WO2015064594A1 - 癌用唾液バイオマーカー、その測定方法、装置、及び、癌用唾液バイオマーカーの特定方法 - Google Patents

癌用唾液バイオマーカー、その測定方法、装置、及び、癌用唾液バイオマーカーの特定方法 Download PDF

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acetylspermidine
alpha
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杉本　昌弘
朋義 曽我
眞琴 砂村
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学校法人 慶應義塾
学校法人東京医科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a saliva biomarker for cancer, a method and apparatus for measuring the same, and a method for identifying a saliva biomarker for cancer, and in particular, early detection of pancreatic cancer, intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN), breast cancer and oral cancer
  • the present invention relates to a cancer salivary biomarker, a method of measuring the same, an apparatus thereof, and a method of specifying a cancer salivary biomarker.
  • pancreatic cancer which is intractable cancer
  • the median survival of non-surgical resected cases such as chemotherapy and radiation therapy for pancreatic cancer has not reached one year. That is, in order to improve the treatment results of these intractable cancers, it is important to diagnose cancer at an early stage where surgical resection is possible. Therefore, we will conduct high-frequency tests using non-invasive, minimally invasive, easily collected biological samples (such as body fluids), and develop a method that can detect cancer at an early stage, or at a later stage that can be resected and treated at the latest. There is a need.
  • Patent Document 1 One of the inventors proposed a serum marker for kidney disease determination in Patent Document 1 and proposed a liver disease marker in Patent Documents 2 and 3.
  • Non-patent Documents 4 and 5 CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9) is used in clinical practice as a protein marker in the blood for digestive system cancer, and it is useful for detection of pancreatic cancer and biliary tract cancer and for evaluating the effect of chemotherapy
  • it is difficult to diagnose cancer at an early stage, and the accuracy of screening for cancer is insufficient Non-patent Document 1).
  • DUPAN-2 pancreatic cancer associated glycoprotein antigen, pancreatic cancer associated antigen
  • CEA Carcinoembryonic Antigen
  • polyamines such as spermine (Spermine), and acetylated polyamines such as N8-acetylspermidine (N8-Acetylspermidine), N1-acetylspermidine (N1-Acetylspermidine), N1-acetylspermine (N1-Acetylspermine)
  • spermine Spermine
  • acetylated polyamines such as N8-acetylspermidine (N8-Acetylspermidine), N1-acetylspermidine (N1-Acetylspermidine), N1-acetylspermine (N1-Acetylspermine)
  • N8-Acetylspermidine N1-acetylspermidine
  • N1-acetylspermine N1-Acetylspermine
  • Non-patent Document 1 spermidine in the blood is known to increase in concentration in breast cancer, prostate cancer and testicular tumor.
  • Non-patent Document 3 spermine and spermidine levels in blood decrease in acute pancreatitis
  • Patent Document 6 proposes a saliva biomarker for detecting lung cancer.
  • pancreatic cancer is said to be difficult to detect at an early stage, and it is important to detect the possibility of cancer quickly by more frequent examination than blood examination.
  • pancreatic cancer can be diagnosed by saliva
  • Non-Patent Document 4 pancreatic cancer can be diagnosed by mRNA in saliva.
  • pancreatic cancer diagnosis is possible with blood metabolites.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned conventional problems, and it is an object of the present invention to use saliva to enable early detection of cancers such as pancreatic cancer, breast cancer and oral cancer.
  • CE capillary electrophoresis apparatus
  • MS mass spectrometer
  • saliva is collected in a uniform collection method, excluding circadian variation and food effects, but it still can not exclude variation in concentration, so a marker is also sought to estimate the sum of metabolite concentrations, and pancreatic cancer
  • a marker is also sought to estimate the sum of metabolite concentrations, and pancreatic cancer
  • markers were found for breast cancer and oral cancer in the same manner.
  • the present invention is made based on the above-mentioned research results, and solves the above-mentioned problems by the cancer saliva biomarker characterized in that it is any one of low molecular weight compounds which are metabolites of saliva samples, or a combination thereof. It is
  • the cancer can be any of pancreatic cancer, intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN), breast cancer, and oral cancer.
  • IPMN intraductal papillary mucinous neoplasm
  • breast cancer breast cancer
  • oral cancer any of pancreatic cancer, intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN), breast cancer, and oral cancer.
  • the absolute concentration in saliva of the following substances, or a combination thereof can be used as the cancer saliva biomarker for detecting pancreatic diseases.
  • N-Acetylputrescine N-Acetylputrescine
  • Adenosine Adenosine
  • 3-Phospho-D-glyceric acid 3PG
  • Urea Urea
  • o-Acetylcarnitine o-Acetylcarnitine
  • Citric acid Citric acid (Citrate), glycyl- Glycine (Gly-Gly), 5-Aminovaleric acid (5-Aminovalerate), Methyl 2-oxopentanoate (2-Oxoisopentanoate), Malate (Malate), Benzoate (Benzoate), Fumaric acid (Fumarate), N -Acetylaspartate (N-Acetylaspartate), Inosine (Inosine), 3-Methylhistidine (3-Methylhistidine), N
  • N8-Acetylspermidine N8-Acetylspermidine
  • Creatinine Creatinine
  • Spermine Spermine
  • N1-Acetylspermidine N1-Acetylspermidine
  • N1-Acetylspermine N1-Acetylspermine
  • Cytidine Cytidine (Cytidine) , Alpha-amino adipate (alpha-Aminoadipate), cytosine (Cytosine), betaine (Betaine), urea (Urea), homovani phosphate (Homovanillate), N-acetylneuraminate (N-Acetylneuraminate), cystine ( Cystine), urocanic acid salt (Urocanate), fumaric acid salt (Fumarate), 1,3-diaminobromone (1,3-diaminobromone (1,3-diaminobromone (1,3-diaminobromon
  • a combination of creatinine, N1-acetylspermidine, alpha-aminoadipic acid salt, N-acetylneuraminic acid salt, 1,3-diaminoblopane can make highly accurate predictions. However, the prediction can be made by changing other combinations and combination methodologies.
  • the absolute concentration in saliva of the following substances, or a combination thereof can be used as the cancer saliva biomarker for detecting breast cancer.
  • Choline Choline
  • 2-hydroxybutyrate (2-Hydroxybutyrate)
  • beta-alanine beta-alanine
  • 3-methylhistidine 3-Methylhistidine
  • alpha-aminobutyric acid (2AB)
  • N-acetylbetaalanine N-Acetyl) -beta-alanine
  • isethionate Isethionate
  • N-Acetylphenylalanine N-Acetylphenylalanine
  • trimethyllysine N6, N6, N6-Trimethyllysine
  • alpha-aminoadipic acid alpha-Aminoadipate
  • creatine Creatine
  • Gamma-butyrobetaine gamma-Butyrobetaine
  • sarcosine Sarcosine
  • pyruvate Pyru
  • a combination of beta-alanine, N-acetyl phenylalanine, and citrulline can be used as an example of the combination of the cancer saliva biomarkers for detecting breast cancer.
  • the prediction can be made by changing other combinations and combination methodologies.
  • Choline Choline
  • N-acetyl phenylalanine N-acetyl spermidine
  • creatine can be used as an example of the combination of the cancer saliva biomarkers for detecting breast cancer.
  • the prediction can be made by changing other combinations and combination methodologies.
  • the concentration in saliva of the following substances, or a combination thereof can be used as the above-mentioned cancer saliva biomarker for detecting oral cancer.
  • Glycyl-glycine (Gly-Gly), citrulline (Citruline), gamma-butyrobetaine (gamma-Butyrobetaine), 3-phenyl lactate (3-Phenyllactate), butyric acid (Butanoate), hexanoic acid (Hexanoate), methionine (Met), Hypoxanthine (Hypoxanthine), spermidine (Spermidine), tryptophan (Trp), aspartate (Asp), isopropanolamine (Isopropanolamine), alanine-alanine (Ala-Ala), N, N-dimethylglycine (N, N-Dimethylglycine) N-Acetylspermidine (N1-Acetylspermidine), N1-, N8-Diacet
  • the above-mentioned substances are substances which are not known in Table 9 listed later.
  • the present invention also provides a method of measuring a salivary saliva biomarker for cancer, comprising the steps of collecting a saliva sample and detecting the cancer salivary biomarker in the collected saliva sample. is there.
  • the present invention also provides a device for measuring a salivary biomarker for cancer, comprising means for collecting a saliva sample and means for detecting the cancer salivary biomarker in the collected saliva sample. It is.
  • the present invention is also based on the procedure of ultrafiltration of a saliva sample, means for comprehensively measuring ionic metabolites in the saliva sample after ultrafiltration, and health based on the concentration of the measured metabolite. It is intended to provide a method for identifying a cancer saliva biomarker, which comprises a procedure for selecting a substance having a high ability to distinguish between a person and a person having pancreatic disease.
  • the correlation value between the measured metabolites can be calculated, and the concentration of each substance can be normalized with the concentration of the substance correlated with the largest number of substances.
  • a mathematical model can also be used to determine the combination of the cancer saliva biomarkers.
  • pancreatic cancer it is possible to detect not only pancreatic cancer but also pancreatic diseases including IPMN and chronic pancreatitis, breast cancer, oral cancer and the like at an early stage using saliva that can be collected non-invasively and easily.
  • pancreatic diseases including IPMN and chronic pancreatitis, breast cancer, oral cancer and the like
  • saliva that can be collected non-invasively and easily.
  • polyamines with other novel substances enables highly accurate predictions.
  • FIG. 1 Flow chart showing the determination procedure of the biomarker in the example of the present invention
  • Figure showing the correlation network of metabolites in saliva as well
  • Figure showing a model of decision tree that distinguishes pancreatic cancer from healthy people
  • the figure also shows the receiver operating characteristic (ROC) curve of a mathematical model that distinguishes pancreatic cancer from healthy subjects when metabolite concentrations normalized with concentration markers are used.
  • ROC receiver operating characteristic
  • a model that classifies healthy subjects (C) and pancreatic cancer (PC) and plots the risk of pancreatic cancer including healthy subjects and pancreatic cancer and chronic pancreatitis (CP) and IPMN.
  • the figure shows the case where the variable increase / decrease method is used for variable selection in the MLR model that distinguishes normal cancer from pancreatic cancer when the absolute concentration of the concentration marker is used as it is Similarly, when using the variable increase method for variable selection in the MLR model that distinguishes pancreatic cancer from healthy persons when the absolute concentration of the concentration marker is used as it is Figure showing an example of total concentration of amino acids in saliva as well The figure which shows the ROC curve when variables are beta alanine, N-acetyl phenylalanine, citrulline in the MLR model for distinguishing breast cancer patients from healthy people.
  • the ROC curve when the variables are N-acetylphenylalanine, N1-acetylspermidine and creatine A network diagram between metabolites to determine the concentration corrector of biomarkers for breast cancer Figure showing substances belonging to polyamines among substances that were significantly different between healthy people and breast cancer patients Figure showing examples of substances other than polyamines among substances that were significantly different between healthy people and breast cancer patients Figure showing the top five substances with small p-values and ROC curves for substances that had significant differences between healthy individuals and breast cancer patients with or without concentration correction
  • Correlation network diagram showing the basis of using Gly as a correction marker Figure showing the concentrations of metabolites in cancerous tissue samples obtained at the time of surgery for oral cancer and healthy tissue samples in the vicinity Figure showing difference in concentration with saliva of healthy people when changing saliva collection method for oral cancer patients
  • Saliva donors A total of 199 samples of saliva samples with different stages of pancreatic cancer and healthy subjects, saliva samples of intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN) and chronic pancreatitis patients for evaluation of specificity are collected did. The number of cases in each group, the constitution of men and women, and the age are shown in Table 1. All pre-treatment cases with no history of chemotherapy treatment were included. The number of defects in Table 1 is the number of cases of unknown value.
  • IPMN intraductal papillary mucinous neoplasm
  • Saliva Collection Method (Step 100 in FIG. 1) ⁇ About the date of collection Do as much as possible except on the day of surgery ⁇ With regard to meals Do not drink except water from 21:00 the previous day Do not take breakfast on the day ⁇ Please be aware of saliva collection on the day that saliva is collected before breakfast AM8: Toothpaste with no toothpaste at least one hour before saliva collection Do not perform intense exercise one hour before saliva collection Do not take care of the oral cavity (such as using a toothpick) Cigarettes Do not breathe Do not drink except water ⁇ Method of saliva collection Rinse the mouth with water before collecting saliva and collect non-irritant mixed saliva. The saliva does not come out intentionally, but only those that naturally drip are collected (spitting method).
  • Pretreatment method for measuring metabolites of saliva Take 400 ⁇ L of a saliva sample, place it on an ultrafiltration filter (molecular weight cut off 5,000 Da), and centrifuge it at 4 ° C. and 9,100 g for 3.5 hours.
  • CE-TOFMS capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometer
  • Nebulizer gas pressure 7 psig Sheath solution: 50% MeOH / 0.1 ⁇ M Hexakis (2,2-difluoroethoxy) phosphazenes Water flow rate: 10 L / min Reference m / z: 2 MeOH 13 C isotope [M + H] + m / z 66.063061, Hexakis (2,2-difluoroethoxy) phosphazene [M + H] + m / z 622.028963 2) Anionic metabolite measurement mode ⁇ HPCE capillary: COSMO (+), inner diameter 50 ⁇ m ⁇ length 10, 6 cm Buffer: 50 mM ammonium acetate, pH 8.5 Voltage: negative, 30kV Temperature: 20 ° C Injection: Pressurized injection 50 mbar, 30 seconds, (about 30 nL) Washing before measurement: Washing with 50 mM ammonium acetate, pH 3.4 for 2 minutes, washing with 50 mM, pH
  • Nebulizer gas pressure 7 psig Sheath solution: 50% MeOH / 0.1 ⁇ M Hexakis (2, 2-difluoroethoxy) phosphazenes containing 5 mM ammonium acetate Water flow rate: 10 ⁇ L / min Reference m / z: 2 [CH 3 COOH] 13 C isotope [MH]-m / z 120.038339, Hexakis (2, 2- difluoroethoxy) phosphazene + CH 3 COOH [MH]-680.035451 ESI needle: platinum
  • the anionic metabolite measurement may be performed before the cationic metabolite measurement.
  • Remove noise (step 130 in FIG. 1) Remove substances with large fluctuations in value depending on the measurement date, and signals that are not derived from metabolites.
  • Step 140 in Figure 1 Only substances for which a peak could be detected in 30% or more cases (eg, 3 out of 10) in each group were selected.
  • Step 150 in Figure 1 After performing a normal test (this time the Mann-Whitney test), the False Discovery Rate (FDR) is used to correct the P value and calculate the Q value, and the Q value is significantly different from Q ⁇ 0.05. The material was sorted out.
  • FDR False Discovery Rate
  • Substances are selected for concentration correction by estimating the concentration of total metabolites in saliva (step 142 in FIG. 1)
  • the quantified value of the quantified metabolite was used to calculate the correlation value between the metabolites in a round-robin manner.
  • a combination of substances satisfying R ⁇ 0.8 in Pearson correlation coefficient (R) is listed. From the group of metabolites in which the largest number of substances correlate with each other, the substances with the highest number of substances in correlation were selected.
  • FIG. 1 An example of the correlation network diagram of the metabolite in saliva is shown in FIG.
  • Step 152 in Fig. 1 After performing the usual test (this time is the Mann-Whitney test) with the value of the concentration of each substance corrected by the concentration of the substance sorted in Step 142, the P value is corrected using False Discovery Rate (FDR). The Q value was calculated, and substances having a Q value significantly different from Q ⁇ 0.05 were selected.
  • FDR False Discovery Rate
  • a multiple logistic regression model which is a mathematical model was developed from the state without variables in step 200.
  • This multiple logistic regression (MLR) Analysis for the ratio P is an object variable, k-number of explanatory variables x 1, x 2, x 3 , ⁇ , using x k,
  • step 210 combinations of independent and smallest variables not correlated with each other are selected using, for example, the variable increasing / decreasing method of stepwise variable selection.
  • the variable x i was selected with a P value of 0.05 when adding a variable and a P value of 0.05 when removing a variable.
  • step 220 the data is divided into one for learning and one for evaluation, and then in step 230, a model is created from the data for learning and evaluated using the data for evaluation. Steps 220 and 230 were repeated in the cross validation consisting of loop 1 in FIG.
  • step 250 the most accurate model is selected from the cross validation results.
  • stepwise method there are also three types of variable increase, variable increase and decrease, variable decrease, etc. in the stepwise method, and there is also adjustment of the threshold, such as adding a variable with a threshold of P ⁇ 0.05. You can make the model many times with the big loop 2 in Fig. 3 and choose the one with the best accuracy.
  • pancreatic cancer (PC) risk values were also calculated for breast cancer, oral cancer (CP) and saliva of IPMN.
  • C healthy subjects
  • C healthy subjects
  • IPMN IPMN
  • AUC values capable of identifying pancreatic cancer from this group were calculated.
  • the data is divided into 10 at random, a model is created using 90% of the data, the model is evaluated with the remaining 10%, this is repeated 10 times, and all cases are always evaluated once Cross validation (CV) was also performed to select the side, collect evaluation data and calculate AUC values.
  • CV Cross validation
  • the substances having high correlation with each other at step 142 are shown in FIG.
  • a line is connected between substances in which R ⁇ 0.8.
  • Eight clusters (population of metabolites) are found, but the top left cluster in the figure contains the most substance.
  • alanine (Ala) is most frequently networked with other substances, this substance is used as a metabolite for normalizing the concentration of whole saliva.
  • the metabolite used for normalization is not limited to the substance most networked with other substances.
  • variable selection and mathematical model are not limited to stepwise method and MLR.
  • Table 2 shows substances having high ability to distinguish pancreatic cancer from healthy persons in step 152 of FIG.
  • the detection rate indicates the ratio of the number of cases in which the peak could be detected among all the cases in the group of healthy subjects and pancreatic cancer respectively.
  • the 95% CI indicates the value of the 95% confidence interval.
  • ROC Receiver Operating Characteristic
  • the area under the ROC curve in FIG. 5 was 0.8763 (95% CI: 0.8209-0.9317, p ⁇ 0.0001).
  • the sensitivity of the optimal cutoff value was 0.8348, and the (1-specificity) was 0.2169.
  • Figure 6 shows the calculated values of pancreatic cancer risk for patients with breast cancer, oral cancer (CP) and IPMN as well as healthy people (C) and pancreatic cancer (PC) using the MLR model that can distinguish between healthy people and pancreatic cancer. Shown in.
  • FIG. 6 is a model for separating a healthy person (C) and a pancreatic cancer (PC), which is a plot of the risk of pancreatic cancer including C, PC and breast cancer, oral cancer (CP) and IPMN, and a box plot. Shows the values of 10%, 25%, 50%, 75% and 90% from the top, and the values outside 10% and 90% are indicated by plots.
  • Table 4 shows AUC values that evaluated the specificity and versatility of the MLR model.
  • CV is the case of cross validation.
  • FIG. 7 shows an ROC curve when an MLR model is created using absolute density without performing density correction.
  • selected markers and coefficients are shown in Table 5.
  • the area under the ROC curve is 0.8264 (95% CI: 0.7619-0.8874, p ⁇ 0.0001), and although the accuracy is slightly lower than when the concentration correction is not performed, it is still high. It was possible to predict with prediction accuracy.
  • the P value when adding variables was 0.05, and the P value when removing variables was 0.05 using the variable increase / decrease method of stepwise variable selection.
  • An ROC curve is shown in FIG. 8 when the P value at the time of adding a variable is 0.05, using the variable increasing method as a method of variable selection.
  • selected markers and coefficients are shown in Table 6.
  • the area under the ROC curve is 0.8373 (95% CI: 0.7792-0.8954, p ⁇ 0.0001), which is the same despite the fact that markers and coefficients different from the model in FIG. 7 are used. It was possible to get the level of prediction accuracy.
  • the concentration of ionic metabolites contained in saliva was measured at the same time, and markers with high ability to distinguish between healthy persons and pancreatic cancer were selected. Furthermore, with this combination of markers, it was possible to develop a model with higher accuracy (sensitivity and specificity) than a single substance.
  • FIG. 9 shows the difference in the total concentration of amino acids in saliva for each disease.
  • the meaning of box whiskers is the same as in FIG.
  • Pancreatic cancer has a significantly higher concentration than healthy people (C), and the fact that the total concentration in saliva is high may also be useful as an indicator of pancreatic cancer risk.
  • C healthy people
  • the accuracy is poor even if these are simply treated as risks (data shown in FIG. 8 between C and PC)
  • the concentration is high in C and the concentration is low in PC
  • the entire concentration can be taken into consideration. Must be reduced. Therefore, according to the method shown in FIG. 2, the marker substance was searched after the variation of the total concentration was canceled by normalizing the substance with high correlation to the metabolite concentration in saliva and detectable in all samples. In addition, it is also possible to omit normalization.
  • polyamines such as spermine
  • acetylated substances of polyamines such as N8-acetylspermidine, N1-acetylspermidine, N1-acetylspermine, etc.
  • concentration correction is performed only with creatinine, and the accuracy comparable to measuring a tumor marker by blood test is Not achieved.
  • polyamines are taken up by erythrocytes in blood (Fu NN, Zhang HS, MaM, Wang H.
  • the diagnostic method detected in the present invention is performed with saliva that can detect the marker substance at a high concentration, and to reduce variations generated for each measurement because the processing steps performed for the measurement are simple. It is a distinctive point that high precision prediction is achieved by the contribution of three points using a mathematical model by combining markers. Also, it is a known fact that mRNA in saliva is different between pancreatic cancer patients and healthy individuals (Non-patent Document 4), but the molecular groups targeted by the present invention are metabolites, which are completely different.
  • Non-patent Document 5 a substance not included in known documents is used as a marker, and the concentration fluctuation peculiar to saliva is canceled. And, the combination of these substances enabled us to develop a highly sensitive and specific pancreatic cancer identification mathematical model.
  • pancreatic cancer predicted by the MLR model shows that this model exhibits high specificity for pancreatic cancer in four groups of healthy subjects, chronic pancreatitis, IPMN, and pancreatic cancer (FIG. 6).
  • the results of cross validation (Table 4) and the results of tests that divide pancreatic cancer and non-pancreatic cancer also show that this model has high sensitivity and specificity that can not be achieved by conventional methods.
  • capillary electrophoresis-mass spectrometry was used to measure metabolites in saliva, but high performance liquid chromatography (LC), gas chromatography (GC), chip LC, etc.
  • Cases include healthy persons (20 cases), breast cancer patients before the start of treatment (37 cases), breast cancer patients (90 cases) including those who received treatment such as chemotherapy and hormone therapy, and only 1 male case of breast cancer All the rest adopted female cases. Before the start of treatment, 8 patients with breast cancer have DCIS and 29 cases with invasive ductal carcinoma.
  • the method of collecting saliva, the method of measuring metabolites, etc. were the same as those for pancreatic cancer.
  • variable addition and addition methods are added with P ⁇ 0.05, added with P ⁇ 0.05, and deleted as beta-alanine (Beta-Ala), N-acetylphenylalanine (N-Acetylphenylalanie), citrulline (Citruline) was used.
  • Beta-Ala beta-alanine
  • N-acetyl phenylalanine is a method including N1-acetylspirimidin (N1-Acetylspermidine) known as a known marker, and performing addition (increase) with P ⁇ 0.05 by the variable increase / decrease method.
  • ROC values of the individual substances are 0.8373 for beta-alanine, 0.7122 for N-acetyl phenylalanine, and 0.698 for citrulline, and these are used as an MLR model to obtain 0.9622.
  • MLR MLR model
  • N-acetylphenylalanine was 0.7122
  • N-acetylspermidine was 0.7811
  • creatine was 0.7824, but when they are combined in the MLR model, 0 It has been confirmed that it improves to .9365.
  • the substances described as 7 and 8 in the items described as known are the substances known from Non-Patent Documents 7 and 8.
  • Fig. 10 create a network diagram in which the breast cancer patients (37 cases) before treatment start shown in Fig. 10 are metabolites of normal persons (20 cases), and a line is drawn between the metabolites showing correlation at R 2 > 0.92 Among them, glutamine (Gln), which is a substance having many binding lines with other substances and can be detected in all samples, was selected as a concentration correction substance. It is indicated by ⁇ in the figure.
  • FIG. 14 shows the top five rankings from the one with the smallest P value.
  • FIG. 16 A network diagram was created (shown in FIG. 16) using all cases of all samples (C, 20 cases and BC, 90 cases), and a concentration correction substance Gly (glycine, shown by .smallcircle. In the figure) was determined. If concentration correction is not performed using this concentration correction marker, 73 substances show a significant difference, and when concentration correction (dividing the concentration of target metabolite by the concentration of Gly), 35 substances show a significant difference, among which 11 showed significant difference with or without concentration correction. Among them, the top five substances with lower P values are shown. The ROC curve is shown on the lower right when an MLR model is created using two substances, Spermine and 6-Hydroxyhexanoate.
  • Tables 9-1 and 9-2 are substances that show differences in absolute concentration with respect to saliva of oral cancer and healthy people. 20 healthy subjects and 20 breast cancer patients (20 cases). Healthy subjects collected saliva 1.5 hours after a meal, and cancer patients performed sampling twice before the meal (from the night before and after fasting) and 1.5 hours after a meal. The P value was calculated by the Mann-Whitney test in either of these comparisons, and the Q value was further calculated at False Discovery Rate (FDR), and substances with Q ⁇ 0.05 were listed.
  • FDR False Discovery Rate
  • oral cancer patients include stages I to IVa, including oral squamous cell carcinoma (17 cases), malignant melanoma (2 cases), and adenoid cystic carcinoma (1 case).
  • spermine, spermidine, or their acetylated substances are highly consistent even in comparison of oral cancer specimens obtained at the time of surgery and nearby healthy regions.
  • choline in this is a known substance in documents 7 and 9, and the concentration increase of the substance in saliva is confirmed, but in the same way as pancreatic cancer and breast cancer.
  • a mathematical model combining multiple novel markers can identify oral cancer with higher accuracy.
  • this substance is elevated in oral cancer but not in breast cancer, it can be used as a variable in a mathematical model to express the specificity of the cancer type.
  • FIG. 17 shows the concentrations of metabolites in the cancerous tissue sample obtained at the time of surgery for oral cancer and healthy tissue samples in the vicinity (here, ⁇ M / g corrected with tissue weight).
  • the left part of the figure is a healthy tissue, and the right part is a cancer tissue.
  • I, II, III, Via indicate the progression (grade) of cancer. It is a part of the substance that has a significant difference between the healthy part and the cancer part.
  • FIG. 1 the difference in concentration with the saliva of a healthy subject (C) when the method of collecting saliva for oral cancer is changed is shown in FIG.
  • healthy people also use Choline (choline) with the lowest P value as an example. Healthy subjects (C) were collected at 1.5 hours after eating, oral cancer was collected from the same patient from P1 at 1.5 hours after eating, P2 at 3.5 hours after eating, and P3 at fasting (before breakfast).
  • Table 10 shows saliva collected from 17 healthy subjects, 21 pancreatic cancer, 16 breast cancer and 20 oral cancer all at fasting time (from 9:00 am on the night before and no meals on the day of collection), liquid chromatography The results of measurement of absolute concentrations of polyamines and hypoxanthine using a mass spectrometer (LC-MS). P-values for evaluating differences in mean values are calculated by Student'st-test, which is a parametric test because the number of cases is small.
  • hypoxanthine As a polyamine and a metabolite other than a polyamine are shown in Table 10.
  • N1, N12-Diacetylspermine N1, N12-diacetylspermidine
  • LC-qTOFMS LC-qTOFMS
  • LC-MS The measurement conditions of LC-MS are as follows.
  • LC system Agilent Technologies 1290 infinity Mobile phase: Solvent A; Water containing 1% Formic acid : Solvent B; Acetonitril containing 0.1% formic acid Flow rate: 0.5 mL / min Gradient [min.
  • the influence of concentration can be reduced by correcting (normalizing) the concentration of saliva by data analysis of a correlation network, and even in the case of saliva with large concentration fluctuation, pancreatic cancer can be distinguished from healthy persons.
  • the method also enables prediction of chronic pancreatitis, IPMN, breast cancer and oral cancer.
  • the range where the test with the marker of the present invention can be performed is determined by the value of the concentration correction marker that reflects saliva concentration, saliva outside the range is excluded from the test target, and absolute concentration or correction is performed only for those in the range. It is also possible to distinguish between a healthy person and each cancer disease person by a mathematical model of combinations of relative concentration markers.
  • pancreatic cancer Even in the case of saliva with large concentration variation, early detection of pancreatic cancer, breast cancer, oral cancer and the like from healthy persons becomes possible.

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Abstract

唾液試料の代謝物である低分子化合物のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする癌用唾液バイオマーカーを用いる。ここで、前記癌用唾液バイオマーカーは、例えばクレアチニン、N1-アセチルスペルミジン、アルファ－アミノアジピン酸塩、N-アセチルノイラミン酸塩、1,3-ジアミノブロパンの組合せとすることができる。これにより、濃度変動の大きな唾液でも、健常者から膵癌、乳癌、口腔癌等の早期発見が可能となる。

Description

癌用唾液バイオマーカー、その測定方法、装置、及び、癌用唾液バイオマーカーの特定方法
　本発明は、癌用唾液バイオマーカー、その測定方法、装置、及び、癌用唾液バイオマーカーの特定方法に係り、特に、膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、乳癌、口腔癌を早期発見するために用いるのに好適な、癌用唾液バイオマーカー、その測定方法、装置、及び、癌用唾液バイオマーカーの特定方法に関する。
　難治癌である膵癌の治療成績は未だ不十分であり、膵癌の化学療法や放射線治療等の非外科切除例の生存期間中央値は一年に到達していない。すなわち、これら難治癌の治療成績を改善するためには、外科切除が可能な早い病期での癌診断が重要である。従って、非侵襲・低侵襲で簡便に採取できる生体試料（体液など）を用いて、高頻度の検査を実施し、早期に、または遅くとも切除治療可能な段階で、癌を検出できる方法を開発する必要がある。
　発明者の一人は、特許文献１で腎臓病判定用血清マーカーを提案し、特許文献２、３で肝臓疾患マーカーを提案している。
　又、膵癌の早期発見を目的として、血液から腫瘍診断マーカーを発見する取り組みも数多く進められている（特許文献４、５）。消化器系癌に関する血中の蛋白マーカーとしては、CA19-9 （carbohydrate antigen 19-9）が臨床現場で活用されており、膵癌・胆道癌の検出や、化学療法の効果を評価する上で有用であるが、早期の癌を診断することは困難であり、癌のスクリーニングとしては精度が不十分である（非特許文献１）。また、ルイス式血液型陰性者では癌でも上昇しない偽陰性を示す問題もある。他にＤＵＰＡＮ－２（膵癌関連糖蛋白坑原、pancreatic cancer associated antigen）、ＣＥＡ（Carcinoembryonic Antigen）などもあるが、前者は胆道癌や肝癌、後者は食道癌、胃癌などの消化器系癌でも陽性を示し、膵癌特異的ではない。また、コストの面からも広く汎用されるには至っていない。
　又、スペルミン（Spermine）などのポリアミン類と、N8-アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミン（N1-Acetylspermine）など、ポリアミンのアセチル化したものは、血中・尿中では様々な癌のマーカーとして知られている（非特許文献２）。代謝経路でアルギニンがオルニチンに代謝され、その後プトレシンを介して、ポリアミン類に代謝される。これらは癌組織の表面の酸素が多いところで生合成が活性化され、癌中央部の低酸素状態のところでは、細胞外からの取り込みが上昇する。癌組織全体としては濃度が高くなり、血中に流れ出して来ると考えられている。例えば、血中のスペルミジンは、乳癌、前立腺癌、睾丸腫瘍において濃度が上昇することが知られている（非特許文献１）。また、スペルミンやスペルミジンは血中での濃度は急性膵炎で低下することが動物実験で知られている（非特許文献３）。
特開２０１１－５８８６３号公報 特開２０１１－２３２１６４号公報 ＷＯ２０１１／１５８５９０Ａ１号公報 特開２０１１－２４７８６９号公報 特表２００９－５０８４９３号公報 特開２０１３－５２１７６３号公報
Hamada S, Shimosegawa T., Biomarkers of pancreatic cancer., Pancreatology. 2011;11:14-9. Soda K （2011）, The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 30（1）： 95. Jin HT, Lamsa T, Merentie M, Hyvonen MT, Sand J, Raty S, Herzig KH, Alhonen L , Nordback I （2008）. Polyamine levels in the pancreas and the blood change according to the severity of pancreatitis. Pancreatology. 8（１）, 15-24. Zhang L, Farrell JJ, Zhou H, Elashoff D, Akin D, Park NH, Chia D, Wong DT. （2010）, Salivary transcriptomic biomarkers for detection of resectable pancreatic cancer. Gastroenterology. 138（3）:949-57 Sugimoto M, Wong DT, Hirayama A, Soga T, Tomita M, (2010), Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles, Metabolomics, 6, 78-95 Soga, T., Baran, R., Suematsu M., Ueno, Y., Ikeda, S., Sakurakawa T., Kakazu, Y., Ishikawa, T., Robert, M., Nishioka, T., Tomita, M. (2006), Differential methabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione sonsumption., Journal of Biological Chemistry, 281 (24): 16768-16776 Sugimoto et al. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles, Metabolomics, 2010, 6, 78-95 Tsutsui et al, High-throughput LC-MS/MS based simultaneous determination of polyamines including N-acetylated forms in human saliva and the diagnostic approach to breast cancer patients, Anal Chem, 2013, 85, 11835-42 Wang Q et al. Investigation and identification of potential biomarkers in human saliva for the early diagnosis of oral squamous cell carcinoma., Clin Chim Acta. 2014; 427:79-85
　従来の血中タンパク質を用いた癌の発見では、膵癌の早期発見のスクリーニングとしては不十分な点がある。また、血液検査は低侵襲な検査ではあるが、健康診断や病院での医療従事者による注射による採血が必要であるため、高頻度の検査が事実上難しい。一方、唾液は、非侵襲でまったく痛みを伴わず、被験者個人でも場所を選ばず採取可能であり、高頻度の検査が可能である利点がある。例えば特許文献６には肺癌検出用唾液バイオマーカーが提案されている。特に膵癌は早期発見が難しいといわれており、血液検査より、更に高頻度な検査で癌の可能性をいち早く検知することが重要である。
　唾液で膵癌が診断できる可能性があることについては、非特許文献４に、唾液中のｍＲＮＡで膵癌を診断できることが記載されている。又、血中代謝物で膵癌診断が可能という報告もある。
　しかしながら、ｍＲＮＡの定量には唾液採取の直後にＲＮａｓｅ阻害剤を唾液に添加してｍＲＮＡを破壊しないようにする工程が必要であり、更に、測定のために複雑な工程と時間を要する。このため定量のためには定量ＰＣＲを用いるが、一般に数個程度のマーカーを定量するのみで非特許文献４でも３５物質を定量しているだけである。このため、網羅性と定量性を確保して多くの分子の傾向をとらえることができず、唾液に生じる濃度補正もできないため、高精度な予測ができない。更に工程が複雑であるために定量値に人工的なノイズが混入してしまう可能性も高い。より簡便な処理で定量値にノイズが入る可能性を極力排除し、網羅的に分子を定量することで、唾液に生じる濃度変動の影響も考慮した信頼性の高いマーカー探索例が報告される提案はこれまでなかった。また、このような信頼性の高い唾液バイオマーカーにより癌、特に膵癌や膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、乳癌、口腔癌を健常者と、識別可能な診断法は提案されていなかった。
　本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、唾液を用いて膵癌、乳癌、口腔癌などの癌を早期発見可能とすることを課題とする。
　本発明者らは、生体試料内の低分子を網羅的に測定できるキャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）と質量分析計（ＭＳ）を併用したＣＥ－ＭＳを用いて、膵癌患者の唾液中の低分子（＝代謝物）の一斉定量を行い、膵癌と健常者を見分ける複数のバイオマーカーを特定した。また、これらを組み合わせて単独のマーカーより精度の高い識別方法を開発し、かつ膵癌以外の癌の唾液を用いた特異性の評価も行った。合わせて、唾液は採取方法をそろえて日内変動や食事の影響を排除して採取しているが、それでも濃度の変動を排除しきれないため、代謝物濃度の総和を推測するマーカーも探し、膵癌と健常者を見分けるマーカーとを組み合わるアルゴリズムを開発した。
  又、乳癌と口腔癌についても同様の手法でマーカーを見出した。
　本発明は、上記研究結果に基づいてなされたもので、唾液試料の代謝物である低分子化合物のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする癌用唾液バイオマーカーにより前記課題を解決したものである。
　ここで、前記癌を、膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、乳癌、口腔癌のいずれかとすることができる。
　又、膵疾患検出用の前記癌用唾液バイオマーカーとして以下の物質、又は、その組合せの唾液中の絶対濃度を使うことができる。N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、アデノシン（Adenosine）、3-ホスホ-D-グリセリン酸(3PG)、尿素(Urea)、o-アセチルカルニチン(o-Acetylcarnitine)、クエン酸(Citrate)、グリシル-グリシン(Gly-Gly)、5-アミノ吉草酸(5-Aminovalerate)、2-オキソペンタン酸メチル(2-Oxoisopentanoate)、リンゴ酸(Malate)、安息香酸エステル(Benzoate)、フマル酸(Fumarate)、N-アセチルアスパラギン酸(N-Acetylaspartate)、イノシン(Inosine)、3-メチルヒスチジン(3-Methylhistidine)、N1-アセチルスペルミン(N1-Acetylspermine)、クレアチン(Creatine)、アルファ-アミノアジピン酸(alpha-Aminoadipate)、ホスホリルコリン(Phosphorylcholine)、2-ヒドロキシペンタアート(2-Hydroxypentanoate)、キサンチン(Xanthine)、コハク酸(Succinate)、6-ホスホグルコン酸(6-Phosphogluconate)、ブタン酸(Butanoate)、ホモバニリン酸(Homovanillate)、O-ホスホセリン(O-Phosphoserine)、トリメチルアミン-N-オキシド(Trimethylamine N-oxide)、ピペリジン(Piperidine)、シスチン(Cystine)、2-イソプロピルリンゴ酸(2-Isopropylmalate)、N8-アセチルスペルミジン(N8-Acetylspermidine)、N1-アセチルスペルミジン(N1-Acetylspermidine)、N-アセチルノイラミン酸(N-Acetylneuraminate)、グルコサミン(Glucosamine)、スペルミン(Spermine)、アグマチン(Agmatine)、N-アセチルヒスタミン(N-Acetylhistamine)、メチオニン(Met)、p-4-ヒドロキシフェニル酢酸(p-4-Hydroxyphenylacetate)、N,N-ジメチルグリシン(N,N-Dimethylglycine)、ヒポタウリン(Hypotaurine)、グルタミン酸-グルタミン酸(Glu-Glu) 、N1,N12-ジアセチルスペルミン(N1,N12-Diacetylspermine)。
　又、唾液の濃度を補正した値を用いる場合は、以下の物質、又は、その組合せをマーカーとして利用することができる。N8-アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、クレアチニン（Creatinine）、スペルミン（Spermine）、アスパラギン酸（Asp）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミン（N1-Acetylspermine）、シチジン（Cytidine）、アルファ－アミノアジピン酸塩（alpha-Aminoadipate）、シトシン（Cytosine）、ベタイン（Betaine）、尿素（Urea）、ホモバニリン酸塩（Homovanillate）、N-アセチルノイラミン酸塩（N-Acetylneuraminate）、シスチン（Cystine）、ウロカニン酸塩（Urocanate）、フマル酸塩（Fumarate）、1,3-ジアミノブロパン（1,3-Diaminopropane）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、ニコチン酸塩（Nicotinate）、アグマチン（Agmatine）、バリン（Val）、2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸塩（2-Hydroxy-4-methylpentanoate）、アラニル‐アラニン（Ala-Ala）、クエン酸塩（Citrate）、グルコサミン（Glucosamine）、カルノシン（Carnosine）、グリシン‐グリシン（Gly-Gly）、2-アミノ酪酸（2AB）、アルギニン（Arg）、N-アセチルグルタミン酸塩（N-Acetylglutamate）、グリセロリン酸塩（Glycerophosphate）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、イソロイシン（Ile）、アデノシン（Adenosine）、グアニン（Guanine）、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）、カダベリン（Cadaverine）。
　又、膵疾患検出用の前記癌用唾液バイオマーカーの組合せの一例として、クレアチニン、N1-アセチルスペルミジン、アルファ-アミノアジピン酸塩、N-アセチルノイラミン酸塩、1,3-ジアミノブロパンの組合せで高精度な予測を行うことができる。ただし、他の組合せや組合せの方法論を変えて予測を行うこともできる。
　又、乳癌検出用の前記癌用唾液バイオマーカーとして以下の物質、又は、その組合せの唾液中の絶対濃度を使うことができる。コリン（Choline）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyrate）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、アルファ-アミノアジピン酸（alpha-Aminoadipate）、クレアチン（Creatine）、ガンマ－ブチロベタイン（gamma-Butyrobetaine）、サルコシン（Sarcosine）、ピルビン酸（Pyruvate）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、セリン（Ser）、ホモバリニン酸（Homovanillate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、ギャバ（GABA）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxypentanoate）、カルニチン（Carnitine）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、乳酸（Lactate）、2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸（2-Hydroxy-4-methylpentanoate）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、酪酸（Butanoate）、アデニン（Adenine）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、プロピオン酸（Propionate）、ベタイン（Betaine）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、クロトン酸（Crotonate）、トリプトファン（Trp）、シトルリン（Citrulline）、グルタミン（Gln）、プロリン（Pro）、2-オキソイソペンタン酸（2-Oxoisopentanoate）、4-安息香酸メチル（4-Methylbenzoate）、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（3-(4-Hydroxyphenyl)propionate）、システイン酸（Cysteate）、アゼライン酸（Azelate）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、ピペコリン酸（Pipecolate）、フェニルアラニン（Phe）、O-ホスホセリン（O-Phosphoserine）、マロン酸（Malonate）、ヘキサン酸(Hexanoate)、p-ヒドロキシフェニル酢酸(p-Hydroxyphenylacetate）。
  上記物質は後出表７において、公知でなく有意な物である。
  又、乳癌検出用の前記癌用唾液バイオマーカーの組合せの一例として、べータアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、シトルリンの組合せを用いることができる。ただし、他の組合せや組合せの方法論を変えて予測を行うこともできる。
  又、唾液の濃度を補正した値を用いる場合は、以下の物質、又は、その組合せをマーカーとして利用することができる。コリン（Choline）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン(Hypotaurine)、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、アゼライン酸（Azelate）、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）、グリコール酸（Glycolate）、4-メチル-2-オキソペンタノン酸（4-Methyl-2-oxopentanoate）、N-アセチルアスペラギン酸（N-Acetylaspartate）、グリセロリン酸（Glycerophosphate）、3-ヒドロキシブチル酸（3-Hydroxybutyrate）、安息香酸（Benzoate）、アジペート（Adipate）、2-イソプロピルマレート（2-Isopropylmalate）、ホスホリルクロリン（Phosphorylcholine）、N-アセチルノイラミネート（N-Acetylneuraminate）、ヒスタミン（His）、o-アセチルカルニチン（o-Acetylcarnitine）、N-アセチルグルコサミン1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、クレアチニン（Creatinine）、アルギニン（Arg）、シリング酸（Syringate）。
  上記物質は後出表８において、公知でなく有意な物である。
  又、乳癌検出用の前記癌用唾液バイオマーカーの組合せの一例として、N-アセチルフェニルアラニン、N-アセチルスペルミジン、クレアチンの組合せを用いることができる。ただし、他の組合せや組合せの方法論を変えて予測を行うこともできる。
  又、口腔癌検出用の前記癌用唾液バイオマーカーとして以下の物質、又は、その組合せの唾液中の濃度を使うことができる。グリシル－グリシン（Gly-Gly）、シトルリン（Citrulline）、ガンマ－ブチロベタイン（gamma-Butyrobetaine）、3‐フェニルラクタート（3-Phenyllactate）、酪酸（Butanoate）、ヘキサン酸（Hexanoate）、メチオニン（Met）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、スペルミジン（Spermidine）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン酸（Asp）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、アラニン－アラニン（Ala-Ala）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-,N8-ジアセチルスペルミジン（N1,N8-Diacetylspermidine）、N8-アセチルスペルミジン(N8-Acetylspermidine)、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、N-アセチルアスパラギン酸（N-Acetylaspartate）、アデニン（Adenine）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxypentanoate）、プトレシン (Putrescine(1,4-Butanediamine))、3-ホスホグリセリン酸バリウム（3PG）、3-フェニルプロピオン酸(3-Phenylpropionate)、セリン（Ser）、1-メチルニコチンアミド（1-Methylnicotinamide）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸（3-Hydroxy-3-methylglutarate）、グアニン（Guanine）、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（3-(4-Hydroxyphenyl)propionate）、4-安息香酸メチル（4-Methylbenzoate）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、アルファ-アミノアジピン酸(alpha-Aminoadipate)、 N6-アセチルリシン(N-epsilon-Acetyllysine)、 グルコサミン(Glucosamine)、 シスチン(Cystine)、カルノシン（Carnosine）、ウロカニン酸（Urocanate）、フェニルアラニン（Phe）、2-デオキシリボース-1-リン酸（2-Deoxyribose 1-phosphate）、シチジン5'-一りん酸二ナトリウム（CMP）、p-ヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenylacetate）、ポリヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、7-メチルグアニン（7-Methylguanine）、イノシン（Inosine）、リシン（Lys）、ジヒドロキシアセトンりん酸（DHAP）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、カルバモイルアスパラギン酸（Carbamoylaspartate）、クレアチニン（Creatinine）、N-メチル-2-ピロリドン（1-Methyl-2-pyrrolidinone）、ピルビン酸（Pyruvate）、プロピオン酸（Propionate）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、N-アセチルオルニチン（N-Acetylornithine）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、クレアチン（Creatine）、ホモセリン（Homoserine）、フマル酸（Fumarate）、グリシン（Gly） 、N1,N12-ジアセチルスペルミン(N1,N12-Diacetylspermine)。
  上記物質は後出表９において、公知でない物である。　
　本発明は、又、唾液試料を採取する工程と、採取した唾液試料中の前記癌用唾液バイオマーカーを検出する工程を含むことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの測定方法を提供するものである。
　本発明は、又、唾液試料を採取する手段と、採取した唾液試料中の前記癌用唾液バイオマーカーを検出する手段を備えたことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの測定装置を提供するものである。
　本発明は、又、唾液試料を限外ろ過する手順と、限外ろ過後の唾液試料中のイオン性代謝物を網羅的に測定する手段と、測定された代謝物の濃度に基づいて、健常者と膵疾患者を見分ける能力の高い物質を選定する手順を含むことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの特定方法を提供するものである。
　ここで、前記癌用唾液バイオマーカーの選定に際して、測定された代謝物間の相関値を計算し、最も多くの物質と相関する物質の濃度で各物質の濃度を正規化することができる。
　又、数理モデルを用いて、前記癌用唾液バイオマーカーの組合せを決定することができる。
　本発明によれば、非侵襲で簡便に採取できる唾液を用いて、膵癌だけでなく、ＩＰＭＮや慢性膵炎を含む膵疾患、乳癌、口腔癌などを早期に検出することが可能となる。特に、ポリアミンと他の新規物質との組合せで、高精度の予測が可能になる。
本発明の実施例におけるバイオマーカーの決定手順を示す流れ図 同じく唾液中代謝物の相関ネットワークを示す図 同じく数理モデルの開発手順を示す流れ図 同じく膵癌を健常者から見分ける決定木(Decision Tree)のモデルを示す図 同じく濃度マーカーで正規化した代謝物濃度を用いた場合の膵癌を健常者から見分ける数理モデルの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図 同じく健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）を分類するモデルで、健常者と膵癌と慢性膵炎（ＣＰ）とＩＰＭＮも含めて、膵癌のリスクをプロットした図 同じく濃度マーカーの絶対濃度をそのまま利用した場合の膵癌を健常者から見分けるＭＬＲモデルで変数選択に変数増減法を用いた場合の図 同じく濃度マーカーの絶対濃度をそのまま利用した場合の膵癌を健常者から見分けるＭＬＲモデルで変数選択に変数増加法を用いた場合の図 同じく唾液中アミノ酸の総濃度の例を示す図 乳癌患者を健常者から識別するためのＭＬＲモデルで変数をベータアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、シトルリンとした場合のＲＯＣ曲線を示す図 同じく変数をN-アセチルフェニルアラニン、N1-アセチルスペルミジン、クレアチンとした場合のＲＯＣ曲線を示す図 乳癌用バイオマーカーの濃度補正物質を決めるための代謝物間のネットワーク図 健常者と乳癌患者の間で有意差があった物質の中でポリアミン類に属する物質を示す図 健常者と乳癌患者の間で有意差があった物質の中でポリアミン類以外の物質の例を示す図 濃度補正の有無に関わらず健常者と乳癌患者で有意差があった物質のｐ値が小さかった上位５物質とＲＯＣ曲線を示す図 Glyを補正マーカーにした根拠を示す相関ネットワーク図 口腔癌の手術時に得られる癌組織検体と、その近傍の健常組織検体の代謝物濃度を示す図 口腔癌患者の唾液採取方法を変えた場合の健常者の唾液との濃度の違いを示す図
　以下、本発明を好適に実施するための形態（以下、実施形態という）につき、詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。また、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要素には、当業者が容易に想到できるもの、実質的に同一のもの、所謂均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。
　まず、図１を参照しながら膵疾患用バイオマーカーの決定手順について説明する。
１．唾液提供者
　膵癌患者の病期ステージの異なる唾液サンプルと、健常者、また、特異性の評価のため、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、および慢性膵炎患者の唾液検体、合計１９９検体を収集した。各群の症例数、男女の構成、年齢を表１に示す。すべて治療前の症例で化学療法の治療履歴のない症例を対象とした。表１中の欠損数は、値がわからない症例数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．唾液の採取方法（図１のステップ１００）
○採取日に関して
　できるだけ手術の当日以外に採取を行う
○食事に関して
　前日２１：００以降、水以外飲まない
　当日朝食を取らない
○当日、唾液採取までに気をつけること
　唾液採取は朝食前でＡＭ８：３０～１１：００の間に行う
　唾液採取の１時間以上前に、歯磨き粉なしで歯磨きする
　唾液採取の１時間前は激しい運動を行わない
　口腔内の手入れ（爪楊枝の使用など）を行わない
　煙草も吸わない
　水以外飲まない
○唾液採取の方法
　唾液採取前に水で口内をゆすぎ、非刺激性の混合唾液を採取する。
　唾液は意図的に出さず、自然に垂れてくるものだけを採取する（吐唾法）。あるいは、口内に唾液がある程度たまった時点（時間の目安は３分程度）でストローをくわえ、チューブに唾液を流しだす（Passive Drool法）。顔を下に向け、ストローを垂直にして口内の唾液を押し出せば、自然と垂れ流れ易いが、ストローの中間で唾液が付着して下に落ち切らない場合、息で押し出す（口をチューブに開けっぱなしにするより、ある程度口の中に唾液をためてから、一度にチューブに落としたほうが集めやすい）。
（できれば）２００μＬ以上採取する。
　唾液採取時、できるだけチューブは氷上に置き低温を保つ、１５分以内に採取を終える（１５分で２００μＬ集まらない場合でも、切り上げる）。
　５分以内に氷上から－８０度あるいはドライアイスで凍結保存する。
ポリプロピレン素材のチューブとストローで唾液を採取する。
　なお、唾液の採取方法は、上記に限定されず、他の方法で採取することも可能である。
３．唾液の代謝物質測定のための前処理方法（図１ステップ１１０）
　唾液サンプルを４００μＬとり、これを、限外ろ過フィルター（分画分子量５，０００Ｄａ）にとり４℃，９,１００ｇで３．５時間遠心分離を行う。ろ液の４５μＬとメチオニンスルホン（Methionine sulfone）、2-モルホリノエタンスルホン酸・一水和物(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)、ＣＳＡ(D-Camphor-10-sulfonic acid)、ナトリウム塩、3-アミノピロリジン（3-Aminopyrrolidine）、トリメシン酸塩（Trimesate）が各２ｍＭとなる水溶液５μＬを混合して５０μＬのサンプルとし、次の方法により測定した。
４．キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ-ＴＯＦＭＳ）での唾液中代謝物の絶対濃度の測定（図１のステップ１２０）
　ＣＥ－ＭＳを用いたメタボローム解析によって、唾液からイオン性代謝物を同定・定量した。
　測定方法は、非特許文献６に記載の方法に従った。以下にパラメータを記載する。
１）陽イオン性代謝物質測定モード
・ＨＰＣＥ
キャピラリー：フューズドシリカ、内径５０μｍ×長さ１００ｃｍ
バッファ：１Ｍ蟻酸（Formate）
電圧：ポジティブ、３０ｋＶ
温度：２０℃
注入：加圧注入　５０ｍｂａｒ、５秒(約３ｎＬ)
測定前の洗浄：３０ｍＭ、ｐＨ９．０の蟻酸アンモニウム（Ammonium Formate）で５分、Milli-Q水で５分、バッファーで５分
・ＴＯＦＭＳ
極性：ポジティブ
キャピラリー電圧：４，０００Ｖ
フラグメンター電圧：７５Ｖ
スキマー電圧：５０Ｖ
ＯＣＴ　ＲＦＶ：１２５Ｖ
ドライガス：窒素（Ｎ２）、１０Ｌ／分
ドライガス温度：３００℃
ネブライザーガス圧力：７psig
シース液：５０％ MeOH / 0.1μM Hexakis (2,2-difluoroethoxy) phosphazene含有水
流速：１０Ｌ／分
リファレンスｍ／ｚ：2MeOH　13C同位体 [M+H]+m/z66.063061,
Hexakis(2,2-difluoroethoxy)phosphazene [M+H]+m/z622.028963
　２）陰イオン性代謝物質測定モード
・ＨＰＣＥキャピラリー：COSMO(+)、内径５０μm×長さ１０、６ｃｍ
バッファ：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．５
電圧：ネガティブ、３０ｋＶ
温度：２０℃
注入：加圧注入５０ｍｂａｒ、３０秒、(約３０ｎＬ)
測定前の洗浄：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ３．４で２分間洗浄、５０ｍＭ、ｐＨ8.5の酢酸アンモニウムで５分間洗浄
・ＴＯＦＭＳ
極性：負
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ
フラグメンター電圧：１００Ｖ
スキマー電圧：５０Ｖ
ＯＣＴ ＲＦＶ：２００Ｖ
ドライングガス：窒素（Ｎ２）、１０Ｌ／分
ドライングガス温度：３００℃
ネブライザーガス圧力：７psig
シース液：5mM酢酸アンモニウム入り５０％MeOH / 0.1μM Hexakis (2,2-difluoroethoxy) phosphazene含有水
流速：１０μＬ／分
リファレンスｍ／ｚ：2[CH3COOH] 13C同位体[M-H]-m/z120.038339, 
Hexakis(2,2-difluoroethoxy) phosphazene +CH3COOH [M-H]- 680.035541
ＥＳＩニードル：白金
　なお、陽イオン性代謝物質測定の前に陰イオン性代謝物質測定を行っても良い。
５．ノイズの除去（図１のステップ１３０）
　測定日によって値の変動の大きな物質や、代謝物由来ではない信号などを除去する。
　最初に測定データから信号ノイズ比が１．５以上のピークを全て検出した。商用で入手可能な標準物質を唾液検体測定前に測定し、質量分析装置から得られる質量電荷比（ｍ／ｚ）の値と、移動時間が一致するピークに物質名を割り振り、同定を実施した。定量は、各ピークのピーク面積を内部標準物質の面積で割って、質量分析装置の測定感度の振れを補正し比ピーク面積を算出し、唾液検体内の比ピークと面積と、標準物質の比ピーク面積の比率を用いて絶対濃度を計算した。
６．各群で検出数の多い物質を選定（図１のステップ１４０）
　各群で３０％以上の症例（例えば、１０人中３人）でピークが検出できた物質だけを選別した。
７．群間で統計的な有意差のある物質を選定（図１のステップ１５０）
　通常の検定（今回はMann-Whitney検定）を実施した後、False Discovery Rate（ＦＤＲ）を用いて、Ｐ値を補正しＱ値を計算し、Ｑ値でＱ＜０．０５と有意差のある物質を選別した。
　この手順により選定された物質が請求項３に記載した物質である。
８．唾液中の総代謝物の濃度を推測して濃度補正するための物質を選出（図１のステップ１４２）
　測定した全検体（健常、乳癌、口腔癌、ＩＰＭＮ、膵癌を含む）にて、定量した代謝物の定量値を用いて代謝物間の相関値を総当たりで計算した。ピアソン相関係数（Ｒ）でＲ≧０．８を満たす物質の組合せを列挙する。最も多くの物質がお互いに相関する代謝物群の中から、更に最も多くの物質と相関する物質を選出した。
　図２に唾液中代謝物の相関ネットワーク図の一例を示す。
９．濃度補正後の物質で統計的な有意差のある物質を選定（図１のステップ１５２）
　各物質の濃度をステップ１４２で選別した物質の濃度で補正した値により、通常の検定（今回はMann-Whitney検定）を実施した後、False Discovery Rate（ＦＤＲ）を用いて、Ｐ値を補正しＱ値を計算し、Ｑ値でＱ＜０．０５と有意差のある物質を選別した。
　次に、図３を参照して、健常者と膵癌を識別する数理モデルの開発手順を説明する。
　図１のステップ１５０又はステップ１５２で選定したマーカーを用いて、ステップ２００で変数が無い状態から数理モデルである多重ロジスティック回帰モデル（ＭＬＲモデル）を開発した。この多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析では、目的変数である比率Ｐに対して、ｋ個の説明変数ｘ１、ｘ２、ｘ３、・・・、ｘｋを使って、
　Ｉｎ（Ｐ／１－Ｐ）＝ｂ０＋ｂ１ｘ１＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋・・・＋ｂｋｘｋ　
…（１）というＰの回帰式を求める。
　具体的には、ステップ２１０で、例えばステップワイズ変数選択の変数増減方法を用いて、お互いに相関しない独立で最小の変数の組合せを選択した。変数を追加するときのＰ値を０．０５、変数を除去するときのＰ値も０．０５とし、変数ｘｉを選択した。
　次いでステップ２２０に進み、データを学習用と評価用に分割した後、ステップ２３０で学習用データでモデルを作り、評価用データで評価した。図３中のループ１で構成されるクロスバリデーションの中でステップ２２０とステップ２３０を繰り返した。
　選択したモデルを用いてステップ２４０で受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を実施し、ＲＯＣ曲線以下の面積（ＡＵＣ）とともに、９５％信頼区間（ＣＩ）を計算してモデルを評価した。また、ＲＯＣ曲線で、Ｙ＝Ｘ＋α(αは定数)の曲線を描き、αの数値を１から０に向かって小さくしてゆき、ＲＯＣ曲線と最初に接するところでαの値を決め、最適カットオフ値を決定した。
　次いでステップ２５０に進み、クロスバリデーションの結果で最も精度の良いモデルを選択した。
　ここでは、ステップワイズ法を用いているが、ステップワイズ法にも変数増加、変数増減、変数減少と３種類あり、Ｐ＜０．０５の閾値で変数を追加するなど、閾値の調整もあるので、図３中の大きなループ２で何度もモデルを作って、一番精度の良いものを選ぶことができる。
　具体的には、ＭＬＲモデルの評価として、乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮの唾液に関しても、膵癌（ＰＣ）のリスクの値を計算した。また、健常者（Ｃ）とＣＰとＩＰＭＮを１つの群とし、この群から膵癌を識別できるＡＵＣ値を計算した。また、データをランダムに１０分割して、９０％のデータを用いてモデルを作り、残り１０％の値でモデルの評価を行い、これを１０回繰り返して、全ての症例が１度は必ず評価側に選ばれるようにし、評価データを集めてＡＵＣ値を計算するクロスバリデーション（ＣＶ）も実施した。
　１０．探索した物質と、膵癌を識別するモデルの結果図１のステップ１２０にて定量した代謝物に対し、ステップ１４２でお互いに相関関係の高い値を示した物質を図２に示した。図２では、Ｒ≧０．８となる物質間に線を結んでいる。８つのクラスター（代謝物の集団）がみられるが、図中の一番左上のクラスターが一番多くの物質を含む。この中でもアラニン（Ala）が他の物質と最も多くネットワークで結ばれているため、本物質を、唾液全体の濃度を正規化するための代謝物とする。なお、正規化に用いる代謝物は、他の物質と最も多くネットワークで結ばれている物質に限定されない。例えば、代謝濃度の総量や、ＣＥ－ＭＳで唾液測定時に得られるシグナルの総和（Total Ion Electropherogram）、または検出した全てのシグナルを大きさ順に並べてその中央の順位に位置するピークの面積を正規化に用いることも可能である。また、変数選択と数理モデルもステップワイズ法とＭＬＲに限定されない。
　例えば変数選択では、Correlation-based Feature Subset法（M. A. Hall (1998). Correlation-based Feature Subset Selection for Machine Learning. Hamilton, New Zealand.参照）、Relief法（Marko Robnik-Sikonja, Igor Kononenko (1997). An adaptation of Relief for attribute estimation in regression. In: Fourteenth International Conference on Machine Learning, 296-304.参照）、SVM変数選択法（I. Guyon, J. Weston, S. Barnhill, V. Vapnik (2002). Gene selection for cancer classification using support vector machines. Machine Learning. 46(1-3): 389-422.参照）などでも適応可能である。
　数理モデルでは、２群を分ける機械学習法の適応も可能である。例えば、ベイズ推定（Berger, James O (1985). Statistical Decision Theory and Bayesian Analysis. Springer Series in Statistics (Second ed.). Springer-Verlag. ISBN 0-387-96098-8.参照）、ニューラル・ネットワーク(ANN)(D. E. Rumelhart, G. E. Hinton, and R. J. Williams, (1986): Learning representaions by back-propagating errors, Nature, 323-9, 533-536.参照)、サポートベクターマシン(SVM)(J. Platt (1998) Fast Training of Support Vector Machines using Sequential Minimal Optimization. In B. Schoelkopf and C. Burges and A. Smola, editors, Advances in Kernel Methods - Support Vector Learning, 参照)、Alternative decision tree (ADTree)(Yoav Freund and Llew Mason (1999) The Alternating Decision Tree Algorithm. Proceedings of the 16th International Conference on Machine Learning, 124-133、及び、Freund, Y., Mason, L. (1999) The alternating decision tree learning algorithm. In: Proceeding of the Sixteenth International Conference on Machine Learning, Bled, Slovenia, 124-133参照)、決定木(Ross Quinlan (1993). C4.5: Programs for Machine Learning. Morgan Kaufmann Publishers, San Mateo, CA参照)、PARTモデル(Eibe Frank, Ian H. Witten (1998) Generating Accurate Rule Sets Without Global Optimization. In: Fifteenth International Conference on Machine Learning, 144-151.参照)、Random forest、PLS判別分析(Partial least squares-discriminant analysis; PLS-DA)(Lindgren, F; Geladi, P; Wold, S (1993). The kernel algorithm for PLS. J. Chemometrics 7: 45-59. doi:10.1002/cem.1180070104.参照)、Orthogonal PLS判別分析(OPLS-DA)(Trygg, J., & Wold, S. (2002). Orthogonal projections to latent structures (O-PLS). Journal of Chemometrics, 16(3), 119-128、及び、Breiman, Leo (2001). Random Forests. Machine Learning 45 (1):5-32. doi:10.1023/A:1010933404324.参照)などでも適応可能である。また、これらの２群を分ける機械学習法を複数生成して、複数の数理モデルの予測値の平均や多数決を用いて予測するBootstrap法やBagging法(Breiman, Leo (1996) Bagging predictors. Machine, Learning24 (2): 123-140参照)を用いることも可能である。更に、教師なし学習である主成分分析(Principal Component Analysis; PCA)(Hotelling, H. (1933). Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology, 24, 417-441.参照)の主成分を用いて分離することも可能である。図４は、膵癌を健常者から見分ける決定木のモデルである。代謝物の濃度は濃度マーカー（ここではAla）で正規化したものを利用した。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８５６、１０分割クロスバリデーション時で０．６５３となった。
　前項９．のステップ１５２で健常者と膵癌を見分ける能力の高い物質を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中で、検出率は、健常者と膵癌それぞれの群の中で、全症例中、何症例でピークが検出できたかという割合を示す。９５％ ＣＩ(Confidential Interval)は、９５％信頼区間の値を示す。
　健常者と膵癌の間で、健常者群と膵癌群でノンパラメトリックな２群検定であるMann-Whitney検定を実施し、代謝物ごとにｐ値を計算し、False Discovery Rate(ＦＤＲ)を用いてｐ値を補正してｑ値の検定を実施した。
　また、これらの物質が膵癌（ＰＣ）と健常者（Ｃ）の２群をどれだけ見分けられるかの感度と特異性の評価のため、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を行った。この結果を図５に示す。代謝物の濃度は、濃度マーカーで正規化したものを利用した。このＭＬＲモデルに含まれる物質と、そのパラメータとオッズ比を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図５におけるＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８７６３(９５％ ＣＩ：０．８２０９－０．９３１７，ｐ＜０．０００１)であった。また、最適カットオフ値の感度は０．８３４８、(１－特異度)は０．２１６９となった。
　健常者と膵癌を見分けることができるＭＬＲモデルを用いて、健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）だけでなく、乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮの患者の膵癌リスクを計算した値を図６に示す。
　図６は、健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）を分離するモデルで、Ｃ、ＰＣと乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮも含めて、膵癌のリスクをプロットした図であり、箱ひげ図は、上から、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％の値を示し、１０％と９０％より外側の値はプロットで表示している。
　表４にＭＬＲモデルの特異性と汎用性を評価したＡＵＣ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ここで、ＣＶはクロスバリデーションの場合である。
　また、濃度補正を行わずに、絶対濃度を用いてＭＬＲのモデルを作成したときのＲＯＣ曲線を、図７に示す。また選択されたマーカーと係数を表５に示す。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８２６４(９５％ ＣＩ：０．７６１９－０．８８７４,ｐ＜０．０００１)であり、濃度補正を実施しない場合と比べてやや精度が落ちるものの、それでも尚高い予測精度で予測が可能であった。また、本モデルの作成には、ステップワイズ変数選択の変数増減方法を用いて、変数を追加するときのＰ値を０．０５、変数を除去するときのＰ値も０．０５としたが、変数選択の方法として変数増加方法を用いて、変数を追加するときのＰ値を０．０５とした場合のＲＯＣ曲線を図８に示す。また、選択されたマーカーと係数を表６に示す。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８３７３（９５％　ＣＩ：０．７７９２－０．８９５４，ｐ＜０．０００１）であり、図７のモデルと異なるマーカーや係数を用いているにも関わらず同水準の予測精度を出すことができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
１１．探索した物質に対する考察
　本発明では、唾液に含まれるイオン性代謝物の濃度を一斉に測定し、健常者と膵癌を識別できる能力の高いマーカーを選出した。更にこのマーカーの組合せにて、単一の物質よりもより精度（感度と特異度）の高いモデルを開発することができた。
　唾液を扱う問題点として、血液に比べて濃度変動が大きいことがあげられる。本方法では、採取時間や採取前の食事制限によって、統一された条件で唾液を採取したが、それでもなお、明らかに全物質が濃い、または、薄い傾向にあるサンプルがあった。図９に唾液中のアミノ酸の総濃度の疾患ごとの違いを示す。箱ひげの意味は図６と同じである。検定はノンパラメトリックの多重検定であるクラリカル・ウォリス（Kruskal-Wallis）で実施し、Ｐ＝０．０１３８であった。またこの後Ｄｕｎｎのポスト検定を実施したところ、ＣとＰＣの間だけｐ＜０．０５であった。
　膵癌（ＰＣ）は健常者（Ｃ）に比べて有意に濃度が高く、唾液中の総濃度が高いことそのものも膵癌のリスクを示す指標として利用できる可能性がある。ただし、ＣでもＰＣより濃度の高い検体や、逆にＰＣでもＣより濃度の低い検体も存在するため、単純にこれらをリスクとして扱っても精度が悪い（図８のデータでＣとＰＣ間でＲＯＣ解析をした結果では、ＡＵＣ＝０．６２８２,ｐ＝０．００４７５６となる）。
　このため、これら（Ｃで濃度が高い、ＰＣで濃度が低い)検体を除外して濃度が一定の範囲内の検体だけを検査対象とする場合は、濃度全体も考慮できるが、検査対象の症例を減らさなければならない。このため、図２に示す方法にて、唾液の代謝物濃度全体に相関が高く、全検体で検出できる物質で正規化して全体濃度の変動をキャンセルしたうえでマーカー物質を探索した。なお、正規化を省略することも可能である。
　マーカーとして候補になった表２中の物質の内、スペルミンなどのポリアミン類と、N8-アセチルスペルミジン、N1-アセチルスペルミジン、N1-アセチルスペルミンなど、ポリアミンのアセチル化した物質は、様々な癌での変動とともに、膵臓の状態を反映する物質ではあるが、例えば尿中のスペルミンなどは、濃度補正をクレアチニンで行うだけしか考慮しておらず、血液検査で腫瘍マーカーを測定することに匹敵する精度は達成できていない。更に血液ではポリアミン類は赤血球に取り込まれているために(Fu NN, Zhang HS, MaM, Wang H. (2007) Quantification of polyamines in human erythrocytes using a new near-infrared cyanine 1-(epsilon-succinimidyl-hexanoate)-1'-methyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium with CE-LIF detection. Electrophoresis. 28(5): 822-9.参照)、遊離した状態での存在量が極めて少なく、尿でも濃度が極めて薄い。乳癌で血液や尿中のポリアミン類を測定しても、最も濃度が高いスペルミジンで約１４０ｎＭ(ナノモル)で、N-アセチルスペルミジンでは約６４ｎＭ（ナノモル）と、唾液中の濃度よりもきわめて低いことが報告されている(Byun JA, Lee SH, Jung BH, Choi MH, Moon MH, Chung BC. (2008) Analysis of polyamines as carbamoyl derivatives in urine and serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 22(1):73-80.参照)。また赤血球中のポリアミン類の定量には複雑な工程も要求される。このため、本発明で検出した診断法は、マーカー物質を高濃度で検出できる唾液で行うこと、また、測定のために行う処理工程が簡便なために測定ごとに発生するばらつきを小さくすること、マーカーを組み合わせて数理モデルを用いる３点が寄与して高精度な予測が達成されることが特徴的な点である。また、唾液中のｍＲＮＡが膵癌患者と健常者の間で違いがあることは既知の事実である（非特許文献４）が、本発明が対象とする分子群は代謝物であり、全く異なる。また唾液中の代謝物そのものが膵癌で変動することは既知であるが（非特許文献５）、本発明では既知文献に含まれていない物質をマーカーとしており、更に唾液で特有の濃度変動をキャンセルし、かつ、これらの物質の組合せにより、感度と特異性の高い膵癌識別数理モデルを開発することができた。
　健常者、慢性膵炎、ＩＰＭＮ、膵癌の４群に関して、ＭＬＲモデルが予測する膵癌のリスク分布から本モデルが膵癌に高い特異性を示すことがわかる（図６）。また、クロスバリデーション（表４）の結果や、膵癌と膵癌以外の群を分ける試験の結果からも、本モデルが従来の方法では達成できない高い感度と特異性を持っていることも示している。
　また実施例では、唾液中の代謝物の測定に、キャピラリー電気泳動―質量分析（ＣＥ－ＭＳ）法を用いたが、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、チップＬＣや、チップＣＥ、それらに質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＧＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ、ＣＥ－ＭＳ法、各種のＭＳ単独の測定法、ＮＭＲ法、代謝物質を蛍光物質やＵＶ吸収物質に誘導体化してから測定する方法、抗体を作成してＥＬＩＳＡ法などで測定する、酵素法を用いるなど、測定法にこだわらず、あらゆる分析法で測定することが可能である。
  次に乳癌用のバイオマーカーについて説明する。
  症例としては、健常者（２０症例）、治療開始前の乳癌患者（３７症例）、化学療法やホルモン療法などの治療を受けた方を含む乳癌患者（９０症例）で、乳癌で１症例だけ男性を含み、残りは全て女性症例を採用した。治療開始前の乳癌患者は８症例がＤＣＩＳ、２９症例が浸潤性乳管癌である。
  唾液の採取方法、代謝物の測定方法などは、膵癌のものと同じとした。
  多重ロジスティック回線モデル（ＭＬＲモデル）を作成するときに行う変数選択法として、Ｑ値≦０．０５の物質のみを用いた。図１０では、変数増減法により、Ｐ≦０．０５で変数追加、Ｐ≧０．０５で変数削除として、ベータアラニン(Beta-Ala)、N-アセチルフェニルアラニン(N-Acetylphenylalanie)、シトルリン(Citrulline)を用いた。図１１では、公知のマーカーとして知られているN1-アセチルスピルミジン(N1-Acetylspermidine)を含み、変数増減法により、Ｐ≦０．０５で変数追加（増加）を行う方法で、N-アセチルフェニルアラニン、N1-アセチルスピルミジン、クレアチン(Creatine)を採用した。図１０のモデルでは、個々の物質のＲＯＣ値は、ベータアラニンが０．８３７３、N-アセチルフェニルアラニンが０．７１２２、シトルリンが０．６９８であり、これらをＭＬＲモデルにすることで、０．９６２２に向上する。また公知のマーカーを含む図１２でも、N-アセチルフェニルアラニンが０．７１２２、N-アセチルスペルミジンが０．７８１１、クレアチンが０．７８２４であったのが、これらをＭＬＲモデルにして組合わせると、０．９３６５に向上することが確認できた。
  乳癌と健常者の間で絶対濃度で、統計的有意差（Mann-Whitney検定でｐ＜０．０５）を示す物質を表７－１、表７－２、表７－３、表７－４に示す。健常者は２０症例、乳癌患者は化学療法やホルモン療法などが行われていない治療前の患者（３７症例）と、全症例（９０症例）の両方のケースで比較を実施した。Ｑ値はFalse Discovery Rate（ＦＤＲ）にて計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  公知と記載した項目に７と８と記載がある物質は、非特許文献７と８で公知の物質である。
  次いで、図１０に示す治療開始前の乳癌患者（３７症例）を健常者（２０症例）の代謝物でＲ２＞０．９２で相関を示す代謝物間に線を引いたネットワーク図を作成し、この中で他の物質と多くを結合線を持つ物質で、全検体で検出できている物質グルタミン（Gln）を、濃度補正物質として選択した。図中に○で示す。
  そして、乳癌と健常者の間で相対濃度で、統計的有意差（Mann-Whitney検定でｐ＜０．０５）を示す物質を表８－１、表８－２、表８－３、表８－４に示す。相対濃度の計算には、各物質をグルタミンの濃度にて割り、無単位の値とした。
  今回唾液の含まれる代謝物を数多く測定したため、個々の物質の有意差を計算するために、（例えばMann-Whitney検定などで）独立した統計を繰り返す必要がある。従って、有意水準α=０．０５にて検定を繰り返すと、偶然棄却される帰無仮説が増えるため、False Discovery Rate (ＦＤＲ)の方法（Storey, J. D., & Tibshirani, R. (2003). Statistical significance for genomewide studies. Proceedings of the National academy of Sciences of the United States of America, 100, 9440-9445）を用いて、Ｐ値を補正し、Ｑ値を計算した。例えばＱ値が０．５の場合は、Ｐ＜０．０５で棄却された帰無仮説のうち、真の帰無仮説が半分含まれていることになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　このように、最も多くの代謝物と相関を示す物質で、かつ全検体で検出可能な物質を濃度補正マーカーとしてグルタミンを用いることで、高齢な患者の唾液など全体濃度が高くなる場合も、本方法を用いて濃度変動の影響を差し引いて癌と健常者を見分けることができる。一方、７０歳以上では唾液の全体の濃度が上昇する傾向にあるため、絶対濃度を用いる場合は、７０歳未満のデータだけを使ってモデルを構築することで高精度な分離が行える。
　健常者(Ｃ、ｎ=２０)と乳癌患者（ＢＣ、治療前だけでなく全症例を含むｎ=９０）の間で、有意差のあった物質の中でポリアミン類に属する物質を図１３に示す。
　又、健常者(Ｃ、ｎ=２０)と乳癌患者（ＢＣ、治療前だけでなく全症例を含むｎ=９０）の間で、有意差のあった物質の中でポリアミン類以外の物質例（Ｐ値が小さかったものから上位５位）を図１４に示す。
　又、濃度補正有り無しのいずれでも健常者(Ｃ、２０症例)と乳癌患者(ＢＣ、９０症例)で有意差(ｐ＜０．０５)のあった物質を図１５に示す。全検体（Ｃ、２０症例とＢＣ、９０症例）の全症例を用いてネットワーク図を作成し（図１６に示す）濃度補正物質Gly（グリシン、図中に○にて示す）を決定した。この濃度補正マーカーにて濃度補正をしない場合７３物質が有意差を示し、濃度補正（対象となる代謝物の濃度をGlyの濃度で割る）をした場合、３５物質が有意差を示し、その中で１１物質が濃度補正ありでもなしでも有意差を示した。この中でＰ値が小さかった上位５物質を示す。また、Spermineと6-Hydroxyhexanoateの２物質を用いてＭＬＲモデルを作成したときのＲＯＣ曲線を右下に示す。
　次に、口腔癌用のバイオマーカーについて説明する。
　表９－１、表９－２は、口腔癌と健常者の唾液の代謝物に関して絶対濃度で、違いを示す物質である。健常者は２０症例、乳癌患者は(２０症例)。健常者は食後１．５時間の唾液採取で、癌患者は食前（前夜から絶食状態）と食後１．５時間に採取の２回を実施した。このどちらかの比較でMann-Whitney検定でP値を計算し、更にFalse Discovery Rate(ＦＤＲ)にてＱ値を計算して、Ｑ＜０．０５となる物質を列挙した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　公知と記載した項目に７、９と記載がある物質は、非特許文献７と９に示されている物質である。
　ここで、口腔癌患者はステージＩ～ＩＶaまでを含み、口腔扁平上皮癌（１７症例）、悪性黒色腫（２症例）、腺様のう胞癌（１症例）を含む。尚、スペルミン、スペルミジン、またはこれらのアセチル化した物質は手術時に得られる口腔癌検体と近傍の健常部位の比較でも濃度が高く整合性が取れている。
　例えばこの中のコリン（表で上から２番目）は、文献７と９にて公知の物質であり、唾液中で物質の濃度上昇が確認されているが、膵癌や乳癌と同一の手法にて複数の新規マーカーを組み合わせた数理モデルにより、より高精度に口腔癌を識別することができる。また、本物質は口腔癌で上昇するものの、乳癌で上昇しないため、数理モデルの中の変数に含めることで、癌種の特異性を出すことができる。
　口腔癌の手術時に得られる癌組織検体と、その近傍の健常組織検体の代謝物濃度（ここでは組織重量で補正したμM/gを使用）を図１７に示す。図左部分が健常組織で、右側が癌組織である。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖｉａは癌の進行度（グレード）を表す。健常部分と癌部分で有意差があった物質の一部である。
　又、口腔癌の唾液採取方法を変えた場合の健常者（Ｃ）の唾液との濃度の違いを図１８に示す。健常者も口腔癌患者の唾液の比較で、最もＰ値が小さかったCholine（コリン）を例として表示している。健常者(Ｃ)は食後１．５時間に採取、口腔癌は同じ患者からＰ１は食後１．５時間、Ｐ２は食後３．５時間、Ｐ３は絶食時（朝食前）に採取した。
　表１０は、健常者１７名、膵癌２１名、乳癌１６名、口腔癌は２０名を全て絶食時（前日夜９時から空腹で、採取当日は食事なし）に採取した唾液で、液体クロマトグラフィー・質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）を使い、ポリアミン類及びヒポキサンチンに関して絶対濃度を測定した結果である。平均値の違いを評価するためのP-valueは、症例数が少ないためパラメトリックな検定であるStudent’ｓt-testにて算出している。
　ポリアミン及びポリアミン以外の代謝物としてヒポキサンチン（Hypoxanthine）の定量結果を表１０に示す。ポリアミン類の中でもN1, N12-Diacetylspermine（N1、N12－ジアセチルスペルミジン）はCE-TOFMSで測定した場合、他の物質とピークが重なるが、LC-qTOFMSの場合はこれらを別々のピークとして測定することができる。ここでは、全て絶食時に採取した検体のみを用いて、健常者１７症例、膵癌２１症例、口腔癌１８症例、乳癌１６症例に関して測定した定量値を掲載した。(定量値の単位はμM)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　ＬＣ－ＭＳ用の唾液の処理は以下の通りである。
　１）２ uM MESになるように調整したMeOH +NH4OH 270uLに, －８０℃保存していた唾液を溶解し、３０ｕＬ加えて撹拌する。
　２）４℃、 １５，０００ ｒｐｍで１０分遠心分離をし、 上層を全量別チューブへ移動する。
　３）その液体全量を遠心濃縮したものに90%MeOH 18uL, BrateBuffer 12uL加えて再溶解する。
　４）うち５ｕＬをＬＣ－ＭＳ測定に、２０ｕＬをELAISA測定に使用する。
　５）LC-MS測定では上記の５ｕＬの溶液に、4uM Methionine-sulfone を含むMilliQ水１０ｕＬ加え希釈したものをサンプルとする。
　ＬＣ－ＭＳの測定条件は以下の通りである。
LC system     : Agilent Technologies １２９０ infinity
Mobile phase  : Solvent A;Water containing 1% Formic acid 
              : Solvent B; Acetonitrile containing 0.1% formic acid
Flow rate     : ０．５ mL/min
Gradient [min. (%B)] : 0(98)-1(98)-3(55)-5(5)
Stop time:    ７ min
Post time:    ３ min
Column : CAPCELL CORE PC (Shiseido: ２．１ｍｍ×50ｍｍ, ２．７ｍｍ)
Column temp.  : ５０ ℃
Injection volume     : 1 ・Ｌ
MS            : Agilent Technologies G6230A 
Gas temp      :３５０ ℃
Gas flow      :１３ Ｌ／ｍｉｎ
Neblizer Gas  :５５ psig
Fragmentor    :１５０
Skimmer       :９０
OCT1 RF Vpp   :２００
VCap          :３５００
Reference     :１２１．０５０８７３, ９２２．００９７９８
Mode          : Positive
　本発明により、唾液の濃度を相関ネットワークのデータ解析で補正（正規化）することで、濃度の影響を軽減でき、濃度変動の大きな唾液でも、健常者から膵癌を見分けることができる。また、本方法は慢性膵炎やＩＰＭＮ、乳癌、口腔癌の予測も可能とする。
　さらに、唾液濃度を反映する濃度補正マーカーの値で、本発明のマーカーによる検査が実施できる範囲を決め、範囲外の唾液は検査対象外とし、範囲内のものだけは、絶対濃度あるいは補正を行った相対濃度のマーカーの組合せの数理モデルで健常者と各癌疾患者を見分けることも可能である。
　濃度変動の大きな唾液でも、健常者から膵癌、乳癌、口腔癌等の早期発見が可能になる。
　　 










　

Claims (15)

  1. 　唾液試料の代謝物である低分子化合物のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする癌用唾液バイオマーカー。
  2. 　前記癌が、膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、乳癌、口腔癌のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  3. 　N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、アデノシン（Adenosine）、3-ホスホ-D-グリセリン酸(3PG)、尿素(Urea)、o-アセチルカルニチン(o-Acetylcarnitine)、クエン酸(Citrate)、グリシル-グリシン(Gly-Gly)、5-アミノ吉草酸(5-Aminovalerate)、2-オキソペンタン酸メチル(2-Oxoisopentanoate)、リンゴ酸(Malate)、安息香酸エステル(Benzoate)、フマル酸(Fumarate)、N-アセチルアスパラギン酸(N-Acetylaspartate)、イノシン(Inosine)、3-メチルヒスチジン(3-Methylhistidine)、N1-アセチルスペルミン(N1-Acetylspermine)、クレアチン(Creatine)、アルファ-アミノアジピン酸(alpha-Aminoadipate)、ホスホリルコリン(Phosphorylcholine)、2-ヒドロキシペンタアート(2-Hydroxypentanoate)、キサンチン(Xanthine)、コハク酸(Succinate)、6-ホスホグルコン酸(6-Phosphogluconate)、ブタン酸(Butanoate)、ホモバニリン酸(Homovanillate)、O-ホスホセリン(O-Phosphoserine)、トリメチルアミン-N-オキシド(Trimethylamine N-oxide)、ピペリジン(Piperidine)、シスチン(Cystine)、2-イソプロピルリンゴ酸(2-Isopropylmalate)、N8-アセチルスペルミジン(N8-Acetylspermidine)、N1-アセチルスペルミジン(N1-Acetylspermidine)、N-アセチルノイラミン酸(N-Acetylneuraminate)、グルコサミン(Glucosamine)、スペルミン(Spermine)、アグマチン(Agmatine)、N-アセチルヒスタミン(N-Acetylhistamine)、メチオニン(Met)、p-4-ヒドロキシフェニル酢酸(p-4-Hydroxyphenylacetate)、N,N-ジメチルグリシン(N,N-Dimethylglycine)、ヒポタウリン(Hypotaurine)、グルタミン酸-グルタミン酸(Glu-Glu) 、N1,N12-ジアセチルスペルミン(N1,N12-Diacetylspermine)のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする膵疾患検出用の請求項１又は２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  4. 　N8-アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、クレアチニン（Creatinine）、スペルミン（Spermine）、アスパラギン酸（Asp）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミン（N1-Acetylspermine）、シチジン（Cytidine）、アルファ－アミノアジピン酸塩（alpha-Aminoadipate）、シトシン（Cytosine）、ベタイン（Betaine）、尿素（Urea）、ホモバニリン酸塩（Homovanillate）、N-アセチルノイラミン酸塩（N-Acetylneuraminate）、シスチン（Cystine）、ウロカニン酸塩（Urocanate）、フマル酸塩（Fumarate）、1,3-ジアミノブロパン（1,3-Diaminopropane）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、ニコチン酸塩（Nicotinate）、アグマチン（Agmatie）、バリン（Val）、2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸塩（2-Hydroxy-4-methylpentanoate）、アラニル-アラニン（Ala-Ala）、クエン酸塩（Citrate）、グルコサミン（Glucosamine）、カルノシン（Carnosine）、グリシル-グリシン（Gly-Gly）、2-アミノ酪酸（2AB）、アルギニン（Arg）、N-アセチルグルタミン酸塩（N-Acetylglutamate）、グリセロリン酸塩（Glycerophosphate）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、イソロイシン（Ile）、アデノシン（Adenosine）、グアニン（Guanine）、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）、カダベリン（Cadaverine）のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする膵疾患検出用の請求項１又は２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  5. 　クレアチニン、N1-アセチルスペルミジン、アルファ－アミノアジピン酸塩、N-アセチルノイラミン酸塩、1,3-ジアミノブロパンの組合せであることを特徴とする膵疾患検出用の請求項４に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  6. 　コリン（Choline）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyrate）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、アルファ-アミノアジピン酸（alpha-Aminoadipate）、クレアチン（Creatine）、ガンマ－ブチロベタイン（gamma-Butyrobetaine）、サルコシン（Sarcosine）、ピルビン酸（Pyruvate）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、セリン（Ser）、ホモバリニン酸（Homovanillate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、ギャバ（GABA）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxypentanoate）、カルニチン（Carnitine）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、乳酸（Lactate）、2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸（2-Hydroxy-4-methylpentanoate）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、酪酸（Butanoate）、アデニン（Adenine）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、プロピオン酸（Propionate）、ベタイン（Betaine）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、クロトン酸（Crotonate）、トリプトファン（Trp）、シトルリン（Citrulline）、グルタミン（Gln）、プロリン（Pro）、2-オキソイソペンタン酸（2-Oxoisopentanoate）、4-安息香酸メチル（4-Methylbenzoate）、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（3-(4-Hydroxyphenyl)propionate）、システイン酸（Cysteate）、アゼライン酸（Azelate）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、ピペコリン酸（Pipecolate）、フェニルアラニン（Phe）、O-ホスホセリン（O-Phosphoserine）、マロン酸（Malonate）、ヘキサン酸(Hexanoate)、p-ヒドロキシフェニル酢酸(p-Hydroxyphenylacetate）のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする乳癌検出用の請求項２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  7. 　べータアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、シトルリンの組合せであることを特徴とする乳癌検出用の請求項２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  8. 　コリン（Choline）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン(Hypotaurine)、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、アゼライン酸（Azelate）、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）、グリコール酸（Glycolate）、4-メチル-2-オキソペンタノン酸（4-Methyl-2-oxopentanoate）、N-アセチルアスペラギン酸（N-Acetylaspartate）、グリセロリン酸（Glycerophosphate）、3-ヒドロキシブチル酸（3-Hydroxybutyrate）、安息香酸（Benzoate）、アジペート（Adipate）、2-イソプロピルマレート（2-Isopropylmalate）、ホスホリルクロリン（Phosphorylcholine）、N-アセチルノイラミネート（N-Acetylneuraminate）、ヒスタミン（His）、o-アセチルカルニチン（o-Acetylcarnitine）、N-アセチルグルコサミン1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、クレアチニン（Creatinine）、アルギニン（Arg）、シリング酸（Syringate）のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする乳癌検出用の請求項２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  9. 　N-アセチルフェニルアラニン、N-アセチルスペルミジン、クレアチンの組合せであることを特徴とする乳癌検出用の請求項２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  10. 　グリシル－グリシン（Gly-Gly）、シトルリン（Citrulline）、ガンマ－ブチロベタイン（gamma-Butyrobetaine）、3‐フェニルラクタート（3-Phenyllactate）、酪酸（Butanoate）、ヘキサン酸（Hexanoate）、メチオニン（Met）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、スペルミジン（Spermidine）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン酸（Asp）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、アラニル－アラニン（Ala-Ala）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-,N8-ジアセチルスペルミジン（N1,N8-Diacetylspermidine）、N8-アセチルスペルミジン(N8-Acetylspermidine)、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、N-アセチルアスパラギン酸（N-Acetylaspartate）、アデニン（Adenine）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxypentanoate）、プトレシン (Putrescine(1,4-Butanediamine))、3-ホスホグリセリン酸バリウム（3PG）、3-フェニルプロピオン酸(3-Phenylpropionate)、セリン（Ser）、1-メチルニコチンアミド（1-Methylnicotinamide）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸（3-Hydroxy-3-methylglutarate）、グアニン（Guanine）、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（3-(4-Hydroxyphenyl)propionate）、4-安息香酸メチル（4-Methylbenzoate）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、アルファ-アミノアジピン酸(alpha-Aminoadipate)、 N6-アセチルリシン(N-epsilon-Acetyllysine)、 グルコサミン(Glucosamine)、 シスチン(Cystine)、カルノシン（Carnosine）、ウロカニン酸（Urocanate）、フェニルアラニン（Phe）、2-デオキシリボース-1-リン酸（2-Deoxyribose 1-phosphate）、シチジン5'-一りん酸二ナトリウム（CMP）、p-ヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenylacetate）、ポリヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、7-メチルグアニン（7-Methylguanine）、イノシン（Inosine）、リシン（Lys）、ジヒドロキシアセトンりん酸（DHAP）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、カルバモイルアスパラギン酸（Carbamoylaspartate）、クレアチニン（Creatinine）、N-メチル-2-ピロリドン（1-Methyl-2-pyrrolidinone）、ピルビン酸（Pyruvate）、プロピオン酸（Propionate）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、N-アセチルオルニチン（N-Acetylornithine）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、クレアチン（Creatine）、ホモセリン（Homoserine）、フマル酸（Fumarate）、グリシン（Gly） 、N1,N12-ジアセチルスペルミン(N1,N12-Diacetylspermine)のいずれか、又は、その組合せであることを特徴とする口腔癌検出用の請求項２に記載の癌用唾液バイオマーカー。
  11. 　唾液試料を採取する工程と、
    採取した唾液試料中の請求項１乃至１０のいずれかに記載の癌用唾液バイオマーカーを検出する工程と、
    　を含むことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの測定方法。
  12. 　唾液試料を採取する手段と、
    　採取した唾液試料中の請求項１乃至１０のいずれかに記載の癌用唾液バイオマーカーを検出する手段と、
    　を備えたことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの測定装置。
  13. 　唾液試料を限外ろ過する手順と、
    　限外ろ過後の唾液試料中のイオン性代謝物を網羅的に測定する手段と、
    　測定された代謝物の濃度に基づいて、健常者と膵疾患者を見分ける能力の高い物質を選定する手順と、
    　を含むことを特徴とする癌用唾液バイオマーカーの特定方法。
  14. 　前記癌用唾液バイオマーカーの選定に際して、測定された代謝物間の相関値を計算し、最も多くの物質と相関する物質の濃度で各物質の濃度を正規化することを特徴とする請求項１３に記載の癌用唾液バイオマーカーの特定方法。
  15. 　数理モデルを用いて、前記癌用唾液バイオマーカーの組合せを決定することを特徴とする請求項１３又は１４に記載の癌用唾液バイオマーカーの特定方法。
    　　
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