WO2014088200A1 - 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Definitions
- Composition for the prevention, improvement or treatment of immune diseases including Bokryeongpi extract, white rice extract or male extract as an active ingredient
- the present invention is made by the task number E0121500 under the support of the Ministry of Knowledge Economy of the Republic of Korea, the research management professional organization of the task is the Korea Food Research Institute, the research project name is "Korea Food Research Institute main business", the research project name "allergic Daewoong functional Food R & D Project ", the lead organization is Korea Food Research Institute.
- the research period is from 01.01.2012 to 12.31.2012.
- the present invention is a composition for preventing, ameliorating or treating Thl-mediated autoimmune disease or Th2-mediated autoimmune disease comprising one or more extracts selected from the group consisting of Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract as an active ingredient and Thl-mediated A method for preventing, ameliorating or treating an immune disease or Th2-mediated immune disease.
- Allergy means “hypersensitivity”, and the Greek word “alios” comes from the word “transformed”. Allergy is a malfunction of the immune system, which means that substances that have little effect on the average person cause abnormal hypersensitivity reactions such as hives, itching, runny nose, and cough. Say. The incidence of such allergic diseases has been increasing worldwide in the last two decades (1, 2). The main growth factors include increased indoor living, development of new materials, the proliferation of allergens such as the introduction of foreign substances from foreign countries, instability of immune status due to environmental pollution and stress, and changes in diet. As such, the incidence of allergic diseases in modern people increases gradually, but most of the treatment methods depend on popular therapies such as antihistamines and steroids, and no fundamental treatments have been found (3).
- Type I-III is a humoral immune response (immediate) in which the antibody is involved
- type IV is a cellular immune response (delayed) in which the cells are directly involved.
- Type IV is delayed-type hypersensitivity Appear in the form of reaction.
- Most allergic reactions include type I asthma, rhinitis, conjunctivitis, food and drug allergies, and atopic dermatitis. In severe cases, anaphylaxis is a life-threatening condition.
- Type I immediate hypersensitivity reactions are divided into two stages.
- the first stage is Thl cell reaction that produces IL-12 and IFN- ⁇ , which inhibit the secretion of IgE and IgGl by the invasion of allergens and increase the secretion of IgG2a.
- Th2 cell reaction producing IL-4, IL-5 and IL-13 is inclined toward Th2, excessive immune response of Th2 secretes IL-4, IL-13, etc.
- IgE-specific antibodies produced are attached to the surface of mast cells or basophil to prepare for the development of allergy. It is said to be sensitized to allergens (5-7) (see Figure: "allergic diseases” and "Thl / Th2 balance").
- the second stage of allergic development is divided into the initial response and the posterior basement, and the initial reaction is an allergen reinvading the body, stimulating mast cells and causing degranulation, resulting in blood vessels caused by histamine, lipid metabolites, and cytokines. Expansion and the like, and the posterior basin is activated by infiltration of neutrophils, eosinophils, macrophages, Th2 cells, basophils, etc. into the tissues. Inflammation is a cause of atopic dermatitis, rhinitis, asthma (7). Among these degranulated secretion substances, histamine is the most well-known factor and is used as an important indicator of allergic symptoms in association with immediate type hypersensitivity reaction (8).
- Food allergies have been on the rise in the last 10 years in about 3-6% of children in developed countries (9). Food allergies occur for food that enters the body through the digestive tract and mainly correspond to type I hypersensitivity reactions. In the case of allergic patients, food allergens penetrate into the undigested state through the intestine (4, 10). Intestinal absorption of these allergens is the first step in the development of food allergens (11). The secretary is not only the organ responsible for digestion and absorption of nutrients, but is also involved in various bioregulations. Intestinal epithelial cells not only have major functions such as digestive absorption, barrier, and signal transduction / transformation, but also have a unique immune system (mucosal i ⁇ unity) and nervous system. You can never underestimate the role.
- intestinal epithelial cells limit the penetration of macromolecules by tight junctions as barriers, but when the junctions are damaged, permeability increases due to impaired barrier function, resulting in food allergy as well as celiac disease and acute pancreatitis. The disease develops (12-17). In other words, strengthening the intestinal barrier function through stabilization of tight junctions will prevent food allergies.
- the inventors have sought to develop natural products that can prevent or treat diseases, disorders or conditions caused by Thl or Th2 immune responses such as inflammatory diseases and allergies.
- Bokyeongpi (3 ⁇ 4 / cocos Wolf) extract, u ] (Cynanchym at rat urn Bunge) extract or male (r / sa na amurense) extract reduced Th-1 related cytokine production, Th-2 related cytokine.
- the present invention has been completed by confirming that there is a decrease in the production of caine, the passage of allergens to the intestinal epithelial cells, the degranulation of mast cells, the differentiation into Treg cells or the Treg cell stabilizing activity.
- the invention is selected from the group consisting of Fukryeongpi (3 ⁇ 4r / cocos Wolf) main liquor, white rice (>? 7 atratum Bunge) extract and male (Ar / saaz / a amurense) extract
- a composition for preventing, ameliorating or treating a Thl-mediated autoimmune disease or Th2-mediated autoimmune disease comprising an extract of at least one species as an active ingredient.
- the present invention provides a Thl-mediated immune disease or Th2-mediated method comprising administering to a subject one or more extracts selected from the group consisting of Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract. It provides a method for preventing, ameliorating or treating an immune disease.
- the inventors have sought to develop natural products that can prevent or treat diseases, disorders or conditions caused by Thl or Th2 immune response such as inflammatory diseases and allergies.
- the present inventors found that Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract reduced Th-1 related cytokine production, Th-2 related cytokine production, allergens decreased passage of intestinal epithelial cells, and degranulation of mast cells. , Induce differentiation into Treg cells or confirm that they have a Treg cell stabilizing activity.
- the extraction solvent used in the present invention is a polar solvent or a non-polar solvent.
- Polar solvents may be selected from (i) water, (ii) alcohol (preferably methane, ethanol, propane, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethane Or ethylene glycol), (iii) acetic acid, (iv) dimethyl-formamide (DMFO) and (v) dimethyl sulfoxide (DMS0).
- Non-polar solvents include acetone acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane nucleic acid, 2,2,4-trimethylpentane, decane, cyclonucleic acid, cyclopentane diisobutylene, 1-pentene, 1-chlorobutane , 1-chloropentane, 0-xylene diisopropyl ether, 2-chloropropane, toluene 1-chloropropane chlorobenzene, benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform dichloromethane, 1,2-dichloroethane, Aniline, diethylamine, ether, carbon tetrachloride and THF.
- the extraction solvent used in the present invention is (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methane, ethane, propane, butanol, etc.), ( c) a mixed solvent of the lower alcohol with water (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) butyl acetate, (h) 1,3-butylene glycol, (i) nucleic acid, or ( j) diethyl ether.
- the extraction solvent used in the present invention is ethane , or water.
- the extraction solvent used in the present invention is ethanol.
- Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract is not only obtained by using the above-mentioned extraction solvent, but also includes the one obtained by further applying the purification process.
- the fraction obtained through the purification method is also included in the white rice extract or male extract of Bokryeongpi extract of the present invention.
- the extract of Bokryeongpi of the present invention is a nucleic acid fraction of the ethanol extract of Bokryeongpi.
- Bokryeongpi extract, white rice extract or male extract used in the present invention may be prepared in a powder state by an additional process such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
- the term 'comprising as an active ingredient' means to include an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the following Bokryeongpi extract, white rice extract or male extract.
- the present invention is a composition extracted from natural botanical material of bokryeongpi, white rice or male as there is no side effect to the human body even in the case of overdose, the quantitative upper limit contained in the composition of the present invention is selected within the appropriate range by those skilled in the art It can be carried out.
- the compositions of the present invention are effective for inducing differentiation into Treg cells to prevent, ameliorate or treat Thl-mediated immune diseases or Th2-mediated immune diseases.
- Induction from T cells to Treg cells may be indicated by increased expression of Foxp3 or increased production of TGF- ⁇ , inducing Thl / Th2 balance by inducing Treg cells to induce Thl-mediated immune disease and / or Th2-mediated immune disease. Effective in the prevention, amelioration or treatment of
- Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract of the present invention induces differentiation into Treg cells.
- Bokyeongpi extract of the present invention increases the expression of Fox3p 1.5-5.0 times, 1.5-3.0 times, 2.0-3.0 times or 2.5-3.0 times compared to the control.
- the white rice extract of the present invention increases the expression of Fox3p by 1.2-5.0 times, 1.2-3.0 times, 1.5-3.0 times, 2.0-3.0 times or 2.5-3.0 times compared to the control.
- the male extract of the present invention increases the expression of Fox3p by 1,5-5.0 times, 1.5-3.0 times, 2.0-3.0 times or 2.5-3.0 times compared to the control.
- Increased expression of Fox3p means that Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract induces differentiation into Treg cells.
- the extract of Bokryeongpi of the present invention increases the production of TGF- ⁇ .
- Bokyeongpi extract of the present invention increases the production of TGF- ⁇ by 30-90%, 50-90%, 60-90%, 60-80% or 65-75% compared to the control group Let's do it.
- composition of the present invention is effective for preventing, ameliorating or treating Thl-mediated immune disease or Th2-mediated immune disease by having Treg cell stabilizing activity.
- Treg cell stabilization 'means that the activity of Treg cells is maintained.
- Bokryeongpi extract, white rice extract or male extract of the present invention has a Treg cell stabilizing activity.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 65-90% of the cells expressing foxp3 after three days of Treg cell culture. According to certain embodiments of the invention the ratio is 67-85%, 67-80%, 67-77%, 70-77% or
- the white rice extract of the present invention is 65-90% of the cells expressing foxp3 after 3 days of Treg cell culture. According to certain embodiments of the invention the ratio is 67-85%, 67-80%, 67-78%, 70-78% or
- the male extract of the present invention is 65-90% of the cells expressing foxp3 after 3 days of Treg cell culture.
- the ratio is 65-85%, 65-80%, 65-75%, 67-75%, 67-73%, 67-71% or 69-71%.
- the ratio of cells expressing foxp3 means that the Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract maintains Treg cell activity and thus has Treg cell stabilizing activity.
- Bokyeongpi extract of the present invention increases the ratio of cells expressing foxp3 3 to 25% after 3 days of Treg cell culture compared to the control. According to certain embodiments of the invention the ratio is 3-20%, 3-17%, 5-17%, 5-13%, 7-13% or 9-13%.
- the white rice extract of the present invention increases the ratio of cells expressing foxp3 after 3 days of Treg cell culture by 3 to 25% compared to the control. According to certain embodiments of the invention the ratio is 3-20%, 3-17%, 5-17%, 5-14%, 8-14% or 10-143 ⁇ 4.
- the male extract of the present invention increases the ratio of cells expressing foxp3ol after 3 days of Treg cell culture by 3 to 20% compared to the control. According to certain embodiments of the invention the ratio is 3-17%, 3-14%, 3-11%, 3-9%, 3-7% or 5-7%.
- Increasing the ratio of the cells expressing foxp3 means that Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract has Treg cell stabilizing activity.
- Bokryeongpi extract used for inducing or stabilizing Treg cells of the present invention has a concentration of 2-30, 5-30, 7-30, 9-30, 9-20, 9-15 or 9 -12 yg / ml.
- the concentration of Bokyeongpi extract is 2-30, 2-20, 5-20, 7-20, or 7-15 ug / ml.
- the white rice extract used for inducing or stabilizing Treg cells of the present invention has a concentration of 0.5-30, 0.8-30, 0.8-20, 0.8-15, 0.8-13 pg / ml.
- the white rice extract is 5-30, 7-30, 7-20, 7-15 or 9-12 yg / ml
- male extracts used for inducing or stabilizing Treg cells of the present invention have a concentration of 3, 200, 50-200, 70-200, 80-200, 90-200, 90-150 or 90 -120 yg / ml.
- the male extract has a concentration of 8, 150, 80-120 or 90-110 yg / ml.
- the compositions of the present invention can be used for the prevention or treatment of various Thl-mediated immune diseases, diseases or conditions.
- Thl-mediated immune disease refers to cytokines produced by the production and / or activity of Thl cells, such as IL- ⁇ , IL-2, IL-12, IL-17, IFN- ⁇ or IL-17 is a cytokine produced from Thl7 cells (CD4 + T cells), and its production includes TNF-a, IL-1 ⁇ , IL-6, and IFN- ⁇ . Cytokines are involved and production of IL-17 is induced by these cytokines. IL-17 is also involved in Thl-mediated immune diseases.
- Thl cell 1 refers to a subset of helper T cell lymphocytes that are characterized in terms of gene expression, protein secretion, and functional activity.
- Thl cells synthesize IL-2 and, but , IL-5, IL-10 and IL-13 represent non-synthesizing cytokine expression patterns
- Thl cells express cell-mediated immune response, organ-specific autoimmune disease and delayed hypersensitivity reactions to various intracellular pathogens. To get involved.
- the Thl-mediated immune disease to which the composition of the present invention is applied is not particularly limited. According to one embodiment of the invention, it is applied to transplant rejection, autoimmune disease or inflammatory disease. According to another embodiment of the invention, the Thl-mediated immune disease to which the composition of the invention is applied is an autoimmune disease or an inflammatory disease, and according to certain embodiments of the invention, colitis, inflammatory bowel disease, type 1 diabetes, type 2 diabetes and rheumatoid arthritis.
- Thl-mediated autoimmune diseases to which the composition of the present invention is applied include colitis, inflammatory bowel disease, type 1 diabetes, type 2 diabetes, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, osteoarthritis, psoriasis, scleroderma, porosity, and atherosclerosis.
- Arteriosclerosis myocarditis, endocarditis, pericarditis, cystic fibrosis, Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease, leprosy, syphilis, Lyme disease, Borrel iosis, angio-Botelosis, tuberculosis, Sarcoidosis , Lupus, discus lupus, alumni lupus, lupus nephritis, systemic lupus erythematosus, asthma, macular degeneration, uveitis, irritable bowel syndrome, Croy's disease, Sjogran syndrome, fibromyalgia chronic fatigue syndrome, chronic fatigue immunodeficiency syndrome, myalgia encephalomyelitis , Amyotrophic lateral sclerosis, Parkin's disease, multiple sclerosis, autism spectrum disorder, attention deficit disorder and attention deficit hyperactivity disorder It includes one, and the like.
- compositions of the present invention can be used for the prevention or treatment of various Th2-mediated immune diseases, diseases or conditions.
- Th2-mediated immune disease refers to a disease involving IgE and mast cells by the production and activity of allergen-specific Th2 cells.
- Th2 cell refers to a subset of helper T cell lymphocytes that are characterized in terms of gene expression, protein secretion and functional activity. For example, Th2 cells exhibit IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13 cytokine expression patterns. Th2 cells are involved in humoral immune response.
- the Th 2′-mediated immune disease to which the composition of the present invention is applied is not particularly limited, and according to one embodiment of the present invention, the Th 2 -mediated immune disease is an allergic disease.
- the term 'allergy' refers to various diseases, diseases or abnormalities caused by hypersensitivity to certain substances in the human body, ie, excessive reaction of the body's immune system to substances from outside.
- Allergic diseases applied to the composition of the present invention are preferably type I immediate hypersensitivity reactions and type IV delayed hypersensitivity reactions.
- Type I immediate hypersensitivity reactions include bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis, allergic otitis media, urticaria and anaphylactic shock ⁇ ⁇ ; ⁇ shock), type IV delayed hypersensitivity Reactions are contact hypersensitivity, allergic contact dermatitis, bacterial allergy, fungal allergy, viral allergy, drug allergy, thyroiditis and allergic encephalitis.
- Type I immediate hypersensitivity reactions are divided into two stages.
- the first stage is Thl cell reaction that produces IL-12 and IFN- ⁇ , which inhibit the secretion of IgE and IgGl by the invasion of allergens and increase the secretion of IgG2a.
- Th2 cell reaction producing IL-4, IL-5 and IL-13 is inclined toward Th2, excessive immune response of Th2 secretes IL-4 and IL-13, and B cells IgE-specific antibodies generated are attached to the surface of mast cells and basophils (basophi 1) is a step of preparing an allergic layer. It is said to be sensitized to allergens.
- the second stage of allergic development is divided into the initial reaction and the posterior basement, and the initial reaction is an allergen reinvading the body, stimulating mast cells and causing degranulation reaction, which is released at this time, such as histamine, lipid metabolites, cytokines, etc. Vascular dilatation, etc., and the late reaction is activated by invasion and activation of neutrophils, eosinophils, macrophages, Th2 cells, basophils in the tissue. It causes atopic dermatitis, rhinitis, and asthma. This degranulation-secreting histamine is the most well known factor and is used as an important indicator of allergic symptoms associated with immediate type hypersensitivity.
- Allergic diseases to which the compositions of the present invention are applied include, but are not limited to, atopic dermatitis, other dermatological diseases associated with atopic dermatitis, allergic rhinitis (acute or chronic), high fever, asthma and food allergies.
- the allergic disease of the invention is asthma, allergic rhinitis, allergic dermatitis, allergic atopic dermatitis or food allergy.
- the allergic disease of the invention is a food allergy.
- the extract of the present invention inhibits degranulation of mast cells.
- the term 'degranulation' refers to a process in which antimicrobial cytotoxic molecules are released from secretory vesicles, which are granules present in certain cells.
- specific cells include granulocytes (eosinophils, eosinophils and basophils) in the immune system and specific lymphoid cells such as mast cells and natural killer cells and cytotoxic T cells.
- the extract of Bokryeongpi of the present invention inhibits 5-95%, 5-80% or 7-80% of mast cell degranulation. According to some embodiments of the present invention, the extract of Bokryeongpi of the present invention inhibits mast cell degranulation by 10-90% or 10-80%. According to certain embodiments of the invention, the white rice extract of the present invention inhibits mast cell degranulation by 50-95%, 50-90%, 60-90% or 60-80%.
- the extract of Bokryeongpi used for mast cell degranulation of the present invention has a concentration of 0.005-10, 0.007-10, 0.3-10, 0.5—10, 0.8-10, 0.8-5, 0.8-3 , 0.8-2, 0.8-1.5 or 0.8-1.2 yg / ml.
- the extract of Bokryeongpi used for mast cell degranulation of the present invention is 0.3-5, 0.5-5, 0.5-3, 0.5-2 or 0.5-1.5 ug / ml.
- the white rice extract of the present invention inhibits mast cell degranulation by 3%, 40-90%, 40-80% or 40-70%. According to some embodiments of the present invention, the white rice extract of the present invention inhibits mast cell degranulation by 50-90%, 50-80% or 5%. In certain embodiments of the invention According to the present invention, the white rice extract inhibits 60-90%, 60-80% or 60-75% of mast cell degranulation.
- the white rice extract used for mast cell degranulation of the present invention has a concentration of 005-10, 0.007-10, 0.01-10, 0.03-10, 0.05-10, 0.08-10, 0.1- 10, 0.3-10, 0.5-10, 0.8-10, 0.8-5, 0.8-3, 0.8-2, 0.8-1.5 or 0.8-1.2 iig / ml.
- the white rice extract used for mast cell degranulation of the present invention is 0.005-5, 0.007-5, 0.01-5, 0.03—5, 0.05-5, 0.08—5, 0.1-5, 0.3 —5, 0.5—5, 0.5-3, 0.5-2 or 0.5-1.5 yg / ml.
- the white rice extract used for mast cell degranulation of the present invention is 0.005-5, 0.005-3, 0.005-2, 0.007-2 or 0.007-1.5 yg / ml.
- the male extract of the present invention inhibits mast cell degranulation by 30-90%, 40-90%, 50-90%, 50-80% or 60-80%.
- the male extract used for mast cell degranulation of the present invention has a concentration of 0.005-10, 0.007-10, 0.007-5, 0.007-3, 0.007-2, 0.007-1.5 or 0.007-1.2 yg / ml.
- the main feature of the present invention is that the composition of the present invention has the activity of inhibiting the Th2 immune response.
- the white rice extract of the present invention inhibits IL-4 production. According to another embodiment of the present invention, the white rice extract of the present invention is 20-70%, 30-70%, 40-70%, 40-60%, 40-55% or 45 compared to the control group Suppresses -50%
- the extract of Bokryeongpi of the present invention inhibits the production of one or more Th2-related cytokines selected from the group consisting of IL-4, IL-5, IL-10 or IL-13. .
- Bokryeongpi extract of the present invention is 10-99%, 20-99%, 30-99%, 40-99%, 40-90%, 40 compared with the control group Inhibits -80%, 40-70%, 40-60% or 40-50%.
- Bokyeongpi extract of the present invention inhibits IL-4 production by 50-99%, 50-90%, 50-80%, 60-80% or 60-70% compared to the control group.
- the extract of Bokryeongpi of the present invention is IL-4 compared to the control Inhibits production 50-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99% or 80-90%.
- Bokyeongpi extract used for inhibiting IL-4 production of the present invention has a concentration of 2-50, 5-50, 7-50, 7-40 or 7-35 yg / mi.
- Bokyeongpi extract used for inhibiting IL-4 production of the present invention has a concentration of 2-30, 2-20, 5-20, 7-20, 7-15 or 9-12 ug. / ml.
- Bokyeongpi extract which is dissolved in the IL-4 production inhibition of the present invention has a concentration of 9-50, 15-50, 20-50, 20-40, 25-40, 25-35 or 28-32 ug / ml.
- Bokyeongpi extract used to inhibit IL-4 production of the present invention has a concentration of 5-50, 10-50, 10-40, 20-40, 20-35, 20-30 or 23 -27 mg / kg body weight.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 20-90%, 30-90%, 30-80%, 30-70%, 30-60%, 30 compared to the control group IL-5 production Suppresses -50% or 40-50%
- Bokyeongpi extract of the present invention is 20-99%, 30-99%, 30-99%, 40-99%, 40-90%, 40 compared to the control group IL-10 production Inhibits -80%, 40-70%, 40-60% or 50-60%.
- Bokyeongpi extract of the present invention inhibits IL-10 production by 50-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99% or 90-99% compared to the control group.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 5-50), 5-40%, 5-30%, 10-30%, 10-25% or 15 compared to the control group IL-13 production Suppresses -20%
- the extract of Bokryeongpi of the present invention inhibits the production of one or more Thl-related cytokines selected from the group consisting of IL-17 and.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 20-90%, 30-90%, 30-80%, 40-80%, 40-70%, 40 compared to the control group Inhibits -60% or 45-55%
- Bokyeongpi extract of the present invention is 20-99%, 30-99%, 40-99%, 50-99%, 60-99%, 70 compared to the control group IFN-Y production Inhibits -99%, 80-99% or 90-99%.
- the "bokryeongpi extract for use in the inhibition of IL-17 generation invention the concentration is 2-30, 2-20, 5-20, and 20, 7-15, or 9-12 yg / ml.
- the extract of Bokryeongpi of the present invention is in serum Inhibits the production of one or more antibodies selected from the group consisting of IgE, IgG2a and IgGl.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 10-70%, 10-60%, 20-60%, 20-50%, 30-50%, 30 compared to the control group IgE production Inhibits -45%, 35-45% or 35-40%.
- Bokyeongpi extract of the present invention compared to the control group IgG2a production in serum 10-70% ⁇ 10-60%, 20-60%, 20-50%, 30-50%, 30 Inhibits -45%, 35-45% or 35-40%.
- Bokyeongpi extract of the present invention is 10-80%, 20-80%, 30-80% 30-70%, 40-70%, 40- 60% or 45-55%.
- IgE, IgG2a, IgGl IgE, IgG2a, IgGl,
- Bokryokpi extract used to inhibit IL-5, IL-10, IL-13, INF- ⁇ or TGF- ⁇ production has a concentration of 5-50, 10-50, 10-40, 20-40, 20-35, 20 -30 or 23-27 mg / kg body weight.
- the white rice extract or male extract of the present invention inhibits the passage of allergens to epithelial cells.
- the epithelial cell layer is intestinal epithelial cell layer.
- the white rice extract of the present invention inhibits 30-80%, 40-80%, 40-70%, 50-70% or 50-60% of allergens through the epithelial cell layer compared to the control group. do.
- the male extract of the present invention inhibits the passage of epithelial layer of the allergen by 5-30, 10-30%, 10-20% or 15-20% compared to the control group.
- the composition comprising white rice extract or male extract of the present invention or a combination extract thereof as an active ingredient prevents Thl-mediated immune disease or Th2-mediated immune disease.
- composition for the prevention, improvement or treatment of Thl-mediated autoimmune disease or Th2-mediated autoimmune disease comprising at least one extract selected from the group consisting of Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention as an active ingredient, an antihistamine composition,
- the anti-inflammatory composition is a pharmaceutical composition, a food composition, a functional food composition, a cosmetic composition or a feed composition.
- composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition.
- the composition of the present invention (a) Pharmaceutically effective amount of at least one extract selected from the group consisting of the above-mentioned Bokryongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of one or more extracts selected from the group consisting of the above-mentioned Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract.
- the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
- Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, phosphate, alginate, Gelatin, silicate, microcrystalline cellulose, pulley vinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavour, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the component stones.
- a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol
- composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and according to one embodiment of the present invention, orally.
- Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be variously prescribed by factor stones, such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction sensitivity of the patient. Can be. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
- compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
- the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium or as an excipient, powder, powder, granule, tablet or voxel It may also be in the form, but may further include a dispersant or stabilizer.
- the composition of the present invention may be provided as a food composition. Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention selected from the group consisting of
- compositions for preventing, ameliorating or treating Thl-mediated immune disease or Th2-mediated immune disease comprising at least one extract as an active ingredient
- a food composition as well as Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract as an active ingredient
- ingredients commonly added in the manufacture of food products include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
- Examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and xyl, sorby, and erythritol.
- sweetening agents natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
- the food composition of the present invention is prepared with a drink
- in addition to the Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract of the present invention citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, bilayer extract, jujube extract, licorice extract, etc. May be further included.
- At least one extract selected from the group consisting of Bokyeongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention as an active ingredient ⁇ 3 ⁇ 41-mediated immune disease or composition for the prevention, improvement or treatment of 2-mediated immune disease is a functional food It can be made into a composition.
- the composition of the present invention contains ingredients that are commonly added in food production, for example, protein, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
- ingredients that are commonly added in food production for example, protein, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
- flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional ingredients.
- natural carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose and the like); Polysaccharides; polysaccharides (eg, textulin, cyclodextrin, etc.); And sugar alcohols (e.g., Xili, Sorbi, Eritri, etc.).
- sweetening agents natural flavoring agents (eg tamarin, stevia extract, etc.) and synthetic flavoring agents (eg saccharin aspartame, etc.) can be used.
- the composition of the present invention can be made into a cosmetic composition. Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention selected from the group consisting of
- compositions for preventing, ameliorating or treating a Thl-mediated immune disease or a Th2-mediated immune disease comprising at least one extract as an active ingredient
- cosmetics other than Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract as active ingredients Includes ingredients commonly used in compositions, including conventional auxiliaries such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavors, and carriers.
- Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing It may be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
- the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
- animal oil, vegetable oil, wax, paraffin starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
- animal oil vegetable oil, wax, paraffin starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide
- tracant cellulose derivative
- polyethylene glycol silicone
- bentonite silica
- lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
- a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, for example water, ethane, isopropanol ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 , 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan fatty acid esters.
- water and ethane are used as carrier components.
- liquid diluents such as propylene glycol, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, Agar or tracant and the like can be used.
- the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
- Fatty acid esters such as ether sulfate, alkylamidobetaine aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol can be used.
- composition of the present invention can be made into a feed composition.
- Bokryeongpi extract, white rice extract and male extract of the present invention selected from the group consisting of
- compositions for preventing, ameliorating or treating a Thl-mediated immune disease or a Th2-mediated immune disease comprising at least one extract as an active ingredient
- the bokyeongpi extract, white rice extract or male extract is prepared as it is or as a feed preparation. It may be prepared by adding an additive commonly added during the process. For example, various nutrients such as vitamins, amino acids, minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents and other additives. Shapes include powders, granules, pellets or suspensions.
- the composition of the present invention When the composition of the present invention is made of a feed composition, it can be supplied alone or in combination to the feed for terrestrial or aquatic animals.
- the feed of the present invention includes a powder feed, solid feed ⁇ moist pellet feed, dry pellet feed, EP (Ext ruder Pellet) feed, fly feed, and the like, but is not limited thereto.
- the present invention provides a composition for preventing, ameliorating or treating Thl-mediated immune disease or Th2-mediated immune disease based on Bokryeongpi, white rice or male.
- the composition of the present invention is excellent in Thl-related cytokine production inhibitory activity, Th2-related cytokine inhibitory activity, degranulation inhibitory activity of mast cells, allergen-induced differentiation into enteric epithelial layer, induction of differentiation into Treg cells or Tregs have cell stabilizing activity.
- the present invention provides a detailed mechanism of action of natural and food derived anti-allergic substances.
- the present invention can provide stability, reduction of production cost and ease of use by using natural products as materials. [Brief Description of Drawings]
- FIG. Lb shows the effect of white rice extract on allergen passage of allergens
- FIG. Lc shows TEER Transepitherial Electrical Resistance, ⁇ Xcin 2 ) levels and allergens of allergens on allergen intestinal epithelial passage. Shows the effect of male extract on.
- 2A shows the effect of Bokyeongpi extract on Th-2 related cytokines (IL-4 and IL-10 production) in mouse splenocytes.
- 2B shows the effect of Bokyeongpi extract on mouse splenocytes Th-2 related cytokines (IFN-Y and IL-17).
- 2C shows the effect of white rice extract on IL-4 production of mouse splenocytes.
- 3a to 3c show the effects of Bokyeongpi extract, white rice extract and male extract on degranulation of mouse mast cells, respectively.
- Figures 4a and 4b shows the effect of Bokyeongpi extract on the differentiation of Treg cells in mouse spleen and lymph node cells to increase Fox3p expression and TGF- ⁇ production
- Figure 4c shows the effect on the Treg cell stabilizing activity of Bokyeongpi extract As a result showing, the stabilizing activity of the Treg cells analyzed by ultrafast flow cytometry and it is shown graphically.
- Figure 5a shows the effect of white rice extract on the induction of differentiation into Treg cells in mouse spleen and lymph node cells
- Figure 5b shows the effect on the Treg cell stabilizing activity of the white rice extract as a high-speed flow cell separator Analyzed stabilization activity results and graphs thereof
- Figure 6a shows the effect of male extract on the induction of differentiation into Treg cells in mouse spleen and lymph node cells
- Figure 6b shows the effect on the Treg cell stabilizing activity of the male extract, as a result of the ultrafast flow cell separator Analyzed stabilization activity results and graphs thereof.
- Figure 7 shows the anti-allergic activity of Bokryeongpi extract at 2 /.
- 7a shows the inhibitory activity of IgE, IgG2a and IgGl production in serum of Bokyeongpi extract
- FIG. 7b shows the inhibitory activity of Thl-related cytokine production
- FIG. 7c shows the inhibitory activity of Th2-related cytokine production
- FIG. 7d shows Treg cell differentiation. Shows inducing activity.
- FIG. 8 shows a sketch for preparing a food allergy model.
- Figure 9 shows the results of the measurement of the effect on food allergy of Bokyeongpi extract by anaphylaxis, diarrhea reaction and rectal temperature changes.
- ⁇ shows the effect on the production of cytokines in the spleen of the food allergy model of Bokyeongpi extract.
- Figure 10a shows that Bokyeongpi extract has the Th2-related cytokine IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13 production inhibitory activity
- Figure 10b is in vivo Trek cytokine associated with the expression of foxp3 Phosphorus TGF- ⁇ production shows increased activity.
- FIG. Lla shows the addition of 95% ethanol extract of Bokryong-Phi, extracts from nuclear-acid fraction (Hexane Fr.), chloroform fraction (Chloroform Fr.), ethyl acetate fraction (Ethyl acetate Fr.), butane fraction (Butanol Fr.) and water fraction ( Water Fr.).
- Lib shows that the hexane fraction of the five fractions of the extract of Bokryeongpi has foxp3 inducing activity.
- Example 1 Securing Samples and Preparing Solvent Extracts
- ATCC-derived Caco-2 cell line (HTB-37) added 10% FBSCFetal Bovine Serum (DMEM), 1% 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, and 0.1 ⁇ non-essential amino acids to Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Subcultured at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
- DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Medium
- the culture medium was used to transfer Caco-2 cells onto the transmembrane, which is the apical side of a 12 well plate transwell, 2 ⁇ 10 5 cells / 0.5 ml was dispensed at a density of ml.
- Caco-2 single cell layer was washed three times with HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), and then white rice extract (final concentration: 400 ug / ml) or male extract (final concentration: 400 ug / ml) was used as bile salts (final). Concentration: 100-150 pg / ml) was added to the upper layer and then treated for 1 hour at 37 ° C, 5% C0 2 incubator. Next, 0VA (0valbumin, final concentration: 400 yg / ml) was added to the upper layer and reacted for 3 hours at 37 ° C, 5% C0 2 incubator, and then again measured TEER value.
- the TEER value was higher than the positive control group treated with the OVA alone.
- the concentration of the OVA passed through the lower layer liquid was recovered from the solution by means of sEL ISA (sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
- the amount of OVA passed in the lower layer was calculated as follows:
- H represents the reaction time (3h) after 0VA addition to the upper layer of Caco_2 single cell layer
- S represents the surface area of the upper layer (1.12 cm 2 ) of the transwell plate.
- Anti-rabbit-0VA antibodies diluted at a concentration of 2 yg / ml in coating buffer ((tris hydroxymethyl) aminomethane 0.05 M, pH 9.0) were dispensed in 100-well for each well in a 96-well plate at 4 ° C. I stayed overnight at. Coated 96-well plates were washed with PBS (Phosphate Buffered Saline) containing a complete buffer solution Tween 20; PBST, 0.138 M NaCl, 0.0127 M KCl, and 0.01 M phosphate complete solution containing 0.05% Tween 20).
- PBS Phosphate Buffered Saline
- Standard 0VA and the recovered solution which was distilled in HBSS in a constant multiple, were added to 100 ⁇ l per well and reacted at room temperature for 1 hour.
- anti-OVA antibody-bound biotin was reacted with PBST at a certain concentration and treated with 100 ⁇ / well for 1 hour at room temperature.
- avidin (avidin) -HRP was reacted with PBST at a certain concentration, treated with 100 ⁇ per well, and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, washing was performed with washing buffer as mentioned above.
- phenyl propionic acid / phosphate buffer 36 mM, pH 7.0
- H 2 0 2 0.002% was added and 1 M NaOH-glycineCl M glycine / 1 M NaOH was added as a semiungung still solution, and 100 ⁇ / well was used as a fluorescent microplate reader. Fluorescence was measured at 320/405 nm (Ex./Em. Wavelength).
- Thl / Th2 cytokine balance control activity test (e vivo) by extracts Mouse splenocytes immunized with OVA
- the cells were washed twice with 5 ml of basic medium and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 1 ml of Red Blood Cell (RBC) lysis complete solution (SIGMA R7757, USA) was added and shaken by hand. The solution was suspended for 3 minutes and then reacted on ice for 3 minutes. Two centrifugations were performed for 5 minutes at rpm. 96-well plates were treated with antigen (0VA, 100 yg / ml) and the extracts prepared at each concentration were added, and the concentration of splenocytes was treated with 5 ⁇ 10 6 cells / well. Next, after incubation for 72 hours at 37 ° C, C0 2 incubator, the supernatant was recovered. Cytokine Analysis of Splenocyte Culture Supernatants
- Splenocyte culture supernatants treated with antigen (0VA, 100 ug / ml) and extracts at each concentration were recovered after 72 hours and used for cytokine analysis.
- BD OptEIATl MOUSE ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) for cytokine analysis ) Kit was used and the experiment was carried out according to the test method specified in the kit. Briefly, capture antibodies were placed overnight at 4 ° C. in 96 well plates. Coated 96-well plates were washed with wash complete solution (PBST) and then analyzed with analyte (10% FBS PBS) was added to each well of 200 ⁇ and blocked for 1 hour at room temperature.
- PBST wash complete solution
- IL-4 production of splenocytes was 65.1%, 30 pg / ml compared with the control group when 10 U g / ml Bokyeongpi extract was added.
- Addition of Bokryokpi extract reduced 86.5% and decreased IL-10 production by 95% (FIG. 2A), decreased IFN- ⁇ production by 95.8% and IL-17 production by 50.53 ⁇ 4> (FIG. 2B).
- IL-4 production of splenocytes was reduced by 47.2% when 10 ug / ml white rice extract was added (FIG. 2C).
- Bokryeongpi extract reduces the Thl immune response, Thl7 immune response or Thl / Thl7 immune response.
- mice were anesthetized with ether, hit with the head of the head and lethal, and then injected with about 10 m of medium (pH 7.4) into the abdominal cavity of the mouse and lightly massaged the abdominal wall for 90 seconds.
- the abdominal wall center line was cut and the peritoneal lavage fluid was collected with an eyedropper, centrifuged at 100Xg for 10 minutes, and then the supernatant was discarded.
- the same medium was used to make a peritoneal suspension with 1X10 6 cells / ml of mast cells. Observation of morphological changes of mast cells
- mast cells were observed with an inverted microscope (Olympus Japan) using a hemacytometer under a magnification of 400 times. Most forms of normal mast cells were circular or ovoid, with clear cell outlines and many granules in the cytoplasm. The diameter of the mast cells was approximately 10-20 times larger than other cells of the peritoneal suspension (lymphocytes or neutrophils).
- mice 6-8 week old female balb / c mice were purchased from Charles River Laboratories. Mice were bred in animal testing facilities at the College of Pharmacy, Seoul National University (Seoul, Korea). All experiments were performed in accordance with the regulations and guidelines of the Seolleul University Animal Testing Committee. Preparation of Bokryeongpi Extract, White Rice Extract and Male Extract
- Bokyeongpi extract, white rice extract and male extract were obtained from Korea Food Research Institute as dissolved in DMS0 (Di methyl Sulfoxide) at a concentration of 25-100 rag / ml, respectively.
- DMS0 Di methyl Sulfoxide
- extract of the above concentration was added to the cell culture medium, complete medium (10% FBS in Gibco RPMI, 1% penicillin / streptomycin, 1% sodium pyruvate 1% non-essential amino acid 1% HEPES 2.5%, ⁇ - Media using 0.1% of mergatoethanol).
- complete medium 10% FBS in Gibco RPMI, 1% penicillin / streptomycin, 1% sodium pyruvate 1% non-essential amino acid 1% HEPES 2.5%
- ⁇ - Media using 0.1% of mergatoethanol As a control, the same medium as the extract was added with only DMS0 as a solvent to the complete medium.
- mice were euthanized with C02 and the spleen and lymph nodes were separated and passed through a 70 ⁇ strainer to obtain a single cell suspension.
- naive CD4 T cells stained with CD25-PE antibody (eBioscience), followed by anti-PE, anti-CD8ci, anti-B220 and anti-CDllb beads (Miltenyl Biotec), and magnetic-activated MACS CD4 T cells were enriched by depletion with Cell Sorting.
- CD62L-Biotin antibody (eBioscience) and anti-biotin beads (Miltenyl Biotec) were then attached and MACS screened to obtain non-sensitized CD4 T cells.
- Antigen-presenting cells were obtained by RBC lysing single cell suspensions obtained from spleen and lymph nodes, followed by MACS depletion with CD3-biotin antibody (eBioscience) and anti-biotin beads (Miltenyl Biotec). In vitro cell culture
- Non-sensitized T cells were challenged with 2 ug / ml anti-CD3 overnight in 96-well flat plates for antibody stimulation conditions. Coated and added with 1 pg / ml anti-CD28 dissolved with unsensitized CD4 T cells 5 ⁇ 10 4 cells / well.
- For antigen presenting cell stimulation conditions 96-well U-bottom poolate was added with the anti-CD3 antibody dissolved and antigen-presenting cells were added at 6 ⁇ 10 4 cells / well with non-sensitized CD4 T cells 3 ⁇ 10 4 cells / well. Incubated.
- Recombinant mouse IL-2 was added at a concentration of 10 ng / ml under both conditions, and an extract diluted to the desired concentration was added to each well. This was incubated for 72 hours at 37, 5% C0 2 conditions, and the cells were collected and analyzed. Intracellular Foxp3 Staining and Flow Cytometry
- the cultured cells were harvested by PBSNC 0.14 M NaCl, 0.003 M C1, 0.01 M Na 2 HP0 4 ,
- cytokine in the splenocyte culture supernatant was analyzed to investigate the effect of Bokyeongpi extract on the cytokine production of splenocytes.
- the production of Treg cytokine TGF- was increased by 70.3% when the 10 ug / ml Bokyeongpi extract was added (Fig. 4b bottom).
- the effect of TGF- production on the extract of Bokryeongpi is confirmed that Bokryeongpi extract induces differentiation into Treg cells.
- foxp3 is characterized by a weak expression ability of the gene promoter itself, and other foxp3 regulatory elements affect the expression on chromatin.
- f oxp3-CNSl Formhead box P3-Conserved Noncoding Sequencel
- NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor-beta
- Foxp3 expressed in this way is not permanently maintained, and its expression may be lost due to various causes such as changes in DNA methylation.
- manipulation of Treg cells in vitro and cross-linking 0X40 (CD134), a member of the TNFC Tumor Necrosis Factor receptor superfamily results in the loss of foxp3 expression and Treg cell immunosuppression. Therefore, it was confirmed whether the expression of Foxp3 was maintained whether Bokryeongpi extract, white rice extract or male extract had Treg cell stabilizing activity.
- Foxp3-GFP mice were used to confirm whether Bokyeongpi extract, white rice extract or male extract can maintain the expression of foxp3. Since the mouse expresses GFP (Green Fluorescence Protein) fluorescence with foxp3 in the nucleus, the mouse can confirm its induction into Treg cells without the in-nuclear staining process, which must make the cells permeable. However, since the mouse used in the experiment was a C57BL / 6 strain, the foxp3 induction effect confirmed through the Balb / c mouse was confirmed once again in the C57BL / 6 mouse to confirm the same effect.
- GFP Green Fluorescence Protein
- Treg cells generated from the thymus in Foxp3-GFP mice expressed fluorescence by themselves and were able to be isolated via FACS and confirmed near 100% purity. After culturing the Treg cells, the ratio of cells expressing foxp3 after 3 days was reduced to about 63.43% (Ctrl: control). This is because the expression of foxp3 is regulated by several factors as described above, and the condition is not established in the culture process.
- Cytokines were analyzed using a BD ⁇ 03 ⁇ 6 ⁇ 31 ⁇ kit, and the Th2-related cytokines IL-5, IL-10 and IL-13 and Thl-related cytokines INF-Y and Treg cytokines. TGF- ⁇ was analyzed.
- IgE, IgG2a and IgGl decreased by about 37.9%, about 38.4%, and about 49.7%, respectively, when orally administered 95% ethanol extract of Bokryongpi (Fig. 7a) and IL-, a Th2-related cytokine. 5, IL-10 and IL-13 production were reduced by about 43.1%, about 56.8% and about 17.3%, respectively (FIG.
- Bokryokpi extract reduced serum IgE, IgG2a and IgGl, decreased Th2-related cytokine production, decreased Thl-related cytokine production, and increased Treg cytokine production in phosphorus ⁇ .
- Ha barkyeongpi extract shows that it has anti-allergic activity.
- Example 8 Bokyeongpi extract activity test in food allergy model Preparation of food allergy model
- BALB / C females of 5 weeks of age were purchased and allergens were induced by intraperitoneal administration of OVA 20 ⁇ ig and alum 2 mg after a week-long debulking period.
- Bokyeongpi extract at 25 mg / kg (body weight)
- orally administered 50 mg of OVA every three days to induce food allergy As a positive control, dexamethasone (2.5 mg / kg (body weight)) was administered in the same manner as the administration group of Bokryeongpi.
- the detailed schedule is shown in FIG. Measures diarrhea, anaphylaxis reaction and changes in rectal temperature
- the spleen of the food allergy model was treated with 0VA 100 ug / ml, and after 72 hours of incubation, the supernatant was recovered and analyzed for cytokines.
- the BD OptEIATM MOUSE EL I SA (Enzyme-1 inked Immunosorbent Assay) kit was used, and the test method was carried out according to the test method specified in the kit.
- the production of Th2-related cytokines IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13 of splenocytes was about 47.3%, about 34.5%, and compared with the control group, respectively. 36.73 ⁇ 4, about 37.7% decreased (FIGS. 10A and 10B), and the in vivo cytokine TGF- ⁇ related to the expression of Treg cytokine foxp3 was increased by about 51.6% (FIG. 10C).
- Bokryeongpi 95% ethanol extract is concentrated, and the 953 ⁇ 4 ethanol extract of the lyophilized Bokryeongpi is dissolved in water, first extracted with hexane (hexane), a low polar solvent, and the filtered sample is again chloroform and ethyl acetate (ethyl). acetate) and butane were separated into 5 fractions, each of which was fractionated 3-4 times sequentially with (butanol).
- the foxp3 induction activity of the five fractions was isolated.
- the activity measuring method is the same as the above-described foxp3 induction activity method.
- foxp3 inducing activity in the hexane fraction of the five fractions Fig. Lib and 11c.
- Li 1 i Gu, Ning Li, Qiurong Li The effect of berber ine in vitro on tight junctions in human Caco-2 intestinal epithelial eel Is.
- Fermented barley extract suppresses the deve 1 opment of atopic dermatitis ⁇ like skin lesions in NC / Nga mice, probably by inhibiting inflammatory cytokines. Biosci Biotechnol Biochem 73: 489-493 (2009)
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Abstract
본 발명은 Th1-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, Th1-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료방법 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 우수한 Th1-관련 사이토카인 생성 억제 활성, Th2-관련 사이토카인 생성 억제 활성, 비만세포의 탈과립 억제 활성, 알레르겐의 장상피세포층 통과 억제 활성, Treg 세포로의 분화 유도 활성, Treg 세포 안정화 활성을 갖는다. 또한, 본 발명은 천연물 및 식품 유래 항알레르기 물질의 세부적인 작용기전을 제공하고, 천연물을 소재로 이용하여 안정성, 생성비용의 감소 및 사용의 편이성을 제공할 수 있다.
Description
【명세서】
【발명의 명칭】
복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 발명은 본 발명은 대한민국 지식경제부의 지원 하에서 과제번호 E0121500 에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국식품연구원, 연구사업명은 "한국식품연구원 주요사업" , 연구과제명은 "알레르기 대웅 기능성식품 연구개발 사업" , 주관기관은 한국식품연구원, 연구기간은 2012. 01. 01 ~ 2012. 12. 31 이다.
또한, 대한민국 지식경제부의 지원 하에서 과제번호 E0131501에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국식품연구원, 연구사업명은 "한국식품연구원 주요사업" , 연구과제명은 "천연물소재의 T세포제어활성을 이용한 항알레르기 식품개발연구" , 주관기관은 한국식품연구원, 연구기간은 2013. 01. 01 ~ 2013. 12. 31 이다.
본 특허출원은 2012년 12월 06일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0141325호, 제 10-2012-0141326호 및 제 10- 2012-0141328호; 그리고 2013년 02월 이일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0012015호, 제 10-2013-0012031호, 제 10- 2013-0012036호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 【배경기술】
근년 소득수준의 향상과 더불어 식습관의 변화, 위생의 청결화,
공해의 심화 등으로 인하여 알레르기는 날로 증가하는 추세를 보이고 있어 전 국민의 20— 25%가 아토피피부염 (AD: atopic dermatitis), 천식, 비염 등의 증상을 가지고 있다. 이는 삶의 질을 현격히 저하시킴으로써 심각한 사회문제를 야기하고 있다. 또한, 식품 알레르기는 영유아의 6-8%에서 확인되고 있고, 소아의 AD는 35%가 식품알레르기에 의한 것으로 결코 무시할 수 없다.
아직까지 여러 알레르기에 대하여 확실한 효과를 보이는 치료제가 거의 없으며, 소아 아토피피부염이 증가하고 있으나 소아의 특성상 치료에 어려움을 겪고 있다. 특히 스테로이드 계통의 약물은 부작용이 심하여 세계적으로 그 대안을 마련하기 위한 시도가 활발하게 이뤄지고 있다. 이러한 알레르기에 대웅하는 방안으로써 독성과 부작용이 없으면서 확실한 효능이 기대되는 소재를 천연물과 식품으로부터 발굴하여 적극적으로 활용할 필요가 있다. 또한, 활성소재 및 성분의 항알레르기 작용기전도 함께 규명되어야 할 것이다.
21세기에 주류를 이루는 치료제는 알레르기 및 당뇨에 대한 것이다 (일본 닛케이산코신문). 미국에서는 5,000만 명이 다양한 알레르기 질환을 갖고 있다 (의약품시장, 연 52억불). 일본에서는 연간 1,560억 엔의 알레르기 관련 의약품시장이 형성되어 있으며, 기능성식품시장은 약 600억 엔이다ᅳ 국내의 경우 이 분야 의약품시장은 약 500억 원이다. 최근 일본 기능성식품의 특허 동향에서 "항비만" 다음으로 출원건수가 많은 분야가 "항알레르기" 이다. 향후 높은 부가가치가 기대되며 이에 대한 대비가 요망된다.
최근에 면역기능조절이나 알레르기억제 활성을 강조하는 건강기능식품의 개발요구가 높아지고 있으며, 그 인정을 위하여 식품의약품안전청에 많은 건수가 신청되고 있다. 또한, 근년 일본의 특허분석을 통하여 조사한 미래 기능성식품의 잠재력은 "항비만" 다음으로 "항알레르기" 활성으로 보고되었다.
알레르기는 "과민반웅" 이라는 뜻으로 그리스어인 "alios" 가 어원이며, 이는 "변형된 것" 을 뜻한다. 이처럼 알레르기란 면역시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 어떤 사람에게만 두드러기, 가려움, 콧물, 기침 등의 이상 과민 반웅을 일으키는 것을
말한다. 최근 20 년 동안 이와 같은 알레르기성 질병의 발병율이 세계적으로 증가하고 있는 추세이다 (1,2). 주된 증가요인으로는 실내생활의 증가, 신소재의 개발, 외국으로부터 이물질 유입등과 같은 알레르기 유발 물질의 급증과 환경오염 및 스트레스로 인한 면역상태의 불안정, 그리고 식생활의 변화 등이 있다. 이처럼 현대인들의 알레르기 질병 발병율은 점차 증가하나 그 치료방법은 대부분 항히스타민제, 스테로이드제 등의 대중적 요법에 의존하고 있는 실정이며, 근본적인 치료방법은 찾지 못하고 있다 (3).
Gell 및 Coombes(1963)는 알레르기반웅을 발현시간과 타입에 기초하여 전통적으로 4 개의 부류로 나누었다 (4). I - III 형은 항체가 관여하는 체액성 면역 반웅 (즉시형)이고, IV 형은 세포가 직접 관여하는 세포성 면역 반웅 (지연형)이다. 그리고 '면역반웅에 관여하는 세포와 매체의 종류에 따라 수분내에 증상이 나타나는 즉시 또는 조기 반웅과 몇 시간 후에 나타나는 후기단계 반응으로 나위는데 제 I 형은 즉시형 과민반웅, 제 IV 형은 지연형 과민반웅의 형태로 나타난다. 대부분의 알레르기 반웅은 제 I 형으로 천식, 비염, 결막염, 식품 및 약물 알레르기, 아토피성 피부염 등이 대표적인 질환으로 나타나고 심한 경우 아나필락시스 (anaphylaxis)가 일어나 생명을 위협하기도 한다.
제 I 형 즉시형 과민반웅은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgGl의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-γ를 생성하는 Thl 세포반웅과 IL-4, IL-5 및 IL-13등을 생성하는 Th2 세포반웅의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4, IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생성한 IgE 특이항체들이 비만세포 (mast cell)나 호염기구 (basophil)의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발증이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다 (5-7) (그림참조: "allergic diseases" , "Thl/Th2 balance") .
알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반웅으로 나뉘며, 초기반웅은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반웅을 유발하여 이 때 방출된 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반웅은 해당조직에 호중구, 호산구, 대식세포, Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써
염증이 유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다 (7). 이 같은 탈과립 분비 물질 중 히스타민은 가장 잘 알려진 인자이며, 즉각형 과민반웅과도 관련되어 알레르기 증상의 중요한 지표로 사용되고 있다 (8).
한편 식품알레르기는 최근 10년 동안 선진국에서는 약 3-6%의 어린이들에게서 발병되며 증가하는 추세를 보이고 있다 (9). 식품알레르기는 소화관을 통해 체내에 들어 온 식품에 대하여 발생하는 것으로 주로 제 I 형 과민반웅에 해당한다. 알레르기 환자의 경우 장관을 통하여 식품알레르겐이 소화되지 않은 상태로 침투하게 되며 (4, 10), 이러한 알레르겐의 장내 흡수가 식품알레르가 발증의 첫 단계라 할 수 있다 (11). 장관은 영양소의 소화흡수를 담당하는 기관일 뿐만 아니라 여러 가지 생체 조절에 관여하고 있다. 장상피 세포는 소화흡수, 장벽 (barrier), 식신호의 전달 / 변환 등의 주요 기능을 가지고 있을 뿐만 아니라 그 밖에도 독특한 면역시스템 (mucosal i麵 unity)이나 신경조직이 발달되어 있는 등 소화관 /장관의 역할을 결코 과소평가할 수 없다. 이렇듯 장상피세포는 장벽으로써 밀착연접 (tight junction)에 의해 거대 분자의 투과를 제한하나 밀착연접이 손상된 경우에는 장벽의 기능 장애로 인해 투과성이 증가되어 식품알레르기뿐만 아니라 소아지방변증, 급성 췌장염과 같은 질환이 발생된다 (12-17). 즉, 밀착연접의 안정화를 통해 장관의 장벽 기능을 강화시킨다면 식품 알레르기를 예방할 수 있을 것이다.
이미 앞선 논문들에서는 식품 및 천연물의 알레르기 억제 활성이 상당수 보고된 바 있으며, 특히 우리나라에서는 알레르기의 치료 및 예방에 식품과 천연물이 한방과 민간요법으로 사용되어 왔다 (18, 19). 이러한 연구들은 주로 빈랑자, 지모, 호로파 등의 한약재 및 약초들의 탈과립 억제 활성을 평가한 결과이며 (20-33), 퀘르세틴 (quercetin), 다래, 마늘, 들깨 기름, 곤약, 소엽, 맥문동의 다당류성분, 영지버섯, 일본간장의 다당체 성분, 로얄 젤리, 동충하초 등에서의 Thl/Th2 면역반웅 조절에 관한 연구도 다수 보고되었다 (34-44). 이 외에 유산균, 발효된 보리, 청국장 등에서의 알레르기성 염증을 억제하는 활성에 관한 결과도 보고되었다 (45-49). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그
전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[발명의 내용]
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 염증성 질환 및 알레르기와 같은 Thl 또는 Th2 면역 반응에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 복령피 ( ¾ / cocos Wolf) 추출물, u] ( Cynanchym at rat urn Bunge) 추출물 또는 남성 ( r/sa na amurense) 추출물이 Th-1 관련 사이토카인 생성 감소, Th-2 관련 사이토카인 생성 감소, 알레르겐의 장상피세포 통과 감소, 비만세포 (mast cell)의 탈과립 감소, Treg 세포로의 분화를 유도 또는 Treg 세포 안정화 활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2—매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 복령피 ( ¾r/ cocos Wolf) 주줄물 , 백미 ( >?3 7 atratum Bunge) 주출물 및 남성 (Ar/saaz/a amurense) 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 객체 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2- 매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명자들은 염증성 질환 및 알레르기와 같은 Thl 또는 Th2 면역 반웅에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Th-1 관련 사이토카인 생성 감소, Th-2 관련 사이토카인 생성 감소, 알레르겐의 장상피세포 통과 감소, 비만세포 (mast cell)의 탈과립 감소, Treg 세포로의 분화를 유도 또는 Treg 세포 안정화 활성을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 복령피, 백미 또는 남성에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매이다. 극성 용매는 (i) 물, (ii) 알코올 (바람직하게는, 메탄을, 에탄올, 프로판을, 부탄올, 노말 -프로판올, 이소 -프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄을 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMS0(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매는 아세톤 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄 핵산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로핵산, 사이클로펜탄 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, 0-자일렌 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 를루엔 1-클로로프로판 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코을 (메탄을, 에탄을, 프로판을, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 흔합용매 (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 핵산 또는 (j) 디에틸에테르이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 에탄을, 또는 물이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 에탄올이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물' 은 상술한 바와 같이
당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획 (fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정올 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷- 오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 복령피 추출물 백미 추출물 또는 남성 추출물에 포함되는 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 복령피 에탄올 추출물의 핵산 분획이다.
본 발명에서 이용되는 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는' 이란 하기의 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 복령피, 백미 또는 남성으로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 상기 복령피, 백미 또는 남성이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다. 본 발명의 조성물은 Treg 세포로의 분화를 유도하여 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료하는 데 유효하다. T세포에서 Treg 세포로의 유도는 Foxp3의 발현 증가 또는 TGF-β의 생성 증가로 알 수 있으며, Treg 세포를 유도함으로써 Thl/Th2 균형을 유도하여 Thl-매개 면역 질환 및 /또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료하는데 유효하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물은 Treg세포로의 분화를 유도한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 Fox3p의 발현을 1.5-5.0배, 1.5-3.0배, 2.0-3.0배 또는 2.5-3.0배 증가시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 대조군과 비교하여 Fox3p의 발현을 1.2-5.0배, 1.2-3.0배, 1.5-3.0배, 2.0-3.0배 또는 2.5-3.0배 증가시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 남성 추출물은 대조군과 비교하여 Fox3p의 발현을 1,5-5.0배, 1.5-3.0배, 2.0-3.0배 또는 2.5-3.0배 증가시킨다.
상기 Fox3p의 발현 증가는 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포로의 분화를 유도함을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 TGF-β의 생성을 증가시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 TGF-β의 생성을 30-90%, 50-90%, 60-90%, 60- 80%또는 65-75% 증가시킨다.
본 발명의 조성물은 Treg 세포 안정화 활성을 가짐으로서 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료하는 데 유효하다.
본 명세서의 용어 "Treg 세포 안정화' '는 Treg 세포의 활성이 유지되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물은 Treg 세포 안정화 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 65-90%이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 67—85%, 67-80%, 67-77%, 70-77% 또는
72- 77%이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 65-90%이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 67-85%, 67-80%, 67-78%, 70-78% 또는
73- 78%이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 남성 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 65-90%이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 65-85%, 65-80%, 65-75%, 67-75%, 67- 73%, 67-71% 또는 69-71%이다.
상기 foxp3을 발현하는 세포의 비율은 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포의 활성을 유지시켜 Treg 세포 안정화 활성을 가짐을 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 대조군과 비교하여 3- 25% 증가된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 3-20%, 3-17%, 5-17%, 5-13%, 7-13%또는 9-13%이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 대조군과 비교하여 3- 25% 증가된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 3-20%, 3-17%, 5-17%, 5-14%, 8-14% 또는 10-14¾)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 남성 추출물은 Treg 세포 배양 3일 뒤 foxp3올 발현하는 세포의 비율이 대조군과 비교하여 3- 20% 증가된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 비율은 3-17%, 3-14%, 3-11%, 3-9%, 3-7%또는 5-7%이다.
상기 foxp3을 발현하는 세포의 비율 증가는 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포 안정화 활성을 가짐을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Treg 세포 유도 또는 안정화에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 2-30, 5-30, 7-30, 9-30, 9-20, 9-15 또는 9-12 yg/ml이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복령피 추출물은 농도가 2-30, 2-20, 5-20, 7-20, 또는 7-15 ug/ml이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Treg 세포 유도 또는 안정화에 이용되는 백미 추출물은 농도가 0.5-30, 0.8-30, 0.8-20, 0.8-15, 0.8-13 pg/ml이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 백미 추출물은 5-30, 7-30, 7-20, 7-15 또는 9-12 yg/ml이다
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Treg 세포 유도 또는 안정화에 이용되는 남성 추출물은 농도가 3으200, 50-200, 70-200, 80-200, 90-200, 90-150 또는 90-120 yg/ml이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 남성 추출물은 농도가 8으 150, 80-120 또는 90-110 yg/ml이다. 본 발명의 조성물은 다양한 Thl-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방또는 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "Thl-매개 면역 질환' '은 Thl 세포의 생성 및 /또는 활성에 의해 생성되는 사이토카인 예컨대, IL-Ιβ , IL-2, IL-12, IL-17, IFN-γ 또는 TNF-ci 등이 관여하는 질환을 의미한다. IL-17은 Thl7 세포 (CD4+T세포)로부터 생산되는 사이토카인으로 이의 생산에는 TNF— a , IL- 1β , IL-6, IFN-γ 등의 사이토카인이 관여되고 이들 사이토카인에 의하여 IL-17의 생산이 유도되는바, Thl-매개 면역 질환에 IL-17도 관여한다.
본 명세서에서 용어 "Thl 세포1 '는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Thl 세포는 IL-2 및 를 합성하지만 IL 4, IL-5, IL-10 및 IL-13는 합성하지 않는 사이토카인 발현 패턴올 나타낸다. Thl 세포는 다양한 세포내 병원균에 대한 세포 -매개 면역반웅, 기관-특이적 자가면역 질환 및 지연성 과민반웅에 관여한다.
본 발명의 조성물이 적용되는 Thl-매개 면역 질환은 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환에 적용된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 Thl—매개 면역 질환은 자가면역질환 또는 염증 질환이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병 및 류마티스 관절염이다.
본 발명의 조성물이 적용되는 Thl-매개 면역 질환은 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 류마티스 관절염, 반웅성 관절염 (Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 공다공증, 아테름성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병 , 나병, 매독, 라임 질환 (Lyme), 보텔리아증 (Borrel iosis), 신경성-보텔리아증, 결핵, 사르코이드증 (Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 흥반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염 , 과민대장 증후군 , 크로씨병 쇼그랜 증후군 , 섬유근통 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애 및 주의력 결핍 과잉행동장애를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 다양한 Th2-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방또는 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "Th2-매개 면역 질환" 은 알레르겐 -특이 Th2 세포의 생성 및 활성에 의한 IgE 및 비만세포가 관여하는 질환을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "Th2 세포" 는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th2 세포는 체액성 면역반웅에 관여한다.
본 발명의 조성물이 적용되는 Th2ᅳ매개 면역 질환은 특별하게 제한되지 않으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Th2-매개 면역 질환은 알레르기 질환이다.
본 명세서에서, 용어 '알레르기' 는 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대한 신체 면역계의 과도한 반응으로 유발되는 다양한 질환, 질병 또는 이상 상태를 의미한다. 본 발명의 조성물에 적용되는 알레르기 질환으로는, 바람직하게는, 제 I 형 즉시형 과민반웅 및 제 IV 형 지연형 과민반웅이다. '제 I 형 즉시형 과민반응은 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 중이염, 두드러기 및 아나필라시 쇼크^^^ ^;^ shock)이고, 제 IV 형 지연형 과민반웅은 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선염 및 알레르기성 뇌염이다. 제 I 형 즉시형 과민반웅은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgGl의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-γ를 생성하는 Thl 세포반웅과 IL-4, IL-5 및 IL-13 등을 생성하는 Th2 세포반웅의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4 및 IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생성한 IgE 특이항체들이 비만세포 (mast cell) 및 호염기구 (basophi 1 )의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발층이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다. 알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반웅으로 나뛰며, 초기반웅은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반웅을 유발하여 이 때 방출된, 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반응은 해당 조직에 호중구, 호산구, 대식세포., Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써 염증이
유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다. 이같은 탈과립 분비 물질 증 히스타민은 가장 잘 알려진 인자이며, 즉시형 과민반응과도 관련되어 알레르기 증상의 중요한 지표로 사용되고 있다.
본 발명의 조성물이 적용되는 알레르기 질환은 아토피 피부염, 아토피와 관련된 다른 피부학적 질환, 알레르기 비염 (급성 또는 만성), 고초열, 천식 및 식품 알레르기를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알레르기 질환은 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염 알레르기성 아토피 피부염 또는 식품 알레르기이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 , 본 발명의 알레르기 질환은 식품 알레르기이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 비만세포의 탈과립을 억제한다.
본 명세서에서, 용어 '탈과립' 은 특정 세포 내 존재하는 과립제 (granules)인 분비소낭 (secretory vesicle)으로부터 항균성 세포독성 분자가 유리되는 과정을 말한다. 상기 특정세포는 면역계 내의 과립구 (호증구, 호산구 및 호염기구) 및 비만세포와 자연살해 세포 및 세포독성 T 세포와 같은 특정 임파 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 비만세포 탈과립을 5-95%, 5-80% 또는 7-80% 억제한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 비만세포 탈과립을 10-90% 또는 10-80% 억제한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 비만세포 탈과립을 50-95%, 50-90%, 60-90% 또는 60-80% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 0.005-10, 0.007-10, 0.3-10, 0.5—10, 0.8-10, 0.8-5, 0.8-3, 0.8-2, 0.8-1.5 또는 0.8-1.2 yg/ml이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 복령피 추출물은 0.3-5, 0.5-5, 0.5-3, 0.5-2 또는 0.5-1.5 ug/ml이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 비만세포 탈과립을 3으90%, 40-90%, 40-80% 또는 40-70% 억제한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면 본 발명의 백미 추출물은 비만세포 탈과립을 50-90%, 50-80% 또는 5으70% 억제한다. 본 발명의 특정 구현예에
따르면, 본 발명의 백미 추출물은 비만세포 탈과립을 60-90%, 60-80% 또는 60-75% 억제한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 백미 추출물은 농도가 으 005- 10, 0.007-10, 0.01-10, 0.03-10, 0.05-10, 0.08-10, 0.1-10, 0.3-10, 0.5-10, 0.8-10, 0.8-5, 0.8-3, 0.8-2, 0.8-1.5 또는 0.8-1.2 iig/ml이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 백미 추출물은 0.005-5, 0.007-5, 0.01-5, 0.03—5, 0.05-5, 0.08—5, 0.1-5, 0.3—5, 0.5—5, 0.5-3, 0.5-2 또는 0.5-1.5 yg/ml이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 백미 추출물은 0.005-5, 0.005-3, 0.005-2, 0.007-2 또는 0.007-1.5 yg/ml이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 남성 추출물은 비만세포 탈과립을 30-90%, 40-90%, 50-90%, 50-80% 또는 60-80% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 비만세포 탈과립에 이용되는 남성 추출물은 농도가 0.005-10, 0.007-10, 0.007-5, 0.007-3, 0.007-2, 0.007-1.5 또는 0.007-1.2 yg/ml이다.
본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 조성물이 Th2 면역반응을 억제하는 활성을 갖는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 IL-4 생성을 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 대조군과 비교하여 IL-4 생성을 20-70%, 30-70%, 40-70%, 40-60%, 40-55%또는 45-50% 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 IL-4, IL-5, IL-10 또는 IL-13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Th2-관련 사이토카인의 생성을 억제한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-4 생성을 10-99%, 20-99%, 30-99%, 40-99%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40-60% 또는 40-50% 억제한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-4 생성을 50-99%, 50-90%, 50-80%, 60-80% 또는 60-70% 억제한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-4
생성을 50-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99% 또는 80-90% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 IL-4 생성 억제에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 2-50, 5-50, 7-50, 7-40 또는 7-35 yg/mi이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 IL-4 생성 억제에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 2-30, 2-20, 5-20, 7-20, 7-15 또는 9-12 ug/ml이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 IL— 4 생성 억제에 이융되는 복령피 추출물은 농도가 9-50, 15-50, 20-50, 20-40, 25-40, 25-35 또는 28-32 ug/ml이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 IL-4 생성 억제에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 5-50, 10-50, 10-40, 20-40, 20- 35, 20-30 또는 23-27 mg/kg (체중)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-5 생성을 20-90%, 30-90%, 30-80%, 30-70%, 30-60%, 30-50% 또는 40-50% 억제한다. 본 발명의 다론 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-10 생성을 20-99%, 30-99%, 30-99%, 40-99%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40-60% 또는 50-60% 억제한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-10 생성을 50-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99% 또는 90-99% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-13 생성을 5-50 ), 5-40%, 5-30%, 10-30%, 10-25% 또는 15-20% 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 IL-17 및 로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Thl-관련 사이토카인의 생성을 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IL-17 생성을 20-90%, 30-90%, 30-80%, 40-80%, 40-70%, 40-60% 또는 45-55% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 IFN-Y 생성을 20-99%, 30-99%, 40-99%, 50-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99% 또는 90- 99% 억제한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 '발명의 IL-17 생성 억제에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 2-30, 2-20, 5-20, 그 20, 7-15 또는 9-12 yg/ml이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 혈청 내
IgE, IgG2a 및 IgGl으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체의 생성을 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 혈청 내 IgE 생성을 10-70%, 10-60%, 20-60%, 20-50%, 30-50%, 30-45%, 35-45% 또는 35-40% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 혈청 내 IgG2a 생성을 10-70%ᅳ 10-60%, 20-60%, 20-50%, 30-50%, 30-45%, 35-45% 또는 35-40% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복령피 추출물은 대조군과 비교하여 혈청 내 IgG2a 생성을 10-80%, 20-80%, 30—80% 30-70%, 40-70%, 40-60%또는 45-55% 억제한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 IgE, IgG2a, IgGl,
IL-5, IL-10, IL-13, INF-γ 또는 TGF-β 생성 억제에 이용되는 복령피 추출물은 농도가 5-50, 10-50, 10-40, 20-40, 20-35, 20-30 또는 23-27 mg/kg (체중)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물 또는 남성 추출물은 알레르겐의 상피세포 통과를 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 상피세포층은 장상피세포층이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물은 대조군과 비교하여 알레르겐의 상피세포층 통과를 30-80%, 40-80%, 40-70%, 50-70% 또는 50-60% 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 남성 추출물은 대조군과 비교하여 알레르겐의 상피세포층 통과를 5-30, 10-30%, 10-20% 또는 15-20% 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백미 추출물 또는 남성 추출물 또는 이들의 조합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Thl- 매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환을 예방한다.
본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물, 기능성 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 조성물이다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a)
상술한 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다 .
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비를, 만니를, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슴, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슴, 미세결정성 샐롤로스, 풀리비닐피를리돈, 셀를로스, 물, 시럽, 메틸 셀롤로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분돌 이외에 윤활제, 습윤제ᅳ 감미제 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 경구 투여한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인돌에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 mg/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 갑셀제
형태일 수도 있으몌 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는
1종 이상꾀 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl—매개 면역 질환 또는 Th2- 매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어 , 단백질, 탄수화물 , 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를, 소르비를, 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두층 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로구성된 군으로부터 선택되는 1종이상의 추출물을유효성분으로포함하^ ¾1-매개 면역 질환또는 2- 매개 면역 질환의 예방, 개선또는치료용조성물은기능성 식품조성물로제조될수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로첨가되는성분을포함하며, 예를들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수희물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드 (예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드 (예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 을리고당;폴리사카라이드 (예컨대, 텍스트린, 시클로덱스트린등) ; 및당알코을 (예컨대, 자일리를, 소르비를, 에리쓰리를 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제 (예컨대, 타 마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제 (예컨대, 사카린 아스파르탐 등)을 이용할수있다.
본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는
1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2- 매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 유효 성분으로서의 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 , 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 -함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 , 영양 화장수, 영양 크림 , 마사지 크림, 에센스, 아이 크림 , 클렌징 크림, 클렌징 포음, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀 전분, 트라칸트, 셀를로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄을, 이소프로판올 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트 , 벤질 알코을, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세를 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄을
또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 회석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비틀 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀를로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코을 설페이트, 지방족 알코을 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인 지방족 알코을, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 사료 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는
1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2- 매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물을 그대로 또는 사료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제 등을 가하여 제조할 수 있다. 예컨대, 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제이다. 그 형상에는 분체, 과립, 펠릿 또는 현탁액 둥이 포함된다.
본 발명의 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 육상 또는 수상 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 흔합하여 공급할 수 있다. 본 발명의 사료에는 분말사료, 고형사료ᅳ 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Ext ruder Pellet) 사료, 날먹이 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 복령피, 백미 또는 남성을 소재로 하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 우수한 Thl-관련 사이토카인 생성 억제 활성, Th2-관련 사이토카인 억제 활성 , 비만세포의 탈과립 억제 활성, 알레르겐의 장상피세포층 통과 억제 활성, Treg 세포로의 분화 유도활성 또는 Treg 세포 안정화 활성을 갖는다.
(d) 본 발명은 천연물 및 식품 유래 항알레르기 물질의 세부적인 작용기전을 제공한다.
(e) 본 발명은 천연물을 소재로 이용하여 안정성, 생성비용의 감소 및 사용의 편이성을 제공할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 la는 알레르겐의 장상피세포 통과를 조사한 실험에 대한 모식도를 나타낸다. 도 lb는 알레르겐의 장상피세포 통과에 대한 백미 추출물의 영향을 보여주고, 도 lc는 알레르겐의 장상피세포 통과에 대한 남성 추출물의 TEER Transepitherial Electrical Resistance, Ω Xcin2) 수치 및 알레르겐의 장상피세포 통과에 대한 남성 추출물의 영향을 보여준다.
도 2a는 마우스 비장세포의 Th-2 관련 사이토카인 (IL-4 및 IL-10 생성)에 대한 복령피 추출물의 영향을 보여준다. 도 2b는 마우스 비장세포꾀 Th-2 관련 사이토카인 (IFN-Y 및 IL-17)에 대한 복령피 추출물의 영향을 보여준다. 도 2c는 마우스 비장세포의 IL-4 생성에 대한 백미 추출물의 영향을 보여준다.
도 3a 내지 3c는 각각 마우스 비만세포 (mast cell)의 탈과립에 대한 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물의 영향을 보여준다.
도 4a 및 4b는 마우스 비장 및 림프절 세포에서 Treg 세포로의 분화 유도에 대한 복령피 추출물의 영향으로 Fox3p 발현 및 TGF-β 생성 증가 활성을 보여주고, 도 4c는 복령피 추출물의 Treg 세포 안정화 활성에 대한 영향을 보여주는 결과로서, Treg 세포를 초고속 유세포 분리기로 분석한 안정화 활성 결과 및 이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a는 마우스 비장 및 림프절 세포에서 Treg세포로의 분화 유도에 대한 백미 추출물의 영향을 보여주고, 도 5b는 백미 추출물의 Treg 세포 안정화 활성에 대한 영향을 보여주는 결과로세 Treg 세포를 초고속 유세포 분리기로 분석한 안정화 활성 결과 및 이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a는 마우스 비장 및 림프절 세포에서 Treg 세포로의 분화 유도에 대한 남성 추출물의 영향을 보여주고, 도 6b는 남성 추출물의 Treg 세포 안정화 활성에 대한 영향을 보여주는 결과로서 , Treg 세포를 초고속 유세포 분리기로 분석한 안정화 활성 결과 및 이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 2/ 에서의 복령피 추출물의 항알레르기 활성을 나타낸다. 도 7a는 복령피 추출물의 혈청 내 IgE, IgG2a 및 IgGl 생성 억제 활성 , 도 7b는 복령피 추출물의 Thl-관련 사이토카인 생성 억제 활성, 도 7c는 Th2- 관련 사이토카인 생성 억제 활성 및 도 7d는 Treg 세포 분화 유도 활성을 보여준다.
도 8은 식품 알레르기 모델 제작을 위한 스케즐을 나타낸다.
도 9는 복령피 추출물의 식품 알레르기에 대한 영향을 아나필락시스, 설사 반웅 및 직장온도 변화로 측정한 결과를 나타낸다.
도 ίθ은 복령피 추출물의 식품 알레르기 모델의 비장에서의 사이토카인의 생성에 대한 영향을 보여준다. 도 10a는 복령피 추출물이 Th2-관련 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13 생성 억제 활성을 가짐을 보여주고, 도 10b는 foxp3의 발현유도와 관련된 인 비보 Treg 사이토카인인 TGF-β 생성 증가 활성을 가짐을 보여준다.
도 lla는 복령피 95% 에탄올 추출물을 추가적으로 핵-산 분획 (Hexane Fr.), 클로로포름 분획 (Chloroform Fr.), 에틸 아세테이트 분획 (Ethyl acetate Fr.), 부탄을 분획 (Butanol Fr.) 및 물 분획 (Water Fr.)으로 분리하는 과정을 보여준다. 도 lib는 복령피 추출물의 상기 5개의 분획 중 헥산 분획이 foxp3유도 활성능을 가짐을 보여준다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 띠라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 1: 시료의 확보 및 용매추출물의 준비
^^mPoria cocos Wolf), ϋ] ( Cynanchym at rat am Bunge) ¾
남^ risae/na amurense)^ 한국식물추출물은행에서 구입하여 시료로 사용하였으며, 각 시료는 95% 에탄올 또는 물로 추출하였다.
각 시료의 에탄올 추출은 시료 분말 200 g을 95% 에탄올 1.8 L에 넣고 3시간 환류 추출로 1차 추출을 하여 추출물을 감압여과하고, 여과 후 남은 시료를 95% 에탄올 2 L에 넣고 3시간 동안 2차 추출 하여 시료의 95% 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 시료 의 95% 에탄을 추출온도는 84-86°C 이다. 추출 및 여과한 '1차 및 2차 추출물을 합하여 농축하고 동결건조 하였다ᅳ 실시예 2: Caco-2 단세포층을 이용한 OVA통과억제 활성시험
Caco-2세포배양 및 OVA통과억제 실험
ATCC 유래의 Caco-2세포주 (HTB-37)는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에 10% FBSCFetal Bovine Serum) , 1% 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신 및 0.1 ιτιΜ 비필수 아미노산을 첨가하여 37°C, 5% C02 조건하에서 계대배양 하였다. Caco-2 단세포층을 이용한 식품 알레르겐 통과시험을 하기 위하여 상기 배양배지를 사용하여 Caco-2 세포를 12 웰 플레이트 트랜스웰 (transwell)의 상층부 (apical side)인 트랜스멤브레인 (transmembrane) 위에 2X105 세포 /ml의 밀도로 0.5 ml 분주하였다. 웰의 하층부 (basolateral side)에는 배양배지 1.5 ml을 첨가하고 37°C, 5% C02 항온반웅기에서 배양하였다. 배지교환은 매 2-3일에 한 번씩 실시하였다. 분주 후 약 2-3주가 지나 단세포층을 형성한 Caco-2 세포의 하층부와 상층부간의 전기저항치 (TEER, transepitherial electrical resistance, ΩΧαιι2)를 MiUipore사의 Mi 11 iceU-ERS(Electrical Resistance System)로 측정하여 수치가 300 Ω Xcuf 초과인 경우 실험에 사용하였다. Caco-2 단세포층은 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 3회 세척 한 후 백미 추출물 (최종농도: 400 ug/ml) 또는 남성 추출물 (최종농도: 400 ug/ml)을 담즙산염 (bile salts, 최종농도: 100-150 pg/ml)와 함께 상층부에 첨가한 후 37°C, 5% C02 항온반웅기에서 1시간 동안 처리하였다. 다음으로 0VA(0valbumin, 최종농도: 400 yg/ml)를 상층부에 첨가 한 후 37°C, 5% C02 항온반웅기에서 3시간 동안 반웅시킨 다음 다시 한 번 더 TEER 수치를 측정하였다.
남성 추출물 및 OVA 처리 후 TEER을 측정한 결과, OVA만을 처리한 양성대조군과 비교하여 높은 TEER 수치를 나타냈다. 이러한 결과는, 남성 추출물 처리 시 Caco-2 단세포층의 TEER 값을 높임으로써 남성 추출물이 장상피세포의 알레르겐의 투과성을 억제하는 것을 의미한다 (도 lc).
여기에서 하층부의 액을 회수하여 통과된 OVA의 농도를 sEL ISA (sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 즉정하였다. 하층부 내의 통과된 OVA량은 다음과 같이 구하였다:
Flux = C ng/ H hr/ S cm2
여기에서 C는 ELISA에 의하여 구한 OVA의 통과량이고, H는 Caco_2 단세포층 상층부에 0VA 첨가 후 반웅시간 (3h)을 나타내며, S는 트랜스웰 플레이트의 상층부 표면적 (1.12 cm2)을 나타낸다.
0VA의 통과량을 조사한 결과, 0VA를 단독으로 처리한 양성대조군과 비교하여 백미 추출물도 처리한 실험군에서 0VA 통과량이 감소하였음을 확인하였고, 이를 백분율로 환산한 결과, 백미 추출물은 4으60%, 남성 추출물은 10-20%의 0VA 통과 억제 효과를 나타내었다 (도 lb 및 lc).
EL ISA에 의한 OVA 분석
코팅 완충액 ((트리스 하이드톡시메틸)아미노메테인 0.05 M, pH 9.0)에 2 yg/ml의 농도로 희석한 항 -래빗 -0VA 항체를 96웰 플레이트에 각 웰 당 100 μΐ씩 분주하여 4°C에서 하룻밤 정치하였다. 코팅된 96웰 플레이트를 세척 완층액버페 Tween 20을 포함하는 PBS(Phosphate Buffered Saline); PBST, 0.138 M NaCl , 0.0027 M KCl 및 0.05% Tween 20을 포함하는 0.01 M 인산염 완층액)로 3회 세척하였다. HBSS에 일정한 배수로 회석한 표준 0VA와 회수액을 각 웰 당 100 μΐ씩 첨가한 후 1시간 동안 상온에서 반웅시켰다. 다시 세척 완층액로 앞에서와 같이 세척한 다음 항 -OVA 항체가 결합된 바이오틴 (biotin)을 PBST로 일정농도 회석하고 웰 당 100 μΐ씩 처리하여 1시간 동안 상온에서 반웅시켰다. 다음으로 상기와 같이 세척 완충액으로 세척한 후 아비딘 (avidin)-HRP를 PBST로 일정농도 회석하여 웰 당 100 μΐ씩 처리하여 1시간 동안 상온에서 반웅시켰다. 이후, 세척 완충액으로 앞서 언급한 바와 같이 세척하였다. 다음으로 기질용액으로써 페닐 프로피온산 (phenyl propionic acid)/인산염 버퍼 (36 mM, pH 7.0)에
H202 0.002%를 첨가한 것을 사용하고 반웅정지액으로 1 M NaOH- 글라이신 (glycine)Cl M 글라이신 /1 M NaOH)을 각 웰 당 100 μΐ씩 사용하고 형광 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 320/405 nm(Ex./Em.파장)에서의 형광을 측정하였다. 실시예 3: 추출물에 의한 Thl/Th2사이토카인 균형조절 활성시험 (e vivo) OVA로 면역한 마우스 비장세포 배양
5주령된 암컷 BALB/c 마우스에 1주 간격으로 2차례 알레르겐 (allergen)을 복강면역하여 알레르기를 유발하였다. 알레르겐은 0VAC20 와 알럼 (alum, 2 mg)의 흔합액을 30분 동안 흔합한 다음 한 마리당 100 μΐ씩 복강 주사하였다 (η=5). 면역 1주 후 마우스를 경추탈골 시키고 무균상태에서 비장을 적출하여 1 ml의 기본배지 (2-머갑토에탄올 및 항생제를 첨가한 RPMI1640, Wei Gene, 대구, 대한민국)를 첨가한 작은 페트리 접시에 옮겨 아이스박스 상에 보관하였다. 페트리 접시에 담긴 비장은 메쉬를 이용하여 단세포화 시킨 뒤.5 ml의 기본배지로 2회 세척하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하였다. 상층액 제거 후 1 ml의 RBC(Red Blood Cell) 용해 완층액 (SIGMA R7757, 미국)을 첨가하여 손으로 잘 흔들어 현탁하고 3분 동안 아이스 위에서 반응시킨 뒤 10 ml의 기본배지 첨가 후 현탁한 뒤 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리를 2회 실시하였다. 96- 웰 플레이트에 항원 (0VA, 100 yg/ml)을 처리하고 각각의 농도로 준비된 추출물을 첨가하였으며, 비장세포의 농도는 5X106 세포 /웰로 처리하였다. 다음으로 37°C, C02 항온반웅기에서 72시간 동안 배양한 후 상층액을 회수하였다. 비장세포 배양 상층액의 사이토카인 분석
항원 (0VA, 100 ug/ml) 및 각각의 농도로 추출물이 처리된 비장세포 배양 상충액을 72시간 후 회수하여 사이토카인 분석에 사용하였다 사이토카인 분석을 위하여 BD OptEIATl MOUSE ELISA(Enzyme- linked Immunosorbent Assay) 키트를 사용하였으며 실험방법은 키트에 명시된 실험방법에 준하여 실험을 실시하였다. 간단히 설명하면 96웰플레이트에 포획 항체를 4°C에서 하룻밤정치하였다. 코팅된 96웰플레이트를세척 완층액 (PBST)으로세척한후분석용회석제 (10% FBS가첨가된
PBS)를 200 μΐ씩 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 블로킹 (blocking)하였다. 다음으로 표준 시료와 샘플 시료를 100 μΐ씩 각 웰에 분주하여 상은에서 2시간 반웅시킨 다음, 검출 항체와스트렙타비딘 (streptoavidin)-HRP를 100 μΐ씩 분주한 후상온에서 1시간동안반웅시켰다. 반응시간후 100 의 기질용액 (0.01% 1MB가 첨가된 인산염-구연산염 완층액, ρΗ 5.0, 0.001% Η2 )으로 상온에서 30분 동안 발색시킨 다음, 2 M ¾S04를 50 μΐ씩 각 웰에 첨가하여 발색반응을 중지시켰다. 발색 정도는 450 ηπι에서 마이크로플레이트리더 ttffiRMOmax, Molecular Devices, 미국)로흡광도를측정하였다.
비장세포의 사이토카인 생성에 대한 복령피 추출물 또는 백미 추출물의 영향을 조사한 결과, 10 Ug/ml 복령피 추출물을 첨가한 경우 대조군과 비교하여 비장세포의 IL-4의 생성은 65.1%, 30 pg/ml 복령피 추출물을 첨가한 경우 86.5% 감소되었고 IL-10의 생성은 95% 감소되었으며 (도 2a), IFN— γ의 생성은 95.8% 및 IL-17의 생성은 50.5¾> 감소되었다 (도 2b). 또한, 10 ug/ml 백미 추출물을 첨가한 경우 대조군과 비교하여 비장세포의 IL-4 생성이 47.2% 감소되었다 (도 2c).
이러한 복령피 추출물 및 백미 추출물 각각의 IL-4 및 /또는 IL-10 생성 감소 효과는 복령피 추출물 또는 백미 추출물이 Th2 면역반웅을 감소시킨다는 것을 보여준다.
또한, 상기 복령피 추출물의 IL-17 및 /또는 IFN-Y 생성 감소 효과는 복령피 추출물이 Thl 면역반응, Thl7 면역반응 또는 Thl/Thl7 면역반웅을 감소시킨다는 것을 보여준다.
• 실시예 4: 탈과립 억제활성 시험
복강 비만세포의 수확
마우스를 에테르로 마취시키고 머리의 뒤통수를 강타하여 치사시킨 후 약 10 mi의 배지 (pH 7.4)을 마우스의 복강 내에 주입하고 90초 동안 복벽을 가볍게 맛사지하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 복강 세척액을 스포이드로 채취하여 100Xg에서 10분 동안 원심 시킨 후 상층액을 버리고, 동일 배지로 비만세포 (mast cells) 수가 1X106 세포 /ml 되도록 복강 부유액을 만들어 실험에 이용하였다.
비만세포의 형태변화 관찰
재부유시킨 비만세포 부유액 200 μΐ에 살린 (saline) 25 μΐ, 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물 (상기 세 추출물에 대하여 1 yg/ml, 0.1 ug/ml 또는 0.01 ug/ml 각각) 25 μΐ를 각각 넣어 37°C 배양기에서 10분 동안 반웅시켰다. 반응 후 컴파운드 48/80(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, 미국) 용액 25 μΐ를 첨가하여 20분 동안 반웅시켰다.
광학현미경 상으로 비만세포의 형태를 관찰하기 위하여 반웅이 끝난 비만세포 부유액 200 μΐ를 도립현미경 재물대 위에 놓여진 슬라이드글라스 (slide glass, 22x60 mm) 위에 떨어뜨려 비만세포들이 침전될 수 있도록 실온에서 10분 동안 정치시켰다. 400배의 배율 하에서 헤마사이토메타 (hemacytometer)를 이용하여 비만세포를 도립현미경 (Olympus Japan)으로 관찰하였다. 정상 비만세포의 형태는 대부분 원형 또는 난원형으로 세포윤곽이 뚜렷하고, 세포질 내에는 많은 과립들이 충만되어 있었다. 비만세포의 직경은 대략 10-20 정도로 복강 부유액의 다른 세포들 (림프구 또는 호중성백혈구)에 비해 2배 이상 컸다. 비만세포의 형태가 원형 또는 난원형으로 세포윤곽이 뚜렷하고, 세포질 내에 광굴절율이 높은 과립들로 충만된 상태를 정상형 비만세포로 구분하였다. 반면에 세포윤곽이 불분명하고 세포질 내 과립들이 세포표면으로 돌출 되거나 세포주위에 흩어져 있는 경우를 탈과립형으로 구분하였다. 탈과립율은 다음 공식에 의하여 산출되었다:
' 비만세포 탈과립율(%)= (탈과립된 비만세포 수 /비만세포 총수) X 100
컴파운드 48/80에 의한 비만세포 탈과립율에 대한 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물의 영향을 조사한 결과, 컴파운드 48/80을 단독 처리한 대조군과 비교하여, 각 추출물 처리 후 컴파운드 48/80를 처리한 실험군에서 복령피 추출물 1 pg/ml을 처리한 경우 65-85%의 탈과립 억제 효과를 확인하였고 (도 3a), 백미 추출물 0.01-1.00 yg/ml을 처리한 경우 40-80¾)의 탈과립 억제 효과를 확인하였으며 (도 3b), 남성 추출물 0.01-1.00 yg/ml을 처리한 경우 50-70%의 탈과립 억제 효과를 확인하였다 (도 3c). 실시예 5: Treg세포로의 분화 유도활성
실험 동물
6-8 주령의 자성 balb/c 마우스를 찰스 리버 래보레이토리 (Charles River Laboratories)로부터 구매하였다. 마우스는 서울대학교 (서울, 대한민국) 약학대학의 동물실험시설에서 사육되었다. 모든 실험은 서을대학교 동물실험위원회의 규정과 가이드라인에 따라 수행하였다. 복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물의 제조
복령피 추출물, 백미 추출물 및 남성 추출물은 각각 25-100 rag/ml의 농도로 DMS0(Di methyl Sulfoxide)에 용해된 상태로 한국식품연구원으로부터 받았다. 실험에 적합한 농도를 만들기 위해서 위 농도의 추출물을 세포 배양 배지인 완전 배지 (Gibco RPMI에 FBS 10%, 페니실린 /스트렙토마이신 1%, 피루브산 나트륨 1%' 비필수 아미노산 1%ᅳ HEPES 2.5%, β-머갑토에탄올 0.1%를 첨가한 배지)를 이용하여 회석하였다. 대조군으로는 완전 배지에 용매인 DMS0만을 추출물과 같은 용량 첨가한 것을 이용하였다. 세포 제조
마우스를 C02로 안락사 시킨 뒤 비장과 림프절을 분리하여 70 μηι 스트레이너 (strainer)를 통과시켜 단세포 현탁물을 수득하였다. 비감작 (naive) CD4 T 세포를 수득하기 위해서 CD25-PE 항체 (eBioscience)로 염색한 뒤 항 -PE, 항 -CD8ci , 항 -B220 및 항 -CDllb 비드 (Miltenyl Biotec)를 붙이고 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)로 디플리션 (depletion)하여 CD4 T 세포를 인리치 (enrich)해 주었다. 그 후 CD62L-바이오틴 항체 (eBioscience) 및 항-바이오틴 비드 (Miltenyl Biotec)를 붙이고 MACS 선별하여 비감작 CD4 T 세포를 수득하였다. 항원제시세포는 비장과 림프절에서 얻은 단세포 현탁물을 RBC 용해 한 뒤 CD3-바이오틴 항체 (eBioscience) 및 항-바이오틴 비드 (Miltenyl Biotec)를 붙여 MACS 디플리션한 것을 사용하였다. 인 비트로 세포 배양
모든 세포 배양은 완전 배지에서 행하였다. 비감작 T 세포는 항체자극 조건의 경우, 96웰 평저 플레이트에 2 ug/ml 항 -CD3을 밤새
코팅하고 비감작 CD4 T 세포 5X104 세포 /웰과 함께 1 pg/ml 항 -CD28을 용해한 상태로 첨가하였다. 항원제시세포 자극 조건의 경우, 96웰 U- 보텀 (boUom) 풀레이트에 항 -CD3 항체를 용해한 상태로 첨가하였고 항원제시세포를 6X104세포 /웰로 비감작 CD4 T 세포 3X104세포 /웰과 함께 배양하였다. 두 조건 모두에서 재조합 마우스 IL-2를 10 ng/ml의 농도로 첨가하였고, 원하는 농도로 희석한 추출물을 각 웰에 첨가하였다. 이것을 37 , 5% C02 조건에서 72시간 배양한 뒤 세포를 회수하여 분석하였다. 세포 내 Foxp3 염색 및 유동세포 분석
배양한 세포를 걷어 PBSNC0.14M NaCl, 0.003M C1 , 0.01M Na2HP04,
0.002M KHP04 , 0.002M NaN3)에 1% FBS를 첨가한 완층액을 이용해 CD4- PE/Cy7(Biolegend)으로 15분 동안 표면 염색을 하였다. 그 후 eBioscience의 Foxp3 염색 세트를 이용하여 지시된 방법대로 세포 내 Foxp3를 염색하였다. FACS 분석은 BD FACS Calibur와 Cell Questpro를 이용하였다.
세포 내 Foxp3 발현에 대한 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물의 영향을 조사한 결과, 10 ug/ml 복령피 추출물을 처리한 경우 대조군과 비교하여 Foxp3 발현이 2배 이상 증가하였고, 10 ng/ml 백미 추출물 처리한 경우 대조군과 비교하여 Foxp3 발현이 2배 이상 증가하였으며, 남성 추출물을 처리한 경우 농도 -의존적으로 Foxp3 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포로의 분화를 유도함을 의미한다 (도 4a, 5a 및 6a). 사이토카인 분석
실시예 3의 방법과 마찬가지로 비장세포 배양 상층액의 사이토카인을 분석하여 비장세포의 사이토카인 생성에 대한 복령피 추출물의 영향을 조사하였다. 그 결과 10 ug/ml 복령피 추출물올 첨가한 경우 Treg 사이토카인인 TGF- 의 생성이 대조군과 비교하여 70.3% 증가되었다 (도 4b 하단). 이러한 복령피 추출물의 TGF- 생성 증가 효과는 복령피 추출물이 Treg세포로의 분화를 유도함을 확인해준다.
통계적 분석
실험 결과의 유의성 평가는 스튜던트 -테스트 (students' t test) 이용하였다. 실시예 6: Treg세포 안정화 활성
Treg세포에서 foxp3의 발현에는 여러 요소들이 복합적으로 작용한다. foxp3는 유전자의 프로모터 자체로는 발현 능력이 약하다는 특징을 가지며 다른 foxp3 조절 요소가 크로마틴 상에서 영향을 미쳐 그 발현에 관여한다. 예를 들어 f oxp3-CNSl (Forkhead box P3-Conserved Noncoding Sequencel)에는 NFAT(Nuclear Factor of Activated T-cells)와 TGF- β (Transforming Growth Factor-beta)에 의해 활성화된 Smad-3에 대한 결합 부위가 존재하여 말초 (periphery)에서 미성숙 (naive) CD4 T 세포가 Treg 세포로 유도 되는 것에 중요한 작용을 한다.
이렇게 발현된 foxp3은 영구적으로 유지되지 않고 DNA 메틸레이션 (methylation)의 변화 등 여러 원인에 의해 그 발현이 소실되기도 한다. 발표된 연구에 따르면 인 비트로 에서 Treg 세포에 조작을 하여 TNFCTumor Necrosis Factor) 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 0X40(CD134)을 교차 -결합 해주면 foxp3의 발현과 Treg 세포의 면역 억제 능력이 소실된다. 따라서 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포 안정화 활성이 있는지를 foxp3의 발현 유지 여부로 확인하였다.
복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 foxp3의 발현을 유지시킬 수 있는지를 확인하기 위해 foxp3-GFP 마우스를 사용하였다. 이 마우스는 핵 내에서 foxp3과 함께 GFP(Green Fluorescence Protein) 형광을 발현하기 때문에 세포를 투과 가능하게 만들어야 하는 핵 내 염색 과정 없이 Treg 세포로의 유도를 확인할 수 있다. 다만, 실험에 사용한 마우스는 C57BL/6 계통이므로 Balb/c 마우스를 통해 확인한 foxp3 유도 효과를 C57BL/6 마우스에서 다시 한 번 확인하는 과정을 거쳐 동일한 효과를 나타냄을 확인하였다. Foxp3-GFP 마우스에 존재하는 흉선에서 생성된 자연 (natural) Treg 세포는 그 자체로 형광을 발현하기 때문에 FACS를 통해 분리할 수 있었고 100%에 가까운 순도를 확인하였다.
상기 Treg 세포를 배양하면 3일 뒤 foxp3을 발현하는 세포의 비율이 63.43% 정도로 감소되어 있는 것을 알 수 있다 (Ctrl: 대조군). 이것은 앞에서 설명한 바와 같이 foxp3의 발현이 여러 요소에 의해 조절되는 현상이며 배양 과정에서 그 조건이 갖추어지지 않았기 때문이다.
반면, Treg 세포로의 유도에 유효한 10 ug/ml 복령피 추출물, 10
Ug/ml 백미 추출물 또는 100 ug/iiil 남성 추출물을 처리한 경우 대조군에 비하여 foxp3 발현 비율이 높게 유지되었다. 즉, Treg 세포의 비율은 복령피 추출물을 처리한 경우 74.91%, 백미 추출물을 처리한 경우 75.78%, 남성 추출물올 처리한 경우 69.98%로 대조군보다 높게 유지되어, 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물이 Treg 세포 안정화 활성이 있음을 알수 았었다 (도 4b, 5b 및 6b). 실시예 7: 복령피 추출물의 인 비보 항알레르기 활성실험
5주령 BALB/c mouse 암컷을 구입하여 일주일간의 적응 기간을 거친 후 OVA 20 pg, 알럼 2 mg을 2차례 복강 주사하여 면역을 실시하였다. 마리당 25 mg/kg의 복령피 95%에탄을추출물을 10일 동안 매일 경구투여를 하였고 마지막 경구투여 후 채혈과 비장, 장관막 림프절 분리를 실행하였다. 혈액은 혈청을 분리하여 IgE, IgG2a, IgGl분석에 활용하였고 비장과 장관막 림프절은 단세포화하여 OVA를 100 yg/ml을 처리 72시간 배양하여 상등액을 취해 사이토카인을 분석하였다. 사이토카인 분석은 BD ^03^6 사의^31八 kit를 이용하여 분석하였고 Th2-관련 사이토카인으로 IL-5, IL-10 및 IL-13과 Thl- 관련 사이토카인으로 INF-Y , Treg 사이토카인으로 TGF-β를 분석하였다. 그 결과, 복령피 95% 에탄올 추출물을 경구투여 한 경우 대조군과 비교하여 IgE, IgG2a 및 IgGl는 각각 약 37.9%, 약 38.4%, 약 49.7% 감소하였고 (도 7a), Th2- 관련사이토카인인 IL-5, IL-10및 IL-13생성은각각 약 43.1%, 약 56.8%및 약 17.3% 감소되었고 (도 7b), Thl-관련 사이토카인인 INF-γ은 약 38.8% 감소되었으며 (도 7c), Treg사이토카인인 TGF-β는 약 37%증가하였다 (도 7d). 따라서 복령피 추출물을 투여한 경우 인 ^^에서 혈청 IgE, IgG2a 및 IgGl이 감소하고, Th2-관련 사이토카인의 생성이 감소하며, Thl-관련 사이토카인의 생성이 감소하고, Treg 사이토카인의 생성이 증가하는바 복령피 추출물이 항알레르기 활성이 있음을 보여준다.
실시예 8: 식품 알레르기 모델에서의 복령피 추출물 활성실험 식품 알레르기모델제작
5 주령의 BALB/C 암컷을 구입하여 일주일간의 적웅 기간을 거친 후 OVA 20 \ig, 알럼 2 mg을 복강 투여하여 알레르기를 유발하였다. 2주 후 복령피 추출물을 25 mg/kg (체중)으로 매일 경구투여를 실시하고, 3일 간격으로 OVA 50 mg을 함께 경구투여 하여 식품알레르기를 유발하였다. 양성 대조군 (positive control)으로는 덱사메타손 (Dexamethason)(2.5 mg/kg (체중))을 복령피 투여군과 동일한 방법으로 투여하였다. 구체적인 스케쥴은 도 8에 나타냈다. 설사, 아나필락시스 반웅 및 직장온도 변화를 측정
4, 5, 6차의 복령피 및 0VA 경구투여 시 식품알레르기 유발 지표로서 설사, 아나필락시스 반웅 및 직장온도 변화를 15분 간격으로 60분 동안 관찰하여 발생 정도를 확인하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 복령피 추출물을 투여한 경우 설사 및 아나필락시스 반웅이 감소하고, 직장온도의 변화가 감소함을 보였다 (도 9). 따라서 복령피 추출물 투여 시 식품 알레르기 유발이 감소함을 확인할 수 있었다. 세포화된 비장상층액의사이토카인 분석
식품 알레르기 모델의 비장을 단세포화 하여 0VA 100 ug/ml을 처리하고 72시간 배양 후 상층액을 회수하여 사이토카인을 분석하였다. 사이토카인 분석을 위하여 BD OptEIATM MOUSE EL I SA( Enzyme- 1 inked Immunosorbent Assay) 키트를 사용하였으며, 실험방법은 키트에 명시된 실험방법에 준하여 실험을 실시하였다. 그 결과, 복령피 추출물을 경구투여한 경우 대조군과 비교하여 비장세포의 Th2—관련 사이토카인인 IL- 4, IL-5, IL-10 및 IL-13 생성은 각각 약 47.3%, 약 34.5%, 약 36.7¾, 약 37.7% 감소되었고 (도 10a 및 10b), Treg 사이토카인인 foxp3의 발현유도 관련 인 비보 사이토카인 TGF-β는 약 51.6% 증가하였다 (도 10c).
이러한 식품 알레르기 모델에 복령피 추출물을 투여한 경우의 Th2- 관련 사이토카인 생성 감소 및 foxp3의 발현유도 사이토카인의 생성 증가 효과는 복령피 추출물이 식품 알레르기 모델에서도 Th2 면역반응을
감소시키고, Treg 세포로의 분화를 유도함을 보여준다. 실시예 9: 복령피 추출물의 활성 분획 발굴
용매분획의 분리
복령피 95% 에탄올 추출불의 용매분획은 상기 농축하여 동결건조 한 복령피의 95¾ 에탄올 추출물을 물에 녹여 저극성 용매인 헥산 (hexane)으로 먼저 추출하여 여과한 시료를 다시 클로로포름 (chloroform), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 부탄을 (butanol )을 이용하여 각각 순차적으로 3-4회씩 분획하여 5개의 분획으로 분리하였다. 상기 5개의 분획을 핵산 분획 (Hexane Fr.), 클로로포름 분획 (Chloroform Fr.), 에틸 아세테이트 분획 (Ethyl acetate Fr.), 부탄을 분획 (Butanol Fr.) 및 물 분획 (Water Fr.)으로 이하 명명하였다 (도 11a). 복령피 추출물의 활성 분획
상기 분리된 5개의 분획물의 foxp3유도 활성능을 측정하였다. 활성능 측정 방법은 상술한 foxp3유도 활성법과 동일하다. 그 결과, 상기 5개의 분획 중, 헥산분획에서 foxp3유도활성이 있음을 확인하였다 (도 lib 및 11c). 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식올 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
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Claims
【청구항 1】
복령피 G "/a cocos Wolf) 추출물, V v) ( Cynanchym atratum Bunge) 추출물 및 남^ (Ar/sae amurense) 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 Thl-매개 면역 질환 또는 Th2- 매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 Treg 세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3]
제 1 항에 있어서, 상기 복령피 추출불은 TGF-β의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 Treg 세포 안정화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성불.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 Thl-매개 면역 질환은 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6]
제 1 항에 있어서, 상기 Th2-매개 면역 질환은 알레르기 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 비만세포 (mast cell)의 탈과립을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 백미 추출물은 IL-4 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL- 13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Th2-관련 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10】
제 1 항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 IL-17 및 IFN-Y로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Thl-관련 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 혈청 내 IgE, IgG2a 및 IgGl로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체의 생성을 억제하는 것올 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】 - 제 1 항에 있어서, 상기 백미 추출물 또는 남성 추출물은 알레르겐의 상피세포 통과를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13】
제 1항에 있어서, 상기 백미, 남성 또는 이들의 조합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Thl—매개 면역 질환 또는 ¾2-매개 면역 질환을 예방하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 14】
제 1 항 내지 제 13 항 증 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물, 기능성 식품 조성물, 화장료 조성물 또는
사료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성불.
【청구항 15]
Th2-매개 면역 질환 예방, 개선 또는 치료방법.
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KR1020130012036A KR101468127B1 (ko) | 2012-12-06 | 2013-02-01 | 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
KR10-2013-0012036 | 2013-02-01 | ||
KR1020130012031A KR101577392B1 (ko) | 2012-12-06 | 2013-02-01 | 복령피 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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Publications (1)
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