WO2014154179A1 - 2β,3α,5α-三羟基-雄甾-6-酮及其制备方法与用途 - Google Patents

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张静夏
林穗珍
谢敏玉
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广州市赛普特医药科技有限公司
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    • C07J71/001—Oxiranes

Definitions

  • the present invention relates to a polyhydroxyfluorenone, specifically 2?, 3?, 5?-trihydroxy-androst-6-one, and a process for its preparation and medical use. Background technique
  • Polyhydroxy fluorenone is an important class of compounds widely found in nature. Many of the hydroxy ketones extracted from marine organisms and terrestrial plants have important physiological functions such as anti-tumor and immune enhancement, for example, ecdysterone and canola sterol. The compounds have a function of promoting plant growth.
  • the present invention provides a novel polyhydroxy fluorenone substance, namely 2 ⁇ , 3 ⁇ , 5 ⁇ -trihydroxy-androst--0-one (hereinafter sometimes referred to as "YC-1 0", “compound (1)”, “compound” ⁇ , and is used interchangeably in this article), its structural formula is as follows (I)
  • the compound of the formula (I) is not naturally occurring, but is obtained by the inventors of the present application by a synthetic method.
  • the polyhydroxyfluorenone has a relatively simple structure relative to a naturally occurring polyhydroxy fluorenone. For example, it does not have long or complex side chains, thus facilitating artificial synthesis.
  • drug delivery is facilitated by a reduction in molecular weight and simplification of the spatial stereostructure.
  • the disappearance of the side chains also reduces the possibility of interaction with other substances.
  • the 1st-position of the compound (I) does not have a side chain, which may increase the bioavailability of the compound in vivo and eliminate its hormone-like action.
  • the unique stereo configuration has the potential to increase its stereoselectivity and have better biological activity.
  • the compounds of formula (I) have been shown to still have specific pharmacological effects and have potential pharmaceutical uses.
  • tests have confirmed the use of the compound for anti-tumor use and for protecting nerve cells, especially optic ganglion cells.
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Therapeutically effective amount” means that the amount of the compound when administered to an individual for treating a disease is sufficient to effect treatment of the disease.
  • the “therapeutically effective amount” may vary depending on the compound, the disease and its severity, the age, weight, etc. of the individual being treated.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” means a diluent, adjuvant, excipient, or the like which can be administered with a compound of the present invention.
  • Another aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), and a second neuroprotective agent.
  • the second neuroprotective agent is different from the compound of the present invention and can be used in combination with the compound of the present invention for achieving neuronal cell protection.
  • the second neuroprotective agent is an optic ganglion cell protectant.
  • a further aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), and a second anti-tumor drug.
  • the second neuroprotective agent differs from the compounds of the invention and can be used in combination with the compounds of the invention for achieving anti-tumor applications.
  • tumor refers to the malignant or benign growth of cells in the skin or body organs, such as, but not limited to, the breast, the prostate, the lungs, the kidneys, the pancreas, the stomach or the intestines. Malignant tumors invade adjacent tissues and spread (metastasize) to distant organs such as bone, liver, lung or brain.
  • tumor as used herein includes metastatic tumor cell types such as, but not limited to, melanoma, lymphoma, leukemia, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, and mastocytoma, as well as tissue cancer types such as, but not limited to, colorectal cancer, prostate cancer, Small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, ? L cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, gastric cancer, glioblastoma, primary liver cancer, ovarian cancer, prostate cancer, and uterine smooth hunger sarcoma.
  • metastatic tumor cell types such as, but not limited to, melanoma, lymphoma, leukemia, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, and mastocytoma
  • tissue cancer types such as, but not limited to, colorectal cancer, prostate cancer, Small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, ? L cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, gastric cancer,
  • a further aspect of the invention provides the use of a compound of formula (I) for the preparation of a neuroprotective or antitumor drug.
  • the compound of the formula (I) of the present invention has been experimentally confirmed to have an effect of inhibiting the growth of tumor cells, and the tumor inhibition rate is dose-dependent, and it also has a significant neuroprotective effect.
  • a further aspect of the invention provides a method of treating or ameliorating a disease or condition, such as a retinal nerve injury caused by a plurality of disease factors or a neurological damage associated with the central nervous system, such as retinal ischemia, trauma, and acute and Optic nerve damage caused by chronic cyanescence, hypertension and diabetes leading to hypertensive retinopathy and diabetic retinal damage, retinitis pigmentosa and macular degeneration, or stroke, brain injury, spinal injury, Parkinson's disease (Parkinson ' Central nervous system diseases such as s disease, PD), Alzheimer's disease (AD), Huntington disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • the method comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), or a prodrug, solvate thereof, or a pharmaceutical composition provided herein, provided herein.
  • prodrug means a compound having a cleavable group and which becomes a pharmaceutically active compound of the formula (I) in vivo by hydrolysis or under physiological conditions, including a derivative of the compound of the present invention.
  • examples of such include, but are not limited to, choline ester derivatives and the like, N-alkyl morpholine esters, and the like.
  • Solvate means a form of a compound which is usually associated with a solvent by a solvolysis reaction. This physical association includes hydrogen bonding. Conventional solvents include water, ethanol, acetic acid, and the like.
  • the compounds of the invention may be prepared, for example, in crystalline form and may be solvated or hydrated.
  • Suitable solvates include pharmaceutically acceptable solvates, such as hydrates, and also include chemical solvates and non-stoichiometric solvates. In some cases, the solvate can be separated, for example, when one or more solvent molecules are incorporated into the crystal lattice of the crystalline solid.
  • solvent includes a solution phase and a separable solvate. Representative solvates include hydrates, ethanolates, and methanolates.
  • a process for the preparation of the above compound of the formula (I) of the present invention which is prepared by reacting androst-5-het-3-ol as a raw material, ie, 3 (3-p-toluene). Sulfonyloxy-5a-hydroxy-androst-6-one, which is subjected to elimination to give compound IX, ie 5a-hydroxy-androst-2-ene-0-one, which is then oxidized and hydrolyzed via a 2-position double bond. The reaction gave Compound I.
  • the compound VI can be produced in various ways, for example:
  • Compound VI is prepared by using male-5-h--3-ol as a raw material, oxidizing, alkaline hydrolysis, NBS oxidation and p-toluenesulfonyl chloride protection by H 2 ⁇ 2 /carboxylic acid system.
  • the method comprises the following steps: ( la) adding the compound androst-5-en-3-ol and formic acid in a reaction flask, adding hydrogen peroxide at a low temperature, reacting for 1 to 2 hours, heating, adding water, stirring and dispersing, and pumping Filtration, drying to give a white solid compound II, the compound male guan-5-5--3-ol: formic acid: hydrogen peroxide: 1: 1 0 ⁇ 30: 0.5 ⁇ 3 (w: v: v); ( lb) in the reaction flask Add alkaline methanol solution, add compound II in proportion, force Heat reflux for ⁇ 2h, the reaction solution is poured into water, dispersed, filtered and dried to obtain white solid compound III.
  • the alkaline methanol solution is: any one of potassium hydroxide, sodium hydroxide and sodium methoxide in methanol.
  • the alkali concentration of the reaction solution is: 2 ⁇ 1 0%; ( lc)
  • compound III and an appropriate amount of dioxane and water are added, NBS is added in portions, and after reacting for 2 to 4 hours, sodium sulfite is added and filtered.
  • Compound VI was prepared by using male-reactive 5-5--3-ol as a raw material, by oxidation of m-chloroperoxybenzoic acid, acid hydrolysis, NBS oxidation and p-toluenesulfonyl chloride.
  • the method comprises: (2 ⁇ ) adding a compound androst-5-en-3-ol to a reaction flask and
  • the acid in the acidic solution of acetone is: sulfuric acid and periodic acid
  • compound IV acetone: the acid of IN is 1: 20 ⁇ 30: 5 ⁇ 1 0 (w : v : v)
  • (2c) In the reaction flask, add compound III and appropriate amount of dioxane and water, add NBS in batches, react for 2 ⁇ 4h, add sodium sulfite, filter cake, wash and wash until Neutral, dry white solid compound V; (2d) In the reaction flask, add appropriate amount of pyridine, compound V and p-toluenesulfonyl chloride, stir at room temperature for 24 ⁇ 36h, add to iced aqueous hydrochloric acid, filter cake, wash and wash Neutral, dry white solid compound VI.
  • Compound VI is prepared by using male-5-en-3-ol as a raw material, by p-toluenesulfonyl chloride protection, oxidation of m-chloroperoxybenzoic acid, and oxidation of Jones reagent.
  • the method comprises the following steps: (3a) adding a compound, androst-5-en-3-ol, anhydrous pyridine and p-toluenesulfonyl chloride in a reaction flask, stirring at room temperature, and pouring into an aqueous solution of glacial hydrochloric acid after completion of the reaction. In the middle, stirring, suction filtration, the filter cake is washed with water to neutral, and dried to give a white solid compound VII; (3b) Compound VII and dichloromethane are added to the reaction flask, and m-chloroperoxybenzoic acid is added in portions with stirring, ice.
  • the compound IX is obtained, for example, by the following steps: adding an appropriate amount of the compound VI, DMF, ⁇ 3 and LiBr to the reaction flask, heating under reflux, and pouring the reaction solution into an aqueous solution of glacial hydrochloric acid, and stirring. After suction filtration, the filter cake was washed until neutral and dried to give a white solid compound IX.
  • compound VI: DMF is 1:3 to 15 (w: V);
  • compound VI: Li 2 C ⁇ 3 : LiBr is: 1 : 4-12 : 4 to 12 (M: M: M).
  • the compound I can be produced by the same method from the compound IX, for example: (1) Compound IX is oxidized by H 2 ⁇ 2 /carboxylic acid system, and the compound of the formula (I) is prepared by alkaline hydrolysis.
  • the method comprises the following steps: (1 ⁇ ) adding compound IX and formic acid in a reaction flask, adding hydrogen peroxide dropwise at a low temperature, reacting for 1 to 2 hours, heating, adding water to stir and disperse, and filtering to obtain a white cake, drying.
  • a white solid compound X is obtained, wherein compound IX: formic acid: hydrogen peroxide is: 1: 10 ⁇ 30: 0.5 ⁇ 3 (w: V: V);
  • (1 b) an alkaline methanol solution is added to the reaction flask, and the compound is added in proportion.
  • the reaction solution is poured into water to disperse, suction filtration, drying to obtain a white solid of the compound of formula (I), wherein the alkaline methanol solution is: potassium hydroxide, sodium hydroxide and sodium methoxide in methanol solution Any one of the above; the alkali concentration of the reaction liquid is: 2 to 10%.
  • the alkaline methanol solution is: potassium hydroxide, sodium hydroxide and sodium methoxide in methanol solution Any one of the above; the alkali concentration of the reaction liquid is: 2 to 10%.
  • the method comprises the following steps: (2 ⁇ ) adding compound IX and CH 2 CI 2 in a reaction flask, adding m-chloroperoxybenzoic acid in portions under stirring, stirring for 2 to 5 hours in an ice bath, and then ending the reaction. Washing with Na 2 C ⁇ 3 solution, Na 2 S solution and water, drying and concentrating to obtain compound XI; (2b) adding an acidic solution of compound XI and acetone in a reaction flask, stirring the reaction at room temperature for several hours, and ending the reaction After use
  • Figure 2 shows that Compound I has a protective effect on glutamate-mediated cerebellar granule neuronal damage.
  • Figure 3 shows that Compound I protects the survival of cerebellar granule neurons in a concentration-dependent manner.
  • Figure 4 shows the protective effect of Compound I on hypokalemia-induced cerebellar granule neuronal death.
  • Figure 5 shows a significant reduction in RGC in the optic nerve clipping injury model, while Compound I significantly prevented RGC reduction.
  • Figure 6 shows the RGC statistics for each group of samples in the optic nerve clipping injury model.
  • Figure ⁇ shows a significant reduction in RGC in the hyperbaric ischemia model, while Compound I reduces RGC loss from hypertensive ischemia.
  • Figure 8 shows the RGC statistics for each group of samples in the high-pressure ischemia model.
  • Li 2 C ⁇ 3 and 60.5 g of LiBr were heated under reflux, and it was confirmed by TLC that there was no compound VI, and the reaction was stopped. It was added to 2 L of a 1:1 (V:V) aqueous solution of glacial hydrochloric acid, stirred, suction filtered, and the filter cake was neutralized with water and dried to give 32 g of white solid compound IX.
  • Steps (3) ⁇ (7) are the same as in Example 1 (3b (7).
  • Steps m ⁇ (5) are the same as m ⁇ (5) in Example i.
  • Steps (4) ⁇ (6) are the same as in Example 1 (5b (7).
  • Steps m ⁇ (4) are the same as m ⁇ (4) in the example i.
  • Steps m ⁇ (4) are the same as m ⁇ (4) in the example i.
  • Steps (1) to (4) are the same as in Embodiment 1 (1 (4).
  • Steps (1) to (5) are the same as in Embodiment 7 (1 (5).
  • Step (7) is the same as Embodiment 7 (7).
  • Steps (1) to (5) are the same as in Embodiment 7 (1 (5).
  • Cell survival rate drug treatment group ⁇ D value / control ⁇ D value X I 00%. All data were expressed as mean ⁇ standard deviation, using the SPSS 1 3. 0 statistical software package, using one-Way ANOVA analysis of variance and ⁇ - ⁇ es ⁇ test, using Sigmaplo ⁇ software to obtain Figure 1. As can be seen from Figure 1, the survival rate of the drug-administered group was statistically significant compared with the control group after treatment with 250, 500, and 1 000 ⁇ of ⁇ C-1 0 for 24 h (P ⁇ 0.05). YC-l 0 is a dose-dependent killing tumor cell. Neuroprotective effect of compound I
  • mice with high doses of YC-10 250 mg/kg had no abnormalities within 14 days after taking the drug; results of glutamate model and low potassium model of primary cerebellar granule neurons cultured in vitro It is shown that YC-1 0 has a significant protective effect on the survival of cerebellar granule neurons; animal model studies of optic nerve damage and retinal ischemia show that in the case of optic axonal injury and retinal ischemia, ⁇ C-1 0 It has a clear protective effect on the survival of optic ganglion cells. The above results indicate that YC-1 0 has no obvious side effects and has neuroprotective effects.
  • mice were continuously observed, all mice were active, eating as usual, the hair color was bright, the fur was not loose, the mouth, the nose, the nose and the ear were free of abnormal secretions, and the urine was normal: the body weight increased, and none of the mice died.
  • the animals were sacrificed, and the important organs such as heart, liver, spleen, lung, kidney, and gastrointestinal tract were examined by anatomy and meat restriction. No abnormal changes were observed. The results showed that 250 mg/kg of YC-1 0 was not toxic to mice.
  • Rat cerebellar granule neurons were cultured on day 8 in vitro, and the drug-administered group was pre-incubated with MK801 or different concentrations of ⁇ C-1 0 for 30 min, and then the model group and all drug-administered groups were replaced with Locke buffer without Mg 2+ .
  • the solution was administered with a final concentration of ⁇ ⁇ ⁇ glutamic acid, ⁇ ⁇ ⁇ glycine and the corresponding concentration of the drug, and placed in a 37 ° C incubator for 30 min, then returned to the normal medium, and continued to culture for 24 h before FDA staining.
  • Rat cerebellar granule neurons were cultured on day 8 in vitro, and the drug-administered group was pre-administered with different concentrations of YC-10 for 30 min, and then the model group and the drug-administered group were replaced with 5K (ie, 5 mM KCI) BME medium (control group was 25K), the corresponding concentration of YC-1 0 was given at the same time, and the culture was continued in a 37 ° C incubator, and FDA staining was performed 24 hours later.
  • 5K ie, 5 mM KCI
  • microscopically observed low potassium media can induce cerebellar granule neuron death, while higher concentrations (50 ⁇ ) of YC-1 0 prevent hypokalemia-induced neuronal death.
  • the results show that YC-1 0 has a protective effect on hypokalemia-induced cerebellar granule neuronal death.
  • 2.3 YC-1 0 protects against optic ganglion cell death caused by optic nerve clipping injury
  • Rats were anesthetized with 10% chloral hydrate. YC-1 0 (20 mg/kg) or solvent was given to the tail vein 20 min before surgery. Then local anesthesia was limited. The conjunctiva was cut along the limbus with corneal scissors and microscopic sputum. The external rectus muscle was separated, the optic nerve was fully exposed, and the optic nerve was clamped for about 2 mm after the restraining of the ball in the opposite direction for 5 seconds, and then the antibiotic was applied to prevent infection. The drug was administered again 2 hours, 2 days, and 3 days after surgery, and the ball was taken for pathological examination 7 days later.
  • Rats were anesthetized with 10% chloral hydrate, local anesthesia was limited, and the perfusion device was placed so that the perfusion surface was 1 76 cm away from the limit level of the rat (approximately 1 30 mmHg internal pressure could be increased), and the nozzle was connected 30G 1 /2
  • the needle carefully inserted into the anterior chamber, at this point, the limiting ball was clearly whitened and the ischemic onset time was recorded. After 1 hour, the needle was quickly pulled out, and the antibiotics were used to limit the medicine and then put back into the cage.
  • the solvent group and the ⁇ C-1 0 group (20 mg/kg) were administered intravenously 20 minutes before the modeling, and the tail vein was administered again 2 hours, the next day and the third day after the modeling. After 7 days of modeling, the ball was taken for pathological examination.

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Abstract

本发明公开了化合物2β，3α，5α-三羟基-雄甾-6-酮，具有式(I)的结构。本发明还公开了该化合物的多种制备方法以及该化合物的用途。

Description

2β,3α,5α-三羟基 -雄甾 -ό-酮及其制备方法与用途 相关申请交叉引用
本申请要求 201 3年 3月 28日提交的中国发明专利申请 201 31 01 041 62.5 号的优先权利益， 其全部公开内容通过引用合并至本文中。 技术领域
本发明涉及一种多羟基甾酮， 具体为 2β,3α,5α-三羟基 -雄甾 -6-酮， 以及其 制备方法和医学应用。 背景技术
多羟基甾酮是自然界广泛存在的一类重要化合物，许多从海洋生物和陆生植 物里提取的多羟基甾酮具有抗肿瘤、提高免疫力等重要生理功能， 例如， 蜕皮甾 酮类和油菜甾醇类化合物具有促进植物生长的功能。
但是，天然的多羟基甾酮在植物体内的含量极低 ,提纯步骤繁琐且耗时较长， 此外，由于结构方面的原因 (例如具有较长和较复杂的侧链)，大多不能人工合成， 这限制了该类物质的使用。如果能够对天然产物的结构进行优化，使之既能够基 本上维持天然的药学功能， 又具有相对天然产物较为简单的结构而便于人工合 成， 那么对于扩大该类物质的应用范围将具有非常重要的意义。 发明内容
本发明提供一种新的多羟基甾酮类物质， 即 2β,3α,5α-三羟基 -雄甾 -0-酮 (下 文有时称 "YC-1 0" 、 "化合物 (1) " 、 "化合物 Γ , 并在本文可互换使用）， 其 结构式为下式 (I) ,
Figure imgf000002_0001
式 (1)。
化学式 (I)的化合物不是天然存在的，而是本申请发明人通过人工合成方法获 得的。该多羟基甾酮相对天然存在的多羟基甾酮类物质具有较为简单的结构，例 如， 不具有长的或复杂的侧链， 因此便于人工合成。此外， 因分子量减小和空间 立体结构简单化，便于药物递送。侧链的消失同时还降低了与其他物质发生相互 作用的可能性。 另外， 化合物 (I)的 1 7-位不具有侧链， 可能增加化合物在体内的 生物利用度， 消除其激素样作用。此外， 独特的立体构型有可能提高其立体选择 性， 具有更好的生物活性。
同时， 式 (I)的化合物被证明仍然具有特定的药理学作用， 具有潜在的药物用 途。 在本发明中， 试验证实该化合物具有抗肿瘤用途， 以及保护神经细胞 (尤其 是视神经节细胞)的用途。
因此， 本发明另一个方面提供一种药物组合物， 其包含治疗有效量的式 (I) 的化合物， 以及药学上可接受的载体。 "治疗有效量" 是指当施用于个体用于治 疗疾病时化合物的量足以对疾病的治疗有效。 "治疗有效量" 可根据化合物、疾 病及其严重程度、 所治疗个体的年龄、 体重等变化。 "药学上可接受的载体" 是 指可与本发明化合物一起施用的稀释剂、 佐剂、 赋形剂等。
本发明另一个方面提供一种药物组合物， 其包含治疗有效量的式 (I)的化合 物， 以及第二种神经细胞保护剂。所述第二种神经细胞保护剂不同于本发明的化 合物，可与本发明的化合物联用，用于实现神经细胞保护。在优选的实施方式中， 所述第二种神经细胞保护剂为视神经节细胞保护剂。
本发明的又一个方面提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的式 (I)的化合 物，以及第二种抗肿瘤药物。所述第二种神经细胞保护剂不同于本发明的化合物， 可与本发明的化合物联用， 用于实现抗肿瘤应用。本文所 S的术语 "肿瘤" 表示 皮肤或机体器官中细胞的恶性或良性生长， 所述的器官为例如但不限子乳房、 前 列腺、 肺、 肾、 胰、 胃或肠。 恶性肿瘤易子侵入相邻的组织并旦扩散 （转移)到 较远的器官， 例如骨、 肝、 肺或脑。 本文所用的术语肿瘤包括转移肿瘤细胞型， 例如但不限于黑素瘤、 淋巴瘤、 白血病、 纤维肉瘤、 横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤， 以及组织癌类型， 例如但不限于结肠直肠癌、 前列腺癌、 小细胞肺癌和非小细胞 肺癌、 ？ L癌、 胰腺癌、 膀朥癌、 肾癌、 胃癌、 胶质母细胞瘤、 原发性肝癌、 卵巢 癌、 前列腺癌和子宫平滑飢肉瘤。
本发明的再一个方面提供式 (I)的化合物在制备神经细胞保护药物或抗肿瘤 药物中的应用。 本发明的式 (I)的化合物经试验证实具有抑制肿瘤细胞生长的作 用， 且抑瘤率成剂量依赖性， 同时其也具有明显的神经细胞保护作用。 本发明的再一个方面提供治疗或缓解疾病或病症的方法，该疾病或病症例如 是多种疾病因素导致的视网膜神经损伤或中枢神经系统神经元损伤相关疾病，例 如视网膜缺血、外伤以及急性和慢性青光限导致的视神经损伤、高血压和糖尿病 导致高血压性视网膜病变和糖尿病视网膜损伤、视网膜色素变性以及黄斑病变等 限科疾病，或者中风、脑损伤、脊柱损伤、帕金森病（Parkinson ' s disease, PD)、 阿尔茨海默病 (Alzheimer' s disease, AD)、 亨廷顿病 (Huntington disease , HD)、肌萎缩侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis , ALS) 等中枢神经系 统疾病。该方法包括将治疗有效量的本发明提供的式 (I)的化合物或其前药、溶剂 化物、 或将本发明提供的药物组合物施用至个体。
在本发明中， "前药" 表示具有可裂解的基团并且通过水解或在生理条件下 变成在体内有药物活性的本发明式 (I)化合物的化合物， 包括本发明化合物的衍生 物。 此类实例包括但不限于胆碱酯衍生物等、 N-烷基吗啉酯等。 "溶剂化物" 表 示通常通过溶剂解反应与溶剂缔合的化合物形式。 这种物理的缔合包括氢键。 常规的溶剂包括水、 乙醇、 乙酸等。 本发明化合物可以制备成例如结晶形式并且 可以溶剂化或水化。 适合的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物， 例如水合 物， 并旦还包括化学针量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。 在某些情况中， 溶剂化物能够分离， 例如当一个或多个溶剂分子揍入结晶固悴的晶格中时。 "溶 剂化物" 包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括水合物、 乙醇 化物和甲醇化物。
本发明的再一个方面提供制备上述本发明的式 (I)化合物的方法，所述方法以 雄甾 -5 希 -3-醇为原料， 经反应制得化合物 VI , 即 3(3-对甲苯磺酰氧基 -5a-羟基- 雄甾 -6-酮， 经消去反应得到化合物 IX , 即 5a-羟基 -雄甾 -2-烯 -0-酮， 再经 2-位双 键经氧化、 水解反应得到化合物 I。
在上述方法中， 其中化合物 VI可通过多种方式制得， 例如：
( 1 )以雄甾 -5 希 -3-醇为原料， 经 H2〇2/甲酸体系氧化、 碱解、 NBS氧化及 对甲苯磺酰氯保护制备化合物 VI。
具体而言， 该方式包括 ( l a) 在反应瓶中按比例加入化合物雄甾 -5-烯 -3- 醇和甲酸， 低温下滴加双氧水， 反应 l ~2h , 加热， 加入水充分搅拌分散， 抽滤、 干燥得白色固体化合物 II , 其化合物雄甾 -5 希 -3-醇:甲酸:双氧水为： 1 : 1 0~30： 0.5~3 (w : v : v) ; ( l b) 在反应瓶中加入碱性甲醇液， 按比例加入化合物 II , 力口 热回流 l ~2h , 反应液倒入水中分散， 抽滤、 干燥得白色固体化合物 III , 其中碱 性甲醇溶液为： 氢氧化钾、氢氧化钠及甲醇钠的甲醇溶液中的任何一种， 所述反 应液的碱浓度为： 2〜1 0%； ( l c) 在反应瓶中， 加入化合物 III及适量的二氧六 环和水， 分批加入 NBS , 反应 2~4h后， 加入亚硫酸钠， 滤饼抽滤、水洗至中性、 干燥得白色固体化合物 V； ( I d) 在反应瓶中， 加入适量吡啶、 化合物 V及对甲 苯磺酰氯， 室温搅拌 24~36h , 加入到冰盐酸水溶液中， 滤饼抽滤、洗涤至中性、 干燥得白色固体化合物 VI。
(2)以雄留 -5-希 -3-醇为原料， 经间氯过氧苯甲酸氧化、 酸解反应、 NBS氧化 及对甲苯磺酰氯保护制备化合物 VI。
具体而言， 该方法包括： （2α) 在反应瓶中加入化合物雄甾 -5-烯 -3-醇及
CH2CI2 , 搅拌下分批加入适量间氯过氧苯甲酸， 冰浴下搅拌 2~5h , 反应结束后 依次用 Na2C〇3溶液、 Na2S〇 液及水洗涤， 干燥， 浓缩得化合物 IV； (2b) 将反应瓶中按比例加入化合物 IV及酸性丙酮水溶液， 室温下搅拌反应数小时， 反应结束后用 Na2C03溶液将反应液调节至中性， 除去丙酮， 浓缩液用乙酸乙 酯萃取， 有机相干燥， 浓缩得化合物 III , 其中丙酮的酸性溶液中的酸为： 硫酸和 高碘酸， 化合物 IV： 丙酮 ： I N的酸为 1 : 20~30 : 5~ 1 0(w : v : v) ; (2c)在反应 瓶中， 加入化合物 III及适量的二氧六环和水， 分批加入 NBS , 反应 2~4h后， 加 入亚硫酸钠， 滤饼抽滤、 水洗至中性、 干燥得白色固体化合物 V； (2d) 在反应 瓶中， 加入适量吡啶、 化合物 V及对甲苯磺酰氯， 室温搅拌 24~36h , 加入到冰 盐酸水溶液中， 滤饼抽滤、 洗涤至中性、 干燥得白色固体化合物 VI。
(3)以雄甾 -5-烯 -3-醇为原料， 经对甲苯磺酰氯保护、 间氯过氧苯甲酸氧化及 琼斯试剂氧化制备化合物 VI。
具体而言， 该方法包括： （3a)在反应瓶中， 加入化合物雄甾 -5-烯 -3-醇、 无 水吡啶及对甲苯磺酰氯， 室温搅拌， 反应结束后倒入至冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水洗至中性， 干燥得白色固体化合物 VII； (3b)在反应瓶中加入化 合物 VII和二氯甲烷， 搅拌下分批加入间氯过氧苯甲酸， 冰浴下搅拌， 反应结束 后， 反应液依次用饱和亚硫酸钠溶液、 碳酸钠溶液及蒸馏水洗涤， 有机层干燥， 浓缩， 硅胶柱层析提纯得白色固体化合物 VIII； (3c)在反应瓶中加入化合物 VIII 和丙酮， 搅拌下加入琼斯试剂， 室温反应数小时， 反应结束后， 用异丙醇停止反 应， 反应液调至中性， 减压浓缩除去丙酮， 浓缩液用乙酸乙酯萃取， 经洗涤， 干 燥， 浓缩得淡绿色固体， 硅胶柱层析提纯得白色固体化合物 VI。
在本发明的方法中， 化合物 IX例如是通过以下步骤反应得到的： 在反应瓶 中加入适量化合物 VI、 DMF、 ^〇〇3及 LiBr, 加热回流， 反应液倒入冰盐酸水 溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼洗涤至中性， 干燥得白色固体化合物 IX。 优选地， 化 合物 VI： DMF为 1 :3~15(w: V);化合物 VI： Li2C〇3: LiBr为： 1 :4-12 :4~12(M： M： M)。
在本发明的方法中， 化合物 I可通过化合物 IX通过同种方式制得， 例如： (1)化合物 IX经 H2〇2/甲酸体系氧化、 碱解制备式 (I)的化合物。
具体而言， 该方法包括： （1α)在反应瓶中按比例加入化合物 IX和甲酸， 低 温下滴加双氧水， 反应 l~2h, 加热， 加入水充分搅拌分散， 抽滤得到白色滤饼， 干燥得白色固体化合物 X, 其中化合物 IX：甲酸:双氧水为： 1 : 10~30:0.5~3 (w: V： V)； (1 b)在反应瓶中加入碱性甲醇溶液，按比例加入化合物 X,加热回流 1 ~2h, 反应液倒入水中分散， 抽滤， 干燥得白色固体的式 (I)化合物， 其中碱性甲醇溶液 为： 氢氧化钾、氢氧化钠及甲醇钠的甲醇溶液中的任何一种； 所述反应液的碱浓 度为： 2〜10%。
(2)化合物 IX经间氯过氧苯甲酸氧化、 酸解反应制备式 (I)的化合物。
具体而言， 该方法包括： （2α)在反应瓶中按比例加入化合物 IX及 CH2CI2, 搅拌下分批加入间氯过氧苯甲酸,冰浴下搅拌 2~5h,反应结束后依次用 Na2C〇3 溶液、 Na2S 液及水洗涤， 干燥， 浓缩得化合物 XI； (2b)在反应瓶中按比例 加入化合物 XI及丙酮的酸性溶液， 室温下搅拌反应数小时， 反应结束后用
Na2C〇3溶液将反应液调节至中性， 除去丙酮， 浓缩液用乙酸乙酯萃取， 有机相 干燥， 浓缩得式 (I)化合物， 其中丙酮的酸性溶液中的酸为： 硫酸和高碘酸， 化合 物 XI： 丙酮 ： 1 N的酸为 1 ： 20~30： 5~10(w： V： V)。 附图说明
图 1显示本发明的化合物 I对 LN18和 DBTRG-50MG细胞的生长抑制作用 (π=3 *, ρ<0.05)。
图 2显示化合物 I对谷氨酸介导的小脑颗粒神经元损伤具有保护作用。
图 3显示化合物 I呈浓度依赖性地保护小脑颗粒神经元的存活。
图 4显示化合物 I对低钾诱导的小脑颗粒神经元死亡的保护作用。 图 5显示视神经夹闭损伤模型中 RGC 明显减少， 而化合物 I能明显阻止 RGC减少。
图 6为视神经夹闭损伤模型中各组样本的 RGC数量统计数据。
图 Ί显示高压缺血模型中 RGC明显减少， 而化合物 I能减少高压缺血造成 的 RGC丟失。
图 8为高压缺血模型中各组样本的 RGC数量统计数据。 具体实施方式
以下实施例仅用于解释本发明， 但本发明的保护范围并不仅限以下实施例。 在以下实施例中： 化合物 I： 2β,3α5α-三羟基 -雄甾 -6-酮； 化合物 II： 3(3,6(3-- 甲酰氧基 -5α-雄甾 -5-醇； 化合物 III : 雄留 _3β,5αόβ-三醇； 化合物 IV： 3(3-羟基- 雄甾 -5β,όβ-环氧; 化合物 V： 3β,5α-二羟基 -雄甾 -6-酮； 化合物 VI： 3(3-对甲苯 磺酰氧基 -5α-羟基 -雄留 -6-酮； 化合物 VII： 3(3-对甲苯磺酰氧基 -雄留 -5-希； 化合 物 VIII： 3(3-对甲苯磺酰氧基 -雄甾 -5β,όβ-环氧；化合物 IX： 5α-羟基 -雄甾 -2-烯 -0- 酮；化合物 X： 2β,3α-二甲酰氧基 -5α-羟基 -雄甾 -6-酮；化合物 XI： 2(3,3(3-环氧 -5α- 羟基 -雄甾 -ό-酮。
化合物 I的制备实施例 1
( 1 )在 2L的反应瓶中按比例加入 54.5g化合物雄甾 -5 希 -3-醇和 1 L甲酸 (巿售 88%) , 降温至 25°C以下， 缓慢滴加 82.5mL双氧水 (巿售 30%) , 经 TLC确认无 原料， 加热至 75°C破坏多余的双氧水。 加入 1 L水充分搅拌分散。 抽滤得到白色 滤饼， 滤饼用饱和 NaHC03溶液浸泡， 抽滤， 滤饼水洗至中性， 干燥得 62.4g 白色固体化合物 II。
(2)在 2L的反应瓶中加入 45g氢氧化钾、 1 500甲醇、 300mL TR¾ 60g化 合物 II ,加热回流，经 TLC确认无化合物 II ,反应液降至室温，倒入 3L水中分散。 加入浓盐酸调 pH=7 , 静置分层， 抽滤， 滤饼水洗涤至中性， 干燥得 49.6g白色 固体化合物 III。
(3)在 1 L的反应瓶中， 加入 49g化合物 III , 600mL二氧六环和 200mL水， 待固体全部溶解， 分批四批共加入 42.5g N-溴代丁二酰亚胺， 经 TLC确认无化 合物 III , 停止反应。 加 l l g亚硫酸钠还原多余的氧化剂， 反应液分散到 4L水中 分散， 抽滤， 滤饼水洗中性， 干燥得 47.8g白色固体化合物 V 。 (4)在 500mL的反应瓶中， 加入 135mL吡啶、 44.3g化合物 V及 45g对甲 苯磺酰氯，室温搅拌，经 TLC确认无化合物 V,停止反应。加入到 300mL 1:1(V: V) 冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水洗至 pH=7, 抽滤， 滤饼洗涤至中 性， 干燥得 61.7g白色固体化合物 VI。
(5)在 1 L的反应瓶中，加入 325mL Ν,Ν-二甲基甲酰胺、54g化合物 Vl、52.1 g
Li2C〇3及 60.5g LiBr, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 VI , 停止反应。 加入到 2L的 1:1(V ： V)的冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水中性， 干燥得 32g 白色固体化合物 IX。
(6)在 500mL的反应瓶中按比例加入 30g化合物 IX和 600mL 甲酸 (巿售 88%) ,升温固体样品溶解，降温至 25°C以下，缓慢滴加 24mL双氧水 (巿售 30%) , 经 TLC确认无化合物 IX, 加热至 75°C维持 10分钟， 破坏多余的双氧水。 倒入 3L水充分搅拌分散。 抽滤得到白色滤饼， 用饱和 NaHC03溶液浸泡至无气泡， 抽滤， 滤饼水洗至中性， 干燥得 26g白色固体化合物 X。
(7)在 500mL的反应瓶中加入 27g氢氧化钾， 600甲醇， 72mL水及 23.4g 化合物 X, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 X, 反应液降至室温， 倒入 3L水中 分散。 加入盐酸调 pH=7, 静置分层， 抽滤， 滤饼洗涤至中性， 丙酮重结晶， 干 燥得 16g白色固体化合物 I。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2), 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 2
(1) 在 2L的反应瓶中按比例加入 70g化合物雄甾 -5-:希 -3-醇,加入 1200mL CH2CI2中， 搅拌下分批加入 105g间氯过氧苯甲酸 ( TTCPBA), 冰浴下搅拌 5h。 反应结束后， 反应液依次用饱和亚硫酸钠溶液、碳酸钠溶液及蒸馏水洗涤， 有机 层干燥， 浓缩得 62g黄色固体化合物 IV。 (2)将 60g化合物 IV溶于 3L丙酮中， 加入 400mL 1 N H2S〇4溶液， 室温下 搅拌反应 3h。 反应结束后用 Na2C03溶液将反应液调节至中性， 减压浓缩除去 丙酮， 浓缩液用乙酸乙酯萃取， 有机相用无水硫酸钠干燥， 浓缩得 48g 黄色固 体,丙酮重结晶得 30.5g化合物 III。
步骤 (3) ~ (7)与实施例 1 中 (3卜 (7)相同。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2), 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 3
步骤 m ~(5)与实施例 i 中 m~(5)相同。
(ό)在 500mL的反应瓶中将 23g化合物 IX溶于 600mL CH2CI2中， 搅拌下 分批加入 34.6g间氯过氧苯甲酸 ( CPBA), 冰浴下搅拌 5h。 反应结束后， 反应 液依次用饱和亚硫酸钠溶液、 碳酸钠溶液及蒸馏水洗涤， 有机层干燥， 浓缩得 20.7g黄色固体化合物 XI。
(7)在 2L的反应瓶中将 17.4g化合物 XI ,溶于 900mL丙酮中，加入 180mL 1 N H2S〇4溶液， 室温下搅拌反应 3h。 反应结束后用 Na2C〇3溶液将反应液调节至 中性， 减压浓缩除去丙酮， 浓缩液用乙酸乙酯萃取， 有机相用无水硫酸钠干燥， 浓缩得 14.4g黄色固体。 丙酮重结晶， 干燥得白色固体化合物 I。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2), 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 4
(1)在 250mL反应瓶中加入 14.64g雄甾 -5-希 -3-醇及 125mL无水吡 D定，搅拌 下分批加入 26.05g对甲苯磺酰氯， 室温反应 24h。 TLC检测无原料后， 停止反 应， 剧烈搅拌下将反应物缓慢倒入 2000mL17%HCI的冰水溶液中， 抽滤， 水洗 至中性， 真空干燥， 得 22.48g白色固体化合物 VII。
(2)在 250mL反应瓶中加入 15.00g化合物化合物 VII 和 200mL CH2CI2, 搅 拌下分批加入 15.12g间氯过氧苯甲酸 ( TTCPBA), 冰浴下搅拌 5h。 TLC检测反 应完全后， 停止搅拌， 反应液依次用饱和亚硫酸钠溶液、碳酸钠溶液及蒸馏水洗 涤。 取有机相， 无水硫酸钠干燥， 蒸除有机溶剂， 真空干燥， 得 14.07g粗品， 硅胶柱层析提纯得 12.3g白色固体化合物 VIII。
(3)在 lOOOmL反应瓶中加入 14.07g化合物 VIII 和 750mL丙酮， 搅拌下加 入 30mLJones试剂， 室温反应 2h。 经 TLC检测反应完全后， 用异丙醇停止反 应， 反应液用 Na2CO 液调至中性， 减压浓缩除去丙酮， 浓缩液用乙酸乙酯 萃取， 有机相用蒸馏水洗涤数次后， 无水硫酸钠干燥， 浓缩得淡绿色固体。硅胶 柱层析提纯得 12.89g白色固体化合物 VI。
步骤 (4) ~ (6)与实施例 1 中 (5卜 (7)相同。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2), 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 5
步骤 m ~(4)与实施例 i 中 m~(4)相同。
(5)在 1L的反应瓶中， 加入 325mL无水 Ν,Ν-二甲基甲酰胺、 54g化合物 VI、 干燥的 69.5g Li2C〇3及 80.6g LiBr, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 VI , 停止反应。加入到 2L的 1:1(V:V)的冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水中 性， 干燥得 32.5g白色固体化合物 IX。 步骤 (ό) ~ (7)与实施例 1 (ό)~(7)相同。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2) , 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 6
步骤 m ~ (4)与实施例 i 中 m~(4)相同。
(5)在 1L的反应瓶中， 加入 325mL无水 Ν,Ν-二甲基甲酰胺、 54g化合物 VI、 干燥的 34.7g Li2C〇3及 40.3g LiBr, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 VI , 停止反应。加入到 2L的 1:1(V :V)的冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水中 性， 干燥得 30.2g白色固体化合物 IX。
步骤 (ό) ~ (7)与实施例 3(0卜 (7)相同。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2) , 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 7
步骤 (1) ~ (4)与实施例 1(1卜 (4)相同。
(5)在 1L的反应瓶中， 加入 432mL无水 Ν,Ν-二甲基甲酰胺、 54g化合物 VI、 干燥的 52.1g Li2C〇3及 60.5g LiBr, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 VI , 停止反应。加入到 2L的 1:1(V :V)的冰盐酸水溶液中， 搅拌， 抽滤， 滤饼用水中 性， 干燥得 30.5g白色固体化合物 IX。 (ό)在 500mL 的反应瓶中按比例加入 30g 化合物 IX 和 600mL 甲酸 (巿售 88%) ,升温固体样品溶解，降温至 25°C以下，缓慢滴加 20mL双氧水 (巿售 30%) , 经 TLC确认无化合物 IX, 加热至 75°C维持 10分钟， 破坏多余的双氧水。 倒入 3L水充分搅拌分散。 抽滤得到白色滤饼， 用饱和 NaHC03溶液浸泡至无气泡， 抽滤， 滤饼水洗至中性， 干燥得 28g白色固体化合物 X。
(7)在 500mL的反应瓶中加入 18g氢氧化钾， 600甲醇， 72mL水及 25g化 合物 X, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 X, 反应液降至室温， 倒入 3L水中分 散。 加入盐酸调 pH=7, 静置分层， 抽滤， 滤饼洗涤至中性， 丙酮重结晶， 干燥 得 8.8g白色固体化合物 I。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50。(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2) , 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例 8
步骤 (1) ~ (5)与实施例 7(1卜 (5)相同。
(ό)在 500mL的反应瓶中按比例加入 30g化合物 IX和 600mL 甲酸 (巿售
88%) ,升温固体样品溶解，降温至 25°C以下，缓慢滴加 36mL双氧水 (巿售 30%) , 经 TLC确认无化合物 IX, 加热至 75°C维持 10分钟， 破坏多余的双氧水。 倒入 3L水充分搅拌分散。 抽滤得到白色滤饼， 用饱和 NaHC03溶液浸泡至无气泡， 抽滤， 滤饼水洗至中性， 干燥得 24g白色固体化合物 X。
步骤 (7) 与实施例 7(7)相同。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2) , 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的制备实施例
步骤 (1) ~ (5)与实施例 7(1卜 (5)相同。
(ό)在 500mL的反应瓶中按比例加入 30g化合物 IX和 600mL 甲酸 (巿售 88%) ,升温固体样品溶解，降温至 25°C以下，缓慢滴加 45mL双氧水 (巿售 30%) , 经 TLC确认无化合物 IX, 加热至 75°C维持 10分钟， 破坏多余的双氧水。 倒入 3L水充分搅拌分散。 抽滤得到白色滤饼， 用饱和 NaHC03溶液浸泡至无气泡， 抽滤， 滤饼水洗至中性， 干燥得 23g白色固体化合物 X。
(7)在 500mL的反应瓶中加入 27g氢氧化钾， 300甲醇， 36mL水及 12.5g 化合物 X, 加热回流， 经 TLC确认无化合物 X, 反应液降至室温， 倒入 3L水中 分散。 加入盐酸调 pH=7, 静置分层， 抽滤， 滤饼洗涤至中性， 丙酮重结晶， 干 燥得 8.0白色固体化合物 I。
m.p: 197〜201°C; 比旋光度： -50°(2mg/mL, 无水乙醇）； Ή NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 0.65(s, 3H, 18-CH3) , 0.87(s, 3H, 19-CH3) , 3.76〜3.83(d , 28Hz, 2H, 2-CH和 3-CH):13C NMR(CDCI3, 400ΜΗζ)δ: 15.52 (CH3) , 17.27(CH3), 19.94(CH2), 20.53(CH2), 24.68(CH2), 26.90(CH2) , 33.02(CH2) , 36.45(CH), 39.72(CH2), 40.92(C) , 41.26(CH2) , 42.54(C) , 44.99(CH) , 54.04(CH) , 68.94(CH), 70.19(CH), 79.71(C), 210.65(C); IR(KBr, cm—1) v.3296, 2937, 1726, 1064; MS(APCI)m/z: 319(M-3)。 化合物 I的抑瘤效果
(1) 接种细胞、 给药处理： 选择对数生长期 LN18细胞和 DBTRG-50MG细 胞,用完全培养液调制成细胞悬液，以每孔 100 μΙ、3χ104/ΓΤΊΐ的密度接种在 96 孔 培养板内。 12 h 后见细胞完全贴壁， 加入丫 C-10, 使 YC-10终浓度分别为 250、 500、 ΙΟΟΟμΜ, 每组浓度均设 5个复孔。
(2) ΜΤΤ与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应： 培养至 24h时， 每孔加入 ΜΤΤ ΙΟμ l(5mg/ml),继续孵育 4 h,此时镜检可观察到活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜 结晶。 (3) 溶解甲臜颗粒： 小心吸去上清， 力 nDMSOl OO μΙ/孔溶解形成的结晶， 在微型振荡器上震荡 5 min ,然后在酶联检测仪上用波长 570 nm检测各孔的光密 度 (〇D值)。
每组实验重复 3 次。细胞生存率 =药物处理组〇D值 /对照组〇D值 X I 00%。 所有数据用均数士标准差表示， 运用 SPSS 1 3. 0 统计软件包， 采用 one-Way ANOVA 方差分析以及 †-†es† 检验， 使用 Sigmaplo†软件得到图 1。 由图 1可知， 分别用 250、 500、 1 000μΜ的丫 C-1 0处理 24h后， 给药组生存率与 对照组生存率比较都是有统计学意义的 (P<0. 05)。 YC-l 0成剂量依赖性的杀伤肿 瘤细胞。 化合物 I的神经保护作用
为了探讨 YC-1 0是否具有神经保护的作用以及开发为临床药物的潜力， 针 对丫 C-1 0的毒性和药效开展各项体外体内研究。 研究结果显示， 摄取大剂量的 YC-10(250mg/kg)的小鼠，在摄药后的 14天内无明显异常；体外培养的原代小 脑颗粒神经元谷氨酸模型和低钾模型的研究结果显示， YC-1 0具有明显的保护小 脑颗粒神经元存活的作用； 视神经损伤和视网膜缺血的动物模型研究结果显示， 在视神经轴突损伤和视网膜缺血的情况下，丫 C-1 0都具有明显的保护视神经节细 胞存活的作用。以上研究结果说明， YC-1 0无明显的毒副作用， 且具有神经保护 作用。
1 毒理研究结果
最大耐受量试验：
用 40%羟丙环糊精配制浓度为 25mg/ml的 YC-1 0注射液， 对 30只 (雌雄 各半)体重为 1 8-22g的昆明小鼠进行尾静脉注射 (0.1 ml/1 0g)。
持续对小鼠进行观察， 所有小鼠活动、 进食如常， 毛色光亮， 皮毛无疏松， 口、 限、鼻、耳无异常分泌物， 大小便正常： 体重有所增长， 全部小鼠无一死亡。 观察 14天后处死动物， 解剖并肉限检查心、 肝、 脾、肺、 肾、 胃肠等重要脏器， 结果均未见异常改变。 结果显示， 250mg/kg的 YC-1 0对小鼠无毒性。
2 药理研究结果 2.1 YC-1 0对谷氨酸介导的小脑颗粒神经元损伤的保护作用
体外培养第 8天的大鼠小脑颗粒神经元， 给药组预先给予 MK801或不同浓 度的丫 C-1 0进行预孵 30min , 然后模型组和所有给药组换成无 Mg2+的 Locke 缓冲液， 同时给予终浓度为 Ι ΟΟμΜ谷氨酸、 Ι ΟμΜ甘氨酸和相应浓度的药物， 置于 37°C培养箱孵育 30min后换回正常培养基， 继续培养 24h后进行 FDA染 色。
如图 2所示， 镜下观察发现， 谷氨酸可以诱导小脑颗粒神经元的损伤死亡， MK801能够阻止谷氨酸对小脑颗粒神经元造成的损伤， 而丫 C-1 0同样可浓度依 赖性地阻止谷氨酸介导的神经元兴奋性毒性损伤。结果显示， YC-1 0对谷氨酸介 导的小脑颗粒神经元损伤具有保护作用， 并且呈浓度依赖性 (图 3)。
2.2 YC-1 0对低钾诱导的小脑颗粒神经元死亡的保护作用
体外培养第 8天的大鼠小脑颗粒神经元,给药组预先给予不同浓度的 YC-10 孵育 30min , 然后模型组和给药组换成 5K (即 5mM KCI)的 BME培养基 (对照组 为 25K) , 同时给予相应浓度的 YC-1 0 , 置于 37°C培养箱继续培养， 24h后进行 FDA染色。
如图 4所示， 镜下观察发现， 低钾培养基可以诱导小脑颗粒神经元的死亡， 而较高浓度 (50μΜ)的 YC-1 0可阻止低钾培养基诱导的神经元死亡。 结果显示， YC-1 0对低钾诱导的小脑颗粒神经元死亡具有保护作用。
2.3 YC-1 0对视神经夹闭损伤引起的视神经节细胞死亡的保护作用
1 0%水合氯醛麻醉大鼠，术前 20min尾静脉给予 YC-1 0(20mg/kg)或溶剂， 然后限部局部麻醉， 用角膜剪和显微镊沿角膜缘剪开结膜， 钝性分离外直肌， 充 分暴露视神经， 用反向夹持镊于限球后约 2mm处钳夹视神经 5秒后松开，术后 涂抹抗生素限膏防止感染。 术后 2小时、 第二天和第三天再次给药， 7天后取限 球进行病理检查。
如图 5 所示， 病理结果显示， 视神经夹闭损伤能引起视网膜视神经节细胞 (RGC)的死亡消失， 而 YC-1 0能减缓或防止视神经节细胞在夹闭损伤下的死亡 消失， 说明 YC-1 0对视神经夹闭损伤引起的视神经节细胞死亡具有保护作用。 视神经夹闭损伤模型中各组样本的 RGC数量统计数据如图 ό所示。 2.4 YC-1 0对限球高压缺血引起的视神经节细胞死亡的的保护作用
1 0%水合氯醛麻醉大鼠， 限部局部麻醉， 安放好灌流装置， 使灌流液面距离 大鼠限球水平面 1 76cm (可增加约 1 30mmHg限内压），管口连接 30G 1 /2针头， 小心插入限前房， 此时可见限球明显变白并记录缺血起始时间。 1小时后迅速将 针头拔出，用抗生素限药水护理后放回笼中词养。溶剂组和丫 C-1 0组 (20mg/kg) 在造模前 20min尾静脉给药， 造模结束后 2小时、 第二天和第三天再次尾静脉 给药。 造模 7天后取限球进行病理检查。
如图 7所示 ,病理结果显示，限球高压缺血能引起视网膜视神经节细胞 (RGC) 的死亡消失， 而 YC-1 0能减少或减缓视神经节细胞在缺血损伤下的死亡消失， 说明丫 C-1 0对限球高压缺血引起的视神经节细胞死亡具有保护作用。 高压缺血 模型中各组样本的 RGC数量统计数据如图 8所示。

Claims

权利要求
1 .化合物 2β,3α,5α-三羟基 -雄甾 -ό-酮， 具有式 I)的结构：
Figure imgf000017_0001
2. 一种药物组合物， 包含治疗有效量的权利要求 1 的化合物， 以及药学上 可接受的载体。
3. 一种药物组合物， 包含治疗有效量的权利要求 1 的化合物， 以及第二种 神经细胞保护剂。
4. 根据权利要求 3所述的药物组合物， 其中所述第二种神经保护药物为视 神经节细胞保护剂。
5. 一种药物组合物， 包含治疗有效量的权利要求 1 的化合物， 以及第二种 抗肿瘤药物。
6. 权利要求 1的化合物在制备神经细胞保护药物中的应用。
7. 权利要求 1的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8. —种制备权利要求 1所述化合物的方法， 所述方法以雄甾 -5-烯 -3-醇为原 料， 经反应制得化合物 3(3-对甲苯磺酰氧基 -5α-羟基-雄留-ό-酮， 经消去反应得 到化合物 5α-羟基 -雄甾 -2-烯 -0-酮， 再经 2-位双键经氧化、 水解反应得到式 (I)的 化合物。
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