JP2016514729A

JP2016514729A - ２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オン、その製造方法及びその用途

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Publication number: JP2016514729A
Application number: JP2016504473A
Authority: JP
Inventors: ジンシアジャン; スイジョンリン; ミンウィシエ
Original assignee: Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2016-05-23
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: CN104072564A; WO2014154179A1; PT2980096T; CA2908088A1; AU2014243510B2; US20160039862A1; CA2908088C; CN105189528B; EP2980096A4; TW201436796A; US9428539B2; CN104072564B; EP2980096A1; KR101771192B1; IL241768B; ES2691530T3; EP2980096B1; CN105189528A; JP6106328B2; KR20160021083A

Abstract

本発明は、式（Ｉ）で示される構造を有する化合物２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンを提供する。本発明は、さらにその化合物の複数の製造方法、及びその化合物の用途を提供する。式（Ｉ）：【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月２８日出願の中国特許出願第２０１３１０１０４１６２．５号の優先権利益を主張し、その開示の全体がここに参考として組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、ポリヒドロキシステロンに関し、具体的に、２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オン、その製造方法及び医学的使用に関する。

ポリヒドロキシステロンは、自然界に広く存在する重要化合物の１つである。海洋生物及び陸生植物から抽出された様々なポリヒドロキシステロンは、抗腫瘍、免疫能向上などの重要な生理機能を有する。例えば、エクジステロン系及びブラシノステロイド系化合物は、植物の生長を促進する機能がある。

しかしながら、天然のポリヒドロキシステロンは、植物における含有量が極めて低く、精製の手順が煩雑で長時間がかかり、また、構造面の理由で（例えば、長くて複雑な側鎖を有する構造）、人工合成が不能な場合が多いため、このような物質の使用が制限される。天然生成物の薬学的機能を基本的に維持し得るとともに人工合成のためにより簡単な構造を持つように、天然生成物の構造を最適化することが可能であれば、このような物質の適用範囲の拡大に非常に重要な意味を持つ。

本発明の一側面において、
式（Ｉ）：
の構造式で示される新規ポリヒドロキシステロン系物質である２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オン（以下、本明細書で互換的に使われる「ＹＣ−１０」、「化合物（Ｉ）」、「化合物」と称することもある）を提供する。

化学式（Ｉ）の化合物は、天然に存在するものではなく、本願発明者らが人工合成の方法により得られるものである。当該ポリヒドロキシステロンは、天然に存在するポリヒドロキシステロン系物質と比べて、例えば、長くて複雑な側鎖を有さないような比較的簡単な構造を持つため、人工合成に便利である。また、分子量の低下及び立体構造の簡単化により、薬物送達に便利である。側鎖を除去することにより、他の物質と相互作用する可能性を低減する。さらに、化合物（Ｉ）の１７−位に側鎖を有さないため、化合物のインビボにおけるバイオアベイラビリティを増加させ、そのホルモン様効果を解消することが可能である。また、特有の立体配置は、化合物（Ｉ）の立体選択性を向上させ、より良い生物活性を与えることができる。

同時に、式（Ｉ）の化合物は、特定の薬理学的作用を有し、潜在的医薬用途に適用可能であることが証明された。本発明において、当該化合物は抗腫瘍作用、及び神経細胞（特に視神経節細胞）の保護作用を持つことが試験によって確認された。

したがって、本発明の別の側面において、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。「治療的有効量」とは、対象者に適用して疾患を治療する場合、化合物の使用量が疾患を効果的に治療するのに十分であることを意味する。「治療的有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、治療対象者の年齢や体重などによって変更できる。「薬学的に許容される担体」とは、本発明の化合物と併用可能な希釈剤、助剤、賦形剤などを意味する。

本発明の他の側面において、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物と、第２の神経細胞保護剤とを含む医薬組成物を提供する。上記第２の神経細胞保護剤は、本発明の化合物と異なって本発明の化合物と併用可能であり、神経細胞の保護を実現するために用いられる。好ましい実施形態において、上記第２の神経細胞保護剤は視神経節細胞保護剤である。

本発明の他の側面において、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物と、第２の抗腫瘍剤とを含む医薬組成物を提供する。上記第２の抗腫瘍剤は、本発明の化合物と異なって本発明の化合物と併用可能であり、抗腫瘍作用を実現するために用いられる。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、皮膚や人体器官における細胞の悪性又は良性増殖を意味し、上記の器官として、例えば、乳房、前立腺、肺臓、腎臓、膵臓、胃、又は腸などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。悪性腫瘍は、隣接組織に侵入しやすく、例えば、骨、肝臓、肺臓、又は脳などの離れた器官まで広がっている（転移）。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、転移性腫瘍細胞型及び組織がん型を含み、転移性腫瘍細胞型として、例えば、黒色腫、リンパ腫、白血病、線維肉腫、平滑筋肉腫、及び肥満細胞腫などが挙げられるがこれらに限定されるものではなく、組織がん型として、例えば、結直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌、及び子宮平滑筋肉腫などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。

本発明の他の側面において、式（Ｉ）の化合物の、神経細胞保護剤又は抗腫瘍剤の製造における使用を提供する。本発明の式（Ｉ）の化合物は、腫瘍細胞増殖抑制効果、用量依存的な腫瘍抑制率を有するとともに、明らかな神経細胞保護作用も有することが試験によって確認された。

本発明の他の側面において、例えば、複数の疾患要因による網膜神経損傷又は中枢神経系ニューロン損傷に関連する疾患などの疾患又は病状を治療又は緩和する方法を提供する。このような疾患又は病状として、例えば、網膜虚血、外傷及び急性・慢性緑内障による視神経損傷、高血圧及び糖尿病による高血圧性網膜症及び糖尿病性網膜症、網膜色素変性及び黄斑変性症などの眼疾患と、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、パーキンソン病（ＰＤ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓｄｉｓｅａｓｅ）、アルツハイマー病（ＡＤ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（ＨＤ：Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）などの中枢神経系疾患となどが挙げられる。この方法は、治療的有効量の本発明に係る式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグ、溶媒和物を対象者に適用するか、又は本発明に係る医薬組成物を対象者に適用することを含む。

本発明において、「プロドラッグ」という用語は、開裂可能な基を有し、かつ加水分解により又は生理的条件下でインビボで薬剤活性のある本発明の式（Ｉ）の化合物に転化する化合物を意味し、本発明の化合物の誘導体を含む。このような化合物の実例として、コリンエステル誘導体、Ｎ−アルキルモルフォリンなどを含むがこれらに限定されるものではない。「溶媒和物」という用語は、一般的に加溶媒分解反応により溶媒と会合する化合物の形態を意味する。このような物理的会合は水素結合を含む。一般的な溶媒は、水、エタノール、酢酸などを含む。本発明の化合物は、例えば、結晶形に調製されてもよく、溶媒和又は水和されてもよい。適切な溶媒和物は、例えば、水和物などの薬学的に許容される溶媒和物を含み、化学量論の溶媒和物及び非化学量論の溶媒和物も含む。場合によって、例えば、１つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子にドープされるときに、溶媒和物が分離できる。「溶媒和物」という用語は、溶液相と分離可能な溶媒和物とを含む。代表的な溶媒和物として、水和物、エタノラート、及びメタノラートを含む。

本発明の他の側面において、アンドロスタ−５−エン−３−オールを原料とし、反応により化合物ＶＩである３β−ｐ−トルエンスルフォニルオキシ−５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンを調製し、脱離反応により化合物ＩＸである５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−２−エン−６−オンを調製し、さらに２−位二重結合における酸化、加水分解反応により本発明の式（Ｉ）の化合物を得る、上記本発明の式（Ｉ）の化合物を製造する方法を提供する。

上記方法において、化合物ＶＩは例えば、下記の方法（１）〜（３）などの複数の方法により得られる。

（１）アンドロスタ−５−エン−３−オールを原料とし、Ｈ_２Ｏ_２／ギ酸による酸化、アルカリ加水分解、ＮＢＳ酸化、及びｐ−トルエンスルホンクロリド保護を行うことにより、化合物ＶＩを製造する。

具体的に、方法（１）は、下記の（１ａ）〜（１ｄ）を含む。

（１ａ）反応フラスコに化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール及びギ酸を加え、その後、低温で過酸化水素を滴下し、１〜２時間反応させてから加熱し、反応液に水を加え、十分に撹拌して分散させた後、吸引濾過して乾燥し、白色固体状の化合物ＩＩを得る。ここで、化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール：ギ酸：過酸化水素は、１：１０〜３０：０．５〜３（ｗ：ｖ：ｖ）である。

（１ｂ）反応フラスコにアルカリ性メタノール溶液を加え、その後、化合物ＩＩを加えて１〜２時間加熱還流させ、させ、反応液を水に入れて分散させた後、吸引濾過して乾燥し、白色固体状の化合物ＩＩＩを得る。ここで、アルカリ性メタノール溶液は、水酸化カリウムのメタノール溶液、水酸化ナトリウムのメタノール溶液、及びナトリウムメトキシドのメタノール溶液から選ばれるいずれか１種であり、上記反応液のアルカリ濃度は２〜１０％である。

（１ｃ）反応フラスコに化合物ＩＩＩ、適量のジオキサン及び水を加え、その後、ＮＢＳをバッチ添加して２〜４時間反応させ、反応液に亜硫酸ナトリウムを加えた後、ケーキ濾過で吸引濾過し、水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｖを得る。

（１ｄ）反応フラスコに適量のピリジン、化合物Ｖ、及びｐ−トルエンスルホンクロリドを加え、室温で２４〜３６時間撹拌した後、混合液を氷塩酸水溶液に入れ、ケーキ濾過で吸引濾過し、中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＶＩを得る。

（２）アンドロスタ−５−エン−３−オールを原料とし、ｍ−クロロ過安息香酸による酸化、酸分解反応、ＮＢＳ酸化、及びｐ−トルエンスルホンクロリド保護を行うことにより、化合物ＶＩを製造する。

具体的に、方法（２）は、下記の（２ａ）〜（２ｄ）を含む。

（２ａ）反応フラスコに化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール及びＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、その後、撹拌しながら適量のｍ−クロロ過安息香酸をバッチ添加し、氷浴で２〜５時間撹拌し、反応が完了した後、反応液をＮａ_２ＣＯ_３溶液、Ｎａ_２ＳＯ_３溶液、水で順次洗浄し、乾燥、濃縮し、化合物ＩＶを得る。

（２ｂ）反応フラスコに化合物ＩＶ及び酸性アセトン水溶液を加え、室温で撹拌しながら数時間反応させ、反応が完了した後、反応液をＮａ_２ＣＯ_３溶液で中性に調整し、濃縮してアセトンを取り除き、濃縮液を酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥、濃縮し、化合物ＩＩＩを得る。ここで、酸性アセトン水溶液における酸は硫酸及び過ヨウ素酸であり、化合物ＩＶ：アセトン：１Ｎの酸は１：２０〜３０：５〜１０（ｗ：ｖ：ｖ）である。

（２ｃ）反応フラスコに化合物ＩＩＩ、適量のジオキサン及び水を加え、その後、ＮＢＳをバッチ添加し、２〜４時間反応させた後、反応液に亜硫酸ナトリウムを加え、ケーキ濾過で吸引濾過し、水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｖを得る。

（２ｄ）反応フラスコに適量のピリジン、化合物Ｖ、及びｐ−トルエンスルホンクロリドを加え、室温で２４〜３６時間撹拌した後、混合液を氷塩酸水溶液に入れ、ケーキ濾過で吸引濾過し、中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＶＩを得る。

（３）アンドロスタ−５−エン−３−オールを原料とし、ｐ−トルエンスルホンクロリド保護、ｍ−クロロ過安息香酸による酸化、及びジョーンズ試薬による酸化を行うことにより、化合物ＶＩを製造する。

具体的に、方法（３）は、下記の（３ａ）〜（３ｃ）を含む。

（３ａ）反応フラスコに化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール、無水ピリジン、及びｐ−トルエンスルホンクロリドを加え、室温で撹拌し、反応が完了した後、反応液を氷塩酸水溶液に入れて撹拌し、その後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＶＩＩを得る。

（３ｂ）反応フラスコに化合物ＶＩＩ及び塩化メチレンを加え、その後、撹拌しながらｍ−クロロ過安息香酸をバッチ添加し、氷浴で撹拌し、反応が完了した後、反応液を飽和亜硫酸ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、蒸留水で順次洗浄し、有機層を乾燥、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固体状の化合物ＶＩＩＩを得る。

（３ｃ）反応フラスコに化合物ＶＩＩＩ及びアセトンを加え、その後、撹拌しながらジョーンズ試薬を加え、室温で数時間反応させ、反応が完了した後、イソプロピルアルコールにより反応を停止させ、反応液を中性に調整し、その後、減圧濃縮してアセトンを取り除き、濃縮液を酢酸エチルで抽出し、洗浄、乾燥、濃縮し、得られた淡緑色の固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固体状の化合物ＶＩを得る。

本発明の方法において、化合物ＩＸは、例えば、下記の工程により得られる。すなわち、反応フラスコに適量の化合物ＶＩ、ＤＭＦ、Ｌｉ_２ＣＯ_３、及びＬｉＢｒを加えて加熱還流させた後、反応液を氷塩酸水溶液に入れて撹拌し、その後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＸを得る。好ましくは、化合物ＶＩ：ＤＭＦは１：３〜１５（ｗ：ｖ）であり、化合物ＶＩ：Ｌｉ_２ＣＯ_３：ＬｉＢｒは１：４〜１２：４〜１２（Ｍ：Ｍ：Ｍ）である。

本発明の方法において、化合物Ｉは、化合物ＩＸから同様に下記の方法（１）及び（２）により得られる。

（１）化合物ＩＸから、Ｈ_２Ｏ_２／ギ酸による酸化、アルカリ加水分解を行うことにより、式（Ｉ）の化合物を製造する。

具体的に、方法（１）は、下記の（１ａ）及び（１ｂ）を含む。

（１ａ）反応フラスコに化合物ＩＸ及びギ酸を加え、その後、低温で過酸化水素を滴下し、１〜２時間反応させてから加熱し、反応液に水を加え、十分に撹拌して分散させた後、吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを乾燥し、白色固体状の化合物Ｘを得た。ここで、化合物ＩＸ：ギ酸：過酸化水素は１：１０〜３０：０．５〜３（ｗ：ｖ：ｖ）である。

（１ｂ）反応フラスコにアルカリ性メタノール溶液を加え、その後、化合物Ｘを加えて１〜２時間加熱還流させ、させ、反応液を水に入れて分散させた後、吸引濾過して乾燥し、白色固体状の式（Ｉ）の化合物を得る。ここで、アルカリ性メタノール溶液は、水酸化カリウムのメタノール溶液、水酸化ナトリウムのメタノール溶液、及びナトリウムメトキシドのメタノール溶液から選ばれるいずれか１種であり、上記反応液のアルカリ濃度は２〜１０％である。

（２）化合物ＩＸから、ｍ−クロロ過安息香酸による酸化、酸分解反応を行うことにより、式（Ｉ）の化合物を製造する。

具体的に、方法（２）は、下記の（２ａ）及び（２ｂ）を含む。

（２ａ）反応フラスコに化合物ＩＸ及びＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、その後、撹拌しながらｍ−クロロ過安息香酸をバッチ添加し、氷浴で２〜５時間撹拌し、反応が完了した後、Ｎａ_２ＣＯ_３溶液、Ｎａ_２ＳＯ_３液、水で順次洗浄し、乾燥、濃縮し、化合物ＸＩを得る。

（２ｂ）反応フラスコに化合物ＸＩ及び酸性アセトン溶液を加え、室温で撹拌しながら数時間反応させ、反応が完了した後、反応液をＮａ_２ＣＯ_３溶液で中性に調整し、濃縮してアセトンを取り除き、濃縮液を酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥、濃縮し、式（Ｉ）の化合物を得る。ここで、酸性アセトン溶液における酸は硫酸及び過ヨウ素酸であり、化合物ＸＩ：アセトン：１Ｎの酸は１：２０〜３０：５〜１０（ｗ：ｖ：ｖ）である。

図１は、本発明の化合物ＩのＬＮ１８及びＤＢＴＲＧ−５０ＭＧ細胞増殖抑制作用（ｎ=３*、ｐ＜０．０５）を示す。図２は、化合物Ｉのグルタミン酸誘発小脳顆粒ニューロン損傷に対する保護作用を示す。図３は、化合物Ｉの小脳顆粒ニューロン生存に対する濃度依存的な保護を示す。図４は、化合物Ｉの低カリウム誘発小脳顆粒ニューロン死に対する保護作用を示す。図５は、視神経クリッピング損傷モデルにおけるＲＧＣが明らかに減少するが、化合物ＩがＲＧＣの減少を明らかに阻止できることを示す。図６は、視神経クリッピング損傷モデルにおける各群サンプルのＲＧＣ数の統計データグラフである。図７は、高圧虚血モデルにおけるＲＧＣが明らかに減少するが、化合物Ｉが高圧虚血によるＲＧＣ損失を減少できることを示す。図８は、高圧虚血モデルにおける各群サンプルのＲＧＣ数の統計データグラフである。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の保護範囲を限定するものではない。以下の実施例において、化合物Ｉは２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンであり、化合物ＩＩは３β，６β−ジホルミルオキシ−５α−アンドロスタ−５−オールであり、化合物ＩＩＩはアンドロスタ−３β，５α，６β−トリオールであり、化合物ＩＶは３β−ヒドロキシ−アンドロスタ−５β，６β−エポキシであり、化合物Ｖは３β，５α−ジヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンであり、化合物ＶＩは３β−ｐ−トルエンスルフォニルオキシ−５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンであり、化合物ＶＩＩは３β−ｐ−トルエンスルフォニルオキシ−アンドロスタ−５−エンであり、化合物ＶＩＩＩは３β−ｐ−トルエンスルフォニルオキシ−アンドロスタ−５β，６β−エポキシであり、化合物ＩＸは５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−２−エン−６−オンであり、化合物Ｘは２β，３α−ジホルミルオキシ−５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンであり、化合物ＸＩは２β，３β−エポキシ−５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンである。

［化合物Ｉの製造実施例１］
化合物Ｉの製造実施例１は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

（１）２Ｌ反応フラスコに化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール５４．５ｇ、及びギ酸１Ｌ（市販品、８８％）を加え、２５℃以下に冷却し、その後、過酸化水素８２．５ｍＬ（市販品、３０％）を徐々に滴下し、原料がなくなることをＴＬＣで確認した後、７５℃に加熱して過剰の過酸化水素を取り除いた。反応液に水１Ｌを加え、十分に撹拌して分散させた。分散液を吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に浸漬した後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＩを６２．４ｇ得た。

（２）２Ｌ反応フラスコに水酸化カリウム４５ｇ、メタノール１５００ｍＬ、水３００ｍＬ、及び化合物ＩＩ６０ｇを加え、加熱還流させ、させ、化合物ＩＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応液を室温まで冷却し、水３Ｌに入れて分散させた。分散液に濃塩酸を加えてｐＨを７に調整し、静置して複数層に分離させた後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＩＩを４９．６ｇ得た。

（３）１Ｌ反応フラスコに化合物ＩＩＩ４９ｇ、ジオキサン６００ｍＬ、及び水２００ｍＬを加え、固体が完全に溶解した後、Ｎ−ブロモコハク酸イミド４２．５ｇを４回でバッチ添加し、化合物ＩＩＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液に亜硫酸ナトリウム１１ｇを加えて過剰の酸化剤を還元させた後、４Ｌ水に分散させ、分散液を吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｖを４７．８ｇ得た。

（４）５００ｍＬ反応フラスコにピリジン１３５ｍＬ、化合物Ｖ４４．３ｇ、及びｐ−トルエンスルホンクロリド４５ｇを加え、室温で撹拌し、化合物ＶがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液を１：１（ｖ：ｖ）の氷塩酸水溶液３００ｍＬに入れ、混合液を撹拌、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水でｐＨが７になるまで洗浄し、その後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＶＩを６１．７ｇ得た。

（５）１Ｌ反応フラスコにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３２５ｍＬ、化合物ＶＩ５４ｇ、Ｌｉ_２ＣＯ_３５２．１ｇ、及びＬｉＢｒ６０．５ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＶＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液を１：１（ｖ：ｖ）の氷塩酸水溶液２Ｌに入れ、混合液を撹拌、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＸを３２ｇ得た。

（６）５００ｍＬ反応フラスコに化合物ＩＸ３０ｇ及びギ酸６００ｍＬ（市販品、８８％）を加え、加熱して固体を溶解させた後、２５℃以下に冷却し、過酸化水素２４ｍＬ（市販品、３０％）を徐々に滴下し、化合物ＩＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、７５℃に加熱して１０分間保持することにより過剰の過酸化水素を取り除いた。反応液を水３Ｌに入れ、十分に撹拌して分散させた。分散液を吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に気泡がなくなるまで浸漬した後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｘを２６ｇ得た。

（７）５００ｍＬ反応フラスコに水酸化カリウム２７ｇ、メタノール６００ｍＬ、水７２ｍＬ、及び化合物Ｘ２３．４ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応液を室温まで冷却し、水３Ｌに入れて分散させた。分散液に濃塩酸を加えてｐＨを７に調整し、静置して複数層に分離させた後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを中性になるまで洗浄し、アセトンで再結晶させ、乾燥し、白色固体状の化合物Ｉを１６ｇ得た。

ｍ．ｐ：１９７〜２０１℃；比旋光度：−５０°（２ｍｇ／ｍＬ，無水エタノール）；^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：０．６５（ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ_３），０．８７（ｓ，３Ｈ，１９−ＣＨ_３），３．７６〜３．８３（ｄ，Ｊ=２８Ｈｚ，２Ｈ，２−ＣＨ及び３−ＣＨ）；^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：１５．５２（ＣＨ_３），１７．２７（ＣＨ_３），１９．９４（ＣＨ_２），２０．５３（ＣＨ_２），２４．６８（ＣＨ_２），２６．９０（ＣＨ_２），３３．０２（ＣＨ_２），３６．４５（ＣＨ），３９．７２（ＣＨ_２），４０．９２（Ｃ），４１．２６（ＣＨ_２），４２．５４（Ｃ），４４．９９（ＣＨ），５４．０４（ＣＨ），６８．９４（ＣＨ），７０．１９（ＣＨ），７９．７１（Ｃ），２１０．６５（Ｃ）；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ^−１）ｖ：３２９６，２９３７，１７２６，１０６４；ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：３１９（Ｍ−３）。

［化合物Ｉの製造実施例２］
化合物Ｉの製造実施例２は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

（１）２Ｌ反応フラスコに化合物アンドロスタ−５−エン−３−オール７０ｇ、ＣＨ_２Ｃｌ_２１２００ｍＬを加え、その後、撹拌しながらｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）１０５ｇをバッチ添加し、氷浴で５時間撹拌した。反応が完了した後、反応液を飽和亜硫酸ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、及び蒸留水で順次洗浄し、有機層を乾燥、濃縮し、黄色固体状の化合物ＩＶを６２ｇ得た。

（２）化合物ＩＶ６０ｇをアセトン３Ｌに溶解させた後、１ＮのＨ_２ＳＯ_４溶液４００ｍＬを加え、室温で撹拌しながら３時間反応させた。反応が完了した後、Ｎａ_２ＣＯ_３溶液で反応液を中性に調整し、減圧濃縮してアセトンを取り除いた。濃縮液を酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、黄色固体を４８ｇ得た。得られた黄色固体をアセトンで再結晶させ、化合物ＩＩＩを３０．５ｇ得た。

工程（３）〜（７）は製造実施例１の工程（３）〜（７）と同様である。

［化合物Ｉの製造実施例３］
化合物Ｉの製造実施例３は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

工程（１）〜（５）は製造実施例１の工程（１）〜（５）と同様である。

（６）５００ｍＬ反応フラスコにおいて化合物ＩＸ２３ｇをＣＨ_２Ｃｌ_２６００ｍＬに溶解させ、その後、撹拌しながらｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）３４．６ｇをバッチ添加し、氷浴で５時間撹拌した。反応が完了した後、反応液を飽和亜硫酸ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、及び蒸留水で順次洗浄し、有機層を乾燥、濃縮し、黄色固体状の化合物ＸＩを２０．７ｇ得た。

（７）２Ｌ反応フラスコにおいて化合物ＸＩ１７．４ｇをアセトン９００ｍＬに溶解させ、その後、１ＮのＨ_２ＳＯ_４溶液１８０ｍＬを加え、室温で撹拌しながら３時間反応させた。反応が完了した後、Ｎａ_２ＣＯ_３溶液で反応液を中性に調整し、減圧濃縮してアセトンを取り除いた。濃縮液を酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、黄色固体を１４．４ｇ得た。アセトンで再結晶させ、乾燥し、白色固体状の化合物Ｉを得た。

［化合物Ｉの製造実施例４］
化合物Ｉの製造実施例４は、下記の工程（１）〜（６）を含む。

（１）２５０ｍＬ反応フラスコにアンドロスタ−５−エン−３−オール１４．６４ｇ及び無水ピリジン１２５ｍＬを加え、撹拌しながらｐ−トルエンスルホンクロリド２６．０５ｇをバッチ添加し、室温で２４時間反応させた。原料がなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応物を激しく撹拌しながら１７％のＨＣｌの氷水溶液２０００ｍＬに徐々に入れ、混合物を吸引濾過し、水で中性になるまで洗浄した後、真空乾燥し、白色固体状の化合物ＶＩＩを２２．４８ｇ得た。

（２）２５０ｍＬ反応フラスコに化合物ＶＩＩ１５．００ｇ及びＣＨ_２Ｃｌ_２２００ｍＬを加え、撹拌しながらｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）１５．１２ｇをバッチ添加し、氷浴で５時間撹拌した。反応終了をＴＬＣで確認した後、撹拌を停止し、反応液を飽和亜硫酸ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、及び蒸留水で順次洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、有機溶媒を留去した後、真空乾燥し、粗生成物を１４．０７ｇ得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固体状の化合物ＶＩＩＩを１２．３ｇ得た。

（３）１０００ｍＬ反応フラスコに化合物ＶＩＩＩ１４．０７ｇ及びアセトン７５０ｍＬを加え、その後、撹拌しながらジョーンズ試薬３０ｍＬを加え、室温で２時間反応させた。反応終了をＴＬＣで確認した後、イソプロピルアルコールにより反応を停止させた。Ｎａ_２ＣＯ_３溶液で反応液を中性に調整し、減圧濃縮してアセトンを取り除いた。濃縮液を酢酸エチルで抽出し、有機相を蒸留水で複数回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、淡緑色固体を得た。得られた淡緑色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固体状の化合物ＶＩを１２．８９ｇ得た。

工程（４）〜（６）は製造実施例１の工程（５）〜（７）と同様である。

［化合物Ｉの製造実施例５］
化合物Ｉの製造実施例５は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

工程（１）〜（４）は製造実施例１の工程（１）〜（４）と同様である。

（５）１Ｌ反応フラスコに無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３２５ｍＬ、化合物ＶＩ５４ｇ、乾燥したＬｉ_２ＣＯ_３６９．５ｇ、及びＬｉＢｒ８０．６ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＶＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液を１：１（ｖ：ｖ）の氷塩酸水溶液２Ｌに入れ、混合液を撹拌、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＸを３２．５ｇ得た。

工程（６）〜（７）は実施例１の工程（６）〜（７）と同様である。

［化合物Ｉの製造実施例６］
化合物Ｉの製造実施例６は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

（５）１Ｌ反応フラスコに無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３２５ｍＬ、化合物ＶＩ５４ｇ、乾燥したＬｉ_２ＣＯ_３３４．７ｇ、及びＬｉＢｒ４０．３ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＶＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液を１：１（ｖ：ｖ）の氷塩酸水溶液２Ｌに入れ、混合液を撹拌、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＸを３０．２ｇ得た。

工程（６）〜（７）は製造実施例３の工程（６）〜（７）と同様である。

［化合物Ｉの製造実施例７］
化合物Ｉの製造実施例７は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

（５）１Ｌ反応フラスコに無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４３２ｍＬ、化合物ＶＩ５４ｇ、乾燥したＬｉ_２ＣＯ_３５２．１ｇ、及びＬｉＢｒ６０．５ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＶＩがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応を停止させた。反応液を１：１（ｖ：ｖ）の氷塩酸水溶液２Ｌに入れ、混合液を撹拌、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物ＩＸを３０．５ｇ得た。

（６）５００ｍＬ反応フラスコに化合物ＩＸ３０ｇ及びギ酸６００ｍＬ（市販品、８８％）を加え、加熱して固体を溶解させた後、２５℃以下に冷却し、過酸化水素２０ｍＬ（市販品、３０％）を徐々に滴下し、化合物ＩＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、７５℃に加熱して１０分間保持することにより過剰の過酸化水素を取り除いた。反応液を水３Ｌに入れ、十分に撹拌して分散させた。分散液を吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に気泡がなくなるまで浸漬した後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｘを２８ｇ得た。

（７）５００ｍＬ反応フラスコに水酸化カリウム１８ｇ、メタノール６００ｍＬ、水７２ｍＬ、及び化合物Ｘ２５ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応液を室温まで冷却し、水３Ｌに入れて分散させた。分散液に塩酸を加えてｐＨを７に調整し、静置して複数層に分離させた後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを中性になるまで洗浄し、アセトンで再結晶させ、乾燥し、白色固体状の化合物Ｉを８．８ｇ得た。

［化合物Ｉの製造実施例８］
化合物Ｉの製造実施例８は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

工程（１）〜（５）は製造実施例７の工程（１）〜（５）と同様である。

（６）５００ｍＬ反応フラスコに化合物ＩＸ３０ｇ及びギ酸６００ｍＬ（市販品、８８％）を加え、加熱して固体を溶解させた後、２５℃以下に冷却し、過酸化水素３６ｍＬ（市販品、３０％）を徐々に滴下し、化合物ＩＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、７５℃に加熱して１０分間保持することにより過剰の過酸化水素を取り除いた。反応液を水３Ｌに入れ、十分に撹拌して分散させた。分散液を吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に気泡がなくなるまで浸漬した後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｘを２４ｇ得た。

工程（７）は製造実施例７の工程（７）と同様である。

［化合物Ｉの製造実施例９］
化合物Ｉの製造実施例９は、下記の工程（１）〜（７）を含む。

（６）５００ｍＬ反応フラスコに化合物ＩＸ３０ｇ及びギ酸６００ｍＬ（市販品、８８％）を加え、加熱して固体を溶解させた後、２５℃以下に冷却し、過酸化水素４５ｍＬ（市販品、３０％）を徐々に滴下し、化合物ＩＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、７５℃に加熱して１０分間保持することにより過剰の過酸化水素を取り除いた。反応液を水３Ｌに入れ、十分に撹拌して分散させた。分散液を吸引濾過し、得られた白色濾過ケーキを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に気泡がなくなるまで浸漬した後、吸引濾過し、得られた濾過ケーキを水で中性になるまで洗浄し、乾燥し、白色固体状の化合物Ｘを２３ｇ得た。

（７）５００ｍＬ反応フラスコに水酸化カリウム２７ｇ、メタノール３００ｍＬ、水３６ｍＬ、及び化合物Ｘ１２．５ｇを加え、加熱還流させ、化合物ＸがなくなることをＴＬＣで確認した後、反応液を室温まで冷却し、水３Ｌに入れて分散させた。分散液に塩酸を加えてｐＨを７に調整し、静置して複数層に分離させた後、吸引濾過し、得られた過ケーキを中性になるまで洗浄し、アセトンで再結晶させ、乾燥し、白色固体状の化合物Ｉを８．０ｇ得た。

［化合物Ｉの腫瘍抑制効果］
（１）細胞播種、投与処理
対数増殖期のＬＮ１８細胞及びＤＢＴＲＧ−５０ＭＧ細胞を完全培地で細胞懸濁液に調製し、１ウェルあたり１００μｌ、３×１０^４／ｍｌの密度で９６ウェル培養プレートに播種した。１２時間後、細胞の培養プレート表面への完全付着が見られ、その後、ＹＣ−１０の最終濃度がそれぞれ２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭになるようにＹＣ−１０を加えた。ここで、各濃度群はぞれぞれ５つのウェルを有する。

（２）ＭＴＴと細胞におけるコハク酸デヒドロゲナーゼの反応
２４時間培養した後、１ウェルごとにＭＴＴ１０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、続いて４時間培養した。この時、顕微鏡検査で生細胞内に形成される青紫色の粒状ホルマザン結晶が観察された。

（３）ホルマザン粒子の溶解
上澄みを注意深く取り除いた後、ＤＭＳＯを１００μｌ／ウェルで加えて結晶を溶解させ、ミニ発振器で５分間振動させた後、酵素免疫測定装置により波長５７０ｎｍで各ウェルの光学濃度（ＯＤ値）を測定した。

各群の実験はそれぞれ３回繰り返された。細胞生存率＝薬物処理群ＯＤ値／対照群ＯＤ値×１００％の式で細胞生存率を算出した。すべてのデータは平均値±標準偏差で示され、ＳＰＳＳ１３．０統計パッケージを使用してｏｎｅ−ＷａｙＡＮＯＶＡ分散分析及びｔ−検定により、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアで図１を得た。図１から、それぞれ２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭのＹＣ−１０により２４時間処理された後、投与群の生存率が対照群の生存率と比較して統計的に有意差がある（Ｐ＜０．０５）ことが分かった。ＹＣ−１０は腫瘍細胞を用量依存的に殺した。

［化合物Ｉの神経保護作用］
ＹＣ−１０の神経保護作用の有無及び臨床薬への開発可能性を検討するために、ＹＣ−１０の毒性及び薬効に対して様々なインビトロ・インビボ研究を行った。研究結果によると、大量のＹＣ−１０（２５０ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスが、投与後１４日以内に明らかな異常は見られなかった。インビトロ培養した初代小脳顆粒ニューロンのグルタミン酸モデル及び低カリウムモデルに対する研究結果によると、ＹＣ−１０は小脳顆粒ニューロンの生存に対して明らかな保護作用を持つことが見られた。視神経損傷及び網膜虚血の動物モデルに対する研究結果によると、視神経軸索損傷及び網膜虚血の場合、ＹＣ−１０は視神経節細胞の生存に対して明らかな保護作用を持つことが見られる。以上の研究結果から、ＹＣ−１０は明らかな毒性及び副作用を有さず、神経保護作用を持つことが分かった。

＜１．毒理研究結果＞
（最大耐量試験）
４０％のヒドロキシプロピルシクロデキストリンを用いて濃度２５ｍｇ／ｍｌのＹＣ−１０注射液を調製した後、注射液を３０匹（雄雌半々）の体重１８〜２２ｇＫＭマウスに対して尾静脈注射（０．１ｍｌ／１０ｇ）を行った。

マウスを連続的に観測した結果、すべてのマウスは通常通りに活動、摂食し、光沢のある毛色、見た目の良い毛皮を呈し、口、目、鼻、耳に異常の分泌物はなく、大小便が正常であり、体重がある程度増加するとともに、すべてのマウスにおいて死亡したものは１つもないことが見られた。１４日観察後、動物を屠殺、解剖し、心、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃腸などの重要臓器を目視検査した結果、異常変化が見られなかった。その結果から、２５０ｍｇ／ｋｇのＹＣ−１０はマウスに対して無毒性であることが分かった。

＜２．薬理研究結果＞
（２．１）ＹＣ−１０のグルタミン酸誘発小脳顆粒ニューロン損傷に対する保護作用
インビトロ培養８日目のラット小脳顆粒ニューロンを投与群とモデル群に分け、投与群にＭＫ８０１又は異なる濃度のＹＣ−１０をあらかじめ与え、３０分間予備培養した。その後、モデル群及びすべての投与群にそれぞれＭｇ^２＋フリーＬｏｃｋｅ緩衝液を与えるとともに、最終濃度１００μＭのグルタミン酸、１０μＭのグリシン、及び対応濃度の薬物を与えた。各群を３７℃の培養器で３０分間培養した後、一般的な培地に置き換え、続いて２４時間培養した後、ＦＤＡ染色を行った。

図２に示すように、顕微鏡観察によると、グルタミン酸が小脳顆粒ニューロンの損傷・死滅を誘発し得るが、ＭＫ８０１はグルタミン酸による小脳顆粒ニューロンの損傷を阻止できる一方、ＹＣ−１０は同様にグルタミン酸によって誘発されるニューロン興奮毒性損傷を濃度依存的に阻止できることが発見された。その結果から、ＹＣ−１０はグルタミン酸誘発小脳顆粒ニューロン損傷に対して濃度依存的な保護作用をもつ（図３）ことが分かった。

（２．２）ＹＣ−１０の低カリウム誘発小脳顆粒ニューロン死に対する保護作用
インビトロ培養８日目のラット小脳顆粒ニューロンを投与群とモデル群に分け、投与群に異なる濃度のＹＣ−１０をあらかじめ与え、３０分間予備培養した。その後、モデル群及びすべての投与群に５Ｋ（すなわち、５ｍＭＫＣｌ）のＢＭＥ培地（対照群：２５Ｋ）を与えるとともに、対応濃度のＹＣ−１０を与えた。各群を３７℃の培養器で培養し続け、２４時間培養した後、ＦＤＡ染色を行った。

図４に示すように、顕微鏡観察によると、低カリウム培地が小脳顆粒ニューロンの死滅を誘発し得るが、濃度の比較的高い（５０μＭ）ＹＣ−１０は低カリウム培地によって誘発されたニューロン死を阻止できることが発見された。その結果から、ＹＣ−１０は低カリウム誘発小脳顆粒ニューロン死に対する保護作用をもつことが分かった。

（２．３）ＹＣ−１０の視神経クリッピング損傷による視神経節細胞死に対する保護作用
１０％の抱水クロラールでラットに麻酔をかけた後、手術２０分前にＹＣ−１０（２０ｍｇ／ｋｇ）又は溶媒を尾静脈投与した。その後、目に局部麻酔をかけ、角膜鋏刀及びマイクロ鉗子を用いて角膜縁に沿って結膜を切り離した。外直筋を鈍的剥離して視神経を十分露出させ、その後、クロスアクション鉗子により眼球後部約２ｍｍ部位における視神経を締め付けてから５秒後、クロスアクション鉗子を外した。手術した後、感染を防止するために抗生物質眼軟膏を塗布した。手術後２時間、２日目、３日目に薬物を再び投与し、７日後眼球を取り出して病理学検査を行った。

図５に示すように、病理学検査の結果によると、視神経クリッピング損傷が網膜視神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を誘発し得るが、ＹＣ−１０は視神経節細胞のクリッピング損傷による死滅を減速又は防止できる。その結果から、ＹＣ−１０は視神経クリッピング損傷による視神経節細胞死に対して保護作用を持つことが分かった。視神経クリッピング損傷モデルにおける各群サンプルのＲＧＣ数の統計データは図６に示される。

（２．４）ＹＣ−１０の眼球高圧虚血による視神経節細胞死に対する保護作用
１０％の抱水クロラールでラットに麻酔をかけた後、目に局部麻酔をかけた。灌流装置を灌流液面からラット眼球水平面までの距離が１７６ｃｍ（約１３０ｍｍＨｇの眼内圧を増加可能）になるように取り付けた後、管口に接続される３０Ｇ１／２針を眼球前房に注意深く挿入した。この時、眼球が明らかに白色になると、虚血開始時間を記録した。１時間後、針を迅速に抜き出し、抗生物質点眼薬で処理した後、ラットを飼育箱に戻して飼育した。モデリング２０分前に溶媒群及びＹＣ−１０群（２０ｍｇ／ｋｇ）に薬物を尾静脈投与し、モデリング完了後２時間、２日目、３日目に薬物を再び尾静脈投与した。モデリング７日後、眼球を取り出して病理学検査を行った。

図７に示すように、病理学検査の結果によると、眼球高圧虚血が網膜視神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を誘発し得るが、ＹＣ−１０は視神経節細胞の虚血損傷による死滅を減少又は減速できる。その結果から、ＹＣ−１０は眼球高圧虚血による視神経節細胞死に対して保護作用を持つことが分かった。高圧虚血モデルにおける各群サンプルのＲＧＣ数量統計データは図８に示される。

Claims

式（Ｉ）：
の構造式で示される化合物２β，３α，５α−トリヒドロキシ−アンドロスタ−６−オン。
治療有効量の請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
治療有効量の請求項１に記載の化合物と、他の神経細胞保護剤とを含む医薬組成物。
前記他の神経細胞保護剤は視神経節細胞保護剤である、請求項３に記載の医薬組成物。
治療的有効量の請求項１に記載の化合物と、他の抗腫瘍剤とを含む医薬組成物。
神経細胞保護剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用。
抗腫瘍剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用。
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
アンドロスタ−５−エン−３−オールを原料とし、反応により化合物３β−ｐ−トルエンスルフォニルオキシ−５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−６−オンを調製し、脱離反応により化合物５α−ヒドロキシ−アンドロスタ−２−エン−６−オンを調製し、さらに２−位二重結合における酸化、加水分解反応により前記式（Ｉ）の化合物を得る、製造方法。