WO2014035090A1 - 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 이용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하고, 이를 증폭하여, 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.

Description

생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도
본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하는 방법, 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시킨 다공성 고체상을 직접 첨가하거나, 역전사 효소 반응을 수행한 후 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법, 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 키트 및 조성물에 관한 것이다.
동식물에 병을 일으키는 병원체를 검출하는 방법 가운데 가장 널리 이용되는 것은 병원체의 고유 단백질을 검출하는 혈청학적 진단법과 핵산을 검출하는 분자생물학적 진단법이 있다. 분자생물학적 진단법에서 널리 이용되는 방법은 PCR(polymerase chain reaction)법이며, 검출감도가 높고 누구나 쉽게 이용할 수 있다는 장점이 있다. PCR을 수행하기 위해서는 우선 주형으로 이용되는 유전체를 대상 조직으로부터 추출해야 한다. DNA를 추출하는 현재의 방법으로는 페놀/클로로포름을 사용하는 방법, 염석하는 방법, 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피법 및 자성 비드를 사용하는 방법 등이 있다. 이 방법들은 미국특허 제5057426호, 제4923978호, EP 특허 제0512767 A1호, 및 EP 제0515484B호, WO 제95/13368호, WO 제97/10331호, 및 WO 제96/18731호 등에 기술되어 있다. 이들은 고체 지지체상에 핵산을 흡수시킨 후 핵산을 분리(isolation)하는 방법에 관하여 기재하고 있다. 이전에 사용되는 방법들은 핵산을 단리하기 위해서 일정 종류의 용매를 사용하였다.
PCR을 이용하여 DNA나 RNA 주형으로부터 목적 부위를 증폭하는 것은 DNA 분자표지, 프로브 제작, cDNA 및 게놈 DNA 라이브러리 제작, 병원체 검정 등과 같은 다양한 분야에 응용될 수 있다. 예로 병원체의 유전체를 증폭할 경우 검체 내의 병원체 존재 유무를 목적하는 산물의 증폭 유무를 가지고 쉽게 판독할 수 있다. 병원체 진단에 이용될 경우 PCR은 특이도와 검출감도가 매우 높지만 다량의 시료를 한번에 검사하는 데에는 많은 어려움이 있다. 이것은 다양한 검체로부터 PCR 주형을 신속하게 분리하는 데에는 아직까지 시간과 비용이 많이 소요되기 때문이다. 여러가지 조직으로부터 DNA나 RNA를 분리하는 다양한 방법이 보고되어 있으며, 혈흔, 머리카락, 상피세포, 잎 조각을 대상으로 끓이는 방법, NaOH 처리 VC-캡쳐, 열추출, 전자레인지 추출, NaOH 추출 등의 방법을 이용하여 PCR이 가능하도록 손쉽게 유전체를 얻을 수 있는 방법도 보고되어 있다. 그러나 이들 방법은 유전체 추출효율이 균일하지 않고 PCR 반응의 재현성이 낮다는 단점이 있다. PCR 기법이 갖는 높은 특이도와 검출 감도를 저해하지 않고 다양한 검체로부터 PCR 주형용 생물학적 분자를 손쉽게 대량으로 추출할 수 있다면, PCR의 활용도가 지금보다 훨씬 높아질 것이라는 것은 누구나 쉽게 예측할 수 있을 것이다.
한편, 한국공개특허 제2005-0088164호에서는 핵산 단리방법에 개시되어 있고, 일본공개특허 제2007-506404호에서는 핵산 분자를 검출하기 위한 신속한 방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 생물학적 시료로부터 다공성 고체상을 이용하여 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하는 방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 생물학적 시료로서 CMV(cucumber mosaic virus)에 감염된 고추 잎에 다공성 고체상인 산화물 재질의 다공성 세라믹 큐브를 금속 핀 V의 뒤쪽 편평한 부분으로 압력을 가해 접촉시켜 고추 시료 내에 존재하는 RNA, gDNA 및 바이러스 입자를 다공성 세라믹 큐브의 공극으로 흡수시킨 후, 흡수된 생물학적 분자에 대해 별도의 용매를 이용한 용출 과정 없이 다공성 세라믹 큐브를 직접 주형으로서 PCR 튜브에 넣고, CMV 특이 프라이머로 증폭시킨 결과, CMV에 감염된 고추임을 확인할 수 있었다. 이상과 같은 방법을 정제한 CMV 입자, CMV에 감염된 전체 RNA, 정제한 고추 게놈 DNA에 적용하여 세라믹 큐브의 재질과 제작 온도에 따라 상기 유전체를 효율적으로 흡수하여 PCR과 cDNA 합성에 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 LTCC 큐브를 이용하여 담배 잎으로부터 분리한 핵산을 주형으로 multiplex RT-PCR과 대장균을 대상으로 BAC 플라스미드 증폭을 성공적으로 수행하였다.
이를 통해, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자의 신속한 분리를 통해 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 진단할 수 있게 함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시킨 다공성 고체상을 직접 첨가하거나, cDNA 합성을 위한 역전사 효소 반응을 수행한 후 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는 생물학적 시료 내에서 표적 서열을 증폭하기 위한 핵산 증폭 반응용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 키트 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자의 신속한 분리를 통해 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 진단할 수 있게 하므로, 목적하는 게놈 DNA 증폭, cDNA 합성, 병원체 감염 유무 등을 신속하고 정확하게 판별하는데 용이하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 다공성 세라믹 큐브를 이용한 유전체 흡착과 RT-PCR/PCR 주형으로의 활용 모식도를 나타낸다. A: 다공성 세라믹 큐브, B: 다공성 세라믹 큐브를 확대한 그림으로 1입방밀리미터(1mm3)의 큐브 표면에 공극의 크기가 달라지도록 재료와 제작 온도를 달리하여 14종의 큐브를 제작함, C: 식물체 잎에 큐브 1개를 올려놓고 핀 V 뒷면으로 큐브를 눌러 조직이 파쇄됨과 동시에 큐브의 공극으로 유전체가 흡수되도록 설계함, D: 유전체가 흡수된 큐브 1개를 RT-PCR 혹은 PCR 주형으로 사용, E: PCR 산물을 아가로스 젤에서 확인.
도 2는 도자기 절편을 이용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응을 위한 DNA/RNA 주형을 분리한 결과를 나타낸다. A: 약 1mm3 크기의 도자기 파편을 제조하는데 사용한 도자기 절편(1~8)으로 6은 도자기 절편 5의 화살표 부위를 의미함. B: Capsicum annuum CM334 고추잎에 8종류의 도자기 파편을 올려놓고 핀 V으로 누른 다음 이를 PCR 주형으로 사용. Tscar 프라이머로 PCR 수행한 결과. C: CM334 고추잎에서 정제한 gDNA(1ug/㎕)를 A에서 얻은 도자기 파편 8종류로 흡수하고 이를 PCR 주형으로 사용. Tscar 프라이머로 PCR 수행한 결과, 레인 M; 1kb DNA 레더, 레인 PC; CM334 고추잎에서 정제한 gDNA(1ug/㎕) 1㎕를 PCR 주형으로 사용. D: RT-PCR에 의한 Tomato spotted wilt virus(TSWV) 검출, 레인 M;1kb DNA 레더, 레인 NC; 건전한 Nicotiana rustica 담배잎에서 분리한 총 RNA 1㎕를 역전사 반응 주형으로 사용, 레인 PC; TSWV를 인공적으로 감염시킨 담배 잎에서 분리한 총 RNA 1㎕를 역전사 반응 주형으로 사용. 레인 1~8; 8종의 도자기 파편을 TSWV에 감염된 N. rustica 담배 잎에 눌러 생물학적 분자(여기서는 바이러스 입자 혹은 RNA)를 흡수시킨 다음 이를 역전사반응용 주형으로 사용함. 화살표는 예상한 PCR 산물의 크기를 의미함.
도 3은 게놈 DNA 증폭이 가장 잘된 도 2A의 4의 도자기 파편(A)과 각각의 산화물 재질로 제조된 다공성 세라믹 큐브의 표면을 전자 현미경(SEM)으로 확대한 사진이다. 모두 1만배 확대한 사진으로 재료와 제작 온도에 따라 표면 형태, 공극의 크기와 갯수에 차이가 있다. 1~14: 순서대로 표 1에 기록된 재료, bar : 1㎛.
도 4는 각각의 산화물 재질로 제조된 다공성 세라믹 큐브를 이용하여 고추 잎에서 CMV RNA 및 게놈 DNA를 분리하여 RT-PCR/PCR 반응을 수행한 결과이다. A: 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus, CMV) 총 RNA를 대상으로 RT-PCR을 수행한 결과, B: 고추 잎에서 정제한 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행한 결과. 레인 M:1kb DNA 레더, 레인 PC: A에서는 CMV에 감염된 고추잎에서 분리한 총 RNA 1㎕를 RT-PCR 주형으로 사용함. 레인 1~14: 순서대로 표 1에 기록된 재료. B에서는 CM334 고추에서 분리한 게놈 DNA 1㎕를 PCR 주형으로 사용함.
도 5는 각각의 산화물 재질로 제조된 다공성 세라믹 큐브를 이용하여 CMV에 감염된 고추잎 및 정제한 CMV 입자를 대상으로 생물학적 분자의 흡수율을 조사한 결과이다. A: CMV 감염 고추잎, B: 정제한 CMV (레인 PC1: CMV 감염된 CM334의 총 RNA 1㎕를 주형으로 사용. 레인 PC2: CMV 감염된 Nicotia tabaccum Xanthi-nc의 총 RNA 1㎕를 주형으로 사용). 레인 1~14: 순서대로 표 1에 기록된 재료.
도 6은 고추잎을 대상으로 본 발명에서 제조한 다양한 다공성 세라믹 큐브를 이용하여 DNA 증폭효율을 분석한 결과이다. 레인 M: 1kb DNA 레더, 레인 1~14: 순서대로 표 1에 기록된 재료, 레인 PC: 정제한 gDNA 1ul를 주형으로 사용.
도 7은 본 발명의 LTCC 다공성 세라믹 큐브 제작온도가 PCR 증폭에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 레인 M: 1kb DNA 레더, 레인 PC: 정제한 gDNA 1ul를 주형으로 사용, 레인 30~34: 30(LTCC, 650℃), 31(LTCC, 700℃), 32(LTCC, 750℃), 33(LTCC, 800℃), 34(LTCC, 850℃).
도 8은 제작온도에 따른 LTCC 다공성 세라믹 큐브의 표면(A~E)과 내부(F~J) 절단면을 나타낸다. A~J: 10,000배로 관찰한 SEM 사진. 30~34: 30(LTCC, 650℃), 31(LTCC, 700℃), 32(LTCC, 750℃), 33(LTCC, 800℃), 34(LTCC, 850℃)
도 9는 제작 온도에 따른 LTCC 다공성 세라믹의 물질 흡수능력과 여과 능력을 조사한 결과이다. 큐브의 표면(A~E)과 내부(F~J) 절단면을 5000배 SEM 및 250배 TEM으로 각각 관찰하여 금 나노입자 및 폴리스틸렌 입자의 혼합액 분포를 조사하였다. 30~34: 30(LTCC, 650℃), 31(LTCC, 700℃), 32(LTCC, 750℃), 33(LTCC, 800℃), 34(LTCC, 850℃)
도 10은 제작 온도에 따른 LTCC 다공성 세라믹의 물질 흡수능력과 여과 능력을 조사한 결과이다. LTCC 다공성 세라믹 큐브의 내부에 흡수된 금 나노입자 및 폴리스틸렌 입자를 용출시킨 후 3500배 TEM으로 그 분포를 조사하였다. 33(LTCC, 800℃), 34(LTCC, 850℃)
도 11은 큐브 표면의 특성이 PCR 산물 증폭 효율에 미치는 영향을 조사한 결과이다. A~C: 1000배로 촬영한 SEM 사진. A, 33(LTCC, 800℃) 큐브 연마 안함; B, 33을 48시간 연마; C, 33을 72시간 연마. D와 E: 레인 M, 1kb DNA 레더; 레인 PC, 정제한 gDNA 1ul를 주형으로 사용; 레인 39, 33(LTCC, 800℃) 큐브 연마 안함; 레인 41, 33을 48시간 연마; 레인 42, 33을 72시간 연마. 프라이머 10(D)과 146(E)을 사용함.
도 12는 본 발명의 LTCC 큐브를 이용하여 담배 잎으로부터 분리한 생물학적 분자를 주형으로 한 멀티플렉스(multiplex) RT-PCR 결과이다. 레인 M: 1kb DNA 레더, 레인 1~3은 각각 CMV(473bp), CIYVV(806bp), CMV(473bp)+CIYVV(806bp)의 RT-PCR 산물.
도 13은 본 발명의 LTCC 큐브를 이용하여 대장균을 대상으로 BAC 플라스미드 증폭 결과이다. 레인 M: 1kb DNA 레더, 레인 1~4는 대장균 배양액 1ul, 2ul, 3ul, 4ul를 주형으로 사용함. 5~8은 대장균을 흡수시킨 다공성 세라믹 큐브(8, LTCC, 850℃)를 한 개, 두 개, 세 개, 네 개를 각각 넣어 주형으로 사용함. PCR 밴드 두께가 일정함, 즉 균일하게 대장균이 흡수되고, 큐브 1개에 흡수된 주형은 4개인 경우와 별반 차이가 없음. 이때 프라이머 농도를 높이면 4개 사용할 때 PCR 밴드가 1개 보다 훨씬 두꺼워짐. 1~4는 대장균 배양 용액의 점도가 높아서 일정하게 첨가되지 않은 결과를 나타냄.
도 14는 생물학적 분자를 흡수시키기 위해 이용가능한 다공성 세라믹의 형태를 나타낸다. A; 단일 심플 구조 (사각, 원형 등), B; 재료 흡수율을 높이기 위해 단일 심플 구조의 내부에 홀 모양의 공간을 형성시킨 구조, C; 표면 기공사이즈 및 서로 다른 재료가 복합화된 구조, D; 밀도가 다른 2중 구조(왼쪽) 및 내부에 공극을 포함한 구조(오른쪽)
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 생물학적 시료는 동물, 식물, 세균 또는 곰팡이 유래일 수 있고, 바람직하게는 식물 또는 동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시키는 방법으로는 생물학적 시료의 형태가 액상일 경우는 단순 접촉을 통해 다공성 고체상으로의 흡수를 유도하는 방법을 의미하고, 고체상일 경우는 다공성 고체상을 핀 V으로 찔러서 세포가 파괴될 때 나오는 생물학적 분자를 흡수시키는 방법을 의미하는 것이나, 이 방법만으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 생물학적 분자는 DNA, RNA, dsRNA, microRNA, 비로이드(viroid), 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 미세조류일 수 있고, 바람직하게는 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 생물학적 분자는 동물의 경우 다양한 소스(source)로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 식물의 경우 각종 기관 추출물로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 잎, 꽃, 줄기, 뿌리, 열매, 종자로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 잎, 종자 또는 꽃으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 미생물의 경우 균총, 균사체 또는 우즈(ooze)로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 이들이 집중적으로 서식하는 곳(병반 발생 부위)에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 미세조류의 경우, 공극 크기를 적절히 조절한 다공성 고체상을 접촉시켜 이들의 일부 입자 또는 세포 전체를 공극 안으로 흡수시키고, 이를 주형으로 PCR 반응시키면 PCR 반응 단계 중 고온 변성 단계(대략 94~96℃)에서 조직 파괴로 인하여 내부의 핵산들이 방출될 수 있어 목적 유전자의 분석이 가능하다.
본 발명의 생물학적 분자는 또한, 핵산 분자의 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 이의 염기가 변형된 유사체(analogue)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 분리된 생물학적 분자가 gDNA인 경우, 세라믹 막대 선단을 생물학적 시료에 접촉시켜 흡착할 수 있다. 출발물질이 mRNA인 경우에는, 이것에 세라믹 막대 선단을 생물학적 시료에 접촉시키고 선단에 흡착된 총 RNA를 주형으로 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성한다. 상기 총 RNA는 식물이나 동물 세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 용이하게 합성할 수 있다. 또한 바이러스일 경우 폴리-A 테일이 있을 경우 위와 동일한 방법으로 cDNA를 합성하나, 토바모바이러스처럼 폴리-A 테일이 없을 경우 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 목적 RNA에 특이적인 안티센스 프라이머(antisense primer)를 이용하여 cDNA를 합성할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 소량의 생물학적 분자는 주형으로 이용할 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법에 응용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, CAPS 또는 SCAR 분자표지, 형광 표식자를 사용하는 HRM, real time PCR, Nested PCR, immunocapture PCR, 동시에 다양한 병원체 검출에 이용되는 mutiplex PCR, 직접적 DNA 서열결정, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253 (1991)), 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
핵산 증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 바이러스 검출을 위해서는 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. 그러나 역전사 반응(RT) 및 PCR을 동일 튜브에서 수행되는 것보다는 RT와 PCR이 각각 다른 튜브에서 진행될 때 주형의 증폭양을 늘릴 수 있어 바이러스 검정 결과의 신뢰성을 높일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 본 발명은 세라믹 블럭에 흡수된 뉴클레오타이드와 매칭되도록 디자인된 지노타이핑(genotyping) 프라이머를 이용하여 조직 내 바이러스 유무를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명을 통한 핵산 증폭은 DNA 분자표지 제작, 프로브 제작, cDNA 및 게놈 DNA 라이브러리 제작, 병원체 검정 등에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 핵산 증폭 반응은 cDNA 합성, 중합효소연쇄반응(PCR), 멀티플렉스(muliplex) PCR, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 다공성 고체상은 탄화셀룰로오스류, 종이를 입자 형태로 뭉친 것, 천연 또는 합성 제오라이트, 폴리스틸렌(polystylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌(polyprophylene), 다공성 금속 입자, 다공성 고무, 유리섬유를 입자 형태로 뭉친 세공성 유리, 석회, 조개껍질, 도자기 절편 또는 산화물 재질의 세라믹일 수 있고, 바람직하게는 산화물 재질의 세라믹일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 산화물 재질의 세라믹은 Al2O3, Fe2O3, LTCC(Low temperature co-fired ceramic), PbO 또는 ZnO을 주성분으로 제조된 세라믹일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 다공성 고체상은 정육면체, 직육면체, 구, 원기둥, 막대 형태(bar type), 막대의 한쪽 말단에 홈이 있는 막대 형태, 끝이 뾰족한 막대 형태, 막대의 한쪽 말단에 홈이 있으며 끝이 뾰족한 막대 형태, 또는 막대의 한쪽 말단에 홈이 있으며 끝이 뾰족하고 끝이 뾰족한 쪽의 내부에 큰 공극을 갖는 막대 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다공성 고체상으로서 산화물 재질의 세라믹을 사용하는 경우 이의 공극의 크기를 조절할 수 있는데, 같은 산화물 재질을 가지고 다공성 세라믹을 제조할 경우 제작 온도에 따라 공극의 크기 및 공극 수를 조절할 수 있어, 목적으로 하는 생물학적 분자의 종류에 따라 최적화된 다공성 세라믹을 이용함으로써 PCR 또는 RT-PCR 반응을 효과적으로 수행할 수 있게 한다. 이와 같은 다공성 세라믹의 공극의 크기는 대상의 생물학적 시료에서 목적으로 하는 생물학적 분자를 선택적으로 흡수할 수 있도록 다공성 고체상의 크기를 적절히 조절할 수 있다. 또한, 상기 산화물 재질의 세라믹의 외형 크기는 PCR용 튜브에 용이하게 들어갈 수 있는 크기이면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 1 mm3 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 핵산 증폭 반응은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은
(a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상에 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 역전사 효소 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 역전사 효소 반응물을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상에 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 역전사 효소 반응을 수행하는 단계;
(c) 상기 역전사 효소 반응물을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(d) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상; 표적 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열을 증폭하기 위한 핵산 증폭 반응용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 핵산 증폭 반응용 키트는 마이크로 RNA 분리, small RNA 분리 또는 cDNA 합성에 이용되는 시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트에서, 상기 핵산 증폭 반응은 cDNA 합성, PCR(Polymerase Chain Reaction), 멀티플렉스(multiplex) PCR 또는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 다공성 고체상은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트에서, 상기 핵산 증폭 반응은 cDNA 합성, PCR(Polymerase Chain Reaction), 멀티플렉스(multiplex) PCR 또는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 다공성 고체상은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 본 발명의 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하며, 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 상기 다공성 고체상의 공극으로 신속하게 흡수시켜 핵산 증폭 반응에 이용할 수 있는 것이다. 상기 다공성 고체상은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 핵산 증폭 반응은 cDNA 합성, PCR(Polymerase Chain Reaction), 멀티플렉스(multiplex) PCR 또는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 다공성 고체상은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다공성 세라믹 큐브를 이용한 유전체 흡착과 RT-PCR/PCR 주형으로의 활용
본 발명의 다공성 세라믹 큐브를 이용한 유전체 흡착과 RT-PCR/PCR 주형으로의 활용 모식도를 도 1에 나타내었다. 본 발명에서는 1 입방밀리미터(1mm3)의 큐브표면에 공극의 크기가 달라지도록 표 1에 기재된 주성분을 재료로 제작 온도를 달리하여 14종의 큐브를 제작하였고, 그 다공성 세라믹 큐브를 확대한 것을 도 1B에 나타내었다. 큐브는 다공성이므로 공극보다 작은 물질을 비선택적으로 흡수하는데, 공극의 크기를 다르게 하여(일반적으로 높은 온도에서 세라믹을 제작할 경우 공극이 작아짐) 조직이 파쇄될 때 나오는 여러 가지 물질 가운데 원하는 것을 선택적으로 흡수, 즉 공극의 크기를 통해 PCR 저해 물질을 최대한 배제할 수 있는 공극의 크기로 초미세여과(ulrafiltration) 기능을 큐브에 부여하는데 목적이 있다.
본 발명에서는 상기 제작한 다공성 세라믹 큐브 1개를 식물체 잎에 올려놓고 핀 V 뒷면으로 큐브를 눌러 조직이 파쇄됨과 동시에 큐브의 공극으로 유전체가 흡수되도록 설계하였고, 상기 유전체가 흡수된 큐브 1개를 RT-PCR 혹은 PCR 주형으로 사용한 결과를 아가로스 젤에서 확인하였다(도 1E).
실시예 2. 도자기 절편을 이용한 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응을 위한 DNA/RNA 주형 분리
청자와 백자를 포함한 7종류의 도자기 절편을 니퍼(nipper)로 잘게 부수고 유약을 포함하지 않는 부위 가운데 크기가 약 1mm3인 파편을 골라 유전체 흡착재료로 사용하였다. 도 2A의 5번 도자기 절편의 경우 유약이 도포된 부위에 따라 황색과 회색으로 구분 되었는데, 이들 각각으로부터 얻은 황토색 파편은 5로, 회색 파편은 6으로 표기하였다. Capsicum annuum CM334 고추잎에 각각의 도자기 파편을 올려놓고 핀 V의 편평한 뒷부분으로 도자기 파편을 가볍게 눌러 gDNA를 흡수하게 하였다. 고추의 모용관 연관된 분자표지를 검정할 수 있는 프라이머 프리믹스가 첨가된 PCR 튜브에 gDNA를 흡수시킨 각각의 도자기 파편을 튜브당 1개씩 첨가하였다. PCR 프리믹스는 10pmol 센스 프라이머(Tsca-F : AAACGCCATCATTCGTTTTC : 서열번호 1) 0.5㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머(Tsca-R : CATGAAAGTTGACCCGAACA : 서열번호 2) 0.5㎕, rTaq-Mix 4㎕, DW 15㎕로 구성되었으며, PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음 (94℃/30초, 59℃/30초, 72℃/60초)에서 35회 증폭하고, 72℃/5분간 반응시킨 후 EtBr을 포함하는 1% 아가로즈젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다.
그 결과 도 2B와 같이 도자기 파편 4, 5, 6에서는 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었다. 게놈 DNA가 가장 증폭이 잘된 도자기 파편 4의 표면을 전자현미경으로 관찰한 결과, 도자기내 공극이 다양한 크기로 분포하는 것을 확인할 수 있었다(도 3의 A). 그러나 도자기 파편의 표면이나 면적을 동일하게 조절할 수 없는 상황에서 도자기 파편의 종류와 PCR 산물 증폭 효율을 명확하게 구별하는 것에는 다소 어려움이 있었다.
따라서 각각의 도자기 파편이 고추의 gDNA를 어느 정도 흡수하고 이것이 실제로 PCR에 적용할 수 있는지를 확인하고자 잎 대신 정제한 CM334 gDNA(1ug/㎕)를 재료로 사용하였다. 정제한 gDNA를 1㎕씩 플라스틱 페트리디쉬 표면에 떨어뜨린 다음 각각의 도자기 파편으로 gDNA를 흡수하고 이들 PCR용 주형으로 사용하였다. 도 2C와 같이 1㎕의 CM334 gDNA를 주형으로 사용한 양성 대조구(PC)와 마찬가지로 동일 크기의 PCR 산물이 모든 처리구에서 증폭됨을 확인할 수 있었으며, 이들의 농도에는 다소 차이가 있었으나 이것은 사용한 도자기 파편의 크기나 표면적이 균일하지 못한 것에서 기인한 것으로 판단되었다. 한편, gDNA를 흡수한 상기 도자기 파편은 PCR 증폭용 주형으로 사용할 수 있음을 확인하였는데, 이들을 식물 바이러스 진단에 활용할 수 있는지에 대한 가능성을 조사하였다. QIAGEN RNeasy Mini Kit를 이용하여 음성과 양성 대조구용 RNA를 정제하기 위하여 바이러스에 감염되지 않은 건전한 Nicotiana rustica 담배 잎(NC용)과 Tomato spotted wilt virus(TSWV)를 인공적으로 감염시킨 Nicotiana rustica 담배 잎(PC용)으로부터 전체 RNA를 분리하고 이를 역전사 반응용 주형으로 사용하였다. TSWV에 감염된 담배잎에 각각의 도자기 파편을 올려놓고 핀 V으로 눌러 RNA 혹은 바이러스 입자를 흡수시키고 이들 조각을 1개씩, 10 pmol 안티센스 프라이머 TSNCPR (5'-TCAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3': 서열번호 3) 0.5 ㎕가 첨가된 역전사 반응용 RT-프리믹스 (reverse transcription master premix, ELPIS-Biotech, Korea)에 튜브당 한 개씩 첨가하였다. 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행한 다음 반응액 1㎕를 PCR용 주형으로 사용하였다. PCR 프리믹스는 10pmol 센스 프라이머(Tsca-F AAACGCCATCATTCGTTTTC : 서열번호 4) 0.5㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머(Tsca-R CATGAAAGTTGACCCGAACA : 서열번호 5) 0.5 ㎕, rTaq-Mix 4 ㎕, DW 15 ㎕로 구성되었다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성시키고, (94℃/30초, 50℃/30초, 72℃/60초)에서 35회 증폭하고, 72℃/5분간 반응시킨 후 EtBr을 포함하는 1% 아가로즈젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물(777bp)의 증폭 유무를 확인하였다. 도 2D와 같이 4번과 6번 도자기 파편을 제외한 나머지 도자기 파편 처리구에서 예상하는 RT-PCR 산물이 성공적으로 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 도자기 파편에 흡수된 TSWV RNA 혹은 TSWV입자만으로도 TSWV 검정이 가능함을 의미하며, 도 2B에 명시된 gDNA보다 RT-PCR에서 PCR 산물이 보다 증폭이 잘된 것은 역전사반응을 통해 PCR 주형이 보다 많이 생성되었기 때문으로 판단되었다. 이상의 결과에서 도자기 파편을 일정한 크기로 제작하고 이를 생물학적 분자를 흡수하는데 사용한다면 보다 우수한 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다.
실시예 3. 산화물 재질의 다공성 세라믹 큐브의 종류에 따른 생물학적 분자의 흡수율 조사
표 1에 기재된 산화물을 주성분으로 제조된 각각의 다공성 세라믹 큐브의 표면을 전자 현미경(SEM)으로 확대한 사진을 도 3에 나타내었다. 세라믹 주성분 및 제작 온도에 따라 표면과 공극의 크기에 차이가 있으므로, 목적으로 하는 생물학적 분자의 흡수율을 높이기 위해서는 세라믹 큐브의 최적의 공극의 크기 및 수를 갖도록 제작해서 사용해야 한다.
표 1
기호 주성분 제작 온도(℃)
1 Al2O3 1450
2 Al2O3 1550
3 Fe2O3 800
4 Fe2O3 850
5 Fe2O3 900
6 LTCC 650
7 LTCC 750
8 LTCC 850
9 PbO 1000
10 PbO 1150
11 PbO 1250
12 ZnO 800
13 ZnO 900
14 ZnO 1000
① CMV에 감염된 캡시쿰 아눔 CM334 고추잎에서 분리한 총 RNA와 CM334 고추에서 분리한 게놈 DNA 대상
산화물 재질의 다공성 세라믹 큐브의 종류에 따른 생물학적 분자의 흡수 효율을 조사하고자 CMV에 감염된 고추잎에서 분리한 총 RNA와 CM334 고추에서 분리한 게놈 DNA를 각각의 세라믹 큐브로 흡수시킨 다음, 이를 RT-PCR과 PCR용 주형으로 사용하였다. CMV는 RT-PCR 프리믹스(RTamp1, Biocubesystem, Korea)에 센스(5'-TACATTGAGTCGAGTCATG-3': 서열번호 6) 및 안티센스(5'-TGGAATCAGACTGGGACA-3': 서열번호 7) 프라이머를 각각 25pmol 농도로 첨가하고, 50℃/20분, 94℃/10분, (94℃/30초, 55℃/30초, 72℃/60초) 35회, 72℃/5분간 반응시킨 후 EtBr을 포함하는 1% 아가로즈젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물(670bp)의 증폭 유무를 확인하였다(도 4A). gDNA의 경우 캡시쿰 아눔 CM334 (Capsicum annuum CM334) 고추잎으로부터 분리한 고농도(100ug) gDNA를 다공성 세라믹 큐브로 각각 흡수시키고 PCR 튜브당 1개씩 첨가하였다. PCR 프리믹스는 10pmol 센스 프라이머(Tsca-F : AAACGCCATCATTCGTTTTC : 서열번호 8) 0.5㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머(Tsca-R : CATGAAAGTTGACCCGAACA : 서열번호 9) 0.5 ㎕, rTaq-Mix 4 ㎕, DW 15 ㎕로 구성되었으며, PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음 (94℃/30초, 59℃/30초, 72℃/60초)에서 35회 증폭하고, 72℃/5분간 반응시킨 후 EtBr을 포함하는 1% 아가로즈젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다. 바이러스 RNA의 경우도 4A와 같이 14종 세라믹 큐브는 모두 비슷한 결과를 보였다(도 4A). 반면에 정제된 gDNA를 이용한 PCR 반응의 효율은 큐브의 재질과 제작 온도에 따라 다르게 나타났다(도 4B). 레인 1(Al2O3, 1450℃)과 레인 2(Al2O3, 1550℃)에서는 증폭량에 큰 차이가 없었고, 낮은 온도에서 제작된 레인 3(Fe2O3, 800℃)과 레인 4(Fe2O3, 850℃)에서는 증폭이 거의 되지 않았으나 고온에서 제작한 레인 5(Fe2O3, 900℃)에서는 약하게 증폭되었다. 레인 6(LTCC, 650℃)은 증폭되지 않지만 레인 7(LTCC, 750℃)과 레인 8(LTCC, 850℃)에서는 강하게 증폭되었다. 레인 9(PbO, 1000℃)와 레인 11(PbO, 1250℃)은 증폭량이 적으나 레인 10(PbO, 1150℃)은 강하게 증폭되었다. 레인 12(ZnO, 800℃)와 레인 14(ZnO, 1000℃)는 거의 증폭되지 않으나 레인 13(ZnO, 900℃)은 약하게 증폭되었다. 이상과 같은 결과를 종합해 보면 큐브 재료와 제작온도에 따라 게놈 DNA의 흡수율에 차이가 나며 레인 8(LTCC, 850℃), 레인 11(PbO, 1250℃), 레인 14(ZnO, 1000℃)처럼 공극이 거의 없는 구조에서는 본 실험에서 사용한 PCR 조건에서는 검출되지 않을 정도로 적은 양의 게놈 DNA가 흡수되는 것으로 판단되었다.
② CMV에 감염된 고추잎과 정제한 CMV 입자 대상
다공성 세라믹 큐브의 종류에 따른 생물학적 분자의 흡수 효율을 조사하고자 CMV에 감염된 고추잎과 정제한 CMV 입자를 각각의 세라믹 큐브로 흡수시킨 다음, 이를 RT-PCR과 PCR용 주형으로 사용하였다. CMV는 RT-PCR 프리믹스(RTamp1, Biocubesystem, Korea)에 CMV 입자 대상 특이적 프라이머 세트인 센스(5'-TACATTGAGTCGAGTCATG-3': 서열번호 10) 및 안티센스 프라이머(5'-TGGAATCAGACTGGGACA-3': 서열번호 11)를 각각 25pmol 농도로 첨가하고, 50℃/20분, 94℃/10분, (94℃/30초, 55℃/30초, 72℃/60초) 35회, 72℃/5분간 반응시킨 후 EtBr을 포함하는 1% 아가로즈젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물(670bp)의 증폭 유무를 확인하였다. 정제한 바이러스를 다공성 세라믹 큐브로 흡수시켰을 때 PCR 산물이 보다 많이 증폭되었으나 두 처리구간의 PCR 산물 증폭 양상은 비슷하였다(도 5).
③ 다공성 세라믹 큐브의 제작온도 및 재질에 따른 생물학적 분자의 흡수율
도 5A의 레인 1, 2는 주성분은 Al2O3로 같은데, 제작온도는 1450℃, 1550℃이며, 레인 3, 4, 5의 주성분은 Fe2O3로 같으나, 제작온도는 800℃, 850℃, 900℃로 Al2O3 및 Fe2O3를 각각 1550℃ 및 900℃에서 제작한 다공성 세라믹 큐브를 이용하여 DNA를 분리시킨 경우 PCR 효율이 높게 나타났다. 레인 6, 7, 8도 주성분은 LTCC(Low temperature co-fired ceramic)로 같은데, 제작온도는 650℃, 750℃, 850℃로, 레인 6은 전혀 증폭되지 않은 결과를 나타내고, 레인 8이 7보다 증폭이 더 잘되는 것으로 나타났다.
④ 다공성 세라믹 큐브를 이용한 고추 DNA 증폭효율 분석
캡시쿰 아눔 sr10(Capsicum annuum sr10) 고추 잎 위에 다공성 세라믹 큐브 하나를 올려 놓고 핀 V의 뒷부분으로 눌러 각각의 큐브로 gDNA를 흡수시키고, 이를 PCR 튜브당 1개씩 첨가하였다. PCR 반응액은 2X PCR 프리믹스(gDamp1, Biocubesystem, Korea) 10㎕에 10pmol 센스 프라이머(Primer 10-F: 5'-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3': 서열번호 12) 0.5㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머(Primer 10-R: 5'-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3': 서열번호 13) 0.5 ㎕, gDNA가 흡수된 큐브 1개, DW 9㎕를 첨가하여 준비하였고, 양성 대조구에서는 큐브 대신 정제한 gDNA(20ng/㎕) 2㎕와 DW 7㎕를 첨가하여 준비하였다. PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음 94℃/30초, 58℃/30초, 72℃/60초에서 35회, 72℃/5분간 반응시켜 증폭하였고, EtBr을 포함하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다. 그 결과, 레인 5(Fe2O3, 900℃), 레인 8(LTCC, 850℃), 레인 9(PbO, 1000℃), 10(PbO, 1150℃) 및 레인 14(ZnO,1000℃)는 증폭이 잘 되었고, 레인 6(LTCC, 650℃), 레인 7(LTCC, 750℃) 및 레인 8(LTCC, 850)과 레인 12(ZnO, 800℃), 레인 13(ZnO, 900℃) 및 레인 14(ZnO, 1000℃)는 제작 온도에 따라 증폭 효율이 뚜렷이 구별되었다(도 6).
실시예 4. 제작조건에 따른 LTCC 다공성 세라믹 큐브
① LTCC 다공성 세라믹 큐브 제작온도가 PCR 증폭에 미치는 영향
반복 실험 결과 ZnO보다 LTCC 재료에서 제작온도에 따른 gDNA 증폭 차이는 명확하게 나타났다(도 6 참고). 제작 온도에 따른 gDNA 증폭 효율을 보다 더 면밀하게 조사하고자 LTCC 다공성 세라믹 큐브 5종(30~34)을 새로 제작하였다. 제작온도는 650~850℃로 50℃ 간격으로 제작하였다 (30(LTCC, 650℃), 31(LTCC, 700℃), 32(LTCC, 750℃), 33(LTCC, 800℃), 34(LTCC, 850℃)). 이때 사용한 프라이머는 센스 프라이머(Primer 10-F: 5'-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3': 서열번호 12), 안티센스 프라이머(Primer 10-R: 5'-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3': 서열번호 13)와 센스 프라이머(Primer 146-F: 5'-AGAAGAAAGAGGAGGCTCCA-3': 서열번호 14), 안티센스 프라이머(Primer 146-R: 5'-TGGAAGCCTTTGAGGGATCT-3': 서열번호 15)의 두 종류를 사용하였다. PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음 94℃/30초, 58℃/30초, 72℃/60초에서 35회, 72℃/5분간 반응시켜 증폭하였고, EtBr을 포함하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다(도 7).
PCR 결과를 나타낸 도 7을 살펴보면, 레인 30(LTCC, 650℃)의 경우 두 종류 프라이머 모두에서 도 6의 레인 6(LTCC, 650℃)처럼 gDNA 증폭이 되지 않았다. 레인 31(LTCC, 700℃)에서는 프라이머 10에서는 약하게 증폭되었으나 프라이머 146에서는 증폭이 잘 되었다. 레인 32(LTCC, 750℃)와 레인 33(LTCC, 800℃)에서는 프라이머 둘 다에서 증폭이 아주 잘 되었다. 반면에 레인 34(LTCC, 850℃)에서는 레인 31(LTCC, 700℃)과 비슷한 결과를 보였는데, 이는 프라이머에 따른 PCR 증폭 효율이 달라질 수 있음을 시사하는 것이다. 이상의 결과에서 다공성 세라믹 큐브를 LTCC로 제작할 때 적합한 제작온도는 750℃~800℃인 것으로 분석되었다.
② 제작온도에 따른 LTCC 다공성 세라믹 큐브의 표면(A~E)과 내부(F~J) 절단면
제작온도에 따른 큐브의 특성을 조사하고자 5종의 LTCC 다공성 세라믹 큐브를 제작하고 이들의 표면(도 8A~E)과 내부(도 8F~J) 절단면, 물질 흡수능력 및 여과 능력을 SEM과 TEM으로 각각 조사하였다. 큐브의 표면(도 8A~E)과 내부(도 8F~J) 절단면 제조 온도가 증가할수록 매끈한 경향을 보였다. 두 경우 모두에서 포어 사이즈는 ㎛ 수준에서는 거의 비슷하였고, 온도가 높을수록 포어 수가 줄어드는 경향을 보였다.
③ 제작 온도에 따른 LTCC 다공성 세라믹 큐브의 물질 흡수능력과 여과 능력 분석
포어 개수가 줄어든다는 것은 분자 흡수량이 적어지는 것으로 이해할 수 있으나 보다 명확한 자료를 얻고자 제작 온도가 다른 LTCC 다공성 세라믹 큐브의 물질 흡수능력과 여과 능력을 인위적으로 제작한 금 나노입자(평균 직경이 40㎚)와 폴리스틸렌 입자(평균 크기 직경이 2㎛, 5㎛, 38~45㎛, Beads&Micro, Korea)의 혼합액을 이용하여 조사하였다. 직경이 다른 위 2가지 물질의 혼합액 20㎕ 당 동일 온도에서 제조한 큐브 10개를 침지하고 마이크로피펫과 필터 페이퍼를 이용해 여액을 완전히 제거하였다. 동일 튜브에 멸균수를 10㎕ 첨가한 다음 65℃에서 30분간 정치하고 10초 동안 볼텍싱한 다음 남은 큐브의 표면 특성과 세척액(washing)의 입자 분포를 관찰하였다 (SEM은 5000배, TEM은 250배).
큐브의 표면을 5000배로 관찰한 결과 도 9D 및 9E에서 쉽게 관찰할 수 있었던 포어에 비슷한 크기의 입자(대략적인 지름이 1㎛ 이내)가 집중적으로 분포하였고(도 9D 및 9E), 33 및 34 큐브의 표면에서 명확하게 구분되었다. 큐브 세척액을 TEM으로 관찰했을 때, 직경이 38㎛ 이상인 입자는 모든 처리구에서 드물게 관찰되었다(자료 미제시). 이는 큐브 표면에 묻은 혼합액이 완전히 제거되지 못해서 생긴 결과로 판단되었다. 한편, 직경이 2~5㎛인 입자 또한 모든 처리구에서는 고르게 관찰되었으며, 30(LTCC, 650℃) 처리구에서는 다른 처리구에 비해 용출된 입자의 양이 월등히 많았고(도 9F), 다른 처리구에서는 직경이 대략 2㎛인 입자가 주로 관찰되었다(도 9G~J). DNA 증폭 결과가 가장 좋았던 33(LTCC, 800℃) 큐브 처리구에서는 다른 처리구에 비해 2㎛ 이하의 입자가 주로 분포하였다.
도 9의 결과는 합성입자가 다공성 세라믹 큐브의 흡수력에 의해 수동적으로 포어 속으로 빨려 들어갈 뿐만 아니라 동시에 포어의 직경에 따라 입자가 선택적으로 흡입될 수 있음을 의미하는데, 실제로 33과 34 큐브의 세척액을 보다 높은 배율로 관찰했을 때, 용출된 입자 직경은 26nm에서 500nm 정도(도 10A 및 도 10B)로 매우 일정한 크기로 분포하였다. 이는 포어 크기를 일정하게 조절할 경우 특정 크기의 입자를 선택적으로 흡수할 수 있음을 시사하는 것이다.
④ 큐브의 표면의 특성이 PCR 산물 증폭 효율에 미치는 영향
표면의 거칠기와 포어 수가 생물학적 분자(여기서는 gDNA)의 흡수량에 어느 정도 영향을 주는지를 조사하였다. DNA 증폭 결과가 가장 좋았던 33(LTCC, 800℃) 큐브의 표면을 48시간과 72시간 연마하고 이들의 표면 특성과 PCR 증폭 효율을 비교하였다.
고추 잎 위에 다공성 세라믹 큐브 하나를 올려 놓고 핀 V의 뒷부분으로 눌러 각각의 큐브로 흡수시키고 이를 PCR 튜브당 1개씩 첨가하였다. PCR 반응액은 2X PCR 프리믹스(gDamp1, Biocubesystem, Korea) 10㎕에 10pmol 센스 프라이머 0.5㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, gDNA가 흡수된 cube 1개, DW 9㎕를 첨가하여 준비하였고, 양성대조구에서는 큐브 대신 정제한 gDNA(20ng/㎕) 2㎕와 DW 7㎕를 첨가하여 준비하였다. PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음 94℃/30초, 58℃/30초, 72℃/60초에서 35회, 72℃/5분간 반응시켜 증폭하였고, EtBr을 포함하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다.
큐브 각각의 표면을 관찰한 결과 표면이 거친 정도는 48시간, 72시간, 0시간 순으로 증가하였고, 포어 개수는 48시간 처리구가 다른 처리구에 비해 적게 관찰되었다. 이들 시료를 이용해 PCR용 프라이머 10번과 146번으로 DNA 증폭 효율을 조사한 결과 48시간 연마구에서는 비연마구에 비해 PCR 증폭효율이 낮았으나, 72시간 처리구에서는 PCR 산물의 증폭효율이 비슷하거나 다소 높게 나타났다(도 11).
이상의 결과에서 제작온도는 큐브 표면의 거칠기와 표면적 및 포어 크기에 영향을 주는 것으로 판단되었다. 또한 제작온도에 따른 큐브의 특성 변화는 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자(여기서는 gDNA 혹은 핵)를 다공성 고체상의 공극으로 흡수하는 단계에서 PCR 반응에 이용되는 주형과 반응 억제 물질의 전체 흡수량에 영향을 준다고 판단할 수 있다. 그러나 무엇보다 중요한 특성 변화는 제작온도가 다공성 큐브에 존재하는 포어의 수 혹은 크기, 그리고 표면적을 조절함으로써 PCR 저해 물질을 선택적으로 제거할 뿐만 아니라 PCR에 필요한 충분한 양의 초기 주형을 획득하는데 많은 영향을 준다는 것이다.
실시예 5. 본 발명의 LTCC 큐브를 이용하여 바이러스에 복합 감염된 담배 잎으로부터 분리한 생물학적 분자를 주형으로 한 멀티플렉스(multiplex) RT-PCR
CMV(Cucumber mosaic virus)와 ClYVV(Clover yellow vein potyvirus)를 담배(N. benthamiana)에 복합감염시켜 바이러스를 증식시킨 후, 복합감염된 담배 잎 위에 다공성 세라믹 큐브(33, LTCC, 800℃) 하나를 올려 놓고 핀 V의 뒷부분으로 눌러 큐브로 생물학적 분자(바이러스 입자 또는 바이러스 intermidiate form)를 흡수시켰다.주형이 흡수된 큐브를 PCR 튜브당 1개씩 첨가하고 RT-PCR 반응액을 분주하였다. 각 바이러스를 단독으로 검출할 경우, RT-PCR 반응액은 RT-PCR 프리믹스(RTamp1, Biocubesystem, Korea)에 10pmol 센스 프라이머 1㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머 1 ㎕, 주형이 흡수된 큐브 1개, DW 18㎕를 첨가하여 준비하였다. 멀티플렉스 RT-PCR에서는 해당 바이러스의 프라이머를 위와 같이 첨가한 다음 DW 6㎕ 첨가하여 준비하였다. PCR 산물은 94℃에서 3분간 변성시킨 다음, 52℃/20분, 94℃/30초, 68℃/30초, 72℃/60초에서 35회, 72℃/5분간 반응시켜 증폭하였고, EtBr을 포함하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머는 CMV의 경우 DPU1 센스 프라이머(5'-CGTCGTGGTTCCCGCTCCG-3': 서열번호 16)와 DPd2 안티센스 프라이머(5'-AGCGCGCATCGCCGAAAGAT-3': 서열번호 17)를 사용하였고, ClYVV의 경우 2F 센스 프라이머(5'-TAAGAGAGGGGCACAGTGGA-3': 서열번호 18)와 2R 안티센스 프라이머 (5'-GCAACAGCACGGGTAACA-3': 서열번호 19)를 사용하였다. 도 12의 결과를 통해, 이것은 다공성 세라믹 큐브에 흡수된 주형으로 현재의 반응액에서 멀티플렉스 RT-PCR이 충분히 가능한 것을 의미하였다.
실시예 6. 본 발명의 LTCC 큐브를 이용하여 대장균을 대상으로 BAC 플라스미드 증폭
다공성 세라믹 큐브는 흡수능력과 함께 여과 효과가 있는 것으로 분석되었는데, 이를 세균 배양액을 큐브에 흡수시키고 이를 주형으로 사용했을 때 PCR이 성공적으로 되는지를 통하여 확인하였다. BAC 콜로니를 멸균된 이쑤시개로 대장균 배양용 액체 배지 5ml에 접종하고, 양성 대조구로 15시간 동안 배양한 대장균을 증식액 1㎕, 2㎕, 3㎕, 4㎕를 주형으로 사용하였다. 랩을 실험대 위에 편평하게 깔고 랩위에 대장균 배양액을 10㎕씩 분주한 다음 다공성 세라믹 큐브(34, LTCC, 850℃)를 한 개, 두 개, 세 개, 네 개를 각각 넣어 대장균을 흡수시켰다. 핀 V으로 대장균이 흡수된 큐브를 건져내고 핀 V에 묻은 여액을 휴지로 제거한 다음 각각의 큐브를 PCR 튜브에 넣고 PCR 반응액을 첨가하였다. PCR 반응액은 2X PCR 프리믹스(gDamp1, Biocubesystem, Korea) 10㎕에 10pmol 센스 프라이머(Primer : 5'-GTCAAATCTGAGGACGCTATGTCT-3': 서열번호 20) 1㎕, 10 pmol 안티센스 프라이머(Primer: 5'-CACTATAGAGAACTAGGTATGTCGTTG-3': 서열번호 21) 1 ㎕, 주형이 흡수된 큐브 1~4개, DW는 최종 부피가 20㎕ 되게 첨가하여 준비하였다. PCR 산물은 95℃에서 3분간 변성시킨 다음, 95℃/30초, 58℃/30초, 72℃/60초에서 30회, 72℃/10분간 반응시켜 증폭하였고, EtBr을 포함하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 목적 PCR 산물의 증폭 유무를 확인하였다(도 13). 배양액을 직접 PCR 주형으로 사용했을 때 첨가한 주형의 양에 따라 PCR 증폭 산물 양이 비례적으로 증가하지 않았다. 반면에 배양액이 흡수된 다공성 세라믹 큐브 처리구에서는 PCR 증폭 산물의 양이 일정하였다. 이것은 다공성 세라믹 큐브 한 개에 흡수된 주형만으로도 현재의 반응액에서 PCR 증폭이 충분히 일어났음을 의미하였다. 따라서 세균을 주형으로 하는 PCR 증폭에도 다공성 세라믹 큐브가 성공적으로 이용될 수 있음을 의미하였다.
실시예 7. 생물학적 분자를 흡수시키기 위해 이용가능한 다공성 세라믹의 형태
본 발명에서는 목적에 따라 생물학적 시료로부터 생물학적 분자를 효율적으로 흡수시키기 위해 도 14와 같은 구조가 이용가능하다. 기본 구조로 공극이 있는 정육면체, 원기둥, 구 또는 직육면체가 가능하고(도 14A), 흡수력을 높이기 위해 내부에 큰 공극을 포함하는 형태가 가능하다(도 14B). 도 14A 구조에서는 단순히 표면 공극으로 유전체를 선택적으로 흡수하지만, 도 14B의 경우는 도 14A보다 흡수율을 높여 흡수하는 유전체의 양을 많게 하는 구조이다. 이것은 홀 외벽의 공극 크기가 일정하게 해야 하며, 홀의 기능은 흡수력을 높이는 것과 동시에 PCR 프라이머를 미리 넣어둬 PCR 단계를 줄일 수 있다. 이는 차후 초기 주형의 양을 많이 필요로 하는 게놈 DNA용 PCR에 적합하다.
또한, 도 14C의 중간 및 오른쪽에 나타낸 구조는 생물학적 분자를 흡수시킨 후 홈이 있는 오른쪽 부위에 살짝 힘을 가하여 이 부분이 떨어져 PCR 튜브로 용이하게 들어가게 한 것인데 큐브의 크기가 너무 작기 때문에 실제 제품을 생산할 때 이용할 수 있는 구조로 사각형의 경우 막대 선단쪽 1mm3 정도로 쉽게 떨어질 수 있도록 홈 부분을 일부 절단한 것이고, 막대 뒷부분은 손잡이 용으로 제작한 플라스틱 봉이 끼워지는 자리이다. 도 14D의 끝이 날카로운 모양을 갖는 구조는 종자나 수목을 대상으로 할 경우 찌르기 쉽게 하기 위한 구조인데, 막대가 동일 재질로 구성되어 있을 때 막대 전체로 유전체가 유입될 수 있기 때문에 막대 부분의 크기만큼 흡수력을 높이고 PCR 튜브에 들어가는 선단부에 유전체가 모이게 하기 위해 재료를 달리하여 설계가 가능하며, 오염 방지 및 흡수력 증가에 매우 효과적이다.

Claims (18)

  1. 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물, 식물, 세균 또는 곰팡이 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 DNA, RNA, dsRNA, microRNA, 비로이드(viroid), 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 미세조류인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭 반응은 cDNA 합성, PCR(Polymerase Chain Reaction), 멀티플렉스(multiplex) PCR 또는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 고체상은 탄화셀룰로오스류, 종이를 입자 형태로 뭉친 것, 천연 또는 합성 제오라이트, 폴리스틸렌(polystylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌(polyprophylene), 다공성 금속 입자, 다공성 고무, 유리섬유를 입자 형태로 뭉친 세공성 유리, 석회, 조개껍질, 도자기 절편 및 산화물 재질의 세라믹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산화물 재질의 세라믹의 주성분은 Al2O3, Fe2O3, LTCC(Low temperature co-fired ceramic), PbO 또는 ZnO인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다공성 고체상은 정육면체, 직육면체, 구, 원기둥, 막대 형태(bar type), 막대의 한쪽 말단에 홈이 있는 막대 형태 또는 끝이 뾰족한 막대 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. (a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 증폭 반응은 PCR(Polymerase Chain Reaction)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. (a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상에 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 역전사 효소 반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 역전사 효소 반응물을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 표적 서열을 증폭하는 방법.
  11. (a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법.
  12. (a) 생물학적 시료에 다공성 고체상을 접촉시켜 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 흡수시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 생물학적 분자를 흡수시킨 다공성 고체상에 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 역전사 효소 반응을 수행하는 단계;
    (c) 상기 역전사 효소 반응물을 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (d) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법.
  13. 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 다공성 고체상의 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상; 표적 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 서열을 증폭하기 위한 핵산 증폭 반응용 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제13항에 있어서, 상기 다공성 고체상은 탄화셀룰로오스류, 종이를 입자 형태로 뭉친 것, 천연 또는 합성 제오라이트, 폴리스틸렌(polystylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌(polyprophylene), 다공성 금속 입자, 다공성 고무, 유리섬유를 입자 형태로 뭉친 세공성 유리, 석회, 조개껍질, 도자기 절편 및 산화물 재질의 세라믹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 키트.
  17. 생물학적 시료 내에 존재하는 생물학적 분자를 공극으로 신속하게 흡수시킬 수 있는 다공성 고체상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 다공성 고체상은 탄화셀룰로오스류, 종이를 입자 형태로 뭉친 것, 천연 또는 합성 제오라이트, 폴리스틸렌(polystylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌(polyprophylene), 다공성 금속 입자, 다공성 고무, 유리섬유를 입자 형태로 뭉친 세공성 유리, 석회, 조개껍질, 도자기 절편 및 산화물 재질의 세라믹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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