WO2014127971A1 - Sequenziervorrichtung zum sequenzieren mindestens eines nukleinsäureeinzelstrangs und verfahren zum sequenzieren mindestens eines nukleinsäureeinzelstrangs - Google Patents

Sequenziervorrichtung zum sequenzieren mindestens eines nukleinsäureeinzelstrangs und verfahren zum sequenzieren mindestens eines nukleinsäureeinzelstrangs Download PDF

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nucleic acid
primer
acid single
single strand
attached
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Oliver Hayden
Gerald Warnat
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a sequencing device for sequencing at least one nucleic acid single strand. Furthermore, the present invention relates to a method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
  • the object of the present invention is therefore to provide a possibility for sequencing at least one
  • Nucleic acid single strand to provide which does not require optical labeling of the nucleotides used to polymerize a complementary strand. This object is achieved by the sequencing device for sequencing at least one nucleic acid single strand according to claim 1 and the method for sequencing at least one nucleic acid single strand according to claim 7.
  • the present invention provides possibilities for
  • Sequencing at least one nucleic acid single strand it being sufficient to have only one marker molecule at one end of the at least one nucleic acid single strand (e.g., via an adapter strand) and / or the at least one nucleic acid single strand
  • the binding can take place in such a way that the end of the marker marked with the marker molecule
  • Nucleic acid single strand or the primer during polymerization has a comparatively large distance from the adjacent polymerase.
  • the adjacent marker molecule does not affect the enzymatic properties of the polymerizing polymerase.
  • the marker molecule thus does not contribute to an increase in the error rate.
  • a quality of the sequencing which can be carried out by means of the present invention is therefore comparatively high. In particular, by means of the present invention, a quality of the sequencing can be realized, which is sufficient for chemical applications.
  • the sequencing device comprises a light emitting device, by means of which the at least one marker molecule is excitable.
  • the detection device is preferably designed for the detection of a light emitted by the at least one marker molecule as the at least one varying signal. Since the conductive surface is a quench of the at least one
  • an intensity of the light detected by the detection device is a signal on the basis of which an increase in the maximum distance of the at least one marker molecule from the conductive surface, and thus an extension of the through Polymerization of extended primer is reliably recognizable.
  • polymerization of a nucleotide during delivery of a particular nucleotide type to the conductive surface can be detected with a relatively low error rate.
  • the detection device is preferably designed to detect the photons emitted by the different marker molecules and to assign them to a specific emission spectrum of the different emission spectra of the marker molecules. Because the different ones
  • Nucleic acid single strands can be attached, the sequencing device described here can be used for simultaneous sequencing of different nucleic acid single strands. This way is a lot of different
  • the detection device is designed for a capacitive detection of the at least one marker molecule.
  • inexpensive dielectric markers in particular metal nanoparticles, can be used as the at least one marker molecule.
  • the detection device can be designed for a single molecule detection of a single one of the marker molecules. In this case, by means of
  • Sequencer a single-stranded sequencing of a single nucleotide single strand executable.
  • expression of a nucleic acid single strand present only in a low concentration prior to sequencing may be dispensed with in such a sequencing device design.
  • the detection device may also be used for simultaneous detection of a plurality of
  • Such a detection device can be formed by means of inexpensive components.
  • the at least one primer at least one with at least one metal nanoparticle as the at least one
  • At least one primer having a first nucleotide number which is smaller than a second nucleotide number of at least one adapter strand alloyed to the at least one nucleic acid single strand is attached to the at least one single nucleic acid single strand.
  • At least one primer is attached to the at least one nucleic acid single strand whose partial sequence together with a partial sequence of the at least one nucleic acid single strand is a restriction sequence for gives a restriction enzyme.
  • a subsequence of the at least one to be sequenced can not be sequenced
  • Nucleic acid single strand can be separated.
  • the sequencing of the at least one nucleic acid single strand can thus be limited specifically to the nucleotides to be determined.
  • Marker molecules performed a single strand sequencing. The method can thus also be carried out if only a comparatively low concentration of
  • a group of equal strands of nucleic acid may also be sequenced simultaneously.
  • inexpensive components can be used for such simultaneous sequencing of identical nucleic acid single strands.
  • nucleic acid single strands with divergent sequences to which different marker molecules are bound directly or indirectly can be simultaneously sequenced.
  • Nucleic acid single strands are sequenced in a relatively short time.
  • At least one strand of microRNA may be sequenced as the at least one nucleic acid single strand.
  • the feasibility of the method is not limited to sequencing at least one microRNA strand.
  • Figure 1 is a schematic representation of an embodiment of the sequencing device
  • FIG. 2 shows a schematic illustration for explaining a first embodiment of the method for
  • FIG. 3 shows a schematic illustration for explaining a second embodiment of the method for sequencing at least one
  • Figures 4 and 5 are schematic representations for explaining a third and a fourth embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
  • Figure 6a-6c are schematic representations for explaining a fifth embodiment of the method for
  • FIG. 1 shows a schematic representation of an embodiment of the sequencing device.
  • the sequencing device shown schematically in Figure 1 is for sequencing at least one
  • Nucleic acid single strand 10 suitable.
  • the at least one nucleic acid single strand 10 may be a single strand of DNA RNA single strand or a PNA single strand.
  • at least one micro RNA strand may be sequenceable as the at least one nucleic acid single strand.
  • Nucleic acid single strands 10 can be sequenced by means of the sequencing device described below.
  • the sequencing device has a sample holder 12, to which a conductive surface 14 can be fastened or fastened.
  • the conductive surface 14 is functionalized and / or functionalized such that at least one polymerase 16 can be bonded to the conductive surface 14.
  • the at least one polymerase 16 is in particular attachable to the conductive surface 14 such that the at least one nucleic acid single strand 10 with a on the
  • Nucleic acid single strand 10 bound primer 18 and at least one attached to the nucleic acid strand 10 and / or the primer 18 marker molecule 20 can bind to the attached to the conductive surface 14 polymerase 16.
  • the at least one polymerase 16 is preferably anchored covalently to the conductive surface 14.
  • the conductive surface 14 may be, for example, a gold electrode.
  • the at least one polymerase 16 is preferably connected to the conductive one by means of a thiol bond
  • a biotin-avidin / streptavidin linkage can also be used to bind the at least one polymerase 16. It should be noted that a variety of bonding possibilities for bonding the at least one polymerase 16 to the conductive surface 14 can be used. With regard to the various possibilities for bonding the at least one polymerase 16 to the conductive surface 14, reference is made in particular to US 2010/0035254 A1.
  • An arrangement of a plurality of polymerases 16 can be selected stochastically or by structuring the conductive surface 14.
  • Suitable marker molecules are organic and inorganic markers. For example, 20 fluorophores can be used as marker molecules. Preferably, exactly one marker molecule 20 is attached to the nucleic acid single strand 10 or primer 18. Under a connection of a
  • Marker molecule 20 on the nucleic acid single strand 10 may also be understood as meaning that the marker molecule 20 is chemically attached to an adapter strand alloyed to the nucleic acid single strand 10 (preferably at the 5 'end). A binding position of the at least one marker molecule 20 is preferred, in which case a distance between the two is made during the polymerization of further nucleotides to the primer 18
  • Polymerase 16 and the at least one marker molecule 20 either increases or decreases.
  • the marker molecule 20 is located at the 5-end of the adapter strand 52 /
  • the applicability of the sequencing device is not limited to the possibilities of binding the at least one marker molecule 20 described here.
  • the sequencing device also has a
  • Nucleotide supply means 22 by means of which different types of nucleotides 24 in a predetermined order to the conductive surface 14 with the at least one attached polymerase 16, the at least one
  • Nucleic acid single strand 10, the attached primer 18 and the at least one attached marker molecule 20 can be supplied.
  • the nucleotide delivery device 22 may be designed in particular for a microfluidic sequential delivery.
  • the various nucleotides 24, such as adenine, thymine, guanine and cytosine for sequencing a DNA strand, successively and at different time intervals on the conductive surface 14 can be added. If an added nucleotide 24 has the correct base, it can be polymerized on the at least one primer 18, or on a repeating strand 26 newly polymerized on the at least one primer 18. Not used Nucleotides 24 may be removed from the conductive surface 14 by means of a purging device.
  • Nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 and the at least one attached marker molecule 20 at least partially displaceable in a swinging motion 30 that a distance between the conductive surface 14 and the at least one marker molecule 20 is variable.
  • Nucleic acid single strand 10 with attached primer 18 is a negatively charged polymer under physiological conditions, such as a pH of 7.2. Therefore, the nucleic acid single strand 10 can be attached to the
  • Primer 18 are reciprocated in the generated alternating electric field between two extreme positions. In a first extreme position, the nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 (as a positive pole) lies on the conductive surface 14. In contrast, the
  • the distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 is minimal, while the distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 in the presence of the
  • Nucleic acid single strand 10 with the tethered primer 18 briefly in the second extreme position becomes maximum. If a distance between the at least one marker molecule 20 and the polymerase 16 is comparatively short, the
  • Marker molecule 20 causes can be inferred by a comparison of the phase of the oscillatory movement 30 in relation to the alternating electric field on the polymerization of the nucleotide 24.
  • the exciter 28 comprises the conductive surface 14 formed as a first electrode and a second electrode 32 attached to a substrate 34.
  • the electrodes 14 and 32 of the excitation device 28 may be separated by a microfluidic channel.
  • the electrodes may also be present on a common substrate.
  • the second electrode 32 and the substrate 34 may be transparent / translucent. It is pointed out, however, that the embodiment of the excitation device 28 shown in FIG. 1 is to be interpreted merely as an example.
  • the sequencing device also has a detection device 36, by means of which at least one of the varying distance between the conductive surface 14 and the at least marker molecule 20 varying signal 38 can be determined.
  • the at least one signal 38 preferably varies according to the oscillatory motion 30 in phase or out of phase with the alternating electric field.
  • An evaluation device 40 of the sequencing device can thus ascertain / determine a polymerization of a nucleotide 24 to the primer 18 or to the newly polymerized continuation strand 26 on the basis of an output signal 42 provided by the detection device 36 taking into account the at least one varying signal 38.
  • the growth of the primer 18, or of the newly polymerized continuation strand 26, can be determined by the evaluator.
  • te driven 40 due to a change in the phase of the signals 38 and 42 are reliably detected in relation to the alternating electric field.
  • the sequencing device thus uses a dynamic measurement of strand properties / strand lengths, whereby a resolution is ensured which allows a detection of a single polymerization of a nucleotide 24.
  • the evaluation device 40 is additionally designed to output information 44 relating to the type of nucleotide 24 polymerized onto the primer 18, or to the newly polymerized continuation strand 26, and / or of the complementary nucleotide of the nucleic acid single strand 10.
  • the sequencing device thus enables sequencing of at least one nucleic acid single strand 10 without the use of labeled nucleotides 24. Instead, it is sufficient if only one marker molecule 20 is attached to one end of the at least one single strand of nucleic acid 10 or to one end of the at least one primer 18. Therefore, the marker molecule 20 bound at a large distance from the adjacent polymerase 16 does not affect the enzyme properties of the polymerizing polymerase 16. The marker molecule 20 thus does not contribute to an increase in an error rate.
  • the sequencing performed by the sequencer is reliable and (nearly) error free.
  • the detection device 36 can be designed for a single-molecule detection of a single one of the marker molecules 20. Alternatively, however, the detection device 36 may also be used for a simultaneous tige detection of a variety of marker molecules 20, which are directly or indirectly attached to nucleic acid single strands 10 having the same sequence, be formed. In the embodiment of Figure 1, the
  • Light emitting device 46 with which at least one inserted as a marker molecule 20 fluorophore can be excited.
  • a light 48 emitted by the light emitting device 46 preferably lies in the absorption spectrum of the at least one marker molecule 20.
  • the detection device 36 is designed to detect a light 38 emitted by the at least one marker molecule 20 as the at least one signal 38.
  • a suitably chosen filter 50 it can be ensured that only the light 38 emitted by the at least one marker molecule 20 is detected by the detection device 36.
  • An output signal 42 corresponding to an intensity of the light 38 can subsequently be output to the evaluation device 40.
  • a comparatively small distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 causes quenching of the respective fluorophore used as marker molecule 20.
  • the oscillating motion 30 can be detected by means of the intensity of the at least one of
  • Marker molecule 20 emitted light 38 can be reliably reproduced.
  • a polymerization of a nucleotide 24 can be reliably detected on the basis of the changing phase position of the varying intensity of the light 38 emitted by the at least one marker molecule 20.
  • different marker molecules 20 with different emission spectra can be stimulated simultaneously by means of the light emitting device 46.
  • the different marker molecules can be linked to single nucleic acid strands 10 with different Sequences be connected.
  • the detection device 36 is preferably designed to detect the photons emitted by the different marker molecules 20 and to assign them to a specific emission spectrum of the different emission spectra of the marker molecules 20.
  • it can be specifically recognized at which of the different nucleic acid individual strands 10 a nucleotide 24 is polymerized with a specific base.
  • Nucleic acid single strands 10 having different sequences can be sequenced simultaneously.
  • the optical design of the sequencing device reproduced in FIG. 1 is to be interpreted merely as an example.
  • the detection device 36 may also be designed for a capacitive detection of the at least one marker molecule 20. Also based on a phase of a detected capacitance in relation to the alternating electric field can on the phase of the
  • FIG. 2 shows a schematic representation for explaining a first embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
  • At least one adapter strand 52 can be attached to one each
  • Nucleic acid single strand 10 are alloyed.
  • the adapter strand 52 may also be referred to as a capture strand.
  • Nucleic acid single strand 10, each with a connected adapter strand 52 and one to the adapter strand 52 matching Primer 18 is applied to a conductive surface with at least one attached polymerase.
  • at least one marker molecule may be attached to nucleic acid single strand 10, or adapter strand 52, and / or primer 18 (chemically).
  • An alternating electric field is applied to the conductive surface with the at least one polymerase attached to the conductive surface, to which the at least one
  • Nucleic acid single strand 10 and / or the primer 18 bound marker molecule is attached produced.
  • the generation of the alternating electric field is such that by means of the alternating electric field of at least one
  • Nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 and the at least one attached marker molecule is at least partially set in a swinging motion, that a distance between the conductive surface and the at least one marker molecule is varied.
  • nucleotides are supplied in a predetermined order to the conductive surface with the one bound polymerase, the at least one nucleic acid single strand 10, the attached primer 18 and the at least one attached marker molecule.
  • at least one signal varying with the varying distance between the conductive surface and the at least one marker molecule is determined.
  • a polymerization of a nucleotide to the primer 18 is determined and a type of nucleotide polymerized on the primer 18 and / or of the complementary nucleotide of the nucleotide
  • Nucleic acid single strand 10 set. For recognizing the type of nucleotide polymerized on the primer 18 and / or Of the complementary nucleotide of the nucleic acid single strand 10, the order of the different types of nucleotides supplied at different times is also usually taken into account.
  • Nucleic acid single strand 10 can then be captured and sequenced by the same polymerase 16.
  • a single polymerase 16 can be used for multiple sequencing.
  • the adapter strand 52 has the same length as the primer 18, wherein a sequence of the adapter strand 52 preferably corresponds to a recognition sequence of the primer 18.
  • the feasibility of the method is not limited to this.
  • FIG. 3 shows a schematic representation for explaining a second embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
  • At least one primer 18 at least one primer 18 having a first nucleotide number which is smaller than a second one is used
  • Nucleotide number of the at least one adapter strand 52 alloyed to the at least one nucleic acid single strand 10 is attached to the at least one nucleic acid single strand 10.
  • a reference measurement can be carried out. If the known base sequence of the sub-strand 54 is determined during the reference measurement, it can be assumed that the components used for carrying out the method are correctly adjusted / calibrated. Otherwise, a check of the components can begin.
  • Figures 4 and 5 are schematic illustrations for explaining a third and a fourth embodiment of the method for sequencing at least one
  • exactly one marker molecule 20 (by means of a chemical bond 55) is attached to the primer 18. In this case, attachment of the marker molecule 20 to the 3-end of the primer 18 is preferred.
  • the tying positions of the marker molecules 20 shown in FIGS. 4 and 5 are to be interpreted merely as examples.
  • a fluorophore can be used as the at least one marker molecule 20.
  • a dielectric marker such as, in particular, a metal nanoparticle may also be used as the marker molecule 20.
  • a capacitive measurement can be used to carry out the methods described herein.
  • Figures 6a-6c are schematic representations for explaining a fifth embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
  • At least one primer 18 is attached as at least one primer 18 to the at least one nucleic acid single strand 10 whose partial sequence together with a partial sequence of the at least one nucleic acid single strand 10 results in a restriction enzyme sequence 56.
  • a restriction enzyme sequence 56 is then not to sequencing partial strand 58 of the nucleic acid single strand 10 is separated from an at least partially to be sequenced residual strand 60 of the nucleic acid single strand 10 (see Figures 6a and 6b).
  • the at least one nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 is then placed on the conductive surface with the at least one attached polymerase 16.
  • Nucleic acid single strand 10 having a primer 18 attached thereto can bind to the at least one polymerase 16 and the method steps already described above are feasible.
  • the embodiment of FIGS. 6a to 6c is suitable for the rapid re-sequencing of sections which are stochastically distributed.
  • the corresponding method can also be carried out with two primers 18 for the forward and the reverse strand. Limiting in this case is only the formation of primer-primer hybridizations when using many different primers 18.
  • the method of Figures 6a-6c is also suitable for a combination of real-time polymerase chain reaction (PCR) and sequencing without a library preparation for sequencing.
  • PCR real-time polymerase chain reaction
  • a molecular beacon primer for example, a reverse transcriptase chain reaction (PCR) is performed with a molecular beacon primer.
  • a restriction enzyme 56 and the polymerase 16 are added to this solution.
  • the product bound to the polymerase 16 and amplified may be anchored stochastically on the conductive surface 14 in sufficient dilution.
  • a total concentration of ions may be over 500 ⁇ .
  • a concentration of magnesium ions may be larger. be greater than 100 ⁇ .
  • concentrations of magnesium ions and a Taq polymerase are between 0.5 to 5 mM.
  • All of the methods represented by FIGS. 2 to 6c can be carried out by means of a single molecule detection of a single one of the marker molecules 20 as a single strand sequencing.
  • a suitable choice of fluorophores single molecule measurements may also be feasible without rapid bleaching of the fluorophore.
  • a group of equal strands of nucleic acid 10 may be simultaneously sequenced by one of the methods. In a further education can also different
  • Nucleic acid strands 10 having divergent sequences to which different marker molecules (directly or indirectly) are attached are simultaneously sequenced by one of the methods described above. In this way, different nucleic acid strands 10 can be sequenced within a comparatively short time.
  • RNA strands, DNA strands and / or PNA strands can be sequenced.
  • at least one micro RNA strand can be sequenced as the at least one nucleic acid single strand.
  • Such a microRNA strand may have a number of about 20 nucleotides, such as 21 to 23 nucleotides.
  • such a microRNA strand does not need to be fragmented by its restriction prior to its sequencing.
  • the length of a sequenceable nucleic acid single strand 10 depends on the stretched strand length (s) present

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs (10) mit einer Probenhalterung (12), an welcher eine leitfähige Oberfläche (14) mit mindestens einer Polymerase (16) befestigbar oder befestigt ist, wobei die Sequenziervorrichtung zusätzlich eine Nukleotidzuführeinrichtung (22), mittels welcher verschiedene Typen von Nukleotiden (24) in einer vorgebbaren Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche (14) zuführbar sind, eine Anregungseinrichtung (28), mittels welcher ein elektrisches Wechselfeld erzeugbar ist, eine Detektionseinrichtung (36), mittels welcher mindestens ein variierendes Signal (38) ermittelbar ist, und eine Auswerteeinrichtung (40), welche dazu ausgelegt ist, unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals (38) eine Information (44) bezüglich eines Typs eines an mindestens einen Primer (18) polymerisierten Nukleotids (24) und/oder des komplementären Nukleotids mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs (10) auszugeben. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs (10).

Description

Beschreibung
Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs und Verfahren zum Sequenzieren min- destens eines Nukleinsäureeinzelstrangs
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs.
Stand der Technik
In der US 2010/0035254 AI ist ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines DNA-Einzelstrangs beschrieben. Zum Ausführen des Verfahrens wird mindestens eine Polymerase an eine Oberfläche gebunden. Dies soll so ausgeführt werden, dass der mindestens eine zu sequenzierende DNA-Einzelstrang mit einem angebundenen Primer an die Polymerase anbinden kann. An- schließend werden optisch markierte Nukleotide auf die Oberfläche mit der mindestens einen angebundenen Polymerase gegeben. Mittels eines optischen Nachweises eines an dem Primer polymerisierten Nukleotids soll es möglich sein, Rückschlüsse auf die Sequenz des DNA-Einzelstrangs zu schließen.
Allerdings erfordert ein Ausführen des in dem vorausgehenden Absatz beschriebenen Verfahrens die optische Markierung der an den Primer zu polymerisierenden Nukleotide. Die dazu ausgeführte Markierungsmethode kann jedoch die Enzymeigenschaf- ten der Polymerase beeinträchtigen. Dies kann zu einer erhöhten Fehlerrate beim Ermitteln der DNA-Sequenz des DNA- Einzelstrangs führen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, eine Mög- lichkeit zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs zur Verfügung zu stellen, welche keine optische Markierung der zum Polymerisieren eines Komplementärstrangs eingesetzten Nukleotide benötigt. Gelöst wird diese Aufgabe durch die Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs nach Anspruch 1 und das Verfahren zum Sequenzieren mindestens ei- nes Nukleinsäureeinzelstrangs nach Anspruch 7.
Die vorliegende Erfindung schafft Möglichkeiten zum
Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs, wobei es ausreichend ist, lediglich ein Markermolekül an einem Ende des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs (z.B. über einen Adapterstrang) und/oder des mindestens einen
Primers anzubinden. Die Anbindung kann so erfolgen, dass das mit dem Markermolekül markierte Ende des
Nukleinsäureeinzelstrangs oder des Primers während einer Polymerisierung einen vergleichsweise großen Abstand zu der benachbarten Polymerase aufweist. Somit beeinträchtigt das benachbarte Markermolekül nicht die Enzymeigenschaften der polymerisierenden Polymerase. Das Markermolekül trägt somit zu keiner Steigerung der Fehlerrate bei. Eine Qualität der mittels der vorliegenden Erfindung ausführbaren Sequenzierung ist deshalb vergleichsweise hoch. Insbesondere kann mittels der vorliegenden Erfindung eine Qualität der Sequenzierung realisiert werden, welche für chemische Anwendungen ausreichend ist.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der
Sequenziervorrichtung umfasst die Sequenziervorrichtung eine Lichtemittiereinrichtung, mittels welcher das mindestens eine Markermolekül anregbar ist. In diesem Fall ist die Detekti- onseinrichtung vorzugsweise für eine Detektion eines von dem mindestens einen Markermolekül emittierten Lichts als das mindestens eine variierende Signal ausgelegt. Da die leitfähige Oberfläche ein Quenchen des mindestens einen
Markermoleküls bewirken kann, ist eine Intensität des mittels der Detektionseinrichtung detektierten Lichts ein Signal, anhand von welchem sich eine Vergrößerung des maximaler Ab- stands des mindestens einen Markermoleküls von der leitfähigen Oberfläche, und damit eine Verlängerung des durch die Polymerisation verlängerten Primers verlässlich erkennbar ist. Somit kann eine Polymerisierung eines Nukleotids während eines Zuführens eines bestimmten Nukleotidtyps an die leitfähige Oberfläche mit einer relativ geringen Fehlerrate erkannt werden.
In einer vorteilhaften Weiterbildung sind mittels der
Lichtemittiereinrichtung verschiedene Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig anregbar. Be- vorzugter Weise ist in diesem Fall die Detektionseinrichtung dazu ausgelegt, die von den verschiedenen Markermolekülen emittierten Photonen zu detektieren und einem bestimmten Emissionspektrum der unterschiedlichen Emissionsspektren der Markermoleküle zuzuordnen. Da die verschiedenen
Markermoleküle direkt oder indirekt an unterschiedlichen
Nukleinsäureeinzelsträngen angebunden sein können, kann die hier beschriebene Sequenziervorrichtung zum gleichzeitigen Sequenzieren verschiedener Nukleinsäureeinzelstränge genutzt werden. Auf diese Weise ist eine Vielzahl verschiedener
Nukleinsäureeinzelstränge innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenzierbar.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist die Detektionseinrichtung für eine kapazitive Detektion des mindes- tens einen Markermoleküls ausgelegt. Damit können kostengünstige dielektrische Marker, wie insbesondere Metall - Nanopartikel , als das mindestens eine Markermolekül eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Detektionseinrichtung für eine Ein- zelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle ausgebildet sein. In diesem Fall ist mittels der
Sequenziervorrichtung eine Einzelstrangsequenzierung eines einzelnen Nukleotideinzelstrangs ausführbar. Somit kann auf eine Exprimierung eines nur in einer geringen Konzentration vorhandenen Nukleinsäureeinzelstrangs vor einer Sequenzierung bei einer derartigen Auslegung der Sequenziervorrichtung verzichtet werden. Als Alternative dazu kann die Detektionseinrichtung auch für eine gleichzeitige Detektion einer Vielzahl von
Markermolekülen ausgebildet sein. Eine derartige Detektions- einrichtung kann mittels kostengünstiger Bauteile ausgebildet werden .
Die in den oberen Absätzen aufgezählten Vorteile sind auch bei einem Ausführen eines derartigen Verfahrens zum
Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs gewährleistet .
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein mit mindestens einem Metall -Nanopartikel als das mindestens eine
Markermolekül markierter Primer an die mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang angebunden. Somit können zum Ausführen des Verfahrens kostengünstige Metall -Nanopartikel anstelle von Fluorophoren eingesetzt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein Primer mit einer ersten Nukleotidanzahl , welche kleiner als eine zweite Nukleotidanzahl mindestens eines an den mindestens ei- nen Nukleinsäureeinzelstrang legierten Adapterstrangs ist, an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang angebunden. Wie unten genauer ausgeführt wird, kann bei einer derartigen Wahl der ersten Nukleotidanzahl und der zweiten Nukleotidanzahl bei jeder Sequenzierung eine Referenzmessung ausgeführt wer- den. Somit kann beispielsweise eine Fehljustage an einer zum Ausführen des Verfahrens verwendeten Vorrichtung schnell erkannt und behoben werden.
In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein Primer an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang angebunden wird, dessen Teilsequenz zusammen mit einer Teilsequenz des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs eine Restriktionssequenz für ein Restriktionsenzym ergibt. In einem nachfolgenden Verfahrensschritt kann mittels des Restriktionsenzyms ein nicht zu sequenzierender Teilstrang des mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrangs von einem zumindest teilweise zu sequenzierenden Reststrang des mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrangs abgetrennt werden. Die Sequenzierung des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs kann somit speziell auf die zu ermittelnden Nukleotide begrenzt werden .
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird mittels einer Einzelmoleküldetektion eines einzigen der
Markermoleküle eine Einzelstrangsequenzierung ausgeführt. Das Verfahren kann somit auch ausgeführt werden, wenn lediglich eine vergleichsweise geringe Konzentration des zu
sequenzierenden Nukleinsäureeinzelstrangs vorliegt.
Als Alternative dazu kann jedoch auch eine Gruppe gleicher Nukleinsäureeinzelstränge gleichzeitig sequenziert werden. In der Regel können für eine derartige gleichzeitige Sequenzierung gleicher Nukleinsäureeinzelstränge kostengünstige Komponenten verwendet werden.
In einer vorteilhaften Weiterbildung können auch verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge mit voneinander abweichenden Sequenzen, an welchen unterschiedliche Markermoleküle direkt oder indirekt angebunden sind, gleichzeitig sequenziert werden. Somit können mehrere verschiedene
Nukleinsäureeinzelstränge in einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenziert werden.
Mittels eines Ausführens des hier beschriebenen Verfahrens kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenziert werden. Die Ausführbar- keit des Verfahrens ist jedoch nicht auf ein Sequenzieren mindestens eines Mikro-RNA-Strangs limitiert.
Beschreibung der Figuren Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Figuren im Detail erläutert, wobei diese Figuren den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen. Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Sequenziervorrichtung;
Figur 2 eine schematische Darstellung zum Erläutern ei- ner ersten Ausführungsform des Verfahrens zum
Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs ;
Figur 3 eine schematische Darstellung zum Erläutern einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs ;
Figur 4 und 5 schematische Darstellungen zum Erläutern einer dritten und einer vierten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs; und
Figur 6a-6c schematische Darstellungen zum Erläutern einer fünften Ausführungsform des Verfahrens zum
Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs .
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Sequenziervorrichtung. Die in Figur 1 schematisch dargestellte Sequenziervorrichtung ist zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs 10 geeignet. Der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann ein DNA-Einzelstrang, ein RNA-Einzelstrang oder ein PNA-Einzelsträng sein. Insbesondere kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenzierbar sein. Somit sind eine Vielzahl verschiedener Typen von
Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mittels der im Weiteren beschriebenen Sequenziervorrichtung sequenzierbar.
Die Sequenziervorrichtung weist eine Probenhalterung 12 auf, an welcher eine leitfähige Oberfläche 14 befestigbar oder be- festigt ist. Die leitfähige Oberfläche 14 ist derart funktio- nalisiert und/oder funktionalisierbar, dass mindestens eine Polymerase 16 an der leitfähigen Oberfläche 14 anbindbar ist. Die mindestens eine Polymerase 16 ist insbesondere so an der leitfähigen Oberfläche 14 anbindbar, dass der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit einem an dem
Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebundenen Primer 18 und mindestens einem an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 und/oder dem Primer 18 angebundenen Markermolekül 20 an die an der leitfähigen Oberfläche 14 angebundene Polymerase 16 anbinden kann.
Die mindestens eine Polymerase 16 wird vorzugsweise kovalent an der leitfähigen Oberfläche 14 verankert. Die leitfähige Oberfläche 14 kann beispielsweise eine Gold-Elektrode sein. Bevorzugter Weise ist in diesem Fall die mindestens eine Polymerase 16 mittels einer Thiolbindung an die leitfähige
Oberfläche 14 gebunden. Auch eine Biotin-Avidin/Streptavidin- Bindung kann zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 genutzt werden. Es wird darauf hingewiesen, dass eine Vielzahl von Bindungsmöglichkeiten zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 an die leitfähige Oberfläche 14 nutzbar ist. Bezüglich der verschiedenen Möglichkeiten zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 an die leitfähige Oberfläche 14 wird insbesondere auf die US 2010/0035254 AI hingewiesen. Eine Anordnung von mehreren Polymerasen 16 kann stochas- tisch oder durch eine Strukturierung der leitfähigen Oberfläche 14 gewählt werden. Als Markermoleküle 20 eignen sich organische und anorganische Marker. Beispielsweise können als Markermoleküle 20 Fluoro- phore eingesetzt werden. Bevorzugter Weise ist genau ein Markermolekül 20 an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 oder dem Primer 18 angebunden. Unter einer Anbindung eines
Markermoleküls 20 an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann auch verstanden werden, dass das Markermolekül 20 an einem (vorzugsweise an dem 5 -Ende) an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 legierten Adapterstrang chemisch angebunden ist. Bevorzugt wird eine Anbindposition des mindestens einen Markermoleküls 20, bei welcher während einer Polymerisierung weiterer Nukleotide an den Primer 18 ein Abstand zwischen der tätigen
Polymerase 16 und dem mindestens einen Markermolekül 20 entweder zu- oder abnimmt. Vorzugsweise liegt das Markermolekül 20 an dem 5-Ende des Adapterstrangs 52/des
Nukleinsäureeinzelstrangs 10 oder an dem 3 -Ende des Primers 18 vor. Die Einsetzbarkeit der Sequenziervorrichtung ist jedoch nicht auf die hier beschriebenen Möglichkeiten der Anbindung des mindestens einen Markermoleküls 20 beschränkt.
Die Sequenziervorrichtung weist auch eine
Nukleotidzuführeinrichtung 22 auf, mittels welcher verschiedene Typen von Nukleotiden 24 in einer vorgebbaren Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche 14 mit der mindestens einen angebundenen Polymerase 16, dem mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang 10, dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül 20 zuführbar sind. Die Nukleotidzuführeinrichtung 22 kann insbesondere für eine mikrofluidische sequenzielle Zuführung ausgelegt sein. Dabei können die verschiedenen Nukleotide 24, wie beispielsweise Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin zum Sequenzieren eines DNA-Strangs, nacheinander und in unterschiedlichen Zeitabschnitten auf die leitfähige Oberfläche 14 zugegeben werden. Sofern ein zugegebenes Nukleotid 24 die richtige Base aufweist, kann es an dem mindestens einen Primer 18, bzw. an einen an dem mindestens einen Primer 18 neu-polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, polymerisiert werden. Nicht verwendete Nukleotide 24 können mittels einer Spüleinrichtung von der leitfähigen Oberfläche 14 entfernt werden.
Mittels einer Anregungseinrichtung 28 der
Sequenziervorrichtung ist ein elektrisches Wechselfeld erzeugbar, mittels welchem der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül 20 zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung 30 versetzbar, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche 14 und dem mindestens einen Markermolekül 20 variierbar ist. Der
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 ist unter physiologischen Bedingungen, wie beispielsweise einem pH-Wert von 7,2, ein negativ geladenes Polymer. Deshalb kann der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen
Primer 18 in dem erzeugten elektrischen Wechselfeld zwischen zwei Extremstellungen hin- und herbewegt werden. In einer ersten Extremstellung liegt der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 (als positiver Pol) auf der leitfähigen Oberfläche 14. Demgegenüber ist der
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 in einer zweiten Extremstellung (als negativer
Pol ) näherungsweise senkrecht zu der leitfähigen Oberfläche 14 ausgerichtet .
Bei einem Vorliegen des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mit dem angebundenen Primer 18 in der ersten Extremstellung ist der Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 minimal, während der Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 bei einem Vorliegen des
Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mit dem angebundenen Primer 18 in der zweiten Extremstellung kurzzeitig maximal wird. Sofern eine Distanz zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der Polymerase 16 vergleichsweise kurz ist, ist die
Schwingbewegung 30 in Phase mit dem elektrischen Wechselpol. Eine vergleichsweise große Distanz zwischen der Polymerase 16 und dem mindestens einen Markermolekül 20 bewirkt demgegen- über eine Schwingbewegung 30 außer Phase zu dem elektrischen Wechselfeld. Da eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 an dem Primer 18, bzw. an den neu polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, eine Vergrößerung (oder Verkleinerung) der Distanz zwischen der Polymerase 16 und dem mindestens einen
Markermolekül 20 bewirkt, kann durch einen Vergleich der Phase der Schwingbewegung 30 im Verhältnis zu dem elektrischen Wechselfeld auf die Polymerisierung des Nukleotids 24 rückgeschlossen werden.
In der Ausführungsform der Figur 1 umfasst die Anregungseinrichtung 28 die als erste Elektrode ausgebildete leitfähige Oberfläche 14 und eine zweite Elektrode 32, welche an einem Substrat 34 angebracht ist. Die Elektroden 14 und 32 der An- regungseinrichtung 28 können durch einen Mikrofluidik-Kanal getrennt sein. In einer alternativen Ausführungsform der Anregungseinrichtung 28 können die Elektroden auch auf einem gemeinsamen Substrat vorliegen. Optionaler Weise können die zweite Elektrode 32 und das Substrat 34 transpa- rent/lichtdurchlässig sein. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die in Figur 1 dargestellte Ausführung der Anregungseinrichtung 28 lediglich beispielhaft zu interpretieren ist . Die Sequenziervorrichtung hat auch eine Detektionseinrichtung 36, mittels welcher mindestens ein mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche 14 und dem mindestens Markermolekül 20 variierendes Signal 38 ermittelbar ist. Das mindestens eine Signal 38 variiert vorzugsweise entspre- chend der Schwingbewegung 30 in Phase oder außer Phase zu dem elektrischen Wechselfeld. Somit kann eine Auswerteeinrichtung 40 der Sequenziervorrichtung anhand eines von der Detektionseinrichtung 36 unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals 38 bereitgestellten Ausgabesignals 42 eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 an den Primer 18, bzw. an den neu-polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, ermitteln/feststellen. Das Anwachsen des Primers 18, bzw. des neu polymerisierten Fortsetzungsstrangs 26, kann von der Auswer- teeinrichtung 40 aufgrund einer Änderung der Phase der Signale 38 und 42 im Verhältnis zum elektrischen Wechselfeld verlässlich erkannt werden. Die Sequenziervorrichtung nutzt somit eine dynamische Messung von Strangeigenschaf- ten/Stranglängen, wobei eine Auflösung gewährleistet ist, welche eine Detektion einer Einzelpolymerisierung eines Nukleotids 24 erlaubt.
Da der Typ der gerade auf die leitfähige Oberfläche 14 zuge- gebenen Nukleotide 24 aufgrund der vorgebbaren Reihenfolge der Nukleotidzuführeinrichtung 22 bekannt ist, kann rückgeschlossen werden, welche Base das neu polymerisierte Nukleotid 24 trägt. Somit ist die Sequenz des Fortsetzungsstrangs 26 ermittelbar, worauf auf die komplementäre Sequenz des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 rückgeschlossen werden kann. Die Auswerteeinrichtung 40 ist zusätzlich dazu ausgelegt, eine Information 44 bezüglich des Typs des an den Primer 18, bzw. an den neu polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, neu- polymerisierten Nukleotids 24 und/oder des komplementären Nukleotids des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 auszugeben.
Die Sequenziervorrichtung ermöglicht somit eine Sequenzierung mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs 10 ohne die Verwendung von markierten Nukleotiden 24. Stattdessen ist es ausreichend, wenn lediglich ein Markermolekül 20 an einem Ende des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 oder an einem Ende des mindestens einen Primers 18 angebunden ist. Das in einem großen Abstand zu der benachbarten Polymerase 16 angebundene Markermolekül 20 beeinträchtigt deshalb nicht die Enzymeigenschaften der polymerisierenden Polymerase 16. Das Markermolekül 20 trägt somit zu keiner Steigerung einer Fehlerrate bei. Die von der Sequenziervorrichtung ausgeführten Sequenzierungen sind verlässlich und (nahezu) fehlerfrei. Wie in Figur 1 dargestellt ist, kann die Detektionseinrich- tung 36 für eine Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle 20 ausgebildet sein. Als Alternative dazu kann die Detektionseinrichtung 36 jedoch auch für eine gleichzei- tige Detektion einer Vielzahl von Markermolekülen 20, welche an Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mit der gleichen Sequenz direkt oder indirekt angebunden sind, ausgebildet sein. In der Ausführungsform der Figur 1 weist die
Sequenziervorrichtung zusätzlich eine
Lichtemittiereinrichtung 46 auf, mit welcher mindestens ein als Markermolekül 20 eingesetzter Fluorophor anregbar ist. Ein von der Lichtemittiereinrichtung 46 emittiertes Licht 48 liegt vorzugsweise im Absorptionsspektrum des mindestens einen Markermoleküls 20. Die Detektionseinrichtung 36 ist für eine Detektion eines von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 als dem mindestens einen Signal 38 ausgelegt. Mittels eines geeignet gewählten Filters 50 kann sichergestellt werden, dass lediglich das von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierte Licht 38 von der Detektionseinrichtung 36 detektiert wird. Somit ist eine fluores- zenzhintergrundfreie Detektion ausführbar. Ein einer Intensität des Lichts 38 entsprechendes Ausgabesignal 42 kann an- schließend an die Auswerteeinrichtung 40 ausgegeben werden.
Ein vergleichsweise kleiner Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 bewirkt ein Quenchen des jeweiligen als Markermolekül 20 einge- setzten Fluorophors . Somit kann die Schwingbewegung 30 mittels der Intensität des von dem mindestens einen
Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 verlässlich wiedergegeben werden. Damit kann bei einer optischen Auslegung der Sequenziervorrichtung eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 anhand der sich ändernden Phasenlage der variierenden Intensität des von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 verlässlich erkannt werden.
In einer Weiterbildung der Sequenziervorrichtung der Figur 1 können mittels der Lichtemittiereinrichtung 46 verschiedene Markermoleküle 20 mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig anregbar sein. Die verschiedenen Markermoleküle können an Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mit unterschiedlichen Sequenzen angebunden sein. Bevorzugter Weise ist die Detekti- onseinrichtung 36 in diesem Fall dazu ausgelegt, die von den verschiedenen Markermolekülen 20 emittierten Photonen zu de- tektieren und einem bestimmten Emissionsspektrum der unter- schiedlichen Emissionsspektren der Markermoleküle 20 zuzuordnen. Somit kann gezielt erkannt werden, an welchem/welchen der unterschiedlichen Nukleinsäureeinzelstränge 10 ein Nukleotid 24 mit einer bestimmten Base polymerisiert wird. Mittels der hier beschriebenen Weiterbildung der
Sequenziervorrichtung können deshalb unterschiedliche
Nukleinsäureeinzelstränge 10 mit verschiedenen Sequenzen gleichzeitig sequenziert werden.
Es wird darauf hingewiesen, dass die in der Figur 1 wiederge- gebene optische Auslegung der Sequenziervorrichtung lediglich beispielhaft zu interpretieren ist. Beispielsweise kann die Detektionseinrichtung 36 auch für eine kapazitive Detektion des mindestens einen Markermoleküls 20 ausgelegt sein. Auch anhand einer Phase einer detektierten Kapazität im Verhältnis zu dem elektrischen Wechselfeld kann auf die Phase der
Schwingbewegung 30 rückgeschlossen werden. Somit sind auch bei einer derartigen Auslegung der Sequenziervorrichtung die oben schon beschriebenen Vorteile gewährleistet. Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung zum Erläutern einer ersten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs .
In einem optionalen Verfahrensschritt kann vor der Sequenzie- rung des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mindestens ein Adapterstrang 52 an jeweils einen
Nukleinsäureeinzelstrang 10 legiert werden. Der Adapterstrang 52 kann auch als Fängerstrang (Capture Probe) bezeichnet werden .
Anschließend wird der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit jeweils einem angebundenen Adapterstrang 52 und einem zu dem Adapterstrang 52 passenden Primer 18 auf eine leitfähige Oberfläche mit mindestens einer daran angebundenen Polymerase aufgebracht. Wahlweise kann mindestens ein (nicht dargestelltes) Markermolekül an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10, bzw. dem Adapterstrang 52, und/oder dem Primer 18 (chemisch) angebunden sein.
Ein elektrisches Wechselfeld wird an der leitfähigen Oberfläche mit der mindestens einen an der leitfähigen Oberfläche angebundenen Polymerase, an welcher der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem an dem
Nukleinsäureeinzelstrang 10/dem Adapterstrang 52 angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen an dem
Nukleinsäureeinzelstrang 10 und/oder dem Primer 18 angebundenen Markermolekül angebunden ist, erzeugt. Das Erzeugen des elektrischen Wechselfeldes erfolgt derart, dass mittels des elektrischen Wechselfeldes der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung versetzt wird, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche und dem mindestens einen Markermolekül variiert wird.
Gleichzeitig oder zwischenzeitlich werden verschiedene Typen von Nukleotiden in einer vorgegebenen Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche mit der einen angebundenen Polymerase, dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10, dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül zugeführt. Wie oben bereits ausgeführt ist, wird während des Erzeugens des elektrischen Wechselfelds min- destens ein mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche und dem mindestens einen Markermolekül variierendes Signal ermittelt. Anschließend wird unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals eine Polymerisierung eine Nukleotids an den Primer 18 ermittelt und ein Typ des an dem Primer 18 polymerisierten Nukleotid und/oder des komplementären Nukleotids des
Nukleinsäureeinzelstrangs 10 festgelegt. Zum Erkennen des Typs des an dem Primer 18 polymerisierten Nukleotids und/oder des komplementären Nukleotids des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 wird in der Regel auch die Reihenfolge der zu verschiedenen Zeiten zugeführten verschiedenen Typen von Nukleotiden berücksichtigt .
Nach einer Sequenzierung des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 kann dieser abgelöst werden. Ein weiterer
Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann danach von der gleichen Polymerase 16 eingefangen und sequenziert werden. Somit kann eine einzelne Polymerase 16 für mehrere Sequenzierungen genutzt werden.
In der Ausführungsform der Figur 2 weist der Adapterstrang 52 die gleiche Länge wie der Primer 18 auf, wobei eine Sequenz des Adapterstrangs 52 vorzugsweise einer Erkennungssequenz des Primers 18 entspricht. Die Ausführbarkeit des Verfahrens ist jedoch nicht darauf limitiert.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung zum Erläutern ei- ner zweiten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs.
In der Ausführungsform der Figur 3 wird als der mindestens eine Primer 18 mindestens ein Primer 18 mit einer ersten Nukleotidanzahl , welche kleiner als eine zweite
Nukleotidanzahl des mindestens einen an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 legierten Adapterstrangs 52 ist, an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebunden. Da die Sequenz des an den Nukleinsäureeinzelstrang 10 angrenzenden Teilstrangs 54 des Adapterstrangs 52, für welche der Primer 18 keine komplementären Basen aufweist, bekannt ist, kann somit eine Referenzmessung ausgeführt werden. Sofern bei der Referenzmessung die bekannte Basenabfolge des Teilstrangs 54 ermittelt wird, kann davon ausgegangen werden, dass die zum Ausführen des Verfahrens eingesetzten Komponenten richtig justiert/geeicht sind. Andernfalls kann mit einer Überprüfung der Komponenten begonnen werden. Somit ist bei der Ausführungsform der Figur 3 das Vorliegen eines Fehlers an der zum Sequenzieren des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 verwendeten Apparatur schnell erkennbar und behebbar.
Figur 4 und 5 zeigen schematische Darstellungen zum Erläutern einer dritten und einer vierten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs .
Bei der Ausführungsform der Figur 4 ist genau ein
Markermolekül 20 an dem Adapterstrang 52 (mittels einer chemischen Bindung 55) angebunden. Vorzugsweise liegt das
Markermolekül 20 an dem 5-Ende des Adapterstrangs 52 vor.
Demgegenüber ist in der Ausführungsform der Figur 5 genau ein Markermolekül 20 (mittels einer chemischen Bindung 55) an dem Primer 18 angebunden. In diesem Fall wird eine Anbindung des Markermoleküls 20 an das 3 -Ende des Primers 18 bevorzugt.
Die in Figur 4 und 5 wiedergegebenen Anbindpositionen der Markermoleküle 20 sind jedoch lediglich beispielhaft zu interpretieren. Als das mindestens eine Markermolekül 20 kann ein Fluorophor eingesetzt werden. Als Alternative dazu kann jedoch auch ein dielektrischer Marker, wie insbesondere ein Metall -Nanopartikel , als Markermolekül 20 verwendet werden. Somit kann auch eine kapazitive Messung zum Ausführen der hier beschriebenen Verfahren genutzt werden.
Figur 6a-6c zeigen schematische Darstellungen zum Erläutern einer fünften Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs.
Bei der Ausführungsform der Figuren 6a-6c wird als der mindestens eine Primer 18 mindestens ein Primer 18 an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebunden, dessen Teilsequenz zusammen mit einer Teilsequenz des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 eine Restriktionssequenz für ein Restriktionsenzym 56 ergibt. Mittels des jeweiligen Restriktionsenzyms 56 wird anschließend ein nicht zu sequenzierender Teilstrang 58 des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 von einem zumindest teilweise zu sequenzierenden Reststrang 60 des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 abgetrennt (vergleiche Figuren 6a und 6b) .
Der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 wird anschließend auf die leitfähige Oberfläche mit der mindestens einen daran angebundenen Polymerase 16 gegeben. Somit kann der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit einem daran angebundenen Primer 18 an die mindestens eine Polymerase 16 binden und die oben bereits ausgeführten Verfahrensschritte sind durchführbar . Die Ausführungsform der Figuren 6a bis 6c eignet sich zum schnellen Re-Sequenzieren von Abschnitten, welche stochas- tisch verteilt vorliegen. Das entsprechende Verfahren kann auch mit zwei Primern 18 für den Forward- und den Reverse- Strang ausgeführt werden. Limitierend ist in diesem Fall nur die Bildung von Primer-Primer-Hybridisierungen bei einer Verwendung von vielen unterschiedlichen Primern 18.
Das Verfahren der Figuren 6a bis 6c eignet sich auch für eine Kombination aus Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) und Sequenzierung ohne eine Library-Präparation für die Sequenzierung. Beispielsweise wird in einem Mikrofluidik-Kanal eine Echtzeit- Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einem Molecular- Beacon-Primer ausgeführt. In diese Lösung wird in der Folge ein Restriktionsenzym 56 und die Polymerase 16 zugesetzt. Das an die Polymerase 16 gebundene und amplifizierte Produkt kann stochastisch auf der leitfähigen Oberfläche 14 in ausreichender Verdünnung verankert werden.
Die oben ausgeführten Verfahren ermöglichen eine markierungs- freie Sequenzierung. Insbesondere ist eine Sequenzierung mit einer im Vergleich zu ISFET-Messungen hohen Ionenstärke ausführbar. Eine Gesamtkonzentration der Ionen kann über 500 μΜ liegen. Eine Konzentration von Magnesium- Ionen kann z.B. grö- ßer als 100 μΜ sein. Ideal sind Konzentrationen von Magnesium-Ionen und einer Taq-Polymerase zwischen 0,5 bis 5 mM.
Alle mittels der Figuren 2 -6c wiedergegebenen Verfahren kön- nen mittels einer Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle 20 als eine Einzelstrangsequenzierung ausgeführt werden. Durch eine geeignete Wahl von Fluorophoren können auch Einzelmolekülmessungen ohne ein schnelles Bleichen des Fluorophors ausführbar sein. Als Alternative dazu kann jedoch auch eine Gruppe gleicher Nukleinsäureeinzelstränge 10 gleichzeitig mittels eines der Verfahren sequenziert werden. In einer Weiterbildung können auch verschiedenen
Nukleinsäureeinzelstränge 10 mit voneinander abweichenden Sequenzen, an welchen unterschiedliche Markermoleküle (direkt oder indirekt) angebunden sind/werden, gleichzeitig mittels eines der oben beschriebenen Verfahren sequenziert werden. Auf diese Weise können verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge 10 innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenziert werden .
Mittels der oben beschriebenen Verfahren können RNA-Stränge, DNA-Stränge und/oder PNA-Stränge sequenziert werden. Insbesondere kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenziert werden. Ein derartiger Mikro-RNA-Strang kann eine Anzahl von ungefähr 20 Nukleotiden, wie beispielsweise 21 bis 23 Nukleotide, aufweisen. Vorteilhafterweise muss ein derartiger Mikro-RNA-Strang vor seiner Sequenzierung nicht mehr mittels einer Restriktion fragmentiert werden.
Die Länge eines sequenzierbaren Nukleinsäureeinzelstrangs 10 hängt von der gestreckt vorliegt Stranglänge/der
Persistenzlänge ab. Somit sind in der Regel etwa 100 Basen mittels der oben erläuterten Verfahren verlässlich
ermittelbar. Es wird darauf hingewiesen, dass zum Ausführen der oben beschriebenen Verfahren keine Thiol-
Funktionalisierung des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 notwendig ist . Alle oben beschriebenen Verfahren ermöglichen eine sehr schnelle Sequenzierung. Es wird insbesondere darauf hingewiesen, dass zum Ausführen der oben beschriebenen Verfahren kei- ne Zwischenschritte zum Entfernen eines Fluorophors nach einer Polymerisierung notwendig sind.
Mittels der oben ausgeführten Verfahren kann auch eine Detek- tion eines Strangtyps mit mehreren Polymerasen 16 ausgeführt werden, bei welcher amplifizierte Nukleinsäureeinzelstränge 10 gerichtet zu einem Sensor mikrofluidisch transportiert werden .

Claims

Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs (10) mit: einer Probenhaiterung (12), an welcher eine leitfähige Oberfläche (14) befestigbar oder befestigt ist, wobei die leitfähige Oberfläche (14) derart funktionalisiert und/oder funktionalisierbar ist, dass mindestens eine Polymerase (16) an der leitfähigen Oberfläche (14) so anbindbar ist, dass der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang (10) mit mindestens einem an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10) angebundenen Primer (18) und mindestens einem an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10) und/oder dem mindestens einen Primer (18) angebundenen Markermolekül (20) an die an der leitfähigen Oberfläche (14) angebundene
Polymerase (16) anbindbar ist; gekennzeichnet durch eine Nukleotidzuführeinrichtung (22), mittels welcher verschiedene Typen von Nukleotiden (24) in einer vorgebbaren Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche (14) mit der mindestens einen angebundenen Polymerase (16), dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10) , dem mindestens einen angebundenen Primer (18) und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül (20) zuführbar sind; eine Anregungseinrichtung (28) , mittels welcher ein elektrisches Wechselfeld erzeugbar ist, mittels welchem der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang (10) mit dem mindestens einen angebundenen Primer (18) und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül (20) zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung (30) versetzbar ist, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche (14) und dem mindestens einen Markermolekül (20) variierbar eine Detektionsemrichtung (36), mittels welcher mindestens ein mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche (14) und dem mindestens einen
Markermolekül (20) variierendes Signal (38) ermittelbar ist; und eine Auswerteeinrichtung (40) , welche dazu ausgelegt ist, unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals (38) eine Polymerisierung eines Nukleotids (24) an den mindestens einen Primer (18) zu ermitteln, und eine Information (44) bezüglich eines Typs des an den mindestens einen Primer (18) polymerisierten Nukleotids (24) und/oder des komplementären Nukleotids des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs (10) auszugeben.
Sequenziervorrichtung nach Anspruch 1, wobei die
Sequenziervorrichtung eine Lichtemittiereinrichtung (46) umfasst, mittels welcher das mindestens eine
Markermolekül (20) anregbar ist, und die Detektionsein- richtung (36) für eine Detektion eines von dem mindestens einen Markermolekül (20) emittierten Lichts (38) als das mindestens eine variierende Signal (38) ausgelegt ist.
Sequenziervorrichtung nach Anspruch 2, wobei mittels der Lichtemittiereinrichtung (46) verschiedene Markermoleküle (20) mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig anregbar sind, und die Detektionseinrichtung (36) dazu ausgelegt ist, die von den verschiedenen Markermolekülen (20) emittierten Photonen zu detektieren und einem bestimmten Emissionspektrum der unterschiedlichen Emissionsspektren der Markermoleküle (20) zuzuordnen.
Sequenziervorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Detektionseinrichtung (36) für eine kapazitive Detektion des mindestens einen Markermoleküls (20) ausgelegt ist.
5. Sequenziervorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektionseinrichtung (36) für eine Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle (20) ausgebildet ist.
6. Sequenziervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Detektionseinrichtung (36) für eine gleichzeitige Detektion einer Vielzahl von Markermolekülen (20) ausgebildet ist.
7. Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines
Nukleinsäureeinzelstrangs (10) mit den Schritten:
Erzeugen eines elektrisches Wechselfelds an einer leitfähigen Oberfläche (14) mit mindestens einer an der leitfähigen Oberfläche (14) angebundenen Polymerase (16), an welche der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang (10) mit mindestens einem an dem mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang (10) angebundenen Primer (18) und mindestens einem an dem mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang (10) und/oder dem mindestens einen Primer (18) angebundenen Markermolekül (20) angebunden ist, derart, dass der mindestens eine
Nukleinsäureeinzelstrang (10) mit dem mindestens einen angebundenen Primer (18) und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül (20) zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung (30) versetzt wird, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche (14) und dem mindestens einen Markermolekül (20) variiert wird;
Zuführen von verschiedenen Typen von Nukleotiden (24) in einer vorgegebenen Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche (14) mit der mindestens einen angebundenen Polymerase (16), dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10), dem mindestens einen angebundenen Primer (18) und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül (20) ; Ermitteln mindestens eines mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche (14) und dem mindestens einen Markermolekül (20) variierenden Signals (38) ; und
Ermitteln einer Polymerisierung eines Nukleotids (24) an den mindestens einen Primer (18) und Festlegen eines Typs des an den mindestens einen Primer (18) polymerisierten Nukleotids (24) und/oder des komplementären Nukleotids des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs (10) unter
Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals (38) .
Verfahren nach Anspruch 7, wobei als der mindestens eine Primer (18) mindestens ein mit mindestens einem Metall - Nanopartikel als das mindestens eine Markermolekül (20) markierter Primer (18) an den mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang (10) angebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei als der mindestens eine Primer (18) mindestens ein Primer (18) mit einer ersten Nukleotidanzahl , welche kleiner als eine zweite Nukleotidanzahl mindestens eines an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10) legierten Adapterstrangs (52) ist, an den mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrang (10) angebunden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei als der mindestens eine Primer (18) mindestens ein Primer (18) an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang (10) angebunden wird, dessen Teilsequenz zusammen mit einer Teil- sequenz des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs
(10) eine Restriktionssequenz für ein Restriktionsenzym
(56) ergibt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei mittels des Restrikti onsenzyms (56) ein nicht zu sequenzierender Teilstrang (58) des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs (10 von einem zumindest teilweise zu sequenzierenden Reststrang (60) des mindestens einen
Nukleinsäureeinzelstrangs (10) abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei mittels einer Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle (20) eine Einzelstrangsequenzierung ausge führt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei eine Gruppe gleicher Nukleinsäureeinzelstränge (10) gleichzeitig sequenziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge (10) mit voneinander abweichenden Sequenzen, an welchen unterschiedliche
Markermoleküle (20) direkt oder indirekt angebunden sind, gleichzeitig sequenziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang (10) mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenziert wird.
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