンパ球の培養］
（活性化工程）
実験１の実施例１，２及び比較例１，２により得られた培養容器を、クリップを用いて、それぞれ培養部が、５ｃｍ×１１ｃｍとなるように区切った。
次いで、ヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）５．８×１０４個を、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのALyS505N-7培地（株式会社細胞科学研究所製）に懸濁し、４ｍｌを培養容器に封入した。そして、そのまま３７℃で７５時間静置して、リンパ球の活性化工程を行った。
このとき、実施例１、２及び比較例２は、培養容器の固相化面を下にして行った。なお、比較例１の培養容器は、上記の通り、その内側の上下両面に同量の抗ＣＤ３抗体が固相化されており、上下の区別、すなわち、固相化面、非固相化面の区別はない。
（活性化工程）
実験１の実施例１，２及び比較例１，２により得られた培養容器を、クリップを用いて、それぞれ培養部が、５ｃｍ×１１ｃｍとなるように区切った。
次いで、ヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）５．８×１０４個を、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのALyS505N-7培地（株式会社細胞科学研究所製）に懸濁し、４ｍｌを培養容器に封入した。そして、そのまま３７℃で７５時間静置して、リンパ球の活性化工程を行った。
このとき、実施例１、２及び比較例２は、培養容器の固相化面を下にして行った。なお、比較例１の培養容器は、上記の通り、その内側の上下両面に同量の抗ＣＤ３抗体が固相化されており、上下の区別、すなわち、固相化面、非固相化面の区別はない。
（増殖工程）
活性化工程を完了した培養容器に、上記培地を４ｍｌ追加し、培養容器を上下反転して、そのまま３７℃で２６時間静置して、リンパ球の増殖を行った（第二実施形態における第一増殖工程）。
次に、クリップを外して、培養容器の培養部の容積を拡大し（第二実施形態における容積拡大工程）、上記培地を２０ｍｌ追加し、そのまま３７℃で６２時間静置して、リンパ球の増殖を引き続き行った（第二実施形態における第二増殖工程）。
培養開始からの上記各操作の時点（７５時間後、７５＋２６（＝１０１）時間後、７５＋２６＋６２（＝１６３）時間後）、及びクリップを外してから１８時間後（７５＋２６＋１８（＝１１９））に、各培養容器におけるリンパ球の数を計数した。その結果を図７に示す。
活性化工程を完了した培養容器に、上記培地を４ｍｌ追加し、培養容器を上下反転して、そのまま３７℃で２６時間静置して、リンパ球の増殖を行った（第二実施形態における第一増殖工程）。
次に、クリップを外して、培養容器の培養部の容積を拡大し（第二実施形態における容積拡大工程）、上記培地を２０ｍｌ追加し、そのまま３７℃で６２時間静置して、リンパ球の増殖を引き続き行った（第二実施形態における第二増殖工程）。
培養開始からの上記各操作の時点（７５時間後、７５＋２６（＝１０１）時間後、７５＋２６＋６２（＝１６３）時間後）、及びクリップを外してから１８時間後（７５＋２６＋１８（＝１１９））に、各培養容器におけるリンパ球の数を計数した。その結果を図７に示す。
図７に示すように、培養容器内の片面のみにそれぞれ４０ｎｇ／ｃｍ２、１１ｎｇ／ｃｍ２の抗ＣＤ３抗体を固相化した実施例１，２では、増殖工程において、リンパ球を顕著に増殖することが可能になっている。このとき、固相化濃度が４０ｎｇ／ｃｍ２の場合（実施例１）と１１ｎｇ／ｃｍ２の場合（実施例２）との間で、増殖効率に大きな差異は見られなかった。
一方、培養容器内の両面に抗ＣＤ３抗体を固相化した比較例１では、実施例１，２と比較して、増殖工程におけるリンパ球の増殖効率が大幅に低くなっていることがわかる。
また、固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度を、実施例２よりもわずかに減らした比較例２では、増殖工程においてリンパ球をほとんど増殖することができていない。このことから、培養容器の固相化面に固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度は、約１０ｎｇ／ｃｍ２以上にすることが好ましいことがわかる。
一方、培養容器内の両面に抗ＣＤ３抗体を固相化した比較例１では、実施例１，２と比較して、増殖工程におけるリンパ球の増殖効率が大幅に低くなっていることがわかる。
また、固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度を、実施例２よりもわずかに減らした比較例２では、増殖工程においてリンパ球をほとんど増殖することができていない。このことから、培養容器の固相化面に固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度は、約１０ｎｇ／ｃｍ２以上にすることが好ましいことがわかる。
次に、本発明の実施形態に係る培養容器の製造方法の実施例及び比較例について、図１６～図２１を参照して説明する。図１６，１８，２０は、実施例及び比較例を表す模式図であり、図１７，１９，２１は、実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
［実験３：抗体固相化培養バッグの製造］
（実施例３）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
（実施例３）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
次に、このバッグを積載台に載置して、空気約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。このとき、このリン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の底面のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上で移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上で移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
固相化濃度の測定は、以下のように行った。
まず、培養容器内の液滴を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで単位面積当たりの蛋白質吸着量（以下、吸着濃度という）を算出した。
まず、培養容器内の液滴を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで単位面積当たりの蛋白質吸着量（以下、吸着濃度という）を算出した。
実施例３の培養容器は、その内側の片面（底面）のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例３の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、４１．５ｎｇ／ｃｍ２であった。
（実施例４）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを２．５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させた。次いで、バッグを上下に反転させ、再度手作業によりバッグを２．５分間揺動して、上記液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面（上下反転前の上面）上を移動させた。これにより、バッグ内壁の両面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを２．５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させた。次いで、バッグを上下に反転させ、再度手作業によりバッグを２．５分間揺動して、上記液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面（上下反転前の上面）上を移動させた。これにより、バッグ内壁の両面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
実施例４の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例４の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、３１．２ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例３）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、このリン酸緩衝液をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、このリン酸緩衝液をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
比較例３の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。比較例３の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、２６．１ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例４）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。そして、手作業によりバッグを５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内を移動させて、バッグの内面に抗体を吸着させた。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。そして、手作業によりバッグを５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内を移動させて、バッグの内面に抗体を吸着させた。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
比較例４の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。比較例４の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、２３．８ｎｇ／ｃｍ２であった。
図１７に示すように、実施例３、実施例４、比較例３、及び比較例４の培養容器底面への面積当たりの抗体の吸着効率（吸着濃度×２２５ｃｍ２／５００００ｎｇ×１００）は、それぞれ１９％、１４％、１２％、１１％であった。
すなわち、実施例３の方法によれば、固相化時間が１分間であるにも拘わらず、固相化時間６０分間の比較例３の結果に比べて、６０％程度吸着効率が大きくなっている。
一方、培養容器に気体を封入することなく液滴を移動させて固相化を行った比較例４では、比較例３の結果に比べて、吸着効率が小さかった。
すなわち、実施例３の方法によれば、固相化時間が１分間であるにも拘わらず、固相化時間６０分間の比較例３の結果に比べて、６０％程度吸着効率が大きくなっている。
一方、培養容器に気体を封入することなく液滴を移動させて固相化を行った比較例４では、比較例３の結果に比べて、吸着効率が小さかった。
また、実施例４の吸着効率が、実施例３の吸着効率より小さいのは、実施例４の吸着面積が、実施例３の吸着面積に比べて、２倍になっているためと考えられる。
さらに、実施例４と比較例４の結果を比べると、培養容器に気体を入れた上で、液滴を移動させて固相化を行うことにより、吸着効率を３０％程度向上できていることが分かる。
このように、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来よりも短時間で、より多くの抗体を培養容器に固相化することが可能になっている。また、従来よりも少量の抗体を用いて、より多くの抗体を培養容器に固相化することも可能になっている。
さらに、実施例４と比較例４の結果を比べると、培養容器に気体を入れた上で、液滴を移動させて固相化を行うことにより、吸着効率を３０％程度向上できていることが分かる。
このように、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来よりも短時間で、より多くの抗体を培養容器に固相化することが可能になっている。また、従来よりも少量の抗体を用いて、より多くの抗体を培養容器に固相化することも可能になっている。
［実験４：抗体固相化フラスコの製造］
（実施例５）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。手作業によりフラスコを５分間２６℃の条件で揺動し、リン酸緩衝液の液滴を１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、フラスコ内の底面に抗体を吸着させ、抗体固相化フラスコを製造した。実施例５の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．９ｎｇ／ｃｍ２であった。
（実施例５）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。手作業によりフラスコを５分間２６℃の条件で揺動し、リン酸緩衝液の液滴を１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、フラスコ内の底面に抗体を吸着させ、抗体固相化フラスコを製造した。実施例５の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．９ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例５）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で６０分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例５の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で６０分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例５の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例６）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で５分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例６の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２１．８ｎｇ／ｃｍ２であった。
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で５分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例６の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２１．８ｎｇ／ｃｍ２であった。
図１９に示すように、実施例５、比較例５、及び比較例６のフラスコの面積当たりの抗体の吸着効率は、それぞれ１３％、１２％、１０％であった。
すなわち、比較例５に示されるように、従来の静置による抗体の固相化方法では、固相化時間６０分間で吸着効率が１２％であるのに対して、実施例５に示されるように、本実施形態の培養容器の製造方法では、固相化時間５分間で吸着効率を１３％にすることができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、フラスコに蛋白質を固相化する場合でも、従来法より短時間で同等量の蛋白質を固相化できることが明らかとなった。
すなわち、比較例５に示されるように、従来の静置による抗体の固相化方法では、固相化時間６０分間で吸着効率が１２％であるのに対して、実施例５に示されるように、本実施形態の培養容器の製造方法では、固相化時間５分間で吸着効率を１３％にすることができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、フラスコに蛋白質を固相化する場合でも、従来法より短時間で同等量の蛋白質を固相化できることが明らかとなった。
［実験５：フィブロネクチン固相化培養バッグの製造］
（実施例６）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
実施例６の培養容器は、その内側の片面（底面）のみにフィブロネクチンが固相化されている。実施例６の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、５３．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
（実施例６）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
実施例６の培養容器は、その内側の片面（底面）のみにフィブロネクチンが固相化されている。実施例６の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、５３．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
（比較例７）
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
比較例７の培養容器は、その内側の両面にフィブロネクチンが固相化されている。比較例７の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、３０．７ｎｇ／ｃｍ２であった。
実施例３と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
比較例７の培養容器は、その内側の両面にフィブロネクチンが固相化されている。比較例７の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、３０．７ｎｇ／ｃｍ２であった。
図２１に示すように、実施例６、及び比較例７の培養容器の面積当たりの抗体の吸着効率は、それぞれ２４％、１４％であった。
すなわち、蛋白質としてフィブロネクチンを用いた場合、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来法よりも７０％以上の吸着効率で、フィブロネクチンを培養容器に固相化することができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、抗体以外の蛋白質でも短時間で効率良く培養容器に固相化できることが明らかとなった。
すなわち、蛋白質としてフィブロネクチンを用いた場合、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来法よりも７０％以上の吸着効率で、フィブロネクチンを培養容器に固相化することができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、抗体以外の蛋白質でも短時間で効率良く培養容器に固相化できることが明らかとなった。
［実験６：固相化装置を用いた抗体固相化培養バッグの製造］
（実施例７）
実施例３と同様にして、８ｃｍ×２０ｃｍ（約１６０ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグを固相化装置における保持部材に載置して、押圧部を用いて、底面が半円筒状になるように固定した。次いで、空気を約２８０ｍｌ封入すると共に、１０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、図１３に示すように、固相化装置における積載台を、Ｙ軸方向に－５０°傾けて（Ｘ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴を培養バッグ内の端部に寄せ、次いで積載台をＸ軸方向に－１０°～１０°の範囲で回転させて（Ｙ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴をＸ軸方向に移動させ、培養バッグ内の左端から右端まで左右に往復移動させた。
（実施例７）
実施例３と同様にして、８ｃｍ×２０ｃｍ（約１６０ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグを固相化装置における保持部材に載置して、押圧部を用いて、底面が半円筒状になるように固定した。次いで、空気を約２８０ｍｌ封入すると共に、１０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、図１３に示すように、固相化装置における積載台を、Ｙ軸方向に－５０°傾けて（Ｘ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴を培養バッグ内の端部に寄せ、次いで積載台をＸ軸方向に－１０°～１０°の範囲で回転させて（Ｙ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴をＸ軸方向に移動させ、培養バッグ内の左端から右端まで左右に往復移動させた。
次に、積載台をＹ軸方向に１０°回転させて液滴を背面側に少し移動させ、次いで積載台を再度Ｘ軸方向に－１０°～１０°の範囲で回転させて、液滴をＸ軸方向に移動させ、培養バッグ内の左端から右端まで左右に往復移動させた。
以上の動作を、Ｙ軸方向の回転角（Ｘ軸回転角）が５０°になるまで繰り返し、培養バッグの底面全体に液滴を移動させた。これを１サイクルとして、４サイクル行い（固相化時間３．５分、温度２６℃）、固相化量を測定した。
以上の動作を、Ｙ軸方向の回転角（Ｘ軸回転角）が５０°になるまで繰り返し、培養バッグの底面全体に液滴を移動させた。これを１サイクルとして、４サイクル行い（固相化時間３．５分、温度２６℃）、固相化量を測定した。
実施例７の培養容器は、その内側の片面（底面）のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例７の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、３０．１ｎｇ／ｃｍ２であった。
したがって、実施例７の培養容器の面積当たりの抗体の吸着効率（吸着濃度×１６０ｃｍ２／１００００ｎｇ×１００）は、４８％であった。これは、比較例３の培養容器の同吸着効率１２％に比べて、４倍となっている。
このように、本実施形態の固相化装置を用いて培養容器を製造することにより、短時間で、従来では実現できないレベルの高い吸着効率を示す培養容器を得られることが明らかとなった。
このように、本実施形態の固相化装置を用いて培養容器を製造することにより、短時間で、従来では実現できないレベルの高い吸着効率を示す培養容器を得られることが明らかとなった。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、培地、及び蛋白質の種類等を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、培地、及び蛋白質の種類等を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
本発明は、単一の培養容器を用いることによって、活性化された細胞の移し替えの煩雑性や、コンタミネーションのリスクを排除しつつ、リンパ球を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。また、本発明は、蛋白質が内面に固相化された培養容器を、短時間で効率的に製造するために、好適に利用することが可能である。
１０ 培養容器
１１ 固相化面
１２ 非固相化面
１３ チューブ
２０ 抗体
３０ リンパ球
４０ 培養液
５０ 仕切り部材
６０ 外装容器
７０ 梱包容器
１００ 培養バッグ
１１０ 固相化面
１２０ 非固相化面
１３０ チューブ
２００ 蛋白質
３００ 固相化装置
３１０ Ｘ軸方向移動用支持台
３２０ 支持柱
３３０ Ｘ軸方向移動用サーボモータ
３４０ Ｘ軸方向移動用ギアボックス
３５０ Ｙ軸原点リミット検出センサ
３６０ Ｙ軸方向移動用支持台
３７０ Ｙ軸方向移動用サーボモータ
３８０ Ｙ軸方向移動用ギアボックス
３９０ Ｘ軸原点リミット検出センサ
４００ 基台
５００ 保持部材
５１０ 本体部
５１０－１ 凹部
５２０ 上蓋部
５３０ 押圧部
１１ 固相化面
１２ 非固相化面
１３ チューブ
２０ 抗体
３０ リンパ球
４０ 培養液
５０ 仕切り部材
６０ 外装容器
７０ 梱包容器
１００ 培養バッグ
１１０ 固相化面
１２０ 非固相化面
１３０ チューブ
２００ 蛋白質
３００ 固相化装置
３１０ Ｘ軸方向移動用支持台
３２０ 支持柱
３３０ Ｘ軸方向移動用サーボモータ
３４０ Ｘ軸方向移動用ギアボックス
３５０ Ｙ軸原点リミット検出センサ
３６０ Ｙ軸方向移動用支持台
３７０ Ｙ軸方向移動用サーボモータ
３８０ Ｙ軸方向移動用ギアボックス
３９０ Ｘ軸原点リミット検出センサ
４００ 基台
５００ 保持部材
５１０ 本体部
５１０－１ 凹部
５２０ 上蓋部
５３０ 押圧部
Claims (17)
- リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、前記固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０～３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されていることを特徴とする培養容器。
- 前記固相化面と前記非固相化面とが接触しない形態で保持されていることを特徴とする請求項１の培養容器。
- 容器内底面積１ｃｍ２当たり０．０１～４ｍｌの気体が封入されていることを特徴とする請求項２の培養容器。
- 請求項１～３のいずれかに記載の培養容器を用いたリンパ球の培養方法であって、
前記培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、前記培養容器における前記固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を活性化させる活性化工程と、
前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる増殖工程と、を有する
ことを特徴とするリンパ球の培養方法。 - 前記活性化工程において、前記培養容器を仕切り部材により仕切ることで、前記培養容器内に培養部を形成し、この培養部にリンパ球及び培養液を封入し、
前記増殖工程として、
前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる第一の増殖工程と、
前記仕切り部材を移動又は除去して前記培養部の容積を拡張する容積拡張工程と、
前記培養部の容積を拡張した後に、リンパ球を増幅させる第二の増殖工程と、を有する
ことを特徴とする請求項４に記載のリンパ球の培養方法。 - 蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、
前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入し、
前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる
ことを特徴とする培養容器の製造方法。 - 軟包材から形成された前記培養容器に、気体を封入する工程と、
気体が封入された前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入する工程と、
前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる工程と、を有する
ことを特徴とする請求項６記載の培養容器の製造方法。 - 前記液滴を移動させる領域が、前記培養容器の内面における対向する容器壁の片方のみであることを特徴とする請求項６又は７記載の培養容器の製造方法。
- 前記気体を、前記培養容器内の底面積１ｃｍ２当たり０．１～４ｍｌの範囲で、前記培養容器に封入することを特徴とする請求項６～８のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記蛋白質が、抗体又は細胞接着性タンパクであることを特徴とする請求項６～９のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記抗体が抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする請求項１０記載の培養容器の製造方法。
- 前記細胞接着性タンパクがフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の培養容器の製造方法。
- 蛋白質を培養容器の内面に固相化する固相化装置であって、
前記蛋白質の溶解している液滴、及び、培養容器を載置する積載台と、
前記積載台を動かして、前記培養容器内の前記液滴を、前記培養容器の内面上で移動させる駆動手段と、を備えたことを特徴とする固相化装置。 - 前記駆動手段として、
前記積載台を、短手方向を中心軸として回転運動させ、前記液滴を、前記培養容器の内面上で、長手方向に移動させる長手方向移動用駆動手段と、
前記積載台を、長手方向を中心軸として回転運動させ、前記液滴を、前記培養容器の内面上で、短手方向に移動させる短手方向移動用駆動手段と、を備えた
ことを特徴とする請求項１３記載の固相化装置。 - 前記培養容器の底面が半円筒形状を形成するように前記培養容器を保持するための、半円筒形状の凹部を有する保持部材を備え、前記保持部材が、前記積載台に固定され、又は、前記積載台と一体に形成されたことを特徴とする請求項１３又は１４記載の固相化装置。
- 前記保持部材の半円筒形状の中心軸の方向が、前記積載台の長手方向と同じ方向になるように、前記保持部材が前記積載台に固定され、又は、前記保持部材が前記積載台と一体に形成されたことを特徴とする請求項１５記載の固相化装置。
- 前記保持部材が、前記培養容器の底面が半円筒形状を形成するように前記培養容器を押圧するための押圧部を備えたことを特徴とする請求項１５又は１６記載の固相化装置。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016042741A1 (ja) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養システムにおける送液方法、及び細胞培養システム |
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6692593B1 (ja) * | 2018-10-17 | 2020-05-13 | 株式会社マンダム | 皮脂腺の観察方法およびその利用 |
| TWI822534B (zh) * | 2022-12-28 | 2023-11-11 | 財團法人工業技術研究院 | 細胞培養裝置 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007175028A (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Koojin Bio Kk | 閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法 |
| JP2009055894A (ja) * | 2007-09-03 | 2009-03-19 | J-Arm Co Ltd | 活性化リンパ球を簡便に大量培養し継代する方法、およびこれに用いる培養バックへのｃｄ３抗体の固相化方法 |
| JP2009195228A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-09-03 | Univ Of Tokyo | 制御性ｔ細胞製造方法及び制御性ｔ細胞増幅装置 |
| JP4399710B2 (ja) | 2003-08-13 | 2010-01-20 | 株式会社リンフォテック | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに細胞増殖培養用キット |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500095A (ja) | 2000-02-24 | 2004-01-08 | エクサイト セラピーズ， インコーポレイテッド | 細胞の同時の刺激および濃縮 |
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| WO2007136386A2 (en) * | 2005-06-06 | 2007-11-29 | The Regents Of The University Of California | Droplet-based on-chip sample preparation for mass spectrometry |
| JP2007104975A (ja) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Toyo Seikan Kaisha Ltd | 培養容器および培養方法 |
| CA2629532C (en) * | 2005-11-18 | 2016-08-09 | University Health Network | Method of expanding double negative t cells |
| US7439014B2 (en) * | 2006-04-18 | 2008-10-21 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet-based surface modification and washing |
| CN101472940B (zh) * | 2006-04-18 | 2012-11-28 | 先进液体逻辑公司 | 基于小滴的生物化学 |
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| JP5659448B2 (ja) * | 2006-08-23 | 2015-01-28 | 株式会社フコク | 培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法 |
| US9046514B2 (en) * | 2007-02-09 | 2015-06-02 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads |
| CN105670928A (zh) | 2007-04-27 | 2016-06-15 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 细胞培养装置、细胞培养体系及细胞培养方法 |
| CN101302491B (zh) * | 2007-05-09 | 2011-09-14 | 王歈 | 高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统 |
| WO2011052638A1 (ja) * | 2009-10-28 | 2011-05-05 | タカラバイオ株式会社 | サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法 |
| JP5740841B2 (ja) | 2010-05-19 | 2015-07-01 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法 |
| WO2012008368A1 (ja) | 2010-07-16 | 2012-01-19 | 株式会社日立製作所 | 細胞培養容器、および細胞培養装置 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4399710B2 (ja) | 2003-08-13 | 2010-01-20 | 株式会社リンフォテック | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに細胞増殖培養用キット |
| JP2007175028A (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Koojin Bio Kk | 閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法 |
| JP2009055894A (ja) * | 2007-09-03 | 2009-03-19 | J-Arm Co Ltd | 活性化リンパ球を簡便に大量培養し継代する方法、およびこれに用いる培養バックへのｃｄ３抗体の固相化方法 |
| JP2009195228A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-09-03 | Univ Of Tokyo | 制御性ｔ細胞製造方法及び制御性ｔ細胞増幅装置 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BUNSEKI KAGAKU, vol. 59, no. 6, 2010, pages 437 - 445 |
| YANNELLI J.R. ET AL.: "Use of anti-CD3 monoclonal antibody in the generation of effector cells from human solid tumors for us in cancer biotherapy", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 130, no. 1, 1990, pages 91 - 100, XP023987168 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016042741A1 (ja) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養システムにおける送液方法、及び細胞培養システム |
| CN111511898A (zh) * | 2018-01-09 | 2020-08-07 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 细胞培养方法及装置 |
| CN111511898B (zh) * | 2018-01-09 | 2024-01-02 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 细胞培养方法及装置 |
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