WO2014208742A1 - オリゴ糖ペプチドの精製方法 - Google Patents

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隆宏 宮内
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第一三共株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types

Definitions

  • the present invention relates to a method for simply purifying oligosaccharide peptides contained in egg yolk components.
  • Sialylglycopeptide (Sialyl GlycoPeptide: hereinafter referred to as “SGP”), which is an oligosaccharide peptide contained in chicken egg yolk, is useful as a raw material for pharmaceuticals because the contained oligosaccharide chain is human.
  • Patent Document 1 As a method for purifying SGP, in Patent Document 1 and the like, an extraction operation for precipitating with a water-soluble organic solvent such as ethanol is performed on the extract from a chicken defatted egg yolk-containing material to a plurality of aqueous solutions.
  • a water-soluble organic solvent such as ethanol
  • ODS-based reverse phase resin a kind of resin for reverse phase partition chromatography
  • Patent Document 2 the technique known before Patent Document 1 requires a plurality of concentrated desalting operations, is insufficient in terms of purity and yield (Patent Document 2), and is not suitable for mass purification. This was due to purification by column chromatography (Non-patent Document 1).
  • the present inventor has intensively studied on the purification method of SGP, and by adding a deproteinizing agent that is not normally used for protein / peptide purification to the aqueous solution of egg yolk component, SGP is dissolved by removing insoluble components. Other unnecessary proteins that remain in the liquid part are removed by a deproteinizing agent, and the obtained dissolved liquid part is adsorbed on a synthetic adsorption resin and eluted to obtain high-purity SGP in a high yield.
  • the present invention was completed by finding that it can be purified and by further study.
  • the present invention provides the following inventions.
  • the protein removal agent is a synthetic silica-based protein removal agent, an additive having a protein coagulation action, or an additive having a protein degradation action.
  • the synthetic silica-based deproteinizing agent is synthetic silica gel or synthetic silica colloid.
  • the synthetic silica-based deproteinizing agent has a particle size of about 1 to 50 ⁇ m, a specific surface area of about 100 to 1500 m 2 / g, a pore volume of about 0.5 to 3 ml / g, and an average pore size of about 1 to
  • the method of (3) which is a synthetic silica gel satisfying 50 nm.
  • the aqueous solution containing an avian egg yolk component is an aqueous solution of chicken egg yolk or defatted egg yolk.
  • the aqueous solution containing an avian egg yolk component is a solution from which insoluble components have been removed in advance.
  • the method of (1) further including the process of collect
  • the resin capable of separating SGP is a reverse phase resin, a normal phase resin, an ion exchange resin, a gel filtration resin, or a synthetic adsorption resin.
  • the removal operation of protein components other than SGP from the egg yolk component is completed by performing the addition / removal operation of the deproteinizing agent with respect to the aqueous solution once. It is possible to purify. Further, since no organic solvent is used in this process, it is safe and does not require special equipment. Furthermore, by using a synthetic adsorption resin such as SEPABEADS SP207SS (Mitsubishi Chemical Corporation) as a column packing resin used for column chromatography operation for recovering SGP from the solution after deproteinization operation, an alkaline solution is obtained. The resin regeneration operation by the used washing
  • FIG. 1 is a chart of the HPLC measurement results of the SGP standard.
  • FIG. 2 is a chart of LC / MS measurement results of the SGP standard.
  • FIG. 3 is a chart of 1 H-NMR measurement results of the SGP sample.
  • FIG. 4 is a chart of the HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • FIG. 5 is a chart of LC / MS measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • 6 is a chart of 1 H-NMR measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • FIG. FIG. 7 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 2.
  • FIG. 1 is a chart of the HPLC measurement results of the SGP standard.
  • FIG. 2 is a chart of LC / MS measurement results of the SGP standard.
  • FIG. 3 is a chart of 1 H-NMR measurement results of the SGP sample.
  • FIG. 4 is a chart of the HPLC measurement results of the glycopeptid
  • FIG. 8 is a graph showing the relative protein concentration (bar graph) and SGP recovery rate (line graph) of the supernatant after treatment when various SYLORUTEs, which are synthetic silica gels, are used as additives in each pH condition.
  • Y-axis shows relative protein concentration (%) and SGP recovery (%), both%.
  • the horizontal axis indicates the pH of the solution during treatment for each additive.
  • the bar graph shows the relative protein concentration when the white bar is treated for 15 minutes and the black bar is treated for 60 minutes.
  • ⁇ indicates the SGP recovery rate when 15 minutes are processed and ⁇ indicates 60 minutes.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative protein concentration (bar graph) and the SGP recovery rate (line graph) of the supernatant after treatment when various Mizucassorb, which is a synthetic silica gel, is used as an additive under various pH conditions.
  • Y-axis shows relative protein concentration (%) and SGP recovery (%), both%.
  • the horizontal axis indicates the pH of the solution during treatment for each additive.
  • the bar graph shows the relative protein concentration when the white bar is treated for 15 minutes and the black bar is treated for 60 minutes.
  • ⁇ indicates the SGP recovery rate when 15 minutes are processed and ⁇ indicates 60 minutes.
  • FIG. 10 shows the relative protein concentration (bar graph) and SGP recovery rate (line graph) of the supernatant after treatment with various carplexes and microdo KM-386P, which are synthetic silica gels, as additives. It is a graph showing. Y-axis shows relative protein concentration (%) and SGP recovery (%), both%. The horizontal axis indicates the pH of the solution during treatment for each additive.
  • the bar graph shows the relative protein concentration when the white bar is treated for 15 minutes and the black bar is treated for 60 minutes.
  • ⁇ indicates the SGP recovery rate when 15 minutes are processed and ⁇ indicates 60 minutes.
  • FIG. 11 is a graph showing the relative protein concentration (bar graph) and SGP recovery rate (line graph) of the supernatant after treatment when various copoloks, which are synthetic silica colloids, are treated under various pH conditions.
  • Y-axis shows relative protein concentration (%) and SGP recovery (%), both%.
  • the horizontal axis indicates the pH of the solution during treatment for each additive.
  • the bar graph shows the relative protein concentration when the white bar is treated for 15 minutes and the black bar is treated for 60 minutes.
  • ⁇ indicates the SGP recovery rate when 15 minutes are processed and ⁇ indicates 60 minutes.
  • FIG. 12 shows the relative protein concentration (bar graph) of the supernatant after treatment when treated under various pH conditions using Celite 545, which is a general filter aid, Fibracel BH-40, and various topcoperlites as additives. It is a graph showing SGP collection
  • FIG. 13 is a graph showing the relative protein concentration (bar graph) and SGP recovery rate (line graph) of the supernatant after treatment when tannic acid and papain are used as additives in each pH condition.
  • Y-axis shows relative protein concentration (%) and SGP recovery (%), both%.
  • the horizontal axis indicates the pH of the solution during treatment for each additive.
  • the bar graph shows the relative protein concentration when the white bar is processed for 15 minutes and the black bar is processed for 60 minutes (for papain, the hatched bar is processed for 20 hours).
  • ⁇ represents the SGP recovery rate after 15-minute processing
  • ⁇ represents 60-minute processing (for papain, ⁇ represents 20-hour processing).
  • FIG. 14 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 4.
  • FIG. 15 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 5.
  • FIG. 16 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 6.
  • FIG. 17 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 7.
  • FIG. 18 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Reference Example 1.
  • the present invention provides a method for purifying a sialylglycopeptide, comprising the following step A; Step A: A step of mixing an aqueous solution containing an avian egg yolk component and a protein removal agent to obtain a solution portion.
  • Step A A step of mixing an aqueous solution containing an avian egg yolk component and a protein removal agent to obtain a solution portion.
  • “mixing” two or more materials means an operation in which all the materials are brought into contact with each other and the components of each material are uniformly distributed or dissolved.
  • the mixing operation is not particularly limited as long as the above-described mixed state can be achieved, and examples thereof include shaking stirring, stirring with a stirring bar, stirring with a stirring blade, and the like.
  • the time required for these operations is not particularly limited, and is, for example, 10 seconds or longer, preferably 5 minutes or longer, more preferably 15 minutes or longer.
  • the temperature at which this operation is performed is not particularly limited as long as the components contained in each material are not altered or denatured, but is preferably 4 ° C to 40 ° C.
  • “to obtain a solution part” means to remove insoluble matters contained in a solution or a mixed solution and collect only the solution part dissolved in a solvent.
  • Typical separation operations include filtration, centrifugation and the like.
  • filter paper, glass filter, membrane filter, filter cloth, and the like can be used.
  • filtration mode natural filtration, suction filtration, pressure filtration, etc. are employable as a filtration mode.
  • the type of filter, filtration mode, centrifugation conditions [number of rotations, time, temperature] and the like can be appropriately selected depending on the state of the solution and the like subjected to separation.
  • the separation operation may be performed after a filter aid such as celite is appropriately mixed with the solution or the like before the separation operation.
  • filter aids As the filter aid used individually, various commonly known filter aids can be employed as long as they do not have a deproteinization effect.
  • the “dissolved liquid part” refers to a liquid sample that contains a liquid as a main component and that is obtained by removing insoluble matters and does not substantially contain insoluble matters. Each component contained in the dissolved liquid part is present in a dissolved state in the liquid at least when the dissolved liquid part is obtained.
  • the solution part may produce insoluble matter during storage due to changes in liquid conditions (pH, temperature, etc.), but such insoluble matter is substantially removed by a normal method such as filtration. The state which does not contain an insoluble matter can be recovered.
  • sialyl glycopeptide (Sialyl GlycoPeptide: hereinafter referred to as“ SGP ”): means reduction of sialylglycan consisting of 11 sugars represented by the following structural formula (I) and sequence formula (II): An oligosaccharide in which the 1-position carbon of GlcNAc at the terminal and the nitrogen atom derived from the side chain amide group at the 4-position Asn of Lys-Val-Ala-Asn-Lys-Thr- (SEQ ID NO: 1) are ⁇ -N glycosidic bonded It is a glycopeptide.
  • SGP is a glycopeptide contained in avian egg yolk, but purified SGP is commercially available and can be purchased.
  • the HPLC chart, LC / MS spectrum, and 1 H-NMR spectrum (measured under the conditions described in Example 1) of SGP manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. are as shown in FIG. 1, FIG. 2, and FIG. 3, respectively. Therefore, it is possible to identify that the obtained glycopeptide is SGP.
  • the “SGP product” is a product containing SGP as one of main components, such as research reagents, industrial raw materials, pharmaceutical additives, food additives, and the like.
  • the SGP purified by the method of the present invention is processed into a state (freeze-dried powder, solution, etc.) according to the product form, enclosed in an appropriate container, packaged, and used as a product. Manufactured. Since SGP obtained by the purification method of the present invention has high purity, it is also useful as a raw material for such SGP products.
  • SGP can be detected or quantified by HPLC or the like using a resin capable of separating SGP.
  • HPLC conditions include the following conditions.
  • HPLC 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.) Column: L-Column 2 ODS 3 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 50 mm (Scientific Substance Evaluation Research Organization) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: H 2 O solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Mobile phase B: MeCN solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Gradient (mobile phase B%): 0% (0 minutes), 10% (5 minutes), 30% (7 minutes), 30% (8 minutes) Flow rate: 0.6 ml / min Detection wavelength: 210 nm
  • HPLC 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.) Column: Inertsil Amide 3 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 75 mm (GL Sciences Inc.) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: H 2 O solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Mobile phase B: MeCN solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Gradient (mobile phase B%): 70% (0 minutes), 30% (6 minutes), 10% (6.01 minutes), 10% (7.5 minutes) Flow rate: 0.6 ml / min Detection wavelength: 210 nm.
  • SGP contained in the solution can be calculated as a peak area value belonging to SGP in the obtained HPLC chart by subjecting the target solution to the above HPLC.
  • the recovery rate of the SGP of the target solution with respect to the SGP content of the starting material solution it can be calculated by the following equation.
  • the purity of the test SGP can be calculated as a relative purity with the purity of the standard SGP as 100%.
  • the standard product SGP for example, a commercially available SGP manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. can be used.
  • As a measuring method a predetermined amount of an aqueous solvent such as water is added to a precisely weighed test SGP, and a completely dissolved test SGP solution is subjected to HPLC measurement under the above conditions, and in the obtained HPLC chart The peak area value of the test SGP is measured.
  • the same operation is performed for the standard SGP, and after preparing a standard SGP solution having the same concentration as the SGP, HPLC measurement under the same conditions is performed, and the purity of the test SGP is calculated by the following formula: Can do.
  • Test SGP purity (%) (Test SGP peak area value / standard product SGP peak area value) ⁇ 100.
  • SGP is known to be contained in the egg yolk of avian eggs, and since the sugar chain structure contained is a human type, even if it is ingested or taken by humans, it does not easily cause an allergic reaction.
  • the “aqueous solution containing an avian egg yolk component” means a solution obtained by mixing an egg yolk component of an avian egg with an aqueous solvent.
  • the origin of the egg is not particularly limited as long as it is a bird, and examples thereof include chickens, quails, pigeons, ostriches, and crows, but chicken-derived eggs are preferred.
  • the egg yolk is separated from the whole egg white from the whole egg as it is, dried as dried egg yolk, degreased defatted egg yolk, or powdered egg yolk powder, or defatted egg yolk powder of the present invention Can be used in the method.
  • Egg yolk powder, defatted egg yolk powder, etc. are sold and can be purchased (York Protein H (Kewpie Corporation), Sunny Pro DF (Taiyo Chemical Corporation), etc.).
  • aqueous solvents can be used as long as they are water-based aqueous solvents that do not substantially contain components that denature proteins.
  • it is water.
  • the egg yolk component-containing solution used in the deproteinization step may be used as it is by mixing egg yolk components such as egg yolk, defatted egg yolk, and their powders with an aqueous solvent, but if necessary, separate insolubles. Only the dissolved solution part may be used.
  • the “protein removal agent” means a material having an effect of reducing the amount of protein in the solution by adding it to a protein-containing solution (referred to as “protein removal effect” in this specification).
  • the mode of the deproteinization effect of the deproteinizing agent used in the present invention is not particularly limited as long as the SGP content in the solution does not decrease.
  • a protein adsorbing like synthetic silica, tannic acid Various deproteinizing agents such as those having a protein coagulation action such as those having a proteolytic action such as papain can be employed, but are preferably deproteinizing agents that adsorb proteins, more preferably Is a synthetic silica-based deproteinizing agent.
  • synthetic silica-based protein removing agent used in the present invention, various forms such as powdered synthetic silica gel and colloidal synthetic silica colloid can be employed.
  • the synthetic silica gel is not particularly limited as long as it has a deproteinization effect.
  • average particle diameter about 1 to 50 (preferably about 2 to 30) ⁇ m
  • ratio Surface area about 100-1500 (preferably about 200-800) m 2 / g
  • pore volume about 0.5-3 (preferably about 1-2) ml / g
  • average pore size about 1-
  • Synthetic silica gel satisfying 50 preferably about 5 to 30 nm
  • Such synthetic silica gels are commercially available as filter aids.
  • SYLOPUTE 202, SYLOPUTE 303, SYLOPUTE 403 (Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.), Carplex BS-303, Carplex BS- 306 (DSL Japan Co., Ltd.), Microdo KM-386P (KD corporation), Mizukasorb A751C, Mizukasorb C-1, Mizukasorb C-6 (Mizusawa Chemical Co., Ltd.) and the like
  • SYLOPUTE 202, SYLOPUTE 303, SYLOPUTE 403 (Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.)
  • Carplex BS-303, Carplex BS- 306 DSL Japan Co., Ltd.
  • Microdo KM-386P KD corporation
  • Mizukasorb A751C Mizukasorb C-1, Mizukasorb C-6 (Mizusawa Chemical Co., Ltd.) and the like
  • Synthetic silica colloids include those charged negatively and those charged positively, and various types can be applied to the present invention.
  • a synthetic silica colloid that is negatively charged is employed, a good deproteinization effect can be obtained by adjusting the solution during the treatment to be acidic (pH 3 to 4).
  • a synthetic silica colloid having a weak negative charge is preferred.
  • Copolok 200, Copolok 300, Copolok 306 (Otsuka Foods Co., Ltd.) and the like can be employed as the synthetic silica colloid.
  • the mixing ratio at the time of mixing the egg yolk component-containing solution and the deproteinizing agent varies depending on the type of deproteinizing agent used.
  • the deproteinizing agent is 0.1 to 50% (v / V or w / v).
  • the egg yolk component-containing aqueous solution is preferably adjusted to be weakly acidic.
  • the time for mixing the egg yolk component-containing solution and the deproteinizing agent is not particularly limited. However, when an additive having a proteolytic action is used as the deproteinizing agent, the SGP is decomposed by being treated for a long time. The SGP content of the solution after treatment may decrease. Therefore, the mixing time when using a deproteinizing agent having a proteolytic action is usually 5 hours or less, preferably 3 hours or less, more preferably 2 hours or less, and optimally 1 hour or less. is there. After mixing the egg yolk component solution and the protein-removing agent, the insoluble matter is separated to obtain a solution portion.
  • the SGP content in the solution part obtained by the above separation operation can be confirmed by a method such as HPLC.
  • the protein content in the solution part can be identified and quantified by various known methods.
  • SDS-PAGE can be used as a protein identification method.
  • an ultraviolet absorption method (absorbance 280 nm), a Bradford method, or the like can be employed as a protein quantification method.
  • SGP can be purified from the deproteinized solution obtained through the above deproteinization step using various column fillers.
  • column fillers used for such purification include synthetic adsorption resins, reverse phase resins, normal phase resins, ion exchange resins, gel filtration resins, and the like.
  • the reverse phase resin is a resin in which a hydrophobic functional group such as a butyl group (C4), an octyl group (C8), an octadecyl group (C18), a triacontyl group (C30), or a phenyl group is added to a base material of silica gel.
  • Synthetic adsorption resin is a filler made of porous cross-linked polymer.
  • Synthetic adsorption resin is a filler made of porous cross-linked polymer.
  • styrene-divinylbenzene synthetic adsorbent styrene-divinylbenzene modified synthetic adsorption resin, methacrylic synthetic adsorption resin, phenol System synthetic adsorption resin and the like. Since fillers such as ODS-based reverse phase resins known to be usable for SGP purification are based on silica gel, they cannot be washed with an alkaline solution.
  • a synthetic adsorption resin As the column filler, the resin can be regenerated by washing with an alkaline solution in addition to washing with an organic solvent, so that impurities can be sufficiently removed. It is possible to reuse the synthetic adsorption resin.
  • various synthetic adsorption resins can be adopted as long as they can adsorb SGP, but styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin is preferable, and styrene-divinyl is more preferable.
  • Benzene-based modified synthetic adsorption resin Specific products include SEPABEADS SP207SS (Mitsubishi Chemical Corporation).
  • the solution after deproteinization obtained in the above step is passed through a column packed with a column packing, and if necessary, washed with an appropriate solvent according to the chromatography separation mode. Then, elution is performed using a mobile phase corresponding to the separation mode of chromatography, and SGP can be purified by collecting a fraction containing SGP in the eluate.
  • the conditions of the deproteinized solution may be appropriately adjusted in accordance with the column filler to be used and the chromatography mode. When an insoluble matter is generated due to the change in the solution conditions, a filter aid such as celite is appropriately mixed with the solution, and only the solution portion is recovered.
  • the SGP contained in the elution fraction can be monitored under the above-mentioned HPLC conditions. If the elution is performed under the same conditions as before, the elution fraction of SGP can be specified from the elution time. Such purification conditions can be set as appropriate according to the type and properties of the column packing employed.
  • the solution after deproteinization is adjusted to neutral or alkaline (preferably around pH 9) of pH 7 or higher, and only the solution part from which insoluble matter has been removed is the SEPABEADS SP207SS.
  • elution can be performed with a concentration gradient of water-2% acetone water.
  • the obtained purified SGP solution may be stored frozen as it is, but may also be stored after concentration or freeze-drying as necessary.
  • Example 1 Purification of SGP using synthetic silica gel-1> After adding 5 L of water to 500 g of defatted egg yolk powder (Kewpie Corp.) and stirring well for 15 minutes, it was filtered with a filter press (Iwata Machinery Co., Ltd.).
  • SEPABEADS SP207SS (Mitsubishi Chemical Corporation) 207 mL (35 ⁇ ⁇ 215 mm) as a synthetic adsorption resin was packed in a column, and the resin was washed with acetone and then with water, and then equilibrated with 20 mM Na 2 HPO 4 .
  • the filtrate obtained above was equilibrated with the resin at a flow rate of 50 mL / min.
  • the resin with the filtrate was washed with 2 L of water at a flow rate of 50 mL / min and then developed at a flow rate of 2% acetone water (v / v) at 25 mL / min, and the eluate was fractionated every 25 mL. (Elution fractions 1 to 40)
  • the eluted fractions 18 to 26 were combined and freeze-dried to obtain 764.4 mg of glycopeptide.
  • the obtained glycopeptide and a standard were subjected to 1 H-NMR measurement, LC / MS measurement and HPLC analysis under the following conditions.
  • the measurement results of the sample by HPLC, LC / MS and 1 H-NMR are shown in FIG. 1, FIG. 2 and FIG. 3, respectively.
  • the measurement results of the obtained glycopeptide by HPLC, LC / MS and 1 H-NMR are shown in FIGS. 4, 5 and 6, respectively.
  • the obtained glycopeptide was compared with the sample by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement, and the same mass spectrum and 1 H-NMR spectrum as the sample were obtained. It was confirmed that it was SGP represented by Formula (II). Moreover, in the result of HPLC, the purity of the obtained SGP was 104% due to the relative area value ratio of the peak attributed to SGP between the obtained SGP and the sample.
  • HPLC 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.) Column: L-Column 2 ODS 3 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 50 mm (Scientific Substance Evaluation Research Organization) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: H 2 O solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Mobile phase B: MeCN solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Gradient (mobile phase B%): 0% (0 minutes), 10% (5 minutes), 30% (7 minutes), 30% (8 minutes) Flow rate: 0.6 ml / min Detection wavelength: 210 nm.
  • NMR NMR: AVANCE500 (500 MHz, Bruker BioSpin Corporation) Solvent: DEUTERIUM OXIDE + 0.1% TMSP (euriso-top).
  • Example 2 Purification of SGP using synthetic silica gel-2>
  • the glycopeptide was purified from the defatted egg yolk powder, and the column elution fractions 20 to 30 were combined and freeze-dried to obtain 694.1 mg of the glycopeptide.
  • the obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement.
  • Example 1 the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1 (FIG. 7). From the HPLC results, the purity was calculated in the same manner as in Example 1. As a result, the purity of the obtained SGP was 102%.
  • Example 3 Examination of application of various protein removal agents to SGP purification> Next, the applicability of various protein removal agents, various general filter aids, and various additives to SGP purification was examined. In the purification method of the present invention, it is important that impurities, particularly unnecessary proteins, are removed from the solution to be subjected to column chromatography and that SGP remains. The examination was performed using the protein content in the solution and the SGP recovery rate as indices.
  • Verification of protein removal performance and SGP recovery rate in defatted egg yolk powder About synthetic silica gel, synthetic silica colloid, general filter aid, additive with protein coagulation action, and additive with proteolytic action, defatted egg yolk powder The protein removal performance with respect to the protein in the inside was evaluated, and the recovery rate against SGP in the defatted egg yolk was evaluated.
  • Copolok 200 (Otsuka Foods Co., Ltd.), Copolok 300 (Otsuka Foods Co., Ltd.), and Copolok 306 (Otsuka Foods Co., Ltd.) were used.
  • Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.), Fibracel BH-40 (Imers Minerals California, Inc.), Topcoperlite No. 31 (Toko Perlite Industry Co., Ltd.), Topco Perlite No. 31 (Toko Perlite Industry Co., Ltd.) was used.
  • Tannic acid (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used as an additive having a protein coagulation action.
  • Papain (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as an additive having a proteolytic action.
  • tannic acid 1% (w / v) was added to the dispensing solution, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes and 60 minutes.
  • papain 1% (w / v) was added to the dispensing solution, and the mixture was contacted with stirring at room temperature for 15 minutes and 60 minutes and at 50 degrees for 20 hours. All the stirring in the experiment was performed with a reciprocating (reciprocating) shaker. Each treated sample was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the resulting supernatant was collected, and the protein content and the SGP recovery rate were measured by the following methods. The results are shown in FIGS.
  • Copolok 200 shows a certain deproteinization effect and SGP recovery rate, and it is considered that highly pure SGP can be purified at any pH.
  • Copolok 300 and 306 a sufficient deproteinization effect and SGP recovery are shown near pH 3 or 4, but at pH 6 or higher, the protein concentration of the solution after treatment was high.
  • Colloidal synthetic silica was also shown to have a high deproteinization effect.
  • tannic acid and papain which are known to have a deproteinization effect other than synthetic silica, showed a certain deproteinization effect and SGP recovery rate for tannic acid regardless of pH. .
  • papain treatment was performed, both the deproteinization effect and the SGP recovery rate fluctuated greatly depending on the pH, indicating that the conditions from acidity were appropriate.
  • the recovery rate of SGP decreases, so the treatment time should be several hours or less, and it is considered that about 15 to 60 minutes is appropriate.
  • Example 4 Purification of SGP using synthetic silica gel-3> After adding 5 L of water to 500 g of defatted egg yolk powder (Kewpie Corp.) and stirring well for 15 minutes, it was filtered with a filter press (Iwata Machinery Co., Ltd.). After adding 250 g of Mizuka Sorb A751C (Mizusawa Chemical Co., Ltd.) to the obtained water extract and stirring well for 15 minutes, it was filtered with a filter press (Iwata Machinery Co., Ltd.). The obtained filtrate was adjusted to pH 9 with 1M NaOH and stirred well. After standing for 30 minutes, 100 g of Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.) was added, and filtration was performed with a filter press (Iwata Kikai Co., Ltd.).
  • the obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement. About obtained SGP, the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1, and purity was computed (FIG. 14, purity: 98%).
  • Example 5 Purification of SGP using synthetic silica gel-4> The glycopeptide was purified from the defatted egg yolk by the same operation as in Example 4, and the column elution fractions 17 to 22 were combined and freeze-dried to obtain 784.1 mg of the glycopeptide. The obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement. About obtained SGP, the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1, and purity was computed (FIG. 15, purity: 99%).
  • Example 6 Purification of SGP using ODS reverse phase resin> After adding 5 L of water to 500 g of defatted egg yolk powder (Kewpie Corp.) and stirring well for 15 minutes, it was filtered with a filter press (Iwata Machinery Co., Ltd.). After adding 250 g of Mizuka Sorb A751C (Mizusawa Chemical Co., Ltd.) to the obtained water extract and stirring well for 15 minutes, it was filtered with a filter press (Iwata Machinery Co., Ltd.). The obtained filtrate was adjusted to pH 6.5 with 1M NaOH and stirred well.
  • Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.) was added, and filtration was performed with a filter press (Iwata Kikai Co., Ltd.). Wakogel 100C18 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 192 mL (35 ⁇ ⁇ 200 mm) was packed in the column as an ODS-based reverse phase resin, and the resin was washed with acetonitrile and subsequently with water, and then equilibrated with 20 mM HCOONH 4 .
  • the filtrate obtained above was equilibrated with the resin at a flow rate of 50 mL / min.
  • the resin with the filtrate was washed with 2 L of water at a flow rate of 50 mL / min and developed at a flow rate of 1% acetonitrile water (v / v) at 25 mL / min, and the eluate was fractionated every 25 mL.
  • Elution fractions 1 to 14 Further, 2% acetonitrile water (v / v) was developed at a flow rate of 25 mL / min, and the eluate was fractionated every 25 mL.
  • Elution fraction 15 to 40 The eluted fractions 8 to 24 were combined and freeze-dried to obtain 565.6 mg of glycopeptide.
  • the obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement. About obtained SGP, the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1, and purity was computed (FIG. 16, purity: 98%).
  • Example 7 Purification of SGP using dried egg yolk powder> Dried egg yolk powder no. 1 (Kewpie Co., Ltd.) 500 g was added with 5 L of water and stirred well for 15 minutes, then 1 kg of Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.) was added, and the mixture was filtered with a suction filter can (Sugia Magen). It was. After adding 250 g of Mizukasorb A751C (Mizusawa Chemical Co., Ltd.) to the obtained aqueous extract and stirring well for 15 minutes, the mixture was filtered with a suction filter can (Sugiamagen). The obtained filtrate was adjusted to pH 9 with 1M NaOH and stirred well. After standing for 30 minutes, 100 g of Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.) was added, and filtration was performed with a suction filter can (Sugiamagen, Inc.).
  • the obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement. About the obtained SGP, the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1, and purity was computed (FIG. 17, purity: 93%).
  • Example 1 Purification of SGP using general filter aid>
  • 250 g of Celite 545 Imers Minerals California, Inc.
  • a general filter aid instead of synthetic silica gel (Mizukasorb A751C), 250 g of Celite 545 (Imers Minerals California, Inc.), a general filter aid, was used, and column elution fractions 14 to 24 were obtained.
  • 955.0 mg of glycopeptide was obtained by lyophilization.
  • the obtained glycopeptide was confirmed to be SGP by comparison with a preparation by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement.
  • the HPLC analysis was performed on the same conditions as Example 1, and purity was computed (FIG. 18, purity: 83%).
  • Celite 545 does not have a deproteinizing effect. Therefore, in this reference example, unnecessary proteins in the solution are not sufficiently removed. As a result, after the separation operation with the synthetic adsorbent, Even so, the purity of the obtained SGP was not sufficient as compared with other examples using a deproteinizing agent. Also from this, in order to obtain high purity SGP, it is necessary to sufficiently remove unnecessary protein in the solution part by mixing and separating the yolk component-containing solution with a filter aid having a deproteinizing effect. was shown to be important.

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Abstract

　本発明は、鳥類の卵黄成分を含む水性溶液と除タンパク剤を混合させ、溶解液部を得る工程を含む、卵黄成分から、簡便に、シアリルグリコペプチドを精製する方法を提供する。

Description

オリゴ糖ペプチドの精製方法
　本発明は、卵黄成分に含まれるオリゴ糖ペプチドを簡便に精製する方法に関する。
　ニワトリの卵黄に含まれるオリゴ糖ペプチドであるシアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ　ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）は、含まれるオリゴ糖鎖がヒト型であるため、医薬品の原料として有用である。
　ＳＧＰの精製方法としては、特許文献１等において、ニワトリの脱脂卵黄含有物から、複数回の水性溶液への抽出操作に次いで、当該抽出液に対するエタノール等の水溶性有機溶媒により沈殿させる抽出操作を複数回行い、得られた沈殿を水に溶解して、ＯＤＳ系逆相樹脂（逆相分配クロマトグラフィー用樹脂の一種）に吸着させ、溶出する方法が知られていた。
　また、特許文献1以前に知られていた技術は、複数の濃縮脱塩操作を必要とし、且つ純度や収率の点で不十分であり（特許文献２）、また、大量精製には不向きなカラムクロマトグラフィーによる精製（非特許文献１）によるものであった。
国際特許公開公報　　WO2011/027868 国際特許公開公報　　WO96/02255号
Akira Seko, et al., Biochimicaet Biophysica Acta, (1997), Vol. 1335, p.23-32
　従来知られていた方法で、高純度のＳＧＰを工業スケールで精製するには、多量の有機溶媒を用いた抽出を複数回繰り返す必要があったため、危険な操作が必要であり、また、多くの時間、設備、労力が必要であった。
　本発明者は、ＳＧＰの精製方法について、鋭意検討を重ね、卵黄成分の水溶液に、通常はタンパク質・ペプチドの精製には用いられない除タンパク剤を加え、不溶成分を除去することでＳＧＰが溶解液部に残り、他の不要なタンパク質は除タンパク剤により除去されること、また、得られた溶解液部を合成吸着樹脂に吸着させ、溶出することで、高純度のＳＧＰを高収率で精製できることを見出し、さらに検討を重ねることで本発明を完成した。
　本発明は、以下の発明を提供する。
（１）　以下の工程Ａを含むことを特徴とする、シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）の精製方法、
工程Ａ：鳥類の卵黄成分を含む水性溶液と除タンパク剤を混合させ、溶解液部を得る工程。
（２）　除タンパク剤が、合成シリカ系除タンパク剤、タンパク質凝固作用を有する添加剤、又はタンパク質分解作用を有する添加剤である（１）の方法。
（３）　合成シリカ系除タンパク剤が、合成シリカゲル又は合成シリカコロイドである（２）の方法。
（４）　合成シリカ系除タンパク剤が、粒子径：約１～５０μｍ、比表面積：約１００～１５００ｍ２／ｇ、細孔容積：約０．５～３ｍｌ／ｇ、平均細孔径：約１～５０ｎｍを満たす合成シリカゲルである（３）の方法。
（５）　鳥類の卵黄成分を含む水性溶液が、ニワトリの卵黄又は脱脂卵黄の水溶液である、（１）の方法。
（６）　鳥類の卵黄成分を含む水性溶液が、事前に不溶成分が除去された溶液である、（１）の方法。
（７）　工程Ａで得られた溶解液部を、ＳＧＰを分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー操作により、ＳＧＰを含有する画分を回収する工程を、さらに含む（１）の方法。
（８）　ＳＧＰを分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂又は合成吸着樹脂である（７）の方法。
（９）　合成吸着樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂、フェノール系合成吸着樹脂である（８）の方法。
（１０）　合成吸着樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である（９）の方法。
（１１）（１）乃至（１０）のいずれかの方法で精製されたＳＧＰを適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ製品の製造方法。
　本発明の方法は、卵黄成分からのＳＧＰ以外のタンパク質成分の除去操作が、水溶液に対する除タンパク剤の添加・除去操作を一回行うことで完了するため、短時間、且つ、少ない労力でＳＧＰを精製することが可能である。また、この工程において有機溶媒を使用しないため、安全であり、特殊な設備も必要としない。さらに、除タンパク操作後の溶液からＳＧＰを回収するカラムクロマトグラフィー操作に用いられるカラム充填用樹脂として、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））のような合成吸着樹脂を使用することで、アルカリ性溶液を用いた洗浄による樹脂回生操作を行なうことができる。この操作により樹脂を再利用することが可能であり、更なるコスト削減が可能である。また、本発明の方法では廃液の量も少なく、合成吸着樹脂として再利用可能なものが選択できるため、環境に対しても悪影響の少ない方法を提供する。
図１は、ＳＧＰ標品のＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図２は、ＳＧＰ標品のＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。 図３は、ＳＧＰ標品の１Ｈ－ＮＭＲ測定結果のチャートである。 図４は、実施例１で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図５は、実施例１で精製された糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。 図６は、実施例１で精製された糖ペプチドの１Ｈ－ＮＭＲ測定結果のチャートである。 図７は、実施例２で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図８は、合成シリカゲルである各種ＳＹＬＯＲＵＴＥを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが１５分処理、黒のバーが６０分処理した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図９は、合成シリカゲルである各種ミズカソーブを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが15分処理、黒のバーが６０分処理した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図１０は、合成シリカゲルである各種カープレックス、マイクロドＫＭ－３８６Ｐを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが１５分処理、黒のバーが６０分処理した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図１１は、合成シリカコロイドである各種コポロックを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが１５分処理、黒のバーが６０分処理した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図１２は、一般的なろ過助剤であるセライト５４５、ファイブラセルＢＨ－４０、各種トプコパーライトを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが15分処理、黒のバーが６０分処理した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図１３は、タンニン酸及びパパインを添加剤として、各ｐＨ条件で処理した際の、処理後上澄み液の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。Ｙ軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の％を示す。横軸は、それぞれの添加剤における処理時溶液のｐＨを示す。棒グラフは、白のバーが１５分処理、黒のバーが６０分処理（パパインについては、斜線のバーが２０時間処理）した場合の相対タンパク質濃度を示す。折れ線グラフでは、◆は１５分処理、●は６０分処理（パパインについて▲は２０時間処理）した場合のＳＧＰ回収率を示す。 図１４は、実施例４で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図１５は、実施例５で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図１６は、実施例６で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図１７は、実施例７で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図１８は、参考例１で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。
　以下において、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、以下の工程Ａを含むことを特徴とする、シアリルグリコペプチドの精製方法を提供する；
工程Ａ：鳥類の卵黄成分を含む水性溶液と除タンパク剤を混合させ、溶解液部を得る工程。
＜混合・分離＞
　本発明において、２つ以上の材料を「混合させる」とは全ての材料を接触させ、各材料の成分が均一に分布又は溶解した状態にせしめる操作を意味する。混合させる操作は、上記の混合状態を達成できる操作であれば、特に限定されず、例えば、振とう攪拌、攪拌子による攪拌、攪拌羽による攪拌等を挙げることができる。これらの操作に要する時間は特に限定されず、例えば、１０秒以上、好ましくは５分間以上、より好ましくは１５分間以上である。この操作を行う際の温度は、各材料に含まれる成分が変質、変性しない温度であれば、特に限定されるものではないが、４℃乃至４０℃が好ましい。
本発明において、「溶解液部を得る」とは、溶液又は混合液中に含まれる不溶物を除去し、溶媒中に溶解した溶解液部のみを回収することを意味する。溶解液部と不溶物を分離する操作としては、公知の様々な方法を採用することができる。代表的な分離操作としては、ろ過、遠心分離等が挙げられる。ろ過に用いるフィルターは、ろ紙、ガラスフィルター、メンブレンフィルター、ろ布等を用いることができる。また、ろ過の様式としては、自然ろ過、吸引ろ過、加圧ろ過等を採用することができる。フィルターの種類、ろ過様式、遠心分離の条件［回転数、時間、温度］等は、分離に供される溶液等の状態に応じて、適宜選択することができる。また、溶液からの不溶物の除去効率を向上させるために、分離操作の前に、適宜セライト等のろ過助剤を溶液等に予め混合させた後で、分離操作を行っても良い。
　個々で用いられるろ過助剤としては、除タンパク効果を有しないものであれば、通常知られている様々なろ過助剤を採用することができる。
　本発明において、「溶解液部」とは、液体を主成分とする試料において、不溶物を除去することで得られる、実質的に不溶物を含まない液体試料をいう。溶解液部に含まれる各成分は、少なくとも当該溶解液部を取得した時点においては液体中に溶解した状態で存在している。当該溶解液部は、保存中、液体条件の変更（ｐＨ，温度等）により、不溶物を生じる場合があるが、このような不溶物は、ろ過等の通常の方法により除去され、実質的に不溶物を含まない状態を回復しうることができる。
　＜シアリルグリコペプチド＞
　本発明において、「シアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）：とは、以下の構造式（Ｉ）及び配列式（ＩＩ）で示される、11個の糖からなるシアリルグリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃの１位炭素と、Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－（配列番号１）の４位Ａｓｎの側鎖アミド基に由来する窒素原子が、β-Ｎグリコシド結合した、オリゴ糖ペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　　　　　（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （ＩＩ）
ＳＧＰは、鳥類の卵黄に含まれる糖ペプチドであるが、精製されたＳＧＰが市販されており、購入することもできる。例えば、東京化成工業（株）製のＳＧＰのＨＰＬＣチャート、ＬＣ／ＭＳスペクトル及び１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（実施例１に記載の条件で測定）は、それぞれ図１、図２及び図３に示すようなピークを示すため、これを標準品として、得られた糖ペプチドがＳＧＰであることを同定することができる。
本発明において、「ＳＧＰ製品」とは、ＳＧＰを主要な構成の一つとして含む製品であり、例えば、研究試薬、工業用原料、医薬品添加剤、食品添加剤等である。ＳＧＰ製品として製造される場合、本発明の方法で精製されたＳＧＰは、製品形態に応じた状態（凍結乾燥粉末、溶液等）に処理され、適切な容器に封入さ手、包装され、製品として製造される。本発明の精製方法で得られるＳＧＰは高純度であるため、このようなＳＧＰ製品の原料としても有用である。
　ＳＧＰは、ＳＧＰを分離可能な樹脂を用いたＨＰＬＣ等により検出又は定量することができ、そのようなＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下の条件を挙げることができる。
 [逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ　３μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（科学物質評価研究機構）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ
[順相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　Ａｍｉｄｅ　３μｍ　φ３．０×７５ｍｍ（ジーエルサイエンス（株））
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：７０％（０分）、３０％（６分）、１０％（６．０１分）、１０％（７．５分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
　溶液中に含まれるＳＧＰは、対象溶液を上記のＨＰＬＣに供し、得られたＨＰＬＣチャートにおける、ＳＧＰに帰属するピーク面積値として算出することができる。例えば、出発材料溶液のＳＧＰ含有量に対する、対象溶液のＳＧＰの回収率を算出する場合、以下の式により算出することができる。
回収率（％）＝（対象溶液のＳＧＰピーク面積値×対象溶液量）／（出発原料溶液のＳＧＰピーク面積値×出発原料溶液量）×１００
　また、被検ＳＧＰの純度は、標準品のＳＧＰの純度を１００％とした相対純度として算出することができる。標準品ＳＧＰとしては、例えば、市販されている東京化成工業（株）製のＳＧＰ等を利用することができる。測定方法としては、正確に秤量した被検ＳＧＰに、水等の水性溶媒を一定量加え、完全に溶解させた被検ＳＧＰ溶液を、上記の条件でＨＰＬＣ測定を行い、得られたＨＰＬＣチャートにおける、被検ＳＧＰのピーク面積値を測定する。同様に、標準品ＳＧＰについても同様の操作を行い、被ＳＧＰと同一の濃度の標準品ＳＧＰ溶液を調製後、同一条件のＨＰＬＣ測定を行い、以下の式によって被検ＳＧＰの純度を算出することができる。
被検ＳＧＰ純度（％）＝（被検ＳＧＰピーク面積値／標準品ＳＧＰピーク面積値）×１００。
　＜卵黄成分含有溶液＞
　ＳＧＰは、鳥類の卵の卵黄に含まれていることが知られており、含まれる糖鎖構造がヒト型であるため、ヒトが摂取又は服用しても、アレルギー反応を起こしにくい。
　本発明において、「鳥類の卵黄成分を含む水性溶液」とは、鳥類の卵の卵黄成分を水性溶媒と混合させた溶液を意味する。卵の由来は、鳥類であれば特に限定されず、ニワトリ、ウズラ、ハト、ダチョウ、カラス等をあげることができるが、好ましくはニワトリ由来の卵である。卵黄は、全卵から卵白と分離させたものをそのまま、乾燥させた乾燥卵黄として、脱脂処理をした脱脂卵黄として、又は、それらを粉末状にした卵黄粉、若しくは脱脂卵黄粉として、本発明の方法に用いることができる。鶏卵の卵黄粉、脱脂卵黄粉などは、販売されており、購入することができる（ヨークプロテインＨ（キユーピー（株））、サニープロＤＦ（太陽化学（株））等）。
　卵黄成分を溶解又は懸濁させる溶媒としては、水を主成分とする水性溶媒であり、タンパク質を変性させる成分を実質的に含まないものであれば、様々な水性溶媒を用いることができるが、好ましくは水である。除タンパク工程に用いられる卵黄成分含有溶液は、卵黄、脱脂卵黄、それらの粉末等の卵黄成分を、水性溶媒と混合させたものをそのまま用いても良いが、必要に応じて、不溶物を分離した溶解液部のみを用いてもよい。
　＜除タンパク剤＞
　本発明において、「除タンパク剤」とは、タンパク質を含む溶液に添加することで、当該溶液中のタンパク質量を低減させる効果（本明細書において「除タンパク効果」という）を有する材料を意味する。本発明に用いられる除タンパク剤の除タンパク効果の様式としては、当該溶液中のＳＧＰ含有量が低減しないものであれば特に限定されず、例えば合成シリカのようにタンパク質を吸着するもの、タンニン酸のようにタンパク質凝固作用を有するもの、パパインのようにタンパク質分解作用を有するもの等、様々な除タンパク剤を採用することができるが、好ましくは、タンパク質を吸着させる除タンパク剤であり、より好ましくは、合成シリカ系除タンパク剤である。
本発明に用いられる合成シリカ系除タンパク剤としては、粉末状の合成シリカゲル、コロイド状の合成シリカコロイド等、様々な形態のものを採用することができる。
合成シリカゲルとしては、除タンパク効果を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、以下のような性質、平均粒子径：約１～５０（好ましくは、約２～３０）μｍ程度、比表面積：約１００～１５００（好ましくは、約２００～８００）ｍ２／ｇ、細孔容積：約０．５～３（好ましくは、約１～２）ｍｌ／ｇ、平均細孔径：約１～５０（好ましくは、約５～３０）ｎｍ、を満たす合成シリカゲルが挙げられる。このような合成シリカゲルは、ろ過助剤として市販されているものがあり、具体的には、例えば、ＳＹＬＯＰＵＴＥ２０２、ＳＹＬＯＰＵＴＥ３０３、ＳＹＬＯＰＵＴＥ４０３（富士シリシア化学（株））、カープレックスＢＳ－３０３、カープレックスＢＳ－３０６（ＤＳＬ・ジャパン（株））、マイクロドＫＭ－３８６Ｐ（ＫＤ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミズカソーブＡ７５１Ｃ、ミズカソーブＣ－１、ミズカソーブＣ－６（水澤化学工業（株））等を採用することができる。
　合成シリカコロイドとしては、マイナスに帯電しているものや、プラスに帯電しているもの等が挙げられ、様々なものを本発明に適用することができる。マイナスに帯電している合成シリカコロイドを採用する場合、処理時の溶液を酸性（ｐＨ３～４程度）に調整することで良好な除タンパク効果が得られる。また、本発明においては、弱いマイナス帯電を有している合成シリカコロイドが好ましい。合成シリカコロイドとして、具体的には、例えば、コポロック２００、コポロック３００、コポロック３０６（大塚食品（株））等を採用することができる。
＜除タンパク操作＞
本発明において、卵黄成分含有溶液と除タンパク剤を混合させる際の混合比率は、用いる除タンパク剤の種類により異なるが、例えば、溶液量に対して除タンパク剤を０．１～５０％（ｖ／ｖ又はｗ／ｖ）で混合させても良い。
また、必要に応じて、除タンパク剤と混合させる前の、卵黄成分含有溶液のｐＨを適宜調製しても良い。除タンパク剤の種類によっては、ｐＨ依存的に除タンパク効果や上清へのＳＧＰの回収率が変動するものがあるため、用いる除タンパク剤に合わせて適切なｐＨを選択することで、ＳＧＰの精製効率を向上させることができる。例えば、各種ＳＹＬＯＰＵＴＥ、各種ミズカソーブ、各種カープレックス、マイクロドＫＭ－３８６Ｐ等は、ｐＨ３～６程度の弱酸性において、除タンパク効果が高く、上清へのＳＧＰの回収率も高い傾向があるため、ＳＧＰの精製効率を向上させるためには、卵黄成分含有水性溶液を弱酸性に調整することが好ましい。
卵黄成分含有溶液と除タンパク剤を混合させる時間は、特に限定されないが、除タンパク剤としてタンパク質分解作用を有する添加剤を用いる場合、長時間処理を行うことでＳＧＰが分解を受けるなどして、処理後溶液のＳＧＰ含量が低下する場合がある。そのため、タンパク質分解作用を有する除タンパク剤を用いる場合の混合時間としては、通常５時間以下であり、好ましくは３時間以下であり、より好ましくは２時間以下であり、最適には１時間以下である。
卵黄成分溶液と除タンパク剤を混合させた後は、不溶物を分離させ、溶解液部を得る。
　　上記の分離操作で得られた溶解液部中のＳＧＰの含有量は、ＨＰＬＣ等の方法により確認することができる。また、当該溶解液部中のタンパク質含量は、公知の様々な方法によって、同定、定量することができる。タンパク質の同定方法としては、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ等を利用することができる。また、タンパク質の定量方法としては、紫外吸光法（吸光度２８０ｎｍ）、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法等を採用することができる。このようなタンパク質の同定、定量において十分にタンパク質が除去されない場合等は、上記の除タンパク操作を繰り返す、又は、適宜複数の除タンパク操作を組み合わせることもできる。
＜除タンパク溶液からのＳＧＰの精製＞
　上記の除タンパク工程を経て得られた除タンパク溶液から、様々なカラム充填剤を用いて、ＳＧＰを精製することができる。このような精製に用いられるカラム充填剤としては、合成吸着樹脂、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂等を挙げることができる。逆相樹脂としては、ブチル基（Ｃ４）、オクチル基（Ｃ８），オクタデシル基（Ｃ１８）、トリアコンチル基（Ｃ３０）、フェニル基等の疎水性官能基を、シリカゲルの基材へ付加させた樹脂であり、特にオクタデシル基を付加したＯＤＳ系逆相樹脂（Ｗａｋｏｇｅｌ　１００Ｃ１８（和光純薬工業（株））を用いたＳＧＰの精製については、特許文献１に記載されている。また、イオン交換樹脂であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（東ソー（株））、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ－２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗｘ２（Ｔｈｅ　Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いたＳＧＰの精製、ゲルろ過樹脂であるＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）を用いたＳＧＰの精製については、非特許文献１に、それぞれ記載されており、これらの文献に記載の条件を参考に、適宜精製することができる。
　＜合成吸着樹脂＞
　　本発明は、精製工程におけるカラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用するＳＧＰの精製方法を提供する。合成吸着樹脂とは、多孔質架橋構造ポリマーからなる充填剤であり、ポリマーの種類により、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着剤、スチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂、フェノール系合成吸着樹脂等が挙げられる。ＳＧＰの精製に利用できることが知られていたＯＤＳ系逆相樹脂等の充填剤は、シリカゲルを基材とするため、アルカリ性溶液を用いた洗浄ができない。そのため有機溶媒を用いた洗浄だけでは不純物の除去が不十分であるため、再利用することができなかった。しかし、カラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用することによって、有機溶媒を用いた洗浄に加え、アルカリ性溶液を用いた洗浄により樹脂回生が可能であることから、不純物の除去が十分に行なうことができ、合成吸着樹脂を再利用することが可能である。このような合成吸着樹脂としては、ＳＧＰを吸着できるものであれば様々な合成吸着樹脂を採用することができるが、好ましくは、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂であり、より好ましくはスチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である。具体的な製品としてはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））等を挙げることができる。
ＳＧＰを精製する方法としては、上記工程で得られた除タンパク後の溶液を、カラム充填剤を充填したカラムに通過させ、必要に応じて、クロマトグラフィーの分離モードに応じた適切な溶媒で洗浄し、クロマトグラフィーの分離モードに応じた移動相を用いて溶出させ、溶出液にＳＧＰが含まれる画分を回収することで、ＳＧＰを精製できる。この精製工程の前に、必要であれば、用いるカラム充填剤やクロマトグラフィーのモードに併せて、除タンパク後溶液の条件を適宜調整しても良い。この溶液条件の変更により不溶物が生じる場合は、適宜、セライト等のろ過助剤を溶液に混合させ、溶解液部のみを回収する操作を行う。溶出画分に含まれるＳＧＰは上記のＨＰＬＣ条件でモニターすることもできるし、以前と同一条件による溶出であれば、溶出時間からＳＧＰの溶出画分を特定することもできる。このような精製の条件は、採用するカラム充填剤の種類、性質に応じて、適宜設定することができる。
例えば、カラム充填剤としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳを用いる場合、除タンパク後の溶液を、ｐＨ７以上の中性乃至アルカリ性（好ましくは、ｐＨ９付近）に調整し、不溶物を除去した溶解液部のみを、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳを充填したカラムに通過させ、カラムを水で洗浄した後、水―２％アセトン水の濃度勾配で溶出を行うことができる。
　得られた精製ＳＧＰ溶液は、そのまま凍結保存しても良いが、必要に応じて、濃縮又は凍結乾燥して保存することもできる。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。ここに示された実施例は、本発明の実施態様の一例に過ぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１．合成シリカゲルを用いたＳＧＰの精製―１＞
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））５００ｇに水５Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られた水抽出液にＳＹＬＯＰＵＴＥ４０３（富士シリシア化学（株））２５０ｇを添加し、１５分間よく攪拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られたろ液は１Ｍ－ＮａＯＨでｐＨ９に調整し、よく攪拌した。３０分間放置した後、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．） １００ｇを添加し、フィルタープレス（薮田機械(株)）でろ過を行なった。
合成吸着樹脂としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））２０７ｍＬ（３５Φｘ２１５ｍｍ）をカラムに充填し、該樹脂をアセトン、続いて水で洗浄後、２０ｍＭ－Ｎａ２ＨＰＯ４で平衡化した。
上記で得られたろ液を平衡化した該樹脂に、流速５０ｍＬ／分で付した。ろ液を付した該樹脂を、水２Ｌ流速５０ｍＬ／分で洗浄後、２％アセトン水（ｖ／ｖ）流速２５ｍＬ／分で展開し、溶出液を２５ｍＬ毎に分画した。（溶出画分１乃至４０）
溶出画分１８乃至２６を合わせて、凍結乾燥することで、７６４．４ｍｇの糖ペプチドを得た。
　得られた糖ペプチドと標品（東京化成工業（株）製ＳＧＰ）について１Ｈ－ＮＭＲ測定、ＬＣ／ＭＳ測定及び以下の条件によるＨＰＬＣ分析を行った。標品のＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲによる測定結果を、それぞれ図１、図２及び図３に示す。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図４、図５および図６に示す。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、標品と同様のマススペクトル及び１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが得られたことから、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表されるＳＧＰであることが確認された。また、ＨＰＬＣの結果において、得られたＳＧＰと標品との、ＳＧＰに帰属するピークの相対面積値比により、得られたＳＧＰの純度は１０４％であった。
［ＨＰＬＣ測定］
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）

カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ　３μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（科学物質評価研究機構）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［ＬＣ／ＭＳ測定］
ＭＳ：６１３０　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ　３μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（科学物質評価研究機構）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［１Ｈ－ＮＭＲ測定］
ＮＭＲ：ＡＶＡＮＣＥ５００（５００ＭＨｚ、ブルカー・バイオスピン（株））
溶媒：ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ　ＯＸＩＤＥ＋０．１％ＴＭＳＰ（ｅｕｒｉｓｏ－ｔｏｐ）。
＜実施例２．合成シリカゲルを用いたＳＧＰの精製―２＞
実施例１と同様の操作により、脱脂卵黄粉から糖ペプチドの精製を行ない、カラム溶出画分２０乃至３０を合わせて凍結乾燥することで、６９４．１ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。
得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った（図７）。このＨＰＬＣの結果から、実施例１と同様に純度を算出したところ、得られたＳＧＰの純度は１０２％であった。
＜実施例３．多様な除タンパク剤のＳＧＰ精製への適用検討＞
　次に、様々な除タンパク剤、様々な一般的なろ過助剤、様々な添加剤のＳＧＰ精製への適用可能性について検討した。
本発明の精製方法においては、カラムクロマトグラフィーに供する溶液において、不純物、特に不要なタンパク質が除去され、且つ、ＳＧＰが残存していることが重要であるため、除タンパク剤等で処理した後の溶液中のタンパク質含量及びＳＧＰ回収率を指標とした検討を行った。
脱脂卵黄粉中のタンパク質除去性能及びＳＧＰ回収率の検証
　合成シリカゲル、合成シリカコロイド、一般的なろ過助剤、タンパク質凝固作用を持つ添加剤、及び、タンパク分解作用を持つ添加剤について、脱脂卵黄粉中のタンパク質に対するタンパク質除去性能を評価し、また、脱脂卵黄粉中のＳＧＰに対する回収率を評価した。
［添加剤］
合成シリカゲルとして、ＳＹＬＯＰＵＴＥ２０２（富士シリシア化学（株））、ＳＹＬＯＰＵＴＥ３０３（富士シリシア化学（株））、ＳＹＬＯＰＵＴＥ４０３（富士シリシア化学（株））、ミズカソーブＡ７５１Ｃ（水澤化学工業（株））、ミズカソーブＣ１（水澤化学工業（株））、ミズカソーブＣ６（水澤化学工業（株））、カープレックスＢＳ－３０３（ＤＳＬ．ジャパン（株））、カープレックスＢＳ－３０６（ＤＳＬ．ジャパン（株））、マイクロドＫＭ－３８６Ｐ（ＫＤ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した。
合成シリカコロイドとして、コポロック２００（大塚食品(株)）、コポロック３００（大塚食品（株））、コポロック３０６（大塚食品（株））を使用した。
一般的なろ過助剤として、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．）、ファイブラセルＢＨ－４０（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．）、トプコパーライトＮｏ．３１（東興パーライト工業（株））、トプコパーライトＮｏ．３１（東興パーライト工業（株））を使用した。
タンパク質凝固作用を持つ添加剤として、タンニン酸（東京化成工業（株））を使用した。タンパク分解作用を持つ添加剤としてパパイン（和光純薬工業（株））を使用した。
　［方法］
　脱脂卵黄粉（キユーピー（株））に対して１０倍量の水を添加し（濃度１００ｍｇ／ｍL）、１５分間よく撹拌した後、ＦＩＬＴＥＲ　ＰＡＰＥＲ　Ｎｏ．２（東洋濾紙（株））でろ過を行なった。得られた脱脂卵黄水溶液はｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８に調整した後、それぞれ１０ｍＬを分注した。
合成シリカゲル及び一般的なろ過助剤については、分注液に５％（ｗ／ｖ）添加し、室温で１５分及び６０分攪拌接触させた。
シリカコロイドについては、分注液に５％（ｖ／ｖ）添加し、室温で１５分及び６０分攪拌接触させた。
タンニン酸については、分注液に１％（ｗ／ｖ）添加し、室温で１５分及び６０分攪拌接触させた。
パパインについては、分注液に１％（ｗ／ｖ）添加し、室温で１５分及び６０分攪拌接触、５０度で２０時間攪拌接触させた。
実験における攪拌は、全てレシプロ（往復）式シェーカーで行なった。
各処理試料は１０，０００ｒｐｍ回転で５分遠心分離し、得られた上澄み液を回収し、以下の方法でタンパク質含有量の測定及びＳＧＰ回収率の測定を行った。結果を図８～図１３に示す。
　ａ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[Bradford, M. M.,Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)]によるタンパク質含量の測定
　スタンダードと上澄み液をそれぞれ１５μＬ分注し、発色液１．5ｍＬをそれぞれに添加して、攪拌後、室温で１０分以上保持して、測定した。なお、発色液にはＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用し、スタンダードには、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して、測定波長は吸光度５９５ｎｍとした。結果は、脱脂卵黄水溶液のタンパク質濃度を１００％としたときの相対タンパク質濃度（％）を図内に表示した。
　ｂ）ＨＰＬＣによるＳＧＰ回収率の測定
実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。同様に、脱脂卵黄水溶液及び各上澄み液各５μＬをＨＰＬＣへ注入し、実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。ＳＧＰの回収率は、同様に、脱脂卵黄水溶液のＳＧＰのピーク面積値を１００％としたときの相対ピーク面積値（％）を図内に表示した。
［結果］
　図８～１０に示されるように、各種合成シリカゲルで処理した溶液においては、タンパク質濃度が低く、合成シリカが高い除タンパク効果を有することが示された。一方で、当該処理後溶液中のＳＧＰの回収率は高く、ＳＧＰは合成シリカには吸着せず、溶液中に溶解していることが示された。また、これらの効果は、処理時の溶液のｐＨにより若干の影響を受け、酸性よりの条件において、除タンパク効果及びＳＧＰ回収率共に高い傾向がある。しかし、いずれの条件においても、処理後の溶液から高純度のＳＧＰが精製できるものと考えられる。
　合成シリカコロイドによる処理の場合、図１１に示されるように、種類によって異なる傾向が示された。コポロック２００では、一定の除タンパク効果とＳＧＰ回収率が示されており、いずれのｐＨにおいても高純度のＳＧＰが精製できると考えられる。一方で、コポロック３００、及び３０６では、ｐＨ３又は４付近では、十分な除タンパク効果とＳＧＰの回収率が示されているが、ｐＨ６以上では、処理後溶液のタンパク質濃度が高いという結果であった。コロイド状の合成シリカにおいても、高い除タンパク効果を有することが示された。
　セライト５４５、ファイブラセルＢＨ－４０、各種パーライト等の一般的なろ過助剤では、図１２に示されるとおり、除タンパク効果が無いことが判明した。このことから、ろ過助剤として一般的なシリカの中でも、セライトのような天然シリカには除タンパク効果が無く、合成シリカを採用することにより、本発明の方法に用いられる添加剤において重要な性質である除タンパク効果が得られることが示された。
　合成シリカ以外の除タンパク効果が知られている、タンニン酸やパパインについては、図１３に示されるように、タンニン酸についてはｐＨによらず、一定の除タンパク効果とＳＧＰ回収率が示された。パパイン処理した場合、除タンパク効果、ＳＧＰ回収率共にｐＨにより大きく変動し、酸性よりの条件が適切であることが示された。また、２０時間のパパイン処理では、ＳＧＰの回収率が低下するため、処理時間は、数時間以下にすべきであり、１５分～６０分程度が適切であると考えられる。
＜実施例４．合成シリカゲルを用いたＳＧＰの精製―３＞
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））５００ｇに水５Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られた水抽出液にミズカソーブＡ７５１Ｃ（水澤化学工業（株））２５０ｇを添加し、１５分間よく攪拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られたろ液は１Ｍ－ＮａＯＨでｐＨ９に調整し、よく攪拌した。３０分間放置した後、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．） １００ｇを添加し、フィルタープレス（薮田機械(株)）でろ過を行なった。
合成吸着樹脂としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））２０７ｍＬ（３５Φｘ２１５ｍｍ）をカラムに充填し、該樹脂をアセトン、続いて水で洗浄後、２０ｍＭ－Ｎａ２ＨＰＯ４で平衡化した。
上記で得られたろ液を平衡化した該樹脂に、流速５０ｍＬ／分で付した。ろ液を付した該樹脂を、水２Ｌ流速５０ｍＬ／分で洗浄後、２％アセトン水（ｖ／ｖ）流速２５ｍＬ／分で展開し、溶出液を２５ｍＬ毎に分画した。（溶出画分１乃至４０）
溶出画分１７乃至２２を合わせて、凍結乾燥することで、７３３．８ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、純度を算出した（図１４、純度：９８％）。
＜実施例５．合成シリカゲルを用いたＳＧＰの精製―４＞
実施例４と同様の操作により、脱脂卵黄粉から糖ペプチドの精製を行ない、カラム溶出画分１７乃至２２を合せて凍結乾燥することで、７８４．１ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、純度を算出した（図１５、純度：９９％）。
＜実施例６．ＯＤＳ系逆相樹脂を用いたＳＧＰの精製＞
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））５００ｇに水５Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られた水抽出液にミズカソーブＡ７５１Ｃ（水澤化学工業（株））２５０ｇを添加し、１５分間よく攪拌した後、フィルタープレス（薮田機械（株））でろ過を行なった。
得られたろ液は１Ｍ－ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整し、よく攪拌した。３０分間放置した後、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．） １００ｇを添加し、フィルタープレス（薮田機械(株)）でろ過を行なった。
ＯＤＳ系逆相樹脂としてＷａｋｏｇｅｌ　１００Ｃ１８（和光純薬工業（株））１９２ｍＬ（３５Φｘ２００ｍｍ）をカラムに充填し、該樹脂をアセトニトリル、続いて水で洗浄後、２０ｍＭ－ＨＣＯＯＮＨ４で平衡化した。
上記で得られたろ液を平衡化した該樹脂に、流速５０ｍＬ／分で付した。ろ液を付した該樹脂を、水２Ｌ流速５０ｍＬ／分で洗浄後、１％アセト二トリル水（ｖ／ｖ）流速２５ｍＬ／分で展開し、溶出液を２５ｍＬ毎に分画した。（溶出画分１乃至１４）さらに２％アセト二トリル水（ｖ／ｖ）流速２５ｍＬ／分で展開し、溶出液を２５ｍＬ毎に分画した。（溶出画分１５乃至４０）
溶出画分８乃至２４を合わせて、凍結乾燥することで、５６５．６ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、純度を算出した（図１６、純度：９８％）。
＜実施例７．乾燥卵黄粉を用いたＳＧＰの精製＞
乾燥卵黄粉Ｎｏ．１（キユーピー（株））５００ｇに水５Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．） １ｋｇを添加し、吸引ろ過缶（（株）スギヤマゲン）でろ過を行なった。
得られた水抽出液にミズカソーブＡ７５１Ｃ（水澤化学工業（株））２５０ｇを添加し、１５分間よく攪拌した後、吸引ろ過缶（（株）スギヤマゲン）でろ過を行なった。
得られたろ液は１Ｍ－ＮａＯＨでｐＨ９に調整し、よく攪拌した。３０分間放置した後、セライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．） １００ｇを添加し、吸引ろ過缶（（株）スギヤマゲン）でろ過を行なった。
合成吸着樹脂としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））２０７ｍＬ（３５Φｘ２１５ｍｍ）をカラムに充填し、該樹脂をアセトン、続いて水で洗浄後、２０ｍＭ－Ｎａ２ＨＰＯ４で平衡化した。
上記で得られたろ液を平衡化した該樹脂に、流速５０ｍＬ／分で付した。ろ液を付した該樹脂を、水２Ｌ流速５０ｍＬ／分で洗浄後、２％アセトン水（ｖ／ｖ）流速２５ｍＬ／分で展開し、溶出液を２５ｍＬ毎に分画した。（溶出画分１乃至４０）
溶出画分１８乃至２１を合わせて、凍結乾燥することで、２１２．２ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行ない、純度を算出した（図１７、純度：９３％）。
＜参考例１．一般的なろ過助剤を用いたＳＧＰの精製＞
　実施例４と同様の方法において、合成シリカゲル（ミズカソーブＡ７５１Ｃ）の代わりに、一般的なろ過助剤であるセライト５４５（Ｉｍｅｒｙｓ　Ｍｉｎｅｒａｌｓ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．）２５０ｇを用いて、カラム溶出画分１４乃至２４を合わせて、凍結乾燥することで、９５５．０ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標品との比較により、ＳＧＰであることが確認された。得られたＳＧＰについて、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、純度を算出した（図１８、純度：８３％）。
　実施例３に示されたように、セライト５４５は除タンパク効果を持たないため、本参考例においては、溶液中の不要なタンパク質が十分に除去されず、結果として、合成吸着剤による分離操作後であっても、除タンパク剤を用いた他の実施例と比較して、得られたＳＧＰの純度が十分ではなかった。このことからも、高純度のＳＧＰを得るためには、卵黄成分含有溶液を、除タンパク効果を有するろ過助剤と混合・分離することで、溶解液部の不要なタンパク質を十分に除去することが重要であることが示された。

Claims (11)

  1. 以下の工程Ａを含むことを特徴とする、シアリルグリコペプチドの精製方法、
    工程Ａ：鳥類の卵黄成分を含む水性溶液と除タンパク剤を混合させ、溶解液部を得る工程。
     
  2. 除タンパク剤が、合成シリカ系除タンパク剤、タンパク質凝固作用を有する添加剤、又は、タンパク質分解作用を有する添加剤、である請求項１の方法。
     
  3. 合成シリカ系除タンパク剤が、合成シリカゲル又は合成シリカコロイドである請求項２の方法。
     
  4. 合成シリカ系除タンパク剤が、粒子径：約１～５０　μｍ、比表面積：約１００～１５００　ｍ２／ｇ、細孔容積：約０．５～３　ｍｌ／ｇ、平均細孔径：約１～５０　ｎｍを満たす合成シリカゲルである、、請求項３の方法。
     
  5. 鳥類の卵黄成分を含む水性溶液が、ニワトリの卵黄または脱脂卵黄の水溶液である、請求項１の方法。
     
  6. 鳥類の卵黄成分を含む水性溶液が、事前に不溶成分が除去された溶液である、請求項１の方法。
     
  7. 工程Ａで得られた溶解液部を、シアリルグリコペプチドを分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより、シアリルグリコペプチドを含有する画分を回収する工程を、さらに含む請求項１の方法。
     
  8. シアリルグリコペプチドを分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂または合成吸着樹脂である請求項７の方法。
     
  9. 合成吸着樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂またはフェノール系合成吸着樹脂である請求項８の方法。
     
  10. 合成吸着樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である請求項９の方法。
     
  11. 請求項１乃至１０のいずれかの方法で精製されたＳＧＰを適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ製品の製造方法。
     
     
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