WO2015068764A1 - フラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

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WO2015068764A1
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fructooligosaccharide
sucrose
solution
dissolved oxygen
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健二 豊田
浩樹 大原
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株式会社明治
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fructooligosaccharides. Specifically, the present invention relates to a method for efficiently and efficiently preparing a fructooligosaccharide-rich sugar solution.
  • Fructooligosaccharide is an oligosaccharide in which one or more fructose residues are bound to sucrose (GF) by a ⁇ 2-1 bond.
  • GF2 1-kestose
  • GF3 nystose
  • GF4 fructosylnystose
  • commercially available fructooligosaccharide products contain 1-kestose, nystose, and fructosyl nystose as major components.
  • Fructooligosaccharide has useful properties such as caries resistance, bifidobacteria growth promoting action and mineral absorption promoting action.
  • Patent Documents 1 to 4 methods for efficiently producing high-purity fructooligosaccharides have been proposed.
  • the fructooligosaccharide content in the reaction solution obtained by the enzyme reaction is generally about 40 to 60%. Therefore, in order to efficiently separate fructooligosaccharides and specific sugar components from the reaction solution, it is necessary to additionally carry out separation and purification means such as chromatographic separation (Patent Documents 3 and 4). In the case of introducing chromatographic separation, not only does the cost of installing dedicated equipment arise, but the manufacturing process becomes complicated.
  • an object of this invention is to provide the method of manufacturing a fructooligosaccharide cheaply and efficiently.
  • the present inventors have maintained the concentration of dissolved oxygen in the enzyme reaction solution at 2 ppm or higher so that the fructooligosaccharide content is 90% or higher. It has been found that a certain sugar solution can be obtained quickly. Furthermore, it has been found that the production efficiency of fructooligosaccharides can be maintained even by scaling up to a level capable of industrial production by introducing a microbubble generator as a means for maintaining the dissolved oxygen concentration in the enzyme reaction solution. The present invention is based on this finding.
  • a method for producing sugar is provided.
  • a method for producing fructooligosaccharide comprising a step of preparing a reaction mixture containing sucrose, ⁇ -fructofuranosidase and glucose oxidase, and the reaction mixture under the optimum conditions for the ⁇ -fructofuranosidase Incubating, wherein the amount of dissolved oxygen is adjusted to 2-8 ppm in the incubating step.
  • the fructooligosaccharide is a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more.
  • the method according to any one of (1) to (3) which is carried out using a reaction tank having an aeration means and a stirring means.
  • the ventilation means is a fine bubble generator.
  • a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more can be obtained quickly.
  • the content of fructooligosaccharides in the obtained sugar liquid is high, high-purity fructooligosaccharides can be provided at low cost without using additional separation and purification means such as chromatographic separation.
  • the production efficiency is usually lower than the laboratory level.
  • a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more can be obtained after the scale-up. Obtainable.
  • the fructooligosaccharide obtained by the method for producing fructooligosaccharide of the present invention can be suitably used for products such as various foods and beverages and pharmaceuticals.
  • the present invention relates to a reaction in which ⁇ -fructofuranosidase is allowed to act on sucrose to produce fructooligosaccharide, and a reaction step in which glucose by-product is reduced by glucose oxidase, so that the amount of dissolved oxygen is 2 ppm or more. This is a method for producing fructooligosaccharides.
  • the above reaction step can be achieved by preparing a reaction mixture containing sucrose and the necessary enzymes and placing it under optimal conditions. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a fructooligosaccharide, the step of preparing a reaction mixture containing sucrose, ⁇ -fructofuranosidase and glucose oxidase, and the reaction mixture comprising the above ⁇ Incubating under optimal conditions of fructofuranosidase, wherein a method is provided wherein the dissolved oxygen content is adjusted to 2 ppm or more in the incubation step.
  • “fructooligosaccharide” means 1-kestose (GF2), nystose (GF3), fructosyl nystose (GF4) and a mixture thereof.
  • ⁇ -fructofuranosidase having fructose transfer activity such that the conversion rate from sucrose to 1-kestose is 40% or more can be used.
  • Aspergillus Aspergillus
  • Penicillium Piericillium
  • Scopulariopsis Spulariopsis
  • Aspergillus niger Aspergillus niger
  • It is derived from Aspergillus japonicus , and more preferably derived from Aspergillus japonicus ATCC20611 strain.
  • the reaction between sucrose and ⁇ -fructofuranosidase is performed in a solution.
  • the sucrose concentration in the reaction solution may be appropriately selected in consideration of the specific activity of the enzyme, the reaction temperature, etc., as long as sucrose can be dissolved. For example, a range of 5 to 80% by weight is preferable, and a range of 20 to 70% by weight is more preferable.
  • the amount of ⁇ -fructofuranosidase added may be an amount that can sufficiently utilize sucrose in the enzyme reaction solution.
  • the amount is adjusted to 1 U to 30 U, preferably 2 U to 15 U, with respect to 1 g of sucrose.
  • the enzyme unit (U) of ⁇ -fructofuranosidase described above is defined as follows. When 2.0 mL of a 25% sucrose solution, 1.0 mL of enzyme solution, and 2.0 mL of Mclvaine buffer (pH 5.0) were mixed and reacted at 40 ° C. for 60 minutes, 1 ⁇ mol of 1-kestose was added per minute. The amount of enzyme to be generated is 1U.
  • the reaction time of sucrose and ⁇ -fructofuranosidase can be appropriately changed until the fructooligosaccharide content is maximized.
  • the time from the start of the enzyme reaction until the fructooligosaccharide content in the reaction solution reaches 90% or more can be 6 to 80 hours, preferably 6 to 27 hours.
  • the method of the present invention reduces glucose by converting ⁇ -fructofuranosidase to sucrose to produce fructooligosaccharides and converting by-product glucose to gluconic acid by glucose oxidase.
  • the glucose oxidase used in the method of the present invention for example, from Aspergillus niger glucose oxidase or Penicillium chrysogenum (Penicillium chrysogenum) can be used those derived from such.
  • Commercial glucose oxidase preparations may have invertase activity as a side activity. Some enzyme preparations containing invertase exhibit a strong activity of hydrolyzing the generated fructooligosaccharides. Therefore, it is desirable that the glucose oxidase used in the method of the present invention has a weak invertase activity that hydrolyzes fructooligosaccharides or does not contain an invertase activity.
  • the amount of glucose oxidase added may be an amount sufficient to convert by-produced glucose. For example, it is adjusted so as to be 1 U or more, preferably 4 U or more with respect to 1 g of sucrose.
  • the enzyme unit (U) of glucose oxidase is defined as follows. Glucose oxidase is allowed to act on glucose as a substrate to produce hydrogen peroxide. Peroxidase is allowed to act in the presence of the generated hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine and phenol, and the generated quinoimine dye is measured and quantified at a wavelength of 500 nm. The amount of enzyme required to oxidize 1 ⁇ mol of glucose per minute under the condition of pH 7.0 is 1 U.
  • Hydrogen peroxide is by-produced in the reaction of converting glucose into gluconic acid by glucose oxidase. Since the enzyme may be deactivated by the oxidizing action of hydrogen peroxide, it is desirable to add a catalase that decomposes hydrogen peroxide as necessary.
  • the method of the present invention further includes a method of removing by-produced hydrogen peroxide with catalase in the reaction step with glucose and glucose oxidase.
  • the catalase used is preferably derived from Aspergillus niger or Micrococcus lysodeikticus .
  • the above-described method includes not only using a glucose oxidase preparation and a catalase preparation in combination, but also selecting and using a commercially available glucose oxidase preparation having a catalase activity as a side activity.
  • the amount of catalase added may be sufficient to convert the by-produced hydrogen peroxide into oxygen and water. For example, it adjusts so that it may become 10U or more with respect to 1g of sucrose, Preferably it is 100U or more.
  • the reaction temperature and pH of the reaction step between sucrose and ⁇ -fructofuranosidase and the by-product glucose and glucose oxidase are carried out under the optimum conditions of ⁇ -fructofuranosidase.
  • the temperature is preferably about 20 to 70 ° C. and the pH is preferably about 4 to 10, more preferably 25 to 40 ° C. and pH 5 to 8.
  • the pH of the reaction solution When converting glucose into gluconic acid, the pH of the reaction solution is lowered by gluconic acid. When the pH of the reaction solution decreases, the reaction for converting sucrose to fructooligosaccharide stops, acid hydrolysis of the generated fructooligosaccharide, or the like occurs. Therefore, it is desirable to adjust the pH to near neutrality by appropriately adding a neutralizing agent to the reaction solution.
  • a neutralizing agent examples include sodium carbonate, calcium carbonate, calcium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, and aqueous ammonia.
  • the amount of dissolved oxygen in the reaction solution can be determined by a method known in the art, for example, a chemical analysis method (titration method), an electrochemical analysis method (diaphragm electrode method), a photochemical analysis method (fluorescence method), or the like. Although it can be measured, it is preferably measured by an electrochemical analysis method (diaphragm electrode method).
  • the amount of aeration is at least 3 L / min. Preferably it is 10 L / min or more, More preferably, it is 20 L / min or more.
  • a fine bubble refers to a bubble having a bubble diameter of centimeter size, millimeter size, and micrometer size among bubbles generated in a reaction solution.
  • the residence time in the reaction solution is increased. By retaining fine bubbles in the reaction solution, the reaction time from the start of the enzyme reaction until obtaining a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more is shortened.
  • an aeration means in an enzyme reaction system of about 2 L, it is preferable to provide a pipe (aeration pipe) for continuously supplying air in the reaction tank.
  • a pipe aeration pipe
  • fine bubbles can be retained in the enzyme reaction liquid by high-speed stirring at a stirring speed of 600 rpm or more by stirring means such as a stirring blade in addition to aeration from a pipe.
  • stirring means such as a stirring blade in addition to aeration from a pipe.
  • a device for generating fine bubbles at the end of the pipe that is, a “fine bubble generating device” is provided.
  • the device examples include an air stone (Ibuki Air Stone # 150), an aerator (OHR aerator: OHR Fluid Engineering Laboratory Co., Ltd.), Aqua Blaster (registered trademark: Ience Co., Ltd.), a microbubble generator, and the like. Can be mentioned.
  • the number of stirring is desirably 300 rpm or less, preferably 200 rpm or less.
  • the resistance of the sugar solution to the stirring blade is large, so that the load due to high-speed stirring is greater than that of a general oxidoreductase reaction.
  • 50L scale or more it is 50 rpm or less, preferably 20 rpm or less.
  • the fructooligosaccharide obtained by the method of the present invention is preferably a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more.
  • “Fructooligosaccharide content” refers to the total content of neutral sugars (fructose, glucose, sucrose, 1-kestose, nystose, and fructosyl nystose) contained in the sugar solution, 1-kestose, nystose and It means the combined content of fructosyl nystose.
  • the sugar composition of the neutral sugar described above can be analyzed, for example, under the following HPLC conditions.
  • a known separation and purification treatment can be additionally performed on the sugar solution containing fructooligosaccharide.
  • the separation and purification treatment include a treatment for adjusting the gluconic acid content by means such as electrodialysis, a treatment for concentration by means such as an evaporator, and a treatment for drying by means such as a vacuum dryer.
  • the fructooligosaccharides obtained by the method of the present invention can be widely applied to known beverages, foods and pharmaceuticals because they can be produced at low cost.
  • Reference Example 1 Preparation of ⁇ - fructofuranosidase 350 mL of a medium containing 2.0% powdered broth, 5.0% sucrose and 0.5% CMC was placed in an Erlenmeyer flask and sterilized, and then the Aspergillus japonicus ATCC20611 strain was planted. Inoculated and cultured at 28 ° C. for 20 hours to prepare a seed culture. A 30 L jar fermenter was charged with 15 L of a medium containing 5.0% sucrose, 3.6% yeast extract and 0.5% CMC, adjusted to pH 6.5, and then sterilized at 120 ° C. for 30 minutes.
  • the culture broth was centrifuged and freeze-dried to obtain a crude enzyme cell having fructose transfer activity.
  • the fructose transfer activity of the crude enzyme cells was 1,580 U / g (cell weight).
  • the fructose transfer activity is as follows when 2.0 mL of a 25% sucrose solution, 1.0 mL of enzyme solution, and 2.0 mL of Mclvaine buffer (pH 5.0) are mixed and reacted at 40 ° C. for 60 minutes. This is a value defined as 1 U (unit) for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of 1-kestose per minute.
  • the crude enzyme cells were lyophilized and used as ⁇ -fructofuranosidase in subsequent tests.
  • Example 1 Production of fructooligosaccharides (1) 2L scale-1 The enzyme reaction was performed under the following conditions. Substrate solution: 578 g of sucrose dissolved in 1350 g of distilled water (sucrose 30% by weight) Enzyme solution: ⁇ -fructofuranosidase with 5.19 U added to 1 g of sucrose (Reference Example 1) 3,000 U Glucose oxidase (trade name: Hyderase 15, Amano Enzyme, containing catalase activity as a side activity) 3,000 U Temperature: 30 ° C pH: 7.0 Stirring speed: 600rpm Aeration rate: 3 L / min (performed continuously through a pipe with a hole diameter of 1 mm arranged at the bottom of the reaction vessel)
  • the reaction solution from 0 to 24 hours after the start of the enzyme reaction was sampled.
  • the sampled reaction solution was heated in a hot water bath set at 82 ° C. for 30 minutes to deactivate the enzyme, thereby terminating the reaction.
  • the solution was filtered with a filter paper and a 0.45 ⁇ m filter.
  • the sugar composition analysis was performed about each obtained reaction liquid.
  • the sugar composition analysis was performed under the following conditions.
  • the total content of the neutral sugars fructose, glucose, sucrose, 1-kestose, nystose, and fructosyl nystose was taken as 100%, and each content was determined from the content of each component.
  • the fructooligosaccharide content was calculated by combining the content of 1-kestose, nystose and fructosyl nystose. The results are shown in Table 1. Abbreviations in the table mean the following.
  • F fructose G: glucose GF: sucrose GF2: 1-kestose GF3: nystose GF4: fructosyl nystose
  • FOS fructooligosaccharide (addition of GF2 + GF3 + GF4)
  • the content of fructooligosaccharide was 90% or more after 20 hours from the start of the enzyme reaction. After 24 hours from the start of the enzyme reaction, a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 95% or more was obtained.
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P)
  • the dissolved oxygen amount was 3 ppm or more (3 to 6 ppm) in the reaction time of 2 to 24 hours. there were.
  • Example 2 Production of fructooligosaccharides (2) 2L scale-2
  • the enzyme reaction was performed under the following conditions.
  • Substrate solution 578 g of sucrose dissolved in 1350 g of distilled water (sucrose 30% by weight)
  • Enzyme solution ⁇ -fructofuranosidase with 5.19 U added to 1 g of sucrose (Reference Example 1)
  • 3,000 U Glucose oxidase (trade name: Hyderase 15, see Example 1)
  • Stirring speed A) 400 rpm, B) 600 rpm, C) 800 rpm
  • Aeration rate 3 L / min (performed continuously through a pipe with a hole diameter of 1 mm arranged at the bottom of the reaction vessel)
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • the reaction solution was sampled from 0 to 30 hours (35 hours in the 400 rpm test section) from the start of the enzyme reaction.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition.
  • Table 2 Table 3, and Table 4 show the results of the test sections where the number of stirring was 400 rpm, 600 rpm, and 800 rpm, respectively.
  • DO means “dissolved oxygen amount”.
  • the air supplied from the pipe having a hole diameter of 1 mm arranged at the bottom of the reaction vessel was finely dispersed in the solution by the rotating stirring blade.
  • the number of stirring was 600 rpm or more, the bubbles were well distributed in the reaction vessel in a very fine state. Therefore, when the number of stirring is 600 rpm or more, it is considered that oxygen necessary for the glucose oxidase reaction was supplied in a sufficient amount in any time zone of the enzyme reaction.
  • Example 3 Production of fructooligosaccharides (3) 2L scale-3
  • the enzyme reaction was performed under the following conditions. In Example 3, the enzyme amount 2 to 3 times that in Examples 1 and 2 was added.
  • Substrate solution 578 g of sucrose dissolved in 1350 g of distilled water (sucrose 30% by weight)
  • Enzyme solution ⁇ -fructofuranosidase (Reference Example 1) 8,764 U (15.2 U added to 1 g of sucrose)
  • Glucose oxidase (trade name: Hyderase 15, see Example 1) 9,000 U (15.6 U added to 1 g of sucrose)
  • Temperature 30 ° C pH: 7.0
  • Stirring speed A) 300 rpm, B) 400 rpm, C) 500 rpm, D) 600 rpm, E) 700 rpm, F) 800 rpm
  • Aeration rate 3 L / min (performed continuously through a pipe with a hole diameter of 1 mm arranged at the bottom of the reaction vessel
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • the reaction solution from 0 to 8 hours after the start of the enzyme reaction was sampled.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition. The results are shown in Tables 5-10.
  • the content of fructooligosaccharide is 90% by setting the dissolved oxygen content in the enzyme reaction solution to at least 2 ppm (2 to 6 ppm), preferably 3 ppm or more (3 to 6 ppm) on the 2L scale. % Of the sugar solution was obtained.
  • the aeration and stirring conditions for maintaining the dissolved oxygen amount were 3 L / min or more and a stirring rate of 600 rpm or more (600 to 800 rpm).
  • Example 4 Production of Fructooligosaccharide (4) Enzymatic reaction was carried out under conditions of 10 L scale or less.
  • Substrate solution 2890 g of sucrose dissolved in 6750 g of distilled water (sucrose 30% by weight)
  • Enzyme solution ⁇ -fructofuranosidase (Reference Example 1) 15,000 U (5.19 U added to 1 g of sucrose)
  • Glucose oxidase (trade name: Hyderase 15, see Example 1) 13,000 U (4.50 U added to 1 g of sucrose)
  • Temperature 30 ° C pH: 7.0
  • Stirring speed 150 rpm
  • Air flow A) 3 L / min (performed continuously through Ibuki Air Stone 30 mm ⁇ 150 mm # 150 (average pore diameter 12 ⁇ m, maximum 44 ⁇ m)); B) 10 L / min (performed continuously through Ibuki Air Stone 30 mm ⁇ 150 mm # 150 (average pore diameter 12 ⁇ m, maximum 44 ⁇ m
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • TOA DK Corporation DO-14P
  • the reaction solution was sampled from 0 to 5 hours after the start of the enzyme reaction, and in the test group B from 0 to 22 hours.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition. The results are shown in Tables 11-12.
  • test section B the enzyme reaction was started with an aeration rate of 10 L / min.
  • the dissolved oxygen level was maintained at about 3 to 6 ppm (2.9 to 5.8 ppm) from the start of the reaction until 22 hours later.
  • test group B a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more could be obtained 15 hours after the start of the enzyme reaction.
  • Example 5 Production of fructooligosaccharide (5) Enzymatic reaction was carried out under the condition of 50L scale or less. Substrate solution: 17.34 kg of sucrose is dissolved in 40.5 kg of distilled water (30% by weight of sucrose) Enzyme solution: ⁇ -fructofuranosidase (Reference Example 1) 89,880 U (added 5180 U to 1 kg of sucrose) Glucose oxidase (trade name: Hyderase 15, see Example 1) 89,700 U (added 5170 U to 1 kg of sucrose) Temperature: 30 ° C pH: 7.0 Stirring speed: 100rpm Ventilation rate: 20 L / min (Ibuki Air Stone 30 mm ⁇ 150 mm # 150 (average pore diameter 12 ⁇ m, maximum 44 ⁇ m) is used, each aeration rate 5 L / min)
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • the reaction solution from 0 to 28 hours after the start of the enzyme reaction was sampled.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition. The results are shown in Table 13.
  • a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more can be obtained by setting the dissolved oxygen content in the enzyme reaction solution to at least 2 ppm or more, preferably 3 ppm or more (3 to 5 ppm) on the 50 L scale. I was able to get it. Further, the aeration and stirring conditions for maintaining the dissolved oxygen amount described above were an aeration amount of 20 L / min or more and a stirring number of 100 rpm or more. Since it is difficult to stir at a high speed of 600 rpm or higher on a 50 L scale, it was useful to introduce a device that generates fine bubbles as a ventilation means.
  • Comparative Example 1 Production of fructooligosaccharide The enzyme reaction was performed under conditions of 4 t scale or less.
  • Substrate solution Dissolve 4000 kg of sucrose with 9300 kg of distilled water (30% by weight of sucrose)
  • Enzyme solution ⁇ -Fructofuranosidase (Reference Example 1) 5200 U added glucose oxidase per 1 kg of sucrose (trade name: Hyderase 15, see Example 1) 6300 U added temperature per 1 kg of sucrose Temperature: 30 ° C.
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • the reaction solution at 0, 24 hours, and 80 hours after the start of the enzyme reaction was sampled.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition.
  • the sugar composition of the solution at the start of the enzyme reaction had a sucrose content of 100%.
  • the sugar composition 24 hours after the start of the reaction was as follows.
  • the amount of dissolved oxygen in the enzyme reaction solution was less than 2 ppm.
  • the fructooligosaccharide content of the reaction solution 24 hours after the start of the reaction was 61.9%. Furthermore, when the sugar composition of the reaction solution after 80 hours was analyzed, the fructooligosaccharide content was 70%. In this test group, a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more could not be obtained.
  • Example 6 Production of fructooligosaccharide (6) An enzyme reaction was carried out under conditions of 4 t scale or less. Substrate solution: Dissolve 4000 kg of sucrose with 9300 kg of distilled water (30% by weight of sucrose) Enzyme solution: ⁇ -Fructofuranosidase (Reference Example 1) 5200 U added glucose oxidase per 1 kg of sucrose (trade name: Hyderase 15, see Example 1) 6300 U added temperature per 1 kg of sucrose Temperature: 30 ° C. pH: 6-7 Stirring speed: 20 rpm Aeration rate: 15.6 L / min
  • the gas was continuously ventilated through a pipe a having a diameter of 4 cm arranged at the bottom of the reaction vessel.
  • a pipe b having a diameter of 15 cm was arranged so as to cover the pipe a.
  • the tip of the pipe b was arranged to protrude about 10 cm from the tip of the pipe a.
  • a plate-like portion provided with a twist was provided at the most distal portion of the pipe b protruding from the pipe a.
  • the amount of dissolved oxygen in the solution during the enzyme reaction was measured using a portable dissolved oxygen meter (TOA DK Corporation: DO-14P).
  • the reaction solution at 0 and 80 hours after the start of the enzyme reaction was sampled.
  • the sampled reaction solution was processed in the same manner as in Example 1 and analyzed for sugar composition.
  • the amount of dissolved oxygen in the enzyme reaction solution was 2 ppm.
  • the sugar composition of the solution at the start of the enzyme reaction had a sucrose content of 100%.
  • the sugar composition 80 hours after the start of the reaction was as follows. Fructose: 4.0% Glucose: 0% Sucrose: 5.6% GF2: 23.0% GF3: 55.9% GF4: 11.5%
  • a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more could be obtained by setting the amount of dissolved oxygen in the enzyme reaction solution to at least 2 ppm or more.
  • the aeration and stirring conditions for maintaining the dissolved oxygen amount were 15 L / min or more for the aeration amount and 20 rpm or more for the stirring rate.
  • the amount of aeration was the same, but a sugar solution having a fructooligosaccharide content of 90% or more could be obtained by introducing a device for generating fine bubbles as a ventilation means. .

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Abstract

　スクロースにβ－フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を生成する反応、及び前記反応によって副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによって低減する反応工程において、溶存酸素量を２～８ｐｐｍとすることを特徴とする、フラクトオリゴ糖の製造方法が開示される。この方法により、フラクトオリゴ糖を安価で効率よく製造することが可能となる。

Description

フラクトオリゴ糖の製造方法 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０１３－２３０１３８号（出願日：２０１３年１１月６日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、フラクトオリゴ糖の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、フラクトオリゴ糖高含有糖液を安価で効率的に調製する方法に関する。
　フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、スクロース（ＧＦ）に1個以上のフラクトース残基がβ２－１結合により結合されたオリゴ糖類である。例えば、スクロースに１個のフラクトース残基が結合したものが１－ケストース（ＧＦ２）、２個結合したものがニストース（ＧＦ３）、３個結合したものがフラクトシルニストース（ＧＦ４）である。一般的に、市販されているフラクトオリゴ糖製品には、主要成分として、１－ケストース、ニストース、及びフラクトシルニストースが含まれている。
　フラクトオリゴ糖は、難う蝕性、ビフィズス菌増殖促進作用、ミネラル吸収促進作用などの有用な性質を有している。
　そこで、高純度のフラクトオリゴ糖を効率的に製造する方法が提案されている（特許文献１～４）。
　スクロースに対してフラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を製造する従来の方法によれば、酵素反応によって得られる反応液中のフラクトオリゴ糖含有率は、一般的には４０～６０％程度である。そこで、反応液からフラクトオリゴ糖や特定の糖成分を効率よく分離するためには、さらにクロマト分離等の分離精製手段を追加的に実施する必要が生じる（特許文献３及び４）。クロマト分離を導入する場合は、専用設備を設置するコストが生じるだけでなく、製造工程は複雑となる。
　一方で、フラクトフラノシダーゼによる酵素反応の効率を高めることを目的として、フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼの混合系を用いることが提案されている。酵素混合系によって得られる反応液中のフラクトオリゴ糖含有率は、最大で８６％まで向上した（特許文献１及び２）。
特開２０１０－２７３５８０号公報 特開昭６２－１４７９２号公報 特開２０００－２３２８７８号公報 国際公開ＷＯ９７／２１７１８号
　しかしながら、市場においては、優れた生理機能を有するフラクトオリゴ糖の用途を拡大するために、より安価なフラクトオリゴ糖を提供することが求められている。そのため、フラクトオリゴ糖をさらに効率的に工業スケールで製造する方法が必要とされている。そこで、本発明は、フラクトオリゴ糖を安価で効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、スクロースを基質として、フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼを作用させる反応工程において、酵素反応液中の溶存酸素濃度を２ｐｐｍ以上に保持することによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を迅速に得られることを見出した。さらに、酵素反応液中の溶存酸素濃度を保持する手段として、微細気泡発生装置を導入することによって、工業生産可能なレベルにスケールアップしてもフラクトオリゴ糖の生産効率を維持できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）スクロースにβ－フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を生成する反応、及び前記反応によって副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによって低減する反応工程において、溶存酸素量を２～８ｐｐｍとする、フラクトオリゴ糖の製造方法。
（２）フラクトオリゴ糖を製造する方法であって、スクロース、β－フラクトフラノシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含有する反応混合物を用意する工程、ならびに該反応混合物を、前記β－フラクトフラノシダーゼの最適条件下でインキュベートする工程、を含んでなり、該インキュベート工程において溶存酸素量が２～８ｐｐｍに調整される、方法。
（３）フラクトオリゴ糖が、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）通気手段及び撹拌手段を有する反応槽を用いて行なう、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）通気手段が微細気泡発生装置である、（４）に記載の方法。
（６）溶存酸素量が２～６ｐｐｍ、好ましくは３～６ｐｐｍである、（１）～（５）のいずれか１つに記載の方法。
　本発明により、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を迅速に得ることができる。また、得られる糖液中のフラクトオリゴ糖含有率が高いため、クロマト分離等の追加的な分離精製手段を用いることなく、高純度のフラクトオリゴ糖を安価に提供することができる。また、工業生産レベルまでスケールアップすると、通常は実験室レベルに対して製造効率は低下するが、本発明の方法を採用することによってスケールアップ後もフラクトオリゴ糖含有率が９０％以上の糖液を得ることができる。本発明のフラクトオリゴ糖製造方法によって得られるフラクトオリゴ糖は、各種飲食品や医薬品等の製品へ好適に使用できる。
　本発明は、スクロースにβ－フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を生成する反応、及び前記反応によって副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによって低減する反応工程において、溶存酸素量を２ｐｐｍ以上とすることを特徴とする、フラクトオリゴ糖の製造方法である。
　また、上記の反応工程は、スクロースと必要な酵素を含有する反応混合物を調製し、これを最適条件下に置くことによって達成することができる。従って、本発明の他の態様によれば、フラクトオリゴ糖を製造する方法であって、スクロース、β－フラクトフラノシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含有する反応混合物を用意する工程、ならびに該反応混合物を、前記β－フラクトフラノシダーゼの最適条件下でインキュベートする工程、を含んでなり、該インキュベート工程において溶存酸素量が２ｐｐｍ以上に調整される方法が提供される。
　本発明において、「フラクトオリゴ糖」とは、１－ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）、フラクトシルニストース（ＧＦ４）及びこれらの混合物を意味する。
　本発明の方法において、β－フラクトフラノシダーゼは、スクロースから１－ケストースへの変換率が４０％以上となるようなフラクトース転移活性を有するものを使用することができる。
　使用するβ－フラクトフラノシダーゼの由来は特に限定されないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属あるいはスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属が挙げられ、好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来もしくはアスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のものであり、より好ましくは、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のものである。
　本発明の方法において、スクロースとβ－フラクトフラノシダーゼとの反応は溶液中で行われる。具体例を示せば次の通りである。反応液中のスクロースの濃度は、スクロースが溶解可能な範囲であれば、酵素の比活性及び反応温度等を考慮して適宜選択してよい。例えば、５～８０重量％の範囲が好ましく、より好ましくは２０～７０重量％の範囲である。
　β－フラクトフラノシダーゼの添加量は、酵素反応液中のスクロースを十分に利用できる量であればよい。例えば、スクロース１ｇに対して１Ｕ～３０Ｕ、好ましくは２Ｕ～１５Ｕとなるように調整する。ここで、前記したβ－フラクトフラノシダーゼの酵素単位（Ｕ）は、以下のように定義される。２５％スクロース溶液２．０ｍＬ、酵素液１．０ｍＬ、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）２．０ｍＬをそれぞれ混合して、４０℃で６０分反応させた時に、１分間に１μｍｏｌの１－ケストースを生成させる酵素量を１Ｕとする。
　スクロースとβ－フラクトフラノシダーゼの反応時間は、フラクトオリゴ糖の含有率が最大となるまでで適宜変更することができる。例えば、酵素反応開始から反応液中のフラクトオリゴ糖含有率が９０％以上となるまでの時間が６～８０時間、好ましくは６～２７時間とすることができる。
　本発明の方法は、スクロースにβ－フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を生成する反応と同時に、副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによってグルコン酸に変換させることによってグルコースを低減する。
　本発明の方法に使用するグルコースオキシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシダーゼ又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来等のものを用いることができる。市販のグルコースオキシダーゼ製剤には、副活性としてインベルターゼ活性を有する場合がある。インベルターゼが含まれている酵素製剤の中には、生成したフラクトオリゴ糖を加水分解する活性が強く発揮されるものがある。そこで、本発明の方法に使用するグルコースオキシダーゼにおいては、フラクトオリゴ糖を加水分解するインベルターゼ活性が弱い、もしくはインベルターゼ活性が含まれていないことが望ましい。
　グルコースオキシダーゼの添加量は、副生するグルコースを変換するのに十分な量であればよい。例えば、スクロース１ｇに対して１Ｕ以上、好ましくは４Ｕ以上となるように調整する。グルコースオキシダーゼの酵素単位（Ｕ）は以下のように定義する。グルコースを基質としてグルコースオキシダーゼを作用させて、過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素と４－アミノアンチピリン及びフェノールの存在下において、パーオキシダーゼを作用させて、発生したキノイミン色素を波長５００ｎｍで測定して定量する。ｐＨ７．０の条件で１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１Ｕとする。
　グルコースオキシダーゼによりグルコースをグルコン酸に変換する反応において、過酸化水素が副生する。過酸化水素の酸化作用により酵素を失活させてしまう場合があるため、必要に応じて、過酸化水素を分解するカタラーゼを添加することが望ましい。
　したがって、本発明の方法では、グルコースとグルコースオキシダーゼによる反応工程において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去する方法もさらに含まれる。使用するカタラーゼとしては、アスペルギルス・ニガー又はミクロコッカス・リソデキティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来等のものが好ましい。また、前記した方法には、グルコースオキシダーゼ製剤とカタラーゼ製剤を併用するだけでなく、副活性としてカタラーゼ活性を有する市販のグルコースオキシダーゼ製剤を選択して用いることも含まれる。
　カタラーゼの添加量は、副生する過酸化水素を酸素と水に変換するのに十分であればよい。例えば、スクロース１ｇに対して１０Ｕ以上、好ましくは１００Ｕ以上となるように調整する。
　スクロースとβ－フラクトフラノシダーゼとの反応、及び副生するグルコースとグルコースオキシダーゼとの反応工程の反応温度及びｐＨは、β－フラクトフラノシダーゼの最適条件下で行うことが好ましい。例えば、温度は２０～７０℃程度、ｐＨは４～１０程度の条件下で行うのが好ましく、より好ましくは２５～４０℃、ｐＨ５～８の範囲である。
　グルコースをグルコン酸に変換させる際、グルコン酸により反応液のｐＨが低下する。反応液のｐＨが低下すると、スクロースからフラクトオリゴ糖へ変換する反応の停止、又は生成したフラクトオリゴ糖の酸加水分解等が起こる。そのため、反応液に適宜中和剤を投入して、ｐＨを中性付近に調整することが望ましい。使用可能な中和剤としては、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などが挙げられる。
　反応液中の溶存酸素量は、当技術分野において公知の方法、例えば、化学分析法（滴定法）、電気化学分析法（隔膜電極法）、光化学分析法（蛍光法）などの方法を用いて測定することができるが、好ましくは電気化学分析法（隔膜電極法）により測定される。
　グルコースとグルコースオキシダーゼの反応は酸化反応であるため、反応に酸素が必要である。したがって、反応液中の溶存酸素量を高めるために、反応液に通気しながら高速撹拌することが望ましい。反応液中の溶存酸素量を維持する上で、通気量としては少なくとも３Ｌ／分以上である。好ましくは１０Ｌ／分以上、より好ましくは２０Ｌ／分以上である。
　本発明の方法においては、通気量を維持するだけでなく、反応液中に微細な気泡を滞留させる通気手段及び撹拌手段を設けることが好ましい。通気手段及び撹拌手段は、反応液中に微細な気泡を滞留させることができれば限定されない。微細な気泡とは、反応液中で発生する気泡のうち、気泡径がセンチメートルサイズ、ミリメートルサイズ、及びマイクロメートルサイズの気泡のことをいう。特に、マイクロメートルサイズの気泡を供給することによって、反応液中の滞留時間が増加する。反応液中に微細な気泡を滞留させることによって、酵素反応開始からフラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得るまでの反応時間は短縮される。
　通気手段として、２Ｌ程度の酵素反応系においては、連続的に空気を供給する配管（散気管）を反応槽に設けることが好ましい。２Ｌ程度の酵素反応系においては、配管からの通気に加えて、撹拌羽根等の撹拌手段によって６００ｒｐｍ以上の撹拌速度で高速撹拌することによって、酵素反応液中に微細な気泡を滞留させることができる。より好ましくは、前記配管の先端に微細な気泡を発生させる装置、すなわち「微細気泡発生装置」を設ける。前記装置の具体例として、エアストーン（いぶきエアストーン＃１５０）、エアレーター（ＯＨＲエアレーター：株式会社ＯＨＲ流体工学研究所）、アクアブラスター（登録商標：株式会社アイエンス）、マイクロバブル発生装置などが挙げられる。
　１０Ｌスケールを超える酵素反応を行なう場合、６００ｒｐｍ以上の高速で撹拌すると、撹拌羽根が金属疲労で破壊される恐れがあること、モーターへの過負荷によるトラブル発生の恐れがある。そのため、スケールアップした酵素反応系においては、撹拌数は３００ｒｐｍ以下、好ましくは２００ｒｐｍ以下とすることが望ましい。特に、本発明のような高濃度の糖溶液を取り扱う糖転移酵素反応においては、撹拌羽根に対する糖溶液の抵抗が大きいため、一般的な酸化還元酵素反応よりも高速撹拌による負荷は大きくなる。５０Ｌスケール以上の場合は、５０ｒｐｍ以下、好ましくは２０ｒｐｍ以下とする。工業スケールでの生産においては、撹拌数に制約があるため、微細な気泡を発生させる装置を導入することが特に好ましい。
　本発明の方法により得られるフラクトオリゴ糖は、好ましくは、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上の糖液である。「フラクトオリゴ糖含有率」とは、糖液中に含まれている中性糖（フラクトース、グルコース、スクロース、１－ケストース、ニストース、及びフラクトシルニストース）の総含量に対する、１－ケストース、ニストース及びフラクトシルニストースを合わせた含有量を意味する。前記した中性糖の糖組成は、例えば以下のＨＰＬＣ条件で分析することができる。カラム：ＲＴ２５０－４．０ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｏｒ １００ ＮＨ２（Ｃｉｃａ－Ｒｅａｇｅｎｅｔ社）、移動相：６６％アセトニトリル、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：示差屈折計。
　フラクトオリゴ糖を含有する糖液に対して、公知の分離精製処理を追加的に実施することができる。分離精製処理として、例えば、電気透析等の手段によってグルコン酸含量を調整する処理、エバポレーター等の手段によって濃縮する処理、真空乾燥機等の手段によって乾燥する処理などが挙げられる。
　本発明の方法により得られるフラクトオリゴ糖は、安価で製造できる点から、公知の飲料、食品及び医薬品に幅広く適用することができる。
　本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１：β－フラクトフラノシダーゼの調製
　粉末ブイヨン２．０％、スクロース５．０％、ＣＭＣ０．５％を含む培地３５０ｍＬを三角フラスコに入れて殺菌した後、アスペルギルス・ジャポニカス　ＡＴＣＣ２０６１１株を植菌し、２８℃で２０時間培養して、種培養液を調製した。３０Ｌジャーファーメンターにショ糖５．０％、酵母エキス３．６％、ＣＭＣ０．５％を含む培地１５Ｌを入れて、ｐＨ６．５に調節した後、１２０℃で３０分殺菌した。次いで、前記培地に前記種培養液３５０ｍＬを無菌的に植菌し、２８℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して、さらに凍結乾燥することにより、フラクトース転移活性を有する粗酵素菌体を得た。前記粗酵素菌体のフラクトース転移活性は、１，５８０Ｕ／ｇ（菌体重量）であった。なお、前記フラクトース転移活性は、２５％スクロース溶液２．０ｍＬ、酵素液１．０ｍＬ、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）２．０ｍＬをそれぞれ混合して、４０℃で６０分反応させた時に、１分間に１μｍｏｌの１－ケストースを生成させる酵素量を１Ｕ（単位）として定義した値である。前記粗酵素菌体を凍結乾燥して、以降の試験におけるβ－フラクトフラノシダーゼとして用いた。
実施例１：フラクトオリゴ糖の製造（１）２Ｌスケール－１
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：スクロース１ｇに対して、５．１９Ｕ添加
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）３，０００Ｕ
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、天野エンザイム製、副活性としてカタラーゼ活性を含有する）３，０００Ｕ
温度：３０℃
ｐＨ：７．０
撹拌速度：６００ｒｐｍ
通気量：３Ｌ／分（反応槽底部に配置した孔径１ｍｍの配管を通じて連続的に行なった）
　酵素反応開始から０～２４時間までの反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、８２℃に設定した湯浴で３０分間加熱して酵素を失活させることにより、反応を終了させた。さらに、反応液に活性炭を基質重量に対して０．３％の割合で添加した後、前記溶液をろ紙及び０．４５μｍのフィルターでろ過した。
　得られた各反応液について糖組成分析を行った。糖組成分析は以下の条件で行った。カラム：ＲＴ２５０－４．０ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｏｒ １００ ＮＨ２（Ｃｉｃａ－Ｒｅａｇｅｎｅｔ社）、移動相：６６％アセトニトリル、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：示差屈折計。中性糖であるフラクトース、グルコース、スクロース、１－ケストース、ニストース、及びフラクトシルニストースの総含量を１００％として、各成分の含量から各々の含有率を求めた。フラクトオリゴ糖含有率については、１－ケストース、ニストース及びフラクトシルニストースの含有率を合わせることによって算出した。結果を表１に示した。表中の略号は以下を意味する。
　Ｆ：フラクトース
　Ｇ：グルコース
　ＧＦ：スクロース
　ＧＦ２：１－ケストース
　ＧＦ３：ニストース
　ＧＦ４：フラクトシルニストース
　ＦＯＳ：フラクトオリゴ糖（ＧＦ２＋ＧＦ３＋ＧＦ４の合算）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果より、酵素反応開始から２０時間以降にフラクトオリゴ糖含有率は９０％以上となった。酵素反応開始から２４時間後には、フラクトオリゴ糖含有率９５％以上の糖液が得られた。酵素反応中の溶液の溶存酸素量をポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定したところ、溶存酸素量は反応時間２～２４時間において３ｐｐｍ以上（３～６ｐｐｍ）であった。
実施例２：フラクトオリゴ糖の製造（２）２Ｌスケール－２
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：スクロース１ｇに対して、５．１９Ｕ添加
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）３，０００Ｕ
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）３，０００Ｕ
温度：３０℃
ｐＨ：７．０
撹拌速度：Ａ）４００ｒｐｍ、Ｂ）６００ｒｐｍ、Ｃ）８００ｒｐｍ
通気量：３Ｌ／分（反応槽底部に配置した孔径１ｍｍの配管を通じて連続的に行なった）
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。酵素反応開始から０～３０時間（４００ｒｐｍ試験区は３５時間）までの反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。
　撹拌数が４００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍの試験区の結果を、それぞれ表２、表３、表４に示した。表中の略号のうち、「ＤＯ」は「溶存酸素量」を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２より、撹拌数が４００ｒｐｍの場合、反応開始から２～８時間経過後までの溶存酸素量は２ｐｐｍ未満であった。また、反応時間が２４時間以降については、溶存酸素量は３ｐｐｍ以上（３．２～４．２ｐｐｍ）に保たれていた。撹拌数が４００ｒｐｍの場合、反応開始から２７時間後にフラクトオリゴ糖含有率が９０％以上となった。
　表３及び表４より、撹拌数が６００～８００ｒｐｍの場合は、反応開始から３０時間経過後まで、溶存酸素量は３ｐｐｍ以上（３．５～５．８ｐｐｍ）に保たれていた。反応開始から２４時間経過すると、反応液中のフラクトオリゴ糖含有率は９０％以上となった。
　表２～４の結果から、２Ｌスケールにおいて、酵素反応液中の溶存酸素量を少なくとも２ｐｐｍ以上（２～６ｐｐｍ）、好ましくは３ｐｐｍ以上（３～６ｐｐｍ）とすることによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。
　２Ｌスケールにおいて、反応槽の底部に配置した孔径１ｍｍの配管から供給された空気は、回転する撹拌羽根によって溶液中に細かく分散されていた。特に、撹拌数が６００ｒｐｍ以上の場合は、気泡が非常に細かい状態で反応槽内に良好に分布していた。そのため、撹拌数が６００ｒｐｍ以上の場合は、グルコースオキシダーゼ反応に必要な酸素が酵素反応のいずれの時間帯においても十分な量で供給されたと考えられる。
実施例３：フラクトオリゴ糖の製造（３）２Ｌスケール－３
　以下の条件で酵素反応を行なった。実施例３では、実施例１及び２に対して２～３倍の酵素量を添加した。
基質溶液：スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液： 
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）８，７６４Ｕ（スクロース１ｇに対して、１５．２Ｕ添加）
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）９，０００Ｕ（スクロース１ｇに対して、１５．６Ｕ添加）
温度：３０℃
ｐＨ：７．０
撹拌速度：Ａ）３００ｒｐｍ、Ｂ）４００ｒｐｍ、Ｃ）５００ｒｐｍ、Ｄ）６００ｒｐｍ、Ｅ）７００ｒｐｍ、Ｆ）８００ｒｐｍ
通気量：３Ｌ／分（反応槽底部に配置した孔径１ｍｍの配管を通じて連続的に行なった）
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。酵素反応開始から０～８時間までの反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。結果を表５～１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　撹拌数５００ｒｐｍ以下（３００ｒｐｍ（表５）、４００ｒｐｍ（表６）、５００ｒｐｍ（表７））の場合、本実施例では、酵素反応時間を８時間までとしたため、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることができなかった。また、表５～７のいずれの試験区においても、溶存酸素量は２ｐｐｍ未満であった。
　撹拌数６００ｒｐｍ以上（６００ｒｐｍ（表８）、７００ｒｐｍ（表９）、８００ｒｐｍ（表１０））の場合、酵素反応開始から８時間以内に、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることができた。撹拌数が７００ｒｐｍ以上の場合（表９～１０）は、全ての酵素反応時間帯において溶存酸素量は２ｐｐｍ以上（２．３～５．６ｐｐｍ）であった。撹拌数が６００ｒｐｍの場合（表８）、酵素反応開始から４時間後以降は溶存酸素量が２ｐｐｍ以上（２．２～３．７ｐｐｍ）であった。
　表５～１０の結果から、２Ｌスケールにおいて、酵素反応液中の溶存酸素量を少なくとも２ｐｐｍ以上（２～６ｐｐｍ）、好ましくは３ｐｐｍ以上（３～６ｐｐｍ）とすることによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。また、前記した溶存酸素量を維持するための通気及び撹拌条件は、通気量を３Ｌ／分以上、かつ撹拌数６００ｒｐｍ以上（６００～８００ｒｐｍ）であった。
実施例４：フラクトオリゴ糖の製造（４）１０Ｌスケール
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース２８９０ｇを蒸留水６７５０ｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）１５，０００Ｕ（スクロース１ｇに対して５．１９Ｕ添加）
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）１３，０００Ｕ（スクロース１ｇに対して４．５０Ｕ添加）
温度：３０℃
ｐＨ：７．０
撹拌速度：１５０ｒｐｍ
通気量：
Ａ）３Ｌ／分（いぶきエアストーン３０ｍｍ×１５０ｍｍ＃１５０（平均細孔径１２μｍ、最大４４μｍ）を通じて連続的に行なった）；
Ｂ）１０Ｌ／分（いぶきエアストーン３０ｍｍ×１５０ｍｍ＃１５０（平均細孔径１２μｍ、最大４４μｍ）を通じて連続的に行なった）
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。試験区Ａについては酵素反応開始から０～５時間後まで、試験区Ｂについては０～２２時間後までの反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。結果を表１１～１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　実施例１～３の約５倍となる１０Ｌスケールにおいては、６００ｒｐｍ以上で高速撹拌することは安全面から難しいため、撹拌数は１５０ｒｐｍとした。本実施例においては、通気手段としてエアストーンを導入したところ、酵素反応液中には微細な気泡が連続的に供給されていた。試験区Ａでは、通気量３Ｌ／分で酵素反応を開始した。反応開始から１時間後には溶存酸素量が２ｐｐｍ未満となり、その後も溶存酸素量は低下する傾向であった。一方、グルコース含有率は酵素反応開始後から上昇し続けて、反応開始から５時間後には１０％を上回った。本試験区では、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることができなかった。グルコース含有率が上昇する原因は、グルコースオキシダーゼ反応が円滑に進行していないことであると考えられた。
　試験区Ｂでは、通気量を１０Ｌ／分として酵素反応を開始した。反応開始から２２時間後までの間、溶存酸素量は約３～６ｐｐｍ（２．９～５．８ｐｐｍ）で維持されていた。試験区Ｂでは、酵素反応開始から１５時間後には、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることができた。
　表１１～１２の結果から、１０Ｌスケールにおいて、酵素反応液中の溶存酸素量を少なくとも２ｐｐｍ以上（２～６ｐｐｍ）、好ましくは３ｐｐｍ以上（３～６ｐｐｍ）とすることによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。また、前記した溶存酸素量を維持するための通気及び撹拌条件は、通気量を１０Ｌ／分以上、かつ撹拌数１５０ｒｐｍ以上であった。１０Ｌスケールにおいて６００ｒｐｍ以上で高速撹拌することは困難であるため、通気手段として微細な気泡を発生させる装置を導入することが有用であった。
実施例５：フラクトオリゴ糖の製造（５）５０Ｌスケール
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース１７．３４ｋｇを蒸留水４０．５ｋｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）８９，８８０Ｕ（スクロース１ｋｇに対して５１８０Ｕ添加）
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）８９，７００Ｕ（スクロース１ｋｇに対して５１７０Ｕ添加）
温度：３０℃
ｐＨ：７．０
撹拌速度：１００ｒｐｍ
通気量：２０Ｌ／分（いぶきエアストーン３０ｍｍ×１５０ｍｍ＃１５０（平均細孔径１２μｍ、最大４４μｍ）を４本使用、各通気量５Ｌ／分）
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。酵素反応開始から０～２８時間後までの反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。結果を表１３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３より、酵素反応開始直後から溶存酸素量は低下し、１時間後には１ｐｐｍまで低下した。反応開始６時間後以降から溶存酸素量が増加する傾向がみられた。同時に、フラクトオリゴ糖含有率も増加する傾向がみられた。反応開始から２０時間後には、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることができた。
　表１３の結果より、５０Ｌスケールにおいて、酵素反応液中の溶存酸素量を少なくとも２ｐｐｍ以上、好ましくは３ｐｐｍ以上（３～５ｐｐｍ）とすることによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。また、前記した溶存酸素量を維持するための通気及び撹拌条件は、通気量を２０Ｌ／分以上、かつ撹拌数１００ｒｐｍ以上であった。５０Ｌスケールにおいて６００ｒｐｍ以上で高速撹拌することは困難であるため、通気手段として微細な気泡を発生させる装置を導入することが有用であった。
比較例１：フラクトオリゴ糖の製造　４ｔスケール
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース４０００ｋｇを蒸留水９３００ｋｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）スクロース１ｋｇに対して５２００Ｕ添加
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）スクロース１ｋｇに対して６３００Ｕ添加
温度：３０℃
ｐＨ：６～７
撹拌速度：２０ｒｐｍ
通気量：１５．６Ｌ／分（反応槽底部に配置した直径４ｃｍの配管の先端約２０ｃｍ部分に設けられた孔径２５μｍの細孔を有するメッシュを通じて連続的に行なった）
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。酵素反応開始から０及び２４時間後、及び８０時間後の反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。
　酵素反応開始時の溶液の糖組成は、スクロース含有率１００％であった。反応開始２４時間後の糖組成は以下の通りであった。
　フラクトース　：１．２％
　グルコース　　：２５．５％
　スクロース　　：１１．４％
　ＧＦ２　　　　：３９．７％
　ＧＦ３　　　　：２１．２％
　ＧＦ４　　　　：１．０％
　フラクトオリゴ糖（ＧＦ２＋ＧＦ３＋ＧＦ４）：６１．９％
　４ｔスケールの反応系において、酵素反応液中の溶存酸素量は２ｐｐｍ未満であった。反応開始から２４時間後の反応液のフラクトオリゴ糖含有率は６１．９％であった。さらに、８０時間後の反応液の糖組成を分析したところ、フラクトオリゴ糖含有率は７０％であった。本試験区において、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液を得ることはできなかった。
実施例６：フラクトオリゴ糖の製造（６）４ｔスケール
　以下の条件で酵素反応を行なった。
基質溶液：スクロース４０００ｋｇを蒸留水９３００ｋｇで溶解（スクロース３０重量％）
酵素溶液：
β－フラクトフラノシダーゼ（参考例１）スクロース１ｋｇに対して５２００Ｕ添加
グルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、実施例１参照）スクロース１ｋｇに対して６３００Ｕ添加
温度：３０℃
ｐＨ：６～７
撹拌速度：２０ｒｐｍ
通気量：１５．６Ｌ／分
　反応槽底部に配置した直径４ｃｍの配管ａを通じて連続的に通気した。前記配管ａを覆うように直径１５ｃｍの配管ｂを配置した。配管ｂの先端は配管ａの先端から約１０ｃｍ突出させて配置した。配管ａから突出させた配管ｂの最先端部分には、ねじれを設けた板状部分を設けた。前記通気手段により通気を行うと、配管ａと配管ｂとの間で反応液を巻き込んで潜流を起こすことによって、反応液内に微細な気泡が発生し、反応液中に微細な気泡が滞留していた。
　酵素反応中の溶液の溶存酸素量を、ポータブル溶存酸素計（東亜ディーケーケー株式会社：ＤＯ－１４Ｐ）を用いて測定した。酵素反応開始から０及び８０時間後の反応液をサンプリングした。サンプリングした反応液は、実施例１と同様に処理して、糖組成を分析した。
　酵素反応液中の溶存酸素量は２ｐｐｍであった。酵素反応開始時の溶液の糖組成は、スクロース含有率１００％であった。反応開始８０時間後の糖組成は以下の通りであった。
　フラクトース　：４．０％
　グルコース　　：０％
　スクロース　　：５．６％
　ＧＦ２　　　　：２３．０％
　ＧＦ３　　　　：５５．９％
　ＧＦ４　　　　：１１．５％
　フラクトオリゴ糖（ＧＦ２＋ＧＦ３＋ＧＦ４）：９０．４％
　５０Ｌスケールにおいて、酵素反応液中の溶存酸素量を少なくとも２ｐｐｍ以上とすることによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。また、前記した溶存酸素量を維持するための通気及び撹拌条件は、通気量を１５Ｌ／分以上、かつ撹拌数２０ｒｐｍ以上であった。本実施例と比較例１において通気量は同じであるが、通気手段として微細な気泡を発生させる装置を導入することによって、フラクトオリゴ糖含有率が９０％以上である糖液を得ることができた。

Claims (6)

  1. 　スクロースにβ－フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を生成する反応、及び前記反応によって副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによって低減する反応工程において、溶存酸素量を２～８ｐｐｍとする、フラクトオリゴ糖の製造方法。
  2. 　フラクトオリゴ糖を製造する方法であって、スクロース、β－フラクトフラノシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含有する反応混合物を用意する工程、ならびに該反応混合物を、前記β－フラクトフラノシダーゼの最適条件下でインキュベートする工程、を含んでなり、該インキュベート工程において溶存酸素量が２～８ｐｐｍに調整される、方法。
  3. 　フラクトオリゴ糖が、フラクトオリゴ糖含有率９０％以上の糖液である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　通気手段及び撹拌手段を有する反応槽を用いて行なう、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　通気手段が微細気泡発生装置である、請求項４に記載の方法。
  6. 　溶存酸素量が２～６ｐｐｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
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