JP2008086271A

JP2008086271A - 標的核酸の検出法

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Publication number: JP2008086271A
Application number: JP2006271684A
Authority: JP
Inventors: Yuuri Mizutani; 有里水谷
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2006-10-03
Filing date: 2006-10-03
Publication date: 2008-04-17

Abstract

【課題】標的核酸の検出法として、ＤＮＡマイクロアレイ技術が存在する。しかし、プローブやターゲットに標識を行う必要があること、装置構成の関係からプローブ数に限度があること、固液相反応なのでハイブリ反応に時間がかかる。
【解決手段】サンプル溶液中の標的核酸を同定するための方法であって、サンプル溶液中の標的核酸と前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブとをハイブリダイゼーション反応させる工程と、前記ハイブリダイゼーション反応を行った溶液を分子篩に供給し、前記標的核酸とハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしなかったプローブとを分離する工程と、前記ハイブリダイズしたプローブを質量分析する工程と、前記質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定する工程とを有することを特徴とする方法。
【選択図】図１

Description

本発明はいわゆる質量分析計を用いた標的核酸（ウイルス、微生物、動植物、ヒトなど）の検出法に関するものであり、特に菌などの微生物の種類を検出する方法に関するものである。

従来、感染症を発症した患者の原因菌を判定する技術として“培養法”と呼ばれる技術がある。この方法は、患者から採取した血液に含まれる菌を特定の培地中で培養し、増殖した菌を観察することによって、感染症の原因菌を特定する。

この技術の欠点は、原因菌の判定に数日の時間を必要とし、患者への治療方針を決める前に原因菌を判定することが、ほぼ不可能であるという点にある。つまり、本来は抗生物質などの治療薬を患者に投与する前に原因菌を特定しておくことが望ましい。しかし、数日後の判定結果を待っていては、患者の病状が悪化し、手遅れになってしまう可能性が高い。このため、原因菌の判定を行う前に、複数の可能性に対応した薬剤の投与をしなければならない。そして結果的に患者に対して薬剤の効果と引き換えに副作用のリスクを負わせることとなっていた。

このような問題を解決するための１つの方法として、原因菌のＤＮＡ解析によって感染症の原因菌を判定する方法がある。この方法は、原因菌内ゲノムのある特定の部分を、例えばＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法やＬＡＭＰ法などの生化学的方法を用いて増幅し、その増幅した核酸配列を読み取ることによって原因菌の判定を行うものである。これらの方法を用いると、短時間での判定が可能であり、しかも原因菌の種類によることなく複数の原因菌について判定ができる。

また、問題を解決する他の方法として、増幅された対象生物由来の核酸断片を、プローブと呼ばれる核酸断片とハイブリダイゼーション反応させることにより、対象生物由来の核酸断片の量を定量する方法が開示されている（例えば特許文献１を参照）。さらに、高密度に集積されたＤＮＡマイクロアレイを用いることにより、１つの対象核酸断片に対して、多数のプローブを設定することが可能となる。その結果、対象核酸断片の配列を読み取るのと同じぐらいの情報を短時間で得ることができる。
米国特許第６０４０１３８号明細書

しかしながら、上記従来技術に示した方法のうち、原因菌のＤＮＡ解析によって感染症の原因菌を判定する方法は、核酸配列の読み取りに非常に高い技術スキルとコストがかかる。ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などのＤＮＡ増幅手法自体は簡単な手順で実施できるが、次工程となる核酸配列の読み取りを可能にするためには、増幅された核酸断片について高い純度が要求される。さらに、シークエンサーと呼ばれる“核酸配列の読み取り装置”は高価であり、読み取りのための操作はＰＣＲ法やＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅に比べて遥かに複雑で、通常の検査技師のスキルでは実施が困難な場合が多い。

一方、ハイブリダイゼーション反応による方法は、シークエンサーに比べて必要なスキルは押さえられるものの、ＤＮＡマイクロアレイを作製する時の基板処理や基板に固定するためのプローブの標識化、また検出するためのＰＣＲ産物の標識化が必要である。また、多数のプローブを載せた基板を作製するための位置決め精度を持つ装置や蛍光標識をスキャンする装置も必要であり、コストが高くなり、更に各工程処理に時間がかかる。またプローブの管理やＤＮＡマイクロアレイの製造装置上の関係からプローブ数、つまり調べられる菌数にも制限が出てきてしまう。またＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションは固相液相反応なので、安定したハイブリダイゼーションが行われるまでには時間を要するので、ハイブリダイゼーションを開始してから検出までに約４時間という長時間を必要とするという課題がある。

本発明は、上記課題を解決するために次の（１）〜（８）のように示した標的核酸の検出方法を提供するものである。

（１）サンプル溶液中の標的核酸を同定するための方法であって、
サンプル溶液中の標的核酸と前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブとをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
前記ハイブリダイゼーション反応を行った溶液を分子篩に供給し、前記標的核酸とハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしなかったプローブとを分離する工程と、
前記ハイブリダイズしたプローブを質量分析する工程と、
前記質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定する工程と、
を有することを特徴とする方法。

（２）前記分子篩による分離が、ゲルろ過または限外ろ過である（１）に記載の方法。

（３）前記標的核酸の所定の塩基配列部分に特異的に結合可能なプローブは、各々のプローブ分子量Ｍ_probeが異なり、それぞれのプローブは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差を有することを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。

（４）前記標的核酸は、ウイルス、微生物、動植物またはヒトの標的核酸であることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の方法。

（５）サンプル溶液中の標的核酸を同定するための方法であって、
サンプル溶液中の標的核酸と前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ群とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
前記ハイブリダイゼーション反応を行った溶液を分子篩に供給し、前記標的核酸とハイブリダイズしたプローブ群とハイブリダイズしなかったプローブ群とを分離する工程と、
前記ハイブリダイズしたプローブ群を質量分析する工程と、
前記質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定する工程と、
を有することを特徴とする方法。

（６）前記分子篩による分離が、ゲルろ過または限外ろ過である（５）に記載の方法。

（７）前記標的核酸の所定の塩基配列部分に特異的に結合可能なプローブ群は、各々で分子量Ｍ_probeが異なり、それぞれのプローブ群は、前記質量分析において、弁別可能な分子量差を有することを特徴とする（５）または（６）に記載の方法。

（８）前記標的核酸は、ウイルス、微生物、動植物またはヒトの標的核酸であることを特徴とする（５）から（７）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、標的核酸やプローブに一切標識する必要がないため、それにかかる処理工程を削減できる。また、一連の工程が単純となり、更に液相反応を利用することでハイブリダイゼーション反応の時間も高速となるため、検出までの時間を短くすることが可能となる。

本発明は、標的核酸と特異的に結合可能なプローブとをハイブリダイゼーション反応させた後に分子篩に供給することで、ハイブリダイゼーションしているプローブとしていないプローブとの分離を行う。分子篩による分離が、ゲルろ過または限外ろ過であると簡便で好ましいが、ゲルろ過であると更なる時間短縮が可能となり好ましい。そして、ハイブリダイゼーションしているプローブと標的核酸とのハイブリッド体を、質量分析計（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いて質量分析し、得られた分子量から標的核酸の検出を行うことを特徴とする。

まず、ＰＣＲを行いサンプルから標的部位の増幅を行う。続いて、様々な種類の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプローブの入ったハイブリ溶液中（バッファー）で、サンプルから標的部位を増幅した核酸とハイブリダイズさせる。標的核酸に特異的に結合可能なプローブは、各々で分子量が異なり、質量分析を行う際に弁別可能な分子量差を有することが好ましい。ここで弁別可能な分子量差とは、質量分析計の測定精度よりも大きい値である。

ハイブリダイゼーションしたプローブと、ハイブリダイゼーションしていないプローブとの分離は、ゲルろ過式のスピンカラムを用いて行う。ゲル粒子は網目構造であり、網目の大きさが一様でない。そのため、大きい分子はゲル粒子中に寄り道ができないため直ちに溶出し、中程度の分子は適当に寄り道しながら溶出し、小さい分子はブラウン運動で網目構造の奥まで自由に寄り道しながら溶出することになる。ハイブリダイゼーションしたオリゴプローブは標的核酸の塩基長が長いため、ゲルろ過を行うと直ちに溶出される。ゲルろ過のスピンカラム内のゲル粒子の網目のサイズは目的の分子量に応じて選択する必要があるので、オリゴプローブ単体とハイブリダイゼーションしたオリゴプローブとを分別することが可能な網目サイズを選択する必要がある。またゲルろ過で溶出する際は、ハイブリダイゼーション反応を行ったハイブリ液をそのまま注入すればよい。

さらに、ゲルろ過後の液（すなわちバッファー）にはＮａ⁺などのカチオンが存在している。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定の際に、Ｎａ⁺やＫ⁺などのカチオンが存在すると、負に帯電したリン酸骨格構造に強く親和し、多価イオンの生成が阻害され、質のよい多価イオンスペクトルが得られなくなる。よって、カチオンを除去するために、陽イオン交換カラムを使用している。

得られたハイブリダイゼーションしたプローブの質量分析を行う。質量分析は、通常用いられる方法で行う事ができるが、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなどを挙げることができる。

上記質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定することができる。本願発明の方法を用いることができる標的核酸として、特にウイルス、微生物、動植物、ヒトの標的核酸を挙げることができる。

上記に示した操作の流れを図１に示す。以下には実施例を挙げて、標的核酸の検出方法に関して、より詳しく説明する。

実施例１は、本発明の基本形態である標的核酸の検出方法であり、標的核酸に対してプローブが一種類の場合の実施例である。実施例２も標的核酸の検出方法であるが、実施例１よりも一つの標的核酸を検出するためのプローブ数を多くし、情報量を多くすることで精度を上げた場合の実施例である。

以下の実施形態では本発明を用いて、感染症起炎菌（黄色ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌）の核酸検出を行った。

（実施例１）
１つの標的核酸に対して１種類のプローブを入れて、標的核酸を検出する場合
［１．プローブＤＮＡの準備］
６種の起炎菌の株を検出するための検出用プローブとして、表１に示す核酸配列を設計した。具体的には、各菌の１６ｓＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列は、当該菌に対し非常に特異性が高く、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきのない、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、表１に示す各プローブ塩基配列はこれに完全に一致したものに限定される必要はない。つまり、各プローブ塩基配列を含む２０から３０程度の塩基長を有するプローブ塩基配列も各表に示す各プローブ塩基配列に含まれるものとする。

なお、以下の各表において、ＰｒｏｂｅＮｏ．は便宜的に割り当てた符号である。

［２．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備］
上記の起炎菌検出用の為の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲプライマーとして、表２に示す核酸配列を設計した。具体的には、１６ｓｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプライマー、つまり約１４００〜１７００塩基長の１６ｓｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。なお、起炎菌の１６ｓｒＲＮＡコーディング領域に対して共通にほぼ全長を増幅できるプライマーセットであれば、表２に挙げたプライマーセットに限定する必要がないことは言うまでもない。

表２に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒを３種、ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒを３種、混合した。それぞれのプライマー濃度が、最終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。

［３．各起炎菌ＧｅｎｏｍｅＤＮＡ（モデル検体）の抽出］
［３−１］微生物の培養＆ＧｅｎｏｍｅＤＮＡ抽出の前処理
上記各起炎菌の標準株（黄色ブドウ球菌標準株（ＡＴＣＣ１２６００）、大腸菌標準株（ＡＴＣＣ１１７７５）、肺炎桿菌標準株（ＡＴＣＣ１３８８３）、緑膿菌標準株（ＡＴＣＣ１０１４５）、肺炎連鎖球菌標準株、インフルエンザ菌株）を定法に従って培養し、微生物培養液を生成した。これらの微生物培養液のそれぞれを１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに１．０ｍｌ（ＯＤ６００＝０．７）採取し、遠心分離で菌体を回収した（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。次に、上清を捨てた後、ＥｎｚｙｍｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０、２５ｍＭＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度遠心分離で菌体を回収した（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。上清を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した
Lysozyme ５０μｌ（２０ｍｇ/ｍｌ in Enzyme Buffer）
N−Acetylmuramidase SG ５０μｌ（０．２ｍｇ/ｍｌ in Enzyme Buffer）
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。

［３−２］Ｇｅｎｏｍｅ抽出
以上に示した微生物のＧｅｎｏｍｅＤＮＡ抽出は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行った。

具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ４０μｌを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌した（ステップ１）。

次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てた（ステップ２）。

次に、洗浄液９００μｌを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）。

次に、分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上清を捨てた（ステップ４）。

上記ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄を行った（ステップ５）。その後、７０％エタノール９００μｌを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁した（ステップ６）。

次に、分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てた（ステップ７）。

ステップ６、７を繰り返して７０％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水１００μｌを加え、チューブミキサーで１０分間攪拌を行った（ステップ９）。

次に分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を新しいチューブに回収した。

［３−３］回収したＧｅｎｏｍｅＤＮＡの検査
回収された微生物（各起炎菌株）のＧｅｎｏｍｅＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。本実施例では、それぞれの菌において、約９〜１０μｇのＧｅｎｏｍｅＤＮＡが回収され、ＧｅｎｏｍｅＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したＧｅｎｏｍｅＤＮＡは、最終濃度５ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。

［４．検体の増幅（ＰＣＲ増幅）］
検体となる微生物遺伝子の増幅反応（１ｓｔＰＣＲ）、および片鎖化反応（２ｎｄＰＣＲ）を以下に示す。

［４−１］１ｓｔＰＣＲ

上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。即ち、９５℃／１０分の保持の後、９２℃（変性）／４５秒、６５℃（アニーリング）／４５秒、および７２℃（伸長）／４５秒を１サイクルとして４０サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。

反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いてプライマーを除去（精製）した後、増幅産物の定量を行った。

［４−２］２ｎｄＰＣＲ

上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。即ち、９５℃／１０分の保持の後、９２℃（変性）／４５秒、６５℃（アニーリング）／４５秒、および７２℃（伸長）／４５秒を１サイクルとして２５サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。

反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去（精製）した。

［５．ハイブリダイゼーション］
上述の［１．プローブＤＮＡの準備］と［４．検体の増幅（ＰＣＲ増幅）］で作製した検体とを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。

［５−１］ハイブリダイゼーション溶液
ハイブリダイゼーション溶液は、［４．検体の増幅（ＰＣＲ増幅）］で作製した（ｉ）全６種類の菌をミックスさせたもの、（ｉｉ）３種類の菌（黄色ブドウ球菌、大腸菌、肺炎連鎖球菌）をミックスさせたもの、の２種類を作製した
組成は以下の通りである
６×ＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／Ｔａｒｇｅｔ（２ｎｄＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔ各菌１０μｌ）／プローブ（各菌２μＭ）
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ９００ｍＭ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ６０ｍＭ，ＥＤＴＡ６ｍＭ，ｐＨ７．４）。

［５−２］ハイブリダイゼーション条件
９２℃ ２分 →５０℃ １時間（９２℃で２分ディネーチャーを行った後、５０℃で１ｈｒハイブリダイゼーションを行った）。

［６．ゲルろ過］
上述［５．ハイブリダイゼーション］のハイブリ反応溶液をゲルに通過させて、検体とハイブリダイズしていないプローブと検体とハイブリダイズしているプローブの分離を行った。

ゲルろ過にはＭｉｃｒｏＳｐｉｎＳ−２００ＨＲｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャルバイオサイエンス株式会社）を用いた。具体的に示すと、まずゲルろ過スピンカラムを室温に戻した。次にカラム内のレジンをよく懸濁した。カラムのキャップを緩め、カラムの先端を折った後、キャップを閉めた。カラムを２ｍｌのチューブに入れて、８００×ｇ（３０００ｒｐｍ）にて１分間遠心分離した。２ｍｌのチューブ内に溜まった液を捨てて、カラムを元の状態に戻した。次に超純水０．４ｍｌをカラム内に加えて、キャップを閉めた。続いて、８００×ｇ（３０００ｒｐｍ）にて１分間遠心分離した。カラムを１．５ｍｌのチューブに乗せかえた。そして、ハイブリ反応溶液５０μｌをカラム中央に染み込ませるように一滴ずつゆっくりと滴下した。そして、８００×ｇ（３０００ｒｐｍ）で２分間遠心分離した。この結果、検体とプローブでハイブリダイズしているハイブリッド体の抽出を行うことができた。

［７．質量分析］
上述［６．ゲルろ過］で抽出したハイブリッド体の質量分析を行った。

［７−１］質量分析の前処理
ゲルろ過で抽出したハイブリッド体の溶液に陽イオン交換カラムを使用して、イオン解離したＮａカチオンの脱離処理を施した。前記の処理によって金属カチオン種を完全に除去される。

上述［６．ゲルろ過］および［７−１］の質量分析の前処理によって得られたサンプルを、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により分析を行う前に、マトリックスを準備した。マトリックスに利用する３−ヒドロキシピコリン酸を、水／アセトニトリル（体積比で７０：３０）中に濃度２０ｍｇ／ｍＬになるように溶解した。

上記の３−ヒドロキシピコリン酸溶液１μｌと、ゲルろ過後、陽イオン交換を行った後の溶液１μｌとをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの核酸専用サンプルホルダー（ＭＴＰＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（登録商標）４００／３８４ＴＦ）上に載せ、乾燥して、３−ヒドロキシピコリン酸の結晶化を行った。

［７−２］質量分析
サンプルホルダー上の試料に含まれる、サンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ブルカー・ダルトニクス株式会社、装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ）にて質量分析した。

質量分析スペクトル中から、実測されたイオン種の質量数に基づき、ハイブリッド体を組んでいた核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe−obs）を決定し、その分子量に対応する菌種の確定を行った。表３に、全６種類の菌種を入れた際の各プローブに対応する分子量の理論値（Ｍprobe）、ならびに、実測値（Ｍprobe−obs）の組み合わせを示す。一方、表４に３種類の菌種を入れた際の各プローブに対応する分子量の理論値（Ｍprobe）、ならびに、実測値（Ｍprobe−obs）の組み合わせを示す。また質量分析は５分で終了した。

表３により、各プローブの理論値である分子量に近い値が、質量分析でも得られていることが確認された。また表３と表４の比較により、検体に混ぜられていない肺炎桿菌と緑膿菌とインフルエンザ菌に関しては、質量分析のピークが確認されないことを確認した。

（実施例２）
１つ標的核酸に対して複数のプローブを入れて、標的核酸を検出する場合
プローブＤＮＡとして表５に示すプローブ（複数）を調製したこと以外は実施例１と同様にして行った。
［１．プローブＤＮＡの準備］
６種の起炎菌の株検出用プローブとして、表５に示す核酸配列を設計した。具体的には、各菌の１６ｓＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列は、当該菌に対し非常に特異性が高く、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきのない、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、表５に示す各プローブ塩基配列はこれに完全に一致したものに限定される必要はなく、各プローブ塩基配列を含む２０から３０程度の塩基長を有するプローブ塩基配列も各表に示す各プローブ塩基配列に含まれるものとする。

サンプルホルダー上の試料に含まれる、サンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ブルカー・ダルトニクス株式会社装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ）にて質量分析する。

質量分析スペクトル中から、実測されたイオン種の質量数に基づき、ハイブリッド体を組んでいた核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe−obs）を決定し、その分子量に対応する菌種の確定を行った。表６に、全６種類の菌種を入れた際の各プローブに対応する分子量の理論値（Ｍprobe）、ならびに、実測値（Ｍprobe−obs）の組み合わせを示す。一方、表７に３種類の菌種を入れた際の各プローブに対応する分子量の理論値（Ｍprobe）、ならびに、実測値（Ｍprobe−obs）の組み合わせを示す。また質量分析は５分で終了した。

表６により、各プローブの理論値である分子量に近い値が、質量分析でも得られていることが確認された。また表６と表７の比較により、検体に混ぜられていない肺炎桿菌と緑膿菌とインフルエンザ菌に関しては、質量分析のピークが確認されないことを確認した。

上記のように、本発明に係る方法は、用いるプローブの数（種類）に一切制限がない。即ち、既知の核酸配列を持つプローブをサンプル中に供給すればいいだけであるため、多種類（例えば、１００種類や１００００種類）の核酸配列を持つプローブを用意することで、同時に多くの情報を一括して得ることができる。

本発明の方法を示した図である。

Claims

サンプル溶液中の標的核酸を同定するための方法であって、
サンプル溶液中の標的核酸と前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブとをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
前記ハイブリダイゼーション反応を行った溶液を分子篩に供給し、前記標的核酸とハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしなかったプローブとを分離する工程と、
前記ハイブリダイズしたプローブを質量分析する工程と、
前記質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定する工程と、
を有することを特徴とする方法。
前記分子篩による分離が、ゲルろ過または限外ろ過である、請求項１に記載の方法。
前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブは、各々で分子量Ｍ_probeが異なり、それぞれのプローブは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記標的核酸は、ウイルス、微生物、動植物またはヒトの標的核酸であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
サンプル溶液中の標的核酸を同定するための方法であって、
サンプル溶液中の標的核酸と該標的核酸と特異的に結合可能なプローブ群とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
該ハイブリダイゼーション反応を行った溶液を分子篩に供給し、前記標的核酸とハイブリダイズしたプローブ群とハイブリダイズしなかったプローブ群とを分離する工程と、
該ハイブリダイズしたプローブ群を質量分析する工程と、
該質量分析で得られた分子量から標的核酸を同定する工程と、
を有することを特徴とする方法。
前記分子篩による分離が、ゲルろ過または限外ろ過である、請求項５に記載の方法。
前記プローブ群は、各々で分子量Ｍ_probeが異なり、それぞれのプローブ群は、前記質量分析において、弁別可能な分子量差を有することを特徴とする請求項５または６に記載の方法。
前記標的核酸は、ウイルス、微生物、動植物またはヒトの標的核酸であることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の方法。