WO2014148847A1 - 히알루론산의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물 - Google Patents

히알루론산의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing hyaluronic acid having a low decomposition rate in the body, and a composition for preventing adhesion, which includes hyaluronic acid prepared by the above method, and specifically, a straptococcus disgalactia 9103 strain (KCTC11818BP) is used as a carbon source and
  • the present invention relates to a method for preparing hyaluronic acid having a low decomposition rate in a body including culturing in a medium containing a nitrogen source, and a composition for preventing adhesion of hyaluronic acid prepared by the above method.
  • Hyaluronic acid (HA), Hyaluronan, (C14H20NNa011) n (n> 1000)) is a macromolecule present in the body and is a polysaccharide called glycosaminoglycan.
  • the structure is a structure in which D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine are repeatedly connected by -1,3 and -1,4 bonds. It is a water-soluble substance, has a very high viscosity, high elasticity, and has a wide range of linear polysaccharides ranging from 1, 000-10, 000, 000 Da (daltons).
  • hyaluronic acid Since hyaluronic acid has a strong moisturizing effect, it has a strong lubricating function under physical friction, and has a very desirable advantage in physical properties such as protection against bacteria and invasion. Very much.
  • biological tissue extraction method or microbial culture method are basically used, but recently, due to many disadvantages such as virus invasion, impurities, and inflammatory reaction, it is possible to control molecular weight and productivity rather than chicken crest extraction method and to obtain high quality raw materials.
  • Possible microbial culture production methods are the trend. In particular, the development trend is determined according to the molecular weight range of hyaluronic acid produced by being controlled by microbial culture.
  • Ultra-low molecular weight hyaluronic acid below 100,000 Da is mainly used for food and cosmetics.
  • the low molecular weight hyaluronic acid with an average molecular weight of 1 million Da is also used as an eye drop material or derivative development target, and the average molecular weight of 3 million to 4 million Da and hyaluronic acid are highly useful as a raw material for injecting knee joints.
  • its use as an ophthalmic surgical aid is increasing, and as the ultra-high molecular weight in the body, it is attracting attention as a raw material of anti-adhesion agent.
  • Adhesion is usually found in the healing process of inflammation, which is caused by entanglement of granules or scars with each other or large amounts of precipitated fibrin. In general, adhesions occur at a frequency of 67 ⁇ 93% after open surgery, and some of them are spontaneously decomposed, but in most cases, adhesions exist even after wound healing (Eur. J. Surg 1997) , Suppl 577, 32-39). In order to prevent this, the development of anti-adhesion agents that physically and chemically block the occurrence of adhesions with surrounding tissues by covering the wound after surgery or pharmacological action, etc. is being developed worldwide.
  • anti-adhesion agents are made by using various polymer materials, and alginic acid, CMC, and hyaluronic acid are mainly used, and hyaluronic acid is a hyaluronic acid crosslinked material that has increased molecular weight, viscosity, or elasticity by using low molecular weight hyaluronic acid. have.
  • the anti-adhesion agent is sold as a film type product, but it is difficult to spread the thin film and it is difficult to use one product in different parts. It was developed as a gel-type product, and it is used to squeeze it with a syringe on the surgical site.
  • the polymer material is used because it can be lowered, and in the case of hyaluronic acid, most crosslinked ones are used.
  • the most problematic in using the crosslinked hyaluronic acid as a raw material of the anti-adhesion agent is the compound used for crosslinking, and the compound used for crosslinking even after hyaluronic acid is decomposed as an in vivo material is present in the body. There is a possibility of staying and causing side effects.
  • Korean Patent No. 10-1074467 prepared the anti-adhesion agent by mixing L-arginine and hyaluronic acid, Korean Patent No. 10-0374666 and In Korean Unexamined Patent Application Publication No. 10-2011-0114810, hyaluronic acid gel for preventing adhesion was made using sodium hyaluronate, which is a kind of hyaluronic acid salt.
  • Korean Patent Publication No. 10-2009- 0012439 used a hyaluronic acid cross-linked by mixing a hyaluronic acid and a crosslinking agent.
  • US6630167 prepared an anti-adhesion agent by mixing a hyaluronic acid aqueous solution with a crosslinking agent solution. Therefore, in the domestic and foreign conventional technology, do not crosslink or The use of unaltered hyaluronic acid alone has not been found, and the use of hyaluronic acid alone is negative in most domestic and foreign prior arts. This was mostly.
  • the present inventors have a long retention period in the body, and while searching for a method of developing hyaluronic acid that is effective in preventing adhesion, the hyaluronic acid prepared using the Straptococcus disgalactia 9103 strain has an excellent anti-adhesion effect due to the slow decomposition rate in the body. Discovered to complete the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing hyaluronic acid having a low degradation rate in the body, comprising culturing the S. aureus 9103 strain (KCTC11818BP) in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.
  • KCTC11818BP S. aureus 9103 strain
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing adhesion, which is prepared by the method for preparing hyaluronic acid of the present invention and which has no crosslinked hyaluronic acid as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing adhesion, which is prepared by the method for preparing hyaluronic acid of the present invention and comprises administering uncrosslinked hyaluronic acid to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a hyaluronic acid prepared by the method for producing hyaluronic acid of the present invention and used for preventing crosslinking that is not crosslinked.
  • the present invention provides a method for producing hyaluronic acid having a low degradation rate in the body comprising culturing Streptococcus disgalactia 9103 strain (KCTC11818BP) in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.
  • KCTC11818BP Streptococcus disgalactia 9103 strain
  • the present invention is prepared by a method for producing hyaluronic acid, and provides an anti-adhesion composition comprising a non-crosslinked hyaluronic acid as an active ingredient.
  • the method for producing hyaluronic acid of the present invention It is to provide an anti-adhesion method comprising the step of administering the hyaluronic acid prepared and not cross-linked to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a hyaluronic acid prepared by the method for preparing hyaluronic acid of the present invention and used for preventing crosslinking without crosslinking.
  • the present invention provides a method for producing hyaluronic acid having a low degradation rate in a body comprising culturing Streptococcus disgalactia 9103 strain (KCTC11818BP) in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.
  • KCTC11818BP Streptococcus disgalactia 9103 strain
  • step (b) may be a manufacturing method comprising the step of recovering hyaluronic acid from the culture cultured in step (a).
  • the Streptococcus disgalactia 9103 strain of the present invention isolates a strain that produces microbial hyaluronic acid isolated from bovine feces, followed by mutation. It does not produce hyaluronic acid degrading enzymes, and it is a microorganism that is selected to be non-hemolytic.
  • Streptococcus disgalactia ID9103 strain of the present invention can be cultured by a conventional culture method of Streptococcus microorganisms.
  • the medium may be a medium including a carbon source and a nitrogen source, and may further include amino acids or metal ions.
  • the carbon source of the present invention may be any carbon source used for culturing known microorganisms, and preferably, may be selected from the group consisting of glucose, fructose, maltose, yudan, galactose, glycerol and combinations thereof. More preferably, it may be maltose.
  • the nitrogen source of the present invention may be any nitrogen source used for culturing known microorganisms, preferably yeast extract, casein peptone, casein acid digest, casein enzyme digest, bactopeptone, kaziton, neopeptone and combinations thereof It may be selected from the group consisting of. More preferably, it may be a casein enzyme digest.
  • the casein enzymatic digestion refers to the enzymatic digestion of casein, for example, tryptone, tryptic tee, trypton extract, BB biosepteptone, diphcocazeingest, victocaziton, bibitriptase kinase peptone, bactote Lipton, Vitek Trypton, Engamine A, Engamine A, Engamine AK, Engamine L Concentration, Eng Case, Eng Case M, Eng Case M, Eng Case Plus, Engage T, Peptase, Trip Ton E. sp., Pancreatic hydrolysis caseincodex, pancreatic hydrolysis casein, enzymatic digestion caseincosher, trypton v.
  • the medium of the present invention may further comprise amino acids or metal ions.
  • the amino acid is not limited in kind, and preferably may be selected from the group consisting of glutamine, lysine, cysteine, arginine, methionine, aspartic acid, glycine, and combinations thereof. More preferably arginine.
  • the metal ion is not limited in its kind, but may be preferably selected from the group consisting of sodium potassium, calcium, magnesium, iron, zinc, manganese and mixtures thereof, more preferably zinc. have.
  • the medium composition of the present invention may be one containing a casein enzyme decomposition product as a nitrogen source, arginine as an amino acid, and zinc as a metal ion.
  • a casein enzyme decomposition product as a nitrogen source
  • arginine as an amino acid
  • zinc as a metal ion.
  • the casein enzyme digest and the concentration of arginine and zinc are not particularly limited, the casein enzyme digest is included at a concentration of 0.53 ⁇ 4 (w / v) to 3% (w / v), arginine is (0.01) % (w / v) to 0.6% (w / v), zinc is preferably included at a concentration of (0.01)% (w / v) to 0.1% (w / v).
  • the culture method of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, batch, fed-batch, or continuous culture.
  • the culture method of the present invention may preferably be a fed-batch culture method.
  • the medium component fed in a fed-batch may be a nitrogen source or a nitrogen source and a carbon source, the nitrogen source may be a casein enzyme digest, and the carbon source may be more preferably maltose.
  • the step of recovering hyaluronic acid in the production method of the present invention may be by a method for separating the active substance from a known microbial culture, specifically, the sterilization process, neutralization process or crystallization process, chromatography or By centrifugation Endotoxin, proteins, nucleic acids, metals, and the like, and removal and purification of impurities and the like.
  • the hyaluronic acid prepared by the hyaluronic acid production method of the present invention is not limited thereto, but preferably may be a high molecular hyaluronic acid having an average molecular weight of 3.5 million Da to 10 million Da.
  • all the average molecular weights described in this invention are a weight average molecular weight.
  • the production method of the present invention can produce a high yield of hyaluronic acid of a polymer having a limited average molecular weight.
  • hyaluronic acid having a molecular weight of 4.43 million Da to 5.59 million Da and an amount of production of 8.07 g / L to 9.42 g / L was manufactured by the method of the present invention, thereby obtaining a high amount of hyaluronic acid having a high yield and molecular weight ( See Table 1).
  • the low degradation rate of the body of the present invention refers to a slow rate of decomposition of hyaluronic acid after administration to the body.
  • the experiment was carried out in the body degradation rate of hyaluronic acid produced by the production method of the present invention.
  • the hyaluronic acid enzyme that decomposes hyaluronic acid in the body is treated with hyaluronic acid to measure the viscosity by molecular weight (3 million Da, 4 million Da, 6 million Da) over time.
  • the value (cP) was measured.
  • the hyaluronic acid having a molecular weight of 4 million Da and 6 million Da was lower in viscosity decrease over time than the hyaluronic acid of 3 million Da.
  • the low viscosity reduction rate means that the decomposition of hyaluronic acid proceeds slowly in the body to maintain the viscosity of hyaluronic acid at a constant level. Accordingly, hyaluronic acid having a molecular weight of 4 million Da or more manufactured by the method of the present invention may have a low decomposition rate in the body, and preferably, hyaluronic acid having a molecular weight of 4 million Da to 6 million Da is an anti-adhesion effect. May be excellent.
  • Hyaluronic acid prepared by the production method of the present invention may have a molecular weight of 3.5 million Da to 10 million Da, preferably 4 million Da to 10 million Da, more preferably 4 million Da to 6 million Da Hyaluronic acid having a molecular weight of less than 3.5 million Da Acid is difficult to expect the anti-adhesion effect due to the fast decomposition rate in the body, it is difficult to manufacture hyaluronic acid having a molecular weight of 10 million Da or more. Therefore, hyaluronic acid prepared by the production method of the present invention has a low decomposition rate in the body.
  • the anti-adhesion composition comprising the hyaluronic acid as an active ingredient is a slow decomposition rate in the body, it is excellent in the anti-adhesion effect.
  • the present invention is prepared by the production method of the present invention, and provides an anti-adhesion composition comprising non-crosslinked hyaluronic acid as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing adhesion, which is prepared by the production method of the present invention and comprises the step of administering uncrosslinked hyaluronic acid to a subject in need thereof.
  • the present invention provides hyaluronic acid prepared by the method for preparing hyaluronic acid of the present invention and used for preventing crosslinking that is not crosslinked.
  • the present invention also provides an anti-adhesion agent comprising the hyaluronic acid of the present invention as an active ingredient.
  • the anti-adhesion agent of the present invention is characterized by comprising the hyaluronic acid of the present invention, and may further include a saline solution, distilled water, a complete solution of sodium phosphate.
  • the hyaluronic acid of the present invention can be used as an anti-adhesion agent because it shows a lubricating effect for preventing time-bound adhesion even in the state of not being crosslinked due to a slow decomposition rate in the body compared to the conventional hyaluronic acid.
  • the non-crosslinked hyaluronic acid refers to hyaluronic acid prepared by the production method of the present invention that does not contain a chemical crosslinking agent, a chemical modifier, and a cationic polymer forming a complex with the hyaluronic acid.
  • the chemical crosslinking agent is a compound that reacts with hyaluronic acid to form a three-dimensional network structure.
  • a polyvalent epoxy compound such as polyglycidyl ether, a divinyl sulfone, formaldehyde, phosphorus oxychloride, a carbodiimide compound and an amino acid ester And a combination of a carbodiimide compound and a dihydrazide compound.
  • the chemical modifier is a compound that forms a covalent bond with a carboxyl group, a hydroxyl group, or a setamido group of hyaluronic acid, a combination of acetic anhydride and concentrated sulfuric acid, a combination of anhydrous trifluoroacetic acid and an organic acid, and an alkyl iodine compound. It may be one or more compounds selected from the group consisting of.
  • the cationic polymer that forms a complex with the hyaluronic acid is a polymer that forms a complex by ionic bonding between a carboxyl group of the hyaluronic acid and an amino group or an imino group of the polymer compound, chitosan, polylysine, polyvinylpyridine, polyethylene It may be one or more cationic polymer selected from the group consisting of imine and polydimethylaminoethyl methacrylate.
  • the subject to which the anti-adhesion composition is administered may be an animal, preferably an animal including a mammal, particularly a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from an animal.
  • the subject may be a patient in need of treatment.
  • administration can mean treatment by applying, spraying, or attaching an anti-adhesion agent containing hyaluronic acid as an active ingredient for the purpose of preventing adhesion to an object in need thereof.
  • the anti-adhesion composition of the present invention can be administered anywhere in the body, but in dog abdominal surgery, gynecological surgery and thoracotomy, various magnetism, tendon membrane, cranial nerve, eye and eye, orthopedic surgery in the abdominal cavity and thoracic cavity, and tendons, ligaments and nerve It may be administered to the membrane in a surgical operation.
  • the anti-adhesion composition of the present invention is not limited thereto, and may be used in the form of a gel, a film, and a film.
  • the present invention provides a method for preparing hyaluronic acid having a low decomposition rate in the body and a composition for preventing adhesion of hyaluronic acid prepared by the above method.
  • Hyaluronic acid produced by the production method of the present invention is a polymer hyaluronic acid of 3.5 million Da to 10 million Da, it is excellent in the prevention of adhesion due to the slow decomposition rate in the body.
  • the anti-adhesion composition of the present invention comprising hyaluronic acid prepared by the production method of the present invention has an excellent anti-adhesion effect, and by using an uncrosslinked hyaluronic acid, the anti-adhesion composition containing an existing crosslinking agent and a compound has It is effective because it can improve the problems and problems of the existing hyaluronic acid.
  • Figure 1 is a photograph of the state opened to see the difference in anti-adhesion efficacy according to the molecular weight.
  • FIG. 2 is a view showing a decomposition rate of hyaluronic acid over time All.
  • Y axis viscosity (cP)
  • X axis min (in)
  • SD rats (female, SPF, Orient Bio Co., Ltd.) were anesthetized by inhalation and continued to be anesthetized during surgery.
  • the limbs were well fixed on the operating table, the abdominal hair was removed well with a razor, disinfectant was applied, and scissors were used to open the abdomen.
  • the cecals were pulled out roughly: the gauze was used to scar the blood so that the gauze was buried, and the abdominal wall where the cecum was located also created the conditions for the cecal and peritoneal walls and adhesions.
  • the sample was treated, sutured, bred for two weeks, and then opened to confirm adhesion.
  • the sample was used by dissolving hyaluronic acid with an average molecular weight of 3 million Da and hyaluronic acid of 4 million Da and 6 million Da in a complete sodium phosphate solution, and maintained aseptic condition.
  • This culture medium determination test for optimal production of hyaluronic acid was carried out in a 7.5L fermentation tank under 35L culture conditions.
  • Medium composition was glucose 6) (w / v), yeast axle 0.5% (w / v), casein peptone 2% (w / v), glutamine 0.06% (w / v), sodium gluconate 0.1 (w / v) 0.02% (w / v), 0.05% (w / v) magnesium sulfate, 0.25% (w / v) dipotassium dihydrogen phosphate, 0.5% (w / v) sodium chloride, 0.5% (w / v) sodium acetate , Ferric chloride 0.007 (w / v), ammonium molybdenum 0.05 (w / v), and culture conditions were based on pH 7.0 and 34 conditions.
  • Hyaluronic acid concentration present in the culture medium in the present invention is carbazole method (T. Bitter, Anal. Biochem., 1962, 4, 330-334) and turbidity analysis (S. Jung-Min, Carbohyd. Polym., 2009, 78, 633-634).
  • the average molecular weight of hyaluronic acid was determined by gel filtration chromatography (Narlin B. Beaty et al, Anal. Biochem., 1985, 147, 387-395). The analysis conditions are as follows. The column used Toyo Soda TSK gel G6000 P3 ⁇ 4 L and the mobile phase is 150mM NaCl, 3mM Na2HP04 (pH7.0), 0.02% NaN 2 . Detect ion is a refrative index detector (Shodex;
  • the concentration of hyaluronic acid produced under the culture conditions was 7 g / L, the molecular weight was measured to be 3 million Da.
  • Arginine was added in place of glutamine, which is the basal medium, to show excellent results of more than 8.53 g / L and about 4.83 million Da in the production and molecular weight of hyaluronic acid.
  • Carbon sources also play an important role in microbial growth and metabolism, as well as being used as precursors of hyaluronic acid. Therefore, it was determined that by changing the type of carbon source can affect the production of 4 million to 6 million Da hyaluronic acid.
  • Metal ions are known to play various roles in the expression of DNA or the activity of enzymes in microbial cells. Therefore, various metal ions were tested in anticipation of affecting the activation and expression of enzymes or DNA involved in the production of hyaluronic acid.
  • the zinc-added group produced 9.42 g / L and about 5.59 million Da molecular weight hyaluronic acid, showing excellent results.
  • Table 1 The zinc-added group produced 9.42 g / L and about 5.59 million Da molecular weight hyaluronic acid, showing excellent results.
  • the viscosity reduction rate (27.5%) of the hyaluronic acid of 3 million Da was significantly higher than that of 4 million Da and 6 million Da of hyaluronic acid.
  • 4 million Da and 6 million Da hyaluronic acid compared to 3 million Da hyaluronic acid is about 3 to 4 times the viscosity decrease rate is lower than the rate of decomposition in the body can be seen, accordingly constant viscosity in the body It was confirmed to maintain the level.
  • hyaluronic acid having a molecular weight of 4 million Da or more produced by the production method of the present invention has a low decomposition rate in the body, and preferably, hyaluronic acid having a molecular weight of 4 million Da to 6 million Da has an excellent anti-adhesion effect. .
  • the present invention provides a method for preparing hyaluronic acid having a low decomposition rate in the body and a composition for preventing adhesion, which includes hyaluronic acid prepared by the above method.
  • Hyaluronic acid produced by the production method of the present invention is a polymer hyaluronic acid of 3.5 million Da to 10 million Da, it is excellent in the prevention of adhesion due to the slow decomposition rate in the body.
  • the anti-adhesion composition of the present invention comprising hyaluronic acid prepared by the production method of the present invention has a haze prevention adhesion effect
  • the use of hyaluronic acid, which is not crosslinked, can improve the problems of the anti-adhesion composition containing the existing crosslinking agent and the compound and the problems of the existing hyaluronic acid, thereby increasing industrial applicability.
  • the International Depositary has deposited the microorganisms indicated in item I of E and has received a request for transfer of the EFT to a deposit under the Budapest Treaty.

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Abstract

본 발명은 체내 저분해 속도를 갖는 히알루론산의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 스트랩토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가지는 히알루론 산의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물을 제공한다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산은 350만 Da 내지 1000만 Da의 고분자 히알루론산으로, 체내 분해 속도가 느려 유착 방지효과가 탁월하다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 본 발명의 유착방지용 조성물은 가교하지 않은 히알루론산을 사용하므로써, 기존의 가교제 및 화합물을 포함하는 유착방지용 조성물이 가진 문제점 및 기존의 히알루론산이 가진 문제점을 개선할 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭]
히알루론산의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물
【기술분야】
본 출원은 2013년 03월 20일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0029876 호 (출원번호)를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이 다.
본 발명은 체내 저분해 속도를 갖는 히알루론산의 제조방법 및 상기 방법으 로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로， 상세하게는 스트랩토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함 하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가지는 히알루론산의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물에 대 한 것이다.
【배경기술】
히알루론산 (Hyaluronic acid(HA), Hyaluronan, (C14H20NNa011)n (n>1000))은 생체에 존재하는 고분자로써 glycosaminoglycan이라는 다당류이다. 그 구조는 D- glucuronic acid와 N-acetylglucosamine이 -1,3 과 -1,4 결합으로 반복적으로 연결 된 구조를 띠고 있다. 수용성 물질이며 점도가 매우 높고 고탄성의 특성을 가지고 있으며 분자량은 1， 000-10, 000 ,000 Da(daltons)에 이르는 광범위한 직쇄의 다당류 이다.
하알루론산은 보습효과가 강하여 물리적 마찰 상태에서 강력한 윤활 작용 기 능이 매우 우수하고 세균 등의 침입에 대한 보호 효과 등의 효능과 물성에 있어서 매우 바람직한 장점을 보유하고 있기 때문에 치료 영역에 필요한 적용증이 매우 많 다. 이러한 히알루론산을 개발하기 위해서는 기본적으로 생체 조직 추출법이나 미 생물 배양법이 사용되지만 최근에는 바이러스 침입， 불순물， 염증 반웅 등 많은 단 점으로 인해서 닭 벼슬 추출법보다는 분자량과 생산성을 조절할 수 있고 고품질의 원료 수득이 가능한 미생물 배양생산법이 대세를 이루고 있다. 특히 미생물 배양에 의해 조절되어 생산된 히알루론산의 분자량 범위에 따라서 개발 용도가 결정되는 것이 최근의 추세이다. 10만 Da 이하의 초저분자 히알루론산은 주로 식품이나 화장 2 품의 용도로 사용되며 평균분자량 100만 Da의 저분자 히알루론산은 점안제 원료나 유도체 개발 대상으로 활용되기도 하며 평균분자량 300만~400만 Da와 히알루론산은 슬관절 주사제 원료로 활용 가치가 높은 편이다. 그 외에도 안과수술보조제로써의 사용도 증가하고 있으며 , 신체 내의 초고분자로써 유착방지제의 원료로 각광받고 있다.
유착 (adhesion)은 보통 염증의 치유 과정에서 볼 수 있는 것으로， 육아조직 이나 반흔 (scar)을 형성할 때 서로 엉겨 붙거나， 다량으로 석출 (析出)되는 섬유소 가 엉겨 이 같은 현상을 일으킨다. 일반적으로 개복수술 후 67~93%정도의 빈도로 유착이 발생하며 이 중 일부는 자발적으로 분해되기도 하지만， 대부분의 경우 상처 치유 후에도 유착이 존재하여 각종 후유증을 유발하기도 한다 (Eur. J. Surg 1997, Suppl 577, 32-39). 이를 방지하기 위하여 수술 후의 상처 부위를 감싸 덮어주거나 약물학적 작용 등으로 주변조직과의 유착 발생을 물리， 화학적으로 차단하는 유착 방지제에 대한 개발이 세계적으로 진행되고 있다. 이러한 유착방지제는 여러 고분 자 물질들을 이용하여 만들어지고 있는데， 알긴산， CMC 및 히알루론산이 주로 사용 되며， 히알루론산은 저분자 히알루론산을 이용하여 분자량이나 점도 또는 탄성 등 을 증대시킨 히알루론산 가교 물질이 사용되고 있다. 일반적으로 유착방지제는 필 름 형태의 제품으로 판매되고 있으나 얇은 필름을 펴는 것이 쉽지 않고 한 개의 제 품을 다른 부위에 나누어 사용하는 것이 어려웠다. 이에 따라 개발된 것이 젤 형태 의 제품이며 수술부위에 주사기로 짜서 사용하도톡 되어 있다. 젤 제품의 특성상 홀러내릴 수 있기 때문에 고분자 물질이 사용되어지며， 히알루론산의 경우 가교된 것을 대부분 사용하였다. 상기와 같이 가교된 히알루론산을 유착방지제의 원료로 사용함에 있어서 가장 문제가 될 수 있는 것이 가교에 사용되는 화합물이며， 히알 루론산이 생체 내 물질로써 분해가 된 후에도 가교에 사용된 화합물이 체내에 체류 하여 부작용을 일으킬 수 있는 가능성이 있다.
히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물에 대한 국내 주요 특허 내용들을 보면, 대한민국 등록특허 제 10-1074467호는 L-아르기닌과 히알루론산을 흔합하여 유착 방지제를 제조하였고, 대한민국 등록특허 제 10-0374666호 및 대한민국 공개특 허 제 10-2011-0114810호에서는 히알루론산 염의 일종인 히알루론산 나트륨을 사용 하여 유착방지용 히알루론산 겔을 만들었다. 또한 대한민국 공개특허 제 10-2009- 0012439호에서는 히알루론산과 가교제를 흔합하여 가교된 히알루론산을 사용하였으 며， 외국의 경우, US6630167은 히알루론산 수용액을 가교제 수용액에 흔합하여 유 착방지제를 제조하였다. 따라서 국내외 종래의 기술에서 가교하지 않거나 구조를 변형하지 않은 히알루론산을 단독으로 사용한 것은 발견되지 않았으며， 히알루론산 을 사용하는 것에 대하여 국내외 종래 기술에서는 대부분 히알루론산이 체내에서 분해가 쉬워 체류시간이 짧아 가교하지 않은 히알루론산만을 이용하는 것에 대하여 부정적인 시각이 대부분이었다.
따라서， 가교하지 않고 체내에서 체류기간이 긴 히알루론산의 개발 및 상기 히알루론산을 사용해 제조한 유착 방지융 조성물의 개발이 시급한 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 체내 체류기간이 길며， 유착방지에 효과적인 히알루론산 을 개발하는 방법을 탐색하던 중 스트랩토코커스 디스갈락티애 9103 균주를 이용해 제조한 히알루론산이 체내 분해 속도가 느려 유착방지효과가 뛰어난 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 스트랩토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가지는 히알루론산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조되고， 가교 되지 않은 히알루론산을 유효성분으로 하는 유착방지용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조되고， 가교 되지 않은 히알루론산을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유착 방지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조되고， 가교 되지 않은 유착방지에 사용되는 히알루론산을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 스트렙토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가지는 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 히알루론산 제조방법으 로 제조되고， 가교되지 않은 히알루론산을 유효성분으로 하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 히알루론산 제조방법으 로 제조되고 가교되지 않은 히알루론산을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계 를 포함하는 유착방지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조되고, 가교되지 않은 유착방지에 사용되는 히알루론산을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 스트렙토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가 지는 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 본 발명의 제조방법은
(a) 스트랩토코커스 디스갈락티애 9130 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소 원이 포함된 배지에서 배양하는 단계 ; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배양물로부터 히알루론산을 회수하는 단계 를 포함하는 제조방법일 수 있다. 상기 본 발명의 스트렙토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (기탁번호 ： KCTC- 11818BP, 출원번호: 10— 2011-0100364)는 소의 분변으로부터 분리된 미생물 증 히알 루론산을 생산하는 균주를 분리한 후, 돌연변이를 유발하여 히알루론산 분해효소를 생산하지 않으며 비용혈성인 것을 선별한 미생물이다.
본 발명의 스트렙토코커스 디스갈락티애 ID9103 균주는 통상적인 스트렙토코 커스 속 미생물의 배양법에 의해 배양할 수 있다.
상기 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지일 수 있으며, 아미노산 또는 금속이온이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 탄소원은 공지의 미생물 배양에 사용되는 탄소원이면 어떠한 것이 든 가능하며, 바람직하게는 포도당, 과당， 엿당， 유단， 갈락토스, 글리세롤 및 이 들의 흔합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 엿 당일 수 있다.
본 발명의 질소원은 공지의 미생물 배양에 사용되는 질소원이면 어떠한 것이 든 가능하며， 바람직하게는 효모엑스， 카제인펩톤, 카제인 산 분해물， 카제인 효소 분해물， 박토펩톤， 카지톤， 네오펩톤 및 이들의 흔합물로 이루어진 군으로부터 선 택되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 카제인 효소 분해물일 수 있다. 상기 카제인 효소 분해물은 카제인을 효소 분해한 것을 말하며， 예를 들어 트립톤, 트립톤티， 트립톤엑스, 비비엘바이오세이트펩톤， 디프코카제인다이제스트, 빅토카지톤， 비비엘트립티카아제펩톤, 박토트립톤, 바이텍트립톤, 엔지아민에이， 엔지아민에이에스， 엔지아민이케이씨， 엔지아민엘컨센트레이션, 엔지케이스, 엔지 케이스엠, 엔지케이스엠이， 엔지케이스플러스， 엔지케이스티티, 펩티카아제, 트립 톤유에스피, 췌액분해카제인코덱스， 췌액분해카제인， 효소분해카제인코셔， 트립톤 브이일 수 있다.
본 발명의 배지는 아미노산 또는 금속이온을 추가로 포함할 수 있다.
상기 아미노산은 그 종류에 제한이 없으며， 바람직하게는 글루타민， 리신, 시스텐인, 아르기닌, 메치오닌 , 아스파르트산 , 글리신 및 이들의 흔합물로 이루어 진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 아르기닌 일 수 있다.
또한 상기 금속이온은 그 종류에 제한이 없으나 바람직하게는 나트륨 칼륨, 칼슘， 마그네슴, 철， 아연， 망간 및 이들의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 것 일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 아연일 수 있다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 배지 조성물은 질소원으로서 카제인 효소 분해 물 및 아미노산으로서 아르기닌, 금속이온으로서 아연을 포함하는 것일 수 있다. 카제인 효소 분해물과 아르기닌 및 아연을 함께 첨가한 배양 배지에서 배양하는 경 우 본 발명 균주에 의한 히알루론산 생산은 분자량을 한정할 수 있으며 이 분자량 에서 가장 좋은 유착방지 효능을 나타내는 특징이 있다.
상기 카제인 효소 분해물 및 아르기닌 및 아연의 농도는 특별히 제한되지 아 니하며, 카제인 효소 분해물은 0.5¾(w/v) 내지 3%(w/v)의 농도로 포함되며， 아르기 닌은 (0.01)%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 아연은 (0.01)%(w/v) 내지 0.1%(w/v)의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법은 특별히 한정되지 않으며， 예를 들어 회분식, 유가식, 연속식 배양일 수 있다. 본 발명의 배양 방법은 바람직하게는 유가식 배양 방법일 수 있다. 상기 유가식 배양에서 유가식으로 공급되는 배지 구성성분은 질소원 또는 질소원 및 탄소원일 수 있으며， 상기 질소원은 카제인 효소 분해물이고， 상기 탄소 원은 엿당인 것이 더욱 바람직할 수 있다. 본 발명의 제조방법에서 히알루론산을 회수하는 단계는 공지의 미생물 배양 물로부터 유효물질을 분리하는 방법에 의할 수 있으며， 구체적으로， 여과 등에 의 한 제균 공정， 중화 공정아나 결정화 공정， 크로마토그래피나 원심 분리 등에 의한 엔도톡신, 단백질, 핵산, 금속 등와 불순물 등의 제거 및 정제 공정 등을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조된 히알루론산은 이에 한정되 지는 않으나， 바람직하게는 350만 Da 내지 1000만 Da의 평균분자량을 가지는 고분 자 히알루론산일 수 있다. 더욱 바람직하게는 400만 Da 내지 600만 Da의 평균 분자 량, 400만 Da 내지 800만 Da의 평균 분자량 및 400만 Da 내지 1000만 Da의 평균분 자량으로 이루어진 평균 분자량 범위군에서 선택된 하나의 범위를 갖는 고분자 히 알루론산 일 수 있다. 또한 본 발명에 기재된 평균분자량은 모두 중량 평균 분자량 (weight average molecul r weight)이다.
또한 본 발명의 제조방법은 평균분자량을 한정한 고분자의 히알루론산을 높 은 수율로 생산할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 제조방법으로 분자량이 432만 Da 내지 598만 Da이고 생산량이 8.07g/L 내지 9.42g/L인 히알루론산을 제조하여 생산량과 분자량이 높은 히알루론산을 얻었다 (표 1 참조). 한편 본 발명의 체내 저분해 속도는 히알루론산이 체내에 투여된 후 분해되 는 속도가 느린 것을 말한다. ,
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 제조 방법으로 생산된 히알루론산의 체 내 분해 속도 바교 실험을 하였다. 체내 분해 속도 비교를 위해 체내에서 히알루론 산을 분해하는 히알루로니다아제 (hyaluronidase) 효소를 히알루론산에 처리하여 시 간 경과에 따른 분자량 별 (300만 Da, 400만 Da, 600만 Da) 점도 측정값 (cP)을 측정 하였다. 그 결과 400만 Da 및 600만 Da의 분자량을 가진 히알루론산이 300만 Da의 히알루론산에 비해 시간 경과에 따른 점도 감소율이 낮은 것으로 나타났다. 점도 감소율이 낮은 것은 체내에서 히알루론산의 분해가 느리게 진행되어 히알루론산의 점도를 일정 수준으로 유지할 수 있는 것을 말한다. 이에 따라 본 발명의 제조방법 으로 제조된 400만 Da 이상의 분자량을 가진 히알루론산은 체내 저분해 속도를 가 질 수 있으며, 바람직하게는 400만 Da 내지 600만 Da의 분자량을 갖는 히알루론산 이 유착방지 효과가 뛰어난 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산은 분자량이 350만 Da 내지 1000 만 Da일 수 있으며， 바ᅳ람작하게는 400만 Da 내지 1000만 Da이고， 더욱 바람직하게 는 400만 Da 내지 600만 Da일 수 있는데， 350만 Da 이하의 분자량을 갖는 히알루론 산은 체내 분해 속도가 빨라 유착방지효과를 기대하기 어려우며, 1000만 Da 이상의 분자량을 갖는 히알루론산은 제조가 어렵다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산은 체내 저분해 속도를 갖 는다.
또한 상기 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 유착방지용 조성물은 체내에 서 분해되는 속도가 느리므로， 유착 방지효과가 탁월하다.
본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조되고， 가교되지 않은 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조되고, 가교되지 않은 히알루론산을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유착방지 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 히알루론산 제조방법으로 제조되고, 가교되지 않은 유 착방지에 사용되는 히알루론산을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 유착방지제 를 제공한다. 본 발명의 유착방지제는 본 발명의 히알루론산을 포함하는 것을 특징 으로 하며， 추가로 생리식염수， 증류수， 인산나트륨 완층용액 등을 포함할 수 있 다.
본 발명의 히알루론산은 기존의 히알루론산에 비하여 체내에서 분해속도가 늦어 가교되지 아니한 상태로도 층분한 시간 유착방지를 위한 윤활 효과를 나타내 므로 유착방지제로 사용이 가능하다.
상기 가교되지 않은 히알루론산은 화학적 가교제， 화학적 변성제 및 히알루 론산과 착물을 형성하는 양이온성 고분자가 포함되지 않는 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산을 말한다.
상기 화학적 가교제는 히알루론산과 반웅하여 3 차원 네트워크 구조를 형성 하는 화합물로, 폴리글리시딜 에테르 등의 다가 에폭시 화합물, 디비닐 술폰， 포름 알데히드， 옥시염화인， 카르보디이미드 화합물과 아미노산 에스테르의 배합물, 및 카르보디이미드 화합물과 디히드라지드 화합물의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다.
상기 화학적 변성제는， 히알루론산의 카르복실기， 히드록실기 또는 세트아미 도기와 반웅하여 공유 결합을 형성하는 화합물로， 무수 아세트산과 진한 황산의 배 합물， 무수 트리플루오로아세트산과 유기산의 배합물 및 알킬 요오드 화합물로 이 루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다. 상기 히알루론산과 착물을 형성하는 양이온성 고분자는， 히알루론산의 카르 복실기와 고분자 화합물의 아미노기 또는 이미노기의 사이에서 이온 결합을 통해 착물올 형성하는 고분자로， 키토산, 폴리라이신， 폴리비닐피리딘， 폴리에틸렌이민 및 폴리디메틸아미노에틸메타크릴레이트으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 양이온성 고분자일 수 있다.
본 발명에서 유착방지용 조성물이 투여되는 개체 (Subject)란 동물, 바람직하 게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (patient)일 수 있다. 본 발명에서 투여는 유착방지를 목적으로 히알루론산을 유효성분으로 하는 유착방지제를 이를 필요로 하는 개체에 도포， 살포 또는 부착하는 것 등으로 처리 하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 유착방지용 조성물은 신체 내 어느 곳에나 투여될 수 있으나， 개 복술， 부인과 수술 및 개흉술에서 복강 및 흉강 내의 각종 자기， 건외막， 두개골， 신경 및 안구, 정형외과 수술에서 건과 인대 및 신경 외과 수술에서 막에 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 유착방지용 조성물은 이에 제한되지는 않으나， 겔, 필름 및 막의 형태로 사용될 수 있다.
【유리한 효과】
이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 체내 저분해 속도를 갖는 히알루론산의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물을 제 공한다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산은 350만 Da 내지 1000만 Da의 고분자 히알루론산으로， 체내 분해 속도가 느려 유착 방지효과가 탁월하다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 본 발명의 유착방지용 조성 물은 유착방지 효과가 탁월하며, 가교하지 않은 히알루론산을 사용하므로써, 기존 의 가교제 및 화합물을 포함한 유착방지용 조성물이 가진 문제점 및 기존의 히알루 론산이 가진 문제점을 개선할 수 있어 효과적이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 분자량에 따른 유착방지 효능 차이를 보기 위하여 개복을 한 상태의 사진이다.
도 2는 시간의 경과에 따른 히알루론산의 분해 속도 비교를 나타낸 도면이 다. (Y축: 점도 (cP), X축: 분 (i n))
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
분자량에 따른 유착방지 효과 실험
SD 랫트 (female, SPF, (주)오리엔트바이오)를 흡입식으로 마취를 하고， 수술 하는 동안 계속해사 마취가 되도록 하였다. 사지를 수술대 위에 잘 고정해 주고 복 부의 털을 면도기로 잘 제거한 후 소독약을 바른 후 가위를 이용하여 복부를 열어 주었다. 맹장을 꺼내 거친：거즈를 이용하여 혈흔이 거즈에 묻어날 정도로 상처를 내어 주고， 맹장이 자리한 위치의 복벽 또한 같은 방법으로 맹장과 내복막벽과 유 착이 일어나는 조건을 만들어 주었다. 시료를 처리하고 봉합하고 2주간 사육한 후 개복하여 유착여부를 확인하였다. 시료는 평균분자량 300만 Da의 히알루론산과 400 만 Da 및 600만 Da의 히알루론산을 인산 나트륨 완층용액에 녹여 사용하였고 무균 상태를 유지하였다.
300만 Da의 히알루론산을 이용하여 유착방지 효능을 확인한 결과 장과 복벽 사이에 유착이 발생함을 확인할 수 있었고， 400만 Da 이상에서는 유착을 발견할 수 없었다. 따라서 400만 Da 내지 600만 Da의 히알루론산에서 유착방지 효능이 있음을 확인하였다 (도 1).
<실시예 2>
고분자 히암루론산 생산을 뷔하 기본 배양 조건
-72의 냉동기에서 보관된 스트랩토코커스 디스갈락티애 ID9103 균주 배양액
4ml을 급속 해동시켜서 5.2% 브레인하트인퓨전 고체배지에 도말하여 37로 24시간 동안 배양한 후 가로세로 1cm2의 면적으로 생육된 콜로니를 잘라 내어 3%토드휴이 트 브로스 (Todd-Hewitt broth) 멸균 액체배지 (heart, infusion 0.31%, neopeptone 2%, dextropse 0.2%, NaCl 0.2%, Disodium phosphate 0.04%, sodium carbonate 0.25%； BD사， 미국) 40ml에 접종하였다. 37, 150rpm에서 진탕 배양한 40ml을 1차 종균배양액으로 사용하였다. 대수 증식기 단계인 6시간 배양 상태에서 무균적으로 1차 종균액을 3% 토드휴이트 브로 스 멸균 액체배지 (40ml, pH 7.8) 3개에 접종하였다. 배양 조건은 37, 150rpm으로 20시간 이상 무균적으로 배양함으로써 2차 종균배양액으로 사용하였다. 이때 종료 된 2차 종균 배양액은 6.40.2의 pH 상태를 유지하고 있으며 OEK600)는 0.350.05이 어야 한다. 2차 종균배양액 80ml을 본배양 배지에 접종하여 40시간 이상 배양함으 로써 배지조성에 따른 히알루론산의 생산성의 차이를 관찰하였고 추후 히알루론산 생산성 증대를 위한 조건을 결정하였다. 이상의 배양공정은 모든 실시예에서 동일 하게 적용되었다.
히알루론산을 최적으로 생산하기 위한 본 배양 배지 결정 시험은 7.5L 발효 조에서 35L 배양액 조건으로 실시하였다. 배지 조성은 포도당 6)(w/v), 효모액스 0.5%(w/v), 카제인 펩톤 2%(w/v), 글루타민 0.06%(w/v), 글루콘산나트륨 0.1 (w/v), 수산 0.02%(w/v), 황산마그네슘 0.15%(w/v), 인산일수소이칼륨 0.25%(w/v), 염화나트륨 0.5%(w/v), 아세트산나트륨 0.5%(w/v), 염화이철 0.007 (w/v) , 암모늄몰리브덴 0.05 (w/v) , 배양조건은 pH 7.0, 34의 조건을 기본으로 하였다.
본 발명에서 배양액 내에 존재하는 히알루론산 농도는 카바졸 방법 (T. Bitter, Anal. Biochem. , 1962, 4, 330-334)과 탁도 분석법 (S. Jung-Mi n, Carbohyd. Polym. , 2009， 78, 633-634)으로 이중으로 확인하였다.
히알루론산의 평균 분자량은 겔 여과 크로마토그라피 방법 (Narlin B. Beaty et al,Anal. Biochem. , 1985， 147， 387-395)으로 구하였다. 분석 조건은 다음과 같 다. 칼럼은 Toyo Soda TSK gelG6000P¾ L을 사용하였으며 이동상은 150mM NaCl , 3mM Na2HP04(pH7.0), 0.02% NaN2이다. Detect ion은 refrative index detector(Shodex;
Showa Denko K.K. 일본)를 사용하였고 표준물질은 polyethylene oxide를 분자량별 로 2mg/ml 농도로 조제하여 사용하였다.
상기 배양 조건으로 생산된 히알루론산의 농도는 7g/L이며， 분자량은 300만 Da인 것으로 측정되었다.
<실시예 3>
고분자 히암루론산 생산성 및 분자량
질소원은 미생물의 대사에 있어서 중요한 역할을 하고， 히알루론산의 생산에 도 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 기본적으로 사용되는 질소원인 펩톤류 를 포함하여 아미노산 종류의 변경을 통하여 얻고자 하는 400만 내지 600만 Da의 히알루론산의 생산에 기여할 수 있을 것이라 판단되었다.
각 펩톤류에 따라 히알루론산의 생산량과 분자량에 차이가 있음을 확인하였 고， 여러 펩톤류 중 기본 배지원인 카제인 (효소 가수분해물)이 8g/L를 상희하는 생 산량과 432만 Da의 분자량을 보이면서 가장 좋은 결과를 보여주었기에 이하 실시예 의 시험에서 카제인 (효소 가수분해물)을 동일하게 사용하였다.
기본 배지인 글루타민을 대신하여 아르기닌을 첨가한 군의 경우 히알루론산 의 생산량과 분자량에서 8.53g/L 이상， 약 483만 Da의 우수한 결과를 보여준다. 탄소원 역시 미생물 생장과 대사에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라， 히알루론 산의 전구체로써 사용되고 있다. 따라서 탄소원의 종류를 변경하여 400만 내지 600 만 Da 히알루론산의 생산에 영향을 줄 수 있을 것이라 판단되었다.
기본 배지인 포도당을 대신해 엿당을 첨가한 군의 경우 8.72g/L의 생산량과 약 552만 Da의 분자량 히알루론산을 생산하여 우수한 결과를 보여준다.
금속이온은 미생물의 세포내에서 DNA의 발현이나 효소의 활성 등에서 다양한 역할들을 수행하고 있다고 알려져 있다. 따라서 히알루론산을 생산함에 있어서 관 여하고 있는 효소나 DNA의 활성화 및 발현에 영향을 줄 것으로 기대하여 다양한 금 속 이온들을 시험하였다.
아연을 첨가한 군의 경우 9.42g/L의 생산량과 약 598만 Da의 분자량 히알루론 산을 생산하여 우수한 결과를 보여준다. 표 1
펩톤류 배지원 종류에 따른 히알루론산 생산성 및 분자량 차 0
Figure imgf000013_0001
<실시예 4>
히앞루론산의 체내 분해 속도 비교 심험
체내에서 히알루론산을 분해하는 효소인 히알루로니다아제 (hyaluronidase)를 이용해 300만 Da, 400만 Da 및 600만 Da의 히알루론산에 대한 분해 속도 비교 실험 을 실시하였다. 분해 속도 비교 실험은 점도 측정값 (cP)을 이용하여 히알루로니다 아제 흔합 전후의 점도 측정값 차이를 통해 히알루론산의 분해정도를 비교하였다. 점도측정은 Brookfield Digital Viscometer LVDV-1+ (Brookfield, USA)를 가지고 실시하였으며 spindle 31, 0.3RPM, 25에서 측정하였고, 그 결과는 각각 표 2와 도 2와 같다. 표 2
히알루론산의 분자량별 체내 분해속도 비교실험
Figure imgf000014_0001
표 2 및 도 2에서 300만 Da의 히알루론산은 점도 감소율 (27.5%)은 400만 Da 및 600만 Da의 히알루론산과 비교하여 크게 나타났다. 반면에 400만 Da 및 600만 Da 히알루론산은 300만 Da의 히알루론산에 비교하여 점도 감소율이 약 3배 내지 4 배 낮아 체내 분해속도가 더 느린 것을 알 수 있고， 이에 따라 체내에서 점도를 일 정 수준 유지하는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 제조 방법으로 제조된 400 만 Da 이상의 분자량을 가진 히알루론산은 체내 저분해 속도를 가지며, 바람직하게 는 400만 Da 내지 600만 Da의 분자량을 가진 히알루론산이 유착방지 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
【산업상 이용가능성】
본 발명은 체내 저분해 속도를 갖는 히알루론산의 제조방법 및 상기 방법으 로 제조된 히알루론산을 포함하는 유착방지용 조성물을 제공한다. 본 발명의 제조 방법으로 제조된 히알루론산은 350만 Da 내지 1000만 Da의 고분자 히알루론산으로， 체내 분해 속도가 느려 유착 방지효과가 탁월하다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는 본 발명의 유착방지용 조성물은 유착방지 효과가 탁 월하며， 가교하지 않은 히알루론산을 사용하므로써， 기존의 가교제 및 화합물을 포 함하는 유착방지용 조성물이 가진 문제점 및 기존의 히알루론산이 가진 문제점을 개선할 수 있어 산업상 이용 가능성이 높다.
국 제 양 식 특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 이 정 치
대한민국 13그 130서을특별시 서초구 양재동 60 일동제약 주식회사
Figure imgf000016_0001
항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:
[X] 과학적 성질의 설명
[ ] 제안된 분류학상의 위치
(적용시 X표시 )
III. 기탁및 수탁 본국제기탁기관은 2010년 12월 02일에 기탁된 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였다.
IV. 이관청구의 수령
본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며， 에 원기탁의 부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.
V. 국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을 가진 자 명칭: Korean Collection for Type Cultures
또는 권한을부여받은공무원 서명:
주소 : 대한민국 305-806 대전 유성구
과학로 111 한국생명공학연구원 (KRIBB) 이 정 숙 이사
서명일: 2010. 12. 10.
BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
스트렙토코커스 디스갈락티애 9103 균주 (KCTC11818BP)를 탄소원 및 질소원이 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 체내 저분해 속도를 가지는 히알루론 산의 제조방법 .
【청구항 2】
제 1항에 있어서 , 상기 탄소원은 엿당이고 , 질소원은 카제인 효소 분해물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 배지에 아미노산 또는 금속이은을 추가로 포함하는 것 을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4】
제 3항에 있어서 , 상기 아미노산은 아르기닌이고 , 상기 금속이은은 아연이온 인 것으로 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5]
제 1항 내지 제 4항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법에 있어서 , 상기 히알루 른산의 분자량은 350만 Da 내지 1000만 Da인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6]
제 5항에 있어서 , 상기 히알루론산의 분자량은 400만 Da 내지 600만 Da인 것 을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7]
저 U항 내지 제 4항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조되고 , 가교되지 않은 히알루론산을 유효성분으로 하는 유착방지용 조성물 .
【청구항 8】
제 1항 내지 제 4항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조되고 , 가교되지 정 정 용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 않은 히알루론산을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유착방지 방법 .
【청구항 9】
제 1항 내지 제 4항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 가교되지 않은 유착방지에 사용되는 히알루론산.
정 정 용지 (규칙 제 91조) ISA/KR
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