KR20130133610A

KR20130133610A - 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 조성물

Info

Publication number: KR20130133610A
Application number: KR1020120057006A
Authority: KR
Inventors: 손동화; 신희순; 최대운
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-12-09

Abstract

본 발명은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 우수한 IL-5 생성 억제 활성, 히스타민 분비 또는 탈과립 억제 활성 및 β-헥소사미니다아제 유리 억제 활성, COX-2 억제 활성 및 알레르겐의 상피세포층 통화 억제 활성을 갖으며, 본 발명은 천연물 및 식품 유래 항알레르기 물질의 세부적인 작용기전을 제공한다.

Description

천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 조성물{Anti-Allergy Compositions Comprising Natural Extracts as Active Ingredients}

본 발명은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1 종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 조성물에 관한 것이다.

근년 소득수준의 향상과 더불어 식습관의 변화, 위생의 청결화, 공해의 심화 등으로 인하여 알레르기는 날로 증가하는 추세를 보이고 있어 전 국민의 20-25%가 아토피피부염(AD), 천식, 비염 등의 증상을 가지고 있다. 이는 삶의 질을 현격히 저하시킴으로써 심각한 사회문제를 야기하고 있다. 또한, 식품 알레르기는 영유아의 6-8%에서 확인되고 있고, 소아의 AD는 35%가 식품알레르기에 의한 것으로 결코 무시할 수 없다.

아직까지 여러 알레르기에 대하여 확실한 효과를 보이는 치료제가 거의 없으며, 소아 아토피피부염이 증가하고 있으나 소아의 특성상 치료에 어려움을 겪고 있다. 특히 스테로이드 계통의 약물은 부작용이 심하여 세계적으로 그 대안을 마련하기위한 시도가 활발하게 이뤄지고 있다. 이러한 알레르기에 대응하는 방안으로써 독성과 부작용이 없으면서 확실한 효능이 기대되는 소재를 천연물과 식품으로부터 발굴하여 적극적으로 활용할 필요가 있다. 또한, 활성소재 및 성분의 항알레르기 작용기전도 함께 구명되어야 할 것이다.

21세기에 주류를 이루는 치료제는 알레르기 및 당뇨에 대한 것이다(일본 닛케이산쿄신문). 미국에서는 5,000만 명이 다양한 알레르기 질환을 갖고 있다(의약품시장, 연 52억불). 일본에서는 연간 1,560억 엔의 알레르기 관련 의약품시장이 형성되어 있으며, 기능성식품시장은 약 600억 엔이다. 국내의 경우 이 분야 의약품시장은 약 500억 원이다. 최근 일본 기능성식품의 특허 동향에서 “항비만” 다음으로 출원건수가 많은 분야가 “항알레르기”이다. 향후 높은 부가가치가 기대되며 이에 대한 대비가 요망된다.

최근에 면역기능조절이나 알레르기억제 활성을 강조하는 건강기능식품의 개발요구가 높아지고 있으며, 그 인정을 위하여 식품의약품안전청에 많은 건수가 신청되고 있다. 또한, 근년 일본의 특허분석을 통하여 조사한 미래 기능성식품의 잠재력은 “항비만” 다음으로 “항알레르기” 활성으로 보고되었다.

알레르기는 “과민 반응”이라는 뜻으로 그리스어인 “allos”가 어원이며, 이는 “변형된 것”을 뜻한다. 이처럼 알레르기란 면역시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 어떤 사람에게만 두드러기, 가려움, 콧물, 기침 등의 이상 과민 반응을 일으키는 것을 말한다. 최근 20 년동안 이와 같은 알레르기성 질병의 발병율이 세계적으로 증가하고 있는 추세이다(1,2). 주된 증가요인으로는 실내생활의 증가, 신소재의 개발, 외국으로부터 이물질 유입등과 같은 알레르기 유발 물질의 급증과 환경오염 및 스트레스로 인한 면역상태의 불안정, 그리고 식생활의 변화 등이 있다. 이처럼 현대인들의 알레르기 질병 발병율은 점차 증가하나 그 치료방법은 대부분 항히스타민제, 스테로이드제 등의 대중적 요법에 의존하고 있는 실정이며, 근본적인 치료방법은 찾지 못하고 있다(3).

Gell 및 Coombes(1963)는 알레르기반응을 발현시간과 타입에 기초하여 전통적으로 4 개의 부류로 나누었다(4). I - III 형은 항체가 관여하는 체액성 면역 반응(즉시형)이고, IV 형은 세포가 직접 관여하는 세포성 면역 반응(지연형)이다. 그리고 면역반응에 관여하는 세포와 매체의 종류에 따라 수분내에 증상이 나타나는 즉시 또는 조기 반응과 몇 시간 후에 나타나는 후기단계 반응으로 나뉘는데 제 I 형은 즉시형 과민반응, 제 IV 형은 지연형 과민반응의 형태로 나타난다. 대부분의 알레르기 반응은 제 I 형으로 천식, 비염, 결막염, 식품 및 약물 알레르기, 아토피성 피부염 등이 대표적인 질환으로 나타나고 심한 경우 아나필락시스(anaphylaxis)가 일어나 생명을 위협하기도 한다.

제 I 형 즉시형 과민반응은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgG1의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-r을 생산하는 Th1 세포반응과 IL-4, IL-5, IL-13등을 생산하는 Th2 세포반응의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4, IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생산한 IgE 특이항체들이 비만세포(mast cell)나 호염기구(basophil)의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발증이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다(5-7). [그림참조: "allergic diseases", "Th1/Th2 balance"]

알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반응으로 나뉘며, 초기반응은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반응을 유발하여 이 때 방출된 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반응은 해당조직에 호중구, 호산구, 대식세포, Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써 염증이 유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다(7). 이 같은 탈과립 분비 물질 중 히스타민은 가장 잘 알려진 인자이며, 즉각형 과민반응과도 관련되어 알레르기 증상의 중요한 지표로 사용되고 있다(8).

한편 식품알레르기는 최근 10년 동안 선진국에서는 약 3-6%의 어린이들에게서 발병되며 증가하는 추세를 보이고 있다(9). 식품알레르기는 소화관을 통해 체내에 들어 온 식품에 대하여 발생하는 것으로 주로 제 I 형 과민반응에 해당한다. 알레르기 환자의 경우 장관을 통하여 식품알레르겐이 소화되지 않은 상태로 침투하게 되며(4, 10), 이러한 알레르겐의 장내 흡수가 식품알레르기 발증의 첫 단계라 할 수 있다(11). 장관은 영양소의 소화흡수를 담당하는 기관일 뿐만 아니라 여러 가지 생체 조절에 관여하고 있다. 장상피 세포는 소화흡수, 장벽(barrier), 식신호의 전달/ 변환 등의 주요 기능을 가지고 있을 뿐만 아니라 그 밖에도 독특한 면역시스템(mucosal immunity)이나 신경조직이 발달되어 있는 등 소화관/장관의 역할을 결코 과소평가할 수 없다. 이렇듯 장상피세포는 장벽로써 밀착연접(tight junction)에 의해 거대 분자의 투과를 제한하나, 밀착연접이 손상된 경우에는 장벽의 기능 장애로 인해 투과성이 증가되어 식품알레르기뿐만 아니라 소아지방변증, 급성 췌장염과 같은 질환이 발생된다(12-17). 즉, 밀착연접의 안정화를 통해 장관의 장벽 기능을 강화시킨다면 식품 알레르기를 예방할 수 있을 것이다.

이미 앞선 논문들에서는 식품 및 천연물의 알레르기 억제 활성이 상당 수 보고된 바 있으며, 특히 우리나라에서는 알레르기의 치료 및 예방에 식품과 천연물이 한방과 민간요법으로 사용되어 왔다(18, 19). 이러한 연구들은 주로 빈랑자, 지모, 호로파 등의 한약재 및 약초들의 탈과립 억제 활성을 평가한 결과이며 (20-33), 퀘르세틴(quercetin), 다래, 마늘, 들깨 기름, 곤약, 소엽, 맥문동의 다당류성분, 영지버섯, 일본간장의 다당체 성분, 로얄 젤리, 동충하초 등에서의 Th1/Th2 면역반응 조절에 관한 연구도 다수 보고되었다(34-44). 이 외에 유산균, 발효된 보리, 청국장 등에서의 알레르기성 염증을 억제하는 활성에 관한 결과도 보고되었다(45-49).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물로부터 식품알레르기 제어물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물이 IL-4의 생성을 억제하고, 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 유리 억제 활성을 갖는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항알레르기용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항히스타민 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 알레르기 예방용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연물로부터 식품알레르기 제어물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물이 IL-4의 생성을 억제하고, 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 유리 억제 활성을 갖는 것을 규명하였다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는,본 발명의 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 ‘알레르기’는 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대한 신체 면역계의 과도한 반응으로 유발되는 다양한 질환, 질병 또는 이상 상태를 의미한다. 본 발명의 조성물에 적용되는 알레르기 질환으로는, 바람직하게는, 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응 및 제 Ⅳ 형 지연형 과민반응이다. 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응은 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 중이염, 두드러기 및 아나필라시 쇼크(anaphylatic shock)이고, 제 Ⅳ 형 지연형 과민반응은 은 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선염 및 알레르기성 뇌염이다. 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgG1의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-γ를 생산하는 Th1 세포반응과 IL-4, IL-5 및 IL-13 등을 생산하는 Th2 세포반응의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4 및 IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생산한 IgE 특이항체들이 비만세포(mast cell) 및 호염기구(basophil)의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발증이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다. 알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반응으로 나뉘며, 초기반응은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반응을 유발하여 이 때 방출된, 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반응은 해당 조직에 호중구, 호산구, 대식세포, Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써 염증이 유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다. 이같은 탈과립 분비 물질 중 히스타민은 가장 잘 알려진 인자이며, 즉시형 과민반응과도 관련되어 알레르기 증상의 중요한 지표로 사용되고 있다.

바람직하게는, 상기 알레르기는 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 아토피 피부염 또는 식품 알레르기이다.

본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 조성물은 Th2 세포반응을 억제하는 활성을 갖는 것이다.

바람직하게는, 상기 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물은 IL-4의 생성을 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 알레르기-유도 마우스로부터 분리한 비장세포에 대극 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물을 각각 처리하는 경우, 대조군과 비교하여 약 30% 이상의 억제 효과를 갖으며, 특히 대황 추출물 및 배초향 추출물은 70% 이상의 IL-4 억제율을 나타낸다(표 1). 보다 바람직하게는, 상기 대황 추출물은 80 mg/ml 농도에서 70-90%의 IL-4 생성 억제 효과를 나타내고, 상기 배초향 추출물은 IL-4의 생성에 대하여 20-40 μg/ml의 IC₅₀ 값을 나타내며, 상기 배초향 추출물 80 mg/ml 농도에서 60-80%의 IL-4 생성 억제 효과를 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항히스타민 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어‘히스타민’은 국소면역반응 뿐 아니라 장(gut)의 생리적 기능을 조절하고 신경전달물질로 기능하는 유기질소화합물이다. 히스타민은 결합조직(connective tissue)에 위치한 호염기구 및 비만세포에서 제조되어 외부 병원체에 의한 면역반응을 유도한다. 히스타민은 백혈구 및 단백질의 모세혈관으로의 침투성을 증가시켜 감염 조직 내 병원체로 유도한다. 비만세포 및 호염기구로부터 히스타민 유리의 가장 중요한 병리 생리학적 기작은 면역반응이다. 특정 항원이 상기 세포의 막에 존재하는 IgE 항체에 의해 감작되면 탈과립 하게 된다.

본 명세서에서, 용어 ‘탈과립’은 특정 세포 내 존재하는 과립제(granules)인 분비소낭(secretory vesicle)으로부터 항균성 세포독성 분자가 유리되는 과정을 말한다. 상기 특정세포는 면역계 내의 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구) 및 비만세포와 자연살해 세포 및 세포독성 T 세포와 같은 특정 임파 세포를 포함한다.

바람직하게는, 상기 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물은 히스타민 분비 또는 탈과립 억제 활성 및 β-헥소사미니다아제 유리(β-hexosaminidase release) 억제 활성을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 마우스의 호염기 세포주인 RBL-2H3 세포주에 상기 추출물을 처리 시, 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물은 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 유리에 대해 20-80%의 억제율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물에 적용되는 염증 질환은 염증성 피부 질환(예컨대, 습진 및 건선), 류마티스 관절염, 접촉성 피부염, 여드름, 부비동염, 골관절염, 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 급성 폐손상, 폐염증, 염증성 장질환(예컨대, 크론병, 궤양성 대장염), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 폐혈증, 폐혈성 쇼크, 맥관염 및 활액낭염 같은 급성 또는 만성 염증 질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물 및 율피 추출물은 COX-2(cyclooxygenase-2) 활성 억제능을 갖으며, 보다 바람직하게는, 상기 결명자 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 2.5-4.0이고, 상기 대극 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 2.5-4.5이며, 상기 대황 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 7.0-9.0이고, 상기 율피 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 7.5-9.5이다.

바람직하게는, 상기 대극 추출물 및 상륙 추출물은 15-LOX(15-Lipooxygenase)의 활성을 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 대극 추출물 및 상륙 추출물의 IC₅₀ 값은 각 87 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 결명자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 결명자 추출물은 알레르겐의 상피세포층 통과를 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 결명자 추출물은 1-10%의 알레르겐의 상피세포층 통과율을 나타내고, 보다 바람직하게는 4-7% 통과율이다.

본 발명에 의해 예방되는 알레르기는 바람직하게는 식품 알레르기이다.

본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 결명자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방용 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물, 기능성 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 조성물이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 결명자, 대극, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물은 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 유효 성분으로서의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 사료 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 결명자, 대극, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 그대로, 또는 사료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제 등을 가하여 제조할 수 있다. 예컨대, 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제이다. 그 형상에는 분체, 과립, 펠릿 또는 현탁액 등이 포함된다.

본 발명의 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 육상 또는 수상 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 본 발명의 사료에는 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 천연물을 소재로 하는 항알레르기용 조성물, 항히스타민 조성물, 항염증용 조성물 및 알레르기 예방용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 우수한 IL-4 생성 억제 활성, 히스타민 분비 또는 탈과립 억제 활성 및 β-헥소사미니다아제 유리 억제 활성, COX-2 억제 활성 및 알레르겐의 상피세포층 통화 억제 활성을 갖는다.

(c) 본 발명은 천연물 및 식품 유래 항알레르기 물질의 세부적인 작용기전을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법 및 실험 재료

시약 및 기기

OVA(Ovalbumin), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 용 일반시약 등은 시그마사(St. Louis, 미국) 제품을 사용하였다. TEER(transepithelial electrical resistance, Ω/㎠)측정을 위해 사용한 Millicell-ERS(Electrical Resistance System)는 밀리포어(Millipore)사(Bedford, MA, 미국)제품을 사용하였다. ELISA를 위한 항OVA항체 및 특이항체-효소 결합물은 자체적으로 제작한 것(류주현, 박춘욱, 이종미, 손동화 (2004) NaOH, 열 및 효소 처리에 의한 계란 난백 중 ovomucoid와 ovalbumin의 항원성 변화. 한국식품과학회지 36(1):147-151)을, 마이크로플레이트(microplate)는 넌크(Nunc)사 제품을, 리더(reader)는 Molecular Devices사 제품을 사용하였다. IgE와 사이토카인 측정에 사용된 ELISA 키트는 BD bioscience사(San Diego, CA, 미국)제품을 사용하였다.

시료의 확보 및 용매추출물의 준비

결명자(Senna obtusifolia L.), 대극(Euphorbia pekinensis), 대황(Rheum rhabarbarum L.), 배초향(Agastache rugosa), 상륙(Phytolacca esculenta) 및 율피(Castanea crenata S.)를 시중에서 구입하여 사용하였다. 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물을 제조하기 위해, 시료를 분쇄한 다음 25배의 50% EtOH을 첨가한 후 Prolabo사의 마이크로웨이브 추출 시스템 Soxwave 100 (Fontenay- Sous-Bois, 프랑스)을 이용하여 90 W에서 5분동안 마이크로웨이브 처리하여 추출하였다. 추출액은 여과지로 여과하고 약 40%까지 감압 농축한 후 0.45 ㎛ 시린지 필터로 막여과 하여 4℃에 보관하며 사용하였다.

즉, 각 식물 100 g 기준으로 70% EtOH 1,000 ㎖을 첨가하고 역류하여 추출하였다(2회 실시). 역류 조건은 약 60℃에서 3시간 후 추출물을 한번 회수 하고 다시 70% EtOH 1,000 ㎖를 첨가하여 총 2회 실시하였다. 그 후 회전식 진공증발기(rotary evaporator)를 이용하여 최종 100 ㎖정도로 감압농축 후 동결건조하여 냉동보관하면서 사용하였다.

Th1/Th2 사이토카인 균형조절 활성시험

6주령 자성 BALB/c 마우스에 1주일 간격으로 2차례 알레르겐(allergen)을 복강면역하여 알레르기를 유발하였다. 알레르겐은 OVA(20 ㎍) 및 백반(2 ㎎)의 혼합액을 30분 동안 혼합한 다음 마리당 100 ㎕ 씩 복강 주사하였다(n=5). 면역 1주후 마우스를 경추탈골 하고 무균상태에서 비장을 적출하여 1 ㎖의 기본배지(2-머캅토에탄올 및 항생제를 포함하는 RPMI1640)을 작은 페트리디쉬에 옮겨 아이스박스위에 보관하였다. 페트리디쉬에 담긴 비장은 메쉬(mesh)를 이용하여 단세포화한 후 5 ㎖의 기본배지로 2회 세척하고 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 상층액 제거 후 1 ㎖의 RBC(Red Blood Cell) 용해 버퍼(SIGMA, 미국)를 첨가하여 손으로 잘 흔들어 현탁하고 3분 동안 아이스 위에서 반응시킨 뒤 10 ㎖의 기본배지 첨가 후 현탁하고 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 2회 실시하였다. 상층액 제거 후 10% FBS를 첨가한 기본배지를 첨가하여 현탁하고 50 ㎕ 중 10 ㎕와 살린(saline) 90 ㎕를 희석하여 10배 희석한 세포 현탁액을 제조하였다. 10배 희석한 세포 현탁액 10 ㎕, 살린 190 ㎕ 및 트리판 블루(SIGMA, 미국) 190 ㎕을 첨가하고 혼합하여 5분 동안 방치 후 세포수를 측정하였다. 48-웰 플레이트에 항원(100 ㎍/㎖)을 처리하고 각 4 ㎍/㎖의 각 추출물을 첨가하였다. 그 후 5×10⁶ 세포/500 ㎕/웰의 밀도로 비장세포를 웰에 분주하였다. 37℃ CO₂ 항온항습기에서 72시간 동안 배양 후, 상층액을 회수하였다.

IL -4의 생성 억제활성

결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 또는 율피 추출물을 상기 비장세포에 첨가하여 나타나는 사이토카인의 분비유형을 조사하였다. 분석은 ELISA 키트(BD Biosicience, 미국)를 이용하여 제조회사의 프로토콜에 따라서 행하였다. 간단히 설명하면 96 웰 플레이트에 포획항체를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 포획항체가 코팅된 96 웰 플레이트를 세척버퍼(트윈 20을 포함하는 PBS; PBST)로 3회 세척한 후 10% FBS를 포함하는 PBS를 200 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 3회 세척 후 각 표준시료와 각 추출물을 100 ㎕씩 각 웰에 분주하여 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 5회 세척하여 검출항체 및 스트렙타비딘-HRP를 100 ㎕씩 분주한 후 상온에서 1시간동안 반응하였다. 7회 세척 후 웰 당 100 ㎕의 기질용액(0.01% TMB를 포함하는 구연산-인산염 버퍼, pH 5.0, 0.001% H₂O₂)으로 상온에서 30분 동안 발색한 후, 2M H₂SO₄를 50 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 발색반응을 중지하였다. 발색정도를 마이크로플레이트 리더(THERMOmax, Molecular Devices, 미국)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

탈과립 억제활성

흰 마우스의 호염기구 세포주인 RBL-2H3 세포주를 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1.0 mM 피루브산나트륨을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에 항온항습기에서 배양하여 히스타민 및 β-헥사미니다아제 활성 시험에 사용하였다.

히스타민 유리 억제활성을 조사하기 위해, RBL-2H3 세포주를 24 웰 플레이트에 1×10⁶세포/㎖로 분주하고 하룻밤 정치하여 세포를 안정화 시킨 다음 각 웰에 각 추출물을 5 ㎕씩 처리하고 1시간 동안 반응하였다. 반응이 종결된 다음 자극제[1 uM 칼슘운반체 A23187+50 nM PMA(Phosbol 12-Myristate 13-Acetate)］를 처리하여 8시간 동안 반응한 후 배양액을 회수하여 5000 rpm으로 5분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 수득하였다. 수득한 상층액을 이용하여 유리된 히스타민 양을 측정하였다. 이를 정량적으로 확인하기 위하여 히스타민 EIA(Enzyme Immunoassay) 키트(EA31, Oxford, 미국)를 이용하였다.

즉, 단일클론 항-히스타민 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 50 ㎕ 상층액 또는 표준시료를 첨가한 다음 바로 효소 결합체 50 ㎕를 첨가하여 교반 한 후 45분 동안 상온에서 방치하고 세척버퍼로 3회 세척하였다. 다음, 기질(Tetra-methyl benzidine; TMB)을 150 ㎕ 첨가한 후 15-20분 동안 반응하고 50 ㎕의 1 N HCl을 첨가하여 반응을 종료하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

β-헥소사미니다아제 유리억제 활성을 조사하기 위해, RBL-2H3 세포주를 1×10⁶세포/㎖로 24 웰 플레이트에 0.5 ㎖씩 분주하고 0.5 ㎍/㎖의 마우스 단일클론 IgE를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 항온항습기에서 하룻밤 배양하여 세포를 감작하였다. 감작된 세포를 0.5 ㎖ 시라가니안(siraganian) 버퍼(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl, 25 mM 포페라진-N,N'-bis(2-에탄설폰산) 및 40 mM NaOH, pH 7.2)로 2회 세척하고 160 ㎕ 반응버퍼[5.6 mM 글루코오스. 1 mM CaCl 및 0.1% BSA(Bovine Serum Albumin)을 포함하는 시라가니안 버퍼]를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 그 후, 5 ㎕ 각 추출물을 첨가하여 20분 동안 반응한 후, DNP-HSA(Dinitrophenyl-Human Serum Albumin, 1 ㎍/㎖) 20 ㎕를 항원으로 처리하여 10분 동안 37℃에서 배양하여 알레르기성 염증 반응을 유도하였다. 반응물을 800 ×g에서 10분 동안 원심분리를 실시한 후 96 웰 플레이트에 20 ㎕ 상층액 및 20 ㎕ 기질(1 mM ρ-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미나이드을 포함하는 0.2 M 구연산, pH 4.5)을 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 반응을 종결시키기 위해 0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃을200 ㎕씩 첨가한 후 발색단(chromophore), ρ-니트로페몰의 양을 ELISA 리더를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

COX 효소에 대한 저해활성

Reddy(2000)등의 방법을 변형하여 인 비트로(In vitro)에서 수행하였다. 96 웰 플레이트에 하나의 웰당 효소 40 ㎕[60 유니트 COX-1(Cyclooxygenase) 또는 30 유니트 COX-2)를 첨가하고, 90 ㎕의 100 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0), 20 ㎕의 30 μM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid), 20 ㎕의 150 μM 헤마틴 및 20 ㎕ 시료를 혼합하여 25℃에서 5분 동안 반응하고, 5 ㎕의 5 mM TMPD 및 5 ㎕의 20mM 아라키돈산을 첨가하여 25℃에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더를 사용하여 603 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 EGCG(Epigallocatechin Gallate , Sigma, 미국) 및 인도메타신(Sigma, 미국)을 사용하였다.

LOX 저해활성

15-LOX 억제 활성의 측정은 리폭시제나아제 억제제 스크리닝 분석키트(lipoxygenase inhibitor screening assay kit, Cayman, 미국)를 이용하여 인 비트로(in vitro)에서 실시하였다. 샘플 10 ㎕에 15-LOX(220 유니트/㎖) 90 ㎕와 1 mM 아라키돈산 10 ㎕를 첨가하여 5분 동안 상온에서 반응 시킨 후, 크로모겐(chromogen) 100 ㎕를 가하여 상온에서 반응시키고 ELISA 리더로 490 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 EGCG(epigallocatechin gallate) 및 노르디히드로구아야레틱산(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)을 사용 하였다.

상피세포층 통과 억제

ATCC 유래의 Caco-2 세포주(HTB-37)를 얼스 염(Earle’salt), 20 % FBS, 1% 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖l 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1.5 g/L 이탄산나트륨, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 1.0 mM 피루브산 나트륨을 포함하는 MEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 계대배양 하였다. Caco-2 단세포층을 이용한 식품 알레르겐 통과시험을 하기 위해 상기 배양배지를 사용하여 Caco-2 세포를 12 트랜스웰 플레이트의 상층부(apical side)인 통과막(transmembrane) 상에 1×10⁵세포/㎖의 밀도로 0.5 ㎖을 분주하였다(51). 웰의 하층부(basolateral side)에는 배양배지 1.5 ㎖을 첨가하고 37℃, 5 % CO₂ 항온항습기에서 배양하였다. 배지교환은 매 2-3일에 간격으로 실시하였다. 분주 후 약 2-3주가 지나 단세포층을 형성한 Caco-2 세포의 하층부와 상층부 간 전기저항치(Transepitherial Electrical Resistance; TEER, Ω×㎠)를 Millicell-ERS(Electrical Resistance System, Millipore, 미국)로 측정하여 수치가 300 Ω×㎠ 초과인 경우 실험에 사용하였다. Caco-2 단세포층을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 3회 세척 한 후 50% EtOH 추출 후 막여과한 추출물(최종농도: 400 ㎍/㎖)을 담즙산염(최종농도: 150 ㎍/㎖)과 함께 상층부에 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 항온항습기에서 1시간 동안 처리하였다. 다음으로 OVA를 상층부에 첨가 한 후(최종농도: 400 ug/ml) 37℃, 5% CO₂ 항온항습기에서 3시간 반응시킨 다음 한번 더 TEER 수치를 측정하였다(도 1).

여기에서 하층부의 액을 회수하여 통과된 OVA의 농도를 sELISA로 측정하였다. 하층부 내의 통과된 OVA량은 다음과 같이 구하였다:

Flux = C ng/ H hr/ S cm²

여기에서 C는 ELISA에 의하여 구한 OVA의 통과량이고, H는 Caco-2 단세포층 상층부에 OVA 첨가 후 반응시간 (3h)을 나타내며, S는 트랜스웰 플레이트의 상층부 표면적(1.1cm²)을 나타낸다.

통계 처리

모든 실험의 결과는 평균치 및 표준편차를 이용하여 나타내었으며, 각 그룹과 시료간의 차이는 SAS를 이용한 ANOVA 및 Duncan's 다중시험법을 통해 유의차 p<0.05 유의 수준에서 검증하였다.

결과

IL -4 생산 억제활성

‘실험재료 및 실험방법’에 명시한 바와 같이 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물에 의한 비장세포의 IL-4 생산억제 활성시험을 행하였다. 상기 추출물의 첨가농도는 4 ㎕/㎖(약 80 ㎎/㎖)로, 대조군과 비교하여 IL-4 생산저해활성을 표 1에 나타내었다.

시료	IL-4 억제율(%)
결명자	0
대극	30.0±6.0
대황	81.8±5.0
배초향	70.0±18.2
상륙	57.2±22.2
율피	27.9±2.2

이러한 결과는 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물이 IL-4의 생성에 대하여 약 30% 이상의 억제 효과를 갖는 것으며, 특히 대황 추출물 및 배초향 추출물은 70% 이상의 IL-4 억제율을 나타내었다.

높은 IL-4 억제활성을 갖는 배초향 추출물의 IC₅₀ 값은 30.91 ㎍/㎖이고, 상륙 추출물의 IC₅₀ 값은 1.95 ㎕/㎖이었다.

히스타민 유리억제 활성

결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물에 대한 히스타민 유리억제 활성을 조사하였다. 무처리시 히스타민의 유리량은 167.7 ng/㎖이며, 자극제[칼슘운반체 A23187 및 PMA(Phosbol 12-Myristate 13-Acetate)]만 처리하는 경우, 히스타민의 유리량은 232.4 ng/㎖이다. 다음의 공식을 통해 히스타민 유리억제율를 산출하였다.

각 추출물을 처리하여 유리된 히스타민을 통해 산출된 억제율을 표 2에 나타내었다. 표 2의 ‘히스타민 유리량’은 각 추출물 처리시 유리량(ng/㎖)에서 무처리시의 히스타민 유리량(167.7 ng/㎖)을 제한 값이다.

시료	히스타민 유리량	억제율(%)
결명자	220.5±5.1	26.0±2.5
대극	203.1±2.2	49.9±3.0
대황	218.3±8.7	29.0±4.9
배초향	211.4±3.4	38.5±3.0
상륙	187.0±1.7	72.2±6.0
율피	214.6±4.2	34.2±3.0

상륙 추출물을 처리하는 경우, 히스타민 유리량은 187.0±1.7 ng/㎖로 나타났으며, 히스타민 유리 억제율은 72.2±6.0 %로 가장 높은 억제율을 나타내었으며, 모든 추출물에서 히스타민 유리 억제 활성을 나타내었다.

β- 헥소사미니다아제 유리억제 활성

결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물에 대한 β-헥소사미니다아제 유리억제 활성을 조사하였다. 무처리시 β-헥소사미니다아제의 유리정도를 나타내는 A₄₀₅ 흡광도는 0.121이며, 자극제[항-DNP(Dinitrophenyl) IgE 항체 및 DNP-HSA(Dinitrophenyl-Human Serum Albumin)]만 처리하는 경우, β-헥소사미니다아제의 유리정도를 나타내는 A₄₀₅ 흡광도는 0.390이다. 다음의 공식을 통해 β-헥소사미니다아제의 유리 억제율를 산출하였다.

각 추출물을 처리하여 유리된 β-헥소사미니다아제을 통해 산출된 억제율을 표 3에 나타내었다.

시료	OD 값(A₄₀₅)	억제율(%)
결명자	0.165±0.02	38.6±1.5
대극	0.144±0.02	46.5±5.5
대황	0.223±0.08	17.2±7.2
배초향	0.178±0.02	33.7±4.2
상륙	0.137±0.01	49.2±2.0
율피	0.202±0.02	24.8±2.8

상륙 추출물을 처리하는 경우, β-헥소사미니다아제 유리량를 나타내는 A₄₀₅ 흡광도는 0.137±0.01로 나타났으며, β-헥소사미니다아제 유리 억제율은 49.2±2.0 %로 높은 억제율을 나타내었다. 모든 추출물에서 β-헥소사미니다아제 유리 억제활성을 보여주었다.

각 추출물의 히스타민 유리 억제율 및 β-헥소사미니다아제 유리 억제율을 정리하여 표 4에 나타내었다.

시료	히스타민 유리 억제율(%)	β-헥소사미니다아제 유리 억제율(%)
결명자	26.0±2.5	38.6±1.5
대극	49.9±3.0	46.5±5.5
대황	29.0±4.9	17.2±7.2
배초향	38.5±3.0	33.7±4.2
상륙	72.2±6.0	49.2±2.0
율피	34.2±3.0	24.8±2.8

COX -1 및 COX -2 효소에 대한 인 비트로( in vitro ) 저해 활성

비만세포는 알레르기 발증의 2단계 전기반응에 관여하는 핵심적인 요소로써, 비만세포 내 효소의 작용으로 인지질대사가 활발해지면 그 대사산물이 알레르기 반응을 더욱 심해지게 된다(알레르기성 염증반응). 그러므로 알레르기를 완화 및 억제하는데 도움이 될 수 있도록, COX(Cyclooxygenase, 특히, COX-2)의 작용을 저해하는 활성이 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물에 존재하는지 검토하고자 하였다.

염증반응에 밀접한 연관이 있는 COX-2 저해활성은 높으나 통상 생체 내에 필수적인 효소인 COX-1의 저해활성은 낮은 추출물이 양호한 것으로 판단하고 이들을 구분하고자 하였다.

각 추출물을 COX-1 및 COX-2 저해활성을 표 5에 나타내었다.

시료	COX-1 저해활성(A₆₀₃)	COX-2 저해활성(A₆₀₃)
결명자	0.492	-0.001
대극	0.198	0.012
대황	0.138	-0.002
배초향	0.189	0.126
상륙	0.122	0.159
율피	0.162	0.008

이 중 COX-2 저해활성이 우수한 추출물을 선발하여 IC₅₀ 값을 비교하였다. 그 대상은 결명자 추출물, 대극 추출물 및 율피 추출물이다(표 6). 대조군의 COX-1 활성을 나타내는 흡광도 값은 0.173이고, COX-2 활성을 나타내는 흡광도 값은 0.149이다.

시료	COX-1 IC₅₀(㎍/㎖)	COX-2 IC₅₀(㎍/㎖)	COX-1 IC₅₀/COX-2 IC₅₀비
결명자	65	200	3.08
대극	10.9	39	3.58
율피	4.1	35	8.54

표 6에서 COX-1 IC₅₀/COX-2 IC₅₀ 비의 수치가 가장 낮게 나타난 결명자 추출물이 저해활성이 우수한 것을 판단되나, 여기에서 그 비율보다 COX-2의 IC₅₀ 값이 낮은 것이 우선되어야 할 것이다.

LOX 저해활성

COX에 이어서 LOX(Lipoxygenase)도 알레르기 발증의 2단계 전기반응에 관여하여 인지질 대사산물을 생산함으로써 염증을 유발하게 되는데, 이를 억제하는 것은 그 증상을 완화하는데 기여할 수 잇을 것이다. 따라서, 이 효소 중의 하나인 15-LOX를 저해하는 활성이 추출물 중에 어느 정도 존재하는지 검토하고자 하였다.

모든 추출물의 15-LOX 저해활성을 조사한 결과, 우수한 값을 나타내는 대극 추출물 및 상륙 추출물의 IC₅₀ 값을 확인하였다. 대극 추출물 및 상륙 추출물의 IC₅₀ 값은 각각 87 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이었다.

상피세포층 통과 억제

식품 알레르기 발증은 가장 먼저 알레르겐이 소화되지 않은 채로 장상피세포층을 통과하여 체내에 흡수되고 이에 대한 생체의 과민한 면역반응이 일어나기 때문이다. 그러므로 알레르겐의 소장통과를 억제하는 활성소재를 탐색하고 선발하여 이를 활용한다면 식품알레르기의 발증 조절이 가능할 것이다. 이러한 논리에 근거하여, 본 발명에서는 결명자, 대극, 배초향 및 상륙 추출물의 장상피세포층 통과억제 활성을 조사하였다.

그 결과, 결명자 추출물이 약 6%의 알레르겐 통과율로 우수한 상피세포 통과 억제 활성을 나타내었다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기용 조성물.
결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항히스타민 조성물.
결명자, 대극, 대황, 배초향, 상륙 및 율피로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
결명자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물, 기능성 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 대극 추출물, 대황 추출물, 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물은 IL-4의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 배초향 추출물은 IL-4의 생성에 대하여 20-40 μg/ml의 IC₅₀ 값을 나타내고 상기 배초향 추출물 80 mg/ml 농도에서 60-80%의 IL-4 생성 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물. 배초향 추출물, 상륙 추출물 및 율피 추출물은 히스타민 분비 또는 탈과립 억제 활성 및 β-헥소사미니다아제 유리(β-hexosaminidase release) 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 결명자 추출물, 대극 추출물, 대황 추출물 및 율피 추출물은 COX-2(cyclooxygenase-2) 활성 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 결명자 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 2.5-4.0이고, 상기 대극 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 2.5-4.5이며, 상기 대황 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 7.0-9.0이고, 상기 율피 추출물은 COX-2 IC₅₀/ COX-1 IC₅₀의 비율이 7.5-9.5인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 대극 추출물 및 상륙 추출물은 15-LOX(15-Lipooxygenase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알레르기는 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 아토피 피부염 또는 식품 알레르기인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 결명자 추출물은 알레르겐의 상피세포층 통과를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 알레르기는 식품 알레르기인 것을 특징으로 하는 조성물.