WO2014080991A1 - 糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法 - Google Patents

糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法 Download PDF

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sugar chain
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glycoprotein
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和央 伊藤
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公立大学法人大阪市立大学
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme having an activity of releasing a sugar chain of a glycoprotein, a method for producing the enzyme, and a method for releasing a sugar chain using the enzyme.
  • Sugar chains are biological information molecules called third biopolymers after proteins and deoxyribonucleic acid (DNA).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • sugar chains are dendritic molecules composed of about 10 types of monosaccharides such as glucose, and most of them exist as glycoproteins bound to proteins and glycolipids bound to lipids.
  • Sugar chains are often present in body fluids as secreted proteins or cover the cell surface as membrane proteins or glycolipids.
  • sugar chains are used for cancer (metastasis, tumor markers, etc.), immunity (immunoreceptor regulation, immune cell differentiation, antibody drugs, etc.), fertilization, development / differentiation (regenerative medicine, etc.), infectious diseases (influenza , H. pylori, cholera toxin, etc.) have been shown to play an important role.
  • cancer metalastasis, tumor markers, etc.
  • immunity immunogenoreceptor regulation, immune cell differentiation, antibody drugs, etc.
  • fertilization development / differentiation (regenerative medicine, etc.)
  • development / differentiation regenerative medicine, etc.
  • infectious diseases influenza , H. pylori, cholera toxin, etc.
  • Patent Document 1 discloses a method for releasing a sugar chain from a glycoprotein using a substance having a hydrazide group that specifically binds to an aldehyde group of the sugar chain.
  • the protein portion is degraded.
  • the structure of the released sugar chain is partially changed.
  • a method using an enzyme is also known as a method for releasing a sugar chain from a glycoprotein without any change in either the sugar chain part or the protein part.
  • it is an enzyme that liberates asparagine-linked sugar chains, and is used worldwide as endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (hereinafter, also simply referred to as “endo”) as Streptomyces plicatus. ) -Derived endo-H.
  • Endo H acts on the high-mannose and hybrid asparagine-linked sugar chains that are characteristic of the sugar chains of yeast and filamentous fungal glycoproteins, but it is a complex that is characteristic of glycoproteins of higher animals such as humans. Does not act on type sugar chains.
  • Endo M derived from Mucorhiemalis, which has recently become commercially available, acts well on high mannose and hybrid sugar chains, like End H.
  • Endo M is used for glycoside synthesis due to its property of acting on a double-stranded complex type sugar chain.
  • its action is low compared to the action on the high mannose type.
  • it hardly acts on the sugar chain of glycoprotein containing fucose between the sugar chain part and the diacetylchitobiose part and the complex type sugar chain having 3 to 5 chain branches.
  • it is necessary to digest the protein portion to obtain a glycopeptide or a sugar asparagine. Therefore, even if this endo M is used, it is difficult to directly release the sugar chain from the glycoprotein itself.
  • these enzymes are by no means easy to use. Therefore, it acts on a sugar chain containing fucose between a sugar chain part and a diacetylchitobiose part and a complex type sugar chain having 3 to 5 branched chains, and has an activity of directly releasing the sugar chain from the glycoprotein itself. Enzymes have long been desired.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the present inventor has reported research results as shown in Non-Patent Documents 1 and 2 in the past.
  • the present inventor found that a component contained in human saliva has the above-described action and activity, and considered that this component is highly likely to be an enzyme. It was named N-acetylglucosaminidase HS (End HS).
  • endo HS is derived from bacteria resident in epithelial cells of the oral mucosa, and that endo HS is represented by a plurality of amino acid sequences using metagenomic method in human saliva.
  • the present invention has been completed by finding that the enzyme group is a group of enzymes and that a specific microorganism produces an enzyme having the above-mentioned actions and activities.
  • the amino acid sequence is derived from a microorganism selected from the genus Lactobacillus and Prebotella, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11.
  • an enzyme having an amino acid sequence having at least 70% homology with these sequences and having an activity of releasing a sugar chain of a glycoprotein is provided.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the above enzyme.
  • the present invention provides a method for producing the enzyme, a host cell transformed with the recombinant vector, a method for releasing a sugar chain using the enzyme, a culture of the cell, and a processed product thereof.
  • the present invention can provide an enzyme capable of directly releasing an asparagine-linked sugar chain from a glycoprotein derived from an animal, including vertebrates such as humans, and a method for producing the same.
  • an enzyme capable of directly releasing an asparagine-linked sugar chain from a glycoprotein derived from an animal, including vertebrates such as humans, and a method for producing the same.
  • the structure of an asparagine-linked sugar chain is provided.
  • Application to functional analysis is also expected.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structure of a sugar chain used in Example 12.
  • PAES is N- [2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamyl
  • Man is mannose
  • GlcNAc is N-acetylglucosamine
  • Amparagine is asparagine.
  • the arrow in the figure represents the ⁇ 1-4 binding site that is cleaved by the enzyme of the present invention. It is the data of the thin layer chromatography performed in Example 12.
  • lane 1 is PAES-Asn-OVA-GP-V as a negative control
  • lane 2 is PAES-Asn-OVA-GP-V and end FV as positive controls
  • lane 3 is PAES-Asn-OVA-GP.
  • lane 4 is the result of applying a suspension of PAES-Asn-OVA-GP-V and culture LF.
  • End FV is endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase of Flammulina velutipes (Enokidake). It is a figure which shows the structure of the sugar chain used in Example 13.
  • “Sia” is sialic acid.
  • Example 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel performed in Example 13.
  • “Endo LF-f” is the culture supernatant of culture LF
  • “Endo LF-b” is a suspension of culture LF
  • “M” is a marker. It is a figure which shows the structure of the sugar chain used in Example 14.
  • “(Sia)” is sialic acid, and the short bold line shown at the base of each sugar chain represents core fucose.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel performed in Example 14.
  • Endo LF-f is the culture supernatant of the culture LF
  • Endo LF-b is the suspension of the culture LF.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel performed in Example 15. It is a figure which shows the structure of the sugar chain used in Example 16.
  • PAES is N- [2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamyl
  • Man is mannose
  • Gal is galactose
  • GlcNAc is N-acetylglucosamine
  • Asn is asparagine.
  • the arrow in the figure represents the ⁇ 1-4 binding site that is cleaved by the enzyme of the present invention.
  • 2 is data of thin layer chromatography performed in Example 16.
  • Lane 1 is PAES-HTF Asn-CHO and water as negative controls
  • Lane 2 is PAES-HTF Asn-CHO and End HS as positive controls
  • Lane 3 is PAES-HTF Asn-CHO and culture PM.
  • Precipitate lane 4 is the result of applying a suspension of PAES-HTFnAsn-CHO and culture PM
  • lane 5 is the result of applying a suspension of PAES-HTF Asn-CHO and culture LF.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel performed in Example 17.
  • Example 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel performed in Example 18. It is a photograph of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the band of the enzyme of the present invention.
  • M is a marker
  • A is the A fraction
  • B is the B fraction.
  • It is a graph which shows the influence of pH with respect to the sugar_chain
  • “ ⁇ ” indicates data when acetate buffer pH 3.52, 4.01, 4.5, 5.0, 5.51 is used, and “ ⁇ ” indicates that phosphate buffer pH 5.47, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 is used.
  • ⁇ indicates data when using Tris-HCl buffer pH 7.55, 8.03, 8.51, and ⁇ indicates data when using borate buffer pH 8.5, 9.0, 10.0.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of the enzyme of the present invention against human transferrin. It is a photograph of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel which shows the sugar chain release activity with respect to the human lactoferrin of the enzyme of this invention.
  • 1 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of bovine lactoferrin of the enzyme of the present invention. It is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of calf fetuin of the enzyme of the present invention.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of the enzyme of the present invention against human ⁇ 1-AG. It is a photograph of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel which shows the sugar chain release activity with respect to sheep IgG of the enzyme of this invention.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of the enzyme of the present invention against human lactoferrin (Plant expression).
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing sugar chain releasing activity of the enzyme of the present invention for takaamylase.
  • 2 is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of the enzyme of the present invention on ovalbumin (OVA). It is a photograph of an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel showing the sugar chain releasing activity of bovine RNase B of the enzyme of the present invention.
  • OVA ovalbumin
  • the enzyme of the present invention is an enzyme derived from a microorganism selected from the genus Lactobacillus and Prevotella.
  • the enzyme of the present invention is an enzyme derived from a microorganism selected from Lactobacillus fermentum, Prevotella bivia and Prevotella melaninogenica.
  • the enzyme of the present invention is an enzyme that binds to, is secreted by, or is endogenous to the cells of these microorganisms.
  • Examples of the enzyme derived from Plavola melaninogenica include an enzyme having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5 encoded by a gene having a base sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • the enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is called endo PM ⁇ .
  • the enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is called endo PM ⁇ .
  • the enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is called endo PM ⁇ .
  • Microorganisms are not particularly limited, but excretions such as vertebrate saliva and urine, and cells and tissues, particularly excrements such as human saliva and urine, and those contained in cells and tissues are preferable.
  • the enzyme of the present invention comprises at least 70%, preferably at least 70% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or any one of these sequences.
  • “homology” means homology calculated using BLAST analysis provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) in the US as a standard setting. Specific numerical values of homology are 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, and 100%.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5 mean enzymes called endo PM ⁇ , endo PM ⁇ , and endoPM ⁇ , respectively.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 or any one of these sequences is an amino acid sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% homology. It is preferable to include a common region indicated by the following region 1, region 2, region 3, and region 4.
  • region 1 is Formula: X 1 GX 2 X 3 GX 4 X 5 X 6 NX 7 E (Where X 1 is a leucine, phenylalanine or tyrosine residue; X 2 is a phenylalanine, tyrosine, isoleucine or valine residue; X 3 is an aspartic acid or asparagine residue; X 4 is an isoleucine, phenylalanine, leucine or valine residue; X 5 is an asparagine or glycine residue; X 6 is a tyrosine or phenylalanine residue; X 7 is tryptophan or serine residue) It consists of an amino acid sequence represented by
  • Region 2 is Formula: X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 X 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 X 19 YX 20 X 21 X 22 X 23 EX 24 X 25 FSX 26 GX 27 X 28 NPX 29 X 30 X 31 X 32 X 33 I (Where X 8 is a glycine, glutamic acid or aspartic acid residue; X 9 is a glycine, lysine, aspartic acid or asparagine residue; X 10 is an aspartic acid or glycine residue; X 11 is an alanine, serine or threonine residue; X 12 is a leucine, methionine, asparagine or serine residue; X 13 is a serine, proline or aspartic acid residue; X 14 is an arginine, glutamic acid, valine or isoleucine residue; X 15 may be an isoleucine,
  • Region 3 is Formula: PX 34 X 35 X 36 X 37 FNX 38 GNGX 39 X 40 X 41 X 42 X 43 X 44 GX 45 X 46 X 47 X 48 X 49 X 50 X 51 WX 52 NX 53 X 54 X 55 QDX 56 X 57 PTX 58 RW (Where X 34 is a phenylalanine or leucine residue; X 35 is an alanine, isoleucine or valine residue; X 36 is a threonine or serine residue; X 37 is a histidine, tyrosine or arginine residue; X 38 is a methionine, threonine or leucine residue; X 39 is a glutamic acid, lysine or leucine residue; X 40 is a leucine, arginine, phenylalanine or serine residue; X 41 is a tyrosine or phenylalanine residue
  • Region 4 is Formula: DAYX 59 GGX 60 X 61 X 62 X 63 X 64 X 65 GX 66 X 67 X 68 X 69 X 70 X 71 X 72 X 73 X 74 X 75 LX 76 KTX 77 X 78 (Where X 59 is a threonine, leucine, methionine or tryptophan residue; X 60 is an alanine or serine residue, X 61 is a cysteine, alanine or threonine residue; X62 is a leucine or valine residue; X 63 is a serine or arginine residue; X 64 is a leucine, isoleucine or valine residue; X 65 is a lysine, phenylalanine, histidine or serine residue; X 66 is a valine, asparagine, serine or glutamine residue; X 67 is a
  • amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 include the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, respectively. .
  • the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is endo HS ⁇ 2
  • the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is endo HS ⁇ 1
  • the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is endo HS ⁇ 1
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 The enzyme consisting of is called endo HS ⁇ 4
  • the enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is called endo HS ⁇ 1
  • the enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is called endo HS ⁇ 3.
  • the average molecular weight of each endo HS is shown in Table 1 below.
  • any of the above-described enzymes of the present invention has an activity of releasing a sugar chain of a glycoprotein.
  • the enzyme of the present invention can liberate double-, three-, four- and five-chain complex sugar chains of glycoproteins.
  • enzymes derived from the genus Lactobacillus and Prevotella or having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or any one of these sequences, high mannose Type and hybrid sugar chains can also be released. Therefore, the enzyme of the present invention can release a wide variety of asparagine-linked sugar chains.
  • the enzyme exhibits the activity of releasing glycoprotein sugar chains at pH 5-10.
  • the enzyme derived from the genus Lactobacillus and Prevoterra, or having at least 70% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or any one of these sequences, the enzyme The pH range showing is preferably pH 5.5-9.
  • the pH range in which the enzyme exhibits the above activity is preferably pH 6-9. Specific numerical values of pH are 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, and 10.
  • the enzyme exhibits the activity of releasing glycoprotein sugar chains at 20 to 40 ° C.
  • the temperature range at which the enzyme exhibits the above activity is preferably 30 to 38 ° C, more preferably 36 to 37 ° C. Specific temperature values are 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, and 40 ° C.
  • the glycoprotein is not particularly limited, and means any protein known to those skilled in the art.
  • the glycoprotein is preferably a glycoprotein in which a sugar chain is ⁇ -bonded to the amino group of asparagine in the protein portion (sometimes referred to as “N-linked type” in the art).
  • the N-linked glycoprotein has a diacetylchitobiose moiety (GlcNAc-GlcNAc) between the amino group of asparagine in the protein part of the glycoprotein and the sugar at the base of the sugar chain.
  • the root sugar means a sugar that binds to one of the two N-acetylglucosamines constituting the diacetylchitobiose moiety in the sugar chain.
  • glycoprotein is not particularly limited, but sugar chains derived from vertebrates including humans are preferable, and human-derived glycoproteins are more preferable. While not intending to be bound by any particular theory, it is believed that according to the method of the present invention, the sugar chain is released from the glycoprotein by cleaving the N-glycoside bond of this diacetylchitobiose moiety.
  • the structure and composition of the sugar chain of the glycoprotein is not particularly limited, and it is in the form of an unbranched sugar chain, or a double chain, a triple chain, a four chain, or 5 as known to those skilled in the art. It means a sugar chain that is in the form of a complex branched into a main chain, or in the form of a high mannose or hybrid type.
  • the high mannose type sugar chain is composed of mannose and N-acetylglucosamine, and the portion called a side chain is composed of only mannose.
  • the hybrid sugar chain is composed of N-acetylglucosamine, galactose, N-acetylneuraminic acid, fucose, as in the complex type in the side chain, and mannose like the high mannose sugar chain. Both of which consist only of.
  • the “side chain” of an asparagine-linked sugar chain is an oligosaccharide that binds to ⁇ 1-4 linked mannose and ⁇ 1-6 linked mannose of the trimannosyl core in the common pentasaccharide matrix of the asparagine linked sugar chain. The chain part.
  • the sugar chain is preferably generally referred to as an asparagine-linked sugar chain, and an N-linked sugar in which the sugar at the root is ⁇ -bonded to the amino group of asparagine in the protein part via a diacetylchitobiose moiety. It constitutes the sugar chain part of the protein.
  • the sugar chain is more preferably in the form of a complex of a double chain, a triple chain, a four chain, or a five chain branch.
  • the sugar constituting the sugar chain is not particularly limited, and is any sugar known to those skilled in the art. Specific examples include glucose, galactose, mannose, fucose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylneuraminic acid, and xylose.
  • the glycoprotein may further have fucose between the sugar at the base of the sugar chain part and the diacetylchitobiose part.
  • this fucose is also referred to as “core fucose”.
  • the enzyme of the present invention can also release sugar chains from glycoproteins or glycopeptides or sugar asparagine having core fucose.
  • the glycoprotein may optionally have sialic acid at the terminal part opposite to the base of the sugar chain part (hereinafter referred to as “terminal side”).
  • the enzyme of the present invention can cleave the diacetylchitobiose portion of a glycoprotein and release a sugar chain having sialic acid bonded to the terminal side from the glycoprotein.
  • Specific examples of the glycoprotein as described above include human transferrin, human lactoferrin, bovine fetuin, and human ⁇ 1 acidic glycoprotein.
  • the enzyme of the present invention exhibits an activity of transferring a sugar chain released from a glycoprotein to a sugar chain receptor when it is brought into contact with the glycoprotein in the presence of the sugar chain receptor.
  • a sugar chain receptor is not particularly limited as long as it is a compound that can become a sugar chain receptor in glycoside synthesis (for example, sugars, proteins, etc.), but physiologically active substances such as salicin, arbutin, and linamarin; glucose Monosaccharides such as (Glc) and galactose (Gal); disaccharides such as sucrose, lactose and maltose; oligosaccharides such as maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose; mannitol, myo -Sugar alcohols such as inositol, sorbitol, xylitol, maltitol and maltotriitol;
  • the enzyme of the present invention is Culturing host cells transformed with a recombinant vector containing a gene encoding the enzyme to obtain a culture; By purifying the obtained culture, it can be produced by the method for producing an enzyme of the present invention including the step of obtaining the enzyme.
  • the above gene has a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17 respectively), or any of the above amino acid sequences
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of region 1 above, the base sequence encoding the amino acid sequence of region 2, the base sequence encoding the amino acid sequence of region 3 and the amino acid sequence of region 4 are encoded. It preferably includes at least one base sequence selected from the group consisting of base sequences.
  • base sequences having homology with SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17 include the base sequences of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18, respectively.
  • Recombinant vectors can be prepared by restriction enzyme treatment and ligation treatment according to procedures known to those skilled in the art, using primers prepared based on the nucleotide sequences of DNA fragments containing the above genes and vectors known to those skilled in the art. it can.
  • the vector is not particularly limited as long as it can function as a cell expression system that expresses a desired protein by introduction into a host cell, and can be selected from vectors known to those skilled in the art. Specific examples include plasmids derived from E. coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, YCp type E. coli-yeast shuttle vector, YIp type E. coli-yeast shuttle vector, E. coli-B. Subtilis shuttle vector, phage vector, retrotransposon, fusion protein Examples include expression vectors to be expressed.
  • the vector is preferably pET23a, pET21a, pET-50b (+) or pET-50a (+).
  • the promoter contained in the above vector is not particularly limited, and can be selected from those known to those skilled in the art according to the type of host cell described below. Specific examples include lac promoter, trp promoter, tac promoter, PL promoter, T7 promoter, and the like.
  • the promoter is preferably a T7 promoter.
  • the recombinant vector may functionally contain other factors such as a selectable marker gene, terminator, and enhancer. Other factors are not particularly limited, and can be selected from those known to those skilled in the art based on the properties of the recombinant vector and the host cell.
  • a recombinant vector can be prepared, for example, by ligating a DNA fragment containing a gene encoding the enzyme of the present invention to a plasmid vector previously digested with an appropriate restriction enzyme.
  • the ligation method is not particularly limited, and can be performed according to any method known to those skilled in the art. Specific examples include a method using a DNA ligase such as Ligation High (Takara Bio).
  • the host cell is not particularly limited, and cells known to those skilled in the art can be used. Specific examples include cells such as E. coli and yeast.
  • the host cell is a BL21 E. coli cell (for example, E. coli BL21DE3, BL21DE3 strain OrigamiDE3, BL21DE strain RosettaDE3 and BL21 Rosetta II) and DH5 ⁇ .
  • a recombinant vector containing the enzyme of the present invention as it is is introduced into a host cell, it may not be sufficient to obtain an enzyme expression level and sugar chain releasing activity to the extent that mass production is possible.
  • the present inventor removes the transmembrane region of a part of the enzyme of the present invention, and then creates a recombinant vector as described above and introduces it into a host cell, thereby obtaining a sufficient enzyme expression level and sugar chain. It has been found that free activity can be obtained.
  • the transmembrane region of the enzyme of the present invention is removed from the viewpoint of improving the solubility of the enzyme and maintaining an appropriate three-dimensional structure.
  • SPLIT 4.0 SERVER membrane protein secondary structure prediction online analysis software (Membrane Protein Secondary Structure Prediction Server; http: / The position of the transmembrane region predicted using /split4.pmfst.hr/split/4/) is shown.
  • Table 2 The removal of the regions shown in Table 2 can be performed according to a method known to those skilled in the art, such as a PCR method based on the above sequence.
  • Table 3 shows the approximate average molecular weight of each endo-HS when the above regions are removed.
  • the enzyme of the present invention can be purified from a microorganism selected from the genus Lactobacillus and Prebotella, or a culture of the host cell transformed as described above, a culture supernatant, or a processed product of the culture.
  • Culture and treatment can be performed as described below. Purification is not particularly limited and can be performed according to any method known to those skilled in the art. Specific examples include salting out with ammonium sulfate, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, purification using column chromatography such as hydrophobic chromatography, and the like.
  • the sugar chain can be released from the glycoprotein by bringing the enzyme of the present invention into contact with a sample containing the glycoprotein.
  • the sample containing glycoprotein is not particularly limited as long as it contains the glycoprotein defined above.
  • the time for contacting the enzyme and the sample containing glycoprotein is 0.5 to 72 hours, preferably 0.5 to 2 hours, and more preferably 0.5 to 1 hour. Specific numerical values of the contact time are 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 24, 36, 48, 60, 72 hours.
  • the temperature at the time of contact is 20 to 40 ° C., preferably 30 to 38 ° C., more preferably 36 to 37 ° C. Specific numerical values of the temperature at the time of contact are 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, and 40 ° C.
  • the enzyme is from the genus Lactobacillus and Prevotera or has at least 70% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or any one of these sequences Is from 5 to 10, preferably from pH 5.5 to 9. Specific numerical values of pH at the time of contact are 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, and 10.
  • the pH upon contact is 5-10, preferably 6 ⁇ 9. Specific numerical values of pH at the time of contact are 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, and 10.
  • the sugar chain released by the contacting step may be isolated or purified according to any method known to those skilled in the art.
  • Specific examples of the isolation or purification method include column chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, normal phase chromatography, and thin layer chromatography.
  • the method for releasing a sugar chain of the present invention comprises culturing the above-mentioned microorganism or the host cell transformed as described above, and the resulting culture or a processed product thereof and sugar.
  • the sugar chain of the glycoprotein can be released by contacting with a sample containing the protein.
  • the first step of the sugar chain releasing method according to the second aspect is a step of culturing the microorganism or the host cell transformed as described above.
  • the culture of the microorganism or the host cell transformed as described above is not particularly limited, and can be performed using any culture method known to those skilled in the art. Specific examples include culture processes such as fed-batch culture, batch culture, repeated batch culture, continuous culture (eg, chemostat or turbidostat), semi-continuous culture, and combinations thereof.
  • the culture conditions can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of various factors such as the type of microorganism or host cell, the bioreactor used, and the like.
  • the bioreactor is not particularly limited, and can be selected from those known to those skilled in the art based on the type of microorganism or host cell. Specific examples include a bubble column type culture tank and an aeration and stirring culture tank.
  • the medium is not particularly limited as long as it is suitable for culturing microorganisms or host cells used in the sugar chain releasing method of the present invention, and can be selected from those known to those skilled in the art.
  • Specific examples include semi-synthetic media, i.e. media containing complex compounds (e.g. yeast extract, soy peptone, casamino acid) (e.g. LB media), chemically defined substances not containing complex compounds (e.g. A synthetic medium (for example, Davis medium) composed of a substance capable of calculating the molecular weight based on the weight of glucose, salt (NaCl) and the like, and a natural medium.
  • the supply amount of the medium can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of various factors such as the type of microorganism or host cell, the bioreactor used, and the culture time.
  • the culture time is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the culture time is preferably 72 to 120 hours, more preferably 85 to 96 hours. Specific values for the culture time are 72, 80, 85, 90, 93, 96, 100, 105, 110, 115, and 120 hours.
  • the culture temperature is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the culture temperature is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 36 to 37 ° C. Specific numerical values for the culture temperature are 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, and 40 ° C.
  • the culture obtained as described above may be subjected to further treatment to be a treated product of the culture.
  • the treatment of the culture is not particularly limited, and known treatment methods including solubilization, culture supernatant separation, purification, and drying can be selected or combined by those skilled in the art as necessary.
  • the culture treatment can be performed, for example, as follows.
  • the culture supernatant is separated from the culture.
  • the separation method is not particularly limited, and any method known to those skilled in the art can be used. Specific examples include filter filtration and centrifugation.
  • the microorganism or host cell may optionally be solubilized according to any method known to those skilled in the art, such as a method using a surfactant.
  • contaminants such as medium components can be removed by any known method such as dialysis, and then a processed product of the culture or culture supernatant can be obtained by any known method such as lyophilization.
  • the second step of the sugar chain releasing method of the present invention is a step of bringing the culture obtained as described above or a processed product thereof into contact with a sample containing glycoprotein.
  • the sample containing glycoprotein is not particularly limited as long as it contains the glycoprotein defined above.
  • the time for contacting the culture or its processed product with the sample containing glycoprotein is 0.5 to 72 hours, preferably 0.5 to 2 hours, more preferably 0.5 to 1 hour. Specific numerical values of the contact time are 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 24, 36, 48, 60, 72 hours.
  • the temperature at the time of contact is 20 to 40 ° C., preferably 30 to 38 ° C., more preferably 36 to 37 ° C. Specific numerical values of the temperature at the time of contact are 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, and 40 ° C.
  • the enzyme is from the genus Lactobacillus and Prevotera or has at least 70% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or any one of these sequences Is from 5 to 10, preferably from pH 5.5 to 9. Specific numerical values of pH at the time of contact are 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, and 10.
  • the pH upon contact is 5-10, preferably 6 ⁇ 9. Specific numerical values of pH at the time of contact are 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, and 10.
  • the sugar chain released by the contacting step may be isolated or purified according to any method known to those skilled in the art.
  • Specific examples of the isolation or purification method include column chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, normal phase chromatography, and thin layer chromatography.
  • the sugar chain released from the glycoprotein is transferred to the sugar chain receptor by bringing the enzyme of the present invention into contact with the glycoprotein in the presence of the sugar chain receptor.
  • the sugar chain transfer method of the present invention can be performed in the same manner as the sugar chain releasing method of the present invention according to the first aspect, except that the method is performed in the presence of a sugar chain receptor.
  • the sugar chain acceptor is preferably in the form of a solution or suspension or dispersion dissolved or suspended or dispersed in an aqueous solvent, more preferably water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, and a mixture thereof with water. It is in.
  • the lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms is not particularly limited as long as it can dissolve, suspend or disperse the sugar chain acceptor, but methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol and 2- Examples include butanol.
  • the sugar chain acceptor is a mixture of the above lower alcohol and water, the mixing ratio can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the concentration of the sugar chain receptor in the solution is preferably 60 to 500 mM, more preferably 100 to 400 mM, and still more preferably 200 to 300 mM. Specific numerical values of the sugar chain receptor concentration are 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, and 400 mM.
  • the weight of the sugar chain receptor with respect to 100 mL of the suspension or dispersion is preferably 1,080 to 9,000 mg, more preferably 1,800 to 7,200 mg, still more preferably. Is 3,600-5,400 mg.
  • Specific numerical values of the weight of the sugar chain receptor include 1,080, 1,440, 1,800, 2,160, 2,520, 2,880, 3,240, 3,600, 3,960, 4,320, 4,680, 5,040, 5,400, 5,760, 6,120, 6,480, 6,840, 7,200, 7,560, 7,920, 8,280, 8,640, 9,000 mg.
  • the glycoprotein is sometimes referred to as “sugar chain donor”.
  • the concentration of the sugar chain donor is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the concentration of the sugar chain donor is preferably 150 to 300 ⁇ M, more preferably 200 to 250 ⁇ M. Specific concentrations of the sugar chain donor are 150, 180, 200, 230, 250, 270, and 300 ⁇ M.
  • Example 1 Cloning of Endo HS ⁇ 2 from Human Saliva Sample Human saliva collected from a healthy person (male, 22 years old) was centrifuged, and the resulting precipitate was suspended in 10 mM Tris-HCl, pH 7.2. The resulting suspension was mixed with CHAPS with a final concentration of 2%, shaken at 20 ° C. for 1 hour, solubilized with the enzyme contained in the suspension, and ultracentrifuge (Hitachi Koki, CP60E, P50AT) The resulting supernatant was used as a solubilized enzyme solution.
  • HTF human transferrin
  • Sigma a human transferrin (HTF) (Sigma) solution (0.2 mg / ml 0.2 M Na, K-phosphate buffer pH 6.2) as a substrate was added and incubated at 37 ° C.
  • the reaction was stopped by adding 10 ⁇ l of SDS-PAGE sample buffer, followed by incubation at 95 ° C. for 3 minutes.
  • the total amount of the reaction solution was subjected to SDS-PAGE using 7.5% separation gel. After electrophoresis, the gel was shaken for 5 minutes in the fixative, then stained with CBB and decolorized.
  • the amount of the HTF band that had lost the sugar chain and had a low molecular weight and the amount of the unreacted band were quantified using a print graph (ato), and the reaction product was calculated.
  • the amount of enzyme that liberates sugar chains from 1 ⁇ g of HTF per minute under the same conditions was defined as 1 unit.
  • electrophoresis was performed using the active fraction obtained as described above. As a result, it was considered that the active fraction contained endoHS alone (data not shown).
  • a partial amino acid sequence of an enzyme contained in the obtained active fraction was identified, and a plurality of base sequences of genes encoding endoHS contained in human saliva were identified using a metagenomic method (SEQ ID NOs: 13, 14, 15). 16, 17, 18).
  • PCR was performed using the metagenome contained in human saliva as a template, and a DNA fragment containing the gene encoding SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO: 13) was amplified, ligated to the pT7 Blue vector, and introduced into NovaBlue Singles Competent Cell.
  • Example 2 Construction of endo-HS ⁇ 2 expression system Plasmid DNA was extracted from the cells obtained as described above, PCR was performed using it as a template, 50 ⁇ l of the PCR reaction solution was transferred to a 1.5 ml tube, and 50 ⁇ l of sterile water was added. And phenol: chloroform: isopropanol 25: 24: 1 (Sigma) 100 ⁇ l was added, mixed, and centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes at room temperature (Kokusan, H-1300). The upper phase was transferred to another 1.5 ml tube, subjected to ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in 10 ⁇ l of sterilized water.
  • the DNA solution thus obtained was subjected to restriction enzyme treatment with Bam HI (TaKaRa) and Sal I (Fermentas).
  • pET-50b (+) (TaKaRa), which is an expression vector, was subjected to restriction enzyme treatment with Bam HI and Sal I.
  • Ligation high Toyobo
  • ligation of 3103 bp PCR product and linear pET-50b (+) was introduced into E.coli DH5 ⁇ and LB containing 0.01% Kanamycin
  • the cells were seeded on an agar medium (1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, 2% Agar, pH 7.0) and cultured overnight at 37 ° C.
  • the mixture was ice-cooled for 5 minutes, incubated in a constant temperature bath at 42 ° C. for 30 seconds, and then ice-cooled for 2 minutes.
  • Cultured cells were glycerol stock (stock A) at -70 ° C.
  • Example 3 Purification of Endo HS ⁇ 2 Using a toothpick from stock A, transfer to 15 ml of LB liquid medium (1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, pH 7.0) containing 0.01% Kanamycin at 180 ° C. at 37 ° C. Overnight shaking culture was performed. 2 ml of the culture was transferred to each of five Sakaguchi flasks containing 200 ml of LB liquid medium containing 0.01% Kanamycin, and cultured at 37 ° C. and 140 rpm until the OD 600 value reached 0.4.
  • LB liquid medium 1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, pH 7.0
  • the obtained supernatant fraction was Co 2+ Profinity IMAC Resin column (0.3% CHAPS, 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole, 10 mM Na, K-phosphate buffer, pH 7.5) buffered with Co 2+ Profinity IMAC Resin column ( and stepwise elution (25 ml each) with 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM and 500 mM imidazole at a flow rate of 1 ml / min.
  • the enzyme activity was measured in the same manner as in Example 1. As a result, about 80% (30000 U) of the enzyme was adsorbed on the column and almost eluted with 0.1 M imidazole. Therefore, the eluted fraction was collected.
  • the flow-through fraction (6000 U) was again loaded onto a Co 2+ Profinity IMAC Resin column and eluted with 200 mM imidazole (25 ml) at a flow rate of 1 ml / min.
  • the resulting elution fraction (700 U) was combined with the elution fraction collected above.
  • Elution was performed with a linear concentration gradient of 0-0.4 M NaCl, and fractionated every 0.5 ml at a flow rate of 0.5 ml / min. As a result, the enzyme activity was divided into a plurality of peaks. 10 ⁇ l of each fraction was subjected to SDS-PAGE, and fractions in which a protein corresponding to a molecular weight of 170.4 ⁇ k was detected were collected and used as an enzyme solution.
  • the His tag region fused to the expressed protein was removed using HRV 3C Protease (Novagen).
  • HRV 3C Protease Novagen
  • 640 ⁇ l of the reaction solution was buffered with a column buffer (0.3% CHAPS, 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole, 10 mM Na, K-phosphate buffer, pH 7.5).
  • a Co 2+ Profinity IMAC Resin column ( ⁇ 1.5 ⁇ 2.8 cm) was loaded, washed with 30 ml of column buffer at a flow rate of 1 ml / min, and fractionated in 5 ml portions to obtain active fractions.
  • the NaCl concentration of the obtained active fraction was adjusted to about 2 mM. This was reduced to about 1.25 ml by ultrafiltration, and this was HPLC (MILLIPORE) using a Mono Q column (1 ml bed volume) buffered with 10 mm mM Na, K-phosphate buffer, pH 7.5 containing 0.3% CHAPS. Waters 600E Multisolvent Delivery System). Elution was performed with a linear concentration gradient of 0-0.4 M NaCl, and fractionated every 0.5 ml at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • endo HS ⁇ 2 was considered to act specifically on glycoproteins having complex type sugar chains and not on those having high mannose type or hybrid type sugar chains.
  • Example 4 Expression and purification of His-tagged recombinant endo-HS ⁇ 2 using 10 ⁇ M IPTG (culture of E. coli)
  • Cells from stock A were transferred to 2 ml of kanamycin-added liquid medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract, 0.1 mg / ml kanamycin, pH 7.0) and shaken at 37 ° C at 180 rpm for 1 hour Culture was performed. 20 ⁇ l of this culture solution was transferred to a Sakaguchi flask containing 200 ml of kanamycin-added liquid medium, and cultured at 37 ° C. and 180 rpm until the OD 600 value was around 0.45.
  • kanamycin-added liquid medium 1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract, 0.1 mg / ml kanamycin, pH 7.0
  • Ni 2+ Profinity IMAC Resin column ( ⁇ 1.5 x 2.8 cm) buffered with column buffer (0.3% CHAPS, 0.3M NaCl, 10 mM imidazole, 50 mM Na, K-phosphate buffer, pH 7.5) And subjected to chromatography (flow rate 1 ml / min) to collect the flow-through fractions.
  • Example 5 Construction of recombinant endo-HS ⁇ 2 expression system A product obtained by removing the tag region and the transmembrane region from the plasmid obtained from the stock A-derived cells by inverse PCR was prepared.
  • the primers used were the following primer HS ⁇ 2 TM deletion F and primer pET-50b (+) 1R (Table 4).
  • reagents contained in the KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) were used.
  • Example 6 Expression of recombinant endo-HS ⁇ 2 using 10 ⁇ M IPTG and purification thereof (culture of E. coli to column chromatography) Cells from stock B were cultured in the same manner as above to obtain cell pellets, and then the crude enzyme was changed in the same manner as above except that the composition of the cold Lysis Buffer was changed to 50 mM potassium phosphate and 10% glycerol. 80 ml fractions were obtained. 1N sodium hydroxide was added to the resulting crude enzyme solution to adjust the pH to around 9.0.
  • Example 7 Sugar chain releasing activity of recombinant endo-HS ⁇ 2 (removal of CHAPS) 2 ml of the purified recombinant endo-HS ⁇ 2 solution obtained as described above was placed in a dialysis tube and dialyzed against 10 mM Na, K-phosphate buffer pH 6.8 200 ml for 4 hours. Similar dialysis was performed four more times.
  • HTF human lactoferrin
  • bovine fetuin Takara Bio
  • human ⁇ 1-acid glycoprotein ⁇ 1-AG, Sigma
  • sheep IgG Sigma
  • ovalbumin OVA, Taiyo Kagaku
  • RNaseB solution both 0.5 mg / ml 0.1M Na, K-phosphate buffer, pH 6.8 was used.
  • a mixture of these substrate solutions (10 ⁇ l) and enzyme solution (1 ⁇ l (4,150 U / ml)) was incubated at 37 ° C. for 0 minutes, 30 minutes, 2 hours and 20 hours, and SDS-PAGE sample buffer (11 ⁇ l) was added to react. Stopped. The total amount of each reaction solution was subjected to SDS-PAGE.
  • endo HS ⁇ 2 acts specifically on glycoproteins having a complex type sugar chain, similarly to endo HS, and does not act on glycoproteins having a high mannose type or a hybrid type sugar chain.
  • Example 8 Transglycosylation activity of recombinant endoHS ⁇ 2
  • the transglycosylation effect of recombinantly expressed endoHS ⁇ 2 (377 U / ml) was examined.
  • the sugar chain asparagine (HTF Asn CHO (2-C), 3.72 mM 0.75 mM) prepared from human transferrin was used as a sugar chain donor, and 1 M glucose (Glc), galactose (Gal) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) was used as a sugar chain receptor (Table 6).
  • a solution obtained by adding 1.25 ⁇ l of 1 M sugar chain receptor, 0.25 ⁇ l of sterilized water, and 0.5 ⁇ l of enzyme solution to 0.5 ⁇ l of HTF-Asn-CHO solution was incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • the orcinol-sulfuric acid mixed solution was sprayed, and the reaction product was colored by heating at 110 ° C. for 15 minutes.
  • Example 9 Crystallization of recombinant endo-HS ⁇ 2 (culture of E. coli) Cells derived from Stock B were transferred to 2 ml of kanamycin-added liquid medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract, 0.1 mg / ml kanamycin, pH 7.0), followed by shaking culture at 37 ° C for 1 hour at 180 rpm It was. 20 ⁇ l of this culture solution was transferred to a Sakaguchi flask containing 200 ml of a kanamycin-added liquid medium, and cultured with shaking at 37 ° C. and 180 rpm for 18 hours.
  • kanamycin-added liquid medium 1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract, 0.1 mg / ml kanamycin, pH 7.0
  • the obtained bacterial cell pellet was lysed by the following method, and the expressed protein was extracted. That is, the bacterial cell pellet derived from 2.2 L of the medium was divided into four equal parts, and each of them was cooled with 45 ml of cold Lysis Buffer (10 mM Na, K-phosphate buffer pH 6.5 containing 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 2 ⁇ M E-64). ), Suspended, frozen at ⁇ 70 ° C., and thawed at room temperature. Then, using Sonifier 250 (Branson), ultrasonic treatment for 30 seconds was performed 6 times with Out put control 2, Duty cycle constant while keeping the temperature low, and the expressed protein was extracted from the cells. The obtained extract solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., the supernatant was transferred to a flask, and 180 ml obtained was used as a crude enzyme fraction.
  • Cold Lysis Buffer 10 mM Na, K-phosphate buffer pH 6.5
  • Ammonium sulfate fraction Ammonium sulfate fraction was added to the crude enzyme fraction while maintaining a low temperature so as to be 40% saturation. After degassing, the mixture was placed at 4 ° C. for 4 hours, centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and then ammonium sulfate was added to the supernatant fraction while maintaining a low temperature so as to be 70% saturation. After deaeration, the mixture was again placed at 4 ° C. for 4 hours, and then centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a precipitate fraction.
  • This precipitate fraction was suspended in 10 mM Na, K-phosphate buffer, pH 6.5 containing 25% ammonium sulfate, centrifuged again at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the resulting supernatant fraction 24 ml was used as the ammonium sulfate fraction.
  • the above fraction was dialyzed against 2 L of 10 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM EDTA, pH 8.4, and the external solution was exchanged four times to lower the ammonium sulfate concentration.
  • the resulting dialyzed internal solution was loaded onto a DEAE-Toyopearl® 650S column ( ⁇ 0.9 ⁇ 7.4 cm) buffered with 10 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM EDTA and pH 8.4. After passing 20 ml of the same buffer through the column, linear concentration gradient elution (100 ml to 100 ml) of 0 to 0.3 mm NaCl was performed to obtain an active fraction.
  • the enzyme solution was concentrated using an ultrafilter, and the Toyopearl HW-55F ( ⁇ 1.6 x 84) buffered with 10 mM Na, K-phosphate buffer solution pH 6.5 containing 5 mM EDTA and 0.15 M NaCl. cm) and chromatographed at a flow rate of 15 ml / min. A part of the obtained active fraction was collected to obtain a purified enzyme solution. A part of the active fraction was collected and used as an enzyme preparation.
  • the enzyme solution was concentrated using an ultrafilter, and this was buffered with 10 mM Na, K-phosphate buffer pH 6.5 containing 5 MM EDTA and 0.15 M NaCl, and a Sephacryl S-200HR ( ⁇ 2.2 x 73 cm ) And chromatography at a flow rate of 15 ml / min.
  • the obtained active fractions were collected and combined with the above purified enzyme solution to obtain a purified enzyme preparation.
  • the enzyme solution was concentrated to about 10 ml or less using an ultrafilter, 50 ml of 10 mM Na, K-phosphate buffer pH 6.5 containing 0.1 M NaCl was added, and the mixture was again concentrated to 10 ml or less. This operation was further performed twice to replace the buffer solution, and then concentrated using an ultrafilter so that A 280 was about 10. As a result of removing the precipitate by centrifugation, A 280 was 9.87.
  • the protein was quantified by measuring the absorbance at 280 nm of the protein solution, assuming that the value of E 1% 280 is 10. The specific activity was expressed as the enzyme unit (U / ml) divided by the protein concentration (mg / ml). The obtained concentrated solution was subjected to the following crystallization.
  • Crystallization was performed using a hanging drop vapor diffusion method. That is, high vacuum grease (Toray Dow Coating) was thinly applied to the jar of a sample cup (Sampletec, 9-A, 0.5 ml), and 100 ⁇ l of a crystallization agent was added. Cover glass (Matsunami glass, 18 ⁇ 18 mm) was placed in a 0.5% aqueous solution of silicon (Auqasil, Thermo Scientific), washed with distilled water, sealed, and then coated with silicon. After mixing 2 ⁇ l of the enzyme solution and 2 ⁇ l of the crystallization agent obtained from the sample cup on a silicon-coated cover glass, the cover glass was turned over and covered with the sample cup, and sealed. The crystallization was performed at 20 ° C.
  • Crystallization using Crystal Screen HT Crystallization was performed using Crystal Screen HT (Hampton Research) No. 15 (0.1 M sodium cacodylate trihydrate pH 6.5 and 10% w / v polyethylene glycol 8,000) as the crystallization agent using the above basic conditions. As a result, cubic crystals were obtained (FIG. 4).
  • Example 10 Identification of Microorganism
  • the present inventor conducted the following experiment in order to identify the microbial species producing the enzyme of the present invention.
  • human transferrin Sigma
  • epithelial cells that peel in human saliva and urine and 1000 strains of cells were isolated from the tissue of blood cells.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Prevotella melaninogenica strain available as ATCC 25845 also exhibits sugar chain releasing activity.
  • Prebotella melaninogenica cultured with 5 microliters of human transferrin solution manufactured by Sigma dissolved in 0.2 M phosphate buffer solution, pH 6.5 to 0.2 mg / ml
  • GAM culture solution 5 microliters of ultracentrifugation supernatant solubilized with 1% sarkosyl, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 24 hours, and 10 microliters of SDS-polyacrylamide gel sample buffer was used. In addition, the reaction was stopped.
  • Example 11 Cultivation of microorganisms Three strains of Lactobacillus fermentum, Prevotella vibia, and Prevotella melaninogenica identified as described above were respectively added to GAM bouillon liquid medium (GAM bouillon “Nissui”, peptone in 1 liter).
  • the obtained 2000 mL culture solution was named culture LB, culture PB, and culture PM, respectively.
  • Example 12 Sugar chain releasing activity of Lactobacillus fermentum culture
  • Sugar chain PAES-Asn-OVA-GP-V [2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamilic acid 5-norbornene-2, 3-dicarboximide Ester OVA-GP-V
  • ovalbumin obtained from Taiyo Kagaku
  • pronase E Korean Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the solution was loaded onto Sephadex G-25 and G-50 columns to separate the peptide fraction and the sugar asparagine fraction.
  • the obtained glycopeptide fraction was loaded onto a Dowex50W-X2 column, and the sugar asparagine was separated into five fractions.
  • the respective fractions were designated as OVA-GP-I, OVA-GP-II, OVA-GP-III, OVA-GP-IV, and OVA-GP-V.
  • OVA-GP-V was mixed with [2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamilic acid 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester (PAES) aqueous solution, and at a pH of 9 at 37 ° C. for 3 hours in the dark. The reaction was carried out.
  • reaction solution was subjected to Sephadex G-25 column chromatography to separate OVA-GP-V bound to PAES. Then, PAES-Asn-OVA-GP-V (FIG. 5B, lane 1) as a negative control, PAES-Asn-OVA-GP-V and endo FV reaction product (lane 2) as a positive control, Reaction product of the culture supernatant of glycan PAES-Asn-OVA-GP-V and culture LF obtained in this way (lane 3), and glycan PAES-Asn-OVA-GP-V and culture LF
  • the reaction product (lane 4) of the suspension was subjected to thin layer chromatography to examine whether sugar chains were released from glycoproteins.
  • endo FV is endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase of Flamulina velutipes (Enokitake).
  • FIG. 5B From FIG. 5B, it was shown that in both cases where the culture supernatant was used and when the cell suspension was used, they had sugar chain releasing activity that hydrolyzes between the sugar chain chitobiose. From these results, it was strongly suggested that the Lactobacillus fermentum strain of the present invention produces cell-bound and secreted endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • Example 13 Sugar chain releasing activity of culture LF on human transferrin
  • Culture supernatant or culture of 5 ⁇ L human transferrin solution manufactured by Sigma, dissolved in 0.2 M phosphate buffer solution, pH 6.5 to 0.2 mg / ml
  • culture LF of Lactobacillus fermentum 5 microliters of the cell suspension was mixed and reacted at 37 ° C. for 0, 0.5, 2, 4 and 24 hours, and 10 microliters of SDS-polyacrylamide gel sample buffer was added to stop the reaction. After the reaction solution stop solution was heated at 95 ° C.
  • Example 14 Sugar chain releasing activity of culture LF on human ⁇ 1-acid glycoprotein Furthermore, the effect of culture LF on human ⁇ 1-acid glycoprotein was examined. 5 ⁇ l of human ⁇ 1-acid glycoprotein solution (manufactured by Sigma) dissolved in 0.2 M phosphate buffer, pH 6.5, and 0.5 mg / ml and the culture supernatant or suspension of cultured cells of Lactobacillus fermentum 5 microliters of the solution was mixed and reacted at 37 ° C. for 0, 0.5, 2, 4 and 24 hours, and 10 microliters of SDS-polyacrylamide gel sample buffer was added to stop the reaction. Then, after heating at 95 ° C.
  • Example 15 Sugar chain releasing activity of Prevotella vibia culture on human transferrin The effect of the culture PB on human transferrin was examined. 5 microliters of human transferrin solution (manufactured by Sigma) dissolved in 0.2M phosphate buffer, pH 6.5 and adjusted to 0.2mg / ml, and centrifuged on 1% sarkosyl from cultured cells of Prevotella vibia A solution in which the concentration is increased by 2 times (Enzyme concentration is 1 time, 2 times, 4 times, 8 times, 16 times, 32 times, 64 times, 128 times, 0 means no enzyme) 5 micron Then, the reaction was carried out at 37 ° C.
  • Example 16 Sugar chain releasing activity of Prevoterra melaninogenica culture Fluorescently labeled human transferrin sugar asparagine of culture PM PAES-HTF Asn-CHO ([2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamilic acid 5-norbornene-2,3 -The action on dicarboximide ester HTF-Asn-CHO) was investigated.
  • Human transferrin purchased from Sigma
  • Pronase E Kerken Pharmaceutical
  • the reaction solutions were separated by Sephadex G-25 and G-50.
  • the peptide fraction was separated from the sugar asparagine fraction.
  • glycopeptide fraction was mixed with an aqueous solution of [2- (2-pyridylamino) ethyl] succinamic acid 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester (PAES), and at a pH of 9 at 37 ° C. for 3 hours in the dark.
  • PAES 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester
  • reaction product of fluorescently labeled sugar asparagine PAES-HTF Asn-CHO and culture PM precipitate, reaction product of PAES-HTF Asn-CHO and culture PM culture supernatant, and PAES-HTF Asn-CHO and culture PM The reaction product of the solubilized product was subjected to thin layer chromatography to examine whether or not the sugar chain was released from the glycoprotein. As a result, in any of the above reaction products, a spot appears at the same position as the mixture of PAES-HTF Asn-CHO and Endo HS as the positive target, not the mixture of PAES-HTF Asn-CHO and water as the negative control. (FIG. 9B).
  • reaction product contains PAES-Asn-GlcNAc produced by hydrolysis between the chitobiose of the sugar chain PAES-HTF Asn-CHO.
  • Prevotella melaninogenica strain of the present invention produced cell-bound and secreted endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • Example 17 Sugar chain releasing activity of cultured PM with respect to human transferrin
  • human transferrin solution SIGMA's 0.2M phosphate buffer solution at 0.2 mg / ml dissolved in pH 6.5
  • Prevotella melaninogenica cell suspension twice each Solutions with increased concentration (enzyme concentrations 1, 2, 4, and 8; 0 is no enzyme).
  • SIGMA's 0.2M phosphate buffer solution at 0.2 mg / ml dissolved in pH 6.5 Prevotella melaninogenica cell suspension twice each Solutions with increased concentration (enzyme concentrations 1, 2, 4, and 8; 0 is no enzyme).
  • Prevotella melaninogenica cell suspension twice each Solutions with increased concentration (enzyme concentrations 1, 2, 4, and 8; 0 is no enzyme).
  • SDS-polyacrylamide 10 microliters of sample buffer for gel electricity was added to stop the reaction.
  • Example 18 Sugar chain releasing activity of culture PM on human ⁇ 1-acid glycoprotein Further, the effect of culture PM on human ⁇ 1-acid glycoprotein was examined. 5 microliters of human ⁇ 1-acid glycoprotein solution (manufactured by Sigma) dissolved in 0.2M phosphate buffer, pH 6.5, and 0.5 mg / ml, and a suspension of cultured cells of Prevotella melaninogenica twice each Solutions with increased concentration (enzyme concentrations 1, 2, 4, and 8; 0 is no enzyme). Mix 5 microliters, react at 37 ° C for 24 hours, SDS-polyacrylamide 10 microliters of sample buffer for gel electricity was added to stop the reaction. Then, after heating at 95 ° C.
  • Example 19 Construction of Endo-PM ⁇ Expression System
  • the present inventor has endo- ⁇ -N- that specifically acts on complex-type sugar chains. Discovered and purified acetylglucosaminidase. And this was named endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase HS (End HS).
  • End HS endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase HS
  • the present inventors have cloned a plurality of genes considered to be endo HS gene homologs (see Example 1).
  • genes are divided into three groups, ⁇ , ⁇ and ⁇ , from the upstream, and they have a cluster structure in which these three genes are arranged in tandem on the genome. Homology analysis of the gene reveals that the gene structure is highly homologous to the gram-negative Prevotella melaninogenica gene and, like Endo HS, three groups of ⁇ , ⁇ and ⁇ have a cluster structure arranged in tandem. I have to.
  • the proteins corresponding to endo HS ⁇ , ⁇ and ⁇ possessed by P. melaninogenica were named endo PM ⁇ , ⁇ and ⁇ , respectively, and an endoPM ⁇ expression system using E. coli as a host was constructed according to methods known to those skilled in the art.
  • pET23a (+) was extracted from E. coli having the plasmid pET23a (+) using the miniprep alkaline method.
  • the extracted pET23a was digested with restriction enzymes BamHI and SalI.
  • Digested with BamHI and SalI The digested pET23a (+) and DNA fragment were ligated using Ligation High (Takara Bio) to obtain a recombinant vector.
  • the obtained recombinant vectors were respectively introduced into E. coli cells DH5 ⁇ .
  • the sugar chain releasing activity of the E. coli transformant was confirmed as follows. Add 5 l of enzyme solution to 5 ll of human transferrin (HTF) solution (0.2 mg / ml 0.2 M Na, K phosphate buffer, pH 6.2) as a substrate, incubate at 37 ° C, and add 10% SDS-PAGE sample treatment solution ⁇ l was added to stop the reaction. And after heat-processing at 95 degreeC for 3 minute (s), it used for SDS-PAGE using 7.5% polyacrylamide gel.
  • HTF human transferrin
  • the mixture was shaken in a fixing solution (50% 50 methanol, 10% acetic acid) for 15 minutes, stained with CBB (1.45% perchloric acid, 0.04% CBB R250), and then decolored to detect a band.
  • the band of HTF that had lost its sugar chain and reduced in molecular weight and the unreacted HTF band were quantified using a print graph (Atto Lane & Spot Analyzer 6.0), and the amount of reaction product was calculated.
  • the amount of enzyme that liberates sugar chains from 1 ⁇ g HTF per minute was defined as 1 unit.
  • Plasmid extraction from DH5 was performed using the miniprep alkaline method.
  • the transformed DH5 was transferred from a glycerol stock by toothpicking to 2 ml of LB liquid medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract) containing 0.1% ampicillin Na, and cultured at 37 ° C for 18 hours at 180 rpm . Transfer 1.5 ml of the culture solution to 1.5 ml tube, centrifuge at 13,000 rpm for 30 seconds at room temperature (Kokusan, H-1300), discard the supernatant, and dissolve the cells into Sol.
  • LB liquid medium 1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract
  • E. coli BL21 (DE3) (Novagen) for expression was transformed.
  • 2 ⁇ l of the plasmid extract collected from the transformed DH5 ⁇ prepared above by the miniprep alkaline method was added to the DH5 ⁇ suspension previously dispensed in a volume of 50 ⁇ l in a 1.5 ⁇ ml tube and mixed gently. The mixture was ice-cooled for 30 minutes, placed in a constant temperature bath at 42 ° C. for 30 seconds, and then ice-cooled for 2 minutes. To this, 450 ⁇ l of SOC medium that had been returned to room temperature was added, and after shaking at 180 ° C.
  • LB + ampicillin sodium agar medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract 0.1% ampicillin sodium, 2% Agarose) was seeded with 280 ⁇ l of the culture solution and cultured at 37 ° C. for 18 hours. Select 10 colonies from the resulting colonies, pick a portion of them with a toothpick, and transfer to 2 ml of LB + ampicillin sodium liquid medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract 0.1% ampicillin sodium), 37 °C And shaking culture was performed at 180 rpm for 16 hours. After culturing, 200 ⁇ l of 80% glycerol was added to 1 ml of the culture, mixed and stored at ⁇ 70 ° C.
  • Example 20 Purification of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase PM
  • the above Escherichia coli was transferred to 2 ml of a liquid medium (1% NaCl, 1% polypeptone, 0.5% dry yeast extract, 0.1% ampicillin sodium), and subjected to shaking culture at 37 ° C. and 180 rpm for 1.5 hours.
  • 20 ⁇ l of this culture solution was transferred to a Sakaguchi flask containing 200 ml of liquid medium, and cultured with shaking at 37 ° C. and 180 rpm for 18 hours.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 4 ° C. and 6,000 rpm for 10 minutes (Sakuma, 50A-7, 10B-N6). The supernatant was removed, and 200 ml of cold 10 mM Na, K phosphate buffer pH 6.5 was added thereto, suspended, and centrifuged at 4 ° C. and 6,000 rpm for 10 minutes (Sakuma, 50A-7, 10B-N6). The supernatant was removed to obtain a cell pellet. The bacterial cell pellet thus obtained was suspended in the same buffer and dispensed into 50 ml tubes so as to be divided into four equal parts. And after centrifuging, the obtained microbial cell was frozen.
  • the obtained extraction solution was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C (Sakuma, M201-IVD, 50F8A-E24L), the supernatant was transferred to a flask, and 86 ml obtained was used as a crude enzyme fraction. The enzyme was obtained. The fraction thus obtained was subjected to the following purification.
  • ammonium sulfate was added while maintaining a low temperature so as to be 30% saturated. After deaeration, the mixture was placed at 4 ° C. for 4 hours and then centrifuged at 4 ° C. at 12,000 rpm for 10 minutes (Sakuma, 50A-7, 6B-N8). Ammonium sulfate was added to the supernatant fraction while maintaining a low temperature so as to be 70% saturation. After deaeration, the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C., and then centrifuged at 4 ° C. and 10,000 ⁇ rpm for 10 minutes (Sakuma, 50A-7, 6B-N8) to obtain a precipitate fraction.
  • This precipitated fraction was dissolved in 10 mM Na containing 30% ammonium sulfate and 5 mM EDTA, K-phosphate buffer solution pH 6.5, and 141 mL of the obtained fraction was used as an ammonium sulfate fraction.
  • the obtained enzyme solution was loaded onto a Butyl-Toyopearl 650M column ( ⁇ 1.27x 9.4 cm) buffered with 10 mM Na, K-phosphate buffer, pH 6.5 containing 30% saturated ammonium sulfate and 5 mM EDTA. . After passing 50 ml of the same buffer through the column, elution with a linear concentration gradient of 30% to 0% (100 ml to 100 ml) was performed, and the eluate was fractionated in 5 ml portions. Two fractions showing activity were collected as A fraction and B fraction, respectively, to prepare enzyme solutions.
  • the enzyme solutions of the A and B fractions were dialyzed against 2 L of 10 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM EDTA, pH 8.5, and the external solution was exchanged three times to lower the ammonium sulfate concentration.
  • the obtained dialysis internal solution was loaded on a DEAE-Toyopearl 650S column ( ⁇ 0.9 ⁇ 7.4 cm) buffered with 10 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM EDTA, pH 8.5. After passing 80 ml of the same buffer through the column, linear concentration gradient elution (100 ml-100 ml) of 0 to 0.5 M NaCl was performed, and the eluate was fractionated in 5 ml portions.
  • the flow-through fractions derived from the A fraction and the B fraction from which the activity was detected were used as enzyme solutions of 102 ml (derived from the A fraction) and 94 ml (derived from the B fraction), respectively, and subjected to the following purification. .
  • the purified enzyme solution derived from the fraction A had a recovery rate of 5.87% and a specific activity of 24,400 ⁇ U / mg.
  • the purified enzyme solution derived from the B fraction had a recovery rate of 0.485% and a specific activity of 2,560 U / mg.
  • 10 ⁇ l of the purified enzyme preparation and 10 ⁇ l of SDS-PAGE sample treatment solution were mixed and incubated at 95 ° C. for 3 minutes. This was subjected to SDS-PAGE using a 12.5% gel.
  • the protein contained in the purified enzyme solution derived from the A fraction and the B fraction both show a single band at a position corresponding to a molecular weight of about 113,000, and both contain purified endoPM ⁇ . Was shown (FIG. 12).
  • Example 21 Properties of End PM ⁇ (1) Optimum pH Using the enzyme solution derived from the B fraction (1,630 U / ml), HTF (0.4 mg / ml) dissolved in distilled water was diluted with various 1 M buffers to give 0.2 mg / ml as the substrate solution. Reacted.
  • the buffer used at this time was acetate buffer pH 3.52, 4.01, 4.5, 5.0, 5.51, phosphate buffer pH 5.47, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, Tris-HCl pH 7.56, 8.03, 8.51, borate buffer
  • the liquid pH was 8.5, 9.0, 10.0.
  • the enzyme showed activity in a wide pH range, and the optimum pH of action was around 8.5 (FIG. 13).
  • glycoproteins used as substrates bovine RNase B (0.2 mg / ml), ovalbumin (OVA, 0.2 mg / ml), calf fetuin (0.5 mg / ml), human lactoferrin (Plant expression) (0.5 mg / ml) ), Bovine lactoferrin (BLF, 0.5 mg / ml), sheep IgG (0.5 mg / ml, SIGMA) and takaamylase (0.36 mg / ml) were dissolved in distilled water.
  • Human lactoferrin (HLF, 0.2 mg / ml) and human acidic glycoprotein ( ⁇ 1 -AG, 0.8 mg / ml) were dissolved in 10 mM Na, K-phosphate buffer, pH 6.7.
  • Human transferrin (HTF, 0.2 mg / ml) was dissolved in 0.2 M Na, K-phosphate buffer, pH 6.2.
  • B fraction (1,630 U / ml) was used as the enzyme solution. Dilute it 10-fold, 100-fold and 1,000-fold with 10 mM Na, K phosphate buffer pH 6.5 + 0.5% Triton X-100, take 5 ⁇ l of each and react with 5 ⁇ l of various glycoproteins for 1 hour. It was.
  • sugar chains were removed from BLF and sheep IgG, which had high-mannose and hybrid sugar chains as well as complex-type sugar chains, and a slightly low molecular weight protein band was generated.
  • bovine RNase B takaamylase with high mannose type sugar chain
  • OVA with high mannose type and hybrid type sugar chain
  • complex type sugar chain with xylose bonded to complex type sugar chain In HLF (Plant expression), the substrate band was not reduced in molecular weight and the sugar chain was not released.
  • Example 22 the present inventor conducted the following experiment in order to examine the influence of the protein having the sugar chain removed by the enzyme of the present invention on the proteolytic enzyme.
  • sugar chains were bound to two sites of human saliva ⁇ -amylase family C (HAS-C) (data not shown).
  • HAS-C human saliva ⁇ -amylase family C
  • HAS-C human saliva ⁇ -amylase family C
  • endo HS solution 1.5 units / ml
  • the enzyme of the present invention is expected to be applied to research activities and diagnosis of various human diseases.
  • functional materials that synthesize glycosides with biological recognition functions such as blood types, construct drug delivery systems, and capture infectious bacteria via sugar chains such as influenza viruses and bacteria It can be expected to be used for development.
  • modification of cell function, elimination of cancer cell metastasis or malignancy, and application to cell transplantation medicine can be expected.

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Abstract

　コンプレックス型糖鎖に作用し、糖タンパク質そのものから糖鎖を直接遊離させる活性を有する酵素を提供することを課題とする。　ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物に由来するか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素により上記課題を解決する。

Description

糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法
　本願は、日本国特許出願2012-255631号（出願日：2012年11月21日）および日本国特許出願2013-108153号（出願日：2013年5月22日）に基づく優先権を主張する。これらの日本国特許出願は、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
　本発明は、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法に関する。
　糖鎖は、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)に次ぐ第３のバイオポリマーと呼ばれる生体情報分子である。ヒトにおいて、糖鎖はブドウ糖などの約１０種類の単糖から構成される樹状分子であり、そのほとんどがタンパク質に結合した糖タンパク質および脂質に結合した糖脂質として存在する。糖鎖は、分泌タンパク質として体液中に存在するか、または膜タンパク質もしくは糖脂質として細胞表面を覆っていることが多い。
　最近の研究により、より多様な糖鎖の機能が明らかにされている。具体的には、糖鎖は、がん(転移、腫瘍マーカーなど)、免疫(免疫受容体調節、免疫細胞分化、抗体医薬など)、受精、発生・分化(再生医療など)、感染症(インフルエンザ、ピロリ菌、コレラ毒素など)などにおいて、重要な役割を果たすことが明らかとなっている。現在、糖鎖の構造および機能解析をすることにより、がんまたは免疫疾患の診断、予防または治療方法の開発、ドラッグデリバリーシステムの構築など、様々な分野への応用が期待されている。
　糖タンパク質に結合した糖鎖の構造および機能解析のためには、糖鎖を遊離することが必要である。
　特許文献１は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に結合するヒドラジド基を有する物質を用いて、糖タンパク質から糖鎖を遊離する方法を開示する。しかしながら、この方法では、タンパク質部分が分解されてしまう。また、遊離した糖鎖の構造が部分的に変化してしまう。
　糖鎖部分およびタンパク質部分のいずれも変化を受けずに糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法として、酵素を用いる方法も知られている。
　具体的には、アスパラギン結合型糖鎖を遊離する酵素で、世界的に利用されているエンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ(以下、単に「エンド」ともいう)として、ストレプトミセス・プリカツス(Streptomyces plicatus)由来のエンドＨが挙げられる。しかし、エンドＨは、酵母および糸状菌の糖タンパク質の糖鎖に特徴的なハイマンノース型およびハイブリッド型のアスパラギン結合型糖鎖に作用するが、ヒトなどの高等動物の糖タンパク質に特徴的なコンプレックス型糖鎖に作用しない。
　最近市販されるようになったムコア・ヒエマリス(Mucor hiemalis)由来のエンドＭは、エンドＨと同様に、ハイマンノース型およびハイブリッド型糖鎖によく作用する。エンドＭは、２本鎖コンプレックス型糖鎖に作用するその性質により、配糖体合成に利用されている。しかし、その作用は、ハイマンノース型に対する作用に比べて低い。また、糖鎖部分とジアセチルキトビオース部分との間にフコースを含む糖タンパク質の糖鎖および３～５本鎖分岐のコンプレックス型糖鎖には作用しにくい。さらに、糖鎖を遊離するためには、タンパク質部分を消化し、糖ペプチドまたは糖アスパラギンとすることが必要である。よって、このエンドＭを用いても、糖タンパク質そのものから糖鎖を直接遊離することは難しい。
特開2009-142238号公報
Transglycosylation of Asparagine-linked Complex-type Oligosaccharides from Glycoproteins by Endo-β-N-acetylglucosaminidase HS, J. Appl. Glycosci., 54, 139-146 Formation of Glycoisoforms of Human Salivary α-Amylase and Endo-β-N-Acetylglucosaminidase HS, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol. 18, No. 99, pp. 73-84
　上記のように、これらの酵素は、利用しやすいとは決していえない。このため、糖鎖部分とジアセチルキトビオース部分との間にフコースを含む糖鎖および３～５本鎖分岐のコンプレックス型糖鎖に作用し、糖タンパク質そのものから糖鎖を直接遊離させる活性を有する酵素が長らく望まれていた。
　このような背景から、本発明者は、過去に非特許文献１及び２に示されるような研究成果を報告している。非特許文献１及び２において、本発明者は、ヒト唾液中に含まれる成分が上記の作用および活性を有することを見出し、この成分が酵素である蓋然性が高いと考え、これをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHS(エンドHS)と命名した。
　今回、本発明者は、驚くべきことに、エンドHSが、口腔粘膜の上皮細胞に常在する菌に由来すること、ヒト唾液においてメタゲノム法を用いて、エンドHSが複数のアミノ酸配列で表される酵素群であること、特定の微生物が上記の作用および活性を有する酵素を産生することを見出して、本発明を完成するに至った。
　かくして、本発明によれば、ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物に由来するか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素が提供される。
　また、本発明は、上記の酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
　更に、本発明は、上記の酵素の製造方法、該組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、上記の酵素を用いる糖鎖の遊離方法、該細胞の培養物およびその処理物を提供する。
　本発明は、ヒトなどの脊椎動物を含む動物由来の糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を直接遊離することが可能な酵素およびその製造方法を提供することができるので、アスパラギン結合型糖鎖の構造および機能解析への応用が期待される。
エンドＨＳα２の発現および精製を示すデータである。図中、左レーンのバンドはエンドＨＳα２であり、右レーン(M)のバンドは分子量マーカーである。 本発明の酵素の糖鎖遊離活性を示すデータである。 本発明の酵素の糖鎖遊離活性を示すデータである。 本発明の酵素の糖鎖遊離活性を示すデータである。 本発明の酵素の糖鎖転移活性を示すデータである。図中、「H」は加水分解生成物、「T」は糖鎖転移反応生成物、「R」は残存糖鎖受容体を表す。 本発明の酵素の結晶の写真である。 実施例１２で用いた糖鎖の構造を示す図である。図中、「PAES」はN-[2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシンアミルであり、「Man」はマンノースであり、「GlcNAc」はN-アセチルグルコサミンであり、「Asn」はアスパラギンである。また、図中の矢印は、本発明の酵素が切断するβ1-4結合部位を表す。 実施例１２で行った薄層クロマトグラフィーのデータである。図中、レーン１は陰性対照としてのPAES-Asn-OVA-GP-V、レーン２は陽性対照としてのPAES-Asn-OVA-GP-VおよびエンドFV、レーン３はPAES-Asn-OVA-GP-Vおよび培養物ＬＦの培養上清、レーン４はPAES-Asn-OVA-GP-Vおよび培養物ＬＦの懸濁液をアプライした結果である。なお、「エンドFV」はフラムリナ・ヴェルティペス(Flamulina velutipes；エノキダケ)のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼである。 実施例１３で用いた糖鎖の構造を示す図である。図中、「Sia」は、シアル酸である。 実施例１３で行ったＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。図中、「Endo LF-f」は培養物ＬＦの培養上清であり、「Endo LF-b」は培養物ＬＦの懸濁液であり、「M」はマーカーである。 実施例１４で用いた糖鎖の構造を示す図である。図中、「(Sia)」は、シアル酸であり、各糖鎖の根元部分に示された短い太線はコアフコースを表す。 実施例１４で行ったＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。図中、「Endo LF-f」は培養物ＬＦの培養上清であり、「Endo LF-b」は培養物ＬＦの懸濁液である。 実施例１５で行ったＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 実施例１６で用いた糖鎖の構造を示す図である。図中、「PAES」はN-[2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシンアミルであり、「Man」はマンノースであり、「Gal」はガラクトースであり、「GlcNAc」はN-アセチルグルコサミンであり、「Asn」はアスパラギンである。また、図中の矢印は、本発明の酵素が切断するβ1-4結合部位を表す。 実施例１６で行った薄層クロマトグラフィーのデータである。図中、レーン１は陰性対照としてのPAES-HTF Asn-CHOおよび水、レーン２は陽性対照としてのPAES-HTF Asn-CHOおよびエンドHS、レーン３はPAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＰＭの沈殿物、レーン４はPAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＰＭの培養上清、レーン５はPAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＬＦの懸濁液をアプライした結果である。 実施例１７で行ったＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 実施例１８で行ったＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のバンドを示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。図中、「M」はマーカー、「A」はA画分、「B」はB画分である。 本発明の酵素の糖鎖遊離活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。グラフにおいて、「○」は酢酸緩衝液pH 3.52、4.01、4.5、5.0、5.51を用いたときのデータを示し、「●」はリン酸緩衝液pH 5.47、6.0、6.5、7.0、7.5を用いたときのデータを示し、「□」はTris-HCl緩衝液pH 7.56、8.03、8.51を用いたときのデータを示し、「■」はホウ酸緩衝液pH 8.5、9.0、10.0を用いたときのデータを示す。 本発明の酵素の糖鎖遊離活性に対する温度の影響を示すグラフである。 本発明の酵素のヒトトランスフェリンに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のヒトラクトフェリンに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のウシラクトフェリンに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素の仔ウシフェツインに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のヒトα1-AGに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のヒツジIgGに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のヒトラクトフェリン(Plant発現)に対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のタカアミラーゼに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のオボアルブミン(OVA)に対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素のウシRNase Bに対する糖鎖遊離活性を示すＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素によって糖鎖を除去されたヒト唾液α-アミラーゼファミリーＣ(HAS-C)タンパク質が、当該タンパク質の分解酵素によって受ける分解の程度を示した電気泳動ゲルの写真である。 本発明の酵素によって糖鎖を除去されたヒト唾液α-アミラーゼファミリーＣ(HAS-C)タンパク質が、当該タンパク質の分解酵素によって受ける分解の程度を示したグラフである。
　本発明の酵素は、ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物に由来する酵素である。好ましくは、本発明の酵素は、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、プレボテラ・ビビア(Prevotella bivia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される微生物に由来する酵素である。より具体的には、本発明の酵素は、これらの微生物の菌体に結合しているか、またはこれらの微生物により分泌されるか、またはこれらの微生物に内在している酵素である。
　プラボテラ・メラニノゲニカに由来する酵素として、配列番号２、４または６の塩基配列を有する遺伝子によりそれぞれコードされる配列番号１、３または５のアミノ酸配列を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は、それぞれ11,000、137,000および140,000の分子量を有する。本発明においては、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素をエンドPMαと呼ぶ。また、配列番号３のアミノ酸配列を有する酵素をエンドPMβと呼ぶ。さらに、配列番号５のアミノ酸配列を有する酵素をエンドPMγと呼ぶ。
　微生物は、特に限定されないが、脊椎動物の唾液および尿などの排泄物ならびに細胞および組織、特にヒトの唾液および尿などの排泄物ならびに細胞および組織に含まれるものが好ましい。
　あるいは、本発明の酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素である。ここで、「相同性」とは、米国の国立生物工学情報センター(ＮＣＢＩ)により提供されるＢＬＡＳＴ解析を標準設定で用いて算出された相同性を意味する。具体的な相同性の数値としては、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％である。
　上記のとおり、配列番号１、配列番号３および配列番号５のアミノ酸配列は、それぞれエンドPMα、エンドPMβおよびエンドPMγと呼ばれる酵素を意味する。
　また、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列としては、下記の領域１、領域２、領域３および領域４で示される共通領域を含んでいることが好ましい。
　すなわち、領域１は、
式：Ｘ1ＧＸ2Ｘ3ＧＸ4Ｘ5Ｘ6ＮＸ7Ｅ
（式中、
　Ｘ1はロイシン、フェニルアラニンまたはチロシン残基であり、
　Ｘ2はフェニルアラニン、チロシン、イソロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ3はアスパラギン酸またはアスパラギン残基であり、
　Ｘ4はイソロイシン、フェニルアラニン、ロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ5はアスパラギンまたはグリシン残基であり、
　Ｘ6はチロシンまたはフェニルアラニン残基であり、
　Ｘ7はトリプトファンまたはセリン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなる。
　領域２は、
式：Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｘ19ＹＸ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23ＥＸ24Ｘ25ＦＳＸ26ＧＸ27Ｘ28ＮＰＸ29Ｘ30Ｘ31Ｘ32Ｘ33Ｉ
（式中、
　Ｘ8はグリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基であり、
　Ｘ9はグリシン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギン残基であり、
　Ｘ10はアスパラギン酸またはグリシン残基であり、
　Ｘ11はアラニン、セリンまたはスレオニン残基であり、
　Ｘ12はロイシン、メチオニン、アスパラギンまたはセリン残基であり、
　Ｘ13はセリン、プロリンまたはアスパラギン酸残基であり、
　Ｘ14はアルギニン、グルタミン酸、バリンまたはイソロイシン残基であり、
　Ｘ15はイソロイシン、スレオニンまたはアラニン残基であるか、または欠失していてもよく、
　Ｘ16はメチオニン、リジン、グルタミンまたはイソロイシン残基であり、
　Ｘ17はセリンまたはグルタミン残基であり、
　Ｘ18はアスパラギン、アルギニンまたはリジン残基であり、
　Ｘ19はスレオニンまたはアラニン残基であるか、または欠失していてもよく、
　Ｘ20はグルタミン、メチオニンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ21はグルタミン酸、ロイシンまたはリジン残基であり、
　Ｘ22はチロシン、アルギニンまたはリジン残基であり、
　Ｘ23はロイシン、スレオニンまたはグルタミン残基であり、
　Ｘ24はアルギニンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ25はアラニン、トリプトファン、イソロイシンまたはメチオニン残基であり、
　Ｘ26はグリシンまたはセリン残基であり、
　Ｘ27はアスパラギン、セリンまたはチロシン残基であり、
　Ｘ28はアルギニンまたはアスパラギン残基であり、
　Ｘ29はロイシン、バリンまたはグリシン残基であり、
　Ｘ30はロイシン、チロシンまたはアスパラギン残基であり、
　Ｘ31はアルギニン、アスパラギン、セリンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ32はプロリン、イソロイシンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ33はグルタミン酸、グルタミン、セリンまたはアラニン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなる。
　領域３は、
式：ＰＸ34Ｘ35Ｘ36Ｘ37ＦＮＸ38ＧＮＧＸ39Ｘ40Ｘ41Ｘ42Ｘ43Ｘ44ＧＸ45Ｘ46Ｘ47Ｘ48Ｘ49Ｘ50Ｘ51ＷＸ52ＮＸ53Ｘ54Ｘ55ＱＤＸ56Ｘ57ＰＴＸ58ＲＷ
（式中、
　Ｘ34はフェニルアラニンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ35はアラニン、イソロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ36はスレオニンまたはセリン残基であり、
　Ｘ37はヒスチジン、チロシンまたはアルギニン残基であり、
　Ｘ38はメチオニン、スレオニンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ39はグルタミン酸、リジンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ40はロイシン、アルギニン、フェニルアラニンまたはセリン残基であり、
　Ｘ41はチロシンまたはフェニルアラニン残基であり、
　Ｘ42はアスパラギンまたはアルギニン残基であり、
　Ｘ43はチロシンまたはリジン残基であり、
　Ｘ44はリジン、アスパラギン酸またはグリシン残基であり、
　Ｘ45はリジン、グルタミンまたはバリン残基であり、
　Ｘ46はリジン、アルギニン、バリンまたはイソロイシン残基であり、
　Ｘ47はスレオニン、リジン、グルタミンまたはアラニン残基であり、
　Ｘ48はアラニン、アスパラギンまたはフェニルアラニン残基であり、
　Ｘ49はグリシンまたはアスパラギン酸残基であり、
　Ｘ50はセリン、アルギニンまたはヒスチジン残基であり、
　Ｘ51はプロリンまたはリジン残基であるかまたは欠失していてもよく、
　Ｘ52はチロシン、バリンまたはアラニン残基であり、
　Ｘ53はメチオニン、バリンまたはロイシン残基であり、
　Ｘ54はセリン、グリシンまたはアスパラギン残基であり、
　Ｘ55はセリン、バリンまたはスレオニン残基であり、
　Ｘ56はバリンまたはチロシン残基であり、
　Ｘ57はバリン、ロイシンまたはメチオニン残基であり、
　Ｘ58はチロシンまたはトリプトファン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなる。
　領域４は、
式：ＤＡＹＸ59ＧＧＸ60Ｘ61Ｘ62Ｘ63Ｘ64Ｘ65ＧＸ66Ｘ67Ｘ68Ｘ69Ｘ70Ｘ71Ｘ72Ｘ73Ｘ74Ｘ75ＬＸ76ＫＴＸ77Ｘ78
（式中、
　Ｘ59はスレオニン、ロイシン、メチオニンまたはトリプトファン残基であり、
　Ｘ60はアラニンまたはセリン残基であり、
　Ｘ61はシステイン、アラニンまたはスレオニン残基であり、
　Ｘ62はロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ63はセリンまたはアルギニン残基であり、
　Ｘ64はロイシン、イソロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ65はリジン、フェニルアラニン、ヒスチジンまたはセリン残基であり、
　Ｘ66はバリン、アスパラギン、セリンまたはグルタミン残基であり、
　Ｘ67はセリン、アスパラギンまたはスレオニン残基であり、
　Ｘ68はアスパラギン、プロリンまたはアスパラギン酸残基であり、
　Ｘ69はアラニン、リジンまたはフェニルアラニン残基であり、
　Ｘ70はグリシン、スレオニン、グルタミン酸またはセリン残基であり、
　Ｘ71はプロリン、アラニン、チロシンまたはアルギニン残基であり、
　Ｘ72はスレオニン、ロイシンまたはバリン残基であり、
　Ｘ73はアスパラギン酸、ヒスチジンまたはリジン残基であり、
　Ｘ74はバリン残基であるかまたは欠失していてもよく、
　Ｘ75はバリン残基であるかまたは欠失していてもよく、
　Ｘ76はチロシンまたはフェニルアラニン残基であり、
　Ｘ77はアスパラギン、アスパラギン酸、リジンまたはメチオニン残基であり、
　Ｘ78はロイシン、フェニルアラニンまたはチロシン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなる。
　配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列の具体例としては、それぞれ配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のアミノ酸配列などが挙げられる。
　本発明においては、配列番号７のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳα２、配列番号８のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳα１、配列番号９のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳβ１、配列番号１０のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳβ４、配列番号１１のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳγ１、配列番号１２のアミノ酸配列からなる酵素をエンドＨＳγ３と呼ぶ。なお、各エンドＨＳの平均分子量を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の本発明の酵素はいずれも、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する。本発明の酵素は、糖タンパク質の２本鎖、３本鎖、４本鎖および５本鎖コンプレックス型の糖鎖を遊離させることができる。また、ラクトバシラス属およびプレボテラ属に由来するか、または配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する酵素については、ハイマンノース型およびハイブリッド型糖鎖を遊離することもできる。したがって、本発明の酵素は、広範多種のアスパラギン結合型糖鎖を遊離することができる。
　酵素は、ｐＨ５～10で糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を示す。ラクトバシラス属およびプレボテラ属に由来するか、または配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する酵素については、酵素が上記活性を示すｐＨの範囲は、好ましくはｐＨ5.5～９である。また、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する酵素については、酵素が上記活性を示すｐＨの範囲は、好ましくはｐＨ６～９である。具体的なｐＨの数値としては、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、10である。
　酵素は、20～40℃で糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を示す。酵素が上記活性を示す温度の範囲は、好ましくは30～38℃であり、より好ましくは36～37℃である。具体的な温度の数値としては、20、25、30、35、36、37、38、39、40℃である。
　糖タンパク質とは、特に限定されず、当業者に公知の任意のものを意味する。糖タンパク質は、好ましくは、そのタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基に糖鎖がβ結合した糖タンパク質(当該技術分野においては「Ｎ結合型」と呼ばれることもある)である。Ｎ結合型の糖タンパク質は、糖タンパク質のタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基と糖鎖の根元の糖との間にジアセチルキトビオース部分(GlcNAc-GlcNAc)を有する。ここで、根元の糖とは、糖鎖中、ジアセチルキトビオース部分を構成する２つのＮ-アセチルグルコサミンのいずれかと結合する糖を意味する。糖タンパク質の由来は、特に限定されないが、ヒトを含む脊椎動物由来の糖鎖が好ましく、ヒト由来の糖タンパク質がより好ましい。特定の理論に縛られることを意図しないが、本発明の方法によれば、このジアセチルキトビオース部分のＮ-グリコシド結合が切断されることにより、糖タンパク質から糖鎖が遊離すると考えられる。
　糖タンパク質の糖鎖の構造および組成は、特に限定されず、当業者に公知のように、分岐していない糖鎖の形態にあるか、または２本鎖、３本鎖、４本鎖または５本鎖に分岐しているコンプレックス型の形態にあるか、あるいはハイマンノース型もしくはハイブリッド型の形態にある糖鎖を意味する。ハイマンノース型糖鎖とは、マンノースおよびＮ-アセチルグルコサミンからなり、特に側鎖と呼ばれる部分はマンノースのみからなる。一方、ハイブリッド型糖鎖は、側鎖と呼ばれる部分がコンプレックス型のようにＮ-アセチルグルコサミンやガラクトース、Ｎ-アセチルノイラミン酸、フコースから構成されるものと、ハイマンノース型糖鎖のようにマンノースのみからなるものとの両方がある。なお、アスパラギン結合型糖鎖の「側鎖」とは、アスパラギン結合型糖鎖の共通五糖母核構造の中のトリマンノシルコアのα1-4結合マンノースとα1-6結合マンノースに結合するオリゴ糖鎖部分をいう。
　糖鎖は、好ましくは、一般にアスパラギン結合型糖鎖と呼ばれるものであり、その根元の糖がジアセチルキトビオース部分を介してタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基にβ結合しているＮ結合型の糖タンパク質の糖鎖部分を構成する。糖鎖は、より好ましくは、２本鎖、３本鎖、４本鎖または５本鎖分岐のコンプレックス型の形態にある。糖鎖を構成する糖は、特に限定されず、当業者に公知の任意の糖である。具体的には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミン、Ｎ-アセチルノイラミン酸、キシロースなどが挙げられる。
　糖タンパク質は、糖鎖部分の根元の糖とジアセチルキトビオース部分との間に、フコースを更に有していてもよい。本発明において、このフコースは、「コアフコース」とも称される。本発明の酵素は、コアフコースを有する糖タンパク質または糖ペプチドもしくは糖アスパラギンからも糖鎖を遊離させることができる。
　また、糖タンパク質は、糖鎖部分の根元とは反対側の末端部分(以下、「末端側」という)に、シアル酸を任意に有していてもよい。本発明の酵素は、糖タンパク質のジアセチルキトビオース部分を切断し、末端側にシアル酸が結合した糖鎖を糖タンパク質から遊離させることができる。
　上記のような糖タンパク質としては、具体的には、ヒトトランスフェリン、ヒトラクトフェリン、ウシフェツイン、ヒトα１酸性糖タンパク質などが挙げられる。
　本発明の酵素は、糖鎖受容体の存在下で、糖タンパク質と接触させたとき、糖タンパク質から遊離させた糖鎖を糖鎖受容体に転移させる活性を示す。このような糖鎖受容体としては、配糖体合成において糖鎖受容体となり得る化合物(例えば、糖類、タンパク質など)であれば特に限定されないが、サリシン、アルブチンおよびリナマリンなどの生理活性物質；グルコース(Glc)およびガラクトース(Gal)などの単糖；スクロース、ラクトースおよびマルトースなどの二糖；マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトへプタオースなどのオリゴ糖；マンニトール、myo-イノシトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトールおよびマルトトリイトールなどの糖アルコール；メタノール、1-プロパノール、1-ブタノール、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、グリセロール、3-クロロ-1,2-プロパンジオールなどのアルコール；ヘキシル-β-チオグルコシド、スクロースモノコラート、アデノシンおよび2-デオキシアデノシンなどの配糖体；ヒトトランスフェリン、ウシフェツイン、ヒトα1-酸性糖タンパク質などの糖タンパク質；ニワトリ卵黄由来シアロ糖ペプチドなどの糖ペプチド；ヒトトランスフェリン由来糖アスパラギン、ウシフェツイン由来糖アスパラギンなどの糖アスパラギン；N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、p-ニトロフェニル-β-D-グルコース(Glc-PNP)、p-ニトロフェニル-β-ガラクトース(Gal-PNP)、p-ニトロフェニル-α-D-グルコース(Glc-α-PNP)、p-ニトロフェニル-α-D-ガラクトース(Gal-α-PNP)、p-ニトロフェニル-β-D-マンノース(Man-PNP)、p-ニトロフェニル-β-D-キシロース(Xyl-PNP)、α-p-ニトロフェニル-グリセロール(グリセロール-PNP)などが挙げられる。
　本発明の酵素は、
　該酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することにより、培養物を得る工程と、
　得られた培養物を精製することにより、前記酵素を得る工程と
を含む、本発明の酵素の製造方法によって製造することができる。
　上記の遺伝子は、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（それぞれ配列番号１３、配列番号１５もしくは配列番号１７）を有するか、または上記のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する。
　このような塩基配列としては、上記の領域１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、領域２のアミノ酸配列をコードする塩基配列、領域３のアミノ酸配列をコードする塩基配列および領域４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を含んでいることが好ましい。
　配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７と相同性を有する塩基配列の具体例としては、それぞれ配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の塩基配列などが挙げられる。
　組換えベクターは、上記の遺伝子を含むDNAフラグメントの塩基配列に基づいて作製したプライマーおよび当業者に公知のベクターを用いて、当業者に公知の手順に従う制限酵素処理およびライゲーション処理により作製することができる。
　ベクターは、宿主細胞に導入することにより、所望のタンパク質を発現する細胞発現系として機能させることが可能なベクターであれば特に限定されず、当業者に公知のベクターから選択することができる。具体的な例としては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、YCp型大腸菌－酵母シャトルベクター、YIp型大腸菌－酵母シャトルベクター、大腸菌－枯草菌シャトルベクター、ファージベクター、レトロトランスポゾン、融合タンパク質として発現する発現ベクターなどが挙げられる。ベクターは、好ましくはpET23a、pET21a、pET-50b(+)またはpET-50a(+)である。
　上記のベクターに含まれるプロモーターは、特に限定されず、後述の宿主細胞の種類に応じて当業者に公知のものから選択することができる。具体的な例としては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、PLプロモーターおよびT7プロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、好ましくは、T7プロモーターである。
　組換えベクターは、選択マーカー遺伝子、ターミネーター、およびエンハンサーなどのその他の因子を機能的に含有してもよい。その他の因子としては、特に限定されず、組換えベクターおよび宿主細胞の性質などに基づいて、当業者に公知のものから選択することができる。
　組換えベクターは、例えば、適当な制限酵素で予め消化したプラスミドベクターに、本発明の酵素をコードする遺伝子を含むDNAフラグメントをライゲーションすることにより作製することができる。
　ライゲーション方法は、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。具体的な例としては、ライゲーションハイ(タカラバイオ)などのDNAリガーゼを用いる方法などが挙げられる。
　宿主細胞としては、特に限定されず、当業者に公知の細胞を用いることができる。具体的な例としては、大腸菌、酵母などの細胞が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、BL21系の大腸菌細胞(例えば、大腸菌BL21DE3、BL21DE3系統OrigamiDE3、BL21DE系統RosettaDE3およびBL21系RosettaII)およびDH5αである。
　しかしながら、本発明の酵素をそのまま含んだ組換えベクターを宿主細胞に導入しても、大量生産を可能にする程度の酵素発現量および糖鎖遊離活性を得るには十分ではないことがある。本発明者は、本発明の酵素の一部について、膜貫通領域を除去してから上記のようにして組換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することにより、十分な酵素発現量および糖鎖遊離活性を得ることができることを見出している。
　ここで、本発明の酵素が膜貫通領域を含んでいる場合、酵素の可溶性の向上や適切な立体構造を保持する観点から、本発明の酵素は膜貫通領域を除去されていることが好ましい。下記の表２では、膜貫通領域を有すると考えられる各エンドＨＳのアミノ酸配列について、当業者に周知のSPLIT 4.0 SERVER膜タンパク質二次構造予測オンライン解析ソフト(Membrane Protein Secondary Structure Prediction Server；http://split4.pmfst.hr/split/4/)を用いて予測された膜貫通領域の位置を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示した領域の除去は、上記の配列に基づいたＰＣＲ法などの当業者に公知の方法に従って行うことができる。上記の領域を除去した場合の各エンドＨＳのおおよその平均分子量を下記の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の酵素は、ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物、または上記のようにして形質転換した宿主細胞の培養物、培養上清または培養物の処理物から精製することができる。培養および処理は、下述のようにして行うことができる。精製は、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。具体的な例としては、硫酸アンモニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クラマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いた精製方法などが挙げられる。
　本発明の糖鎖の遊離方法は、第１の観点によれば、本発明の酵素と糖タンパク質を含む試料とを接触させることにより、糖タンパク質から糖鎖を遊離させることができる。
　糖タンパク質を含む試料は、上記に定義した糖タンパク質を含むものであれば特に限定されない。
　酵素と糖タンパク質を含む試料とを接触させる時間は、0.5～72時間であり、好ましくは0.5～２時間であり、より好ましくは0.5～１時間である。具体的な接触時間の数値としては、0.5、0.75、１、1.5、２、３、４、５、10、15、20、24、36、48、60、72時間である。
　接触時の温度は、20～40℃であり、好ましくは30～38℃であり、より好ましくは36～37℃である。具体的な接触時の温度の数値としては、20、25、30、35、36、37、38、39、40℃である。
　酵素がラクトバシラス属およびプレボテラ属に由来するか、または配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する場合、接触時のｐＨは、５～10であり、好ましくはｐＨ5.5～９である。具体的な接触時のｐＨの数値としては、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、10である。
　酵素が配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する場合、接触時のｐＨは、５～10であり、好ましくは６～９である。具体的な接触時のｐＨの数値としては、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、10である。
　接触工程により遊離させた糖鎖は、当業者に公知の任意の方法に従って、単離または精製してもよい。単離または精製方法の具体的な例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーなどが挙げられる。
　また、本発明の糖鎖の遊離方法は、第２の観点によれば、上記の微生物または上記のようにして形質転換された宿主細胞を培養し、得られた培養物またはその処理物と糖タンパク質を含む試料とを接触させることにより、前記糖タンパク質の糖鎖を遊離させることができる。
　この第２の観点による糖鎖の遊離方法の第１の工程は、上記の微生物または上記のようにして形質転換された宿主細胞を培養する工程である。
　微生物または上記のようにして形質転換された宿主細胞の培養は、特に限定されず、当業者に公知の任意の培養方法を用いて行うことができる。具体的な例としては、流加培養、回分培養、反復回分培養、連続培養(例えばケモスタット又はタービドスタット)、半連続培養等の培養プロセス及びこれらの組合せが挙げられる。培養条件は、微生物または宿主細胞の種類、使用するバイオリアクターなどの様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
　バイオリアクターとしては、特に限定されず、微生物または宿主細胞の種類などに基づいて、当業者に公知のものから選択できる。具体的な例としては、気泡塔型培養槽、通気撹拌培養槽などが挙げられる。
　培地は、本発明の糖鎖の遊離方法に用いる微生物または宿主細胞の培養に適するものであれば特に限定されず、当業者に公知のものから選択できる。具体的な例としては、半合成培地、すなわち複合化合物(例えば酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸)を含む培地(例えばLB培地等)、複合化合物を含まない化学的に定義された物質(例えば、グルコース、塩(NaCl)等の重量に基づいて分子量を算出できる物質)からなる合成培地(例えばDavis培地等)、天然培地等が挙げられる。
　培地の供給量は、微生物または宿主細胞の種類、使用するバイオリアクター、培養時間等の様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
　培養時間は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。培養時間は、好ましくは72～120時間、より好ましくは85～96時間である。具体的な培養時間の数値としては、72、80、85、90、93、96、100、105、110、115、120時間である。
　培養温度は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。培養温度は、好ましくは30～40℃、より好ましくは36～37℃である。具体的な培養温度の数値としては、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃である。
　上記のようにして得られた培養物は、更なる処理に付し、培養物の処理物としてもよい。
　培養物の処理は、特に限定されず、可溶化、培養上清分離、精製および乾燥などを含む公知の処理方法を、必要に応じて当業者が選択するかまたは組み合わせて行うことができる。培養物の処理は、例えば、以下のようにして行うことができる。
　まず、培養物から培養上清を分離する。分離方法としては、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。具体的な例としては、フィルター濾過、遠心分離等が挙げられる。分離の前には、任意に、界面活性剤を用いる方法などの当業者に公知の任意の方法に従って、微生物または宿主細胞を可溶化してもよい。次いで、透析などの公知の任意の方法により培地成分等の夾雑物を除去し、その後、凍結乾燥などの公知の任意の方法により培養物または培養上清の処理物を得ることができる。
　この第２の観点による本発明の糖鎖の遊離方法の第２の工程は、上記のようにして得られる培養物またはその処理物と糖タンパク質を含む試料とを接触させる工程である。
　糖タンパク質を含む試料は、上記に定義した糖タンパク質を含むものであれば特に限定されない。
　培養物またはその処理物と糖タンパク質を含む試料とを接触させる時間は、0.5～72時間であり、好ましくは0.5～２時間であり、より好ましくは0.5～１時間である。具体的な接触時間の数値としては、0.5、0.75、１、1.5、２、３、４、５、10、15、20、24、36、48、60、72時間である。
　接触時の温度は、20～40℃であり、好ましくは30～38℃であり、より好ましくは36～37℃である。具体的な接触時の温度の数値としては、20、25、30、35、36、37、38、39、40℃である。
　酵素がラクトバシラス属およびプレボテラ属に由来するか、または配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する場合、接触時のｐＨは、５～10であり、好ましくはｐＨ5.5～９である。具体的な接触時のｐＨの数値としては、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、10である。
　酵素が配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有する場合、接触時のｐＨは、５～10であり、好ましくは６～９である。具体的な接触時のｐＨの数値としては、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、10である。
　接触工程により遊離させた糖鎖は、当業者に公知の任意の方法に従って、単離または精製してもよい。単離または精製方法の具体的な例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーなどが挙げられる。
　本発明の糖鎖の転移方法は、糖鎖受容体の存在下で、本発明の酵素と、糖タンパク質とを接触させることにより、糖タンパク質から遊離させた糖鎖を糖鎖受容体に転移させることができる。
　本発明の糖鎖転移方法は、糖鎖受容体の存在下で行うことを除いては、上記第１の観点による本発明の糖鎖の遊離方法と同様にして行うことができる。糖鎖受容体は、好ましくは水性溶媒、より好ましくは水、炭素数１～４の低級アルコールおよびその水との混合物中に溶解または懸濁もしくは分散された溶液または懸濁液もしくは分散液の形態にある。炭素数１～４の低級アルコールは、糖鎖受容体を溶解または懸濁もしくは分散可能なものであれば特に限定されないが、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノールおよび２－ブタノールなどが挙げられる。糖鎖受容体が上記の低級アルコールと水との混合物である場合には、その混合比は、当業者が適宜設定することができる。
　糖鎖受容体が溶液の形態にある場合、溶液中の糖鎖受容体の濃度は、好ましくは60～500ｍＭ、より好ましくは100～400ｍＭ、更に好ましくは200～300ｍＭである。具体的な糖鎖受容体の濃度の数値としては、60、80、100、150、200、250、300、350、400ｍＭである。
　糖鎖受容体が懸濁液または分散液の形態にある場合、懸濁液または分散液100ｍＬに対する糖鎖受容体の重量は、好ましくは1,080～9,000ｍｇ、より好ましくは1,800～7,200ｍｇ、更に好ましくは3,600～5,400ｍｇである。具体的な糖鎖受容体の重量の数値としては、1,080、1,440、1,800、2,160、2,520、2,880、3,240、3,600、3,960、4,320、4,680、5,040、5,400、5,760、6,120、6,480、6,840、7,200、7,560、7,920、8,280、8,640、9,000ｍｇである。
　なお、糖鎖の転移方法に関して記述するとき、糖タンパク質は、「糖鎖供与体」と呼ばれることもある。糖鎖供与体の濃度は特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。糖鎖供与体の濃度は、好ましくは150～300μＭ、より好ましくは200～250μＭである。具体的な糖鎖供与体の濃度としては、150、180、200、230、250、270、300μＭである。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ヒト唾液サンプルからのエンドHSα2のクローニング
　健常人(男性22才)から採取したヒト唾液を遠心分離し、得られた沈殿を10 mM Tris-HCl, pH7.2に懸濁した。得られた懸濁液を終濃度２％のCHAPSと混合し、20℃で１時間振盪し、懸濁液に含まれる酵素の可溶化を行い、超遠心分離機(Hitachi Koki、CP60E、P50AT)により遠心分離し、得られた上清を可溶化酵素溶液とした。この溶液を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、酵素活性のピークのうち比活性60以上の活性画分を集め、濃縮し、1％ CHAPSを含む10 mM Tris-HCl, pH 8.8で平衡化したQ-Sepharose HPカラム（φ1.0 x 6.3 cm）に流速0.2 ml/minで負荷し、0～0.15 M NaClの直線濃度勾配（50 - 50 ml）を行い、流速0.2 ml/minにて2 mlずつ分画し、活性画分を得た。なお、酵素活性の測定は以下のようにして行った。酵素を含有するサンプルに、基質としてのヒトトランスフェリン(HTF)(シグマ)溶液(0.2 mg/ml 0.2 M Na, K-リン酸緩衝液pH 6.2)５μlを加え、37℃でインキュベートした。SDS-PAGEサンプルバッファー10μlを加え反応を停止した後、95℃で３分間インキュベートした。そして、反応液全量を7.5％分離ゲルを用いるSDS-PAGEに供した。電気泳動後、ゲルを固定液中で５分間振盪した後、CBB染色を行い、脱色した。そして、糖鎖を失い低分子量化したHTFのバンドと未反応のバンドの量をプリントグラフ(アトー)を用いて定量し、反応生成物を算出した。こうして、同条件下で１分間に１μｇのHTFから糖鎖を遊離する酵素量を１単位とした。その後、上記のようにして得られた活性画分を用いて電気泳動を行った結果、活性画分には、エンドＨＳが単独で含まれていると考えられた(データ示さず)。得られた活性画分に含まれる酵素の部分アミノ酸配列を特定し、メタゲノム法を用いて、ヒト唾液に含まれるエンドＨＳをコードする遺伝子の塩基配列を複数特定した(配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８)。ヒト唾液に含まれるメタゲノムを鋳型としてPCRを行い、エンドHSα2をコードする遺伝子(配列番号１３)を含むDNA断片を増幅し、pT7 Blueベクターにライゲーションし、NovaBlue Singles Competent Cellに導入した。
実施例２：エンドHSα2発現系の構築
　上記のようにして得られた細胞からプラスミドDNAを抽出し、それを鋳型としてPCRを行い、PCR反応液50 μlを1.5 mlチューブに移し、滅菌水50 μlとフェノール:クロロホルム:イソプロパノール 25:24:1(シグマ)100 μlを加え、混合し、室温にて13,000 rpm、5分間遠心（Kokusan、H-1300）した。上相を別の1.5 mlチューブに移し、エタノール沈殿に供し、得られた沈殿を滅菌水10 μlに溶解した。こうして得られたDNA溶液を、Bam HＩ(TaKaRa)とSal Ｉ(Fermentas)による制限酵素処理に供した。同時に発現用ベクターであるpET-50b(+)(TaKaRa)についてもBam HＩとSal Ｉによる制限酵素処理を行った。Ligation high(Toyobo)を用いて、3103 bpのPCR産物と直鎖状pET-50b(+)とをライゲーションして得られた発現用ベクターをE.coli DH5αに導入し、0.01% Kanamycinを含むLB寒天培地（1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, 2% Agar、pH 7.0）にまき、37℃で一晩培養した。
　得られたコロニーの１つに由来する細胞を、0.01% Kanamycinを含むLB液体培地(1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, pH 7.0）2 ml中で37℃において180 rpmで一晩振盪培養を行った。培養後、ミニプレップアルカリ法に従ってプラスミド溶液を得た。
　あらかじめ1.5 mlチューブに分注されている発現用大腸菌E.coli BL21(DE3) Competent Cells（Novagen）懸濁液50 μlを氷中で融解し、上記のプラスミド溶液1 μlを加え、穏やかに混合した。5分間氷冷し、42℃の恒温槽で30 秒間インキュベートした後、2 分間氷冷した。そしてSOC Medium 250 μlを加え、37℃にて180 rpm、１時間振盪培養を行った後、0.01% Kanamycinを含むLB寒天培地（1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, 2% Agar、pH 7.0）にまき、37℃で一晩培養した。培養細胞を－70℃でグリセロールストック(ストックＡ)した。
実施例３：エンドHSα2の精製
　ストックＡからつまようじで0.01% Kanamycinを含むLB液体培地(1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, pH 7.0）15 mlに植継ぎ、37℃において180 rpmで一晩振盪培養を行った。その培養液2 mlを、0.01% Kanamycinを含むLB液体培地200 mlを入れた坂口フラスコ5本にそれぞれ移し、37℃において140 rpmで、OD600の値が0.4となるまで培養した。OD600の値が0.4となった時点で、5本の坂口フラスコに100 mM IPTGを200 μlずつ加え、20℃にて140 rpmで4時間振盪培養を行った。得られた培養液を合わせて、4℃において6500 rpm、10分間遠心分離した。上清を除き、得られた菌体ペレットを上清で懸濁した後、50 mlチューブ(NUNC)に移し、遠心分離機（サクマ、M201-IVD、50F8A-E24L）を用いて4℃において7000 rpm、10分間遠心分離し、上清を捨て、菌体ペレットを得た。
　各菌体ペレット(湿重量1.14 g)に対して、冷Lysis Buffer 80 mlを加え、懸濁し、Sonifier 250（BRANSON）を用いて、氷中にてOut put control 、Duty cycle Constantで30秒間の超音波処理を7回行い、菌体から発現タンパク質の抽出を行った。得られた抽出溶液を4℃において12,000 rpm、20分間遠心分離し、上清をフラスコに移した。沈殿について、さらに冷Lysis Buffer 80 mlを加え、懸濁し、Sonifier 250（BRANSON）を用いて、氷中にてOut put control 、Duty cycle Constantで30秒間の超音波処理を3回行い、4℃において12,000 rpm、20分間遠心（サクマ、M201-IVD、50F8A-E24L）し、その上清を前述の上清と合わせ、得られた160 mlを上清画分とした。
　得られた上清画分を、カラムバッファー(0.3% CHAPS、0.3 M NaCl、10 mMイミダゾール、10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 7.5)で緩衝化したCo2+ Profinity IMAC Resinカラム（φ1.5 x 2.8 cm）に負荷し、流速1 ml/minにて100 mM、200 mM、300 mM、400 mMそして500 mM イミダゾールによるステップワイズ溶出(各25 ml)を行い、得られた画分について実施例１と同様にして酵素活性を測定した。その結果、約80%(30000U)の酵素がカラムに吸着し、0.1 Mイミダゾールによってほとんど溶出された。そこで溶出画分を集めた。また、素通り画分(6000U)について再度、Co2+ Profinity IMAC Resinカラムに負荷し、流速1 ml/minにて200 mM イミダゾール溶出(25 ml)を行った。得られた溶出画分(700U)を、上記で集めた溶出画分と合わせた。
　限外濾過器（アドバンテック東洋UHP-43, 分子量10,000カットとアドバンテック東洋UHP-25, 分子量20,000カット）を用いて、得られた溶出画分のNaCl濃度を約1.25 mMまで下げ、約1.5 mlとした。これを0.3% CHAPSを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 7.5で緩衝化したDEAE-Toyopearl 650Sカラム(3 ml)を用いたHPLC（MILLIPORE、Waters 600E Multisolvent Delivery System）に供した。0-0.4 M NaClの直線濃度勾配溶出を行い、流速0.5 ml/minにて0.5 mlごとに分画した。その結果、酵素活性は複数のピークに分かれた。それぞれの画分10 μlをSDS-PAGEに供し、分子量170.4 kに相当するタンパク質が検出された画分を集め酵素溶液とした。
　発現タンパク質に融合しているHisタグ領域の除去をHRV 3C Protease(Novagen)を用いて行った。反応液から遊離したHisタグ領域を除くため、反応液640 μlをカラムバッファー(0.3% CHAPS、0.3 M NaCl、10 mMイミダゾール、10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 7.5)で緩衝化したCo2+ Profinity IMAC Resinカラム（φ1.5 x 2.8 cm）に負荷し、さらにカラムバッファー30 mlで流速1 ml/minにて洗い、5 mlずつ分画し、活性画分を得た。
　限外濾過器を用いて、得られた活性画分のNaCl濃度を約2 mMとした。これを限外濾過で約1.25 mlとし、これを0.3% CHAPSを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 7.5で緩衝化したMono Qカラム(1 mlベッド体積)を用いたHPLC（MILLIPORE、Waters 600E Multisolvent Delivery System）に供した。0-0.4 M NaClの直線濃度勾配溶出を行い、流速0.5 ml/minにて0.5 mlごとに分画した。得られた各画分10 μlをSDS-PAGEに供したところ、分子量112.5 kのバンドがほぼ単一となる画分が得られ、このバンドがエンドHSα2に相当すると考えられた(図１)。この画分を用いて、エンドHSα2の性質を調べた。
（各種糖タンパク質への作用）
　基質溶液10 μlに上記の画分1 μlを加えた混合液を4個用意し、それぞれ37℃で0分間、30分間、3時間そして22時間インキュベートし、SDS－PAGEサンプルバッファー10 μl加え反応を停止した。それぞれのサンプルについて適当な濃度のポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEに供した。その結果、コンプレックス型糖鎖を持つHTF、HLF、フェツインおよびα1-AGについて、基質分子からの糖鎖の除去にともなって低分子化した基質のバンドが経時的に生成した。また、ヒツジIgGのH鎖でも同様であった。一方、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖をもつOVAとRNase Bでは基質のバンドは低分子化せず、糖鎖は遊離しなかった。従って、エンドHSα2は、コンプレックス型糖鎖を持つ糖タンパク質に特異的に作用し、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖を持つものには作用しないと考えられた。
（糖アスパラギンへの作用）
　基質溶液0.5 μlに滅菌水1.5 μlと酵素溶液0.5 μlを加えた混合液をPCR中に4本用意し、それぞれ37℃で0、4、8そして24時間インキュベートし、全反応液をTLCプレート（メルク、シリカゲル 60）に負荷した。20 cm長のろ紙（ワットマン3MM）を1 cm間隔で折り、TLCプレートの上端に付け、展開液（１－プロパノール:酢酸:水＝3:3:2）に浸し、室温にて約20時間展開した。展開後、乾燥させ、オルシノール－硫酸法によって加水分解物を検出した。その結果、ENGHSα2による加水分解生成物が経時的に生成した。そして、残存基質と加水分解物のスポットをプリントグラフ（アトー Lane & Spot　Analyzer 6.0）で定量し、加水分解物の割合を算出した。そして、8時間反応した場合のHTF-Asn-CHOの加水分解物のモル数と、このとき用いた酵素量により8時間で分解され得るHTFのモル数を算出したところ、ENGHSα2のHTF-Asn-CHOへの作用はHTFへの作用よりも低く、約1%であった。従って、ENGHSα2の糖アスパラギンへの作用は低いものと考えられた。
（糖鎖転移活性）
　HTF-Asn-CHO溶液0.5 μlに1 M糖鎖受容体1.25 μl、滅菌水0.25 μlそして酵素溶液0.5μlを加えたものを37℃にて24時間インキュベートし、TLCに供し、加水分解物と糖鎖転移生成物を検出した。その結果、ENGHSα2のグルコースへの糖鎖転移生成物が検出されたが、ガラクトースとN-アセチルグルコサミンへの糖鎖転移生成物は検出されなかった。また、グルコースへの糖鎖転移活性も低かった。
実施例４：10μM IPTGを用いたHisタグ付加組換えエンドHSα2の発現とその精製
（大腸菌の培養）
　ストックＡ由来の細胞をカナマイシン添加液体培地(1% NaCl, 1%ポリペプトン, 0.5%乾燥酵母エキス, 0.1 mg/mlカナマイシン, pH 7.0)2 mlに植継ぎ、37℃にて180 rpmで１時間振盪培養を行った。この培養液20μlを、カナマイシン添加液体培地200 mlが入った坂口フラスコに移し、37℃にて180 rpmで、OD600の値が0.45付近となるまで培養した。OD600の値が0.45となった時点で、５本の坂口フラスコに200 mM IPTG(滅菌蒸留水溶液中)を1mlずつ加え、20℃にて180 rpmで２時間振盪培養を行った。得られた培養液を４℃にて6,000 rpmで５分間遠心分離し、上清を除き、菌体ペレットを得た。
（Lysateの調製）
　培地1L由来の菌体ペレットを等分し、それぞれに1mM PMSFを含む冷Lysis Buffer 40 ml(50mM リン酸カリウム、400 mM NaCl, 100mM KCl, 10%グリセロール, 0.5% Triton X-100, 10mM イミダゾール)を加え、懸濁し、－70℃で凍結した後、室温にて融解を一度行った。その後、Sonifier 250(ブランゾン)を用いて、低温に保ちながらOut put control 1, Duty cycle Constantで30秒間の超音波処理を４回行い、菌体から発現タンパク質の抽出を行った。得られた抽出溶液を４℃において12,000 rpm、10分間遠心分離し、上清80 mlをフラスコに移し、粗酵素画分とした。
（カラムクロマトグラフィー）
　得られた粗酵素画分をカラム緩衝液(0.3% CHAPS, 0.3M NaCl, 10mMイミダゾール, 50mM Na,K-リン酸緩衝液, pH 7.5)で緩衝化したCo2+ Profinity IMAC Resinカラム(φ1.5 x 2.8 cm)に負荷し、素通り画分を集めた。これを、１％CHAPSを含む10mM Na,K-リン酸緩衝液, pH 7.5で緩衝化したDEAE-Toyopearl 650Sカラム(φ1.72 x 12.5 cm)を用いるクロマトグラフィー(０～0.4M NaClの直線濃度勾配溶出、流速1.7ml/min)に付し、素通り画分を集めた。これを、カラム緩衝液(0.3% CHAPS, 0.3M NaCl, 10mMイミダゾール, 50mM Na,K-リン酸緩衝液, pH 7.5)で緩衝化したNi2+ Profinity IMAC Resinカラム(φ1.5 x 2.8 cm)を用いるクロマトグラフィー(流速1ml/min)に付し、素通り画分を集めた。
　この素通り画分10μlとSDS-PAGEサンプル処理液10μlと混合し、95℃にて３分間インキュベートした。これを12.5%ゲルによるSDS-PAGEに供した。また、CO2+ Profinity IMAC Resinカラムクロマトグラフィーの吸着溶出画分と、Lysateの10μlをSDS-PAGEに供した。
　その結果、分子量170kの発現酵素タンパク質のバンドはわずかであった。その代わり、分子量116kのタンパク質バンドが検出された。一方、Lysate中からは分子量170kの発現酵素タンパク質のバンドと116kのタンパク質バンドが検出された。また、CO2+ Profinity IMAC Resin吸着溶出画分中には117kの発現酵素タンパク質のバンドが存在した。
　上記の結果から、10μM IPTG存在下、37℃で17時間ゆっくりとした発現誘導で生成したHisタグ付加組換えエンドHSα2は精製の過程で著しく失活しなかったが、CO2+ Profinity IMAC Resinカラムクロマトグラフィーの非吸着画分に活性の大部分が存在することがわかった。この画分には、N末端側の膜貫通領域付近でプロテオリシスを受けたと考えられる分子量116kの酵素タンパク質が存在していた。これについて、本発明者は、精製の過程で大腸菌由来のプロテアーゼによって部分消化を受けた可能性を考えた。そこで、膜貫通領域を欠失したエンドHSα2の発現系を構築した。
実施例５：組換えエンドHSα2発現系の構築
　ストックＡ由来の細胞から得られたプラスミドから、インバースPCRによってタグ領域と膜貫通領域を除いた産物を調製した。使用したプライマーは、下記のプライマーHSα2 TM deletion FとプライマーpET-50b(+)1Rである(表４)。この反応では、KOD -Plus- Mutagenesis Kit(Toyobo)に含まれる試薬を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　反応後、PCR反応液中のテンプレートであるプラスミドを分解するため、反応液20 μlとDpn Ｉ(10 u/μl)0.8 μlを混合し、37℃にて1時間インキュベートした。PCR産物のセルフライゲーションを行うために、Dpn Ｉ消化物2 μl、滅菌水7 μl、Ligation High 5 μlそしてT4 Polynucletide Kinase(5 u/μl)1 μlを混合し、16℃にて1時間インキュベートした。あらかじめ1.5 mlチューブに分注されている発現用E. coli BL21(DE3) Competent Cells （Novagen）懸濁液20 μlを氷中で融解し、上記のライゲーション反応液1 μlを加え、穏やかに混合した。5分間氷冷し、42℃の恒温槽で30 秒間インキュベートした後、2 分間氷冷した。そしてSOC Medium 280 μlを加え、37℃にて180 rpm、１時間振盪培養を行った後、0.01% Kanamycinを含むLB寒天培地（1% NaCl, 1% Polypeptone, 0.5% Yeast extract, 2% Agar、pH 7.0）にまき、37℃で一晩培養した。培養した細胞を－70℃でグリセロールストック(ストックＢ)した。
実施例６：10μM IPTGを用いた組換えエンドHSα2の発現とその精製
（大腸菌の培養～カラムクロマトグラフィー）
　ストックＢ由来の細胞を上記と同様にして培養し、菌体ペレットを得、次いで、冷Lysis Bufferの組成を50mMリン酸カリウム, 10%グリセロールに変更したこと以外は上記と同様にして、粗酵素画分80mlを得た。得られた粗酵素溶液に１規定の水酸化ナトリウムを添加し、pH 9.0付近に調整した。これを0.3% CHAPS, 1mM PMSF, 5mM EDTAを含む10mM Tris-HCl pH 9.0で緩衝化したQ-Sepharose FF(φ1.5 x 2.8 cm)に負荷し、素通り画分を集めた。得られた素通り画分を、限外濾過器を用いて濃縮し、これを0.3% CHAPSと0.15M NaClを含む10mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.8で緩衝化したSephacryl S-200HR(φ2.2 x 73 cm)に負荷し、流速15ml/minにてクロマトグラフィーを行い、活性画分を集めた。限外濾過器を用いてこれを濃縮し、これを0.3% CHAPSと0.15M NaClを含む10mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.8で緩衝化したSephacryl S-200HR(φ2.2 x 73 cm)を用いるクロマトグラフィー(流速15ml/min)に付した。その結果、タンパク質のピークが２つ検出されたが、実施例１と同様にして酵素活性測定を行ったところ、酵素活性は２つめのタンパク質ピークから検出された。活性画分を集め、酵素溶液とした。
　酵素溶液10μlとSDS-PAGEサンプル処理液10μlとを混合し、95℃にて３分間インキュベートした。これを12.5%ゲルによるSDS-PAGEに供した。その結果、分子量108k単一タンパク質バンドとして組換えエンドHSα2が検出された。活性の回収率は41.8%で、15900 Uとなった。また、約7.8 mgの精製組換えエンドHSα2が得られた。
実施例７：組換えエンドHSα2の糖鎖遊離活性
（CHAPSの除去）
　上記のようにして得られた精製組換えエンドHSα2の溶液2 mlを透析チューブに入れ、10 mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.8 200 mlに対して４時間透析を行った。同様の透析をさらに４回行った。
（CHAPS除去後の活性）
　得られた酵素溶液を、0.3% CHAPSを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.8で希釈し、活性を測定した。その結果、透析によるCHAPS除去前後での活性はそれぞれ4,463 U/ml、4,150 U/mlであり、活性の変化は認められなかった。しかし、CHAPS除去後の酵素をCHAPSを含まない同緩衝液で希釈後、活性を測定したところ、1,294 U/mlにまで活性が低下した。従って、酵素溶液からCHAPSを除去しても、酵素の失活は認められないが、酵素希釈時にCHAPSが存在しないと、活性が低下するものと考えられた。
（各種糖タンパク質への作用）
　上記のCHAPS除去により得られた酵素溶液を用い、エンドHSα2の各種糖タンパク質への作用を調べた。基質としてHTF、ヒトラクトフェリン(HLF、シグマ)、ウシフェツイン(タカラバイオ)、ヒトα1-酸性糖タンパク質(α1-AG、シグマ)、ヒツジIgG(シグマ)、オボアルブミン(OVA、太陽化学)及びRNaseB溶液(シグマ)(いずれも0.5 mg/ml 0.1M Na,K-リン酸緩衝液, pH 6.8)を用いた。これらの基質の溶液10μlに酵素溶液1μl(4,150 U/ml)を加えた混合液を、37℃で０分間、30分間、２時間及び20時間インキュベートし、SDS-PAGEサンプルバッファー11μlを加え、反応を停止した。それぞれの反応液全量をSDS-PAGEに供した。
　結果を図２Ａ～Ｃに示す。コンプレックス型糖鎖を有するHTF、HLF、フェツイン及びα1-AGは、基質分子からの糖鎖の除去に伴って低分子化した基質のバンドが経時的に生成した(図２Ａ及び２Ｂ)。また、ヒツジIgGのH鎖でも同様であった。一方、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖を有するOVA及びRNaseBでは基質のバンドは低分子化せず、糖鎖は遊離しなかった(図２Ｃ)。上記の基質からは、それぞれ下記の表５に示される糖鎖が遊離したと考えられる。なお、表５中、「Sia」は、シアル酸である。また、表５のHLF、α1-AG、ヒツジIgGの模式図に示された短い太線は、コアフコースを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記の結果から、エンドHSα2は、エンドHSと同様にコンプレックス型糖鎖を有する糖タンパク質に特異的に作用し、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖を有する糖タンパク質には作用しないと考えられた。
実施例８：組換えエンドHSα2の糖鎖転移活性
　組換え発現エンドHSα2 (377 U/ ml)の糖鎖転移作用を調べた。ヒトトランスフェリンから調製した、2本鎖コンプレックス型糖鎖の糖アスパラギン（HTF Asn CHO(2-C)、3.72 mM 0.75 mM）を糖鎖供与体として、1 M グルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)およびN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を糖鎖受容体として用いた(表６)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　HTF-Asn-CHO溶液0.5 μlに1 M糖鎖受容体1.25 μl、滅菌水0.25 μlそして酵素溶液0.5μlを加えたものを37℃にて24時間インキュベートした。反応液をシリカゲル60（メルク社）の薄層プレートに負荷し、折りたたんだ濾紙（ワットマン3MM）をプレート上端にクリップで付け、展開溶媒（1-プロパノール：酢酸：水、3：3：2）によって37℃において20時間展開した。乾燥した後、オルシノール硫酸混合溶液を噴霧し、110℃において15分間加熱して反応生成物の発色を行なった。
　その結果、糖鎖受容体(R)よりも大きいサイズの糖鎖転移反応生成物(図３中、Tの位置と同程度の高さに記された４つの矢印で表される)を確認した。なお、「H」と同程度の高さに表されるのは糖鎖受容体が加水分解を受けて生成した加水分解生成物と考えられる。組換え発現エンドHSα2は、ヒトトランスフェリンから調製した、2本鎖コンプレックス型糖鎖の糖アスパラギンから、グルコース、ガラクトースそしてN-アセチルグルコサミンに転移し、矢印で示した糖鎖転移反応生成物を生成した(図３)。
実施例９：組換えエンドHSα2の結晶化
（大腸菌の培養）
　ストックＢ由来の細胞をカナマイシン添加液体培地(１％ NaCl, 1%ポリペプトン, 0.5%乾燥酵母エキス, 0.1 mg/mlカナマイシン, pH 7.0)2mlに植継ぎ、37℃において180rpmで１時間振盪培養を行った。この培養液20μlを、カナマイシン添加液体培地200 mlが入った坂口フラスコに移し、37℃において180rpmで18時間振盪培養を行った。さらに、この培養液2 mlを、カナマイシン添加液体培地200 mlが入った坂口フラスコ12本にそれぞれ写し、37℃において180rpmで、OD600の値が0.45付近となるまで約１時間培養した。OD600の値が0.45となった時点で、11本の坂口フラスコに2mM IPTG(滅菌蒸留水溶液中)を終濃度10μMとなるように1mlずつ加え、20℃にて180rpmで20時間振盪培養を行った。得られた培養液を４℃において6,000 rpm、５分間遠心分離した。上清を除き、菌体ペレットを得た。
（Lysateの調製）
　得られた菌体ペレットを以下の方法で溶菌させ、発現タンパク質の抽出を行った。すなわち、培地2.2 L由来の菌体ペレットを４等分し、それぞれに1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 2μM E-64を含む冷Lysis Buffer 45 ml(10 mM Na,K-リン酸緩衝液 pH 6.5)を加え、懸濁し、－70℃で凍結した後、室温にて融解を行った。その後、Sonifier 250(ブランゾン)を用いて、低温に保ちながらOut put control 2, Duty cycle constantで30秒間の超音波処理を６回行い、菌体から発現タンパク質の抽出を行った。得られた抽出溶液を４℃において12,000 rpm, 10分間遠心分離し、上清をフラスコに移し、得られた180 mlを粗酵素画分とした。
（硫安分画）
　粗酵素画分に硫酸アンモニウムを40%飽和になるよう低温に保ちながら加えた。脱気後、４℃で４時間置いた後、４℃において14,000 rpm、10分間遠心分離した後、上清画分に硫酸アンモニウムを70％飽和になるよう低温に保ちながら加えた。脱気後、再び４℃で４時間置いた後、４℃において14,000 rpm、10分間遠心分離し、沈殿画分を得た。この沈殿画分を、25%硫酸アンモニウムを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液, pH 6.5に懸濁し、再び４℃において14,000 rpm、10分間遠心分離し、得られた上清画分24 mlを硫安分画画分とした。
（カラムクロマトグラフィー）
　得られた酵素溶液を、25％飽和の硫酸アンモニウムと5 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液, pH 6.5で緩衝化したButyl-Toyopearl 650Sカラム(φ1.27 x 9.4 cm)に負荷した。同緩衝液50mlをカラムに通じた後、30％～０％の直線濃度勾配溶出(100 ml-100 ml)を行い、溶出液を流速1.7 ml/minにて5 mlずつ分画し、活性が検出されたフラクションを集めた。
　上記のフラクションを、5 mM EDTAを含む2Lの10 mM Tris-HCl緩衝液, pH 8.4に対し透析を行い、外液を４回交換し硫酸アンモニウム濃度を下げた。得られた透析内液を5 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液, pH 8.4で緩衝化したDEAE-Toyopearl 650Sカラム(φ0.9 x 7.4 cm)に負荷した。同緩衝液20 mlをカラムに通じた後、０～0.3 M NaClの直線濃度勾配溶出(100 ml-100 ml)を行い、活性画分を得た。限外濾過器を用いてこれを濃縮し、5mM EDTAと0.15 M NaClを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.5で緩衝化したSephacryl S-200HR(φ2.0 x 81 cm)を用いるクロマトグラフィー(流速15 ml/min)に付し、活性画分を集め、これを酵素溶液とした。
　限外濾過器を用いて酵素溶液を濃縮し、これを5 mM EDTAと0.15 M NaClを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.5で緩衝化したToyopearl HW-55F(φ1.6 x 84 cm)に負荷し、流速15ml/minにてクロマトグラフィーを行い、得られた活性画分の一部を集め精製酵素溶液とした。また、活性画分の一部を集め酵素標品とした。
　限外濾過器を用いて酵素溶液を濃縮し、これを5 mM EDTA及び0.15M NaClを含む10mM Na,K-リン酸緩衝液pH 6.5で緩衝化したSephacryl S-200HR(φ2.2 x 73 cm)に負荷し、流速15 ml/minにてクロマトグラフィーを行い、得られた活性画分を集め、上記の精製酵素溶液と合わせ、精製酵素標品とした。
　精製酵素標品10μlとSDS-PAGEサンプル処理液10μlとを混合し、95℃にて３分間インキュベートした。これを15％ゲルによるSDS-PAGEに供した。
　その結果、純度98％で、エンドHSα2の遺伝子から推定される分子量と同じ分子量108kのタンパク質バンドが検出された。活性の回収率は50.7％で、348,000 Uの酵素が得られた。比活性は71倍に上昇し、約13,000 U/mgの精製酵素タンパク質が約28 mg得られた。
　限外濾過器を用いて酵素溶液を約10 ml以下に濃縮し、0.1M NaClを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液 pH 6.5を50 ml加え、再び10 ml以下に濃縮した。この操作をさらに２回行い、緩衝液を置換した後、限外濾過器を用いてA280が約10になるように濃縮した。遠心分離により沈殿を除去した結果、A280は9.87となった。なお、タンパク質の定量は、E1% 280の値を10と仮定し、タンパク質溶液の280 nmにおける吸光度を測定することにより行った。また、比活性は、酵素単位(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)で割った値で示した。得られた濃縮液を以下の結晶化に供した。
（結晶化条件）
　結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて行った。すなわち、サンプルカップ(サンプラテック, 9-A, 0.5 ml)の淵に高真空用グリース(東レ・ダウコーティング)を薄く塗り、結晶化剤を100μl加えた。カバーグラス(松浪ガラス、18 x 18 mm)をシリコン(Auqasil, サーモサイエンティフィック)の0.5％水溶液に入れ、蒸留水で洗った後、封函してシリコンコーティングを行った。シリコンコーティングしたカバーグラス上で酵素溶液2μlとサンプルカップから得た結晶化剤2μlを混合した後、カバーグラスを裏返してサンプルカップにかぶせて密閉した。なお、結晶化は20℃で行った。
（Crystal Screen HTを用いた結晶化）
　結晶化剤としてCrystal Screen HT(ハンプトンリサーチ) No. 15(0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5及び10% w/v ポリエチレングリコール8,000)を用い、上記の基本条件を用いて結晶化を行った。その結果、立方体状の結晶が得られた(図４)。
実施例１０：微生物の同定
　次に、本発明者は、本発明の酵素を産生する微生物種を同定するために以下の実験を行った。
　まず、ヒトトランスフェリン(シグマ社)を基質として用いて、Ｎ結合型の糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を遊離させる活性を有するものとして、ヒトの唾液中および尿中に剥離してくる上皮細胞および血球系細胞の組織から1000株の菌体を分離した。分離した菌体の16s rRNA遺伝子の塩基配列を当業者に公知の塩基配列データベースNCBI(The National Center for Biotechnology Information)と比較した。その結果、分離した菌体のうち1株の菌体がラクトバシラス・ファーメンタム、残りの1株の菌体がプレボテラ・ビビアと同定された。
　また、ATCC 25845として入手可能なプレボテラ・メラニノゲニカ株も糖鎖遊離活性を示すことを下記の方法により明らかにした。まず、ヒトトランスフェリン溶液（シグマ社製のものを0.2ｍg/mlになるよう0.2Mリン酸緩衝液、ｐＨ6.5に溶解したもの）5マイクロリットルと、GAM培養液を用いて培養したプレボテラ・メラニノゲニカの菌体懸濁液および菌体を1％サルコシルで可溶化した超遠心上清5マイクロリットルを混合し、37℃において24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトトランスフェリンを分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した(データ示さず)。
実施例１１：微生物の培養
　上記のようにして同定したラクトバシラス・ファーメンタムおよびプレボテラ・ビビア、ならびにプレボテラ・メラニノゲニカの３種の菌株を、それぞれＧＡＭブイヨン液体培地（ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」・1リットル中ペプトン10.0g、ダイズペプトン3.0g、プロテオーゼペプトン10.0g、消化血清末13.5g、酵母エキス5.0g、肉エキス 2.2g、肝臓エキス 1.2g、ブドウ糖3.0g、リン酸二水素カリウム2.5g、塩化ナトリウム 3.0g、溶性デンプン5.0g、L-システイン塩酸塩0.3g、チオグリコール酸ナトリウム0.3g、.pH7.1±)中で4日間、37℃で静置培養した。得られた2000mLの培養液を、それぞれ培養物ＬＢ、培養物ＰＢおよび培養物ＰＭと命名した。
　ヒトトランスフェリン溶液（シグマ社製のものを0.2ｍg/mlになるよう0.2Mリン酸緩衝液、ｐＨ6.5に溶解したもの）5マイクロリットルと、培養物ＬＢ、ＰＢおよびＰＭの懸濁液5マイクロリットルとをそれぞれ混合し、37℃において24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトトランスフェリンを分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。これらの培養物ＬＢ、ＰＢおよびＰＭは、それぞれ7、6.5及び6のｐＨで最適化された糖鎖遊離活性を示すことがわかった。
　得られた培養物の培養上清および該培養物を培養物ＬＢはCHAPS(［3-（3-cholamidepropyl）dimethylammonio-1-propanesulphonate)で、培養物ＰＢおよび培養物ＰＭはサルコシルで可溶化した可溶化物を用いて、糖鎖遊離活性について更に詳細に調べた。
実施例１２：ラクトバシラス・ファーメンタム培養物の糖鎖遊離活性
　糖鎖PAES-Asn-OVA-GP-V ([2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシナミル酸5-ノルボルネン-2、3-ジカルボキシイミドエステルOVA-GP-V)を、オボアルブミン（太陽化学より入手）を用いて沸騰水中で加熱変性した後、プロナーゼE(科研製薬)を加えて、37℃にて2日分解反応を行ない、反応液をセファデックスG-25、G-50のカラムに負荷して、ペプチド画分と糖アスパラギン画分を分離した。得られた糖ペプチド画分をDowex50W-X2のカラムに負荷し、糖アスパラギンを5つの画分に分離した。そして、それぞれの画分をOVA-GP-I、OVA-GP-II、OVA-GP-III、OVA-GP-IV、OVA-GP-Vとした。このうちOVA-GP-Vを[2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシナミル酸5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミドエステル(PAES)水溶液と混合し、ｐＨ9にて37℃において3時間暗所で反応を行なった。反応液をセファデックスG-25のカラムクロマトグラフィーに供し、PAESと結合したOVA-GP-Vを分離した。
　そして、陰性対照としてのPAES-Asn-OVA-GP-V (図５Ｂ、レーン１)、陽性対照としてのPAES-Asn-OVA-GP-VおよびエンドFVの反応生成物(レーン２)、上記のようにして得られた糖鎖PAES-Asn-OVA-GP-Vおよび培養物ＬＦの培養上清の反応生成物(レーン３)、ならびに糖鎖PAES-Asn-OVA-GP-Vおよび培養物ＬＦの懸濁液の反応生成物(レーン４)を用いて薄層クロマトグラフィーを行い、糖タンパク質から糖鎖が遊離したかどうかを調べた。ここで、「エンドFV」とは、フラムリナ・ヴェルティペス(Flamulina velutipes；エノキダケ)のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼである。
　結果を図５Ｂに示す。図５Ｂから、培養上清を用いた場合および菌体懸濁液を用いた場合のいずれにおいても、それらが糖鎖のキトビオース間を加水分解する糖鎖遊離活性を有することが示された。この結果から、本発明のラクトバシラス・ファーメンタム株が、菌体結合型および分泌型のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを産生していることが強く示唆された。
実施例１３：ヒトトランスフェリンに対する培養物ＬＦの糖鎖遊離活性
　次に、培養物ＬＦのヒトトランスフェリンへの作用を調べた。ヒトトランスフェリン溶液（シグマ社製のものを0.2ｍg/mlになるよう0.2Mリン酸緩衝液、ｐＨ6.5に溶解したもの）5マイクロリットルとラクトバシラス・ファーメンタムの培養物ＬＦの培養上清または培養菌体懸濁液5マイクロリットルを混合し、37℃において0、0.5、2、4および24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。反応液停止液を95℃において3分間加熱した後、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトトランスフェリンを分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。
　その結果、培養物ＬＦの培養上清を用いた場合(Endo LF-f)および培養物ＬＦの可溶化物を用いた場合(Endo LF-b)のいずれにおいても、66 Mr-3～97 Mr-3の間に３つのバンドが現れ、０時間の時点においては97 Mr-3に最も近い位置に存在するバンドが最も濃く、時間が経つにつれて真ん中の位置にバンドがシフトし、更に時間が経つと66 Mr-3に最も近い位置にバンドがシフトした(図６Ｂ)。この結果は、ヒトトランスフェリンに結合した分子量約2,000の糖鎖が、時間が経つにつれてヒトトランスフェリンから遊離していくことを示す。すなわち、この結果は、培養物ＬＦの培養上清および可溶化物のいずれもが、ヒトトランスフェリンに対して糖鎖遊離活性を有することを示している。
実施例１４：ヒトα1-酸性糖タンパク質に対する培養物ＬＦの糖鎖遊離活性
　更に、培養物ＬＦのヒトα1-酸性糖タンパク質への作用を調べた。0.2Mリン酸緩衝液, ｐＨ6.5に溶解し、0.5ｍg/mlとしたヒトα1-酸性糖タンパク質溶液（シグマ社製）5マイクロリットルとラクトバシラス・ファーメンタムの培養上清または培養菌体懸濁液5マイクロリットルを混合し、37℃において0、0.5、2、4および24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、12.5％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトα1-酸性糖タンパク質を分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。
　その結果、培養物ＬＦの培養上清を用いた場合(Endo LF-f)および培養物ＬＦの可溶化物を用いた場合(Endo LF-b)のいずれにおいても、31 Mr-3～45 Mr-3の間に３つのバンドが現れ、０時間の時点においては45 Mr-3に最も近い位置に存在するバンドが最も濃く、時間が経つにつれて31 Mr-3の位置に向かって徐々に５段階でバンドがシフトした(図７Ｂ)。この結果は、ヒトα1-酸性糖タンパク質に結合していた、コアフコースを有する２～５本鎖のコンプレックス型の糖鎖５つが、時間が経つにつれてヒトα1-酸性糖タンパク質から遊離していくことを示す。すなわち、この結果は、培養物ＬＦの培養上清および可溶化物のいずれもが、ヒトα1-酸性糖タンパク質に対して糖鎖遊離活性を有することを示している。
実施例１５：ヒトトランスフェリンに対するプレボテラ・ビビア培養物の糖鎖遊離活性
　培養物ＰＢのヒトトランスフェリンへの作用を調べた。0.2Mリン酸緩衝液、ｐＨ6.5に溶解し、0.2ｍg/mlとしたヒトトランスフェリン（シグマ社製）溶液5マイクロリットルと、プレボテラ・ビビアの培養菌体から1％サルコシルで可溶化した遠心上清を2倍ずつ濃度が濃くなるようにした溶液（それぞれ酵素濃度が1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍。0は酵素無し。）5マイクロリットルを混合し、37℃において16時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトトランスフェリンを分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。
　その結果、培養物ＰＢ可溶化物の濃度が高くなればなるほど、０倍のときのバンド位置よりも低分子量の位置にバンドがシフトしていくことがわかった(図８)。この結果は、ヒトトランスフェリンに結合していた、末端側にシアル酸を含む２本鎖分岐の糖鎖が遊離したことを示す。したがって、この結果は、培養物ＰＢの可溶化物が、ヒトトランスフェリンに対して糖鎖遊離活性を有することを示している。
実施例１６：プレボテラ・メラニノゲニカ培養物の糖鎖遊離活性
　培養物ＰＭの蛍光標識ヒトトランスフェリン糖アスパラギンPAES-HTF Asn-CHO ([2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシナミル酸5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミドエステルHTF－Asn-CHO)への作用を調べた。ヒトトランスフェリン（シグマ社より購入）を沸騰水中で加熱変性した後、プロナーゼE(科研製薬)を加えて、37℃にて2日分解反応を行ない、反応液をセファデックスG-25、G-50のカラムに負荷して、ペプチド画分と糖アスパラギン画分を分離した。得られた糖ペプチド画分を[2-(2-ピリジルアミノ)エチル]スクシナミル酸5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミドエステル(PAES)水溶液と混合し、ｐＨ9にて37℃において3時間暗所で反応を行なった。反応液をセファデックスG-25のカラムクロマトグラフィーに供し、PAESと結合したHTFAsn-CHOを分離した。
　蛍光標識糖アスパラギンPAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＰＭ沈殿物の反応生成物、PAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＰＭ培養上清の反応生成物、ならびにPAES-HTF Asn-CHOおよび培養物ＰＭ可溶化物の反応生成物の薄層クロマトグラフィーを行い、糖タンパク質から糖鎖が遊離したかどうかを調べた。
　その結果、上記反応生成物のいずれにおいても、陰性対照としてのPAES-HTF Asn-CHOおよび水の混合物ではなく陽性対象としてのPAES-HTF Asn-CHOおよびエンドHSの混合物と同じ位置にスポットが現れた(図９Ｂ)。この結果は、上記反応生成物に、糖鎖PAES-HTF Asn-CHOのキトビオース間が加水分解されることによって生成したPAES-Asn-GlcNAcが含まれることを示す。この結果から、本発明のプレボテラ・メラニノゲニカ株が、菌体結合型および分泌型のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを産生していることが強く示唆された。
実施例１７：ヒトトランスフェリンに対する培養物ＰＭの糖鎖遊離活性
　次に、培養物ＰＭのヒトトランスフェリンへの作用を調べた。ヒトトランスフェリン溶液（シグマ社製のものを0.2 mg/mlになるよう0.2Mリン酸緩衝液、pH 6.5に溶解したもの）5マイクロリットルと、プレボテラ・メラニノゲニカの培養菌体懸濁液を2倍ずつ濃度が濃くなるようにした溶液(酵素濃度が1倍、2倍、4倍、8倍。0は酵素なし。)5マイクロリットルを混合し、37℃において24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトトランスフェリンを分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。
　その結果、培養菌体懸濁液において２段階のバンドが現れ、酵素濃度が１倍に近づけば近づくほど低分子量の位置にバンドがシフトすることが明らかとなった(図１０)。この結果は、ヒトトランスフェリンに結合していた、末端側にシアル酸を含む２本鎖分岐の糖鎖が遊離したことを示す。したがって、培養物ＰＭ懸濁液がヒトトランスフェリンに対して糖鎖遊離活性を有することが示された。
実施例１８：ヒトα1-酸性糖タンパク質に対する培養物ＰＭの糖鎖遊離活性
　更に、培養物ＰＭのヒトα1-酸性糖タンパク質への作用を調べた。0.2Mリン酸緩衝液、ｐＨ6.5に溶解し、0.5ｍg/ml としたヒトα1-酸性糖タンパク質（シグマ社製）溶液5マイクロリットルとプレボテラ・メラニノゲニカの培養菌体懸濁液を2倍ずつ濃度が濃くなるようにした溶液(酵素濃度が1倍、2倍、4倍、8倍。0は酵素なし。)5マイクロリットルを混合し、37℃において24時間反応を行ない、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気用サンプルバッファーを10マイクロリットル加え反応を停止した。そして、95℃において3分間加熱した後、12.5％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、糖鎖の遊離したヒトα1-酸性糖タンパク質を分離し、分離したタンパク質をクマジーブリリアントブルーによって染色した。
　その結果、５段階のバンドが現れ、酵素濃度16倍から１倍に向かって低分子量側にバンドがシフトしていくことが明らかとなった（図１１）。この結果は、ヒトα1-酸性糖タンパク質に結合していた、コアフコースを有する２～５本鎖のコンプレックス型の糖鎖が遊離したことを示す。したがって、培養物ＰＭ懸濁液がヒトα1-酸性糖タンパク質に対して糖鎖遊離活性を有することが示された。
実施例１９：エンドPMα発現系の構築
　本発明者は、ヒト唾液α-アミラーゼの糖鎖不全分子種の生成機構の研究過程で、コンプレックス型糖鎖に特異的に作用するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを発見し、精製している。そして、これをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHS（エンドHS）と命名した。
　また、エンドHSの遺伝子のクローニングに関する研究を行う過程で、本発明者は、エンドHSの遺伝子ホモログと考えられる複数の遺伝子をクローニングしている（実施例１を参照）。これらの遺伝子は上流よりα、β およびγ の3つのグループに分けられ、ゲノム上でこれら3遺伝子がタンデムに並んだクラスター構造をとっている。遺伝子の相同性解析により、その遺伝子構造はグラム陰性Prevotella melaninogenicaの遺伝子と高い相同性を示し、エンドHSと同様にα、βおよびγの３つのグループがタンデムに並んだクラスター構造を有することを明らかにしている。このP. melaninogenicaが有するエンドHSα、βおよびγに相当するタンパク質をそれぞれエンドPMα、βおよびγと命名し、大腸菌を宿主とするエンドPMα発現系の構築を当業者に公知の方法に従って行った。
　すなわち、ミニプレップアルカリ法を用いて、プラスミドpET23a(+)を有する大腸菌からpET23a(+)を抽出した。次に、抽出したpET23aを制限酵素BamHIおよびSalIにより消化した。また、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、ならびに配列番号２５および２６の塩基配列を有するプライマーを用いるPCR法によりそれぞれ増幅した配列番号２、４および６の配列を含むDNAフラグメントを制限酵素BamHIおよびSalIにより消化した。消化したpET23a(+)およびDNAフラグメントをライゲーションハイ(タカラバイオ)を用いてそれぞれライゲーションし、組換えベクターを得た。得られた組換えベクターを大腸菌細胞DH5αにそれぞれ導入した。
　大腸菌形質転換体の糖鎖遊離活性は、以下のようにして確認した。基質としてヒトトランスフェリン（HTF）溶液（0.2 mg/ml 0.2 M Na,K リン酸緩衝液、pH 6.2）5 μlに酵素液5 μlを加え、37℃でインキュベートし、SDS-PAGEサンプル処理液を10 μl加え反応を停止した。そして、95℃にて3分間加熱処理した後、7.5％のポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEに供した。泳動後、固定液(50% メタノール、10% 酢酸)中で15分間振盪し、CBB(1.45％ 過塩素酸、0.04% CBB R250)染色を行った後、脱色してバンドを検出した。糖鎖を失い低分子化したHTFのバンドと未反応のHTFのバンドをプリントグラフ（Atto Lane & Spot Analyzer 6.0）を用いて定量し、反応生成物量を算出した。なお、1分間に1 μgのHTFから糖鎖を遊離する酵素量を1単位とした。
　ミニプレップアルカリ法を用いてDH5からプラスミド抽出を行った。形質転換DH5をグリセロールストックからつまようじで0.1% アンピシリンNaを含むLB液体培地(1% NaCl, 1% ポリペプトン, 0.5% 乾燥酵母エキス）2 mlに植継ぎ、37℃において180 rpmで18時間振盪培養した。培養液1.5 mlを1.5 mlチューブに移し、室温にて13,000 rpmで30秒間遠心（Kokusan、H-1300）し、上清を捨て、菌体にSol. I (50 mM Glucose、25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM EDTA）100 μlを加えボルテックスで混合し、1分間氷冷した。次に、Sol. II (0.2 N NaOH、1% SDS) 200 μlを加え軽く混合し、氷中で5分間インキュベートした後、Sol. III (3 M酢酸Na pH 5.3) 150 μlを加え軽く混合し、氷中で5分間インキュベートした。そして、4℃において12,000 rpm、10分間遠心（Sakuma、M201-IVD、50F8A-E24L）し、上清400 μlを新しいチューブに移し、1 mlの99%冷エタノールを加え軽く混合し、4℃において12,000 rpm、5 分間遠心（Sakuma、M201-IVD、50F8A-E24L）し、上清を除去した。沈殿に200 μlのSol. IV（100 mM酢酸Na,50 mM Tris-HCl pH 7.5）を加え、ボルテックスミキサーで撹拌し溶解した。そして、99%冷エタノール500 μlを加え軽く混合し、4℃において12,000 rpmで5 分間遠心(Sakuma、M201-IVD50F8A-E24L)し、沈殿に70%冷エタノール500 μlを加え、3 分間遠心(Sakuma、M201-IVD50F8A-E24L)した。上清を除き風乾後、TE 20 μl に溶解した。これにRNaseA（Wako、2 μg/μl 10 mM Tris-HCl pH 7.5) 1 μlを加え、37℃において30分間反応させた。反応後、滅菌水79 μlおよびフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール25：24：1溶液100 μl（Sigma）を加え、ボルテックスミキサーでよく攪拌し、13,000 rpmで5 分間遠心(Kokusan、H-1300)した。そして、その上清95 μlをとり滅菌水5 μlを加え、これに3 M酢酸Na 10 μlおよび99%冷エタノール250 μlを加え、-70℃にて20 分間放置した後、4℃において12,000 rpmで20 分間遠心(Sakuma、M201-IVD50F8A-E24L)し、沈殿に70%冷エタノール500 μlを加え、4℃において12,000 rpmで5 分間遠心(Sakuma、M201-IVD50F8A-E24L)した。上清を除き風乾後、滅菌水20 μl に溶解した。
　抽出後、抽出液1 μlを1.0％アガロースゲル電気泳動（1％ L03，Takara、1× TAE Buffer）に供した。電気泳動後のゲルは、0.5 μg/mlのエチヂウムブロマイド（Wako）溶液中で15 分間振盪した。その後、ゲルに紫外線を照射（Atto、Printgraph）した。その結果、4500 bp長のバンドが検出された。目的のプラスミドはスーパーコイルをとっていると考えられるため、予想される6685 bpよりも短い長さの位置に泳動されるため、矢印で示した4500 bpのバンドがプラスミドと考えられた。
　発現用大腸菌BL21(DE3)（Novagen）の形質転換を行った。前述で調製した形質転換DH5αからミニプレップアルカリ法で回収したプラスミド抽出液2 μl を、あらかじめ1.5 mlチューブに50 μlずつ分注されているDH5α懸濁液に加え、穏やかに混合した。30 分間氷冷し、42℃の恒温水槽に30 秒間入れた後、2 分間氷冷した。これに、室温に戻しておいたSOC培地450 μlを加え、37℃において180 rpmで1 時間振盪後、LB+アンピシリンナトリウム寒天培地（1% NaCl、1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス　0.1%アンピシリンナトリウム、2% アガロース）に280 μlの培養液を撒き、37℃で18 時間培養した。生じたコロニーのうち10 個のコロニーを選び、一部をつまようじでとり、LB+アンピシリンナトリウム液体培地（1% NaCl、1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス　0.1% アンピシリンナトリウム）2 mlへ植え継ぎ、37℃において180 rpmで16時間振盪培養を行った。培養後、培養液1mlに80%グリセロールを200 μl加え、混合し、-70℃で保存した。
　これらをつまようじでとり、それぞれ2本ずつのLB+アンピシリンナトリウム液体培地（1% NaCl、1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス　0.1% アンピシリンナトリウム）2 mlに植継ぎ、37℃において180 rpmで一晩振盪培養を行った。この培養で増殖した7コロニーについて、それぞれの培養液20 μlを新しい0.1%アンピシリンナトリウムを含むLB液体培地2 mlにそれぞれ移し、37℃において180 rpmで、OD600＝0.4となるまで培養した。OD600＝0.4となった時点でそれぞれのコロニーについて1本の培養液に1 mM IPTGを20 μlずつ加え、発現誘導を行った。もう一方にはIPTGを加えず、非誘導コントロールとした。その後、37℃において180 rpm で4時間振盪培養を行い、発現誘導を行ったものとコントロールについて、培養液1.5 mlを1.5 mlチューブに移し、室温にて13,000 rpm、30 秒間遠心（Kokusan、H-1300）し、上清を捨て、菌体ペレットを得た。このようにして得られた菌体ペレットを-20℃にて保存し、以下の実験に供した。
　各菌体ペレットに冷Lysis Buffer（10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5、0.5％Triton X-100）500 μlを加え懸濁し、液体窒素と42℃の恒温槽を用いて凍結融解を4回繰り返し、菌体のLysateを得た。これを全Lysateとした。
　まず、全Lysateの活性を測定したところ、IPTGによる誘導にかかわらず、全Lysate中に活性が検出された。さらに、発現タンパクを調べた。すなわち、全Lysate 10 μlにSDS-PAGE サンプル処理液 10 μlを加え、95℃にて3 分間加熱処理した後、10％のポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEに供した。泳動後、固定液中で15分間振盪し、CBB染色を行った後、脱色してバンドを検出した。
　その結果、コントロールと比較して増加する、予想される発現エンドPMαの分子量113,209に相当するバンドが検出された。そこでこれらのうち、最も活性の高いコロニーを以下に記載する実施例２０および２１の実験に供した。
実施例２０：エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼＰＭの精製
　本発明者は、エンドＰＭの性質をより詳細に調べるため、エンドＰＭの精製を行った。上記の大腸菌を液体培地(1% NaCl, 1% ポリペプトン, 0.5% 乾燥酵母エキス, 0.1%アンピシリンナトリウム）2 mlに植継ぎ、37℃において180 rpmで1時間半振盪培養を行った。この培養液20 μlを、液体培地200 mlを入れた坂口フラスコに移し、37℃において180 rpmで18 時間振盪培養を行った。さらに、この培養液2 mlを、液体培地200 mlを入れた坂口フラスコ11 本にそれぞれ移し37℃において180 rpmで、OD600 ＝ 0.4付近となるまで2 時間培養した。OD600 ＝ 0.4となった時点で、11 本の坂口フラスコに1 mM IPTG(滅菌蒸留水溶液中)を終濃度10 μMとなるよう2 mlずつ加え、20℃にて180 rpmで18 時間振盪培養を行った。
　得られた培養液を4℃において6,000 rpm、10 分間遠心（Sakuma、50A-7、10B-N6）した。上清を除き、これに冷10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5を200 ml加え、懸濁し、4℃において6,000 rpm、10 分間遠心（Sakuma、50A-7、10B-N6）した。上清を除き、菌体ペレットを得た。このようにして得られた菌体ペレットを、同緩衝液に懸濁し、50 mlチューブに4等分になるように分注した。そして遠心した後、得られた菌体を冷凍した。
　そのうちの2本を以下の方法で溶菌させ、発現タンパク質の抽出を行った。すなわち、それぞれに1 mM PMSF、5 mM EDTAおよび2 μM E-64を含む冷Lysis Buffer 30 ml(10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5）を加え、懸濁した。その後、Sonifier 250（BRANSON）を用いて、低温に保ちながらOut put control 2 、Duty cycle Constantで30秒間の超音波処理を4回行い、菌体から発現タンパク質の抽出を行った。得られた抽出溶液を4℃において8,000 rpm、10分間遠心（Sakuma、M201-IVD、50F8A-E24L）し、上清をフラスコに移し、得られた86 mlを粗酵素画分とし、565,000Uの酵素を得た。こうして得られた画分を以下の精製に供した。
　粗酵素画分に硫酸アンモニウムを30%飽和になるよう低温に保ちながら加えた。脱気後、4℃で4時間置いた後、4℃において12,000 rpm、10分間遠心（Sakuma、50A-7、6B-N8）した。上清画分に硫酸アンモニウムを70%飽和になるよう低温に保ちながら加えた。脱気後、4℃で一晩置いた後、4℃において10,000 rpm、10分間遠心（Sakuma、50A-7、6B-N8）し、沈殿画分を得た。この沈殿画分を、30%硫酸アンモニウムと5 mM EDTAを含む10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5に溶解し、得られた画分141 mlを硫安分画画分とした。
　得られた酵素溶液を、30%飽和の硫酸アンモニウムと5 mM EDTAを含む10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 6.5で緩衝化したButyl-Toyopearl 650Mカラム(φ1.27x 9.4 cm)に負荷した。同緩衝液50 mlをカラムに通じた後、30%～0%の直線濃度勾配溶出（100 ml-100 ml）を行い、溶出液を5 mlずつ分画した。活性を示した２つの画分を、それぞれA画分およびB画分としてそれぞれ回収し、酵素溶液とした。
　A画分とB画分の酵素溶液を、5 mM EDTAを含む2 Lの10 mM Tris-HCl緩衝液、pH 8.5に対し透析を行い、外液を3回交換し硫酸アンモニウム濃度を下げた。得られた透析内液を5 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液、pH 8.5で緩衝化したDEAE-Toyopearl 650Sカラム(φ0.9x 7.4 cm)に負荷した。同緩衝液80 mlをカラムに通じた後、0～0.5 M NaClの直線濃度勾配溶出（100 ml-100 ml）を行い、溶出液を5 mlずつ分画した。
　その結果、A画分とB画分はいずれも溶出画分には酵素活性はほとんど検出されず、素通り画分にほとんどの酵素活性が検出された。そこで、活性が検出されたＡ画分由来およびＢ画分由来の素通り画分をそれぞれ102 ml(A画分由来)および94 ml(B画分由来)の酵素溶液とし、以下の精製に供した。
　限外濾過器(アドバンテック東洋 UHP-43，分子量20,000カット)を用いて、A画分由来およびB画分由来の酵素溶液をそれぞれ約5 mlに濃縮し、これを5 mM EDTAと0.15 M NaClを含む10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5で緩衝化したSephacryl S-200HR(φ2.0x 81.0 cm)に負荷し、クロマトグラフィーを行い、溶出液を5 mlずつ分画した。酵素活性が検出されたA画分由来およびB画分由来の画分をそれぞれ回収し、酵素溶液とした。
　限外濾過器(アドバンテック東洋 UHP-43，分子量20,000カット)を用いて、A画分由来およびB画分由来の酵素溶液をそれぞれ約4 mlに濃縮し、これを5 mM EDTAと0.15 M NaClを含む10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5で緩衝化したToyopearl HW-55F(φ2.6x 46.5 cm)に負荷し、クロマトグラフィーを行い、溶出液を5 mlずつ分画した。それぞれの活性フラクションを回収し、A画分由来およびB画分由来の精製酵素溶液とした。
　A画分由来の精製酵素溶液は回収率5.87％で、比活性は24,400 U/mgとなった。またB画分由来の精製酵素溶液は回収率0.485％で、比活性は2,560 U/mgとなった。精製酵素標品10 μlとSDS-PAGEサンプル処理液10 μlとを混合し、95℃にて3 分間インキュベートした。これを12.5％ゲルによるSDS-PAGEに供した。その結果、A画分およびB画分由来の精製酵素溶液中に含まれるタンパク質は、いずれも約113,000の分子量に相当する位置にシングルバンドを示し、いずれも精製されたエンドＰＭαを含んでいることが示された(図１２)。
実施例２１：エンドＰＭαの性質
(1)作用最適ｐＨ
　B画分由来の酵素溶液(1,630 U / ml)を用いて、蒸留水に溶解したHTF（0.4 mg/ml）を1 Mの各種緩衝液で希釈し0.2 mg/mlとしたものを基質溶液として反応させた。この時用いた緩衝液は、酢酸緩衝液pH 3.52、4.01、4.5、5.0、5.51、リン酸緩衝液pH 5.47、6.0、6.5、7.0、7.5、Tris-HCl pH 7.56、8.03、8.51、ホウ酸緩衝液pH 8.5、9.0、10.0であった。
　その結果、本酵素は広いpH領域で活性を示し、作用最適pHは8.5付近であった(図１３)。
(2)温度安定性
　B画分由来の酵素溶液(1,630 U / ml)を用いて、これを10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5+0.5％Triton X-100で1000倍希釈し、その5 μlを恒温槽で20、30、35、37、40、50、60、70℃において30分間インキュベートした後、これらにHTF溶液（0.2 mg/ml 0.2M Na,K-リン酸緩衝液、pH 6.2）5 μlを加え1時間反応させた。
　その結果、本酵素は40℃まで安定であった(図１４)。
(3)糖タンパク質への作用
　エンドPMαの各種糖タンパク質への作用を調べた。基質として用いた糖タンパク質のうち、ウシRNase B（0.2 mg/ml）、オボアルブミン（OVA 、0.2 mg/ml）、仔ウシフェツイン（0.5 mg/ml）、ヒトラクトフェリン（Plant発現）(0.5 mg/ml)、ウシラクトフェリン（BLF、0.5 mg/ml ）、ヒツジIgG（0.5 mg/ml、SIGMA）、タカアミラーゼ（0.36 mg/ml）は蒸留水に溶解した。ヒトラクトフェリン（HLF、0.2 mg/ml）、ヒト酸性糖タンパク質（α1-AG、0.8 mg/ml ）は10 mM Na,K-リン酸緩衝液、pH 6.7に溶解した。ヒトトランスフェリン（HTF、0.2 mg/ml）は 0.2 M Na,K-リン酸緩衝液、pH 6.2に溶解した。
　酵素溶液として、B画分(1,630 U/ml)を用いた。これを10 mM Na, K リン酸緩衝液 pH 6.5+0.5％Triton X-100で10倍、100倍および1,000倍希釈し、ここからそれぞれ5 μlずつとり、各種糖タンパク質5 μlと1時間反応させた。そして、SDSサンプル処理液を10 μl加え反応を停止し、95℃で3分間熱処理をした。RNase B は20％、α1-AGは15％、ヒツジIgGとOVAは12.5％、フェツインとタカアミラーゼは10%、HTF、HLF、BLF、HLF（Plant発現）は7.5％の濃度のゲルを用いたSDS-PAGEに供した。
　その結果、図１５Ａ～Ｊに示したように、コンプレックス型糖鎖のみを持つHTF、HLF、フェツイン、α1-AGは基質分子からの糖鎖の除去にともなって低分子化したタンパク質のバンドが生成した。一方、コンプレックス型糖鎖とともにハイマンノース型、ハイブリッド型糖鎖をもつBLF、ヒツジIgGでは一部の糖鎖が除去され、わずかに低分子化したタンパクのバンドが生成した。一方、ハイマンノース型糖鎖をもつウシRNase B、タカアミラーゼや、ハイマンノース型とハイブリッド型糖鎖をもつOVA、コンプレックス型糖鎖にキシロースの結合している、植物タイプのコンプレックス型糖鎖をもつHLF（Plant発現）では基質のバンドは低分子化せず、糖鎖は遊離しなかった。
実施例２２
　次に、本発明者は、本発明の酵素によって糖鎖を除去されたタンパク質が、当該タンパク質分解酵素により受ける影響を調べるため、以下の実験を行った。
　まず、ヒト唾液α-アミラーゼファミリーＣ(HAS-C)の2カ所に糖鎖が結合していることを確認した（データ示さず）。次に、このヒト唾液α-アミラーゼファミリーC(HAS-C)溶液(15μg/ml)とエンドHS溶液(1.5単位/ml)とをそれぞれ等量混合し、37℃において様々な時間インキュベートし、糖鎖が1ヶ所結合したものと糖鎖をすべて除去したものを調製した。エンドHSによって調製した、糖鎖の数の異なるヒト唾液α-アミラーゼ(16μg)とリジルエンドペプチダーゼ(和光純薬、1.6μg)とを80μlの0.1MTris-HCl, pH9溶液中で37℃において反応を行ない、経時に反応液10μlをSDS-PAGE電気泳動に供した(図１６Ａ)。そして、リジルエンドペプチダーゼの作用を受けず、残存するそれぞれのアミラーゼのバンドの量を測定した。結果を図１６Ｂに示す。糖鎖が2ヶ所に結合しているHAS-Cは反応を通じて、ほとんど減少せず、リジルエンドペプチダーゼの分解作用をほとんど受けなかった。ところが、エンドHSの作用によって糖鎖が1か所結合している状態になると、アミラーゼのバンドは経時的に減少し、50％以下にまで減少した。さらに、エンドHSによって糖鎖をすべて除去され、全く糖鎖が結合していないものは、反応の半ばでほとんど分解されて消失した。このように、結合しているアスパラギン結合型糖鎖の本数に依存して、タンパク質分解酵素の作用を受けにくくなることが、エンドHSを使用することによって明らかとなった。この結果は、タンパク質にコンプレックス型糖鎖を付加することによって、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解を阻止することができることを示唆している。エンドHSは糖鎖転移作用をもっているため、この作用を利用して、タンパク質にアスパラギン結合型糖鎖を転移導入することによって糖タンパク質を酵素合成し、タンパク質分解酵素耐性を付与することが期待できる。
　本発明の酵素は、研究活動、ヒトの各種疾患の診断などへの応用が期待できる。また、本発明の酵素を応用し、血液型などの生体認識機能をもつ配糖体の合成、ドラッグデリバリーシステムの構築、インフルエンザウイルスや細菌などの糖鎖を介した感染菌を捕捉する機能性素材の開発への利用が期待できる。さらに、細胞機能の改変、がん細胞の転移または悪性度などの解消、細胞移植医療などへの応用も期待できる。

Claims (15)

  1. 　ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物に由来するか、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素。
  2. 　前記微生物が、ラクトバシラス・ファーメンタム、プレボテラ・ビビアおよびプレボテラ・メラニノゲニカから選択され、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する請求項１に記載の酵素。
  3. 　前記酵素が、膜貫通領域を除去されている請求項１に記載の酵素。
  4. 　前記糖タンパク質が、脊椎動物を含む動物に由来する糖タンパク質である請求項１に記載の酵素。
  5. 　前記糖鎖が、前記糖タンパク質のタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基にジアセチルキトビオース部分を介して結合している糖鎖である請求項１に記載の酵素。
  6. 　前記糖鎖が、２～５本鎖分岐のコンプレックス型の糖鎖である請求項５に記載の酵素。
  7. 　前記糖タンパク質が、糖鎖部分の根元の糖とジアセチルキトビオース部分との間に、フコースを更に含む請求項１に記載の酵素。
  8. 　前記糖鎖が、その末端側にシアル酸を含む請求項１に記載の酵素。
  9. 　請求項１に記載の酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  10. 　前記遺伝子が、膜貫通領域をコードする領域を除去されている請求項９に記載の組換えベクター。
  11. 　請求項９に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
  12. 　請求項１１に記載の細胞を培養することにより、培養物を得る工程と、
    　得られた培養物を精製することにより、請求項１に記載の酵素を得る工程と
    を含む酵素の製造方法。
  13. 　請求項１に記載の酵素と、糖タンパク質を含む試料とを接触させることにより、前記糖タンパク質の糖鎖を遊離させる糖鎖の遊離方法。
  14. 　請求項１１に記載の宿主細胞を含む培養物。
  15. 　請求項１４に記載の培養物の処理物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210054042A1 (en) * 2018-02-02 2021-02-25 Univerza V Ljubljani Affinity ligands for antibody fc region
US11529380B2 (en) 2016-12-23 2022-12-20 MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UNIPROT 5 October 2010 (2010-10-05), "Glycosyl hydrolase family 85", accession no. 9RX78 *
DATABASE UNIPROT 5 October 2010 (2010-10-05), "Glycosyl hydrolase family 85", accession no. 9RX79 *
DATABASE UNIPROT 5 October 2010 (2010-10-05), "Glycosyl hydrolase family 85", accession no. 9RX80 *
ITO, K. ET AL.: "Human salivary endo-beta-N- acetylglucosaminidase HS specific for complex type sugar chains of glycoproteins", J. BIOL. CHEM., vol. 268, no. 21, 1993, pages 16074 - 16081 *
ITO, K.: "Formation of Glycoisoforms of Human Salivary a-Amylase and Endo-p-N- Acetylglucosaminidase HS", TRENDS IN GLYCOSCIENCE AND GLYCOTECHNOLOGY, vol. 18, no. 99, 2006, pages 73 - 84 *
SENBA, M. ET AL.: "Cloning of the Gene of beta-N- Acetylglucosaminidase from Lactobacillus casei ATCC 27092 and Characterization of the Enzyme Expressed in Escherichia coli", BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 23, no. 5, 2000, pages 527 - 531 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11529380B2 (en) 2016-12-23 2022-12-20 MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants
US20210054042A1 (en) * 2018-02-02 2021-02-25 Univerza V Ljubljani Affinity ligands for antibody fc region
US12195512B2 (en) * 2018-02-02 2025-01-14 Univerza V Ljubljani Affinity ligands for antibody Fc region

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