WO2015000856A1 - Immortalisierte humane chorionzelllinie sowie verfahren zur immortalisierung humaner chorionzellen - Google Patents

Immortalisierte humane chorionzelllinie sowie verfahren zur immortalisierung humaner chorionzellen Download PDF

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WO2015000856A1
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genes
cells
chorionic
gene
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PCT/EP2014/063866
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Günter CICHON
Jonas Stanke
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the invention relates to an immortalized chorion cell line and a method for producing immortal cell lines from human embryonic chorionic tissue, and to the use of the cell line for producing recombinant protein and / or medicinal active substances.
  • tumor cells are used only in exceptional cases, as these are burdened by the presence of some undefined oncogenes or viral pathogens.
  • cell lines of animal origin e.g., COS cells
  • COS cells are more likely to be used to produce recombinant proteins.
  • the use of animal cell lines is burdened by undesirable contamination of the product with animal proteins, so that cell lines, which are of human origin but have no malignant background, have special value for the production of medicinal agents.
  • ESchG Embryo Protection Act
  • the invention is based on the finding that embryonic cells have many advantages as starting points for the production of cell lines.
  • EP 1 161 548 B2 describes the production of recombinant proteins in human cells by using adenovirus E1 protein coding sequences.
  • EP 1 161 548 B2 discloses a method for producing at least one recombinant protein in a cell comprising providing a cell comprising in its genome sequences encoding E1A and E1B of an adenovirus, the cell being in its genome does not include a sequence encoding a structural adenoviral protein, and wherein the cell is of a human embryonic
  • Retinoblast is derived.
  • Retinoblasts are the precursor cells of the retina. Their extraction is problematic, because it is essential to directly access to vital cells, which can be obtained only in the context of a termination of pregnancy.
  • An immortalized cell line is disclosed, for example, in WO 2001/036615 A2.
  • the cell line disclosed therein relates to a permanent amniocytic cell line containing at least one nucleic acid which effects the expression of the gene products of the E1 region of adenovirus.
  • the use of chorionic tissue as a starting point for the production of an immortalized cell line is neither disclosed nor suggested in WO 2001/036615 A2.
  • Chorionic tissue using adenoviral genes has hitherto not been disclosed or suggested in the prior art.
  • the invention therefore has the aim to use a different starting material, which is easy to win and beyond advantageous for further use.
  • the starting material used is preferably the embryonic portion of the placenta (the embryonic chorion).
  • the invention is therefore based on the object of providing means and corresponding methods by which substances can be synthesized which can ultimately serve as medicaments. This problem is solved by the features of claim 1. Further advantageous
  • the invention therefore relates to an immortalized human chorionic cell line.
  • the embryonic part of the placenta consists of the chorion plate, which rests on a thin egg skin (the amnion).
  • the maternal part of the placenta is the so-called decidua.
  • the chorion plate represents the main tissue component of the embryonic placenta and bears the brunt of the
  • Chorionic cells naturally synthesize a large number of endocrine factors and proteins, making them particularly suitable for use as a producer cell line for expression of recombinant human proteins and vaccines (MHF Sullivan, Endocrine cell lines from the placenta, Molecular and Cellular Endocrinology 228 (2004) 103 -1 19,
  • chorionic tissue not described. Immortalization of chorionic tissue using adenoviral genes has the advantage that the oncogenes used (adenovirus E1 genes) in the context of human cells only have a comparatively low transformation potential. In humans, no malignant tumors are known which are triggered by adenovirus E1 genes, so that the production of medical devices (recombinant proteins, vaccines, growth factors, hormones, etc.) on cell lines immortalized by adenovirus E1 genes appears to be safer from a biological safety point of view.
  • the invention also relates to an immortalized human chorionic cell originally derived from the embryonic portion of the placenta (the embryonic chorion).
  • the terms "cell line” and "cell” are both to be used for a description of the present invention.
  • Cell lines are cells of a tissue type that can breed in the course of cell culture. Both immortalized (immortal) cell lines and primary cells cultured (primary culture) are known in the art.
  • a primary culture is a non-immortalized cell culture obtained directly from a tissue.
  • the invention therefore relates to immortalized (immortal) cell lines and cells comprising
  • Chorionic tissue or chorionic cells are generated.
  • Immortalization is the removal of the limit on the number of
  • immortalized cells can divide as often as desired and can be propagated essentially indefinitely in cell culture.
  • a "permanent" or “immortalized” cell line is meant, according to the present invention, that the corresponding cells are in some way genetically engineered to grow substantially permanently in cell culture.
  • the immortalized cell line of the present invention enables the production of recombinant cells Proteins, recombinant adenoviruses or other medicinal agents in a cell line without risk of undesired contamination of the recombinant product with safety-relevant oncogenes
  • the immortalized human chorionic cell lines of the present invention are very well suited by their biological properties for the production of recombinant drugs.
  • the cell line (or the individual cells of the cell line) comprises nucleic acid sequences (or at least one nucleic acid) which encode one or more E1 genes of an adenovirus and preferably cause expression of the E1 gene products.
  • the E1 genes the E1a, E1b1 and / or E1b2 genes are preferred.
  • the (at least one) nucleic acid or nucleic acid sequences which causes the expression of the E1 gene products of adenovirus may be any suitable nucleic acid or nucleic acids which result in stable expression of these gene products.
  • the nucleic acid sequences are preferably exogenous nucleic acid sequences. Exogenous nucleic acid sequences are understood as meaning all sequences which have been used as transgene or other nucleic acid newly introduced into the cell (after isolation of the cell). To achieve the desired immortalization of cells over extended periods of time
  • the E1 sequences can be detected by PCR amplification from the genome of
  • Adenovirus type 5 complete genome: http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AC_000008.1).
  • E1 genes of human adenovirus serotype 5 were chosen for immortalization. In principle immortalization is also possible with E1 genes other adenoviruses of the 57 previously known different adenovirus serotypes.
  • Immortalization plasmids used Ad5 base position 437-3366: Preferred nucleotide sequence of the adenoviral E1 genes (SEQ ID NO: 1):
  • the aforementioned preferred adenoviral gene sequences encode the following
  • Ad5 E1a SEQ ID NO: 2
  • Ad5-E1b (19K) (SEQ ID NO: 3):
  • Ad5-E1b (55K) (SEQ ID NO: 4):
  • extrachromosomal e.g. as an episomally replicating plasmid or mini-chromosome.
  • extrachromosomal e.g. as an episomally replicating plasmid or mini-chromosome.
  • the expression of the various gene products can be one and the same
  • Nucleic acid molecule or, for example, different nucleic acid molecules are effected.
  • expression is understood in the prior art, the process of producing the product of a gene that is either a specific protein that causes a specific feature or a specific property, or RNA forms that are not translated into proteins (eg antisense RNAs, tRNAs).
  • RNA forms that are not translated into proteins (eg antisense RNAs, tRNAs).
  • suitable options for achieving the desired expression will be apparent to the person skilled in the art.
  • the introduction of an adenoviral E1 gene that partially deregulates the cell cycle shows a surprisingly good rate of transformation without the need for tumor-inducing agents.
  • adenoviral E1 genes to immortalize chorionic cells provides a means of generating a chorionic cell line by low-risk and non-tumor-inducing agents. Since the immortalized cell lines produced on the basis of the adenoviral E1 genes are non-tumorigenic, the recombinant cells produced in this cell line are Proteins for medical use in humans are significantly safer than proteins produced in an immortalized cancer cell line.
  • Another embodiment of the invention relates to immortalized human chorionic cells comprising nucleic acid sequences that result in (preferred continuous) expression of the CAR receptor.
  • the CAR receptor (cosackie and adenovirus receptor) improves the infectivity of chorionic cells with recombinant adenoviruses, which is advantageous in terms of the production of recombinant proteins and the production of adenoviral vaccines.
  • a particular aspect of the invention relates to the manner of linking the genes of the CAR receptor and the E1 genes required for the immortalization.
  • the linkage of these two genes is preferably in a manner that allows long term stable expression of the CAR receptor, although the CAR receptor does not contribute to the immortalization of the chorionic cells.
  • telomere is the reverse transcriptase subunit of the human telomerase complex (hTERT).
  • telomere sequences are deposited in online genebanks (e.g., NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AB085628.1).
  • Preferred nucleotide sequence human telomerase (SEQ ID NO. 5):
  • the (at least one) nucleic acid or nucleic acid sequences which brings about the expression of the telomerase can be any suitable nucleic acid or nucleic acids which lead to a stable expression of these gene products.
  • Nucleic acid sequences are preferably exogenous nucleic acid sequences. Exogenous nucleic acid sequences are understood as meaning all sequences which have been used as transgene or other nucleic acid newly introduced into the cell (after isolation of the cell).
  • the invention implements the artificial expression of key proteins useful for the
  • Immortality of the cells are effective, for example, the telomerase, the one
  • telomeres Preventing chromosome end-disruption during DNA replication in eukaryotes.
  • Telomerase restores the ends of the chromosomes, called telomeres. Immortalization by telomerase also provides a way to immortalize the cells by non-tumorigenic transformation.
  • telomere By using telomerase and / or adenoviral E1 genes, the telomerase and / or adenoviral E1 genes, the telomerase and / or adenoviral E1 genes, the telomerase and / or adenoviral E1 genes, the telomerase and / or adenoviral E1 genes, the telomerase and / or adenoviral E1 genes.
  • chorion cells are immortalized without significant phenotypic changes in native cells.
  • Another embodiment of the invention relates to an immortalized human
  • Chorion cell line characterized in that the nucleic acid sequences encoding one or more E1 genes of an adenovirus and / or telomerase are integrated in the genome at the locus of a tumor suppressor gene (e.g., p53 or Rb).
  • a tumor suppressor gene e.g., p53 or Rb.
  • Tumor suppressor gene refers to all genomic regions associated with the expression of the tumor suppressor gene.
  • such regions are the tumor suppressor encoding gene, the promoter of the gene and / or others
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing an immortal chorionic cell line, wherein human embryonic chorionic tissue is used as a starting tissue, which is immortalized by means of adenoviral E1 genes and / or human telomorase.
  • a further subject of the present invention is therefore a process for producing a permanent chorion cell line, in particular one as defined above
  • Chorion cell line characterized by transfecting chorionic cells with at least one nucleic acid which causes expression of the adenoviral gene products of the E1 a region and / or E1 b region, or a telomerase.
  • the resulting cell clones may then optionally be further isolated and cloned to obtain single cell lines, if desired.
  • the invention relates to a method for producing an immortal chorion cell line, comprising the following steps: a) providing and / or obtaining chorion cells, preferably of human
  • embryonic chorionic tissue as starting material; comprehensively favoring the culturing of the cells; b) transfecting the cells with nucleic acid sequences (or at least one
  • Nucleic acid encoding one or more E1 genes of an adenovirus and preferentially effecting the expression of the E1 gene products, and / or transfecting the cells with nucleic acid sequences (or at least one nucleic acid) encoding human telomerase and preferentially effecting the expression of telomerase; c) culturing the cells in cell culture; d) subcloning of the cells, whereby the cells are diluted so that (preferably under microscopic control) cell populations emerge, which emerge from a single cell. e) Cultivation of the cells in cell culture.
  • provision and / or recovery means any process that is suitable for the preparation of chorionic tissue.
  • Chorionic tissue obtained by biopsy. Alternatively, it can also be obtained from tissue obtained as part of spontaneous abortion and human genetic
  • the inventive method can also be carried out with already recovered or isolated chorionic tissue.
  • Biopsy extraction of chorionic tissue is also known as chorionic biopsy (chorion biopsy).
  • the invention therefore relates in a preferred embodiment to a method in which human embryos are not destroyed.
  • embryonic cells which are preferably obtained in the context of human genetic diagnostics and are usually discarded after completion of the studies, or cells obtained by biopsy can be used.
  • the invention may be characterized, in association with one or more of the embodiments disclosed herein, as a method of immortalizing human chorionic cells or as a method of producing immortal chorionic cell lines.
  • the method of the invention may comprise separating the chorionic cells from chorionic villus biopsy material.
  • the chorionic cells can be separated from amniocytes to produce the desired ones
  • Isolate chorionic cells as starting material.
  • Isolate chorionic cells as starting material.
  • a preferred embodiment (preferably under sterile conditions)
  • Chorionic tissue used in culture medium and then treated with an enzymatic digestion may comprise a trypsin and / or collagenase treatment, preferably for at least 10 minutes, or between 10 to 120 minutes, preferably between 20 and 60 minutes.
  • recombinant enzymes of non-animal origin are used here to reduce the risk of
  • the cells growing in cell culture are transfected with the nucleic acids according to the invention.
  • the isolated or provided chorionic cells can be cultured only about 4-6 passages. After successful integration and continuous expression of adenoviral E1 genes or telomerase, the growth inhibition is abolished and the relative proportion of transfected cells in the cell culture increases continuously.
  • the proportion of E1-expressing cells is about 15 to 35%, preferably 25%.
  • the proportion of human serum in the culture medium is maintained at 20% to 40%, preferably 30%.
  • the cells are subcloned.
  • the cells are isolated, for example under microscopic control in 96-well plates, so that it is ensured that a newly growing cell population from a single
  • the proportion of human serum in the culture medium is reduced to 15 to 20%, and after further 2 to 4, preferably 3 weeks to 7 to 15, preferably 10%. Subsequently, the proportion of human serum in the culture medium should be reduced 2 to 4 weeks later, preferably 3 weeks later to 2.5 to 7%, preferably 5%, then 2 to 4 weeks, preferably 3 weeks later to 1% to 5% , preferably 2.5%, and finally reduced to 0%. From this point on, the cells are preferably cultured under serum-free conditions (eg in 293-SFM (life technologies)).
  • the rate of division of the fastest clones is preferably 24-36 hours and the immortalization is complete.
  • transfection or “transfection” is understood here to mean any process which is suitable for introducing said nucleic acid (s) into the cells, examples of which are electroporation, liposomal systems of any type and combinations of these processes. Coprecipitation may be used In this type of transfection, the DNA is introduced into a mixture of calcium chloride and sodium phosphate.
  • the at least one nucleic acid which effects the expression of the adenoviral E1 gene products or telomerase may preferably be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, RNA and mRNA.
  • the nucleic acid is used in the form of a DNA expression vector. Examples include integrative vectors, bacterial plasmids, episomally replicating plasmids or mini-chromosomes. Preference is given to expression plasmids obtained by transfection into the genome of the recipient cell for
  • At least one nucleic acid is meant that the expression-causing elements can be located on one and the same nucleic acid as well as on different nucleic acids. For example, separate nucleic acids may be provided for expression of the gene products of the E1A and E1B regions.
  • the method according to the invention is characterized
  • the gene for the CAR receptor is expressed.
  • the invention further relates to a method for producing an immortal
  • Chorionic cell lines in which the gene used for immortalization e.g., adenovirus E1 genes or telomerase
  • shuts down by targeted homologous recombination to the locus of a tumor suppressor gene e.g., p53 or Rb
  • a tumor suppressor gene e.g., p53 or Rb
  • the invention relates to a process for the production of an immortal chorionic cell line in which the expression-controlling elements of the tumor suppressor gene are preserved, so that the loss of the
  • Tumorsuppressorgens reflectively increased promoter performance for the expression of the transgene (eg adenoviral E1 genes or telomerase) is used.
  • the transgene eg adenoviral E1 genes or telomerase
  • the invention relates to a method for the production of immortal chorion cell lines, which is characterized in that the insertion of the transgene DNA sequences are used which are homologous to the
  • the invention therefore relates to an immortalized human chorionic cell line, which is obtained by the production method according to the invention.
  • the immortalized human chorionic cell line may optionally be characterized by one or more of the method features or corresponding structural features disclosed in connection with the method.
  • the invention further relates to the use of the immortalized human chorion cell line according to the invention for the production of recombinant proteins and / or
  • a method of producing recombinant proteins which is performed on the basis of the immortalized human chorionic cell line, the cells containing a suitable expression cassette encoding one or more E1 genes of an adenovirus and / or a telomerase.
  • the recombinant protein produced is a human protein.
  • any protein can be expressed as the recombinant protein.
  • medicinally relevant human proteins are preferred.
  • human recombinant proteins are Human Growth Hormone (rHGH), Human Insulin (BHI), Follicle Stimulating Hormone (FSH), Factor VIII Kogenate, Erythropoietin (EPO), Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF), Filgrastim, alpha - galactosidase A alpha-L-iduronidase (rhIDU; laronidase), N-acetyl-4-sulfatase (rhASB;
  • Galsulfase tissue plasminogen activator (TPA), glucocerebrosidase, interferon (IF) or interferon beta-1b, or insulin-like growth factor 1 (IGF-1).
  • TPA tissue plasminogen activator
  • IF interferon
  • IGF-1b insulin-like growth factor 1
  • the chorion cell line according to the invention is generally suitable in particular for the production of adenoviral vectors which are characterized by deletions of the E1A and E1B genes.
  • Another aspect of the invention relates to a method for the production of recombinant adenoviruses using the immortalized human chorionic cell lines of the invention.
  • the recombinant adenoviruses E1 / E3 are deleted adenoviruses.
  • the invention further relates to the use of genes of the adenoviral E1 region for immortalizing a chorionic cell, wherein the genes of the adenoviral E1 region a Sequence identity to so-called E1-deleted adenoviruses of less than 90%, preferably less than 70% sequence identity, more preferably less than 50% sequence identity, to reduce the risk of unwanted recombination between the E1 -deleased adenoviruses and genes of the adenoviral E1 region to minimize.
  • a preferred embodiment is characterized in that the genes of the adenoviral E1 region do not have sufficient sequence homologies to so-called E1 -deleted adenoviruses in order to allow recombination between the E1 -deleased adenoviruses and genes of the adenoviral E1 region.
  • sequence identity can be determined by routine measures. A person skilled in the field of molecular biology will be able to check whether a certain sequence identity reduces the probability of recombination.
  • nucleic acid sequences can be altered without the
  • Amino acid sequence of the encoded protein change. Degenerate codons and thus the redundancy of the genetic code can be used for this. This can minimize the risks of recombination without causing functional changes in the protein.
  • the invention further relates to a method in which adenoviral E1 genes are introduced by homologous recombination into the genome of the (chorion) target cell in a manner which simultaneously leads to inactivation of individual tumor suppressor genes and in this way in a shortened period of time and in one higher proportion contributes to the immortalization and transformation of target cells.
  • Immortalization uses gene (e.g., adenovirus E1 genes or telomerase) targeted by homologous recombination at the locus of a tumor suppressor gene (e.g., p53 or Rb) and turns it off by the integration event.
  • gene e.g., adenovirus E1 genes or telomerase
  • a tumor suppressor gene e.g., p53 or Rb
  • the Amnion (Amnios, also sheep skin) is the thin, vaseless innermost egg skin and thus part of the amniotic sac of the amniotes (reptiles, birds and mammals).
  • the chorion (Zottenhaut) forms the middle and the decidua (Siebhaut) the external Eihaut.
  • the chorion is the outer part of the two embryonic layers of the amniotic sac, while the decidua belongs to the maternal part of the amniotic sac.
  • the chorion consists of the extraembryonic mesoderm and the trophoblast and forms the pediatric or embryonic part of the placenta, while the amnion presents the innermost layered epithelium of the amniotic sac and is responsible for a significant proportion of the production of the amniotic fluid.
  • Amnion and chorion differ from their anatomical location, function and genetic expression profile.
  • the chorionic tissue represents the main part of the embyonal placental tissue and bears the brunt of the metabolism between mother and child. About the Choriongwebe the embryo is supplied with nutrients and growth factors.
  • choroid cells similar to the liver are capable of producing a large number of hormones (such as human chorionic gonadotropin (HCG), pregnancy-associated protein A (PAPP-A), human placental lactogen (hPL), placental corticotropin releasing hormone),
  • Leukocyte protease inhibitors Elafine
  • enzymes or coagulation modulating factors Factor VII activating protease, Factor XIII
  • Factor VII activating protease Factor XIII
  • Diagnostics also a different way of sampling (either by amniocentesis or chorionic villus sampling). Furthermore, chorionic tissue accumulates in the context of abortions. While the fetus is inevitably lost in the event of abortion, the chorionic tissue remains vital for a longer period of time, from which in turn the chorion cells can be obtained. Due to the different
  • amniocentesis amniotic fluid by syringe and centrifuged the ammnocytes floating in it. Chorionic cells are never recovered in this way because there are no chorionic cells in the amniotic fluid.
  • the shiny, child-facing side of the placenta is the thin skin (Amnion), which can be detached from the placenta by a simple pull. Underneath, the chorionic tissue is displayed.
  • amnion and chorionic cells have morphological similarities in cell culture, they differ in their expression profile.
  • the chorion forms the so-called trophoblasts and amniotic cells by the height and the expression profile of so-called trophoblast markers such as CDX2, alpha and ß-HCG.
  • trophoblast markers such as CDX2, alpha and ß-HCG.
  • EOMES, EpCam / TROP1, ERR beta / NR3B2, FGF-4 and TROP-2 (Plouzek et al Placenta 1993
  • Chorionic tissue is therefore a biological material that becomes available without having to kill embryos.
  • the chorionic villus sampling also known as chorion biopsy, which is frequently performed as part of a pregnancy diagnosis, makes such material available in principle and without any moral-ethical complications.
  • the shaggy chorionic tissue is the precursor of the mother cake. It contains - as a rule - the same genetic information as the body cells of the embryo. The cells are usually harvested between the 10th and 12th week of gestation. There are two possible ways to remove the chorionic villi: (a) Transabdominal Method: Sub
  • chorionic cells In order to obtain and isolate endogenous proteins and active substances naturally produced by chorionic cells, as well as for use as a production platform for recombinant proteins (antibodies, coagulation factors, vaccines, hormones, etc.), chorionic cells are particularly suited to other embryonic tissues, since the production of growth hormones and nutrients belongs to their physiological determination.
  • a surprising aspect of the invention consists in the use of chorionic tissue for the establishment of new human cell lines, which, like amniotic cells, are uncritically accessible in the context of human genetic diagnostics, but not only by another anatomical situation but also by a different functional background distinguish different expression profile of amniotic cells.
  • a chorionic villi biopsy can usually be carried out earlier than an amniocentesis (since a certain amount of amniotic fluid must be present for the amniocentesis).
  • amniocentesis since a certain amount of amniotic fluid must be present for the amniocentesis.
  • early embryonic development chorionic tissue has an increased susceptibility to neoplastic developmental disorders (bladder moles, choriocarcinoma)
  • Chromosomal maldistribution indicating an increased tendency to transform and facilitates the attempt of intentional transformation or immortalization (eg by the stable expression of adenoviral E1 genes). Due to its physiological importance in the nutritive supply of the embryo and its diverse
  • chorionic tissues are particularly suitable for the establishment of cell lines for the production of recombinant drugs and proteins.
  • the immortalization or transformation of chorionic cells by stable transfection of one or more harmless to humans transgenes allows access to new human cell lines, which are characterized by a high biological safety profile and in a special way for the production of recombinant drugs are suitable.
  • Adenoviruses are a relatively homogeneous group of viruses characterized by an icosahedral capsid consisting mainly of the virally-encoded hexon, penton and fiber proteins and a linear, double-stranded DNA genome about 36 kilobases in size ( kb).
  • the viral genome contains at the ends the inverted terminal repeat sequences (ITRs), which are the viral origin of replication. Further, at the left end of the genome is the packaging signal required to package the viral genome into the viral capsids during an infection cycle.
  • ITRs inverted terminal repeat sequences
  • Adenoviruses have been isolated from many species.
  • Adenoviral vectors have mostly been derived from serotypes 2 (Ad2) and 5 (Ad5). Infections by Ad2 and Ad5 are endemic in humans. Ad2 and Ad5 are not oncogenic in humans and have a good one
  • E1 a is the first viral gene expressed after reaching the nucleus by the viral chromosome.
  • the E1 a gene encodes the 12S and HS proteins that are formed by alternative splicing of the E1 a RNA.
  • the E1A proteins activate the transcription of a number of cellular and viral genes through interaction with transcription factors.
  • the main functions of E1 a are a) the activation of the other early viral functions El b, E2, E3 and E4 and b) the induction of resting cells to enter the S phase of the cell cycle.
  • the sole expression of E1 A leads to programmed cell death of cells (apoptosis).
  • E1 B is one of the early viral genes activated by E1a.
  • the E1b gene encodes the EIB 55 kD protein and the EIB 19 kD protein, which result from alternative splicing of the E1b RNA.
  • the 55 kD protein modulates the progression of the cell cycle through interaction with the p53 tumor suppressor gene, is involved in the prevention of the p53 tumor suppressor gene
  • the E1b-19 kD protein is also important for the prevention of EIA-induced apoptosis of cells.
  • All human adenoviruses are capable of transforming cells in cell culture.
  • the co-expression of E1a and El b is generally preferred.
  • Embedded in the E1b transcription unit is the protein IX gene, which encodes a structural component of the viral capsid.
  • the genes of the so-called early region 1 (E1 region) of adenovirus serotype 5 (E1a, E1b1, E1b2) are not tumorogens for humans.
  • the cancer-inducing potential is other viral genes, e.g. that of HPV oncogenes E6 and E7 or that of SV40 virus (SV40 T antigen) is beyond dispute.
  • the use of genes of the adenoviral E1 region is therefore one way cells too
  • cell lines which have been immortalized by stable transfection of adenoviral E1 genes are suitable for the production of recombinant so-called E1 / E3 deleted adenoviruses, since the genes or gene functions deleted in the viruses functionally complement in this case by the packaging cell can be.
  • First generation adenoviral vectors (Gilardi et al., FEBS Letters 267, 60-62, 1990; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1, 241-256, 1990) are characterized by deletions of E1a and E1 b genes, and / or the E3 gene.
  • E1 have a and El b
  • E1a is required for the activation of viral genes and E1b for the accumulation of viral transcripts.
  • E3 is also deleted to increase the capacity for uptake of foreign DNA. E3 is dispensable for the production of adenoviruses in cell culture. The capacity for the
  • Second generation adenoviral vectors are characterized by deletions of E2 and / or E4 in addition to deletions of E1a and Elb (Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 6196-6200, 1994; Yang et al., Nature Genet., 7, 362-367, 1994; Gorziglia et al., J. Virol 70, 4173-4178, 1996; Krougliak and Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586, 1995;
  • Second generation adenoviral vectors have been developed to further reduce the transcription of viral genes and the expression of viral proteins and thus further reduce the antiviral immune response. The capacity for uptake of foreign DNA is not significantly increased over first generation adenoviral vectors. Second generation adenovirus vectors are produced in cell lines that complement the respective defect (E2 and / or E4) in addition to E1a and Elb.
  • the capacity for uptake of foreign DNA is about 37 kb, since the vast majority of the adenoviral genome is removed.
  • Various systems have been described for the preparation of adenoviral vectors of high DNA capacity (Kochanek et al., Supra; Parks et al., Proc Natl Acad Sci., USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy et al., J Viral 71, 1842-1849, 1997).
  • the advantage of these adenoviral vectors with high DNA capacity compared to adenoviral vectors of the first and second generation lies in the greater capacity for uptake of foreign DNA and in lower toxicity and immunogenicity (Schiedner et al., Nature Genet. 18, 180- 183, 1998; Morral et al., Hum. Gene Ther. 9, 2709-2716, 1998).
  • the E1 region is replaced by a therapeutic gene.
  • the production of this recombinant, a therapeutically valuable gene-bearing virus is e.g. by cotransfection of a so-called helper or transfer plasmid, in which the transgene is flanked on both sides by regions which are homologous to the virus genome.
  • the generation of a recombinant virus requires homologous recombination between the transfer plasmid and the viral genome. Both plasmids alone can not generate adenoviruses. However, if a co-transfection of a 293 cell with the two plasmids occurs by chance, genetic information can be exchanged
  • Concentrations of the virus for therapeutic trials will increase these adenoviruses that are not replicable in normal cells in the 293 helper cell line. These cells stably integrate the missing E1 region into their genome, provide the gene product for virus replication and thus allow amplification of the recombinant adenovirus. These adenoviruses can not replicate in any other cellular system.
  • Coagulation factors membrane proteins or cell cycle proteins.
  • Proteins that can be expressed from vectors produced in transformed chorionic cells are dystrophin (Hoffman et al., Cell 51, 919, 1987, Factor VIII (Wion et al., Nature 317, 726 1985, Cystic Fibrous Transmembrane Regulator Protein (CFTR) (Anderson et al., Science 251, 679, 1991, Omithine transcarbamylase (OTC) (Murakami et al., J. Biol. Chem., 263, 18437, 1988, Alphai-antitrypsin (Fagerhol et al., Hum Genet., Vol.
  • HSV herpes simplex virus
  • Vectors produced in transformed choriocells may contain, in addition to the therapeutic gene, any reporter gene to better track the expression of the vector.
  • reporter genes include e.g. the ⁇ -galactosidase gene (Fowler et al., Proc Natl Acad., USA 74, 1507, 1977).
  • Vectors that can be produced in transformed choriocells may contain more than a single gene. The maximum number of genes that can be produced in such vectors depends on the uptake capacity of the respective vector and on the gene size.
  • the cell line produced according to the invention is also suitable for the expression of
  • the cultivation and immortalization of the chorion cells takes place exclusively in the absence of materials of animal origin.
  • culture media which contain only human sera, or recombinant proteins or other components (growth factors, insulin, recombinant trypsin, etc.) of non-animal origin.
  • This application further describes a method for immortalization in which the transforming adenoviral E1 genes are introduced into the genome of the target cell by homologous recombination.
  • the homologous recombination is preferably carried out in the Location of tumor suppressor genes (especially in the loci of tumor suppressor genes p53 and retinoblastoma gene (Rb)).
  • Homologous recombination eliminates the function of these tumor suppressor genes. At the same time, recombination occurs in a manner that leaves intact the expression controlling elements of the tumor suppressor genes, that is, the promoter region above the start codon of the tumor suppressor gene and the polyadenylation region below the stop codon of the tumor suppressor gene.
  • Recombination can be used for the expression of immortalization genes (E1 genes, telomerase), which after the loss of the tumor suppressor gene reflectively increased promoter performance (the tumor suppressor gene).
  • E1 genes immortalization genes
  • telomerase telomerase
  • the integration of cells used for immortalization of cells takes place randomly in transcriptionally active of the genome of the target cell. From the experience in the production of knock-in or knock-out mice, in which certain gene functions are targeted to be switched off or on, it is known that the probability of a directed integration to a particular gene locus in the genome can be increased by the fact that the Gene is flanked by gene segments that are homologous to the target region in the genome. Typically, the homologous recombination then takes place in a manner in which the genes lying between the homologous elements are exchanged for the previously integrated in the genome shares.
  • the below Figure 4 explains the principle using the example of integration in the p53 locus. Basically, this principle can be applied to everyone
  • apoptosis inner cell death
  • Immortalization especially of primary cells of human origin, since stable integration of the immortalization gene (eg adenoviral E1 genes or human telomerase) simultaneously eliminates tumor suppressor function of the target cell (e.g., p53 or Rb). Basically, the probability of a homologous
  • Tumor suppressor functions increase the likelihood of successful cell transformation by a factor of 5-10 over simple untargeted stable integration.
  • Tumor suppressors are proteins that control the cell cycle. It is not so much the name of a protein function as a physiological definition. A Mutation or deletion of a tumor suppressor-encoding gene (tumor suppressor gene) increases the likelihood of cell division remaining. In this sense, tumor suppressor genes have a comparable effect on mutations such as proto-oncogenes. Examples of tumor suppressors are: p16: This protein family inhibits the CDKs and thus prevents a transfer from the G1 to the S-phase of the cell cycle. p27:
  • This protein controls the transition from G0 to the G1 phase of the cell cycle and prevents it, if it is increasingly formed.
  • Both virus-affected cells promote p27 formation via a tissue mediator (TGF-ß) as well as neighboring cells in the
  • Rb Rb normally encloses the transcriptional factor E2F, which is essential for the initiation of the S-phase. Phosphorylation gradually opens the envelope, leaving the transcription factor "released".
  • E2F transcriptional factor
  • the p53 This protein usually ensures that a cell divides only if its genome is intact. The protein p53 is measurable in many types of degenerate cells in an increased amount. It is also present in normally growing cells, but hardly or not at all in resting cells. In many tumor types, the gene coding for p53 has mutated. In some but not all tumors, the protein appears to act as a tumor suppressor. p53 plays a role in the regulation of the cell cycle, where it slows the activity of a number of genes. p53 is found in all vertebrates.
  • p53 is used as integration target to integrate the transgenes of the invention in the genome.
  • homologous recombination is known to one skilled in the art and refers to an exchange between two DNA sequence regions with sufficient sequence identity.
  • homologous can also be understood as having high sequence identity or similarity in the nucleotide sequence, so homologs can account for more than a 50%, 60%, 70%, and “homologous" double sequence DNA sequences %, 80%, or preferably more than 90% sequence identity to one another. The invention therefore encompasses the possible application of a
  • Sequence-specific recombination namely a targeted (ie not random) integration of DNA into a genome by recombination.
  • Recombination is widespread in genetic engineering and well known to one skilled in the art of molecular biology.
  • tools are available today that can be used to artificially produce recombinant DNA and introduce it into organisms.
  • DNA sequences can be cut with restriction enzymes on specific recognition sequences and recombined with ligases.
  • plasmids or viruses serve as vectors to transfer the recombinant DNA into the target organism.
  • Alternative to Conventional DNA cloning with restriction enzymes and ligases are also known, based on homologous recombination-based technologies, such as recombineering
  • the invention encompasses the use of nucleic acid sequences encoding one or more E1 genes of an adenovirus and / or telomerase.
  • the nucleic acid sequences are preferably selected from the group comprising: a) a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. 5;
  • nucleic acid molecule which is complementary to a nucleotide sequence according to a
  • c) a nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) or b) under stringent conditions hybridization conditions are known to a person skilled in the art, and are described, for example, in Sambrook, Molecular Cloning, Ed.1-3, Cold Spring Harbor, NY;
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has a sufficient
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) to e) which is modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and is functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) to e).
  • nucleic acid sequence provided that has sufficient sequence identity to be functionally analogous to the nucleic acid sequence according to item a), b) and / or c). For the purposes of the invention is called to the said nucleotide sequences or with these
  • Sequence variant can safely and effectively cause the desired immortalization of chorionic cells.
  • Functionally analogous sequences within the meaning of the invention are all
  • the nucleic acid molecule has at least 60%, preferably 70%, preferably 80%, very particularly preferably 90%, sequence identity to a nucleic acid molecule according to point a), b) and / or c).
  • Coexpression of the CAR receptor Almost all known viruses use mammalian cell infection to assist in the production of surface receptors that are naturally expressed by these mammalian cells and that have certain physiological functions in the context of a healthy cell. As part of an infection, the viruses first bind to the extracellular parts of these mostly membrane-bound receptors and then arrive in the context of natural mechanisms
  • Endocytosis inside the cell.
  • Human adenoviruses often use the CAR receptor for infection.
  • the natural role of the CAR receptor is binding to and
  • the level of expression of the CAR receptor in different tissues can vary widely, and embryonic nerve cells have a high number of CAR receptors, whereas they are barely detectable in adult neurons (Bergelson et al., Science 275 (5304): 1320 -3).
  • the CAR receptor In contrast to the expression of E1 genes, which are essential for the establishment and maintenance of the transformed state of a cell, the CAR receptor has
  • the expression of the CAR receptor has been linked to the expression of the E1 genes in a manner which makes a loss of the CAR receptor largely impossible ,
  • the CAR receptor gene and the adenoviral E1 genes have been linked together in a manner that ensures that E1 genes and the CAR receptor are always expressed together. This goal is achieved by the following arrangement of genes and expression-controlling elements. Just below the promoter (homologous regions) is the gene for the CAR receptor, which is followed by the complete gene of the adenoviral E1 region. Between the two genes lies a so-called
  • interribosomal entry site IRES site. If this expression cassette is stably incorporated into the genome of a host cell, the expression of the genes is necessarily always together, since initially only a so-called. Primary transcript (only one mRNA) is made, the but can bind to the ribosome via both the 5 'untranslated portion of the mRNA and the IRES sequence, resulting in the production of two different proteins from only one mRNA strand. Instead of a so-called IRES site, it is possible to introduce into the same target so-called self-cleaving sequences which also lead to the expression of two different gene products (see FIG. 5).
  • a plasmid was first commissioned for synthesis (gene art) carrying 1000 base pairs of the upstream region and 1000 base pairs of the downstream region of the human p53 gene.
  • a gene fragment from the genome of the human adenovirus serotype 5 genome was placed between these two p53 flanking sequences.
  • the gene fragment comprises the base pairs 438-3510 of the adenoviral wild-type genome.
  • At the 5 'end of this sequence is a short portion of the E1 -A promoter (position 438-559) and from base 560 the coding for E1 genes shares.
  • an additional polyadenylation signal was used (poly-A from bovine growth hormone).
  • FIG. 6 shows the p53-Ad5-E1 (final) plasmid.
  • the plasmid was cut with the restriction enzyme EcoRI, whereby unwanted sequence portions (ampicillin-resistance and the attachment site for bacterial DNA polymerase, the so-called origin of reolication (ori)) fall out of the plasmid (see plasmid map; 6).
  • the two gene fragments were separated on an agarose gel (0.8%) and the desired 5321 base pair segment was excised and purified.
  • the introduction of the DNA on chorion cells was carried out by calcium phosphate coprecipitation.
  • the DNA is transformed into a mixture of calcium chloride and
  • the source of primary chorionic cells is excess chorionic tissue, which is obtained after chorionic villus sampling, as well as the tissue produced as part of a natural abortion and subsequent genetic diagnosis.
  • tissue is then subjected to enzymatic digestion with trypsin / EDTA (0.05%) in medium (DMEM), first for about 30 minutes, and then preferably after about 60 minutes of digestion with collagenase.
  • trypsin / EDTA 0.05%) in medium (DMEM)
  • human recombinant trypsin from E. coli, biozol
  • recombinant collagen from Clostridium perfrigens, Sigma-Aldrich
  • the speed of the enzymatic digestion should be controlled microscopically every 10 minutes, since a too long incubation reduces the viability of the cells and too short digestion reduces the yield and only one
  • the process of cell release can be supported.
  • the cells released in this way are washed twice and cultured in DMEM culture medium (without animal additives) but with the addition of 30% human serum. After 24 hours, a change of medium and the dead cells are separated, since they can affect the growth of adhering to the bottom of the culture dish cells.
  • the cells are initially cultivated in 6-well plates (9 cm 2 per well). After the chorion cells have grown approximately 70% confluent, 10 ⁇ g pre-cut DNA (after EcoRI digestion) is evenly dripped into the cell medium by calcium transfection (in 200 ⁇ l transfection buffer). The size of the calcium crystals can be controlled under the microscope (the smaller the better). After 6 hours and after 24 hours, the medium is changed and the cells are washed once each gently with medium. If the transfection mixture is left on the cells for too long, too much of the cells will die off.
  • the proportion of E1-expressing cells is about 25%.
  • the proportion of human serum is kept at 30%. Now there is a subcloning of the cells.
  • the cells in a 96-well plate are thinned so strongly that under microscopic control in individual wells only a cell is detectable.
  • cell culture supernatant from the bulk culture is added for further cultivation (which still contains stimulating growth factors). Under these conditions, a complete tissue combination can be used again from individual cells.
  • the proportion of human serum is reduced to 20% every 3 weeks and then to 10%, then to 5%, to 2.5% and finally to 0% after a further 3 weeks. From this point on the cells are cultured under serum-free conditions in 293-SFM (life technologies).
  • FIG. 1 Organization of the adenovirus genome, location of the early genes.
  • the figure shows a scheme of organization of an adenovirus genome.
  • the approximately 35000 base pair genome is divided into 100 so-called mapunits (mu).
  • 1 mu measures approximately 350 base pairs (bp).
  • the genes of the so-called E1 region start at about 1.5 mu and end at about 10 mu, so span (involving the promoter and polyA region a range of about 3500 bp. Since the presence of these genes to a accelerated
  • Figure 4 Scheme of homologous recombination: The p53 gene is exchanged for the E1 gene without losing the expression-controlling elements of the p53 locus. In this way, after the loss of the p53 gene reflectively increased p53 promoter power can be used for expression of the transgene.
  • FIG. 5 The use of an interribosomal entry site (IRES) sequence between CAR receptor gene and E1 gene allows CAR receptor expression to be compulsorily linked to that of the E1 gene. Pair gene. In this way, a stable CAR receptor expression can be ensured without the use of a selection marker.
  • IRS interribosomal entry site
  • FIG. 6 Schematic representation of the p53-Ad5-E1 (final) plasmid.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine immortalisierte Chorionzelllinie und ein Verfahren zur Herstellung immortaler Zelllinien aus humanem embryonalem Choriongewebe, sowie die Verwendung der Zelllinie zur Herstellung von rekombinantem Protein und/oder medizinischer Wirkstoffe.

Description

IMMORTALISIERTE HUMANE CHORIONZELLLINIE SOWIE VERFAHREN ZUR IMMORTALISIERUNG HUMANER CHORIONZELLEN
BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft eine immortalisierte Chorionzelllinie und ein Verfahren zur Herstellung immortaler Zelllinien aus humanem embryonalem Choriongewebe, sowie die Verwendung der Zelllinie zur Herstellung von rekombinantem Protein und/oder medizinischer Wirkstoffe.
HINTERGRUND ZUR ERFINDUNG
Die Herstellung immortaler Zelllinien aus differenziertem (adulten) Gewebe oder Zellen humanen Ursprungs ist ein schwieriges und nur in Ausnahmefällen erfolgreiches Verfahren, da humane Zellen durch eine große Zahl von natürlichen Tumorsuppressorgenen vor unkontrollierter Teilung geschützt sind. Die meisten humanen Zellen, die heute in der medizinischen Forschung zu unterschiedlichsten Fragstellungen Verwendung finden, sind daher aus der Kultivierung bösartiger Tumore hervorgegangen. Die Entstehung eines bösartigen Tumors ist ein Vorgang, der sich normalerweise über 2-3 Jahrzehnte erstreckt und durch Mutation oder Fehlregulation den Funktionsverlust mehrerer Tumorsuppressorgene zur Voraussetzung hat.
Zur Produktion rekombinanter Proteine oder Impfstoffe, die einer medizinschen Verwendung zugeführt werden sollen, werden nur in Ausnahmefällen Tumorzellen herangezogen, da diese durch die Anwesenheit teilweise auch Undefinierter Onkogene oder viraler Erreger belastet sind. Aus diesem Grund werden zur Produktion rekombinanter Proteine eher Zelllinien tierischen Ursprungs (z.B. COS-Zellen) verwendet. Die Nutzung tierischer Zelllinien ist allerdings durch unerwünschte Kontaminationen des Produktes mit tierischen Eiweißen belastet, so dass Zelllinien, die humanen Ursprungs sind, aber keinen malignen Hintergrund haben, besonderen Wert zur Produktion medizinischer Wirkstoffe haben.
Ausgedehnte Transfektionsstudien in den 1970iger und 80iger Jahren haben deutlich gemacht, dass die Immortalisierung humaner embryonaler Zellen leichter gelingt, als die von aus adultem Gewebe stammenden Zellen, da embryonale Zellen natürlicherweise noch ein höheres Wachstumspotential und einen niedrigeren Differenzierungsgrad in sich tragen und noch nicht so stark durch epigenetische Regulation in ihrem Proliferationsverhalten eingeschränkt sind. So wurden häufig primäre humane embryonale Nierenzellkulturen als Zielzellen zur Bestimmung des transformierenden Potentials viraler Gene herangezogen. Auf diese Weise ist auch die weltweit verbreitet HEK (human embryonic kidney) 293 Zelllinie entstanden (Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Viral. 1977 Jul;36(1 ):59-74.), die initial durch Transfektion des kompletten Genoms eines Adenovirus Serotyp 5 hergestellt worden ist.
Das Embryonenschutzgesetz (ESchG) ist ein deutsches Gesetz zur Regelung der ln-vitro- Fertilisation und trifft eine Abwägung zwischen moralisch-ethisch vertretbaren Handlungen an Embryonen, sowie im weitesten Sinne Erbinformationen enthaltenen Zellen humanen Ursprungs, sowie der Freiheit von Wissenschaft und Forschung. Gegenwärtig schützt das ESchG die Nutzung pluripotenter Stammzellen bis zum 8-Zellstadium, betrifft jedoch nicht die Verwendung von embryonalem Gewebe, welches z.B. im Rahmen eines
Schwangerschaftsabbruches zugänglich wird.
Gleichwohl ist die wissenschaftliche oder kommerzielle Nutzung von Embryonen, die im Rahmen eines Schwangerschaftsabbruches zugänglich werden, wenn auch nicht verboten, so doch ethisch-moralisch nicht unkritisch.
Im Unterschied dazu erscheinen die Nutzung und der Rückgriff auf embryonale Zellen, die natürlicherweise im Rahmen der humangenetischen Diagnostik anfallen und die nach Abschluss der Untersuchungen üblicherweise verworfen werden, ethisch vertretbar.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass embryonale Zellen als Ausgangspunkt für die Herstellung von Zelllinien viele Vorteile aufweisen.
So beschreibt beispielsweise die EP 1 161 548 B2 die Herstellung von rekombinanten Proteinen in menschlichen Zellen durch Verwendung von Adenovirus E1 Protein kodierenden Sequenzen. Dabei offenbart die EP 1 161 548 B2 insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem rekombinanten Protein in einer Zelle, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die in ihrem Genom Sequenzen umfasst, die E1A und E1 B eines Adenovirus kodieren, wobei die Zelle in ihrem Genom keine Sequenz umfasst, die ein strukturelles adenovirales Protein codiert, und wobei die Zelle von einem humanen embryonalen
Retinoblasten stammt.
Retinoblasten sind die Vorläuferzellen der Netzhaut. Ihre Gewinnung ist problematisch, weil es unumgänglich ist hierzu direkt auf vitale Zellen zuzugreifen, die ausschließlich im Rahmen eines Schwangerschaftsabbruches gewonnen werden können. Eine immortalisierte Zelllinie wird beispielsweise in WO 2001/036615 A2 offenbart. Die darin offenbarte Zelllinie betrifft eine permanente Amniozyten-Zelllinie, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, die die Expression der Genprodukte der E1-Region von Adenovirus bewirkt. Die Anwendung von Choriongewebe als Ausgangspunkt für die Herstellung einer immortalisierten Zelllinie wird in WO 2001/036615 A2 weder offenbart noch nahegelegt.
Die Etablierung von stabilen Zelllinien aus Choriongewebe unter Nutzung starker Onkogene wie z.B. des SV40 T-Antigen oder der Papillomavirusonkogene E6 und E7 ist in der
Vergangenheit mehrfach gelungen (Lei et. al. (1992b), Graham et al. (1993), Shih et al.
(1998), Choy and Manyonda (1998), Khoo et al (1998)). Eine Immortalisierung von
Choriongewebe unter Nutzung adenoviraler Gene ist bislang im Stand der Technik weder offenbart noch nahegelegt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung hat daher das Ziel ein anderes Ausgangsmaterial zu verwenden, welches unproblematisch zu gewinnen und darüber hinaus vorteilhaft für die weitere Verwendung ist. Erfindungsgemäß wird bevorzugt als Ausgangsmaterial der embryonale Anteil der Plazenta (das embryonale Chorion) verwendet.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel und entsprechende Verfahren bereitzustellen, durch welche Substanzen synthetisiert werden können, die letztlich als Medikamente dienen können. Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1 . Weitere vorteilhafte
Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen beschrieben.
Die Erfindung betrifft daher eine immortalisierte humane Chorionzelllinie.
Der embryonale Anteil der Plazenta besteht aus der Chorionplatte, der eine dünne Eihaut (das Amnion) aufliegt. Der mütterliche Anteil der Plazenta ist die sog. Dezidua. Die Chorionplatte stellt den Hauptgewebeanteil der embryonalen Plazenta und trägt die Hauptlast des
Stoffwechsels zwischen mütterlichem und embryonalem Kreislauf.
Chorionzellen synthetisieren natürlicherweise eine große Zahl von endokrinen Faktoren und Proteinen, was sie in besonderer Weise zur Nutzung als Produktionszelllinie zur Expression rekombinanter humaner Proteine und Impfstoffe geeignet macht (M.H.F. Sullivan, Endocrine cell lines from the placenta, Molecular and Cellular Endocrinology 228 (2004) 103-1 19,
Mitchell et al. Progesterone synthesis by human amnion, chorion and decidua at term. Am. J. Obstet. Gynecol. 1987 157(2):349-53). Bisher ist im Stand der Technik die Immortalisierung einer Zelllinie auf Basis eines
Choriongewebes nicht beschrieben. Eine Immortalisierung von Choriongewebe unter Nutzung adenoviraler Gene hat den Vorteil, dass die genutzten Onkogene (Adenovirus E1-Gene) im Kontext menschlicher Zellen nur ein vergleichsweise niedriges Transformationspotential besitzen. Bei Menschen sind keine bösartigen Tumore bekannt, die durch Adenovirus E1- Gene ausgelöst werden, so dass die Herstellung von Medizinprodukten (rekombinante Proteine, Impfstoffe, Wachstumsfaktoren, Hormone, u.ä.) auf durch Adenovirus E1 -Gene immortalisierten Zelllinien sicherheitsbiologisch unkritischer erscheint.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine immortalisierte humane Chorionzelle, die ursprünglich aus dem embryonalen Anteil der Plazenta (dem embryonalen Chorion) gewonnen wurde. Die Begriffe„Zelllinie" und„Zelle" sind beide für eine Beschreibung der vorliegenden Erfindung anzuwenden. Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Laufe der Zellkultur fortpflanzen können. Es sind sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur) im Stand der Technik bekannt. Als Primärkultur bezeichnet man eine nicht-immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde. Die Erfindung betrifft daher immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien und Zellen, die aus
Choriongewebe bzw. Chorionzellen generiert werden.
Unter Immortalisierung versteht man die Aufhebung der Begrenzung der Anzahl von
Zellteilungen. Immortalisierte Zellen können sich im Gegensatz zu gewöhnlichen Zellen beliebig häufig teilen und lassen sich in Zellkultur im Wesentlichen unbegrenzt vermehren. Unter einer "permanenten" oder„immortalisierten" Zelllinie versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung, dass die entsprechenden Zellen in irgendeiner Weise derart genetisch verändert sind, dass sie im Wesentlichen permanent in Zellkultur weiterwachsen können. Die immortalisierte Zelllinie der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Proteinen, rekombinanten Adenoviren oder weitere medizinische Wirkstoffen in einer Zelllinie ohne Risiko von unerwünschten Kontaminationen des rekombinanten Produktes mit sicherheitsrelevanten Onkogenen. Außerdem sind die immortalisierten humanen Chorionzelllinien der vorliegenden Erfindung durch ihre biologischen Eigenschaften für die Herstellung von rekombinanten Wirkstoffen sehr gut geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die immortalisierte humane
Chorionzelllinie dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie (bzw. die einzelnen Zellen der Zelllinie) Nukleinsäuresequenzen (oder mindestens einen Nukleinsäure) umfasst, die ein oder mehrere E1-Gene eines Adenovirus kodieren und bevorzugt die Expression der E1- Genprodukte bewirken. Bei den E1 -Genen sind bevorzugt die E1 a-, E1 b1- und/oder E1 b2- Gene. Bei der (mindestens einen) Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenzen, die die Expression der E1 -Genprodukte von Adenovirus bewirkt, kann es sich um jede geeignete Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren handeln, die zu einer stabilen Expression dieser Genprodukte führen. Die Nukleinsäuresequenzen sind bevorzugt exogene Nukleinsäuresequenzen. Unter exogene Nukleinsäuresequenzen sind sämtliche Sequenzen zu verstehen, die als Transgen oder andere neu in der Zelle (nach Isolierung der Zelle) eingeführte Nukleinsäure verwendet wurden. Um die gewünschte Immortalisierung der Zellen über längere Zeiträume
beizubehalten, sollten die exogenen Nukleinsäuresequenzen bevorzugt in das Genom integriert sein. Die E1 -Sequenzen können über PCR-Amplifikation aus dem Genom von aus
Wildtypadenoviren isolierter DNA entnommen werden. Die genaue Lage der adenoviralen E1- Gene ist über online-Gendatenbanken zugängig (z.B. NCBI; beispielsweise human
Adenovirus Typ 5 komplettes Genom: http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AC_000008.1 ).
Im Beispielteil der vorliegenden Anmeldung wurden E1-Gene der humanen Adenovirusserotyp 5 zur Immortalisierung gewählt. Grundsätzlich ist eine Immortalisierung aber auch mit E1 - Genen andere Adenoviren der 57 bislang bekannten verschiedenen Adenovirusserotypen möglich.
Folgende Genabschnitte wurden für die Klonierung des bevorzugten
Immortalisierungsplasmides verwendet: Ad5 Basenposition 437 - 3366: Bevorzugte Nukleotidsequenz der adenoviralen E1 -Gene (SEQ ID NO. 1):
ttttattattatagtcagctgacgtgtagtgtatttatacccggtgagttcctcaagaggccactcttgagtg ccagcgagtagagttttctcctccgagccgctccgacaccgggactgaaaatgagacatattatctgccacgg aggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatctt ccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatc ccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttact cacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagaga gccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttc cacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttg caggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacc tgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaat tttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtct gaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgcta tcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttc taacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtggg cgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaac gccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgt aagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatata atgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctg tgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggc aaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctg tttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacac cggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgag cggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgcta ctgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggc ggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggct gaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagaggg agcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctga gtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccata gagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtgg cacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaa cggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggg gtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcc tggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggac cgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggct tcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccaca atgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtgg caactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcac gtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgg gtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagag catgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgag acccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtga ccgaggagctgaggcccgatcacttggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatac agattga
Die vorgenannten bevorzugten adenoviralen Gen-Sequenzen codieren für folgende
Genprodukte:
Bevorzugten Aminosäuresequenzen der adenoviralen E1 -Genprodukte (hAd5): Ad5 E1a (SEQ ID NO. 2):
MRHI ICHGGVITEEMAASLLDQLIEEVLADNLPPPSHFEPPTLHELYDLDVTAPEDPNEEAVSQI PDSVMLA VQEGIDLLTFPPAPGSPEPPHLSRQPEQPEQRALGPVSMPNLVPEVIDLTCHEAGFPPSDDEDEEGEEFVLDY VEHPGHGCRSCHYHRRNTGDPDIMCSLCYMRTCGMFVYSPVSEPEPEPEPEPEPARPTRRPKMAPAILRRPTS PVSRECNSSTDSCDSGPSNTPPEIHPVVPLCPIKPVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP
Ad5-E1 b (19K) (SEQ ID NO. 3):
MEAWECLEDFSAVRNLLEQSSNSTSWFWRFLWGSSQAKLVCRIKEDYKWEFEELLKSCGELFDSLNLGHQALF QEKVIKTLDFSTPGRAAAAVAFLSFIKDKWSEETHLSGGYLLDFLAMHLWRAVVRHKNRLLLLSSVRPAI IPT EEQQQQQEEARRRRQEQSPWNPRAGLDPRE
Ad5-E1 b (55K) (SEQ ID NO. 4):
MERRNPSERGVPAGFSGHASVESGCETQESPATVVFRPPGDNTDGGAAAAAGGSQAAAAGAEPMEPESRPGPS GMNVVQVAELYPELRRILTITEDGQGLKGVKRERGACEATEEARNLAFSLMTRHRPECITFQQIKDNCANELD LLAQKYSIEQLTTYWLQPGDDFEEAIRVYAKVALRPDCKYKISKLVNIRNCCYISGNGAEVEIDTEDRVAFRC SMINMWPGVLGMDGVVIMNVRFTGPNFSGTVFLANTNLILHGVSFYGFNNTCVEAWTDVRVRGCAFYCCWKGV VCRPKSRASIKKCLFERCTLGILSEGNSRVRHNVASDCGCFMLVKSVAVIKHNMVCGNCEDRASQMLTCSDGN CHLLKTIHVASHSRKAWPVFEHNILTRCSLHLGNRRGVFLPYQCNLSHTKILLEPESMSKVNLNGVFDMTMKI WKVLRYDETRTRCRPCECGGKHIRNQPVMLDVTEELRPDHLVLACTRAEFGSSDEDTD
Sie kann/können in das Genom der Zelle integriert, d.h. chromosomal, oder
extrachromosomal, z.B. als episomal replizierendes Plasmid oder Mini-Chromosom, vorliegen. Die Expression der verschiedenen Genprodukte kann dabei von ein und demselben
Nukleinsäuremolekül oder beispielsweise verschiedenen Nukleinsäuremolekülen bewirkt werden. Als "Expression" wird im Stand der Technik der Prozeß des Herstellens des Produkts eines Gens, das entweder ein spezifisches Protein ist, das ein spezifisches Merkmal oder eine spezifische Eigenschaft bewirkt, oder von RNA-Formen verstanden, die nicht in Proteine translatiert werden (z.B. antisense RNAs, tRNAs). Dem Fachmann werden angesichts der vorliegenden Beschreibung, insbesondere auch des vorgeschlagenen Verfahrens, geeignete Möglichkeiten zur Erzielung der gewünschten Expression ersichtlich sein. Die Einführung eines adenoviralen E1 -Gens, das den Zellzyklus teilweise dereguliert, zeigt eine überraschend gute Transformationsrate, ohne dass Tumorinduzierende Mittel erforderlich sind. Die Verwendung adenoviraler E1-Genen zur Immortalisierung von Chorionzellen stellt eine Möglichkeit der Erzeugung einer Chorionzelllinie durch risikoarme und nicht- tumorinduzierende Agentien dar. Da die auf Basis der adenoviraler E1-Gene hergestellten immortalisierten Zelllinien nicht Tumor auslösend sind, sind die in dieser Zelllinie hergestellten rekombinanten Proteine für die medizinische Anwendung im Menschen deutlich sicherer als Proteine, die in einer immortalisierten Krebszelllinie hergestellt wurden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft immortalisierte humane Chorionzellen, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die zu einer (bevorzugten kontinuierlichen) Expression des CAR-Rezeptors führen.
Der CAR-Rezeptor (Cosackie und Adenovirusrezeptor) verbessert die Infizierbarkeit von Chorionzellen mit rekombinanten Adenoviren, was hinsichtlich der Produktion rekombinanter Proteine und der Produktion adenoviraler Impfstoffe von Vorteil ist.
Ein besonderer Aspekt der Erfindung betrifft die Art der Verknüpfung der Gene des CAR- Rezeptors und der für die Immortalisierung benötigten E1-Gene. Die Verknüpfung dieser beiden Gene erfolgt bevorzugt in einer Weise, die eine dauerhaft stabile Expression des CAR- Rezeptors erlaubt, obwohl der CAR-Rezeptor keinen Beitrag zur Immortalisierung der Chorionzellen leistet.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft immortalisierte humane Chorionzelllinien, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die humane Telomerase kodieren und bevorzugt die Expression der Telomerase bewirken. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Telomerase die Reverse-Transkriptase-Untereinheit des humanen Telomerasekomplexes (hTERT).
Die Sequenzen der humanen Telomerase sind in online-Genbanken hinterlegt (z. B. NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AB085628.1 ).
Bevorzugte Nukleotidsequenz: humane Telomerase (SEQ ID NO. 5):
atgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactaccgcgaggtgctgccgctgg ccacgttcgtgcggcgcctggggccccagggctggcggctggtgcagcgcggggacccggcggctttccgcgc gctggtggcccagtgcctggtgtgcgtgccctgggacgcacggccgccccccgccgccccctccttccgccag gtgtcctgcctgaaggagctggtggcccgagtgctgcagaggctgtgcgagcgcggcgcgaagaacgtgctgg cctteggettcgcgctgctggacggggcccgcgggggcccccccgaggccttcaccaccagcgtgcgcagcta cctgcccaacacggtgaccgacgcactgcgggggagcggggcgtgggggctgctgctgcgccgcgtgggcgac gacgtgctggttcacctgctggcacgctgcgcgctctttgtgctggtggctcccagctgcgcctaccaggtgt gcgggccgccgctgtaccagctcggcgctgccactcaggcccggcccccgccacacgctagtggaccccgaag gcgtctgggatgcgaacgggcctggaaccatagcgtcagggaggccggggtccccctgggcctgccagccccg ggtgcgaggaggcgcgggggcagtgccagccgaagtctgccgttgcccaagaggcccaggcgtggcgctgccc ctgagccggagcggacgcccgttgggcaggggtcctgggcccacccgggcaggacgcgtggaccgagtgaccg tggtttctgtgtggtgtcacctgccagacccgccgaagaagccacctctttggagggtgcgctctctggcacg cgccactcccacccatccgtgggccgccagcaccacgcgggccccccatccacatcgcggccaccacgtccct gggacacgccttgtcccccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctcaggcgacaaggagcagct gcggccctccttcctactcagctctctgaggcccagcctgactggcgctcggaggctcgtggagaccatcttt ctgggttccaggccctggatgccagggactccccgcaggttgccccgcctgccccagcgctactggcaaatgc ggcccctgtttctggagctgcttgggaaccacgcgcagtgcccctacggggtgctcctcaagacgcactgccc gctgcgagctgcggtcaccccagcagccggtgtctgtgcccgggagaagccccagggctctgtggcggccccc gaggaggaggacacagacccccgtcgcctggtgcagctgctccgccagcacagcagcccctggcaggtgtacg gcttcgtgcgggcctgcctgcgccggctggtgcccccaggcctctggggctccaggcacaacgaacgccgctt cctcaggaacaccaagaagttcatctccctggggaagcatgccaagctctcgctgcaggagctgacgtggaag atgagcgtgcgggactgcgcttggctgcgcaggagcccaggggttggctgtgttccggccgcagagcaccgtc tgcgtgaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtgtgtacgtcgtcgagctgctcaggtcttt cttttatgtcacggagaccacgtttcaaaagaacaggctctttttctaccggaagagtgtctggagcaagttg caaagcattggaatcagacagcacttgaagagggtgcagctgcgggagctgtcggaagcagaggtcaggcagc atcgggaagccaggcccgccctgctgacgtccagactccgcttcatccccaagcctgacgggctgcggccgat tgtgaacatggactacgtcgtgggagccagaacgttccgcagagaaaagagggccgagcgtctcacctcgagg gtgaaggcactgttcagcgtgctcaactacgagcgggcgcggcgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgg gcctggacgatatccacagggcctggcgcaccttcgtgctgcgtgtgcgggcccaggacccgccgcctgagct gtactttgtcaaggtggatgtgacgggcgcgtacgacaccatcccccaggacaggctcacggaggtcatcgcc agcatcatcaaaccccagaacacgtactgcgtgcgtcggtatgccgtggtccagaaggccgcccatgggcacg tccgcaaggccttcaagagccacgtctctaccttgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctca cctgcaggagaccagcccgctgagggatgccgtcgtcatcgagcagagctcctccctgaatgaggccagcagt ggcctcttcgacgtcttcctacgcttcatgtgccaccacgccgtgcgcatcaggggcaagtcctacgtccagt gccaggggatcccgcagggctccatcctctccacgctgctctgcagcctgtgctacggcgacatggagaacaa gctgtttgcggggattcggcgggacgggctgctcctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctcac ctcacccacgcgaaaaccttcctcagctatgcccggacctccatcagagccagtctcaccttcaaccgcggct tcaaggctgggaggaacatgcgtcgcaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcacagcctgtttctgga tttgcaggtgaacagcctccagacggtgtgcaccaacatctacaagatcctcctgctgcaggcgtacaggttt cacgcatgtgtgctgcagctcccatttcatcagcaagtttggaagaaccccacatttttcctgcgcgtcatct ctgacacggcctccctctgctactccatcctgaaagccaagaacgcagggatgtcgctgggggccaagggcgc cgccggccctctgccctccgaggccgtgcagtggctgtgccaccaagcattcctgctcaagctgactcgacac cgtgtcacctacgtgccactcctggggtcactcaggacagcccagacgcagctgagtcggaagctcccgggga cgacgctgactgccctggaggccgcagccaacccggcactgccctcagacttcaagaccatcctggactga Die vorgenannten bevorzugten Sequenzen kodieren für humane Telomerase-reverse
Transkriptase.
Bevorzugte Aminosäuresequenz der humanen Telomerase (SEQ ID NO. 6):
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLAT VRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPS RQ VSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGD DVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAP GARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGT RHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIF LGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAP EEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWK MSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKL QSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSR VKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIA SIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASS GLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPH LTHAKTFLSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRF HACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRH RVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
Bei der (mindestens einen) Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenzen, die die Expression der Telomerase bewirkt, kann es sich um jede geeignete Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren handeln, die zu einer stabilen Expression dieser Genprodukte führen. Die
Nukleinsäuresequenzen sind bevorzugt exogene Nukleinsäuresequenzen. Unter exogene Nukleinsäuresequenzen sind sämtliche Sequenzen zu verstehen, die als Transgen oder andere neu in der Zelle (nach Isolierung der Zelle) eingeführte Nukleinsäure verwendet wurden.
Die Erfindung setzt die künstliche Expression von Schlüsselproteinen um, die für die
Unsterblichkeit der Zellen wirksam sind, beispielsweise die Telomerase, die eine
Beeinträchtigung der Chromosomenenden während der DNA-Replikation in Eukaryonten vermeidet. Telomerase stellt die Endstücke der Chromosomen, die sogenannten Telomere, wieder her. Eine Immortalisierung mittels Telomerase stellt ebenfalls eine Möglichkeit dar, mittels einer nicht tumorerzeugenden Transformation, die Zellen zu immortalisieren.
Durch die Anwendung von Telomerase und/oder adenoviralen E1-Gene können die
Chorionzellen überraschenderweise ohne erhebliche phänotypischen Änderungen der nativen Zellen immortalisiert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine immortalisierte humane
Chorionzelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die ein oder mehrere E1-Gene eines Adenovirus und/oder Telomerase kodieren, im Genom an den Genort eines Tumorsupressorgens (z.B. p53 oder Rb) integriert sind. Der„Genort" eines
Tumorsupressorgens betrifft sämtliche Genomregionen, die in Zusammenhang mit der Expression des Tumorsupressorgens stehen. Insbesondere sind solche Regionen das tumorsupressorkodierende Gen, der Promoter des Gens und/oder weitere
Promoter/Enhancer-Kombinationen, die einen Einfluss auf die Genexpression des
Tumorsupressors aufweisen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine immortalisierte humane
Chorionzelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass das Tumorsuppressorgen durch das
Integrationsereignis ausgeschaltet ist. Die„Ausschaltung" eines Gens betrifft sämtliche mögliche Änderungen des Gens, die zu einer reduzierten, inhibierten oder bevorzugt nichtvorhandenen Expression des Gens führen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie, wobei humanes embryonales Choriongewebe als Ausgangsgewebe verwendet wird, welches mittels adenoviraler E1 -Gene und/oder humaner Telomorase immortalisiert wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer permanenten Chorionzelllinie, insbesondere einer wie vorangehend definierten
Chorionzelllinie, gekennzeichnet durch das Transfizieren von Chorionzellen mit mindestens einer Nukleinsäure, die die Expression der adenoviralen Genprodukte der E1 a-Region und/oder E1 b-Region bewirkt, oder einer Telomerase. Die erhaltenen Zellklone können dann gegebenenfalls weiter isoliert und unter Erhalt von Einzelzelllinien, wenn gewünscht, kloniert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung und/oder Gewinnung von Chorionzellen, bevorzugt von humanem
embryonalem Choriongewebe als Ausgangsmaterial; umfassend bevozugt das Inkulturbringen der Zellen; b) Transfektion der Zellen mit Nukleinsäuresequenzen (oder mindestens einen
Nukleinsäure), die ein oder mehrere E1-Gene eines Adenovirus kodieren und bevorzugt die Expression der E1 -Genprodukte bewirken, und/oder Transfektion der Zellen mit Nukleinsäuresequenzen (oder mindestens einen Nukleinsäure), die humane Telomerase kodieren und bevorzugt die Expression der Telomerase bewirken; c) Kultivierung der Zellen in Zellkultur; d) Subklonierung der Zellen, wobei die Zellen so verdünnt werden, dass (bevorzugt bei mikroskopischer Kontrolle) Zelllpopulationen entstehen, die aus einer einzelnen Zelle hervorgehen. e) Kultivierung der Zellen in Zellkultur.
Unter dem Begriff„Bereitstellung und/oder Gewinnung" wird hierin jedes Verfahren verstanden, dass zur Vorbereitung von Choriongewebe geeignet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das humane embryonale
Choriongewebe mittels Biopsie gewonnen. Alternativ kann es auch aus Gewebe gewonnen werden, das im Rahmen eines Spontanabortes anfällt und einer humangenetischen
Diagnostik zugeführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit bereits gewonnenen oder isolierten Choriongewebe durchgeführt werden.
Die Gewinnung von Choriongewebe durch Biopsie ist auch als Chorionzottenbiopsie (engl, chorion biopsie) bekannt. Die Chorionzottenbiopsie, auch Chorionbiopsie genannt, ist eine Untersuchungsmethode der pränatalen (= vorgeburtlichen) Diagnostik. Es sind zwei Arten möglich, um die Chorionzotten zu entnehmen: 1 ) Transabdominale Methode: Unter
Ultraschallkontrolle wird durch die Bauchdecke der Schwangeren eine Nadel in die Plazenta vorgeschoben und Gewebe entnommen (= Punktion). 2) Transzervikale Methode: Ein dünner Schlauch (Katheter) wird über die Vagina und den Gebärmuttermund in die Plazenta (= Mutterkuchen) geführt und Choriongewebe entnommen.
Die Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren, in dem menschlichen Embryonen nicht zerstört werden. Als Ausgangsmaterial können embryonale Zellen, die bevorzugt im Rahmen der humangenetischen Diagnostik anfallen und die nach Abschluss der Untersuchungen üblicherweise verworfen werden, oder Zellen, die durch eine Biopsie gewonnen werden, verwendet werden.
Die Erfindung kann - in Zusammenhang mit einem oder mehreren der hierin offenbarten Ausführungsformen - als ein Verfahren zur Immortalisierung humaner Chorionzellen oder als ein Verfahren zur Herstellung immortaler Chorionzelllinien gekennzeichnet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren eine Trennung der Chorionzellen aus dem Material der Chorionzottenbiopsie umfassen. Beispielsweise können die Chorionzellen von Amniozyten getrennt werden, um die gewünschten
Chorionzellen als Ausgangsmaterial zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird (bevorzugt unter sterilen Bedingungen)
Choriongewebe in Kulturmedium eingesetzt und anschließend mit einem enzymatischen Verdau behandelt. Diese Behandlung kann eine Trypsin- und/oder Collagenase-Behandlung umfassen, bevorzugt für mindestens 10 Minuten, oder zwischen 10 bis 120 Minuten, bevorzugt zwischen 20 und 60 Minuten. In einer bevorzugten Ausführungsform finden hier rekombinante Enzyme nicht-tierischer Herkunft Verwendung, um das Risiko einer
unerwünschten Kontamination mit Kranheitsrerregern tierischen Ursprungs niedrig zu halten.
Anschließend werden die in Zellkultur wachsenden Zellen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren transfiziert. Ohne Zugabe transformierender Agentien können die isolierten bzw. bereitgestellten Chorionzellen nur ca. 4-6 Passagen kultiviert werden. Nach erfolgreicher Integration und kontinuierlicher Expression von adenoviralen E1 -Genen bzw. Telomerase wird die Wachstumshemmung aufgehoben und der relative Anteil von transfizierten Zellen in der Zellkultur steigt kontinuierlich an.
4 bis 8 Wochen, bevorzugt 6 Wochen nach Transfektion liegt der Anteil an E1 -exprimierenden Zellen bei etwa 15 bis 35 %, bevorzugt 25%. Während dieser Zeit wird der Anteil an humanen Serum im Kulturmedium bei 20% bis 40%, bevorzugt 30% gehalten.
Um eine reine Zellpopulation zu erhalten werden die Zellen subkloniert. Hierbei werden die Zellen beispielsweise unter mikroskopischer Kontrolle in 96-well Platten vereinzelt, so dass sichergestellt ist, dass eine neu auswachsende Zellpopulation aus einer einzelnen
Vorläuferzelle hervorgegangen ist.
Nach der Sub-Klonierung wird der Anteil an humanem Serum in der Kulturmedium
kontinuierlich reduziert um die Zellen letztendlich unter serumfreien Bedingungen kultivieren zu können.
Zu diesem Ziel ist nach der Sub-Klonierung in einer Ausführungsform vorgesehen, den Anteil an humanem Serum in der Kulturmedium auf 15 bis 20%, und nach weiteren 2 bis 4, bevorzugt 3 Wochen auf 7 bis 15, bevorzugt 10% reduziert wird. Anschließend sollte der Anteil an humanem Serum in der Kulturmedium 2 bis 4 Wochen später, bevorzugt 3 Wochen später auf 2,5 bis 7%, bevorzugt 5% reduziert werden, dann 2 bis 4 Wochen, bevorzugt 3 Wochen später auf 1 % bis 5%, bevorzugt 2,5%, und schließlich auf 0% reduziert werden. Von diesem Zeitpunkt an werden die Zellen bevorzugt unter serumfreien Bedingungen (z. B. in 293-SFM (life technologies)) kultiviert.
Nach 5 bis 7 Monaten, bevorzugt 6 Monaten, liegt die Teilungsgeschwindigkeit der schnellsten Klone bei bevorzugt 24-36 Stunden und die Immortalisierung ist abgeschlossen. Unter dem Begriff "Transfizieren" oder„Transfektion" wird hierin jedes Verfahren verstanden, dass sich zum Einbringen der genannten Nukleinsäure(n) in die Zellen eignet. Als Beispiele sind die Elektroporation, liposomale Systeme jeglicher Art und Kombinationen dieser Verfahren zu nennen. Calciumphosphat-Copräzipitation kann eingesetzt werden. Bei dieser Art der Transfektion wird die DNA in ein Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat eingebracht.
Bei der mindestens einen Nukleinsäure, die die Expression der adenoviralen E1 -Genprodukte oder Telomerase bewirkt, kann es sich bevorzugt um genomische DNA, cDNA, synthetische DNA, RNA und mRNA handeln. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure in Form eines DNA- Expressionsvektors verwendet. Beispiele hierfür sind integrative Vektoren, bakterielle Plasmide, episomal replizierende Plasmide oder Mini-Chromosomen. Bevorzugt sind Expressionsplasmide, die durch Transfektion in das Genom der Empfängerzelle zur
Integration gebracht werden.
Mit dem Ausdruck "mindestens eine Nukleinsäure" wird zum Ausdruck gebracht, dass die die Expression bewirkenden Elemente sich sowohl auf einer und der gleichen Nukleinsäure als auch auf verschiedenen Nukleinsäuren befinden können. Beispielsweise können getrennte Nukleinsäuren für die Expression der Genprodukte der E1A- und E1 B-Regionen vorgesehen sein.
In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch
gekennzeichnet, dass zusätzlich zu adenoviralen-E1 -Genen das Gen für den CAR-Rezeptor exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer immortalen
Chorionzelllinien, bei dem das zur Immortalisierung verwendete Gen (z.B. adenovirus E1 - Gene oder Telomerase) durch gezielte homologe Rekombination an den Genort eines Tumorsuppressorgens (z.B. p53 oder Rb) und dieses durch das Integrationsereignis ausschaltet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinien, bei dem die expressionssteuernden Elemente des Tumorsuppressorgens erhalten bleiben, so dass die mit dem Verlust des
Tumorsuppressorgens reflektorisch gesteigerte Promoterleistung zur Expression des Transgens (z.B adenovirale E1 -Gene oder Telomerase) genutzt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung immortaler Chorionzelllinien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Insertion des Transgens DNA-Sequenzen genutzt werden, die homolog zu den das
Tumorsuppressorgen flankierenden genomischen Arealen sind. Die Erfindung betrifft daher eine immortalisierte humane Chorionzelllinie, welche durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren gewonnen wird. Die immortalisierte humane Chorionzelllinie kann ggf. durch eines oder mehrere der Verfahrensmerkmale oder entsprechende Strukturmerkmale, die im Zusammenhang mit dem Verfahren offenbart sind, gekennzeichnet werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen immortalisierten humanen Chorionzelllinie zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und/oder
medizinischen Wirkstoffen.
Demgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Proteine vorgesehen, welches auf Basis der immortalisierten humanen Chorionzelllinie durchgeführt wird, wobei die Zellen eine geeignete Expressionskassette enthalten, die ein oder mehreren E1 -Gene eines Adenovirus und/oder eine Telomerase kodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das rekombinante hergestellte Protein ein humanes Protein. Als rekombinantes Protein kann im Wesentlichen jedes beliebiges Protein exprimiert werden. Insbesondere sind medizinische relevante humane Proteine bevorzugt. Beispiele für menschliche rekombinante Proteine sind menschliches Wachstumshormon (rHGH), menschliches Insulin (BHI), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Faktor VIII Kogenate, Erythropoietin (EPO), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Filgrastim, alpha- Galactosidase A alpha-L-lduronidase (rhIDU; laronidase), N-Acetyl-4-Sulfatase (rhASB;
Galsulfase), Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA), Glucocerebrosidase, Interferon (IF) oder Interferon beta-1 b, oder Insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1 ).
Die erforderlichen Methoden für die Expression und Isolierung eines rekombinant
hergestellten Proteins sind einem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinexpression oder Molekularbiologie bekannt.
Die erfindungsgemäße Chorion-Zelllinie eignet sich neben ihrer Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren im allgemeinen insbesondere zur Herstellung von adenoviralen Vektoren, die durch Deletionen der E1A- und E1 B-Gene charakterisiert sind. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Adenoviren unter Verwendung der erfindungsgemäßen immortalisierten humanen Chorionzelllinien. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die rekombinanten Adenoviren E1/E3 deletierte Adenoviren.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Genen der adenoviralen E1-Region zur Immortalisierung einer Chorionzelle, wobei die Gene der adenoviralen E1-Region eine Sequenzidentität zu sog. E1 -deletierten Adenoviren von weniger als 90%, bevorzugt weniger als 70% Sequenzidentität, weiterhin bevorzugt weniger als 50% Sequenzidentität, aufweisen, um das Risiko einer unerwünschten Rekombination zwischen den E1 -deletierten Adenoviren und Genen der adenoviralen E1 -Region zu minimieren. Eine bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Gene der adenoviralen E1 -Region keine ausreichende Sequenzhomologien zu sog. E1 -deletierten Adenoviren aufweisen, um eine Rekombination zwischen den E1 -deletierten Adenoviren und Genen der adenoviralen E1 -Region zu ermöglichen.
Auf diese Weise werden das Risiko einer unerwünschten Rekombination und die Entstehung von Wildtypviren minimiert. Gemäß dieser Ausführungsform kann eine ausreichende
Homologie (bzw. Sequenzidentität) durch Routinemaßnahmen festgestellt werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie ist in der Lage zu prüfen, ob durch eine gewisse Sequenzidentität die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination reduziert wird.
Beispielsweise können die Nukleinsäuresequenzen verändert werden, ohne die
Aminosäuresequenz des kodierten Proteins zu ändern. Degenerierten Codons und somit die Redundanz des genetischen Codes können hierfür verwendet werden. Hierdurch können die Risiken einer Rekombination minimiert werden, ohne funktionelle Änderungen des Proteins hervorzurufen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, bei welchem durch homologe Rekombination adenovirale E1 -Gene in einer Weise in das Genom der (Chorion-) Zielzelle eingeführt werden, die gleichzeitig zur einer Inaktivierung einzelner Tumorsuppressorgene führt und auf diese Weise in einem verkürzten Zeitraum und in einem höheren Anteil zur Immortalisierung und Transformation von Zielzellen beiträgt. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem das zur
Immortalisierung verwendete Gen (z.B. adenovirus E1 -Gene oder Telomerase) durch gezielte homologe Rekombination an den Genort eines Tumorsuppressorgens (z.B. p53 oder Rb) und dieses durch das Integrationsereignis ausschaltet.
BEISPIELE UND DETAILLIERTE ERLÄUTERUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben. Diese betreffen mögliche und zum Teil bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und sollen nicht den Umfang der Erfindung beschränken.
Anatomische Lage und physiologische Bedeutung des Choriongewebes
Das Amnion (Amnios, auch Schafshaut) ist die dünne, gefäßlose innerste Eihaut und damit Teil der Fruchtblase der Amnioten (Reptilien, Vögel und Säugetiere). Das Chorion (Zottenhaut) bildet die mittlere und die Dezidua (Siebhaut) die äußere Eihaut. Das Chorion ist der äußere Anteil der beiden embryonalen Lagen der Fruchtblase, während die Dezidua zum maternalen Anteil der Fruchtblase gehört. Das Chorion besteht aus dem extraembryonalen Mesoderm und dem Trophoblasten und bildet den kindlichen, bzw. embryonalen Anteil der Plazenta, während das Amnion das innerste einschichte Epithel der Fruchtblase vorstellt und zu einem wesentlichen Anteil für die Produktion des Fruchtwassers verantwortlich ist.
Amnion und Chorion unterscheiden sich sowohl von ihrer anatomischen Lokalisation, von ihrer Funktion und von ihrem genetischen Expressionsprofil her. Das Choriongewebe stellt den Hauptanteil des embyonalen Plazentagewebes dar und trägt die Hauptlast des Stoffwechsels zwischen Mutter und Kind. Über das Choriongwebe wird das Embryo mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren versorgt. Seinen vielfältigen physiologischen Funktionen entsprechend sind Chorionzellen ähnlich der Leber in der Lage eine große Zahl von Hormonen (wie humanes Choriongonadotropin (HCG), schwangerschafts-assoziiertes Protein A (PAPP-A) humanes Plazentalaktogen (hPL), plazentares corticotropin Releasing-Hormon),
Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren (Myostatine, Endogline, proangiogenetischer Plazentawachstumsfaktoren), immunologische Abwehrstoffen (wie Defensine,
Leukozytenproteaseinhibitoren, Elafine), Enzyme oder gerinnungs-modulierende Faktoren (Faktor VI l-aktivierende Protease, Faktor XIII) und viele weitere Proteine zu produzieren.
Die unterschiedliche anatomische Lage erfordert im Rahmen der humangenetischen
Diagnostik auch eine unterschiedliche Art und Weise der Probengewinnung (entweder mittels Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie). Ferner fällt Choriongewebe im Rahmen von Schwangerschaftsabbrüchen an. Während der Fötus bei einem Schwangerschaftsabbruch unweigerlich verloren geht, bleibt das Choriongewebe über längere Zeit vital, woraus sich wiederum die Chorionzellen gewinnen lassen. Bedingt durch die unterschiedliche
anatomische Lage entnimmt man bei der Amniozentese Fruchtwasser per Spritze und zentrifugiert die darin schwimmenden Ammniozyten ab. Chorionzellen gewinnt man auf diese Weise nie, da sich keine Chorionzellen im Fruchtwasser befinden. Am deutlichsten wird der Unterschied zwischen der Eihaut (Amnion) und dem darunterliegenden Chorion nach der Entbindung. Die glänzende dem Kind zugewandte Seite der Plazenta ist die dünne Eihaut (Amnion), die von der Plazenta durch einfachen Zug abgelöst werden kann. Darunter kommt das Choriongewebe zur Darstellung. Auch wenn Amnion- und Chorionzellen in Zellkultur morphologische Ähnlichkeiten aufweisen unterscheiden sie sich in ihrem Expressionsprofil. Das Chorion bildet den sog. Trophoblasten und von Amnionzellen durch die Höhe und das Expressionsprofil von sog. Trophoblastenmarkern wie CDX2, alpha- und ß-HCG. EOMES, EpCam/TROP1 , ERR beta/NR3B2, FGF-4 und TROP-2 (Plouzek et al. Placenta 1993
14(3):277-85, Fariha Cytotherapy 201 1 13(5): 582-93, Portmann-Lanz et al. Am. J. Obstet. Gynecol. 2006;194:664-73, Simat et al. Med. J. Malaysia 2008; 63:53-4, Poloni et al.
Cytotherapy 2008; 10; 690-7,).
Choriongewebe ist daher ein biologisches Material das verfügbar wird, ohne dass Embryonen getötet werden müssen. Auch durch die im Rahmen einer Schwangerschaftsdiagnostik häufig durchgeführte Chorionzottenbiopsie, auch Chorionbiopsie genannt, ist derartiges Material grundsätzlich und ohne moralisch-ethische Komplikationen verfügbar. Die
Chorionzottenbiopsie ist eine Untersuchungsmethode der pränatalen (= vorgeburtlichen) Diagnostik. Bereits sehr früh in der Schwangerschaft (10. bis 12. Schwangerschaftswoche) kann diese Diagnosemethode Aufschluss über bestimmte Stoffwechselerkrankungen und Chromosomenschäden beim Ungeborenen geben.
Das zottige Choriongewebe ist die Vorstufe des Mutterkuchens. Es enthält - in der Regel - die gleichen Erbinformationen wie die Körperzellen des Embryos. Die Gewinnung der Zellen erfolgt für gewöhnlich zwischen der 10. und 12. Schwangerschaftswoche. Es sind zwei Arten möglich, um die Chorionzotten zu entnehmen: (a) Transabdominale Methode: Unter
Ultraschallkontrolle wird durch die Bauchdecke der Schwangeren eine Nadel in die Plazenta vorgeschoben und Gewebe entnommen (= Punktion), (b) Transzervikale Methode: Ein dünner Schlauch (Katheter) wird über die Vagina und den Gebärmuttermund in die Plazenta (= Mutterkuchen) geführt und Choriongewebe entnommen. Die transabdominale Methode wird aufgrund der geringeren Risiken heutzutage bevorzugt. Die im Rahmen einer Biopsie entnommenen Gewebeproben enthalten ca. 20 bis 30 Milligramm Chorionzotten.
Zur Gewinnung und Isolierung natürlicherweise von Chorionzellen produzierter körpereigener Proteine und Wirkstoffe, als auch zur Nutzung als Produktionsplattform für rekombinante Proteine (Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Impfstoffe, Hormone etc.) sind Chorionzellen gegenüber anderen embryonalen Geweben in besonderer Weise geeignet, da die Produktion von Wachstums- und Nährstoffen zu ihrer physiologischen Bestimmung gehört.
Ein überraschende Aspekt der Erfindung besteht in der Nutzung von Choriongewebe zur Etablierung neuer humaner Zelllinien, die ähnlich wie Amnionzellen auf unkritische Weise im Rahmen der humangenetischen Diagnostik zugänglich werden, sich aber nicht nur durch eine andere anatomische Lage, sondern auch einen anderen funktionellen Hintergrund und ein unterschiedliches Expressionsprofil von Amnionzellen unterscheiden.
Eine Chorionzottenbiospie kann in der Regel früher als eine Amniozentese durchgeführt werden (da für die Amniozentese eine erst gewisse Menge an Fruchtwasser vorhanden sein muß). In der frühen Embryonalentwicklung weist Choriongewebe eine erhöhte Anfälligkeit für neoplastische Entwicklungsstörungen (Blasenmole, Chorionkarzinom) durch
Chromosomenfehlverteilungen auf, was ein Hinweis auf eine erhöhte Transformationsneigung ist und den Versuch einer absichtsvollen Transformation bzw. Immortalisierung (z.B. durch die stabile Expression adenoviraler E1-Gene) erleichtert. Aufgrund seiner physiologischen Bedeutung bei der nutritiven Versorgung des Embryos und seinen vielfältigen
Syntheseaufgaben, eignen sich Choriongewebe in besonderer Weise zur Etablierung von Zelllinien für die Produktion rekombinanter Wirkstoffe und Proteine.
Die Immortalisierung bzw. Transformation von Chorionzellen durch stabile Transfektion eines oder mehrerer für den Menschen ungefährlicher Transgene (z.B. adenovirale E1-Gene) ermöglicht den Zugang zu neuen humanen Zelllinien, die sich durch einen hohes biologisches Sicherheitsprofil auszeichnen und in besonderer Weise für die Herstellung rekombinanter Wirkstoffe geeignet sind.
Immortalisierung primärer humaner Zellen durch Nutzung adenoviraler E1 -Gene
Adenoviren sind eine relativ homogene Guppe von Viren, die durch ein ikosahedisches Kapsid charakterisiert sind, das hauptsächlich aus den viral-kodierten Hexon-, Penton- und Fiber- Proteinen, sowie einem linearen, doppelsträngigen DNA-Genom mit einer Größe von etwa 36 Kilobasen (kb) besteht. Das virale Genom enthält an den Enden die Invertierten Terminalen Wiederholungssequenzen (ITRs), bei denen es sich um den viralen Replikationsursprung handelt. Ferner befindet sich am linken Ende des Genoms das Verpackungssignal, das für die Verpackung des viralen Genoms in die Viruskapside im Verlauf eines Infektionszyklus erforderlich ist. Adenoviren sind von vielen Spezies isoliert worden. Es gibt mehr als 40 verschiedene menschliche Serotypen, basierend auf zwischen den verschiedenen Serotypen diskrimierenden Parametern wie Hämagglutination, Tumorigenität und DNA- Sequenzhomologie (Wigand et al., in: Adenovirus DNA, Doerfler Hrsg., Martinus Nijoff Publishing, Boston, S. 408-441 , 1986). Adenovirale Vektoren sind bisher meist von den Serotypen 2 (Ad2) und 5 (Ad5) abgeleitet. Infektionen durch Ad2 und Ad5 sind endemisch beim Menschen. Ad2 und Ad5 sind im Menschen nicht onkogen und haben eine gute
Sicherheitsdokumentation, da in den USA erfolgreich und komplikationslos Vakzinierungen an militärischem Personal durchgeführt wurden (Pierce et al., Am. J. Epidemiol. 87, 237-246, 1968).
E1 a ist das erste virale Gen, das nach Erreichen des Zellkern durch das virale Chromosom exprimiert wird. Das E1 a-Gen kodiert für die 12S- und HS-Proteine, die durch alternatives Spleißen der E1 a-RNA gebildet werden. Die E1A-Proteine aktivieren die Transkription einer Reihe von zellulären und viralen Genen durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren. Die Hauptfunktionen von E1 a sind a) die Aktivierung der anderen frühen viralen Funktionen El b, E2, E3 und E4 und b) die Induktion ruhender Zellen, in die S-Phase des Zellzyklus einzutreten. Die alleinige Expression von E1 A führt zum programmierten Zelltod von Zellen (Apoptose). E1 B ist eines der frühen viralen Gene, die durch E1 a aktiviert werden. Das E1 b-Gen kodiert für das EIB-55-kD-Protein und das EIB-19-kD-Protein, die durch alternatives Spleißen der E1 b-RNA entstehen. Das 55-kD-Protein moduliert die Progression des Zellzyklus durch Interaktion mit dem p53-Tumorsuppressorgen, ist involviert in die Verhinderung des
Transports zellulärer mRNA spät während der Infektion, und verhindert die EIA-induzierte Apoptose von Zellen. Das E1 b-19-kD-Protein ist ebenfalls für die Verhinderung der EIA- induzierten Apoptose von Zellen wichtig.
Alle humanen Adenoviren sind in der Lage, Zellen in der Zellkultur zu transformieren. Für die Transformierung ist in der Regel die Ko-expression von E1a und El b bevorzugt. Eingebettet in die E1 b-Transkriptionseinheit ist das Protein IX-Gen, das für eine Strukturkomponente des viralen Kapsids kodiert. Die Gene der sog. early region 1 (E1 -Region) von Adenovirus Serotyp 5 (E1 a, E1 b1 , E1 b2) sind nach aktuellem Stand der Forschung nicht tumorogen für den Menschen. Im Unterschied dazu ist das krebsauslösende Potential andere viraler Gene, wie z.B. das der HPV-Onkogene E6 und E7 oder das des SV40 Virus (SV40 T-Antigen) unstrittig. Die Nutzung von Genen der adenoviralen E1 -Region ist daher ein Weg Zellen zu
immortalisieren, der das Risiko unerwünschter Kontaminationen eines rekombinanten Produktes mit sicherheitsrelevanten Onkogenen sehr niedrig hält.
Neben der Produktion rekombinanter Proteine sind Zelllinien, die durch stabile Transfektion adenoviraler E1-Gene immortalisiert worden sind, zur Produktion rekombinanter sog. E1/E3 deletierter Adenoviren geeignet, da die in den Viren deletierten Gene bzw. Genfunktionen in diesem Fall durch die Verpackungszelle funktionell komplementiert werden kann.
Adenovirale Vektoren der ersten Generation (Gilardi et al., FEBS Letters 267, 60-62, 1990; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1 , 241 -256, 1990) sind durch Deletionen der E1 a- und E1 b-Gene, und/oder des E3-Gens, charakterisiert. E1 a und El b haben
transformierende und transaktivierende Eigenschaften. Ferner ist E1 a für die Aktivierung viraler Gene und E1 b für die Akkumulation viraler Transkripte erforderlich. In einigen Vektoren ist außerdem E3 deletiert, um die Kapazität für die Aufnahme fremder DNA zu erhöhen. E3 ist für die Herstellung von Adenoviren in der Zellkultur entbehrlich. Die Kapazität für die
Aufnahme fremder DNA beträgt etwa 8 kb. Adenovirus-Vektoren der ersten Generation sind bisher überwiegend in 293-Zellen produziert worden (siehe unten), die den E1A- und E1 B- Defekt der Vektoren komplementieren.
Adenovirale Vektoren der zweiten Generation sind durch Deletionen von E2 und/oder E4 zusätzlich zu Deletionen von E1 a und El b charakterisiert (Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 91 , 6196-6200, 1994; Yang et al., Nature Genet., 7, 362-367, 1994; Gorziglia et al., J.Virol. 70, 4173-4178,1996; Krougliak und Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586, 1995;
Zhou et al., J. Viral. 70, 7030-7038, 1996). In einigen Vektoren ist außerdem E3 deletiert, um die Kapazität für die Aufnahme fremder DNA zu erhöhen. Adenovirale Vektoren der zweiten Generation wurden entwickelt, um die Transkription von viralen Genen und die Expression viraler Proteine weiter zu reduzieren und um somit die antivirale Immunantwort weiter zu verringern. Die Kapazität für die Aufnahme fremder DNA ist gegenüber adenoviralen Vektoren der ersten Generation nicht wesentlich erhöht. Adenovirus-Vektoren der zweiten Generation werden in Zelllinien produziert, die zusätzlich zu E1 a und El b den jeweiligen Defekt (E2 und/oder E4) komplementieren.
Die Kapazität für die Aufnahme fremder DNA beträgt etwa 37 kb, da der weit überwiegende Teil des adenoviralen Genoms entfernt ist. Es sind verschiedene Systeme zur Herstellung adenoviraler Vektoren großer DNA-Kapazität beschrieben worden (Kochanek et al., supra; Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy et al., J. Viral. 71 , 1842-1849, 1997). Der Vorteil dieser adenoviralen Vektoren mit großer DNA-Kapazität im Vergleich zu adenoviralen Vektoren der ersten und zweiten Generation liegt in der größeren Kapazität für die Aufnahme fremder DNA und in einer geringeren Toxizität und Immunogenität (Schiedner et al., Nature Genet. 18, 180-183, 1998; Morral et al., Hum. Gene Ther. 9, 2709- 2716, 1998).
Bei der Konstruktion dieser in der Medizin verwendeten rekombinanten,
replikationsdefizienten Adenoviren wird die E1 -Region durch ein therapeutisches Gen ausgetauscht. Die Herstellung dieser rekombinanten, ein therapeutisch wertvolles Gen tragenden Viren, erfolgt z.B. durch Kotransfektion eines sog. Helfer- oder Transferplasmides, bei dem das Transgen an beiden Seiten von zum Virusgenom homologen Bereichen flankiert wird. Die Entstehung eines rekombinanten Virus setzt eine homologe Rekombination zwischen Transferplasmid und viralem Genom voraus. Beide Plasmide können für sich allein keine Adenoviren generieren. Kommt es jedoch zufällig zur Kotransfektion einer 293-Zelle mit den beiden Plasmiden, kann es zu einem Austausch der genetischen Information durch
Cross-over, einer homologen Rekombination kommen. Daraus entstehen rekombinante, E1- und E3-deletierte Adenoviren, die das therapeutische Gen beinhalten. Um hohe
Konzentrationen des Virus für Therapiestudien zu erreichen, werden diese Adenoviren, die in normalen Zellen nicht replikationsfähig sind, in der 293 Helfer-Zelllinie vermehrt. Diese Zellen enthalten die fehlende E1-Region stabil in ihrem Genom integriert, stellen das Genprodukt für die Virusreplikation zur Verfügung und ermöglichen so die Amplifikation des rekombinanten Adenovirus. Diese Adenoviren können in keinem anderen zellulären System replizieren.
Bei den therapeutischen Genen, die von in transformierten Chorionzellen, d.h. einer imortalen Chorionzelllinie, produzierten Vektoren (z. B. E1/E3 deletierter Adenoviren) kodiert und exprimiert werden können, kann es sich z. B. um jede beliebigen Muskelproteine,
Gerinnungsfaktoren, Membranproteine oder Zellzyklusproteine handeln. Beispiele für Proteine, die von in transformierten Chorionzellen hergestellten Vektoren exprimiert werden können, sind Dystrophin (Hoffman et al., Cell 51 , 919, 1987, Faktor VIII (Wion et al., Nature 317, 726 1985, Zystische Fibröse Transmembran Regulator Protein (CFTR) (Anderson et al., Science 251 , 679, 1991 , Omithin-Transcarbamylase (OTC) (Murakami et al., J. Biol. Chem., 263, 18437, 1988, Alphai -Antitrypsin (Fagerhol et al., in: Hum. Genet., Bd. 1 1 , Harris Hrsg., Plenum, New York, S.l, 1981 . Die Gene, die für Proteine kodieren, sind bekannt und können aus genomischen oder cDNA-Banken kloniert werden. Ein Beispiel für ein weiteres Gen, welches von Vektoren exprimiert werden, die in transformierten Chorion hergestellt werden können, ist das Thymidin-Kinase-Gen von Herpes simplex-Virus (HSV) Typ I zur Therapie von Tumorerkrankungen.
Vektoren, die in transformierten Chorionzellen hergestellt werden, können zusätzlich zum therapeutischen Gen ein beliebiges Reporter-Gen enthalten, um die Expression des Vektors besser verfolgen zu können. Beispiele von Reporter-Genen sind im Stand der Technik bekannt und schließen z.B. das ß-Galaktosidase-Gen ein (Fowler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1507, 1977). Vektoren, die in transformierten Chorionzellen hergestellt werden können, können mehr als ein einzelnes Gen enthalten. Die maximale Zahl an Genen, die in solchen Vektoren produzierten werden können, hängt von der Aufhahmekapazität des jeweiligen Vektors und von der Gengröße ab.
Die erfindungsgemäß hergestellte Zelllinie eignet sich auch zur Expression von zur
Immortalisierung geeigneter Gene, insbesondere adenoviraler E1 -Gene.
Freiheit von Pathogenen tierischen Ursprungs
Die Kultivierung und Immortalisierung der Chorionzellen erfolgt ausschließlich in Abwesenheit von Materialien tierischen Ursprungs. Es werden bei der Kultivierung bevorzugt ausschließlich Kulturmedien verwendet, die nur humane Seren, bzw. rekombinante Proteine oder weitere Komponenten (Wachstumsfaktoren, Insulin, rekombinantes Trypsin etc.) nicht-tierischen Ursprungs enthalten.
Alle Produkte, die mit Hilfe dieser Zelllinie produziert werden (therapeutische Proteine, Impfstoffe, rekombinante Viren, Hormone) sind frei von Pathogenen tierischen Ursprungs.
Verfahren zur Immortalisierung durch homologe Rekombination in Tumorsuppressor- Genorte
Diese Anmeldung beschreibt im Weiteren ein Verfahren zur Immortalisierung, bei der die transformierenden adenoviralen E1 -Gene durch homologe Rekombination in das Genom der Zielzelle eingebracht werden. Die homologe Rekombination erfolgt dabei bevorzugt in die Genorte von Tumorsuppressorgenen (inbesondere in die Genorte der Tumorsuppressorgene p53 und des Retinoblastomgens (Rb)).
Durch die homologe Rekombination wird die Funktion dieser Tumorsuppressorgene ausgeschaltet. Gleichzeitig erfolgt die Rekombination in einer Art und Weise, die die expressionssteuernden Elemente der Tumorsuppressorgene, also die Promoterregion oberhalb des Startcodons der Tumorsuppresssorgene und die polyAdenylierungsregion unterhalb des Stopcodons der Tumorsupressorgene, intakt läßt. Durch diese Art der
Rekombination kann die nach Verlust des Tumorsuppressorgens reflektorisch gesteigerte Promoterleistung (der Tumorsuppresorgene) für die Expression der zur Immortalisierung genutzen Gene (E1-Gene, Telomerase) genutzt werden.
Üblicherweise erfolgt die Integration von zur Immortalisierung von Zellen genutzen Gene zufällig in transkriptionsaktive des Genoms der Zielzelle. Aus den Erfahrungen bei der Herstellung von knock-in oder knock-out Mäusen, bei denen bestimmte Genfunktionen gezielt an oder abgeschaltet werden sollen, ist bekannt, dass die Wahrscheinlichkeit einer gerichteten Integration an einen bestimmte Genlocus im Genom dadurch gesteigert werden kann, daß das einzubringenden Gen von Gensegmenten flankiert wird, die zur Zielregion im Genom homolog sind. Üblicherweise erfolgt die homologe Rekombination dann in einer Weise, in der die zwischen den homologen Elementen liegenden Gene gegen die zuvor im Genom integrierten Anteile ausgetauscht werden. Die unten stehende Figur 4 erläutert das Prinzip am Beispiel der Integration in den p53 Genort. Grundsätzlich kann dieses Prinzip aber auf alle
Gene angewandt werden, deren Abschaltung zu einer Beschleunigung der Zellzyklus bzw. zu einer Abnahme der Apotoseneigung (Apotose: innerer Zelltod) einer Zelle führt.
Die Nutzung dieses Verfahrens erhöht die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen
Immortalisierung insbesondere von Primärzellen humanen Ursprungs, da mit der stabilen Integration des zur Immortalisierung genutzten Gens (z.b. adenovirale E1-Gene oder humane Telomerase) gleichzeitig eine Tumorsuppressorfunktion der Zielzelle (z.B. p53 oder Rb) ausgeschaltet wird. Grundsätzlich gilt, dass die Wahrscheinlichkeit einer homologen
Rekombination mit der Länge der flankierenden Bereiche korrelliert. Im Idealfall sollten die homologen Anteile mehrere Tausend Basenpaare lang sein. Eigene Untersuchungen zur Immortalisierung muriner Fibroblasten (NIH-3T3) haben gezeigt, dass die Nutzung des beschriebenen Mechanismus zur Deletion von
Tumorsuppressorfunktionen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Zelltransformation um den Faktor 5-10 gegenüber der einfachen ungezielten stabilen Integration erhöht.
Tumorsuppressoren sind Proteine, die den Zellzyklus kontrollieren. Es handelt sich weniger um die Bezeichnung einer Proteinfunktion als um eine physiologische Definition. Eine Mutation oder Deletion eines für einen Tumorsuppressor codierenden Gens (Tumorsuppressorgens) erhöht die Wahrscheinlichkeit einer verbleidenden Zellteilung. In diesem Sinne haben Tumorsuppressorgene eine vergleichbare Auswirkung bei Mutationen wie Proto-Onkogene. Beispiele für Tumorsuppressoren sind: p16: Diese Proteinfamilie hemmt die CDKs und verhindert so einen Übertritt von der G1 zur S-Phase des Zellzyklus. p27:
Dieses Protein kontrolliert den Übergang von G0 zur G1-Phase des Zellzyklus und verhindert diesen, wenn es vermehrt gebildet wird. Sowohl von Viren befallene Zellen fördern über einen Gewebemediator (TGF-ß) die p27 Bildung, als auch benachbarte Zellen bei der
Kontaktinhibition. Rb: Rb umschließt normalerweise schalenartig den Transkriptionsfaktor E2F, der zur Einleitung der S-Phase zwingend gebraucht wird. Durch Phosphorylierung öffnet sich nach und nach die Hülle, und der Transkriptionsfaktor wird "freigelassen". In Tumorzellen ist das Gen für das RB-Protein in über 60 % der Fälle mutiert. Die Regulation (also der Phosphorylierungsmechanismus) des RB-Proteins ist sogar in jeder Tumorzelle in irgendeiner Weise gestört. Das p53: Dieses Protein sorgt in der Regel dafür, dass sich eine Zelle nur dann teilt, wenn ihr Erbgut auch intakt ist. Das Protein p53 ist in vielen Typen von entarteten Zellen in erhöhter Menge messbar. Es ist auch in normal wachsenden Zellen vorhanden, aber in ruhenden Zellen kaum oder gar nicht zu finden. In vielen Tumortypen ist das für p53 kodierende Gen mutiert. In manchen, aber nicht allen Tumoren scheint das Protein als Tumorsuppressor zu wirken. p53 spielt eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus, wo es die Aktivität einer Anzahl von Genen bremst. p53 ist in allen Wirbeltieren zu finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird p53 als Integrationstarget verwendet, um die erfindungsgemäße Transgene im Genom zu integrieren.
Die "homologe Rekombination" ist für einen Fachmann bekannt und bezieht sich auf einen Austausch zwischen zwei DNA-Sequenzregionen mit einer ausreichenden Sequenzidentität. Voraussetzung sind„homologe", nämlich doppelsträngige DNA-Abschnitte mit einer zueinander hohen Sequenzidentität. "Homolog" kann auch so verstanden werden, als eine hohe Sequenzidentität oder -Ähnlichkeit in der Nucleotidsequenz. Homologen können daher mehr als eine 50%, 60%, 70%, 80%, oder bevorzugt mehr als 90% Sequenzidentität zu einander aufweisen. Die Erfindung umfasst daher die mögliche Anwendung einer
Sequenzspezifischen Rekombination, nämlich eine gezielte (also nicht zufällige) Integration von DNA in ein Genom durch eine Rekombination. Rekombination ist in der Gentechnik weit verbreitet und für einen Fachmann auf dem Gebiet der molekularen Biologie gut bekannt. In der Gentechnik stehen heute Werkzeuge zur Verfügung, mit deren Hilfe rekombinante DNA künstlich hergestellt und in Organismen eingeschleust werden kann. Im Zuge einer Klonierung können DNA Sequenzen mit Restriktionsenzymen an spezifischen Erkennungssequenzen geschnitten und mit Ligasen neu verknüpft. Häufig dienen Plasmide oder Viren als Vektoren, um die rekombinante DNA in den Zielorganismus zu transferieren. Alternative zur konventionellen DNA-Klonierung mit Restriktionsenzymen und Ligasen sind auch bekannt, auf homologer Rekombination basierende Technologien, wie das Recombineering
(Recombination-Engineering) und Kassettenaustauschverfahren. Die Anwendung solcher üblichen Methoden zur Durchführung der Erfindung ist hiermit umfasst.
Sequenzvariante
Die Erfindung umfasst die Anwendung von Nukleinsäuresequenzen, ein oder mehrere E1 - Gene eines Adenovirus und/oder Telomerase kodieren. Die Nukleinsäuresequenzen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend: a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 5;
b) ein Nukleinsäuremolekül, welches zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) komplementär ist, c) Ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (Hybridisierungsbedingungen sind einem Fachmann bekannt, und sind z. B. in Sambrook, Molecular Cloning, Ed. 1 -3, Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben);
d) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende
Sequenzidentität aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) funktionsanalog zu sein,
e) ein Nukleinsäüremolekül, das infolge des genetisches Codes zu einer Nükleotidsequenz gemäß a) bis c) degeneriert ist; und
f) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) bis e), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis e) ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung einer
Nukleinsäuresequenz vorgesehen, die eine ausreichende Sequenzidentität aufweist, um mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Punkt a), b) und/oder c) funktionsanalog zu sein. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nukleotidsequenzen bzw. mit diesen
Nukleotidsequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die
Sequenzvariante sicher und effektiv die gewünschte Immortalisierung der Chorionzellen hervorrufen können. Funktionsanaloge Sequenzen im Sinne der Erfindung sind alle
Sequenzen, die der Fachmann durch Routineversuche als gleichwirkend identifizieren kann. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 %, Sequenzidentität zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß Punkt a), b) und/oder c) auf.
Coexpression des CAR-Rezeptors Nahezu alle bekannten Viren bedienen sich bei der Infektion von Säugerzellen der Hilfe von Oberflächen-Rezeptoren, die von diesen Säugerzellen natürlicherweise exprimiert werden und die im Kontext einer gesunden Zelle bestimmte physiologische Funktionen besitzen. Im Rahmen einer Infektion binden die Viren zunächst an die extrazellulären Anteile dieser meist membranständigen Rezeptoren und gelangen dann im Rahmen natürlicher Mechanismen
(Endozytose) ins Innere der Zelle. Humane Adenoviren nutzen häufig den CAR-Rezeptor zur Infektion. Die natürliche Aufgabe des CAR-Rezeptors ist die Bindung an und die
Kommunikation mit anderen Zellen. Die Höhe der Expression des CAR-Rezeptors in unterschiedlichen Geweben kann stark variieren, so findet man auf embryonalen Nervenzellen eine hohe Zahl von CAR-Rezeptoren, während sie bei adulten Nervenzellen kaum noch nachweisbar sind (Bergelson et al. Science 275 (5304): 1320-3 ).
Um Zelllinien zur Herstellung und Vermehrung von Adenoviren zu nutzen, ist es daher von Vorteil, wenn diese Zellen eine erhöhte Dichte von CAR-Rezeptoren an ihrer Oberfläche tragen. Durch die erhöhte Zahl von CAR-Rezeptoren steigt die Wahrscheinlichkeit, dass es bei physischen Kontakt eines Virus mit einer Wirtszelle zu einer Infektion kommt, so dass in der Folge geringere Menge von Viren nötig sind alle Zellen eines Kulturansatz zu infizieren. Wir konnten zeigen, dass sich die Infizierbarkeit von Zielzellen durch die konstitutive
Expression des CAR-Rezeptors deutlich verbessern lässt.
Im Unterschied der Expression von E1 -Genen, die für die Etablierung und Aufrechterhaltung des transformierten Zustandes einer Zelle essentiell sind, besitzt die CAR-Rezeptor
Expression keine Bedeutung für die Zelltransformation. Dadurch droht immer die Gefahr, dass das Gen bei Kultivierung und Vermehrung der Zelllinie wieder verloren geht.
Um einen Verlust des für die Infizierbarkeit einer Zelllinie hilfreichen CAR-Rezeptors zu verhindern, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Expression des CAR-Rezeptors mit der Expression der E1-Gene in einer Weise verknüpft, die einen Verlust des CAR- Rezeptors weitgehend unmöglich macht.
Zum Ziel der Immortalisierung von Chorionzellen mit einem erhöhten CAR-Rezeptorbesatz, wurden daher das CAR-Rezeptorgen und die adenoviralen E1-Gene in einer Weise miteinander verknüpft, die sicherstellt, dass E1-Gene und der CAR-Rezeptor immer gemeinsam exprimiert werden. Dieses Ziel wird durch folgende Anordnung von Genen und expressionssteuerenden Elementen erreicht. Direkt unter dem Promoter (homologe Bereiche) liegt zunächst das Gen für den CAR-Rezeptor, das von dem vollständigen Genen der adenoviralen E1 -Region gefolgt wird. Zwischen den beiden Genen liegt eine sog.
interribosomal entry site (IRES-site). Wird diese Expressionskassette stabil in das Genom einer Wirtzelle eingebaut, erfolgt die Expression der Gene notwendigerweise immer gemeinsam, da zunächst nur ein sog. Primärtranskript (nur eine mRNA) gemacht wird, die aber sowohl über den 5' untranslatierten Anteil der mRNA als auch über die IRES-Sequenz an das Ribosom binden kann, was dazu führt, dass aus nur einem mRNA Strang zwei verschiedene Proteine hergestellt werden. An Stelle einer sog. IRES-site können zum gleichen Ziel aus sog. selbstspaltenden Sequenzen eingeführt werden, die zu auch zur Expression zweier verschiedener Genprodukte führt (siehe Fig. 5).
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL
Immortalisierung von Chorionzellen:
Es wurde zunächst ein Plasmid zur Synthese in Auftrag (gene art) gegeben, dass 1000 Basenpaare der upstream-Region und 1000 Basenpaare der downstream-Region des Gens für humanes p53 trägt. Zwischen diese beiden p53-flankierenden Sequenzen wurde im nächsten Schritt ein Genfragment aus dem Genom des humanen Adenovirus Serotyp 5 Genom gesetzt. Das Genfragment umfasst die Basenpaare 438 - 3510 des adenoviralen Wildtypgenoms. Am 5' Ende dieser Sequenz liegt ein kurzes Anteil des E1 -A Promoters (Position 438 - 559) und ab Base 560 die für E1-Gene codierenden Anteile. Am 3' Ende wurde ein zusätzliche poly-Adenylierungsignal eingesetzt (poly-A aus bovinem Wachstumshormon). In Figur 6 wird das p53-Ad5-E1 (final)-Plasmid dargestellt.
Vor der Transfektion auf Chorionzellen wurde das Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten, wodurch unerwünschte Sequenzanteile (Ampicillin-Reistenz und die Ansatzstelle für bakterielle DNA-Polymerase, das sog. origin of reolication (ori)) aus dem Plasmid herausfallen (siehe Plasmidkarte; Fig. 6). Die beiden Genfragmente wurden auf einem Agarosegel (0,8%) aufgetrennt und das gewünschte 5321 Basenpaar lange Segment herausgeschnitten und aufgereinigt.
Das Einbringen der DNA auf Chorionzellen erfolgte durch Calciumphosphat-Copräzipitation. Bei dieser Art der Transfektion wird die DNA in ein Gemisch aus Calciumchlorid und
Natriumphosphat eingebracht. Bei dieser Reaktion fällt Calciumphosphat als unlösliches Salz aus, das an seiner Oberfläche negativ geladene DNA Moleküle bindet. Die unlöslichen Calciumphosphat-DNA Komplex sinken unter dem Einfluss der Schwerkraft auf den Boden der Kulturschale auf die zu tranfizierenden Zellen und werden über Endozytose in das Zytosol der Zelle aufgenommen und von dort in den Kern geschleust. Präoaration der Chorionzellen:
Als Quelle für primäre Chorionzellen dient zum einen überschüssiges Choriongewebe, das nach Chorionzottenbiopsie anfällt, als auch das im Rahmen eines natürlichen Abortes und der sich anschließenden humangenetischen Diagnostik anfallenden Gewebe. Hierzu werden zunächst unter mikroskopischer Sicht und möglichst sterilen Bedingungen mütterliche Gewebe Anteile abpräpariert. Das Gewebe wird dann in Medium (DMEM) zunächst für ca. 30 Minuten einem enzymatischen Verdau mit Trypsin/EDTA (0,05%) und bevorzugt anschließend einem ca. 60 minütigem Verdau mit Collagenase unterzogen. Um jeden Kontakt mit tierischen Produkten zu vermeiden, wird humanes recombinantes Trypsin (aus E.coli, Biozol), sowie recombinantes Collagen (aus Clostridium perfrigens, Sigma-Aldrich) verwendet. Die Geschwindigkeit des enzymatischen Verdaus soll etwa alle 10 Minuten mikroskopisch kontrolliert werden, da eine zu lang andauernde Inkubation die Viabilität der Zellen herabsetzt und ein zu kurzer Verdau die Ausbeute verringert und nur eine
ungenügende Menge an Zellen aus dem Gewebeverband freisetzt. Durch leichte
mechanische Irritation (Beklopfen des Falconröhrchens) kann der Vorgang der Zellfreisetzung unterstützt werden. Nun werden die in dieser Weise freigesetzten Zellen zweimal gewaschen und in DMEM-Kulturmedium (ohne tierische Zusätze) aber unter Zugabe von 30% humanem Serum kultiviert. Nach 24 Stunden erfolgt ein Mediumwechsel und die toten Zellen werden abgetrennt, da sie das Wachstum der sich am Boden der Kulturschale anhaftende Zellen beeinträchtigen können.
Die Kultivierung der Zellen erfolgt zunächst in 6-well Platten (9 cm2 pro well). Nachdem die Chorionzellen ca. 70% konfluent gewachsen sind, wird 10 μg vorgeschnittene DNA (nach EcoRI Verdau) durch Calciumtransfektion (in 200 μΙ Transfektionspuffer) gleichmäßig in das Zellmedium eingetropft. Die Größe der Calciumkristalle kann unter dem Mikroskop kontrolliert werden (je kleiner umso besser). Nach 6 Stunden und nach 24 Stunden wird das Medium gewechselt und die Zellen jeweils einmal sanft mit Medium gewaschen. Läßt man das Transfektionsgemisch zu lange auf den Zellen, stirbt ein zu großer Teil der Zellen ab.
Nun werden die Zellen weiter kultiviert und nach ca. 1 x pro Woche gesplittet (1 :3).
Chorionzellen wachsen nur langsam, allerdings erkennt man bereits nach 10 -14 Tagen, dass innerhalb der Gesamtpopulation kleine Herde von Zellen entstehen, die etwas kleiner erscheinen, sich aber durch eine höhere Wachstumsgeschwindigkeit auszeichnen. Ohne Zugabe transformierender Agentien kann man Chorionzellen nur über 4-6 Passagen kultivieren, danach sistiert das Wachstum fast vollständig. Nach erfolgreicher Integration und kontinuierlicher Expression von adenoviralen E1 -Genen ist die Wachstumshemmung aufgehoben und der relative Anteil von erfolgreich transfizierten Zellen in der Zellkultur steigt kontinuierlich an.
6 Wochen nach Transfektion liegt der Anteil an E1 -exprimierenden Zellen bei etwa 25%. Während dieser Zeit wird der Anteil an humanen Serum bei 30% gehalten. Nun erfolgt eine Subklonierung der Zellen. Zu diesem Zweck werden die Zellen in einer 96- well Platte so stark vedünnt, dass bei mikroskopischer Kontrolle in einzelnen wells nur noch eine Zelle nachweisbar ist. Um den Zellen in dieser Phase die Proliferation zu erleichtern, wird zur weiteren Kultivierung noch Zellkulturüberstand aus der Bulk-Kultur zugesetzt (der noch stimuliernde Wachstumsfaktoren enthällt). Unter diesen Bedingungen lässt sich aus einzelnen Zellen wieder ein kompletter Gewebeverband heranziehen. Im nächsten Schritt wird alle 3 Wochen der Anteil an humanem Serum auf 20% und nach weiteren 3 Wochen auf 10%, dann auf 5%, auf 2,5% und schließlich auf 0% reduziert. Von diesem Zeitpunkt an werden die Zellen unter serumfreien Bedingungen in 293-SFM (life technologies) kultiviert.
Während des kontinuierlichen Serumentzugs verlangsamt sich zunächst das Wachstum der Zellen, dennoch fallen Unterschiede in der Wachstumsgeschwindkeit einzelner Subklone auf. Die 10 am schnellsten wachsenden Subpopulationen werden kontinuierlich weiterkultiviert. Nach 6 Monaten liegt die Teilungsgeschwindigkeit der schnellsten Klone bei 24-36 Stunden und die Immortalisierung ist abgeschlossen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN Die Erfindung wird anhand der Figuren beschrieben. Diese betreffen mögliche bzw bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und beschränken den Umfang der Erfindung nicht.
Figur 1 : Organisation des Adenovirusgenoms, Lage der frühen Gene. Die Abbildung zeigt ein Schema der Organisation eines Adenovirusgenoms. Üblicherweise unterteilt man das ca. 35000 Basenpaare lange Genom in 100 sog. Mapunits (mu). 1 mu misst entsprechend ca. 350 Basenpaare (bp). Die Gene der sog. E1 -Region beginnen bei ca. 1 ,5 mu und enden bei ca. 10 mu , umspannen also (unter Einbeziehung der Promoter- und polyA-Region einen Bereich von etwa 3500 bp. Da die Anwesenheit dieser Gene zu einer beschleunigten
Degradation der beiden Tumorsuppressorgene p53 und Rb (Retinoblastomgen) führen, kommt es zu einer Beschleunigung des Zellzyklus und zur Transformation der Zelle. Figuren 2 und 3: Anatomische Zuordnung des Chorion innerhalb einer humanen Plazenta. Das Choriongewebe ist darin gekennzeichnet.
Figur 4: Schema der homologen Rekombination: Das p53-Gen wird gegen das E1-Gen ausgetauscht, ohne das die expressionssteuerenden Elemente des p53-Locus verloren gehen. Auf diese Weise kann die nach Verlust des p53 Gens reflektorisch gesteigerte p53- Promotorleistung zur Expression des Transgens genutzt werden.
Figur 5: Die Nutzung einer interribosomal entry site (IRES) - Sequenz zwischen CAR- Rezeptorgen und E1-Gen erlaubt es die CAR-Rezeptorexpression zwingend an die des E1- Gens zu koppeln. Auf diese Weise kann eine stabile CAR-Rezeptorexpression ohne Nutzung eines Selektionsmarkers sichergestellt werden.
Figur 6: Schematische Darstellung des p53-Ad5-E1 (final)- Plasmids.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Immortalisierte humane Chorionzelllinie.
2. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie Nukleinsäuresequenzen umfasst, die ein oder mehrere E1-Gene eines Adenovirus kodieren.
3. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die ein oder mehrere E1 -Gene eines Adenovirus die E1 a-, E1 b1- und/oder E1 b2-Gene sind.
4. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie Nukleinsäuresequenzen umfasst, die zu einer (bevorzugt kontinuierlichen) Expression des Cosackie und Adenovirusrezeptors (CAR-Rezeptors) führen.
5. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie Nukleinsäuresequenzen umfasst, die humaner Telomerase kodieren.
6. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Telomerase die Reverse-Transkriptase-(RT-)-Untereinheit des humanen Telomerase-Komplexes (hTERT) ist.
7. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die ein oder mehrere Ei- Gene eines Adenovirus und/oder Telomerase kodieren, im Genom integriert sind.
8. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die ein oder mehrere E1-Gene eines Adenovirus und/oder Telomerase kodieren, im Genom an den Genort eines Tumorsupressorgens (z.B. p53 oder Rb) integriert sind.
9. Immortalisierte humane Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Tumorsuppressorgen ausgeschaltet ist.
10. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass humanes embryonales Choriongewebe als Ausgangsgewebe verwendet wird, welches mittels ein oder mehrere E1 -Gene eines Adenovirus und/oder Telomerase immortalisiert wird.
1 1 . Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu adenoviralen-E1 -Genen das Gen für den CAR-Rezeptor exprimiert wird.
12. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, bei dem das zur Immortalisierung verwendete Gen (z.B. adenovirus E1-Gene oder Telomerase) durch gezielte homologe Rekombination in den Genort eines Tumorsuppressorgens (z.B. p53 oder Rb) integriert wird.
13. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Tumorsuppressorgen durch das Integrationsereignis ausgeschaltet wird.
14. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem die expressionssteuernden Elemente des Tumorsuppressorgens erhalten bleiben.
15. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die mit dem Verlust des
Tumorsuppressorgens reflektorisch gesteigerte Promoterleistung zur Expression des Transgens (z.B adenovirale E1 -Gene oder Telomerase) genutzt wird.
16. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Insertion des zur Immortalisierung verwendeten Gens DNA-Sequenzen verwendet werden, die homolog zu den das Tumorsuppressorgen flankierenden genomischen Arealen sind.
17. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsgewebe mittels einer Chorionbiopsie gewonnen wird.
18. Verfahren zur Herstellung einer immortalen Chorionzelllinie nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsgewebe im Rahmen eines Spontanabortes anfällt und/oder einer humangenetischen Diagnostik gewonnen wird.
19. Immortalisierte humane Chorionzelllinie, hergestellt und/oder herstellbar durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
20. Verwendung der immortalisierten humanen Chorionzelllinie nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung rekombinanter Proteine.
21 . Verwendung der immortalisierten humanen Chorionzelllinie nach einem oder
mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung medizinischer Wirkstoffe.
22. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine unter Verwendung einer
immortalisierten humanen Chorionzelllinie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
23. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie eine geeignete Expressionskassette enthält, die ein oder mehreren E1-Gene eines Adenovirus und/oder eine Telomerase kodieren.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Protein ein humanes Protein ist.
25. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Adenoviren unter Verwendung einer
immortalisierten humanen Chorionzelllinie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Adenovirus einen E1/E3-deletierten Adenovirus ist.
27. Verwendung von Genen der adenoviralen E1 -Region zur Immortalisierung einer Chorionzelle, wobei die Gene der adenoviralen E1-Region eine Sequenzidentität zu sog. E1 -deletierten Adenoviren von weniger als 90%, bevorzugt weniger als 70% Sequenzidentität, weiterhin bevorzugt weniger als 50% Sequenzidentität, aufweisen, um das Risiko einer Rekombination zwischen den E1 -deletierten Adenoviren und Genen der adenoviralen E1-Region zu minimieren.
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