WO2015041264A1 - アルギン酸資化性微生物及び目的物質の製造法 - Google Patents

アルギン酸資化性微生物及び目的物質の製造法 Download PDF

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WO2015041264A1
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秀高 土井
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a novel microorganism serving as a microorganism host during fermentation production of useful substances when using seaweed biomass using microorganisms such as bacteria.
  • Fermentation methods using microorganisms are used for mass production of substances such as fuels such as ethanol and foods such as L-amino acids, feeds, and pharmaceuticals, which are industrially useful.
  • Sugars produced from food grains such as sugar cane and corn, that is, glucose, fructose, sucrose, molasses, starch hydrolysate, etc. are used as the main raw material for fermentation using microorganisms.
  • cereals and oils derived from non-food terrestrial biomass such as sugarcane, corn stalks and leaves, and Jatropha oil are also used by microorganisms due to the increase in grain prices due to the increase in food demand due to the global population increase in recent years. It is industrially useful as the main raw material source for fermentation.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Marine biomass mainly seaweed
  • Marine biomass can be produced without the use of farmland, agricultural water, and fertilizers, and among the algae, brown algae, including non-food parts, is twice the sugar cane and five times the maize fermented main ingredient production capacity per unit area It is known that there is (Non-patent Document 2).
  • Brown algae store significant amounts of sugars such as alginic acid, glucose and mannitol, which are polymerized polysaccharides of D-mannuronic acid and L-guluronic acid.
  • Non-patent document 3 Non-patent document 4, Patent document 1, Patent document 2). That is, it is considered that obtaining microorganisms capable of assimilating alginic acid is important in producing useful substances by fermentation using microorganisms from marine biomass from brown algae.
  • microorganism that can assimilate alginic acid as a single carbon source and can grow rapidly can be newly isolated and obtained, it is useful as a host microorganism for fermentation using microorganisms that produce useful substances from marine biomass. There is no known method for producing a target substance by fermentation using Vibrio spp.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of assimilating alginic acid and a method for producing a target substance by fermentation using the microorganism.
  • the inventor of the present invention has isolated Vibrio spp. That can assimilate alginic acid from the digestive tract of Sazae (scientific name: Turbo cornutus), which is considered to be ingested on a daily basis by brown algae. Furthermore, the inventors have found that amino acids can be produced by imparting amino acid-producing ability to vibrio bacteria capable of assimilating alginic acid.
  • a Vibrio bacterium having an ability to produce a target substance and having an ability to assimilate alginate is cultured in a medium containing a carbon source extracted from a carbon source obtained from a seaweed-derived biomass seaweed, A method for producing a target substance by a fermentation method, characterized in that the target substance is produced and accumulated in a medium, and the target substance is recovered from the medium.
  • the bacterium having the ability to produce the target substance and having the ability to assimilate alginate is a Vibrio bacterium having a 16S ribosomal RNA gene having a sequence having a homology of 95% or more with SEQ ID NO: 1. the method of.
  • the bacterium having the target substance-producing ability and the alginate-assimilating ability is a Vibrio bacterium having a 16S ribosomal RNA gene having SEQ ID NO: 1.
  • the Vibrio bacterium having the ability to produce the target substance and having the ability to assimilate alginic acid belongs to Vibrio arginobola.
  • the method as described above, wherein the bacterium having the target substance-producing ability and the alginic acid-assimilating ability is derived from Vibrio sp. NITE BP-01635 strain.
  • the target substance is L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, L-valine, L-leucine, glycine, L-threonine, Selected from L-serine, L-proline, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine, L-cystine, L-methionine, L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine and L-asparagine The method as described above, wherein said method is one or more amino acids.
  • the target substance is ethanol.
  • the target substance is isopropyl alcohol, acetone, propylene, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, 1-propanol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, ethylene glycol, And the method as described above, selected from the group consisting of isobutanol.
  • the bacterium is a Vibrio bacterium with enhanced activity of an L-amino acid biosynthesis enzyme.
  • the bacterium is a Vibrio bacterium having enhanced activity of a protein that excretes L-amino acids.
  • the protein excreting L-amino acid is ybjL.
  • the seaweed is a large seaweed contained in brown algae, red algae, and green algae.
  • the carbon source obtained from the seaweed is one or more carbon sources selected from alginic acid, cellulose, mannitol, pectin, galacturonic acid, carrageenan, and agar.
  • the saccharide extract obtained from the seaweed contains alginic acid and the alginic acid is hydrolyzed by pretreatment with an alginic acid hydrolase or acid, and then cultured. .
  • SA2 strain in a sodium alginate minimal medium (1: Turbidity at wavelength 600 nm of Vibrio sp. SA2 strain, 2: Turbidity at wavelength 600 nm of MG1655 strain). Maximum specific growth rate in minimal liquid medium with glucose or sodium alginate alone as carbon source. Electron micrograph of Vibrio sp. SA2 strain. Gram stain of Vibrio sp. SA2 strain (photo). Molecular phylogenetic tree based on the nucleotide sequence linked to the housekeeping gene of Vibrio sp. SA2 strain (the lower left line indicates the scale bar, and the number located at the branch of the phylogenetic branch indicates the bootstrap value).
  • the Vibrio bacterium of the present invention is a bacterium belonging to the genus Vibrio having an alginate assimilation ability, and the 16S ribosomal RNA gene has a sequence showing 95% or more homology with SEQ ID NO: 1. Vibrio bacteria.
  • alginic acid means a polymerized polysaccharide of D-mannuronic acid and L-guluronic acid.
  • alginic acid refers to ⁇ -D-mannuronic acid (M) and ⁇ -L-guluronic acid (G), also called ⁇ -1,4′-mannurono-1,4′-L-guluroglycan.
  • M ⁇ -D-mannuronic acid
  • G ⁇ -L-guluronic acid
  • alginic acid a homopolymer of ⁇ -D-mannuronic acid (hereinafter also referred to as “poly (M)” or “M block”), a homopolymer of ⁇ -L-guluronic acid (hereinafter referred to as “poly (G)”) or There is a region of a heteropolymer of ⁇ -D-mannuronic acid and ⁇ -L-guluronic acid (hereinafter also referred to as “poly (MG)” or “MG block”).
  • the alginic acid of the present invention is preferably obtained from seaweed.
  • “seaweed” refers to green algae plants such as Aosa and Aonori, red algae plants such as Amanori and Ogonori, brown algae plants such as Kombu, Alame, Kajime, Wakame, Nissan Walla, etc., and a plurality of species selected from these Refers to a combination of Particularly preferred are brown algae plants, which are macroalgae called Macroalgae. Brown algae plants are preferred in that they store a large amount of mannitol, a sugar alcohol, as an initial assimilation product of photosynthesis.
  • the brown algae plants that can be used in the present invention include the order of the brown algae class Cytosoniphonales, Ectocarpales, Dictyosiphonales, Chordariales, Ralphsiales, Ralphsiales, (Desmaresiales), Compositae (Laminariales), Musselid (Cuteralials), Usbaogi (Syringoderales), Sphazelarias, sigmoidea (Dicyotales), Tiropteris (es) Fucales), including but those belonging to Durubiaera th (Durvilaeales), preferably Laminaria japonica (Laminaria japonica).
  • Macombu has a very high production volume as marine biomass and is large in size, and can be stably supplied in large quantities as a raw material for producing the target substance.
  • the seaweed can be either raw or dried, but preferably raw.
  • raw seaweed it is possible to omit the drying process of seaweed with extremely high energy consumption, and there is almost no need to add water separately in the process of obtaining a seaweed saccharified solution, which is advantageous.
  • the seaweed may be swollen as necessary.
  • seaweed may be fragmented as necessary.
  • the seaweed can be fragmented by a known method, for example, using a scissors, a mixer, ultrasonic treatment, a French press, a stone mortar, a mortar, a homogenizer, glass beads, a milling machine, etc. until the desired size is obtained. Can be cut into pieces.
  • alginic acid can be obtained by the following method.
  • Precipitation Acid is added to an aqueous solution of sodium alginate to lower the pH and again precipitate as insoluble alginic acid. If a calcium salt is used instead of an acid, it can also be precipitated as insoluble calcium alginate. (4) Drying The precipitated alginic acid is dehydrated, washed well, and dried to obtain alginic acid. If this alginic acid is neutralized with an alkali, it becomes an alginate. If sodium is used as the alkali used for neutralization, it becomes sodium alginate, and if potassium is used, it becomes potassium alginate.
  • the carbon source such as alginic acid obtained in the steps as described above can be used as a carbon source for the medium after performing an enzymatic degradation reaction with an enzyme such as alginate lyase or a hydrolysis reaction with an acid.
  • an acid such as inorganic acid such as hydrochloric acid or phosphoric acid, sulfonic acid such as sulfuric acid, carboxylic acid such as acetic acid or formic acid is added to seaweed.
  • an acid treatment a seaweed saccharified solution in which decomposition of polysaccharides in seaweed, that is, saccharification is promoted can be obtained.
  • seaweed can be obtained with an enzyme having an enzymatic activity of alginate lyase (EC.4.2.2.3), ⁇ -carrageenase (Lambda-carrageenase, EC 3.2.1.162) or pectinase.
  • alginate lyase EC.4.2.2.3
  • ⁇ -carrageenase Libda-carrageenase, EC 3.2.1.162
  • pectinase can be enzymatically treated.
  • a seaweed saccharified solution in which decomposition of polysaccharides in seaweed, that is, saccharification is promoted can be obtained.
  • the above-mentioned seaweed fragmentation, swelling, acid treatment, and enzyme treatment steps for obtaining the seaweed saccharified solution may be performed independently and continuously, or any of the steps may be performed simultaneously. Also good. Further, the order of these steps may be changed.
  • the above-described enzyme can be used, and it can be used by directly expressing it in a microorganism, or a separately isolated alginate lyase may be used.
  • pectinase polygalacturonase, pectin lyase, pectin esterase, pectin methyl esterase and the like can be used.
  • Cellulose contained in seaweed can be decomposed by adding cellulase after extracting and separating polysaccharides containing alginic acid.
  • cellulase is also referred to as endo-1,4- ⁇ -glucanase, and means an enzyme that mainly hydrolyzes ⁇ 1 ⁇ 4 glucoside bonds of cellulose to produce cellobiose.
  • Cellulase is present in higher plants, bacteria, filamentous fungi, wood-rotting fungi, mollusks and the like.
  • the origin of cellulase is not limited, and those extracted and purified from microorganisms or those produced by molecular biology can also be used.
  • the bacterium of the present invention can assimilate alginate purified by the extraction process exemplified above.
  • alginates mean sodium alginate and potassium alginate
  • the bacterium of the present invention is preferably a bacterium that can grow on a minimal medium using alginic acid and alginate as a carbon source.
  • a bacterium capable of assimilating alginic acid in the medium at a concentration of 0.5 g / L or more, 1 g / L or more, or 2.5 g / L or more is preferable.
  • the medium containing the minimum components necessary for bacterial vegetative growth is defined as the minimum medium.
  • the bacterium of the present invention belongs to the genus Vibrio, and the species name is usually selected from Vibrio rumoiensi s or Vibrio alginovora.
  • the bacterium of the present invention is characterized in that the 16S ribosomal RNA gene has a sequence having a homology of 95% or more with SEQ ID NO: 1. For example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of homology It is preferable to have properties. Whether or not it has a defined 16S ribosomal RNA can be determined, for example, by comparing the base sequence data of the 16S ribosomal RNA gene with the sequence data of a known species, comparing the sequence data of a known species and performing phylogenetic analysis. it can. The phylogenetic analysis and the phylogenetic tree creation method are performed, for example, according to the following procedure.
  • genomic DNA as a template is extracted from bacteria.
  • Methods for extracting DNA from bacteria are known and any method may be used. In general, a method of treating cells with a cell wall degrading enzyme such as lysozyme, a physical destruction method using glass beads, a treatment method of repeating freeze-thawing, and the like are used. Commercially available reagents for DNA extraction can also be used. Genomic DNA does not necessarily have to be extracted in an intact state. Therefore, it is possible to appropriately select a method that has a low possibility of sample contamination, is easy to operate, and can be performed quickly.
  • the target DNA encoding 16S ribosomal RNA is amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • the primer sequences used in PCR can be designed as appropriate so that at least target DNAs encoding 16S ribosomal RNAs of all known bacteria belonging to the family Lacnospiridae can be amplified, but are usually conserved across species.
  • a primer (universal primer) consisting of the above sequences is used.
  • the PCR conditions are not particularly limited, and can be appropriately selected within the range usually used.
  • the reaction can be performed using a commercially available PCR reagent according to the attached instructions.
  • the DNA fragment amplified by PCR is purified using a spin column or the like, if necessary, and its base sequence is determined.
  • the base sequence can be determined according to a standard method.
  • a known sequence showing the highest homology can be extracted by performing a homology search with a known bacterial 16S ribosomal DNA sequence using an appropriate gene sequence database and homology search program.
  • BLAST and FASTA can be used through the homepage of the Japan DNA Data Bank (DDBJ). If blastn or fasta is selected as a program, the determined base sequence is used as a query, and 16S rRNA (Prokaryotes) is selected as a search target database and a search is performed, a known sequence showing high homology is extracted and output.
  • Any other gene sequence database can be used as long as it contains a dataset of bacterial 16S ribosomal RNA gene sequences.
  • Other than the above-mentioned homology search programs known per se can also be used.
  • the molecular evolutionary phylogenetic tree can be estimated based on the base sequence of the amplified DNA, and the taxonomic position of the isolated bacteria can be specified.
  • Molecular evolutionary phylogenetic tree analysis software is also available on the Internet and can be used (CLUSTAL W etc.). As a result of phylogenetic tree analysis, when the isolated bacterium is in the same cluster as the bacterium belonging to the family Lacnospiridae, the bacterium can be identified as a bacterium belonging to the genus Vibrio of the present invention.
  • the bacterium of the present invention can be obtained from the seaweed shown above and organisms that grow using seaweed as a food source.
  • it can be obtained from Sazae, abalone, sea cucumber, horse mackerel, hailfish, red sea bream, spatula and the like.
  • the bacterium of the present invention comprises a 16S ribosomal RNA gene comprising a nucleic acid sequence having 95% or more homology with the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It has a 16S ribosomal RNA gene.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of the 16S ribosomal RNA gene of one of the bacteria of the present invention (NITE BP-01635 strain) belonging to the genus Vibrio described later. Homology between nucleic acid sequences is calculated using the homology search program BLAST described above.
  • the bacterium has the 16S ribosomal RNA gene using the above-described method for analyzing the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene.
  • a method known per se PCR, Southern blotting, DNA array, etc. is used. I can do it.
  • NITE BP-01635 strain also referred to as Vibrio sp. SA2 in this specification
  • NITE P-01635 an independent administrative corporation product. Deposited in Japan at the Evaluation Technology Infrastructure Organization (Room 2-5-8, Kazusa Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture) (contract date: June 13, 2013) and on September 13, 2013, an international deposit was made based on the Budapest Treaty. It has been transferred and deposited under the deposit number of NITE BP-01635.
  • the bacterium of the present invention is further modified so as to have a substance-producing ability.
  • the target substance is not limited as long as the target substance is produced using the bacterium of the present invention.
  • L-amino acid means L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, L-valine, L-leucine, glycine, L- Threonine, L-serine, L-proline, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine, L-cystine, L-methionine, L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine and L-asparagine Means one or more amino acids selected from
  • the nucleic acid includes a purine nucleoside and a purine nucleotide.
  • Purine nucleosides include inosine, guanosine, xanthosine, and adenosine.
  • the bacterium of the present invention may have the ability to produce one kind of purine nucleoside, or may have the ability to produce two or more kinds of purine nucleosides. In the present invention, one kind of purine nucleoside may be produced, or two or more kinds of purine nucleosides may be produced.
  • Purine nucleotides include 5'-phosphate esters of purine nucleosides.
  • 5'-phosphate esters of purine nucleosides include inosinic acid (inosine-5'-phosphate ester; IMP), guanylic acid (guanosine-5'-phosphate ester; GMP), xanthylic acid (xanthosine-5'- Phosphate ester; XMP), and adenylic acid (adenosine-5′-phosphate ester; AMP).
  • the following method is selected for modification to have L-amino acid production ability.
  • Vibrio bacteria having L-amino acid-producing ability can be obtained by imparting L-amino acid-producing ability to a wild strain of Vibrio bacteria as described above.
  • an auxotrophic mutant strain, an L-amino acid analog resistant or metabolically controlled mutant strain, which has been used for breeding conventional coryneform bacteria, Escherichia bacteria, etc. L- Breeding can be carried out using a method of creating a recombinant strain with enhanced activity of an amino acid biosynthesis enzyme (Amino Acid Fermentation Co., Ltd. Publishing Center).
  • impartation of imparted auxotrophy, L-amino acid analog resistance, metabolic control mutation and other properties may be combined with enhancement of the activity of the L-amino acid biosynthetic enzyme.
  • methods for imparting various amino acid-producing ability will be exemplified.
  • L-lysine producing bacteria include L-homoserine, or mutant strains that require L-threonine and L-methionine (Japanese Patent Publication Nos. 48-28078 and 56-6499), mutants that require inositol or acetic acid.
  • Mutation treatment methods for obtaining mutants from Vibrio spp. include UV irradiation, mutations commonly used for mutation treatment such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid. The method of processing with an agent is mentioned. Vibrio bacteria having L-amino acid-producing ability can also be obtained by selecting natural mutants of Vibrio bacteria.
  • An L-amino acid analog resistant mutant can be obtained by, for example, inoculating a mutated Vibrio bacterium into an agar medium containing various concentrations of the L-amino acid analog and selecting a strain that forms a colony. it can.
  • the auxotrophic mutant strain forms a Vibrio bacterium colony on an agar medium containing a target nutrient substance (for example, L-amino acid) and replicates it on the agar medium containing no nutrient substance. It can be obtained by selecting a strain that cannot grow on an agar medium containing no substance.
  • a target nutrient substance for example, L-amino acid
  • the ability to produce L-lysine can be imparted, for example, by enhancing dihydrodipicolinate synthase activity and / or aspartokinase activity.
  • DDPS dihydrodipicolinate synthase
  • AK aspartokinase III
  • Any microorganism that can express DDPS activity and AK activity among microorganisms belonging to the genus Vibrio can be used as a microorganism that provides a gene encoding DDPS and a gene encoding AK.
  • the microorganism may be either a wild strain or a mutant derived therefrom. Specific examples include E. coli (Escherichia coli) K-12 strain and Vibrio natrigens IFO15636 strain.
  • a gene encoding DDPS derived from bacteria belonging to the genus Escherichia (dapA, Richaud, F. et al. J.
  • Vibrio gene can be obtained by using the following GenBank database. Vibrio cholerae O1 biovar eltor str.N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852 Vibrio cholerae O1 biovar eltor str.N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032 Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020 Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021 Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795 Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796 Vibrio vulnificus YJ016 chromosome
  • Vibrio bacteria known to have alginate lyase activity and are capable of degrading alginic acid include the following microbial species.
  • Vibrio alginolytics Vibrio spectacularus Vibrio kanaloaei Vibrio pomeroyi Vibrio chagasii Vibrio lentus Vibrio cyclitrophicus Vibrio crassostreae Vibrio halitiocoli
  • genes belonging to the genus Vibrio can be obtained by referring to the GenBank database ID shown in the table below. Specifically, enter the Assembly ID in the table below from the NCBI URL (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and download each Assembly ID from the WGS (Whole Genome Sequence) Project page. The gene of the genus Vibrio can be obtained.
  • DDPS and AK used in the present invention are preferably those that are not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • Wild-type DDPS derived from Vibrio is known to be feedback-inhibited by L-lysine
  • wild-type AKIII from Vibrio is known to be inhibited and feedback-inhibited by L-lysine. Therefore, it is preferable that dapA and lysC introduced into Vibrio bacteria encode DDPS and AKIII having a mutation that cancels feedback inhibition by L-lysine, respectively.
  • DDPS and AK do not necessarily have to be mutated.
  • DDPS derived from Corynebacterium is originally known not to be feedback-inhibited by L-lysine.
  • gene encoding aspartokinase may have a homolog, and the gene source is not limited as long as it has aspartokinase activity.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to clearly quantify this condition, for example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97%. 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which is a condition in which DNAs having the above homology hybridize and DNAs having lower homology do not hybridize, or normal Southern hybridization washing conditions.
  • the conditions include washing once, more preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS. .
  • the aspartokinase activity can be measured by the method described in Miyajima, Retal; The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2), 139-148.
  • the genes are not limited to wild-type genes, and as long as they have aspartokinase activity, one or several amino acids at one or more positions in the amino acid sequence encoded by the above open reading frame of each gene It may be a mutant or artificially modified protein that encodes a protein having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition.
  • “one or several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to Mean 5.
  • a conservative mutation is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • Gln and Asn when it is a basic amino acid
  • Lys, Arg, and His when it is an acidic amino acid
  • Asp and Glu when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys. , Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg Substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe Substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala substitution, Trp to Phe or Tyr substitution
  • BLAST Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993 5873 (1993)
  • FASTA Method Enzymol., 183, 63 (1990)
  • the plasmid used for gene cloning may be any plasmid that can be replicated in microorganisms such as Escherichia bacteria, and specific examples include pBR322, pTWV228, pMW119, and pUC19.
  • any vector that functions in the genus Vibrio can be used as long as it is a plasmid that can autonomously replicate in the genus Vibrio.
  • Any vector plasmid that has ori derived from pUC, pACYC184, or IncQ can be used as the vector plasmid.
  • a marker gene used for selection a Tn903-derived kanamycin resistance gene, a Tn9-derived chloramphenicol resistance gene, a streptomycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, or the like can be used.
  • the vector is cleaved with a restriction enzyme that matches the ends of the DNA fragment containing dapA and lysC. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase. dapA and lysC may be mounted on separate vectors or on the same vector.
  • DNA encoding a mutant dihydrodipicolinate synthase that is not subject to feedback inhibition by L-lysine examples include DNA encoding a protein having a sequence in which the histidine residue at position 118 is substituted with a tyrosine residue.
  • the threonine residue at position 352 is replaced with an isoleucine residue
  • the glycine residue at position 323 is replaced with an asparagine residue
  • 318 Examples include DNA encoding AKIII having a sequence in which the methionine at the position is replaced with isoleucine (see US Pat. Nos. 5,610,010 and 6,040,160 for these variants). Mutant DNA can be obtained by site-specific mutagenesis such as PCR.
  • plasmids RSFD80, pCAB1, and pCABD2 are known as plasmids containing mutant dapA encoding mutant mutant dihydrodipicolinate synthase and mutant lysC encoding mutant aspartokinase (USA) Patent No. 6040160).
  • Escherichia coli strain JM109 transformed with RSFD80 US Pat. No.
  • any method can be used as long as sufficient transformation efficiency can be obtained.
  • electroporation Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)).
  • the enhancement of DDPS activity and / or AK activity can also be achieved by allowing multiple copies of dapA and / or lysC on the chromosomal DNA of Vibrio bacteria.
  • Introducing dapA and / or lysC in multiple copies onto the chromosomal DNA of Vibrio bacteria can be carried out by homologous recombination using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target.
  • a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA repetitive DNA, inverted repeats present at the end of a transposable element, and the like can be used.
  • dapA and / or lysC can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA.
  • DDPS activity and / or AK activity is amplified.
  • Amplification of DDPS activity and / or AK activity can be achieved by replacing expression control sequences such as dapA and / or lysC promoters with strong ones in addition to the gene amplification described above (JP-A-1-215280). No. publication). For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter of lambda phage, PL promoter, tet promoter, amyE promoter, spac promoter and the like are known as strong promoters. By replacing these promoters, DDPS activity and / or AK activity is amplified by enhancing the expression of dapA and / or lysC. Substitution of expression regulatory sequences may be combined with increasing copy number of dapA and / or lysC.
  • DNA cleavage, ligation, and other methods such as chromosomal DNA preparation, PCR, plasmid DNA preparation, transformation, setting of oligonucleotides used as primers, etc. adopt ordinary methods well known to those skilled in the art. can do. These methods are described in Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Second Edition ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).
  • DDPS activity and / or AK activity the activity of other enzymes involved in L-lysine biosynthesis may be enhanced.
  • enzymes include dihydrodipicolinate reductase (dapB), diaminopimelate decarboxylase (lysA), diaminopimelate dehydrogenase (ddh) (above, WO 96/40934 pamphlet), phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc ) (Japanese Patent Laid-Open No. 60-87788), Aspartate aminotransferase (aspC) (Japanese Patent Publication No.
  • Diaminopimelate epimerase (dapF) (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-135066), Aspartate semialdehyde dehydration Examples thereof include enzymes of the diaminopimelate pathway such as elementary enzyme (asd) (WO 00/61723 pamphlet), and enzymes of the aminoadipate pathway such as homoaconite hydratase (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-157276).
  • the parentheses after the enzyme name are gene names (the same applies to the following description).
  • the Vibrio bacterium of the present invention may be a bacterium whose L-lysine producing ability is enhanced by enhancing L-lysine excretion activity.
  • L-lysine excretion activity can be increased by increasing the expression level of the ybjE gene or increasing the expression level of the lysE gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-237379, WO 97/23697 pamphlet).
  • the Vibrio bacterium of the present invention further has an effect on the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that generates a compound other than an L-amino acid by branching from the L-amino acid biosynthetic pathway, or on the synthesis or accumulation of an L-amino acid.
  • the enzyme activity that functions in the present invention may be reduced or deficient.
  • examples of such enzymes include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (cadA, ldcC), malic enzyme, etc., and a strain in which the activity of the enzyme is reduced or absent is disclosed in International Publication No. WO95 / 23864, It can be constructed with reference to WO96 / 17930 pamphlet and WO2005 / 010175 pamphlet.
  • a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell is applied to the gene of the enzyme on the genome by a usual mutation treatment method or gene recombination technique. What is necessary is just to introduce.
  • Such mutations can be introduced, for example, by deleting a gene encoding an enzyme on the genome by genetic recombination or by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. Achieved.
  • a partial gene of the target gene is modified to produce a mutant gene that does not produce a normally functioning enzyme, transformed into a bacterium belonging to the genus Vibrio with the DNA containing the gene, and the mutant gene and genome
  • the target gene on the genome can be replaced with a mutant.
  • the gene replacement using such homologous recombination is a method called “Red-driven integration” (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
  • An L-tryptophan-producing bacterium can be constructed by modifying, for example, one or more activities among anthranilate synthase activity, phosphoglycerate dehydrogenase activity, or tryptophan synthase activity.
  • anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L-tryptophan and L-serine, respectively, the enzyme activity can be further enhanced by retaining a desensitized mutant enzyme. it can.
  • the anthranilate synthase gene (trpE) and / or the phosphoglycerate dehydrogenase gene (serA) is mutated so as not to be subjected to feedback inhibition, and the obtained mutant gene belongs to the genus Vibrio.
  • trpE anthranilate synthase gene
  • serA phosphoglycerate dehydrogenase gene
  • Bacteria into which a recombinant DNA containing a tryptophan operon has been introduced are also suitable L-tryptophan-producing bacteria.
  • a method for introducing a tryptophan operon containing a gene encoding a desensitized anthranilate synthase can be mentioned. (JP 57-71397, JP 62-244382, US Pat. No. 4,371,614).
  • the ability to produce L-tryptophan can be improved or enhanced by enhancing expression of a gene (trpBA) encoding tryptophan synthase among tryptophan operons.
  • Tryptophan synthase consists of ⁇ and ⁇ subunits and is encoded by trpA and trpB, respectively.
  • a suitable L-tryptophan-producing bacterium can also be obtained by deleting trpR, which is a repressor of the tryptophan operon, or by introducing a mutation into trpR (US Pat. No. 4,371,614, WO2005 / 056776 pamphlet). ).
  • an L-tryptophan-producing bacterium can be constructed by modifying it so as to have a trait requiring L-phenylalanine and L-tyrosine.
  • a strain with increased 3-phosphoserine phosphatase (serB) activity (US4,371,614) and a strain with increased phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) may also be used.
  • serB 3-phosphoserine phosphatase
  • pckA phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • L-tryptophan, L-phenylalanine, and L-tyrosine are all aromatic amino acids and have a common biosynthetic system.
  • Deoxyarabino-heptulonic acid phosphate synthase is a gene encoding an aromatic amino acid biosynthetic enzyme.
  • aroG 3-dehydroquinate synthase
  • aroB shikimate dehydratase
  • shikimate kinase (aroL)
  • the ability to produce aromatic amino acids can be improved by making multiple copies of genes encoding these enzymes on a plasmid or genome.
  • these genes are known to be controlled by a tyrosine repressor (tyrR), and the biosynthetic enzyme activity of aromatic amino acids may be increased by deleting the tyrR gene (European Patent 763127). No. description).
  • tyrR tyrosine repressor
  • biosynthetic enzyme activity of aromatic amino acids may be increased by deleting the tyrR gene (European Patent 763127). No. description).
  • you may weaken biosynthetic systems other than the target aromatic amino acid. For example, when the target amino acid is L-tryptophan, the L-phenylalanine biosynthesis system and the L-tyrosine biosynthesis system may be weakened (US 4,371,614).
  • 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase (aroF, aroG) is subject to feedback inhibition by aromatic amino acids, and may be modified so as not to receive feedback inhibition.
  • aromatic amino acids for example, when Escherichia coli aroF is used, L-aspartic acid at position 147 from the N-terminus or L-serine at position 181 is replaced with other amino acid residues, and in the case of aroG, L-aspartic acid at position 146 from the N-terminus is used.
  • An aromatic amino acid-producing bacterium can be obtained by introducing a mutant aroF or aroG gene substituted in to a host (EP0488424).
  • strains lacking tyrA and tyrR in addition to the above-mentioned modifications, strains lacking tyrA and tyrR, and strains obtained by amplifying the phenylalanine excretion gene yddG or yedA gene can be used.
  • a preferable bacterium belonging to the genus Vibrio having L-threonine-producing ability can be obtained by modifying to enhance the L-threonine biosynthetic enzyme.
  • the genes encoding L-threonine biosynthetic enzymes include aspartokinase III gene (lysC), aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd), aspartokinase I gene (thrA) encoded by thr operon, homoserine kinase Gene (thrB) and threonine synthase gene (thrC). Two or more of these genes may be introduced.
  • the L-threonine biosynthesis gene may be introduced into a bacterium belonging to the genus Vibrio in which threonine degradation is suppressed.
  • threonine degradation can be suppressed by reducing threonine dehydrogenase activity.
  • the enzyme activity of the L-threonine biosynthetic enzyme is suppressed by the final product, L-threonine. Therefore, in order to construct an L-threonine-producing bacterium, it is desirable to modify the L-threonine biosynthetic gene so that it is not subject to feedback inhibition by L-threonine.
  • the thrA, thrB, and thrC genes constitute the threonine operon, but the threonine operon forms an attenuator structure, and the expression of the threonine operon is inhibited by isoleucine and threonine in the culture medium. The expression is suppressed by attenuation.
  • this modification can be achieved by removing the leader sequence or attenuator of the attenuation region (Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R . M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987); International Publication No. 02/26993; International Publication No. 2005/049808 reference).
  • aspartokinase III gene can be a gene modified so as not to be subjected to feedback inhibition by L-lysine.
  • the lysC gene modified so as not to receive such feedback inhibition can be obtained from the genes described above.
  • L-threonine biosynthetic enzymes strengthening genes related to glycolysis, TCA cycle, respiratory chain, genes controlling the expression of these genes, and sugar uptake genes are also useful for breeding L-threonine producing bacteria. Is preferred. Examples of these genes effective for L-threonine production include transhydrogenase gene (pntAB) (European Patent 733712), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (pepC) (International Publication No. 95/06114 pamphlet), phosphoenol. Examples include pyruvate synthase gene (pps) (European Patent No. 877090) and pyruvate carboxylase gene (International Publication No. 99/18228, European Application No. 1092776) of coryneform bacteria or Bacillus bacteria.
  • pntAB transhydrogenase gene
  • pepC phosphoenolpyruvate carboxylase gene
  • pps European Patent No. 877090
  • pyruvate carboxylase gene
  • genes that confer resistance to L-threonine and / or genes that confer resistance to L-homoserine, or confer L-threonine resistance and / or L-homoserine resistance to the host Is also suitable.
  • genes that confer resistance include rhtA gene (Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003)), rhtB gene (European Patent Application Publication No. 0994190), rhtC gene (European Patent Application Publication No. 1013765) ), YfiK, yeaS gene (European Patent Application Publication No. 1016710).
  • the methods described in European Patent Application Publication No. 0994190 and International Publication No. 90/04636 can be referred to.
  • Vibrio bacterium having an ability to produce L-glutamic acid, it can be modified so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-glutamic acid biosynthesis is increased.
  • enzymes involved in L-glutamate biosynthesis include glutamate dehydrogenase (hereinafter also referred to as “GDH”) (gdhA), glutamine synthetase (glnA), glutamate synthase (gltAB), citrate synthase (gltA), phosphoenols.
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • glnA glutamine synthetase
  • gltAB glutamate synthase
  • citrate synthase phosphoenols.
  • Pyruvate carboxylase ppc
  • pyruvate carboxylase pyruvate dehydrogenase (aceEF, lpdA), pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno), phosphoglycermutase (pgmA, pgmI), phosphoglycerate kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapA), triosephosphate isomerase (tpiA), furtose bisphosphate aldolase (fbp), phosphofructokinase (pfkA, pfkB), Examples thereof include glucose phosphate isomerase (pgi).
  • these enzyme genes one or more of CS, PEPC, and GDH are preferable, and all three are more preferable (US Pat. Nos.
  • the yhfK gene (WO2005 / 085419 pamphlet) and ybjL gene (WO2008 / 133161 pamphlet) encoding proteins that excrete L-glutamic acid and the ybjL gene derived from Escherichia coli are represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence is sequenced The number 3 is shown.
  • a bacterium belonging to the genus Vibrio having L-glutamic acid-producing ability a bacterium having a reduced or deficient activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce other compounds is used. May be.
  • Enzymes that catalyze a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce compounds other than L-glutamic acid include 2-oxoglutarate dehydrogenase, isocitrate lyase, phosphate acetyltransferase, acetate kinase, acetohydroxyacid synthase Acetolactate synthase, formate acetyltransferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrroline dehydrogenase and the like.
  • a bacterium having an increased expression level of a gene encoding an enzyme of the L-histidine biosynthesis pathway may be used.
  • genes encoding L-histidine biosynthetic enzymes include ATP phosphoribosyltransferase (hisG), phosphoribosyl AMP cyclohydrolase (hisI), phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase (phosphoribosyL-ATP pyrophosphohydrolase) (hisIE), and phosphoribosylform.
  • Mimino-5-aminoinidazole carboxyamide ribotide isomerase phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase
  • hisA phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase
  • hisH amide transferase
  • HisB histidinol phosphatase
  • hisD histidinol dehydrogenase
  • L-histidine-producing bacteria can also be obtained by imparting resistance to sulfaguanidine, D, L-1,2,4-triazole-3-alanine, and streptomycin (USD No. 2119536).
  • L-arginine-producing bacteria In order to obtain L-arginine-producing bacteria, ⁇ -methylmethionine, p-fluorophenylalanine, D-arginine, arginine hydroxamic acid, S- (2-aminoethyl) -cysteine, ⁇ -methylserine, ⁇ -2-thienylalanine Or modification to have resistance to sulfaguanidine. It is also suitable as a method for breeding L-arginine-producing bacteria to have a mutation resistant to feedback inhibition by L-arginine and to have a highly active N-acetylglutamate synthase.
  • L-arginine biosynthesis enzymes include N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N-acetylglutamate kinase (argB), acetyl Examples include ornithine transaminase (argD), acetylornithine deacetylase (argE) ornithine carbamoyltransferase (argF), argininosuccinate synthase (argG), and argininosuccinate lyase (argH) carbamoyl phosphate synthase (carAB).
  • argA N-acetylglutamate synthase
  • argC N-acetylglutamylphosphate reductase
  • argJ ornithine acetyltransferase
  • the N-acetylglutamate synthase gene is a mutant gene encoding a mutant enzyme in which the amino acid sequence corresponding to the 15th to 19th positions of the wild type is replaced and feedback inhibition by L-arginine is released. It is more preferable to use (European Application Publication No. 1170361).
  • the L-leucine-producing bacterium inactivates the branched chain amino acid transaminase encoded by the ilvE gene and increases the activity of the aromatic amino acid transaminase encoded by the tyrB gene (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-024259), or 4- It can be obtained by modifying to have azaleucine or 5,5,5-trifluoroleucine resistance. Furthermore, the feedback inhibition of isopropylmalate synthase by L-leucine is modified for desensitization (European Patent No. 1067191), so that it is resistant to ⁇ -2-thienylalanine and ⁇ -hydroxyleucine. A suitable L-leucine-producing bacterium can also be constructed by modifying the above (US Pat. No. 5,763,231).
  • L-isoleucine-producing bacteria are resistant to 6-dimethylaminopurine (Japanese Patent Laid-Open No. 5-304969), resistant to L-isoleucine hydroxamate (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882), and resistant to thiisoleucine (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882).
  • Patent Document 1 DL-ethionine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882), or arginine hydroxamate resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882).
  • recombinant Vibrio bacteria can be obtained by using a plasmid to enhance a gene encoding threonine deaminase or acetohydroxy acid synthase, which is an L-isoleucine biosynthetic enzyme (JP-A-2-458, JP-A-2-42988). Gazette, JP-A-8-47397) and the like.
  • the L-valine-producing bacterium is modified so as to have a mutation requiring lipoic acid for growth or / and a mutation deficient in proton ATPase, as described in WO96 / 06926, or at least ilvG, It can be constructed by expressing each gene of ilvM, ilvE and ilvD and introducing a DNA fragment containing the ilvGMEDA operon into the cell.
  • the ilvGMEDA operon is subject to expression regulation (attenuation) of the operon by L-valine and / or L-isoleucine and / or L-leucine. It is preferable that a region necessary for nuation is removed or mutated (US Pat. No. 5,998,178).
  • the ilvGMEDA operon preferably does not express threonine deaminase activity.
  • the L-amino acid-producing bacterium used in the present invention may have a gene that is involved in sugar uptake, sugar metabolism (glycolysis), and energy metabolism in addition to a gene encoding a specific biosynthetic enzyme. Good.
  • genes involved in sugar metabolism include genes encoding glycolytic enzymes and sugar uptake genes.
  • Glucose 6-phosphate isomerase gene pgi; WO 01/02542 pamphlet
  • phosphoenolpyruvate Synthase gene pps; European application 877090
  • phosphoglucomutase gene pgm; WO 03/04598 pamphlet
  • fructose diphosphate aldolase gene fba; WO 03/04664 pamphlet
  • pyruvate Kinase gene pykF; WO 03/008609 pamphlet
  • transaldolase gene talB
  • WO 03/008611 pamphlet fumarase gene
  • fumarase gene fum; WO 01/02545 pamphlet
  • phosphoenolpyruvate synthase gene pps; European Application Publication No. 877090 pamphlet
  • non-PTS sucrose uptake inheritance Gene csc; European Application
  • genes involved in energy metabolism include a transhydrogenase gene (pntAB; US Pat. No. 5,830,716) and a cytochrome type oxidase gene (cyoB European Patent Application Publication No. 1070376).
  • Examples of a method for imparting or enhancing isopropyl alcohol production ability include a method of modifying a microorganism so that the activity of one or more enzymes selected from isopropyl alcohol biosynthesis enzymes is increased.
  • Examples of such enzymes include, but are not limited to, acetoacetate decarboxylase, isopropyl alcohol dehydrogenase, CoA transferase, and thiolase (WO2009 / 008377A1). In particular, it is preferable to enhance the activities of all these four enzymes.
  • Examples of the method for imparting or enhancing the ability to produce isopropyl alcohol include a method of modifying a microorganism so that the activity of GntR (gntR) is reduced.
  • GntR refers to a transcription factor that negatively regulates the expression of an operon encoding the metabolic system of gluconic acid. Specifically, the operon encodes a gluconic acid uptake system and a gluconic acid phosphorylase.
  • Escherichia coli has two gluconic acid metabolic systems, GntI and GntII, but GntR suppresses the expression of both.
  • the microorganism having the ability to produce isopropyl alcohol may be modified so that the activity of lactate dehydrogenase is reduced.
  • the production of lactic acid can be suppressed and isopropyl alcohol can be produced efficiently even under culture conditions in which oxygen supply is limited.
  • Culture conditions with limited oxygen supply are generally 0.02 vvm to 2.0 vvm (vvm; aeration volume [mL] / liquid volume [mL] / hour [minute] when only air is used as a gas. ), Which means a rotational speed of 200 to 600 rpm.
  • Acetone is a precursor of isopropyl alcohol in isopropyl alcohol production. Therefore, the acetone production ability can be imparted or enhanced by partially utilizing a method for imparting or enhancing isopropyl alcohol production ability. For example, the ability to produce acetone increases the activity of one or more enzymes selected from the above-exemplified isopropyl alcohol biosynthetic enzymes other than isopropyl alcohol dehydrogenase, ie, acetoacetate decarboxylase, CoA transferase, and thiolase. Thus, it can be imparted or enhanced by modifying the microorganism.
  • ⁇ Ethanol-producing bacteria As a microorganism capable of producing ethanol, a lactate dehydrogenase gene (ldhA) deficient and a mutation introduced with a pyruvate decarboxylase gene (pdc) and an alcohol dehydrogenase gene (adhB) derived from Zymomonas mobilis Strains, and strains in which the phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppc) of the strain is further deleted (J Mol Microbiol Biotechnol 2004, 8, 243-254).
  • pdc pyruvate decarboxylase gene
  • adhB alcohol dehydrogenase gene
  • the pyruvate / formate lyase gene (pfl) and the fumarate reductase gene (frd) are deleted, and the pyruvate decarboxylase gene (pdc) derived from Zymomonas mobilis and Examples include strains into which an alcohol dehydrogenase gene (adhB) has been introduced (Ann NY Acad Sci. 2008, 1125, 363-372).
  • the method of producing the target substance of the present invention is a medium containing a carbon source obtained from seaweeds of bacteria belonging to the genus Vibrio bred to have the target substance-producing ability by the above-described method.
  • the target substance is produced and accumulated in the medium by culturing, and the target substance is recovered from the medium or cells.
  • a medium conventionally used in the fermentation production of a target substance using microorganisms can be used. That is, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • a carbon source a carbon source obtained from seaweed can be used.
  • Carbon sources obtained from seaweed include alginic acid, cellulose, glucose, mannitol, pectin, galacturonic acid, carrageenan, and agar.
  • typical brown algae contain alginate, mannitol and glucose in a ratio of 5: 8: 1 (Wargacki, et al. (2012) 2012Science. 335.p308-313).
  • other sugar sources such as glucose, sucrose, fructose, glycerol, and ethanol may be contained.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, and the like
  • an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1, L-homoserine or a yeast extract
  • a small amount of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary.
  • it is more preferable that a certain concentration of salt is contained.
  • the salt may be a salt of the target substance combined with a counter ion, or salt (NaCl).
  • the medium used in the present invention may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • L-amino acids that improve growth and productivity may be added.
  • L-lysine fermentation L-threonine, L-homoserine and L-isoleucine are used.
  • L-isoleucine, L-lysine, L-glutamic acid and L-homoserine are used, and in L-tryptophan fermentation.
  • L-phenylalanine, L-tyrosine and the like are preferably added. The addition concentration is about 0.01-10 g / L.
  • Cultivation is preferably carried out for 1 to 7 days under aerobic conditions, and the culture temperature is preferably 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 39 ° C, more preferably 34 ° C to 38 ° C.
  • the pH during the culture is preferably 5-9.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
  • the recovery of the target substance from the fermentation broth can be performed by a normal method.
  • L-amino acid can be recovered from the fermentation broth by combining an ion exchange resin method, a precipitation method, and other known methods.
  • L-amino acid accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, etc., and the microbial cells are removed by centrifugation.
  • the recovered L-amino acid may be a free L-amino acid or a salt containing a sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, or potassium salt.
  • the recovered L-amino acid may contain microbial cells, medium components, moisture, and microbial metabolic byproducts.
  • the purity of the collected L-amino acid is 50% or more, preferably 85% or more, particularly preferably 95% or more. The same applies to other target substances.
  • NaCl is preferably present in the medium in an amount of 0.5% or more, preferably 0.5 to 4%, more preferably 0.7 to 3.5%.
  • Example 1 Acquisition of Vibrio sp. SA2 strain Sazae collected in the Kasumura area of Nanao City, Ishikawa Prefecture was used for screening for new microorganisms capable of assimilating alginate (collected location: latitude north: 37.0981 east longitude: sea near 137.0499 ).
  • the colony is scraped with ASE, suspended in physiological saline, washed 3 times with physiological saline, then plated on a freshly prepared sodium alginate selection agar medium, and incubated at 37 ° C for 50 hours incubation time. Then, the strain in which colony formation was confirmed was further subjected to SI using a sodium alginate selection agar medium, and suspended in 4 mL of a medium in which 15 g / L NaCl was additionally added to the LB liquid medium, and cultured in a test tube. Cultivate the tube at 37 ° C with a reciprocating stirring speed of 120rpm.
  • Daigo artificial seawater SP composition MgCl 2 ⁇ 6H 2 O 9.474g / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 1.328g / L Na 2 SO 4 3.505g / L KCl 0.597g / L NaHCO 3 0.171g / L KBr 0.085g / L Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 O 0.034g / L SrCl 2 0.012g / L NaF 3mg / L LiCl 1mg / L KI 0.07mg / L CoCl 2 ⁇ 6H 2 O 0.0002mg / L AlCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.008mg / L FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.006mg / L Na 2 WO 4 ⁇ 2H 2 O 0.0002mg / L (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O 0.0008mg / L NaCl 20.747g / L
  • Example 2 Molecular phylogenetic analysis of Vibrio sp. SA2 strain Bacteria obtained by static culture of glycerol stock 50 ⁇ L of SA2 strain in an agar medium with 15g / L NaCl added to LB liquid medium at 37 ° C for 16 hours Total genomic DNA was extracted from the body using PurElute Bacterial Genomid Kit (manufactured by Edgebio). The total genomic DNA obtained was analyzed with the next-generation sequencer Miseq (Illumina) and BLAST analysis (Altshul, et al. “Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs” (1997) Nucleic Acids Research.
  • the SA2 strain belongs to a cluster formed by Vibrio species.
  • the SA2 strain was supported by a 98% bootstrap value to belong to the cluster formed by Vibrio rumoiensis, Vibrio litoralis, Vibrio casei.
  • the SA2 strain also formed a cluster with Vibrio rumoiensis, which was supported by a bootstrap value of 89%.
  • the above results revealed that the SA2 strain is a closely related species of the genus Vibrio. Therefore, the SA2 strain was named Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain).
  • Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) was analyzed by virtue of BLAST analysis. Rumoiensis was 99.5%, Vibrio litoralis was 97.9%, Vibrio casei was 96.3%. Vibrio sp. SA2 strain may be the same type of microorganism as Vibrio rumoiensis because it has been reported that microbial species with homology of the full-length 16S rRNA gene of less than 98.7% can be judged as different species. (Stackebrandt, et al. “Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards” (2006) Microbiol. Today. 33, p152-155.).
  • Vibrio sp. SA2 strain and Vibrio rumoiensis type ⁇ strain showed a value of 36-39% and an average of 37.5% homology (Table 2 below).
  • microorganism species are currently defined as having the same species as strains showing homology values of 70% or more (Wayne, et al. "Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. "(1987) Int. J. Syst. Bacteriol. 37, p463-464.). Therefore, Vibrio sp. SA2 strain was found to be a new species of microorganism belonging to another species, Vibrio rumoiensis type strain.
  • Example 4 Electron micrograph of Vibrio sp. SA2 strain (fixation of bacterial cells)
  • a glycerol stock of Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) was plated 50 ⁇ L each on an agar medium supplemented with LB NaCl 15 g / L, and left as a seed culture for 16 hours at a culture temperature of 25 ° C.
  • the fixed cells were washed four times with 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.4) at a temperature of 4 ° C. Further, the fixed cells washed were left in a 1% tannic acid, 0.1M cacodylate buffer (pH 7.4) for 2 hours at a temperature of 4 ° C. to perform a second fixation treatment. After the second fixing treatment, the fixed cells were washed four times with 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.4) at a temperature of 4 ° C. Then, it was left to stand in a 2% osmium tetraoxide, 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.4) at 4 ° C. for 3 hours.
  • the freeze-dried sample was coated with a thin layer (60 nm) of osmium using an osmium plasma coater (catalog number: NL-OPC80NS) manufactured by Nippon Laser Electronics.
  • osmium plasma coater catalog number: NL-OPC80NS
  • Example 5 Gram staining test result of Vibrio sp. SA2 strain 50 ⁇ L of glycerol stock of Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) was plated on MB2216 (Becton Dickinson) supplemented agar medium and seeded As culture, static culture was performed at a culture temperature of 30 ° C. for 24 hours. The obtained bacterial cells were stained according to a conventional method using a gram differentiation staining solution Faber G “Nissui” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), observed and photographed using an optical microscope BX50F4 manufactured by Olympus, and shown in FIG. An optical microscope image of SA2 strain was obtained. From the results, it was shown that the Vibrio sp. SA2 strain belongs to a gram-negative bacterium.
  • Example 6 Multilocus gene analysis of Vibrio sp. SA2 strain Multilocus gene analysis using housekeeping genes conserved in the genome of Vibrio spp. For identification of Vibrio spp. Since it is common to perform molecular phylogenetic analysis to compare sequences), 6 housekeeping genes (atpA, pyrH, recA, etc.) stored in the genome of Vibrio spp. Using the sequences of rpoA, rpoD and 16S rRNA genes), multilocus gene analysis was performed.
  • the sequence of the genes of atpA, pyrH, recA, rpoA, rpoD of Vibrio sp. SA2 strain was obtained in the same manner as the acquisition of the full-length sequence of 16S rRNA gene of SEQ ID NO: 1.
  • the atpA gene of Vibrio sp. SA2 strain is described in SEQ ID NO: 6.
  • the pyrH gene of Vibrio sp. SA2 strain is described in SEQ ID NO: 7.
  • the recA gene of Vibrio sp. SA2 strain is described in SEQ ID NO: 8.
  • the rpoA gene of Vibrio sp. SA2 strain is described in SEQ ID NO: 9.
  • the rpoD gene of Vibrio sp. SA2 strain is described in SEQ ID NO: 10.
  • the rpoD gene sequence of Vibrio casei is described in SEQ ID NO: 11.
  • the rpoD gene sequence of Vibrio litoralis is described in SEQ ID NO: 12.
  • the rpoD gene sequence of Vibrio rumoiensis is described in SEQ ID NO: 13.
  • the pyrH gene sequence of Vibrio rumoiensis is described in SEQ ID NO: 14.
  • Non-Patent Document 7 For multilocus gene analysis, MEGA ver 5.0 described in Non-Patent Document 7 was used. Further, the proximity coupling method described in Non-Patent Document 8 was used as a phylogenetic tree estimation method. As a base substitution model, the method of Jukes and Cantor described in Non-Patent Document 9 was used. For the reliability evaluation of the tree shape, the bootstrap method of 1000 iterations described in Non-Patent Document 10 was used.
  • Vibrio spp By virtue of multilocus gene analysis using the sequences of housekeeping genes (atpA, pyrH, recA, rpoA, rpoD and 16S rRNA genes) characteristic of Vibrio spp. Among them, it was found to be included in a cluster formed by three types of Vibrio casei, Vibrio litoralis, and Vibrio rumoiensis (Fig. 7). This cluster was supported by a high bootstrap value of 100%. In addition, Vibrio sp. SA2 strain formed a cluster with Vibrio litoralis. Therefore, this multilocus gene analysis showed that the Vibrio sp. SA2 strain has a close relationship with Vibrio litoralis.
  • Vibrio sp. SA2 strain belongs to a different species than Vibrio litoralis. Furthermore, as described above, the Vibrio sp. SA2 strain had a homology of the full-length 16S rRNA gene of 97.9% compared to Vibrio litoralis. Report that it can be judged that microbial species with less than 98.7% homology of 16S rRNA gene full-length sequence are different species (Stackebrandt, et al. “Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards”. (2006) Microbiol. Today. 33, p152-155.). Therefore, Vibrio sp. SA2 strain was shown to belong to a different species from Vibrio litoralis, which was shown to be the most closely related by multilocus gene analysis, and was shown to be a microorganism belonging to a new species of Vibrio bacteria.
  • Example 7 Analysis of cell fatty acid composition of Vibrio sp. SA2 strain and related species Vibrio sp. SA2 strain was shown to belong to a new species of Vibrio spp. A general analysis of fatty acid composition of bacterial cells was performed on Vibrio sp. SA2 and related species.
  • Glycerol stock of Vibrio sp. SA2 (NITE BP-01635), Vibrio rumoiensis (type strain DSM19141), Vibrio litoralis (type strain DSM17657), Vibrio casei (type strain DSM 22364)
  • the stock was plated on an agar medium supplemented with MB2216 (manufactured by Becton Dickinson Co.) at a rate of 50 ⁇ L, 50 ⁇ L each, and then statically cultured as a seed culture at a culture temperature of 30 ° C. for 24 hours.
  • Vibrio sp. SA2 strain has a cell fatty acid composition with characteristics different from those of closely related species forming clusters by multilocus gene analysis and 16S rRNA gene analysis.
  • Example 8 Biochemical characteristics and physiological characteristics analysis results of Vibrio sp. SA2 strain Based on the method described in Non-Patent Document 11, the catalase reaction, oxidase reaction, acid production from glucose of Vibrio sp. SA2 strain, Analysis was performed on gas production from glucose, glucose oxidation / fermentation ability (O / F test) and sensitivity to O129. As a result, Vibrio sp. SA2 strain showed physiological characteristics as shown in Table 5.
  • Vibrio sp. SA2 strain was tested using API20NE kit, which is a kit for analyzing physiological characteristics of gram-negative bacteria manufactured by bioMerieux. The results are shown in Table 6.
  • API ZYM kit is a kit for analyzing biochemical characteristics (enzyme activity) of microorganisms manufactured by bioMerieux. The results are shown in Table 7.
  • Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) is a microorganism having the following characteristics.
  • Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) is a gram-negative bacterium. It is a gonococcus having a diameter of 0.7-0.8 ⁇ m and a width of 1.5-2.5 ⁇ m when cultured on an agar medium and liquid medium of MB2216, and is flagellar and non-motile. When cultured on MB2216 agar medium at 30 ° C for 24 hours, it forms a light yellow, smooth, circular colony with a diameter of 2.0-3.0 mm. When culturing MB2216 in an agar medium and a liquid medium, it can grow at a temperature of 4-40 ° C. and can grow at a pH of 5-10.
  • the condition that 1-14% NaCl is added at a temperature of 25-30 ° C. and pH 7-8 is the optimum condition for growth.
  • the main constituent fatty acids are 16: 1 w7c / 16: 1 w6c (38.18%), 16: 0 (27.97%), 18: 1 w7c (14.28%), 14: 0 3OH / 16: 1 iso I (8.65%), 12: 0 (3.86%), 18: 0 (2.03%) and 14: 0 (1.67%).
  • Vibrio sp. SA2 strain falls under all previously reported microbial species Not shown to belong to a new species of Vibrio spp. Therefore, the inventor found that Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) belongs to a new species of Vibrio genus bacteria, and named the new species to which the Vibrio sp. SA2 strain belongs as Vibrio alginovora in accordance with international bacterial naming conventions .
  • Example 9 Test tube culture of Vibrio sp. SA2 strain in minimal medium As a characteristic of a conventional microorganism strain belonging to Vibrio rumoiensis, it cannot grow because it is too hot at 40 ° C and has no alginate lyase activity. It was reported that there was no ability to assimilate alginate (Garrity, et al. (2005) Bergey's manual of systematic bacteriology 2nd Edition Part B p526-527). Therefore, the inventors of the present invention used a glycerol stock of Vibrio sp.
  • SA2 strain NITE BP-01635 strain
  • a glycerol stock of Escherichia coli MG1655 strain ATCC 47076 strain
  • the cells were plated one by one and statically cultured at 37 ° C. for 16 hours as a seed culture. After seed culture, the cells grown on the agar medium were scraped with ase and suspended in 1 mL of sterile physiological saline, and the turbidity at an absorbance of 600 nm was measured with a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi).
  • Example 10 Measurement of specific maximum growth rate of Vibrio sp. SA2 strain at 37 ° C in a minimal medium Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) glycerol stock, and Escherichia coli MG1655 strain ( A glycerol stock of ATCC 47076) was plated on an agar medium supplemented with 15 g / L of LB NaCl at a rate of 50 ⁇ L, and statically cultured at 37 ° C. for 16 hours as a seed culture.
  • Vibrio sp. SA2 strain NITE BP-01635 strain
  • Escherichia coli MG1655 strain A glycerol stock of ATCC 47076
  • the cells grown on the agar medium were scraped with ase and suspended in 1 mL of sterile physiological saline, and the turbidity at an absorbance of 600 nm was measured with a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi). Thereafter, inoculation was carried out in 5 mL of a minimal liquid medium supplemented with sodium alginate as the only carbon source shown above so that the turbidity at an absorbance of 600 nm was 0.05. Using a constant-temperature shaking culture apparatus TVS062CA (manufactured by Advantech Co., Ltd.), the test tube culture was performed continuously at 37 ° C. and 70 rpm for 24 hours.
  • TVS062CA constant-temperature shaking culture apparatus
  • Glucose M9 liquid medium Composition glucose 2.5g / L Na 2 HPO 4 6 g / L KH 2 PO 4 3 g / L NH 4 Cl 1 g / L NaCl 0.5g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.246g / L Thiamine ⁇ HCl 10mg / L
  • Glucose M9 NaCl liquid medium Composition glucose 2.5g / L Na 2 HPO 4 6 g / L KH 2 PO 4 3 g / L NH 4 Cl 1 g / L NaCl 15.5g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.246g / L Thiamine ⁇ HCl 10mg / L
  • Example 11 Measurement of viable temperature of Vibrio sp. SA2 strain in sodium alginate minimal medium Vibrio sp. SA2 strain (NITE BP-01635 strain) glycerol stock, and Escherichia coli MG1655 strain (ATCC 47076) as a comparative control strain 50 ⁇ L each of the glycerol stock of the strain) was plated on an agar medium supplemented with LB NaCl 15 g / L and statically cultured as a seed culture at a culture temperature of 37 ° C. for 16 hours.
  • NITE BP-01635 strain sodium alginate minimal medium
  • Vibrio sp. SA2 strain NITE BP-01635 strain
  • Escherichia coli MG1655 strain ATCC 47076
  • glycerol stock of Vibrio rumoiensis S-1 strain (DSM 19141 strain) was plated on an agar medium supplemented with LB NaCl 15 g / L, and statically cultured as a seed culture at a culture temperature of 31.5 ° C. for 16 hours. After seed culture, the cells grown on the agar medium were scraped with ase and suspended in 1 mL of sterile physiological saline, and the turbidity at an absorbance of 600 nm was measured with a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi).
  • Vibrio sp. SA2 strain is a new microbial strain belonging to a new microbial species having an ability to assimilate alginate that can grow at a high temperature of 40 ° C., which is different from the microbial strain belonging to Vibrio rumoiensis. Indicated.
  • Example 12 Comparison of viable temperature of Vibrio sp. SA2 strain and other Vibrio genus bacteria on agar medium
  • Vibrio sp. SA2 strain NITE BP-01635 strain
  • glycerol stock and comparative control strain Vibrio rumoiensis
  • type strain ATCC33125 strain LB Daigo Artificial Seawater SP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Catalog No. 395-01343)
  • HTMLCONTROL Forms.HTML Hidden.1 And then statically cultured as a seed culture at a culture temperature of 25 ° C. for 16 hours.
  • Vibrio sp. SA2 strain was cultured in 40 mL of LB NaCl 15 g / L liquid medium in two Sakaguchi flasks at a culture temperature of 37 ° C. and a stirring speed of 120 rpm until the OD600 nm was around 0.5. 80 mL of the obtained culture broth was collected by centrifugation under conditions of a rotation speed of 7000 rpm, an operation time of 7 min, and a temperature of 4 ° C.
  • LB NaCl 15 g / L liquid medium 0.5 mL was added to the electroporated electrocompetent cell, and the culture was allowed to stand at 37 ° C. for 2.5 hours for recovery culture.After that, 15 g of LB NaCl containing 40 mg / L kanamycin was added. Colony formation was confirmed by static culture for 24 hours on / L agar medium. The obtained colonies were further SI-treated with LB NaCl 15 g / L agar medium containing 40 mg / L kanamycin and suspended in 4 mL of LB NaCl 15 g / L liquid medium containing 40 mg / L kanamycin. went.
  • the glycerol stock of the strain prepared and obtained was named the glycerol stock of Vibrio sp. SA2 / pMW219-ybjL strain.
  • sodium alginate hydrolyzate solution 5 g was added to 100 mL of 3N sulfuric acid, followed by heating at 65 ° C. for 3 hours.
  • the obtained sodium alginate hydrolyzate solution was adjusted to pH 7.0 by adding KOH, and a sodium alginate hydrolyzate sugar solution was obtained.
  • the following sodium alginate hydrolyzate minimal liquid medium was prepared using the obtained sodium alginate hydrolyzate sugar solution.
  • Thaw glycerol stocks of Vibrio sp. SA2 / pMW219-ybjL strain apply 100 ⁇ L of each uniformly to LB NaCl 15 g / L agar medium containing 40 mg / L kanamycin, and incubate at 30 ° C for 48 hours did. Approximately 1/4 amount of the cells on the obtained plate was suspended in 0.5 mL of physiological saline, and the turbidity at a wavelength of 600 nm was measured with a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi).
  • the obtained suspension containing the fungus is inoculated into a 5 mL mL of the above-mentioned sodium alginate hydrolyzate minimal liquid medium placed in an L-shaped test tube and shaken at a wavelength of 600 nm so that the turbidity is 0.05.
  • the cells were cultured for 22 hours at 34 ° C. with a rotating stirring speed of 70 rpm using a culturing apparatus TN-1506 (manufactured by Advantech Toyo). After completion of the culture, the amount of L-glutamic acid accumulated in the medium was measured using Biotech Analyzer AS310 (manufactured by Sakura Seiki Co., Ltd.).
  • sequence SEQ ID NO: 1 Base sequence of 16S ribosomal RNA gene of Vibrio sp.
  • SA2 sequence SEQ ID NO: 2 Base sequence of ybjL gene derived from Escherichia coli SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of SEQ ID NO: YbjL protein derived from Escherichia coli 4: Primer SEQ ID NO: 5: Primer SEQ ID NO: 6: nucleotide sequence of atpA gene of Vibrio sp.
  • SA2 strain SEQ ID NO: 8 recA gene of Vibrio sp.
  • SA2 strain SEQ ID NO: 9 nucleotide sequence of the rpoA gene of Vibrio sp.
  • SA2 strain SEQ ID NO: 10 nucleotide sequence of the rpoD gene of Vibrio sp.
  • SA2 strain SEQ ID NO: 11: nucleotide sequence of the rpoD gene of Vibrio casei 12: Vibrio Litoralis rpoD gene nucleotide sequence SEQ ID NO: 13: Vibrio rumoiensis rpoD gene nucleotide sequence SEQ ID NO: 14: Vibrio rumoiensis pyrH gene nucleotide sequence SEQ ID NO: 15: Vibrio rumoiensis 16S ribose Nucleotide sequence of the RNA gene

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Abstract

　アルギン酸を資化できる細菌、及び、その細菌を用いて目的物質を発酵法により生産する方法を提供する。目的物質生産能を有し、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻から得られた炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、目的物質の製造法。

Description

アルギン酸資化性微生物及び目的物質の製造法
　本発明は、細菌などの微生物を用いた海藻バイオマスの利用に際し、有用物質生産の発酵生産時の微生物宿主となる新規微生物にかかわる。
　エタノールなどの燃料やＬ－アミノ酸などの食品、飼料、医薬品に用いられる物質の大量生産には微生物を用いた発酵法が用いられ、産業上有用である。
　微生物を用いた発酵の主原料にはサトウキビやトウモロコシといった食料穀物から生産される糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。
　また、近年の世界的な人口増加による食料需要増などに起因する穀物価格上昇により、サトウキビやトウモロコシの茎や葉、ヤトロファ油などの非食料の陸上バイオマスから得られる糖類や油脂類も微生物を用いた発酵の主原料源として産業上有用である。
　しかしながら、非食料の陸上バイオマス生産には食料穀物生産と直接には競合しないものの、農地や農業用水、肥料利用などの点で食料穀物生産と間接的に競合するほか、世界的な土地収奪などの問題があることが課題として指摘されている（非特許文献１）。
　そこで、微生物を用いた発酵の主原料として海藻を中心とした海洋性バイオマスに着目が集まっている。海洋性バイオマスは農地や農業用水、肥料を使用せず生産できる上、海藻のうち褐藻類には非食料部分も含めてサトウキビの２倍、トウモロコシの５倍の単位面積あたりの発酵主原料生産能力があることが知られている（非特許文献２）。褐藻類は著量にD-マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の重合多糖であるアルギン酸、グルコース、マンニトールといった糖類を蓄える。
　だが、褐藻類が蓄積する糖類を発酵の主原料とする上では、褐藻中の糖類の中に主たる成分として含まれるアルギン酸が微生物による資化が困難であることが産業上利用する上での課題として挙げられている（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１、特許文献２）。すなわち、アルギン酸を資化できる微生物を入手することが褐藻類からの海洋性バイオマスを利用して有用物質を微生物によって発酵生産する上で重要であると考えられる。
　アルギン酸を単一の炭素源として資化し、迅速に生育できる微生物を新規に単離、入手できれば、海洋性バイオマスからの有用物質生産を行う微生物による発酵法の宿主微生物として有用性があるが、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を用いて目的物質を発酵法により生産する方法は知られていない。
国際公開WO 2009/046375号 国際公開WO 2011/024858号
Bringezu,et al. (2009) United Nations Environmental Programme Somerville,et al. (2010) Science. 329, p790-792. Takeda,et al. (2011) Energy Environ. Sci.4 p2575-2581 Wargacki, et al. (2012) Science. 335.p308-313 Kim,et al. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2013,vol 63,p3697-3703 Yamamoto et al..Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,1998,vol48,p813-819 Tamura et al. Mol.Biol.Evol.,2011,vol28,p2731-2739 Saitou et al. Mol.Biol.Evol.,1987,vol4,p406-425 Jukes et al. New York:Academic Press.1969 Felsenstein et al.Evolution,1985,vol39,p783-791 Barrow 、Feltham著Cowan and Steel's Manual for the Identification of the Medical Bacteria.3rd Edition.1993,Cambridge University Press.
　本発明は、アルギン酸を資化できる微生物、及び、その微生物を用いて目的物質を発酵法により生産する方法を提供することを課題とする。
　本発明の発明者は、褐藻類を餌として日常的に摂取していると考えられるサザエ（学名：Turbo cornutus）の消化管から、アルギン酸を資化可能なビブリオ属細菌を分離した。
　さらに、アルギン酸資化可能なビブリオ属細菌にアミノ酸生産能を付与し、アミノ酸生産が可能なことを見出した。
　［１］　アルギン酸資化能を有するビブリオ属に属する細菌であり、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する、ビブリオ属細菌。
　［２］　前記１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１を有する、前記記載のビブリオ属細菌。
　［３］　アルギン酸を単一の炭素源として生育できることを特徴とする、前記記載のビブリオ属細菌。
　［４］  ビブリオ・アルギノボーラ(Vibrio alginovora)に属することを特徴とする、前記記載のビブリオ属細菌。
　［５］　ビブリオ属NITE　BP-01635株である、前記記載のビブリオ属細菌。
　［６］　目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻類由来のバイオマス海藻類から得られた炭素源から抽出された炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、発酵法による目的物質の製造法。
　［７］　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有する細菌が、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有するビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
　［８］　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有する細菌が、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１を有するビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
　［９］  前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、ビブリオ・アルギノボーラに属することを特徴とする、前記記載の方法。
　［１０］　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有する細菌が、ビブリオ属NITE　BP-01635株由来である、前記記載の方法。
　［１１］　前記目的物質が、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、グリシン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である、前記記載の方法。
　［１２］　前記目的物質が、エタノールである、前記記載の方法。
　［１３］　前記目的物質が、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、１－プロパノール、１，３－プロパンジオール、１，２－プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、前記記載の方法。
　［１４］　前記細菌がＬ－アミノ酸生合成系酵素の活性が増強されたビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
　［１５］　前記細菌がＬ－アミノ酸を排出するタンパク質の活性が増強されたビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
　［１６］　前記Ｌ－アミノ酸を排出するタンパク質が、ybjLである、前記記載の方法。
　［１７］　前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻であることを特徴とする、前記記載の方法。
　［１８］　前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天から選択される1種以上の炭素源である、前記記載の方法。
　［１９］　前記海藻類から得られた糖類抽出物がアルギン酸を含有し、アルギン酸の加水分解をアルギン酸加水分解酵素または酸による前処理によって行ってから培養を行うことを特徴とする、前記記載の方法。
Vibrio sp.SA2株とVibrio rumoiensis type strainとの16S rRNA遺伝子配列比較（上段がVibrio sp.SA2株の配列（配列番号１）、下段がVibrio rumoiensis type strain S-株の配列（配列番号１５）、点線枠はギャップによる相違、実線枠は置換による相違）。 Vibrio sp. SA2株の16S rRNA遺伝子全長配列による分子系統樹（系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す）。 Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での試験管培養結果（1: Vibrio sp. SA2株の波長600nmの濁度、2: MG1655株の波長600nmの濁度）。 グルコースまたはアルギン酸ナトリウムのみを炭素源とした最少液体培地での最大比増殖速度。 Vibrio sp. SA2株の電子顕微鏡写真。 Vibrio sp. SA2株のグラム染色図（写真）。 Vibrio sp. SA2株のハウスキーピング遺伝子を連結した塩基配列に基づく分子系統樹（左下の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。）。
＜１＞本発明の細菌
　本発明のビブリオ属細菌は、アルギン酸資化能を有するビブリオ属に属する細菌であり、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する、ビブリオ属細菌である。
　本発明においてアルギン酸とは、Ｄ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の重合多糖を意味する。本明細書において使用する「アルギン酸」という用語は、β－１，４’－マンヌロノ－１，４’－Ｌ－グルロノグリカンとも呼ばれるβ－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ）の２種のウロン酸のピラノース環が主としてβ１→４結合した多糖を指す。アルギン酸中にはβ－Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｍ）」または「Ｍブロック」とも呼ぶ）、α－Ｌ－グルロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｇ）」または「Ｇブロック」とも呼ぶ）、β－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸のヘテロポリマー（以下、「ポリ（ＭＧ）」または「ＭＧブロック」とも呼ぶ）の領域が存在する。本発明のアルギン酸は、海藻類から取得されることが好ましい。
　本発明において「海藻類」とは、アオサ、アオノリなどの緑藻植物、アマノリ、オゴノリなどの紅藻植物、コンブ、アラメ、カジメ、ワカメ、ホンダワラなどの褐藻植物等、およびこれらから選択される複数種の組み合わせを指す。特に好ましくは、Macroalgaeと呼ばれる大型藻類である、褐藻植物である。褐藻植物は、光合成の初期同化産物として糖アルコールであるマンニトールを多く貯蔵している点において好ましい。本発明において用いうる褐藻植物には、褐藻綱カヤモノリ目（Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、シオミドロ目（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、ウイキョウモ目（Ｄｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、ナガマツモ目（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、イソガワラ目（Ｒａｌｆｓｉａｌｅｓ）、ケヤリモ目（Ｓｐｏｒｏｃｈｎａｌｅｓ）、ウルシグサ目（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａｌｅｓ）、コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）、ムチモ目（Ｃｕｔｌｅｒｉａｌｅｓ）、ウスバオオギ目（Ｓｙｒｉｎｇｏｄｅｒｍａｔａｌｅｓ）、クロガシラ目（Ｓｐｈａｃｅｌａｒｉａｌｅｓ）、アミジグサ目（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）、チロプテリス目（Ｔｉｌｏｐｔｅｒｉｄａｌｅｓ）、アスコセイラ目（Ａｓｃｏｓｅｉｒａｌｅｓ）、ヒバマタ目（Ｆｕｃａｌｅｓ）、ドゥルビアエラ目（Ｄｕｒｖｉｌａｅａｌｅｓ）に属するものが挙げられるが、好ましくはマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）である。マコンブは海洋バイオマスとして非常に生産量が高く、また大型であることから、目的物質生産のための原料として安定して大量に供給することができる。
　本発明において海藻は、生のもの、乾燥したものいずれも利用することが可能であるが、好ましくは生のものを利用する。生の海藻を利用することによって、エネルギー消費量が極めて高い海藻の乾燥工程を省略することができ、また海藻糖化液を得る工程において水を別途添加する必要性がほとんどなく有利である。本発明において海藻は必要に応じて膨潤させてもよい。
　本発明において海藻は、必要に応じて細片化されていても良い。海藻の細片化は公知の方法によって行うことができ、例えば、ハサミ、ミキサー、超音波処理、フレンチプレス、石臼、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ、ミリングマシーンなどを用いて所望の大きさになるまで細片化することができる。
　海藻に含まれるアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天などの炭素源は海藻から通常の方法で得ることができる。例えばアルギン酸は以下の方法で取得できる。
(1)抽出工程
　原料海藻をよく洗浄した後、アルカリを加えて加熱し、藻体中のアルギン酸を可溶化する。海藻に含まれているアルギン酸は、海水中のミネラルと塩をつくり、不溶性のゼリー状態で細胞壁間に充填されている。海藻にナトリウム塩を加えることで、アルギン酸の不溶性塩が水溶性のアルギン酸ナトリウムに置換され、藻体外に溶出する。
(2)ろ過工程
　アルギン酸が十分に溶け出したら、ろ過して不溶性成分を除き、アルギン酸ナトリウムの溶液を得る。可溶化したアルギン酸の粘性により、抽出液は高い粘性を帯びる。これをろ過するためには大量の水を加えて希釈し、粘性を下げる。
(3)析出
　アルギン酸ナトリウムの水溶液に酸を加えて pH を下げ、再び不溶性のアルギン酸として析出させる。酸の代わりにカルシウム塩を用いると、これも不溶性のアルギン酸カルシウムとして析出させることもできる。
(4)乾燥
　析出したアルギン酸を脱水した後よく洗浄し、乾燥させてアルギン酸を得る。このアルギン酸をアルカリで中和すれば、アルギン酸塩となる。中和に用いるアルカリにナトリウムを使えばアルギン酸ナトリウムに、カリウムを使えばアルギン酸カリウムとなる。
　上記のような工程で取得されたアルギン酸などの炭素源は、アルギン酸リアーゼなどの酵素による酵素分解反応または酸による加水分解反応を行った後に、培地の炭素源として用いることができる。例えば、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るには、海藻に塩酸やリン酸のような無機酸、硫酸のようなスルホン酸、酢酸、ギ酸のようなカルボン酸といった酸を添加して酸処理することにより海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
　また、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るには海藻をアルギン酸リアーゼ（EC.4.2.2.3）またはλ-カラギナーゼ(Lambda-carrageenase、EC 3.2.1.162)またはペクチナーゼの酵素活性を持つ酵素で酵素処理することができる。酵素処理することで海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
　前述の海藻糖化液を得るための工程である海藻の細片化、膨潤、酸処理、酵素処理の工程はそれぞれを独立して連続して行ってもよいし、いずれかの工程を同時に行ってもよい。また、これらの工程の順序を変えて行ってもよい。
　アルギン酸リアーゼは、上述した酵素を利用することが出来、微生物に直接発現させて使用することも出来るし、別途単離したアルギン酸リアーゼを使用してもよい。
　ペクチナーゼはポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなどが利用できる。
　海藻に含まれるセルロースは、アルギン酸を含む多糖類を抽出、分離した後に、セルラーゼを加えることによって分解することが出来る。本発明において、セルラーゼとは、エンド－１，４－β－グルカナーゼとも称し、セルロースのβ１→４グルコシド結合を加水分解し、おもにセロビオースを生成する酵素を意味する。セルラーゼは、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、軟体動物などに存在する。本発明においては、セルラーゼの由来は問われず、微生物から抽出・精製したもの、或いは分子生物学的に製造したものを用いることもできる。
　本発明の細菌は上記に例示される抽出工程により精製したアルギン酸塩を資化出来る。本発明においてアルギン酸塩とは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムを意味し、本発明の細菌は、アルギン酸、アルギン酸塩を炭素源として最少培地で生育できる細菌が好ましい。例えば培地中のアルギン酸を0.5g/L以上、1g/L以上、又は2.5g/L以上の濃度で資化できる細菌が好ましい。本発明においては、細菌の栄養増殖に必要な成分を最小限に含む培地を最少培地とする。
　なお、本発明の細菌は、ビブリオ属細菌に属し、通常、種名は、Vibrio rumoiensi　sまたはVibrio alginovoraから選択される。
　本発明の細菌は、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する特徴があるが、例えば96％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性を有することが好ましい。定義される16SリボソームRNAを有するかどうかは、例えば16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列データと既知種の配列データとを比較し、既知種の配列データとを比較し系統解析を行って決定することができる。系統解析及び系統樹の作成方法は、例えば以下の手順に従って行なう。
　まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は公知であり、いずれの方法を使用してもよい。一般的には、細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが使用される。また市販のＤＮＡ抽出用の試薬も使用することができる。ゲノムＤＮＡは必ずしもインタクトな状態で抽出されなくてもよい。従って、試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行なうことのできる方法を適宜選択することができる。
　次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１６ＳリボソームＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーの配列は、少なくともラクノスピラ科に属する全ての既知細菌の１６ＳリボソームＲＮＡをコードする標的ＤＮＡが増幅されるよう適宜設計することができるが、通常、生物種を超えて保存された配列からなるプライマー（ユニバーサルプライマー）が使用される。またＰＣＲの条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。市販のＰＣＲ用試薬を使用して、添付の説明書に従って反応を行うことができる。
　ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製されたのち、その塩基配列が決定される。塩基配列の決定は定法に従って行なうことができる。
　決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベース及び相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌１６ＳリボソームＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高い相同性を示す既知配列を抽出することができる。例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のホームページを通じて、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡが利用できる。プログラムとしてｂｌａｓｔｎやｆａｓｔａを選択し、決定された塩基配列をクエリーとし、検索対象データベースとして１６Ｓ ｒＲＮＡ（Prokaryotes）を選択して検索を実施すれば、高い相同性を示す既知配列が抽出され出力される。細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータセットを含む限り、いかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる。また、上記以外の自体公知の相同性検索プログラムを用いることもできる。
　増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、単離された細菌の分類学的位置を特定することもできる。分子進化系統樹解析ソフトはインターネット等でも公開されており、それらを利用することができる（ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等）。系統樹解析の結果、単離された細菌がラクノスピラ科に属する細菌と同じクラスターにある場合、当該細菌を本発明のビブリオ属に属する細菌として同定することができる。
　本発明の細菌は、上記に示される海藻及び海藻を食源として生育する生物から取得されえる。例えば、サザエ、アワビ、タツナミガイ、ウマヅラハギ、ブダイ、マダイ、ベラ等から取得されえる。
　一態様において、本発明の細菌は、配列番号１で表される核酸配列と９５％以上の相同性を有する核酸配列を含む１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１で表される核酸配列を含む１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。ここで配列番号１は、後述するビブリオ属に属する本発明の細菌の１つ（NITE BP-01635株）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列を示す。核酸配列間の相同性は、上記の相同性検索プログラムＢＬＡＳＴを使用して計算される。
　細菌が上記１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有することは、上述の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析方法を用いて確認することができる。あるいは、下記に詳述する本発明の検出用試薬及び検出方法に従って、該遺伝子を特異的に検出し得るプライマー又はプローブを用いて、自体公知の方法（ＰＣＲ、サザンブロッティング、ＤＮＡアレイ等）により調べることが出来る。
　本発明者らが単離した、本発明の細菌の一例の菌株（NITE BP-01635株 本明細書中では、Vibrio sp. SA2とも呼ぶ）は、受託番号NITE P-01635で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に国内寄託され（受託日：２０１３年６月１３日）、２０１３年９月１３日にブタペスト条約の基づく国際寄託に移管され、NITE BP-01635の受託番号のもとで寄託されている。
　なお、本発明の細菌は、さらに物質生産能を有するように改変されていることが好ましい。
　本発明において、目的物質とは、本発明の細菌を用いて、目的物質が生産されれば、目的物質は問わないが、例えば、Ｌ－アミノ酸、核酸、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、１－プロパノール、１，３－プロパンジオール、１，２－プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールが挙げられる。
　本発明において、Ｌ－アミノ酸とは、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、グリシン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸を意味する。
　本発明において、核酸とは、プリンヌクレオシド、およびプリンヌクレオチドが挙げられる。プリンヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、キサントシン、およびアデノシンが挙げられる。本発明の細菌は、１種のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよい。本発明においては、１種のプリンヌクレオシドが製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオシドが製造されてもよい。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン－５’－リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン－５’－リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン－５’－リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン－５’－リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。
　本発明において、Ｌ－アミノ酸の生産能力を有するように改変するためには、以下の方法が選択される。
＜アミノ酸生産菌＞
　Ｌ－アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌は、上記のようなビブリオ属細菌の野生株にＬ－アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ－アミノ酸生産能を付与するためには、従来のコリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の育種に使用されてきた、栄養要求性変異株、Ｌ－アミノ酸アナログ耐性、または代謝制御変異株、Ｌ－アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組み換え株等の創製法を利用して育種することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター）。Ｌ－アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ－アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ－アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
　以下、各種アミノ酸生産能を付与するための方法を例示する。
＜Ｌ－リジン生産菌＞
　例えば、Ｌ－リジン生産菌は、Ｌ－ホモセリン、又はＬ－スレオニン及びＬ－メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ－（２－アミノエチル）-Ｌ－システイン、γ－メチルリジン、α－クロロカプロラクタム、ＤＬ－α－アミノ－ε－カプロラクタム、α－アミノ－ラウリルラクタム、アスパラギン酸－アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ－ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。特にＬ－リジンアナログとして、S-(2-アミノエチル)-Ｌ－システイン（AEC）に耐性を有する変異株として育種することが好ましい。
　ビブリオ属細菌から変異株を得るための変異処理法としては、紫外線照射、またはN－メチル－N'－ニトロ－N－ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、ビブリオ属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ－アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を得ることができる。
　Ｌ－アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したビブリオ属細菌を種々の濃度のＬ－アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。
　また、栄養要求性変異株は、ビブリオ属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ－アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
　次に、Ｌ－リジン生合成系酵素の活性の増強によってＬ－リジン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
　Ｌ－リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
　ビブリオ属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、ビブリオ属で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをビブリオ属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
　DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、ビブリオ属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12やビブリオ・ナトリージェンスIFO15636等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
　また、ビブリオ属の遺伝子は以下のGenBankのデータベースを利用することによって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
　アルギン酸リアーゼ活性を持ちアルギン酸を分解できることが知られているビブリオ属細菌としては以下の微生物種を挙げることができる。
Vibrio alginolytics
Vibrio splendidus 
Vibrio kanaloaei
Vibrio pomeroyi
 Vibrio chagasii
Vibrio lentus 
Vibrio cyclitrophicus
 Vibrio crassostreae
Vibrio halitiocoli
　また、ビブリオ属の遺伝子は下記表に記載のGenBankのデータベースのIDを参照することによって取得できる。具体的には、NCBIのURL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/から下記表のAssembly IDを入力し、各々のAssembly IDについてWGS(Whole Genome Sequence) Projectのページからダウンロードすることによってビブリオ属の遺伝子を取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。ビブリオ属由来の野生型DDPSはＬ－リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、ビブリオ属由来の野生型AKIIIはＬ－リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、ビブリオ属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ－リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。
　尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ－リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
　また、アルパルトキナーゼをコードする遺伝子は、ホモログが存在することがあり、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、遺伝子源は限定されない。
　ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　なお、アスパルトキナーゼ活性は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法によって測定することができる。また遺伝子はいずれも野生型遺伝子には限られず、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、各遺伝子の上記のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、上記機能が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。
　保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
　各遺伝子の上記オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
　遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
　また、ビブリオ属で機能するベクターとは、例えばビブリオ属で自律複製出来るプラスミドであれば、いずれでも用いることが出来る。ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる．選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。
　dapA及びlysCとビブリオ属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
　Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
　なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
　上記のように調製した組換えＤＮＡをビブリオ属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。ビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
　なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ－リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)（特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
　本発明のビブリオ属細菌はＬ－リジン排出活性を増強させることによってＬ－リジン生産能が高められた細菌であってもよい。例えば、ybjE遺伝子の発現量を増加させること、lysE遺伝子の発現量を増加させることでＬ－リジン排出活性を高めることができる（特開2005-237379、WO97/23697号パンフレット）。
　さらに、本発明のビブリオ属細菌は、さらに、Ｌ－アミノ酸の生合成経路から分岐してＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ－アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ－リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットを参照にして構築できる。
　これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一～二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、又はIS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
　例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでビブリオ属に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
　上記のようなＬ－リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ－アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ－アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
　Ｌ－トリプトファン生産菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強するように改変することによって構築できる。ここで、アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ－トリプトファン及びＬ－セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性をより強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子をビブリオ属に属する細菌に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる（国際公開第94/08031号パンフレット参照）。
　また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ－トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入する方法が挙げられる。（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ－トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
　また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損させたり、trpRに変異を導入することによっても好適なＬ－トリプトファン生産菌が得られる（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。
　さらに、Ｌ－トリプトファン生産菌は、Ｌ－フェニルアラニン及びＬ－チロシン要求性の形質を有するように改変することによっても構築できる。
　また、Ｌ－トリプトファン生産菌としては、３－ホスホセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）にすること、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株にすることによっても構築できる。
　Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ－ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３－デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５－エノール酸ピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる（欧州出願公開763127号明細書）。従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇させてもよい（欧州特許763127号明細書参照）。また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ－トリプトファンの場合、Ｌ－フェニルアラニン生合成系、Ｌ－チロシン生合成系を弱化させてもよい（US4,371,614）。
　また、３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロン酸－７－リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、エシェリヒア・コリのaroFを用いる場合、Ｎ末端より１４７番目のＬ－アスパラギン酸または１８１番目のＬ－セリンを他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６番目のＬ－アスパラギン酸、１４７番目のＬ－メチオニン、１５０番目のＬ－プロリンもしくは２０２番目のＬ－アラニンの１アミノ酸残基、または１５７番目のＬ－メチオニン及び２１９番目のＬ－アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424）。
　Ｌ－フェニルアラニン生産菌としては、上述のような改変のほかに、tyrA,tyrRを欠損させた株や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、又はyedA遺伝子を増幅した株を用いることができる。
　Ｌ－スレオニン生産能を有するビブリオ属に属する細菌として好ましいものは、Ｌ－スレオニン生合成系酵素を強化するように改変することによって取得できる。Ｌ－スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ－スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたビブリオ属に属する細菌に導入してもよい。例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を低下させることによって、スレオニン分解を抑制することができる。
　Ｌ－スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ－スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ－スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ－スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ－スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。したがって、この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
　また、Ｌ－スレオニンによるフィ－ドバック阻害を受けないようにビブリオ属細菌を改変するために、α－アミノ－β－ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性を付与してもよい。
　また、アスパルトキナ－ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ－リジンによるフィ－ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることができる。このようなフィ－ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、上述に記載した遺伝子より取得できる。
　Ｌ－スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子やそれらの遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することもＬ－スレオニン生産菌の育種に好適である。これらのＬ－スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
　また、Ｌ－スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ－ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ－スレオニン耐性、及び／又はＬ－ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123－135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ－スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
　Ｌ－グルタミン酸生産能を有するビブリオ属細菌を構築するためには、Ｌ－グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変することができる。Ｌ－グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素遺伝子の中では、CS、PEPC及びGDHのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい（米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書）。
　また、さらに６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増大するように改変してもよい（欧州特許出願公開1352966号明細書）し、Ｌ－グルタミン酸を排出するタンパク質をコードするyhfK遺伝子（WO2005/085419号パンフレット）やybjL遺伝子（WO2008/133161パンフレット）エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号３に示す。
　また、Ｌ－グルタミン酸生産能を有するビブリオ属に属する細菌としては、Ｌ－グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた細菌を用いてもよい。Ｌ－グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ－グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１－ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましく、２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損した菌株は、欧州特許0952221号公報、0955368号公報、米国特許5,378,616号公報を参照にして構築することが出来る。
　Ｌ－ヒスチジン生産能を有する細菌としては、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量が増大した細菌を用いてもよい。Ｌ－ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ATP ホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル-ATP ピロホスホヒドラーゼ（phosphoribosyＬ－ATP pyrophosphohydrolase）（hisIE）、ホスホリボシルフォルミミノ－５－アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase）（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（amidotransferase）(hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
　また、スルファグアニジン、D,Ｌ－1,2,4-triazole-3-alanine、及びストレプトマイシン耐性を付与することによってもＬ－ヒスチジン生産菌が得られる（ロシア2119536号）。
　Ｌ－システイン生産菌を構築するためには、シスタチオニン－β－リアーゼ活性が低下するように改変すること（特開2003-169668号公報）や、Ｌ－システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持させるように改変することが好ましい（特開平11-155571号公報）。
　Ｌ－アルギニン生産菌を得るためには、α－メチルメチオニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、Ｄ－アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ－（２－アミノエチル）－システイン、α－メチルセリン、β－２－チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するように改変することが好ましい。また、Ｌ－アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ－アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するように改変することも、Ｌ－アルギニン生産菌の育種法として好適である。
　またＬ－アルギニン生産能を有するビブリオ属細菌として、Ｌ－アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を増大させた細菌を用いることが出来る。例えば、Ｌ－アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ遺伝子（argA）としては、野生型の１５位～１９位に相当するアミノ酸配列が置換され、Ｌ－アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型酵素をコードする変異型遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
　Ｌ－ロイシン生産菌は、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、tyrB遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させること（特開2004-024259）、または4-アザロイシン又は5,5,5－トリフルオロロイシン耐性を有するように改変することによって取得することができる。また、Ｌ－ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作する用に改変すること、（欧州特許第1067191号明細書）、β－２－チエニルアラニン及びβ－ヒドロキシロイシンに耐性を有するように改変すること（米国特許第5,763,231号明細書）によっても好適なＬ－ロイシン生産菌を構築することが出来る。
　Ｌ－イソロイシン生産菌は、６－ジメチルアミノプリン耐性（特開平5-304969号公報）、Ｌ－イソロイシンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）、チアイソロイシン耐性（特開平5-130882号公報）、ＤＬ－エチオニン耐性（特開平5-130882号公報）、またはアルギニンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）を付与することによって取得することができる。また、組換え体ビブリオ属細菌は、Ｌ－イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強する方法（特開平2-458号公報、特開平2-42988号公報、特開平8-47397号公報）等によって得られる。
　Ｌ－バリン生産菌は、WO96/06926に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びプロトンATPaseを欠損する変異を有するように改変すること、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片を細胞内に導入することによって構築することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ－バリン及び／又はＬ－イソロイシン及び／又はＬ－ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ－バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書）。また、ilvGMEDAオペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
　また、本発明に用いるＬ－アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
　糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６－リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fba;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
　エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochrome bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
＜イソプロピルアルコール生産菌＞
　イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、イソプロピルアルコール生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼが挙げられる（WO2009/008377A1）。特に、これら４種酵素全ての活性を増強するのが好ましい。また、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、GntR（gntR）の活性が低下するように微生物を改変する方法が挙げられる。GntRとは、グルコン酸の代謝系をコードするオペロンの発現を負に制御する転写因子を指す。同オペロンは、具体的には、グルコン酸の取り込み系とグルコン酸のリン酸化酵素をコードする。例えば、エシェリヒア・コリには、２つのグルコン酸の代謝系、GntI系とGntII系、が存在するが、GntRはそれら両方の発現を抑制する。
　イソプロピルアルコール生産能を有する微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されていてよい。このような改変により、酸素供給が制限された培養条件下においても、乳酸の生産が抑制され、イソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。酸素供給が制限された培養条件とは、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ～２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、回転数２００～６００ｒｐｍのことをいう。
＜アセトン生産菌＞
　アセトンは、イソプロピルアルコール生産におけるイソプロピルアルコールの前駆体である。よって、アセトン生産能は、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法を一部利用することにより、付与又は増強することができる。例えば、アセトン生産能は、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ以外の上記例示したイソプロピルアルコール生合成系酵素、すなわちアセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼ、から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変することにより、付与又は増強することができる。
＜エタノール生産菌＞
　また、エタノール生産能を有する微生物としては、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入された変異株や、同株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）をさらに欠損させた株が挙げられる（J Mol Microbiol Biotechnol 2004, 8, 243-254）。また、エタノール生産能を有する微生物としては、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ遺伝子（pfl）およびフマル酸レダクターゼ遺伝子（frd）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入された株も挙げられる（Ann N Y Acad Sci. 2008, 1125, 363-372）。
＜２＞本発明の製造法
　本発明の目的物質の製造法は、上述の方法によって目的物質生産能を有するように育種されたビブリオ属に属する細菌を海藻から得られた炭素源を含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地又は菌体より目的物質を回収する方法である。
　使用する培地は、微生物を用いた目的物質の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、海藻から得られた炭素源を用いることが出来る。
　海藻から得られた炭素源とは、アルギン酸、セルロース、グルコース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天が挙げられる。例えば典型的な褐藻類ではアルギン酸とマンニトールとグルコースを5:8:1の割合で含む(Wargacki, et al. (2012) Science. 335.p308-313)。培地には海藻から得られた炭素源が含まれていれば、その他の糖源例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、グリセロール、エタノールが含まれていても構わない。
　窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることができる。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。また、本発明の細菌を培養する際には、ある一定濃度の塩を含んでいることがなお好ましい。塩とは目的物質がカウンタイオンと結合して塩化したものでもよいし、食塩（NaCl）でもよい。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
　また生育や生産性を向上させるようなＬ－アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ－リジン発酵の場合、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ホモセリン、Ｌ－イソロイシンを、Ｌ－スレオニン発酵の場合、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－ホモセリンを、Ｌ－トリプトファン発酵では、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。
　培養は好気的条件下で１～７日間実施するのがよく、培養温度は２５℃～４０℃が好ましく、好ましくは３０℃～３９℃、さらに好ましくは３４℃～３８℃がよい。培養中のｐＨは５～９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
　発酵液からの目的物質の回収は通常の方法で実施できる。例えば、発酵液からのＬ－アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ－アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ－アミノ酸は、フリー体のＬ－アミノ酸であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。また、回収されるＬ－アミノ酸は、目的とするL-アミノ酸以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたL-アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である。他の目的物質についても同様である。
　尚、本発明においては、NaClを培地中に0.5％以上存在させることが好ましく、好ましくは０．５～４％、さらに好ましくは０．７～３．５％培地中に存在させることが好ましい。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞Vibrio sp. SA2株の取得
　石川県七尾市灘浦地区で採取されたサザエをアルギン酸資化可能新規微生物のスクリーニングに用いた（採取された場所　北緯：37.0981  東経：137.0499付近の海）。
　120℃、0.15MPaで20分間オートクレーブ処理することにより滅菌したダイゴ人工海水SP溶液(和光純薬社製、組成は下記参照)に、前述のサザエの殻をハンマーで砕き、緑褐色の消化管内容物を青エーゼで1ループすくいとって懸濁した。重合度2000以上のアルギン酸ナトリウム（和光純薬社製一級試薬　300-400cP カタログ番号：192-09995）のみを炭素源として含むアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地（組成は下記参照）にサザエ消化管の懸濁液を適宜ダイゴ人工海水で希釈してプレーティングした。培養温度25℃で培養時間75時間静置培養し、多数のコロニー形成を確認した。
　エーゼでコロニーをかきとり、生理食塩水に懸濁した後生理食塩水で3回洗浄した後、新たに調製したアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地にプレーティングし、培養温度37℃で培養時間50時間静置培養し、コロニー形成を確認した株をさらにアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地でSIして、LB液体培地に15g/LのNaClを追加添加した培地4mLに懸濁して試験管培養を行った。培養温度は37℃、往復撹拌速度120rpmの条件で試験管振とう培養して吸光度600nmのODが0.3程度になったところで等量の滅菌20%グリセロールを加え-80℃で冷凍してグリセロールストックを作製し、超低温庫で保存した。最も早期にシングルコロニーを形成した菌株をSA2株と命名した。
ダイゴ人工海水SP組成
MgCl2・6H2O       9.474g/L
CaCl2・2H2O       1.328g/L
Na2SO4             3.505g/L
KCl                0.597g/L
NaHCO3            0.171g/L
KBr                0.085g/L
Na2B4O7・10H2O    0.034g/L
SrCl2               0.012g/L
NaF                  3mg/L
LiCl                  1mg/L
KI                   0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O  0.0008mg/L
NaCl                 20.747g/L
アルギン酸ナトリウム選抜寒天培地 組成
アルギン酸ナトリウム　   5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NaCl                    0.5 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   21.247g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
MgCl2・6H2O         9.474g/L
CaCl2・2H2O         1.328g/L
Na2SO4               3.505g/L
KCl                  0.597g/L
NaHCO3              0.171g/L
KBr                  0.085g/L
Na2B4O7・10H2O      0.034g/L
SrCl2                 0.012g/L
NaF                    3mg/L
LiCl                   1mg/L
KI                    0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O   0.0008mg/L
Bacto Agar               15g/L
＜実施例２＞Vibrio sp. SA2株の分子系統樹解析
　SA2株のグリセロールストック50μLをLB液体培地に15g/LのNaClを添加した寒天培地で37℃、16時間静置培養して得た菌体から、PurElute Bacterial Genomid Kit (Edgebio社製)を用いて全ゲノムDNAを抽出した。得られた全ゲノムDNAを次世代シークエンサーMiseq(イルミナ社製)にて分析し、BLAST解析（Altshul, et al. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs" (1997) Nucleic Acids Research. 25, p3389-3402）によって16S rRNA遺伝子全長の配列を取得した（配列番号１）。その結果、SA2株はVibrio rumoiensis type strain S-1株(DSM19141株)と16S rRNA遺伝子全長配列の比較において99.5%の相同性を示した(2塩基のギャップによる相違と6塩基の置換による相違を含む。図１)。
　得られたSA2株の16S rRNA遺伝子全長配列から分子系統樹推定ソフトウェアMEGA ver.5.0(Tamura, et al. "'MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods" (2011) Mol. Biol. Evol. 28, p2731-2739)を用いて近隣結合法（Saitou, et al. "The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenic trees" (1987) Mol. Biol. Evol. 4, p406-425）によって分子系統樹を作製した（図２）。近隣結合法に用いる塩基置換モデルとしてはKimura 2-parameter modelを用いた (Kimura. "A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences" (1980) J. Mol. Evol. 16, p111-120  参照) 。また作製した分子系統樹の樹形の信頼性を評価するため、1000回反復してブートストラップ法による検証を行った。（Felsenstein. "Confidence limits on phylogenics: an approach using the bootstrap" (1985) Evolution. 39, p783-791参照）
　分子系統解析の結果、SA2株はVibrio属の種によって形成されるクラスターに属することが明らかとなった。SA2株は、Vibrio rumoiensis、Vibrio litoralis、Vibrio caseiにより形成されるクラスターに属することがブートストラップ値98％で支持された。また、SA2株はVibrio rumoiensisとクラスターを形成し、そのクラスターは89％のブートストラップ値で支持された。以上の結果より、SA2株はVibrio属の近縁種であることが明らかになった。そのため、SA2株をVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）と命名した。
＜実施例３＞DNA-DNAハイブリダイゼーション法によるVibrio sp. SA2株の種の同定
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）は、BLAST解析から、16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が、Vibrio rumoiensisと99.5%、Vibrio litoralisと97.9%、Vibrio caseiと96.3%であった。16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が98.7%未満の微生物種は別種であると判断できるとの報告があるため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensisとのみ同種の微生物である可能性が考えられた（Stackebrandt, et al.''Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards.'' (2006)Microbiol. Today. 33, p152-155.）。
　そこで、DNA-DNAハイブリッド形成試験によるVibrio sp. SA2株の種の同定をVibrio sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strain の間で固定側DNAとプローブ側DNAを交換して3回ずつ実施した（川村好章著「細菌の系統分類と同定方法」(2000)日本細菌学雑誌. 55. p545-584、鈴木健一朗ら編「微生物の分類・同定実験法　分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に」(2000) p34-47参照）。
　その結果、Vibrio  sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strainのゲノムDNAは36－39％の値を示し、平均で37.5％の相同値を示した(下記表２)。現在、微生物の種はDNA-DNAハイブリッド形成試験による相同値の比較の結果、70％以上の相同値を示す菌株同士を同種とすると定義されている（Wayne, et al. "Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics." (1987) Int. J. Syst. Bacteriol. 37, p463-464.参照）。そのため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensis type strainと別種に属する新規種の微生物であるとわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
＜実施例４＞Vibrio sp. SA2株の電子顕微鏡写真撮影
（菌体の固定）
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度25℃で16時間静置培養した。得られた菌体を2%パラホルムアルデヒド, 2%グルタルアルデヒド, 0.1M カコジル酸緩衝液(cacodylate buffer) (pH7.4)に4℃の温度条件で一晩（約16時間）浸けこみ、菌体を固定処理した。0.1M cacodylate buffer (pH7.4)で4℃の温度条件で4回固定菌体を洗浄した。さらに、洗浄した固定菌体を1% タンニン酸, 0.1M cacodylate buffer (pH7.4)に4℃の温度条件で2時間静置し、二度目の固定処理を行った。この二度目の固定処理の後、0.1M cacodylate buffer (pH7.4)で4℃の温度条件で4回固定菌体を洗浄した。その後、2%オスミウムテトラオキシド, 0.1M cacodylate buffer (pH7.4)に4℃の温度条件で3時間静置した。
（脱水処理）
　前述の処理を行った固定菌体を、50%エタノールで4℃の温度条件で30分置換し、脱水処理を行った。続いて、70%エタノールで4℃の温度条件で30分置換し、脱水処理を行った。続いて、90%エタノールで25℃の温度条件で30分置換し、脱水処理を行った。さらに、室温にて100%エタノールで30分ずつ4回置換し、脱水処理を行い、さらに室温で100%エタノールで一晩置換し、固定化脱水菌体サンプルを取得した。
（凍結乾燥）
　前述のVibrio sp. SA2株の固定化脱水菌体サンプルを、室温で50% tert-ブチルアルコール 50% エタノール混合液で1時間置換した。さらに、室温にてtert-ブチルアルコールで1時間置換したのち、4℃の温度条件でtert-ブチルアルコールで1時間の置換を3回実施した。置換されたサンプルを凍結乾燥した。
（コーティング）
　凍結乾燥したサンプルを、日本レーザ電子社製オスミウム・プラズマコータ （カタログ番号：NL-OPC80NS）を用いてオスミウムの薄層（60nm）でコートした。
（観察と撮影）
　コートしたサンプルを、日本電子社製電子顕微鏡（カタログ番号：JSM-6340F）で加速電圧5kVの条件にて観察、撮影し、図５に示すVibrio sp. SA2株の電子顕微鏡撮影像を得た。この結果から、LB NaCl 15g/L添加寒天培地にて生育したVibrio sp. SA2株は、無鞭毛の桿状の菌体であることが示された。
＜実施例５＞Vibrio sp. SA2株のグラム染色試験結果
　MB2216(ベクトン・ディッキンソン社製)添加寒天培地にVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックを50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度30℃で24時間静置培養した。得られた菌体をグラム鑑別用染色液フェイバーG「ニッスイ」（日本製薬社製）を用いて常法に従い染色し、オリンパス社製光学顕微鏡BX50F4を用いて観察、撮影し図6に示すVibrio sp. SA2株の光学顕微鏡撮影像を得た。その結果から、Vibrio sp. SA2株は、グラム陰性細菌に属することが示された。
＜実施例６＞Vibrio sp. SA2株のマルチローカス遺伝子解析
　ビブリオ属の微生物種の同定にはビブリオ属のゲノムで保存されているハウスキーピング遺伝子を用いたマルチローカス遺伝子解析（複数の遺伝子を結合した配列を比較する分子系統樹解析）を実施することが一般的であるため、非特許文献５を参照しビブリオ属細菌のゲノムで保存されているハウスキーピング遺伝子の6遺伝子（atpA,pyrH,recA,rpoA,rpoDおよび16S rRNA遺伝子）の配列を用い、マルチローカス遺伝子解析を実施した。
　前述の配列番号１の16S rRNA遺伝子全長配列の取得と同様の方法で、Vibrio sp. SA2株のatpA,pyrH,recA,rpoA,rpoDの遺伝子の配列を取得した。
Vibrio sp. SA2株のatpA遺伝子については配列番号６に記載する。
Vibrio sp. SA2株のpyrH遺伝子については配列番号７に記載する。
Vibrio sp. SA2株のrecA遺伝子については配列番号８に記載する。
Vibrio sp. SA2株のrpoA遺伝子については配列番号９に記載する。
Vibrio sp. SA2株のrpoD遺伝子については配列番号１０に記載する。
　次に、データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)上で配列が公開されていた遺伝子と非特許文献６の方法に従い取得したVibrio casei, Vibrio litoralis, Vibrio rumoiensisのrpoD遺伝子配列、さらにウェブサイトThe Taxonomy of Vibrios(http://www.taxvibrio.lncc.br/)から取得したVibrio rumoiensisのpyrH遺伝子配列を用い、表３に示すマルチローカス遺伝子解析に用いる150遺伝子の配列を得た。
Vibrio caseiのrpoD遺伝子配列については配列番号１１に記載する。
Vibrio litoralisのrpoD遺伝子配列については配列番号１２に記載する。
Vibrio rumoiensisのrpoD遺伝子配列については配列番号１３に記載する。
Vibrio rumoiensisのpyrH遺伝子配列については配列番号１４に記載する。
　マルチローカス遺伝子解析には非特許文献７に記載のMEGA ver 5.0を用いた。
　また、系統樹推定法として非特許文献８に記載の近接結合法を用いた。塩基置換モデルとしては非特許文献９に記載のJukes and Cantorの方法を用いた。樹形の信頼性評価には非特許文献１０に記載の1000回反復のブートストラップ法を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　以上のビブリオ属細菌に特徴的なハウスキーピング遺伝子（atpA,pyrH,recA,rpoA,rpoDおよび16S rRNA遺伝子）の配列を用いたマルチローカス遺伝子解析により、Vibrio sp. SA2株は既報ビブリオ属細菌種のうちVibrio casei, Vibrio litoralis, Vibrio rumoiensisの3種で形成されるクラスターに含まれることが見出された（図７）。このクラスターは100％の高いブートストラップ値で支持された。さらにこのクラスターの中でもVibrio sp. SA2株はVibrio litoralisとクラスターを形成していた。そのため、このマルチローカス遺伝子解析からはVibrio sp. SA2株はVibrio litoralisと最近縁な関係にあることが示された。このクラスターは99％のブートストラップ値で支持されたが、両者には遺伝的距離が認められ、Vibrio sp. SA2株はVibrio litoralisと異なる種に属することが示された。さらに、前述の通り、Vibrio sp. SA2株は16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が、Vibrio litoralisと比較すると97.9%であった。16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が98.7%未満の微生物種は別種であると判断できるとの報告（Stackebrandt, et al.''Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards.'' (2006) Microbiol. Today. 33, p152-155.）がある。そのため、Vibrio sp. SA2株はマルチローカス遺伝子解析で最も近縁であると示されたVibrio litoralisと異なる種に属することが示され、新種のビブリオ属細菌に属する微生物であることが示された。
＜実施例７＞Vibrio sp. SA2株と近縁種の菌体脂肪酸組成分析
　Vibrio sp. SA2株が新種のビブリオ属細菌に属することが示されたことから、微生物種の化学分類性状の記載として一般的である菌体の脂肪酸組成分析をVibrio sp. SA2株とその近縁種について実施した。
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてVibrio rumoiensis (type strain DSM19141株)、Vibrio litoralis (type strain DSM17657株)、Vibrio casei (type strain DSM 22364株)のグリセロールストックをMB2216(ベクトン・ディッキンソン社製)添加寒天培地に50μLずつプレーティングし50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度30℃で24時間静置培養した。得られた菌体からSherlock Microbial Identification System(Version 6.0)の菌体脂肪酸組成分析操作マニュアル(Version6)に記載の方法に従い、Caldulation Method TSBA6およびライブラリーTSBA6を用いて、表4に記載の主要脂肪酸組成を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　以上の結果より、Vibrio sp. SA2株はマルチローカス遺伝子解析および16S rRNA遺伝子解析でクラスターを形成している近縁種とは異なった特徴の菌体脂肪酸組成を持つことが示された。
＜実施例８＞Vibrio sp. SA2株の生化学的特徴および生理学的特徴解析結果
　非特許文献１１に記載の方法に基づき、Vibrio sp. SA2株のカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、グルコースからの酸産生、グルコースからのガス産生、グルコースの酸化能/発酵能(O/Fテスト)およびO129への感受性について解析を実施した。その結果、Vibrio sp. SA2株は表5のような生理学的特徴を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　さらに、bioMerieux社製のグラム陰性細菌の生理学的特徴を解析するキットであるAPI20NEキットを用いてVibrio sp. SA2株を試験した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　さらにbioMerieux社製の微生物の生化学的特徴（酵素活性）を解析するキットであるAPI ZYMキットを用いてVibrio sp. SA2株の持つ種々の酵素活性を試験した。その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　以上の結果と至適培養条件の検討より、Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）は下記のような特徴を持つ微生物であると言える。
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）はグラム陰性細菌である。MB2216の寒天培地および液体培地で培養した際直径0.7-0.8μm幅1.5-2.5μmの大きさの桿菌であり、無鞭毛性で運動性を持たない。MB2216の寒天培地にて30℃.培養時間24時間培養すると薄黄色でなめらかで円状の直径2.0-3.0 mm のコロニーを形成する。MB2216の寒天培地および液体培地での培養時は温度4-40℃の間で生育可能であり、pH5-10の間で生育可能である。MB2216液体培地では温度25-30℃、pH7-8でNaClを1-14%添加された条件が生育に至適な条件である。NaClの添加濃度が15%を超えると、生育が不能となる。また、主要な構成菌体脂肪酸は16:1 w7c/16:1 w6c(38.18 %), 16:0(27.97 %), 18:1 w7c(14.28 %), 14:0 3OH/16:1 iso I(8.65 %), 12:0(3.86%), 18:0(2.03%)及び14:0(1.67%)となっていた。
　以上の結果と、本発明における16S rRNA全長配列比較解析、マルチローカス遺伝子解析、およびDNA-DNAハイブリダイゼーション試験結果から、Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）は既報の微生物種全てに該当しない新種のビブリオ属細菌に属すると示された。そのため、発明者はVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）を新種のビブリオ属細菌に属することを見出し、国際細菌命名規約に則りそのVibrio sp. SA2株が属する新種をVibrio alginovora と命名した。
＜実施例９＞Vibrio sp. SA2株の最少培地での試験管培養
　従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株の特徴として、40℃では高温すぎるため生育不可能であることと、アルギン酸リアーゼ活性を持たずアルギン酸資化能がないことが報告されていた（Garrity, et al.（2005）Bergey's manual of systematic bacteriology 2nd  Edition PartB p526-527）。そこで、発明者らはVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、メインの培養として下記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続9時間試験管培養を行なった。その結果、Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のアルギン酸資化による有意な生育が見られた。そのため、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なったアルギン酸資化能を有する新規微生物株であることが示された。
アルギン酸ナトリウム最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム　   2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   15.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
＜実施例１０＞Vibrio sp. SA2株の最少培地での３７℃における比最大増殖速度測定
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、上記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。
　同様の試験管培養をメインの培養に用いた培地を下記に示す２種の、グルコースを単一炭素源とするM9最少培地にそれぞれ変更して37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。結果を表８及び図３に示す。得られた生育のデータから、各々の条件での比最大増殖速度を測定した（図４）。その結果、アルギン酸ナトリウム最少液体培地でのVibrio sp. SA2株の比最大増殖速度がエシェリヒア・コリMG1655株のグルコースM9液体培地での比増殖速度の約2倍であることが明らかとなった。
グルコースM9液体培地 組成
グルコース　　　　　　   2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   0.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
グルコースM9 NaCl液体培地 組成
グルコース　　　　　　   2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   15.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
＜実施例１１＞Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での生育可能温度測定
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。また、Vibrio rumoiensis S-1株(DSM 19141株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度31.5℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、上記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、培養温度条件を37℃から43℃まで１℃ずつ変更した上、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。その結果、表９に示すようにVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）は40℃の培養温度でアルギン酸ナトリウム最少液体培地で良好に生育し、Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）が40℃でアルギン酸ナトリウムを資化可能な微生物であることが示された。以上の実験結果より、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なった40℃の高温で生育可能なアルギン酸資化能を有する新規微生物種に属する新規微生物株であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
＜実施例１２＞Vibrio sp. SA2株と他のVibrio属細菌との寒天培地での生育可能温度比較
　Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてVibrio rumoiensis (type strain DSM19141株)およびVibrio splendidus (type strain ATCC33125株)のグリセロールストックをLB ダイゴ人工海水SP(和光純薬工業　カタログ番号：395-01343) HTMLCONTROL Forms.HTML:Hidden.1 添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度25℃で16時間静置培養した。得られたシード培養菌体を白エーゼで10μL程度かきとり、LB ダイゴ人工海水SP添加寒天培地、アルギン酸ナトリウム選抜寒天培地、M9グルコースダイゴ人工海水SP添加寒天培地の3種類の培地にストリークし、25-39℃までの温度で48時間静置培養した。その結果、表１０に示すようにVibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のみが34℃の培養温度でアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地で良好に生育し、Vibrio sp. SA2株（NITE BP-01635株）のみが34℃以上の温度でアルギン酸ナトリウムを資化可能な微生物であることが示された。
M9グルコースダイゴ人工海水SP添加寒天培地組成
Glucose             　   5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   21.247g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
MgCl2・6H2O         9.474g/L
CaCl2・2H2O         1.328g/L
Na2SO4               3.505g/L
KCl                  0.597g/L
NaHCO3              0.171g/L
KBr                  0.085g/L
Na2B4O7・10H2O      0.034g/L
SrCl2                 0.012g/L
NaF                    3mg/L
LiCl                   1mg/L
KI                    0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O   0.0008mg/L
Bacto Agar               15g/L
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
＜実施例１３＞Vibrio sp. SA2株へのＬ－グルタミン酸生産能付与
　エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをPurElute Bacterial Genomic kit (Edgebio社製)を用いて抽出した。得られたゲノムDNAをテンプレートとして、配列番号３に示したYbjLタンパク質をVibrio sp. SA2株において異種発現させるため、配列番号４、配列番号５に示したプライマーでPCR反応を行い、増幅されたDNAを定法にしたがい精製し、制限酵素HindIII、SalIで消化したベクターpMW219（ニッポンジーン社製）にIn-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結して、ybjL増幅発現用プラスミドpMW219-ybjLを構築した。
　Vibrio sp. SA2株を、LB NaCl 15g/L液体培地40mLで坂口フラスコ2本にてOD600nmが0.5前後まで培養温度37℃、撹拌速度120rpmにて振とう培養した。得られた培養液80mLを回転速度7000rpm、運転時間7min、温度4℃の条件で遠心集菌した。氷上で冷やした滅菌された2mM HEPES, 100mMスクロース,5mM CaCl2溶液15mLで2回洗浄（懸濁後、回転速度7000rpm、運転時間7min、温度4℃の条件で遠心集菌）の後、滅菌された10% グリセロール溶液1mLに懸濁し、Vibrio sp. SA2株のエレクトロコンピテントセルを取得した。Vibrio sp. SA2株の100μLにエタノール沈殿したpMW219-ybjLプラスミドDNA(1μg以上)を加え、1.8kV 25μFでエレクトロポレーションして、Vibrio sp. SA2株にpMW219-ybjLを導入した。エレクトロポレーションしたエレクトロコンピテントセルに、LB NaCl 15g/L液体培地を0.5mL添加し、37℃で2.5時間静置培養して回復培養としたあと、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地で24時間静置培養を行い、コロニー形成を確認した。得られたコロニーをさらに40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地でSIして、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L液体培地4mLに懸濁して試験管培養を行った。培養温度は37℃、往復撹拌速度120rpmの条件で試験管振とう培養して吸光度600nmのODが0.3程度になったところで等量の滅菌20%グリセロールを加え-80℃で冷凍してグリセロールストックを作製し、得られた株のグリセロールストックをVibrio sp. SA2/ pMW219-ybjL株のグリセロールストックと命名した。
　アルギン酸ナトリウム5gを100mLの3N硫酸に添加し、65℃で3時間加温処理を行った。得られたアルギン酸ナトリウム加水分解物溶液をKOHを加えてpHが7.0となるように調製し、アルギン酸ナトリウム加水分解物糖液を取得した。得られたアルギン酸ナトリウム加水分解物糖液を用いて下記に示すアルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地を調製した。
アルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム加水分解物　   2.5g/L
Na2HPO4                          6 g/L
KH2PO4                　　　　　 3 g/L
NH4Cl                    　　　   1 g/L
NaCl                            15.5g/L
MgSO4・7H2O                   0.246g/L
Thiamine・HCl         　　　    10mg/L
カナマイシン　                     40mg/L
　Vibrio sp. SA2/ pMW219-ybjL株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地に均一に塗布し、30℃にて48時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、L字試験管にはりこんだ5 mLの前述のアルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地に、波長600nmの濁度が0.05になる液量を接種し、振とう培養装置TN-1506 (アドバンテック東洋社製)で回転攪拌数70rpm、34℃において22時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ－グルタミン酸の量をバイオテックアナライザーAS310（サクラ精機社製）を用いて測定した。
　結果を表１３に示す。表１３に示すように、アルギン酸を単一の炭素源として資化できる微生物として単離したVibrio sp. SA2株に、pMW219-ybjLを導入してＬ－グルタミン酸生産能を付与した菌株は、アルギン酸を単一の炭素源とする培地にて著量のＬ－グルタミン酸を蓄積した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
配列の説明
配列番号１：Vibrio sp. SA2株の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列
配列番号２：エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子の塩基配列
配列番号３：エシェリヒア・コリ由来のYbjLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：Vibrio sp. SA2株のatpA遺伝子の塩基配列
配列番号７：Vibrio sp. SA2株のpyrH遺伝子の塩基配列
配列番号８：Vibrio sp. SA2株のrecA遺伝子の塩基配列
配列番号９：Vibrio sp. SA2株のrpoA遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Vibrio sp. SA2株のrpoD遺伝子の塩基配列
配列番号１１：Vibrio caseiのrpoD遺伝子の塩基配列
配列番号１２：Vibrio litoralisのrpoD遺伝子の塩基配列
配列番号１３：Vibrio rumoiensisのrpoD遺伝子の塩基配列
配列番号１４：Vibrio rumoiensisのpyrH遺伝子の塩基配列
配列番号１５：Vibrio rumoiensisの16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列
　海洋性バイオマスからの有用物質生産が可能になる。

Claims (19)

  1. 　アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌であり、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する、ビブリオ属細菌。
  2. 　前記１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１を有する、請求項１に記載のビブリオ属細菌。
  3. 　アルギン酸を単一の炭素源として生育できることを特徴とする、請求項１または２に記載のビブリオ属細菌。
  4. 　ビブリオ・アルギノボーラに属することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のビブリオ属細菌。
  5. 　ビブリオ属NITE BP-01635株である、請求項１～４のいずれか一項に記載のビブリオ属細菌。
  6. 　目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻類から得られた炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、発酵法による目的物質の製造法。
  7. 　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する細菌である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、１６ＳリボソームRNA遺伝子が配列番号１を有する細菌である、請求項６に記載の方法。
  9. 　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、ビブリオ・アルギノボーラに属することを特徴とする、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、ビブリオ属NITE BP-01635株由来である、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記目的物質が、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、グリシン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記目的物質が、エタノールである、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記目的物質が、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、１－プロパノール、１，３－プロパンジオール、１，２－プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記細菌がＬ－アミノ酸生合成系酵素の活性が増強されたビブリオ属細菌である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記細菌がＬ－アミノ酸を排出するタンパク質の活性が増強されたビブリオ属細菌である、請求項６～１１及び１４のいずれか一項の記載の方法。
  16. 　前記Ｌ－アミノ酸を排出するタンパク質がybjLである、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻であることを特徴とする、請求項６～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天から選択される1種以上の炭素源であることを特徴とする、請求項６～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記海藻類から得られた糖類抽出物がアルギン酸を含有し、アルギン酸の加水分解をアルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応によって行ってから培養を行うことを特徴とする、請求項６～１８のいずれか一項に記載の方法。
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