WO2014017067A1 - 構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡 - Google Patents

構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡 Download PDF

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WO2014017067A1
WO2014017067A1 PCT/JP2013/004446 JP2013004446W WO2014017067A1 WO 2014017067 A1 WO2014017067 A1 WO 2014017067A1 JP 2013004446 W JP2013004446 W JP 2013004446W WO 2014017067 A1 WO2014017067 A1 WO 2014017067A1
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diffraction grating
wavelength
light
structured
structured illumination
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PCT/JP2013/004446
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Inventor
大内　由美子
Original Assignee
株式会社ニコン
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Publication date
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0064—Optical details of the image generation multi-spectral or wavelength-selective arrangements, e.g. wavelength fan-out, chromatic profiling

Definitions

  • the present invention relates to a structured illumination device and a structured illumination microscope.
  • the specimen In the field of specimen (specimen) observation and measurement, to achieve a resolution that exceeds the performance of the objective lens, the specimen is illuminated with spatially modulated illumination light (structured illumination light) to produce an image (modulated image).
  • structured illumination light spatially modulated illumination light
  • a structured illumination microscope that generates a super-resolution image (demodulated image) of a sample by acquiring and removing (demodulating) a modulation component contained in the modulated image has been proposed (see Patent Document 1).
  • a light beam emitted from a light source is branched into a plurality of light beams by a diffraction grating or the like, and these light beams interfere with each other in the vicinity of a sample to form interference fringes.
  • This is structured illumination light.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a structured illumination apparatus and a structured illumination microscope apparatus having a configuration that is advantageous for expanding the wavelength range used.
  • two light branching portions that individually split two kinds of light beams having different wavelengths and a plurality of branching components generated in each of the two light branching portions on a sample are provided.
  • An optical system for interference is provided.
  • one aspect of the structured illumination microscope of the present invention includes one aspect of the structured illumination apparatus of the present invention and a detection optical system that detects an image of the specimen illuminated by the optical system.
  • FIG. 3A is a view of the first diffraction grating 131 ′ viewed from the direction along the optical axis
  • FIG. 3B is a diagram showing three pairs of ⁇ first-order diffracted lights generated by the first diffraction grating 131 ′.
  • Is a diagram showing three pairs of condensing points formed on the pupil conjugate plane 6A ′
  • FIG. 3C is a diagram showing the polarization direction of the light transmitted through the half-wave plate.
  • 4 is a diagram illustrating a liquid crystal element 63.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 includes a laser unit 100, an optical fiber 11, an illumination optical system 10, an imaging optical system 30, a first image sensor 351, and a second image sensor 352.
  • a control device 39, an image storage / arithmetic device 40, and an image display device 45 are provided.
  • the illumination optical system 10 is an epi-illumination type and illuminates the specimen 5 via the first dichroic mirror 7 and the objective lens 6 of the imaging optical system 30.
  • the laser unit 100 includes a first laser light source 101, a second laser light source 102, shutters 103 and 104, a mirror 105, a dichroic mirror 106, a lens 107, and the like.
  • Each of the first laser light source 101 and the second laser light source 102 is a coherent light source, and the emission wavelengths thereof are different from each other.
  • the wavelength ⁇ 1 of the first laser light source 101 is longer than the wavelength ⁇ 2 of the second laser light source 102 ( ⁇ 1> ⁇ 2).
  • the laser light having the wavelength ⁇ 1 emitted from the first laser light source 101 enters the dichroic mirror 106 through the shutter 103 and the mirror 105, the laser light is reflected by the dichroic mirror 106.
  • the laser beam having the wavelength ⁇ 2 emitted from the second laser light source 102 enters the beam splitter 106 via the shutter 104, the laser beam is transmitted through the dichroic mirror 106 and integrated with the laser beam having the wavelength ⁇ 1.
  • the optical fiber 11 is, for example, a multimode optical fiber. If such a multimode optical fiber is used, the temporal coherency of laser light can be reduced.
  • the illumination optical system 10 includes a collector lens 12, a dichroic mirror 55, a mirror 56, a first polarizing plate 231, a second polarizing plate 232, a first diffractive optical element (first diffraction grating) 131, A two-diffractive optical element (second diffraction grating) 132, a dichroic mirror 57, a mirror 58, a condenser lens 16, a zero-order light cut mask 14, a lens 25, a field stop 26, a field lens 27,
  • the excitation filter 28, the first dichroic mirror 7, and the objective lens 6 are disposed.
  • the laser light emitted from the emission end (point light source) of the optical fiber 11 is converted into a parallel light beam by the collector lens 12 and then enters the dichroic mirror 55.
  • the laser light incident on the dichroic mirror 55 the laser light having the wavelength ⁇ 1 is transmitted through the dichroic mirror 55 and incident on the first diffraction grating 131 via the first polarizing plate 231. Is done. These diffracted light beams enter the dichroic mirror 57 via the mirror 58 and are reflected by the condenser lens 16 when reflected by the dichroic mirror 57.
  • the laser light incident on the dichroic mirror 55 the laser light having the wavelength ⁇ 2 reflects the dichroic mirror 55 and enters the second diffraction grating 132 via the mirror 56 and the second polarizing plate 232. Is branched into diffracted light beams. These diffracted light beams pass through the dichroic mirror 57 and are collected by the condenser lens 16.
  • the first diffraction grating 131 is a one-way diffraction grating having a periodic structure (grating pitch) in a predetermined direction (direction perpendicular to the grating line) in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system 10.
  • the first polarizing plate 231 is a polarizing plate that adjusts the polarization direction of the laser light incident on the first diffraction grating 131 in the same direction as the grating line of the first diffraction grating 131. Further, the distance from the arrangement surface of the first diffraction grating 131 to the condenser lens 16 corresponds to the focal length of the condenser lens 16.
  • the pupil conjugate plane 6A ' is the focal position (rear focal position) of the lens 16, and the lens 27 and the lens 25 with respect to a pupil 6A (a position where ⁇ first-order diffracted light is condensed) of the objective lens 6 described later.
  • These positions are concepts that include positions determined by a person skilled in the art in consideration of design requirements such as aberration and vignetting of the objective lens 6 and the lenses 27 and 25.
  • the direction of translational movement may be a direction having a component in the same direction as the branching direction even if it does not coincide with the branching direction.
  • the first diffraction grating 131 and the first polarizing plate 231 can be rotated around the optical axis at a pitch of 120 ° by the first rotation mechanism 151B.
  • an electric motor or the like can be applied as the first rotation mechanism 151B.
  • the first diffraction grating 131 rotates, the direction of the interference fringes (described later) of the wavelength ⁇ 1 switches between 0 °, 120 °, and 240 °, and the first polarizing plate 231 rotates together with the first diffraction grating 131.
  • the relationship between the branching direction of the diffracted light beam with wavelength ⁇ 1 and the polarization direction is maintained, and as a result, the diffracted light beam contributing to the interference fringes with wavelength ⁇ 1 is maintained as s-polarized light.
  • the direction of translational movement by the first translation mechanism 151A is the same component as that in the branching direction when the rotation position of the first diffraction grating 131 is 0 °, 120 °, or 240 °. It is assumed that the predetermined direction is set. However, in this case, since the relationship between the translational movement amount and the phase shift amount varies depending on the rotation position of the first diffraction grating 131, the translation is performed so that the phase shift amount becomes equal regardless of the rotation position of the first diffraction grating 131. It is assumed that the movement pitch is set for each rotation position of the first diffraction grating 131.
  • the second diffraction grating 132 is a one-way diffraction grating having a periodic structure (grating pitch) in a predetermined one direction (direction perpendicular to the grating line) in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system 10.
  • the second polarizing plate 232 is a polarizing plate that adjusts the polarization direction of the laser light incident on the second diffraction grating 132 in the same direction as the grating line of the second diffraction grating 132. Further, the distance from the arrangement surface of the second diffraction grating 132 to the condenser lens 16 corresponds to the focal length of the condenser lens 16.
  • the direction of translational movement may be a direction having a component in the same direction as the branching direction even if it does not coincide with the branching direction.
  • the second diffraction grating 132 and the second polarizing plate 232 can be rotated around the optical axis at a pitch of 120 ° by the second rotation mechanism 152B.
  • the structure similar to the above-mentioned 1st rotation mechanism 151B is applicable.
  • the direction of translation by the second translation mechanism 152A is the same component as that of the branching direction when the second diffraction grating 132 is rotated at 0 °, 120 °, or 240 °. It is assumed that the predetermined direction is set. However, in this case, since the relationship between the translational movement amount and the phase shift amount varies depending on the rotation position of the second diffraction grating 132, the translation is performed so that the phase shift amount becomes equal regardless of the rotation position of the second diffraction grating 132. The movement pitch is set for each rotation position of the second diffraction grating 132.
  • the relationship between the structural period (grating pitch) of the first diffraction grating 131 and the structural period (grating pitch) of the second diffraction grating 132 is the ⁇ first-order diffraction generated in the first diffraction grating 131.
  • the diffraction angle of the light beam and the diffraction angle of the ⁇ first-order diffracted light beam generated by the second diffraction grating 132 are set to be equal.
  • the grating pitch of the second diffraction grating 132 is the first diffraction grating. It is set finer by a fixed amount than the lattice pitch of the lattice 131.
  • the arrangement pattern (arrangement interval) of the condensing point pairs (condensing point pair of wavelength ⁇ 1) formed on the pupil conjugate plane 6A ′ by the ⁇ first-order diffracted light beams generated by the first diffraction grating 131, and the first The arrangement pattern (arrangement interval) of the condensing point pair (condensing point pair of wavelength ⁇ 2) formed on the pupil conjugate plane 6A ′ by the ⁇ first-order diffracted light beams generated by the two diffraction gratings 132 is the same (however, the wavelength (The arrangement direction of the collection point pair of ⁇ 1 depends on the rotation position of the first diffraction grating 131, and the arrangement direction of the collection point pair of wavelength ⁇ 2 depends on the rotation position of the second diffraction grating 132.) .
  • the diffracted light beams of the respective orders from the first diffraction grating 131 or the second diffraction grating 132 toward the pupil conjugate plane 6A ′ enter the 0th-order light cut mask 14 arranged in the vicinity of the pupil conjugate plane 6A ′.
  • ⁇ 1st-order diffracted light beams pass through the 0th-order light cut mask 14, and other diffracted light beams are cut by the 0th-order light cut mask 14.
  • the 0th-order light cut mask 14 is formed by forming a plurality of openings or transmission parts on a mask substrate.
  • the positions of the openings or transmission parts on the substrate are ⁇ 1st order diffracted light on the pupil conjugate plane. Corresponds to the incident position.
  • the ⁇ 1st-order diffracted light beam of wavelength ⁇ 1 that has passed through the 0th-order light cut mask 14 forms a surface (image of the first diffraction grating 131) conjugate with the first diffraction grating 131 near the field stop 26 by the lens 25,
  • the ⁇ 1st-order diffracted light beam of wavelength ⁇ 2 that has passed through the 0th-order light cut mask 14 forms a plane (image of the second diffraction grating 132) conjugate with the second diffraction grating 132 in the vicinity of the field stop 26 by the lens 25.
  • One and the other of the ⁇ first-order diffracted light beams incident on the field stop 26 are converted into parallel light by the field lens 27, and after passing through the excitation filter 28, reflected by the first dichroic mirror 7, and the pupil plane 6 ⁇ / b> A of the objective lens 6.
  • the light is condensed at positions symmetrical to each other with respect to the optical axis.
  • the condensing points formed on the pupil plane 6A include a condensing point pair having a wavelength ⁇ 1 and a condensing point pair having a wavelength ⁇ 2.
  • the arrangement pattern (arrangement interval) of the condensing point pair of wavelength ⁇ 2 on the pupil plane 6A is the same (however, the arrangement direction of the condensing point pair of wavelength ⁇ 1 is the rotation of the first diffraction grating 131) Depending on the position, the direction in which the pair of condensing points of wavelength ⁇ 2 is arranged depends on the rotational position of the second diffraction grating 132).
  • the interference fringes formed on the sample 5 include an interference fringe having a wavelength ⁇ 1 and an interference fringe having a wavelength ⁇ 2. These interference fringes are used as structured illumination light for spatially modulating the specimen 5.
  • the periodic structure of the interference fringes and the periodic structure (of the fluorescent region) of the specimen 5 When the specimen 5 is illuminated with such interference fringes, the periodic structure of the interference fringes and the periodic structure (of the fluorescent region) of the specimen 5 generate moire fringes. In the moire fringes, the high-frequency structure of the specimen 5 is generated. Is shifted to a lower frequency side than the original frequency, the light generated according to this structure travels toward the objective lens 6 at an angle smaller than the original angle. Therefore, when the specimen 5 is illuminated by the interference fringes, even the high-frequency structural information of the specimen 5 is transmitted by the objective lens 6 and a super-resolution effect is obtained.
  • the super-resolution effect is a ratio between the resolution R of the structured illumination microscope apparatus 1 when the specimen 5 is not modulated and the resolution (R + K) of the structured illumination microscope apparatus 1 when the specimen 5 is modulated. (R + K) / R.
  • the super-resolution effect (R ( ⁇ ) + K (P)) / R ( ⁇ ) has a wavelength ⁇ 1. , ⁇ 2 is not common.
  • the arrangement pattern of the condensing point pair of the wavelength ⁇ 1 on the pupil plane 6A and the arrangement pattern of the condensing point pair of the wavelength ⁇ 2 on the pupil plane 6A are the same.
  • An appropriate difference was given between the grating pitch P1 of the first diffraction grating 131 and the grating pitch P2 of the second diffraction grating 132.
  • the grating pitch P1 of the first diffraction grating 131 and the grating pitch P2 of the second diffraction grating 132 can be set independently, even if the difference between the wavelength ⁇ 1 and the wavelength ⁇ 2 is large, the wavelength Both the condensing point pair of ⁇ 1 and the condensing point pair of wavelength ⁇ 2 are accommodated in the pupil plane 6A, and both the interference fringes of wavelength ⁇ 1 and the interference fringes of wavelength ⁇ 2 can be generated reliably. Therefore, it is possible to reliably obtain both the super-resolution effect due to the interference fringes with the wavelength ⁇ 1 and the super-resolution effect due to the interference fringes with the wavelength ⁇ 2.
  • the specimen 5 is, for example, a culture solution dropped on a parallel plate-like glass surface, and in the vicinity of the glass interface in the culture solution, a fluorescent cell (a cell stained with a fluorescent dye) ) Exists.
  • a fluorescent cell a cell stained with a fluorescent dye
  • both the first fluorescent region excited by light of wavelength ⁇ 1 and the second fluorescent region excited by light of wavelength ⁇ 2 are expressed.
  • fluorescence of wavelength ⁇ 1 ' is generated according to light of wavelength ⁇ 1
  • fluorescence of wavelength ⁇ 2' is generated according to light of wavelength ⁇ 2.
  • Fluorescence generated in the specimen 5 enters the imaging optical system 30.
  • an objective lens 6, a first dichroic mirror 7, a barrier filter 31, a second objective lens 32, and a second dichroic mirror 35 are arranged in this order from the sample 5 side.
  • the fluorescence having the wavelength ⁇ 1 ' reflects the second dichroic mirror 35, and the fluorescence having the wavelength ⁇ 2' passes through the second dichroic mirror 35.
  • the fluorescence having the wavelength ⁇ 1 ′ reflected from the second dichroic mirror 35 forms a modulated image of the first fluorescence region on the imaging surface 361 of the first imaging device 351, and transmits the fluorescence having the wavelength ⁇ 2 ′ transmitted through the second dichroic mirror 35. Forms a modulated image of the second fluorescent region on the imaging surface 362 of the second imaging element 352.
  • Each of the first image sensor 351 and the second image sensor 352 is a charge storage type two-dimensional image sensor such as a CCD or a CMOS.
  • the first image sensor 351 acquires the first modulated image by capturing the modulated image of the first fluorescent region and sends it to the control device 39, and the second image sensor 352 captures the modulated image of the second fluorescent region. As a result, the second modulated image is acquired and sent to the control device 39.
  • the control device 39 includes the first laser light source 101, the second laser light source 102, the shutters 103 and 104, the first translation mechanism 151A, the second translation mechanism 152A, the first rotation mechanism 151B, the second rotation mechanism 152B, and the first.
  • a series of first modulated images and a series of second modulated images are acquired by controlling each of the image sensor 351 and the second image sensor 352, the series of first modulated images and series of second modulated images are stored in the image. -It gives to the arithmetic unit 40.
  • the control device 39 can control the irradiation timing of the laser light having the wavelength ⁇ 1 on the sample 5 by controlling the combination of the on / off timing of the first laser light source 101 and the opening / closing timing of the shutter 103. .
  • control device 39 can control the irradiation timing of the laser beam having the wavelength ⁇ 2 on the sample 5 by controlling the combination of the on / off timing of the second laser light source 102 and the opening / closing timing of the shutter 104. .
  • the shutters 103 and 104 are composed of, for example, an acousto-optic device such as AOTF
  • the irradiation timing of the laser light with the wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 on the sample 5 can be controlled by simply controlling the AOTF. it can.
  • control device 39 can control the frame period of the first image sensor 351 by controlling the charge accumulation timing and the charge read timing of the first image sensor 351.
  • control device 39 can control the frame period of the second image sensor 352 by controlling the charge accumulation timing and the charge read timing of the second image sensor 352.
  • the frame period refers to the time from the start of capturing one image by the image sensor to the start of capturing the next image.
  • the control device 39 also includes a charge accumulation period within the frame period of the first image sensor 351 and an open period within the frame period of a mechanical shutter (not shown) disposed between the first image sensor 351 and the sample 5. By controlling this combination, the exposure time (fluorescence light reception time) within the frame period of the first image sensor 351 can be controlled.
  • the control device 39 also includes a charge accumulation period within the frame period of the second image sensor 352, and an open period within the frame period of the mechanical shutter (not shown) disposed between the second image sensor 352 and the sample 5. By controlling the combination, the exposure time (fluorescence light receiving time) within the frame period of the second image sensor 352 can be controlled.
  • the image storage / arithmetic unit 40 performs a known demodulation calculation on the series of first modulated images given from the control unit 39 to generate a first demodulated image (first super-resolution image), and also the control unit A known demodulation operation is performed on the series of second modulated images given from 39 to generate a second demodulated image (second super-resolution image).
  • a known demodulation calculation for example, a method disclosed in US81115806 can be used.
  • the first super-resolution image and the second super-resolution image are stored in an internal memory (not shown) of the image storage / arithmetic device 40 and sent to the image display device 45.
  • the control device 39 acquires a series of first modulated images necessary for the demodulation calculation and a series of second modulated images necessary for the demodulation calculation by the following procedures (0) to (6).
  • the control device 39 sets the wavelength of the laser light applied to the specimen 5 to both ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132 to 0 ° via the first rotation mechanism 151B and the second rotation mechanism 152B, thereby causing interference fringes. Is set to 0 °.
  • the control device 39 starts translational movement of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132 via the first translation mechanism 151A and the second translation mechanism 152A.
  • the control device 39 irradiates the sample 5 with laser light during the translational movement of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132, and exposes both the first imaging element 351 and the second imaging element 352. (Imaging) is repeated over a plurality of sheets.
  • the control device 39 sets the pitch of the translational movement of the first diffraction grating 131 in accordance with the frame period of the first imaging element 351 during the imaging period of the plurality of sheets by the first imaging element 351 and the second imaging element 352. And the pitch of the translational movement of the second diffraction grating 132 is set to a pitch corresponding to the frame period of the second image sensor 352, whereby the phase difference of interference fringes between adjacent images of a series of first modulated images is set. Is set to a predetermined value ⁇ less than 2 ⁇ , and the phase difference of interference fringes between adjacent images of a series of second modulated images is set to a predetermined value ⁇ less than 2 ⁇ .
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132 to 120 ° via the first rotation mechanism 151B and the second rotation mechanism 152B, and performs the procedure in that state. (2) to (4) are executed.
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132 to 240 ° via the first rotation mechanism 151B and the second rotation mechanism 152B, and performs the procedure in that state. (2) to (4) are executed.
  • the control device 39 determines that the direction of the interference fringes is 0 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ , and the direction of the interference fringes. Is 120 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ and at least three first modulated images, and the direction of the interference fringes is 240 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ .
  • the modulated image is acquired in order. These at least nine first modulated images are a series of first modulated images necessary for generating the first super-resolution image.
  • the control device 39 obtains at least three second modulated images in which the direction of the interference fringes is 0 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ . , At least three second modulated images with the interference fringe direction being 120 ° and the interference fringe phase shifted by ⁇ , and the interference fringe direction being 240 ° and the interference fringe phase being shifted by ⁇ Three second modulated images are acquired in order. These at least nine second modulated images are a series of second modulated images necessary for generating the second super-resolution image.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 includes each of the two light branching portions (131, 132) and the two light branching portions (131, 132) that individually split two kinds of light beams having different wavelengths. And an optical system (10) for causing the plurality of branched components generated in step (b) to interfere on the specimen.
  • the light branching portions (131, 132) are prepared for each wavelength, it is possible to set the branching angle of the light flux for each wavelength, so that the difference in the branching angle due to the difference in wavelength can be suppressed. .
  • the configuration of the structured illumination microscope apparatus 1 according to the present embodiment is advantageous in expanding the wavelength range used.
  • each of the two light branching portions (131, 132) is a diffractive optical element, and the structural period is mutually between the two light branching portions (131, 132). Unlikely, the relationship of the structural period between the two optical branching portions is set so that the super-resolution effect is equal between wavelengths.
  • a plurality of diffraction components generated in each of the two light branching portions (131, 132) are located at different positions on the pupil (6A) of the objective lens (6). These diffraction components interfere with each other on the object side of the objective lens by focusing on the object lens, and the relationship between the structural periods between the two optical branching portions (131, 132) is that a plurality of diffraction components are on the pupil (6A).
  • the arrangement pattern of a plurality of condensing points to be formed is set to be equal between wavelengths.
  • the super-resolution effect of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment is unchanged regardless of the wavelength used.
  • the two light branching portions (131, 132) are individually arranged on the non-common optical paths of the two types of light beams.
  • the detection optical system (30) detects the image of the sample (5) for each wavelength.
  • the sample (5) is simultaneously illuminated (excited) with two types of use wavelengths, and two types of images formed according to the two types of use wavelengths are simultaneously displayed. It is possible to detect.
  • the two polarizing plates (231 and 232) are individually arranged on the non-common optical paths of the two types of light beams.
  • one characteristic of the two polarizing plates (231, 232) is made optimal for one of two types of light beams having different wavelengths, and the two polarizing plates
  • the other characteristic of (231, 232) can be made optimum for the other of the two types of light beams having different wavelengths.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment. Since the present embodiment is a modification of the first embodiment, only differences from the first embodiment will be described here.
  • a first diffraction grating 131 ′ and a second diffraction grating 132 ′ that branch light in three directions are used instead of the first diffraction grating 131 and the second diffraction grating 132 that branch light in one direction.
  • a light beam selecting member 18 for selecting a diffracted light beam in a necessary direction is disposed.
  • the arrangement location of the first diffraction grating 131 ′ is the same as the arrangement location of the first diffraction grating 131 of the first embodiment
  • the arrangement location of the second diffraction grating 132 ′ is the second diffraction grating of the first embodiment.
  • the arrangement location of the grating 132 is the same, and the arrangement location of the light beam selection member 18 is in the vicinity of the pupil conjugate plane 6A ′.
  • the postures of the first diffraction grating 131 ′ and the second diffraction grating 132 ′ are fixed, and the light beam selection member 18 can be rotated around the optical axis at a pitch of 120 ° by the rotation mechanism 18A. is there.
  • the polarizing plate 23 is disposed between the collector lens 12 and the dichroic mirror 55 (a common optical path of the laser light having the wavelength ⁇ 1 and the laser light having the wavelength ⁇ 2).
  • Each arrangement position of the liquid crystal element 62 is in the vicinity of the pupil conjugate plane 6A ′.
  • one liquid crystal element (third liquid crystal element 63) is arranged instead of the first translation mechanism 151A and the second translation mechanism 152A.
  • the arrangement position of the third liquid crystal element 63 is in the vicinity of the pupil conjugate plane 6A '.
  • the first diffraction grating 131 ′ has a periodic structure in each of a 0 ° direction V 0 , a 120 ° direction V 120 , and a 240 ° direction V 240 ,
  • the period (grating pitch) of the periodic structures (grating lines) in each direction is common.
  • the plurality of grid lines arranged toward the direction V 0 which is a grid line for branching the incident light beam in the direction V 0 which 0 °
  • the plurality of grid lines arranged toward the direction V 120 of the 120 ° a grid line for branching the incident light beam toward the direction V 120 of 120 °
  • the lattice line for branching the incident light beam in the 0 ° direction V 0 is referred to as “0 ° branching lattice line”
  • the lattice line for branching the incident light beam in the 120 ° direction V 120 is referred to as “120”.
  • the grid line for branching the incident light beam in the 240 ° direction V 240 is referred to as a “240 ° branch grid line”.
  • the first diffraction grating 131 ′ simultaneously branches the incident light beam in each of the 0 ° direction V 0 , the 120 ° direction V 120 , and the 240 ° direction V 240 to generate three pairs of ⁇ first-order diffracted light beams. Generate at the same time. These three pairs of ⁇ first-order diffracted light beams form three pairs of condensing points on the pupil conjugate plane 6A ′ as shown in FIG.
  • the pair of condensing points is formed by a ⁇ first-order diffracted light beam branched in a 120 ° direction V 120 , and the pair of condensing points arranged in a 240 ° direction V 240 has a 240 ° direction. ⁇ branched into V 240 1 in which order diffracted light flux is formed.
  • the periodic structure of the first diffraction grating 131 ′ is a concentration-type periodic structure formed using density (transmittance) or a phase-type periodic structure formed using steps (phase difference).
  • the phase difference type periodic structure is preferable in that the diffraction efficiency of the + 1st order diffracted light is higher.
  • the structure of the second diffraction grating 132 ′ is the same as the structure of the first diffraction grating 131 ′, and the direction of the grating line of the second diffraction grating 132 ′ is the same as that of the first diffraction grating 131 ′. Corresponding direction) is set.
  • the grating pitch of the second diffraction grating 132 ′ is different from the grating pitch of the first diffraction grating 131 ′, and the grating pitch of the second diffraction grating 132 ′ and the grating pitch of the first diffraction grating 131 ′ are different.
  • the relationship is the same as the relationship in the first embodiment (the relationship between the grating pitch of the second diffraction grating 132 and the grating pitch of the first diffraction grating 131).
  • the axial direction of the polarizing plate 23 is set so that the polarization direction of the incident light beam with respect to the first diffraction grating 131 ′ and the second diffraction grating 132 ′ is adjusted in the same direction as the 0 ° branching grating line. .
  • the first liquid crystal element 61 is an element that can control the refractive index anisotropy by electrically controlling the orientation of the liquid crystal. Therefore, when the first liquid crystal element 61 is turned on by the drive circuit 61A, the first liquid crystal element 61 has the wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2. Acts as a half-wave plate for the incident light beam and is turned off by the drive circuit 61A, it is parallel to the incident light beam of wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 (refractive index anisotropy 0, refractive index isotropic).
  • the direction of the fast axis of the first liquid crystal element 61 in the on state is set to a direction rotated by ⁇ 30 ° when the clockwise direction is + with respect to the axial direction of the polarizing plate 23. .
  • the structure of the second liquid crystal element 62 is the same as that of the first liquid crystal element 61.
  • a half-wave plate with respect to incident light of wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 is used.
  • it is turned off by the drive circuit 62A it acts as a parallel plate for incident light of wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • the direction of the fast axis of the second liquid crystal element 62 in the on state is different from the direction of the fast axis of the first liquid crystal element 61, and +30 with respect to the axial direction of the polarizing plate 23. It is set in the direction rotated by °.
  • ⁇ first-order diffracted light beams branched in a direction of 0 ° V 0 (a pair of condensing points arranged in a direction of 0 ° V 0 ) and ⁇ first-order diffraction beams branched in a direction of V 120 of 120 ° a light beam (a pair of converging point arranged in the direction V 120 of 120 °)
  • 240 ° ⁇ 1-order diffracted light beam (240 ° a pair of current arranged in a direction V 240 of the branched direction V 240 of Each polarization state with respect to the light spot) is set to S-polarized light when the specimen 5 is irradiated. That is, the polarization direction of each light after passing through the half-wave plate is set to a direction as shown in FIG.
  • the direction of the fast axis of the 1/2-wavelength plate (first liquid crystal element 61) is passed through a 1/2-wavelength plate
  • the polarization direction of the light after that ( ⁇ 60 ° with respect to the grid line for 0 ° branching) and the polarization direction of the light before passing through the half-wave plate are 2 It is necessary to set the direction equally divided, that is, the direction rotated by ⁇ 30 ° with respect to the axial direction of the polarizing plate 23 ( ⁇ 30 ° with respect to the grid line for 0 ° branching).
  • the fast axis direction of the half-wave plate (second liquid crystal element 62) is after passing through the half-wave plate.
  • the light polarization direction (+ 60 ° with respect to the 0 ° branching grid line) and the light polarization direction before passing through the half-wave plate are divided into two equal parts.
  • Direction that is, a direction rotated by + 30 ° with respect to the axial direction of the polarizing plate 23 (+ 30 ° with respect to the grid line for 0 ° branching).
  • the second liquid crystal element 62 is In the case where the polarization direction of those ⁇ 1st order diffracted light beams that have passed is the same direction as the 0 ° branching grating line and the ⁇ 1st order diffracted light beams branched in the direction 120 of 120 ° are used, the first liquid crystal element By turning on only 61, the polarization directions of the ⁇ first-order diffracted light beams that have passed through the second liquid crystal element 62 are set to the same direction as the grid lines for 120 ° branching, and branched into a direction V 240 of 240 °.
  • the polarization direction of light after passing through the half-wave plate and the polarization direction of light before passing through the half-wave plate ( The angle formed by the axial direction of the polarizing plate 23 is assumed to be an acute angle, but may be an obtuse angle (the phase is only shifted by ⁇ , and it remains S-polarized light).
  • the third liquid crystal element 63 acts as a phase plate for the incident light beams of wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2, and sets the phase delay amount of the incident light beam for each region in accordance with a signal given from the drive circuit 63A. It is possible.
  • the liquid crystal element 63 there are at least a region A and a region A ′ shown in FIG.
  • One region A is one incident region of ⁇ first-order diffracted light beams branched in the direction of 0 °, one incident region of ⁇ first-order diffracted light beams branched in the direction of 120 °, and branched in the direction of 240 °. It is a set with one incident region of the ⁇ first-order diffracted light flux.
  • the other region A ′ includes the other incident region of the ⁇ 1st-order diffracted light beam branched in the 0 ° direction, the other incident region of the ⁇ 1st-order diffracted light beam branched in the 120 ° direction, and the 240 ° direction. It is a set with the other incident area of the branched ⁇ first-order diffracted light beams.
  • the drive circuit 63A gives a difference (phase delay amount difference) between the phase delay amount in the region A and the phase delay amount in the region A ′, the phase difference between the ⁇ first-order diffracted light beams branched in the 0 ° direction. And a phase difference is given between ⁇ 1st order diffracted light beams branched in the direction of 120 °, and a phase difference is given between ⁇ 1st order diffracted light beams branched in the direction of 240 °.
  • the drive circuit 63A shifts the phase delay amount difference between the regions A and A ′, the phase difference of the ⁇ 1st-order diffracted light beams branched in the 0 ° direction is shifted and branched in the 120 ° direction.
  • the phase difference of the ⁇ 1st order diffracted light beam is shifted, and the phase difference of the ⁇ 1st order diffracted light beam branched in the direction of 240 ° is shifted.
  • the phase of the interference fringes in the direction of 0 ° is shifted
  • the phase of the interference fringes in the direction of 120 ° is shifted
  • the phase of the interference fringes in the direction of 240 ° is shifted.
  • the opening pattern of the light beam selection member 18 includes a first opening portion 19 and a second opening portion that individually allow one and the other of the ⁇ first-order diffracted light beams branched in a certain direction to pass therethrough. 20, and the lengths of the first opening 19 and the second opening 20 around the optical axis are set such that linearly polarized ⁇ first-order diffracted light beams can pass therethrough. . Therefore, each shape of the 1st opening part 19 and the 2nd opening part 20 is a shape close
  • the light beam selection member 18 can be rotated around the optical axis at a pitch of 120 ° by the rotation mechanism 18A.
  • the rotation position of the light beam selection member 18 is set to 120 °, of ⁇ 1st order diffracted light beams branched in the directions of 0 °, 120 °, and 240 °, ⁇ 1 branched in the direction of 120 °. Since only the next diffracted light passes through the light beam selection member 18, the direction of the interference fringes formed on the sample 5 is 120 °.
  • the rotational position of the light beam selection member 18 is set to 240 °, out of ⁇ first-order diffracted light beams branched in the directions of 0 °, 120 °, and 240 °, ⁇ 1 branched in the direction of 240 °. Since only the next-order diffracted light passes through the light beam selection member 18, the direction of the interference fringes formed on the sample 5 is a direction of 240 °.
  • a plurality of (six in the example shown in FIG. 5) notches 21 are formed on the outer peripheral portion of the light beam selecting member 18 as shown in FIG.
  • a sensor 22 for detecting the presence or absence of these notches 21 is disposed at a position directly opposite to the locus.
  • the sensor 22 is composed of a photo interrupter or the like.
  • the detection signal of the sensor 22 can be used as a signal (angle signal) indicating the rotational position of the light beam selection member 18.
  • the control device 39 acquires a series of first modulated images necessary for the demodulation calculation and a series of second modulated images necessary for the demodulation calculation by the following procedures (0) to (6).
  • the control device 39 sets the wavelength of the laser light applied to the specimen 5 to both ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • the control device 39 sets the direction of the interference fringes to the direction of 0 ° by setting the rotation position of the light beam selection member 18 to the direction of 0 ° via the rotation mechanism 18A. Further, the control device 39 sets the ⁇ first-order diffracted light flux contributing to the interference fringes to s-polarized light by turning off both of the liquid crystal elements 61 and 62 via the drive circuits 61A and 62A.
  • the control device 39 starts shifting the phase delay amount difference between the regions A and A ′ of the liquid crystal element 63 via the drive circuit 63A.
  • the control device 39 irradiates the specimen 5 with laser light during the shift of the phase delay amount difference, and exposes (images) both the first image sensor 351 and the second image sensor 352 over a plurality of sheets. And repeat. Note that the frame period of the first image sensor 351 and the frame period of the second image sensor 352 are set in common.
  • the control device 39 sets the shift pitch of the phase delay amount difference to the frame period of the first image sensor 351 and the second image sensor 352 during a plurality of image capturing periods by the first image sensor 351 and the second image sensor 352.
  • the phase difference of interference fringes between adjacent images of a series of first modulated images is set to a predetermined value ⁇ less than 2 ⁇
  • the interference fringes between adjacent images of a series of second modulated images Is set to a predetermined value ⁇ of less than 2 ⁇ .
  • the control device 39 sets the direction of the interference fringes to the direction of 120 ° by setting the rotation position of the light beam selection member 18 to the direction of 120 ° via the rotation mechanism 18A. Further, the control device 39 turns on only the former of the liquid crystal elements 61 and 62 via the drive circuits 61A and 62A, thereby setting the ⁇ first-order diffracted light flux contributing to the interference fringes to s-polarized light. In this state, the control device 39 executes steps (2) to (4).
  • the control device 39 sets the direction of the interference fringes to the direction of 240 ° by setting the rotation position of the light beam selection member 18 to the direction of 240 ° via the rotation mechanism 18A. Further, the control device 39 sets only the latter of the liquid crystal elements 61 and 62 via the drive circuits 61A and 62A, thereby setting the ⁇ 1st-order diffracted light beam contributing to the interference fringes to s-polarized light. In this state, the control device 39 executes steps (2) to (4).
  • the control device 39 determines that the direction of the interference fringes is 0 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ , and the direction of the interference fringes. Is 120 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ and at least three first modulated images, and the direction of the interference fringes is 240 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ .
  • the modulated image is acquired in order. These at least nine first modulated images are a series of first modulated images necessary for generating the first super-resolution image.
  • the control device 39 obtains at least three second modulated images in which the direction of the interference fringes is 0 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ . , At least three second modulated images with the interference fringe direction being 120 ° and the interference fringe phase shifted by ⁇ , and the interference fringe direction being 240 ° and the interference fringe phase being shifted by ⁇ Three second modulated images are acquired in order. These at least nine second modulated images are a series of second modulated images necessary for generating the second super-resolution image.
  • the method of switching the direction of the interference fringes, the method of shifting the phase of the interference fringes, and the method of adjusting the polarization direction of the diffracted light beam contributing to the interference fringes are the first.
  • the other points are the same as those of the structured illumination microscope apparatus 1 of the first embodiment.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment can obtain a super-resolution effect at each of the two used wavelengths having a large wavelength difference, It is possible to share the image effect between wavelengths.
  • FIG. 6 is a configuration diagram of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment. Since the present embodiment is a modification of the first embodiment, only differences from the first embodiment will be described here.
  • the first diffraction grating 131 ′′ acting only on the light of wavelength ⁇ 1 and the light of wavelength ⁇ 2 are used.
  • Both the second diffraction grating 132 "acting only on the two laser beams are arranged in the common optical path of the two laser beams.
  • the dichroic mirrors 55 and 57 and the mirrors 56 and 58 are omitted, and one polarizing plate is used for adjusting the polarization direction of the laser light having the wavelength ⁇ 1 and adjusting the polarization direction of the laser light having the wavelength ⁇ 2. 23 is also used.
  • the location of the first diffraction grating 131 ′′ and the location of the second diffraction grating 132 are close to each other, and the distance from the location of both to the condenser lens 16 is equal to the focal length of the condenser lens 16.
  • the widths of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ in the optical axis direction are sufficiently small and fall within the focal depth of the condenser lens 16.
  • first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ are fixed to each other through an adhesive layer in a posture in which the grating lines are directed in the same direction, and the translational movement of the first diffraction grating 131 ′′
  • One translation mechanism 15A is also used for translation of the second diffraction grating 132 ′′
  • one rotation mechanism 15B is also used for rotation of the first diffraction grating 131 ′′ and rotation of the second diffraction grating 132 ′′.
  • the acquisition of the first modulated image and the acquisition of the second modulated image share one image sensor 35. For this reason, the second dichroic mirror 55 is omitted.
  • two units including the excitation filter 28, the first dichroic mirror 7, and the barrier filter 31 are prepared.
  • a unit switching mechanism for switching the unit to be arranged between the two units is provided.
  • One of these two units is a unit suitable for use wavelength ⁇ 1 (unit for wavelength ⁇ 1), and the other is a unit suitable for use wavelength ⁇ 2 (for wavelength ⁇ 2).
  • Unit The control device 39 switches the unit arranged in the optical path between the unit for wavelength ⁇ 1 and the unit for wavelength ⁇ 2 through this unit switching mechanism.
  • the first diffraction grating 131 ′′ is a hologram diffraction grating made of a photopolymer or the like. As shown in FIG. 7, the hologram diffraction grating has different angles with respect to a substrate such as a monomer mixed with a photosensitive agent. By projecting a pair of coherent light (object light and reference light) simultaneously, the interference fringes are projected onto the substrate, and the structure corresponding to the interference fringe pattern is fixed (recorded) on the substrate. is there.
  • the hologram diffraction grating is a type suitable as the diffraction grating of this embodiment. (Transmission type). Further, if the wavelength of the pair of coherent light and the angle between the pair of coherent light (angle ⁇ r of the reference light with respect to the object light) are appropriately set, the selected wavelength region (hologram diffraction) of the hologram diffraction grating is set. The wavelength range of light diffracted by the grating can be limited to a desired wavelength range.
  • the wavelength of the pair of coherent light at the time of manufacturing the hologram diffraction grating is set to 405 nm and the angle of the pair of coherent light (angle ⁇ r of the reference light with respect to the object light) is set to 60 °
  • FIG. 8 shows the relationship between the angle of a pair of coherent light (the angle ⁇ r of the reference light with respect to the object light), the angle width ⁇ of the used light beam, and the wavelength width ⁇ of the selected wavelength region of the used light beam. Is shown.
  • the example shown in FIG. 8 is an example in which the wavelength of a pair of coherent light is set to 405 nm in order to set the center wavelength of the used wavelength to 405 nm, but also when these wavelengths are set to other values. It is considered that a relationship similar to the relationship shown in FIG.
  • a hologram diffraction grating manufactured with coherent light having a wavelength ⁇ 1 is used as the first diffraction grating 131 ′′ of the present embodiment.
  • the second diffraction grating 132 ′′ is a hologram diffraction grating similar to the first diffraction grating 131 ′′.
  • the wavelength of coherent light used in the production of the second diffraction grating 132 ′′ is set to ⁇ 2.
  • the first diffraction grating 131 ′′ has a function of selectively diffracting the incident light beam having the wavelength ⁇ 1
  • the second diffraction grating 132 ′′ has a function of selectively diffracting the incident light beam of the wavelength ⁇ 2. Is done.
  • the manufacturing conditions ( ⁇ r) other than the wavelength are shared between the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′. Accordingly, the relationship between the grating pitch of the second diffraction grating 132 ′′ and the grating pitch of the first diffraction grating 131 ′′ is the same as that in the first embodiment (the grating pitch of the second diffraction grating 132 and the grating of the first diffraction grating 131). The relationship with the pitch).
  • the control device 39 acquires a series of first modulated images and a series of second modulated images necessary for the demodulation operation by the following procedures (0) to (7).
  • the control device 39 sets the wavelength of the laser light applied to the specimen 5 to ⁇ 1, and sets the unit set in the optical path to the unit for wavelength ⁇ 1.
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ to 0 ° via the rotation mechanism 15B.
  • the control device 39 starts the translational movement of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ via the translation mechanism 15A.
  • the control device 39 irradiates the sample 5 with laser light during translation of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′, and performs exposure (imaging) of the imaging device 35 over a plurality of sheets. And repeat.
  • the control device 39 sets the pitch of the translational movement of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ to a pitch corresponding to the frame period of the imaging element 35 during the imaging period of the plurality of sheets by the imaging element 35.
  • the phase difference of the interference fringes between adjacent images of the series of modulated images acquired in the procedure (3) is set to a predetermined value ⁇ less than 2 ⁇ .
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ to 120 ° via the rotation mechanism 15B, and in this state, performs steps (2) to (4). Execute.
  • the control device 39 sets the rotation positions of the first diffraction grating 131 ′′ and the second diffraction grating 132 ′′ to 240 ° via the rotation mechanism 15B, and performs the procedures (2) to (4) in that state. Execute.
  • the control device 39 sets the wavelength of the laser light applied to the sample 5 to ⁇ 2, and sets the unit to be set in the optical path to the unit for the wavelength ⁇ 2, and in this state, the procedures (1) to ( 6) is executed.
  • the control device 39 determines that the direction of the interference fringes is 0 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ , and the direction of the interference fringes. Is 120 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ and at least three first modulated images, and the direction of the interference fringes is 240 ° and the phase of the interference fringes is shifted by ⁇ .
  • the modulated image is acquired in order. These at least nine first modulated images are a series of first modulated images necessary for generating the first super-resolution image.
  • the control device 39 causes the direction of the interference fringes to be 0 ° and the phase of the interference fringes to be shifted by ⁇ and the direction of the interference fringes to be 120. And at least three second modulated images whose phases of interference fringes are shifted by ⁇ , and at least three second modulated images whose directions of interference fringes are 240 ° and whose phases of interference fringes are shifted by ⁇ . And in order. These at least nine second modulated images are a series of second modulated images necessary for generating the second super-resolution image.
  • the two light branch portions (131 ′′, 132 ′′) are arranged in the common optical path of the two types of light beams, and one of the two light branch portions is two types.
  • the second embodiment has the wavelength selectivity for selectively branching one of the light beams, and the other of the two light branching portions has the wavelength selectivity for selectively branching the other of the two types of light beams.
  • the other points are the same as those of the structured illumination microscope apparatus 1 of the first embodiment.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment can obtain a super-resolution effect at each of the two used wavelengths having a large wavelength difference, It is possible to share the image effect between wavelengths.
  • a rotatable diffraction grating is used to switch the direction of the interference fringes.
  • the diffraction grating can be switched in accordance with the electrical signal. (Spatial light modulation element) or the like may be used.
  • a translationally movable diffraction grating is used to shift the phase of the interference fringes, but the grating position can be shifted in accordance with an electrical signal.
  • a diffraction grating spatial light modulation element or the like may be used.
  • the rotatable light beam selection member is used to switch the direction of the interference fringes, but the light beam capable of switching the aperture pattern according to the electrical signal.
  • a selection member liquid crystal element or the like may be used.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the second embodiment is the same as the structured illumination microscope apparatus 1 of the first embodiment in all of the interference fringe direction switching method, the interference fringe phase shift method, and the polarization direction adjustment method. However, it is also possible to realize a structured illumination microscope apparatus in which only a part is modified.
  • the number of imaging elements is two in order to capture two modulated images having different wavelengths in parallel.
  • the number of image sensors may be 1.
  • the second dichroic mirror 35 and the image sensor 351 are omitted, and two units (cubes) including the excitation filter 28, the first dichroic mirror 7, and the barrier filter 31 are prepared, and the units arranged in the optical path are prepared. It is only necessary to switch between the two units and drive the image sensor 352 before and after the switching.
  • the diffraction angle of the light of wavelength ⁇ 1 in the first diffraction grating and the diffraction angle of the light of wavelength ⁇ 2 in the second diffraction grating are the same.
  • an image of the first diffraction grating projected onto the field stop surface instead of (or in addition to) providing a difference between the grating pitch of the first diffraction grating and the grating pitch of the second diffraction grating, an image of the first diffraction grating projected onto the field stop surface.
  • a projection magnification of the image of the second diffraction grating projected onto the field stop surface may be given.
  • the single optical path of the laser beam having the wavelength ⁇ 1 from the first diffraction grating to the field stop surface A lens may be inserted into at least one of the single optical path of the laser beam having the wavelength ⁇ 2 from the second diffraction grating to the field stop surface.
  • the used wavelength is switched at the timing when all of the series of first modulated images have been acquired, but may be performed each time the phase of the interference fringes is shifted. It may be performed each time the direction of the interference fringes is switched.
  • the number of imaging elements is set to 1, and two modulation images having different wavelengths are sequentially captured.
  • the number of imaging elements is set to 2, and two modulations having different wavelengths are used. Images may be taken in parallel.
  • the amount of movement of the diffraction grating necessary to shift the phase of the interference fringes by a predetermined amount depends on the grating pitch of the diffraction grating, in this case, the two diffraction gratings are not fixed to each other, and are described above. It is desirable to provide a translation mechanism for each of the two diffraction gratings.
  • a hologram diffraction grating that branches light of a specific wavelength in one direction is used as the first diffraction grating or the second diffraction grating.
  • a hologram diffraction grating that simultaneously branches light of a specific wavelength in a plurality of directions may be used. In manufacturing such a hologram diffraction grating, three pairs of coherent light beams may be irradiated onto the substrate simultaneously from three directions.
  • the light beam selection member 18 (optical axis) described in the second embodiment is used instead of the rotation mechanism 15B.
  • the optical element having the same function may be disposed in the vicinity of the pupil conjugate plane 6A ′.
  • the wavelength of light assigned to each of the two diffraction gratings is a single wavelength, but the wavelength of light assigned to at least one of the two diffraction gratings may be a broad wavelength.
  • the number of laser light sources of the laser unit is increased to 3 or more, and among the laser beams emitted from the laser unit, laser beams belonging to a relatively long wavelength region are assigned to the first diffraction grating, and the relatively short wavelength region The laser beam belonging to may be assigned to the second diffraction grating.
  • the number of the first modulated images in which the direction of the interference fringes is the same and only the phase of the interference fringes is different is described as “at least three”. It is set to 5 sheets. In that case, the number of the series of first modulated images used for generating the first super-resolution image is nine or fifteen.
  • the number of the second modulated images in the series in which the direction of the interference fringes is the same and only the phases of the interference fringes are different is described as “at least three”. Or it is set as 5 sheets. In that case, the number of the series of second modulated images used for generating the second super-resolution image is nine or fifteen.
  • the number of diffraction gratings is set to 2, but the number of diffraction gratings may be expanded to 3 or more in order to further expand the operating wavelength range.
  • the transmission type diffraction grating is used, but it goes without saying that a reflection type diffraction grating may be used.
  • the structured illumination microscope apparatus is used as a two-dimensional structured illumination microscope apparatus.
  • the structured illumination microscope apparatus is replaced with a three-dimensional structured illumination microscope apparatus (3D-SIM). : 3D-Structured (Illumination (Microscopy)).
  • a high-order light cut mask is used instead of the zero-order light cut mask 14.
  • the high-order light cut mask is provided with an opening for allowing the 0th-order diffracted light beam to pass through the 0th-order light cut mask 14.
  • the opening is formed in the vicinity of the optical axis, and the shape of the opening is, for example, a circle.
  • the light beam selection member 18 is further provided with an opening for allowing the 0th-order diffracted light beam to pass therethrough.
  • the opening is formed in the vicinity of the optical axis, and the shape of the opening is, for example, a circle. According to such a high-order light cut mask and a light beam selection member, not only the ⁇ 1st-order diffracted light beam but also the 0th-order diffracted light beam can contribute to the interference fringes.
  • the interference fringes generated by the interference of the three diffracted light beams are spatially modulated not only in the surface direction of the sample 5 but also in the depth direction of the sample 5. Therefore, according to this interference fringe, a three-dimensional super-resolution image of the sample 5 can be generated.
  • a + 1st order diffracted light beam and a ⁇ 1st order diffracted light beam are used as diffracted light beams contributing to interference fringes. It goes without saying that other combinations may be used.
  • a + 1st order diffracted light beam and a ⁇ 1st order diffracted light beam are used as diffracted light beams contributing to interference fringes.
  • the combination with the 0th-order diffracted light beam is used, it goes without saying that other combinations may be used.
  • a demodulated image may be acquired by optical demodulation described in US Pat. No. 8,811,378.
  • the dichroic mirror 7 is replaced with a mirror, the optical path between the dichroic mirror 55 and the first diffraction grating 131, and between the dichroic mirror 55 and the second diffraction grating 132.
  • a dichroic mirror that separates fluorescence generated according to each excitation light ( ⁇ 1, ⁇ 2) from each excitation light and an image sensor that receives the fluorescence may be disposed for each of the optical paths.
  • the dichroic mirror 7 is replaced with a mirror, and the optical path between the collector lens 12 and the hologram diffraction grating is generated according to the excitation light ( ⁇ 1, ⁇ 2). What is necessary is just to arrange
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Structured illumination microscope apparatus, 100 ... Laser unit, 11 ... Optical fiber, 10 ... Illumination optical system, 30 ... Imaging optical system, 351 ... 1st image sensor, 352 ... 2nd image sensor, 39 ... Control apparatus, DESCRIPTION OF SYMBOLS 40 ... Image memory

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Abstract

　使用波長域の拡大に有利な構成を実現するために、本発明の構造化照明装置の一態様は、波長の異なる２種類の光束を個別に分岐する２つの光分岐部（１３１、１３２）と、前記２つの光分岐部の各々で発生した複数の分岐成分を標本上で干渉させる光学系（１０）とを備える。

Description

構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡
　本発明は、構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡に関する。
　試料（標本）の観察や計測の分野では、対物レンズの性能を超えた解像度を達成するために、空間変調された照明光（構造化照明光）により標本を照明して画像（変調画像）を取得し、その変調画像に含まれる変調成分を除去（復調）することにより、標本の超解像画像（復調画像）を生成する構造化照明顕微鏡が提案されている（特許文献１参照）。
　特に、下記特許文献に開示された構造化照明顕微鏡では、光源から射出した光束を回折格子等により複数の光束に分岐し、それらの光束を標本の近傍で互いに干渉させることで干渉縞を形成し、これを構造化照明光としている。
米国特許第６２３９９０９号公報
　このような構造化照明顕微鏡においても、他の顕微鏡と同様、使用波長を切り替えたいという要求が生じ得るが、使用波長が変化すると超解像効果が変化し、使用波長の変化幅が大きいと超解像効果が得られなくなる虞もある。この事実は、構造化照明顕微鏡の使用波長域の拡大の妨げとなっている。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、使用波長域の拡大に有利な構成の構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置を提供することを目的とする。
　本発明の構造化照明装置の一態様は、波長の異なる２種類の光束を個別に分岐する２つの光分岐部と、前記２つの光分岐部の各々で発生した複数の分岐成分を標本上で干渉させる光学系とを備える。
　また、本発明の構造化照明顕微鏡の一態様は、本発明の構造化照明装置の一態様と、前記光学系で照明された前記標本の像を検出する検出光学系とを備える。
第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。 第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。 図３（Ａ）は、第１回折格子１３１’を光軸に沿った方向から見た図であり、図３（Ｂ）は、第１回折格子１３１’で発生した３対の±１次回折光が瞳共役面６Ａ’に形成する３対の集光点を示す図であり、図３（Ｃ）は、１／２波長板を透過した光の偏光方向を示す図である。 液晶素子６３を説明する図である。 光束選択部材１８を光軸に沿った方向から見た図である。 第３実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。 ホログラム回折格子の作製方法を説明する図である。 参照光の角度θｒと、使用光束の角度幅Δθと、選択波長域の波長幅Δλとの関係を示している。
　［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　図１は、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。図１に示すとおり構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、第１撮像素子３５１と、第２撮像素子３５２と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５とが備えられる。なお、照明光学系１０は落射型であり、結像光学系３０の第１ダイクロイックミラー７及び対物レンズ６を介して標本５の照明を行う。
　レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３、１０４、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７などが備えられる。
　第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長λ１は、第２レーザ光源１０２の波長λ２よりも長いと仮定する（λ１＞λ２）。
　第１レーザ光源１０１から射出した波長λ１のレーザ光は、シャッタ１０３、ミラー１０５を介してダイクロイックミラー１０６へ入射すると、そのダイクロイックミラー１０６を反射する。
　一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λ２のレーザ光は、シャッタ１０４を介してビームスプリッタ１０６へ入射すると、そのダイクロイックミラー１０６を透過し、波長λ１のレーザ光と統合される。
　ダイクロイックミラー１０６から射出したレーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射すると、光ファイバ１１の内部を伝搬した後に光ファイバ１１の出射端に点光源を生成し、照明光学系１０へ向かう。なお、光ファイバ１１は、例えばマルチモードの光ファイバである。このようなマルチモードの光ファイバを用いれば、レーザ光の時間的コヒーレンシーを低下させることができる。
　照明光学系１０には、コレクタレンズ１２と、ダイクロイックミラー５５と、ミラー５６と、第１偏光板２３１と、第２偏光板２３２と、第１回折光学素子（第１回折格子）１３１と、第２回折光学素子（第２回折格子）１３２と、ダイクロイックミラー５７と、ミラー５８と、集光レンズ１６と、０次光カットマスク１４と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、第１ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。
　光ファイバ１１の出射端（点光源）から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換された後、ダイクロイックミラー５５へ入射する。
　ダイクロイックミラー５５へ入射したレーザ光のうち、波長λ１のレーザ光は、そのダイクロイックミラー５５を透過し、第１偏光板２３１を介して第１回折格子１３１へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これらの回折光束は、ミラー５８を介してダイクロイックミラー５７へ入射し、そのダイクロイックミラー５７を反射すると、集光レンズ１６によって集光される。
　一方、ダイクロイックミラー５５へ入射したレーザ光のうち、波長λ２のレーザ光は、そのダイクロイックミラー５５を反射し、ミラー５６、第２偏光板２３２を介して第２回折格子１３２へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これらの回折光束は、ダイクロイックミラー５７を透過すると、集光レンズ１６によって集光される。
　ここで、第１回折格子１３１は、照明光学系１０の光軸と垂直な面内における所定の１方向（格子線に直交する方向）に周期構造（格子ピッチ）を有した１方向回折格子であり、第１偏光板２３１は、第１回折格子１３１へ入射するレーザ光の偏光方向を第１回折格子１３１の格子線と同じ方向に整える偏光板である。また、第１回折格子１３１の配置面から集光レンズ１６までの距離は、集光レンズ１６の焦点距離に相当する。このような第１回折格子１３１で発生した各次数の回折光束は、集光レンズ１６によって集光されると、瞳共役面６Ａ’上に複数の集光点を形成する。ここで、瞳共役面は、レンズ１６の焦点位置（後ろ側焦点位置）であって、後述する対物レンズ６の瞳６Ａ（±１次回折光が集光する位置）に対してレンズ２７、レンズ２５を介して共役な位置をいう（これらの位置は、当業者が対物レンズ６、レンズ２７、２５の収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した位置をも含む概念である。）。これらの集光点の各々から光軸までの距離は、その集光点を形成する回折光束の回折角度に依存するので、次数が共通である回折光束の集光点の位置は、光軸に関して対称となる。また、これらの集光点の配列方向は、第１回折格子１３１による回折光束の分岐方向（＝格子線の配列方向）に対応する。
　また、第１回折格子１３１は、ピエゾモータ等からなる第１並進機構１５１Ａによって回折光束の分岐方向（＝格子線の配列方向）にかけて並進移動が可能である。なお、並進移動の方向は、分岐方向に一致していなくとも、分岐方向と同方向の成分を有した方向であればよい。この方向に第１回折格子１３１が並進移動すると、後述する波長λ１の干渉縞の位相がシフトする。
　また、第１回折格子１３１及び第１偏光板２３１は、第１回動機構１５１Ｂによって光軸の周りに１２０°のピッチで回動可能である。なお、第１回動機構１５１Ｂとしては、例えば、電気モータ等を適用することができる。第１回折格子１３１が回動すると、波長λ１の干渉縞（後述）の方向が０°、１２０°、２４０°の間で切り替わり、第１回折格子１３１と共に第１偏光板２３１が回動すれば、波長λ１の回折光束の分岐方向と偏光方向との関係は維持され、その結果、波長λ１の干渉縞に寄与する回折光束はｓ偏光に維持される。
　なお、第１並進機構１５１Ａによる並進移動の方向は、第１回折格子１３１の回動位置が０°、１２０°、２４０°の何れであった場合にも、前記分岐方向と同方向の成分を有した所定方向に設定されるものとする。但し、この場合、並進移動量と位相シフト量との関係は第１回折格子１３１の回動位置によって異なるので、第１回折格子１３１の回動位置に依らず位相シフト量が等しくなるよう、並進移動のピッチは第１回折格子１３１の回動位置毎に設定されるものとする。
　一方、第２回折格子１３２は、照明光学系１０の光軸と垂直な面内おける所定の１方向（格子線に直交する方向）に周期構造（格子ピッチ）を有した１方向回折格子であり、第２偏光板２３２は、第２回折格子１３２へ入射するレーザ光の偏光方向を第２回折格子１３２の格子線と同じ方向に整える偏光板である。また、第２回折格子１３２の配置面から集光レンズ１６までの距離は、集光レンズ１６の焦点距離に相当する。このような第２回折格子１３２で発生した各次数の回折光束は、集光レンズ１６によって集光されると、瞳共役面６Ａ’上に複数の集光点を形成する。これらの集光点の各々から光軸までの距離は、その集光点を形成する回折光束の回折角度に依存するので、次数が共通である回折光束の集光点の位置は、光軸に関して対称となる。また、これらの集光点の配列方向は、第２回折格子１３２による回折光束の分岐方向（＝格子線の配列方向）に対応する。
　また、第２回折格子１３２は、ピエゾモータ等からなる第２並進機構１５２Ａによって回折光束の分岐方向（＝格子線の配列方向）にかけて並進移動が可能である。なお、並進移動の方向は、分岐方向に一致していなくとも、分岐方向と同方向の成分を有した方向であればよい。この方向に第２回折格子１３２が並進移動すると、後述する波長λ２の干渉縞の位相がシフトする。
　また、第２回折格子１３２及び第２偏光板２３２は、第２回動機構１５２Ｂによって光軸の周りに１２０°のピッチで回動可能である。なお、第２回動機構１５２Ｂの構成としては、前述の第１回動機構１５１Ｂと同様の構成を適用することができる。第２回折格子１３２が回動すると、波長λ２の干渉縞（後述）の方向が０°、１２０°、２４０°の間で切り替わり、第２回折格子１３２と共に第２偏光板２３２が回動すれば、波長λ２の回折光束の分岐方向と偏光方向との関係は維持され、その結果、波長λ２の干渉縞に寄与する回折光束はｓ偏光に維持される。
　なお、第２並進機構１５２Ａによる並進移動の方向は、第２回折格子１３２の回動位置が０°、１２０°、２４０°の何れであった場合にも、前記分岐方向と同方向の成分を有した所定方向に設定されるものとする。但し、この場合、並進移動量と位相シフト量との関係は第２回折格子１３２の回動位置によって異なるので、第２回折格子１３２の回動位置に依らず位相シフト量が等しくなるよう、並進移動のピッチは第２回折格子１３２の回動位置毎に設定されるものとする。
　ここで、以上の第１回折格子１３１の構造周期（格子ピッチ）と、以上の第２回折格子１３２の構造周期（格子ピッチ）との関係は、第１回折格子１３１で発生する±１次回折光束の回折角度と、第２回折格子１３２で発生する±１次回折光束の回折角度とが等しくなるように設定される。上述したとおり、第１回折格子１３１へ入射する光束の波長λ１よりも、第２回折格子１３２へ入射する光束の波長λ２の方が短いので、第２回折格子１３２の格子ピッチは、第１回折格子１３１の格子ピッチよりも一定量だけ細かく設定される。この設定によると、第１回折格子１３１で発生した±１次回折光束が瞳共役面６Ａ’に形成する集光点対（波長λ１の集光点対）の配列パターン（配置間隔）と、第２回折格子１３２で発生した±１次回折光束が瞳共役面６Ａ’に形成する集光点対（波長λ２の集光点対）の配列パターン（配置間隔）とが同じになる（但し、波長λ１の集光点対の配列方向は、第１回折格子１３１の回動位置に依存し、波長λ２の集光点対の配列方向は、第２回折格子１３２の回動位置に依存する。）。
　次に、第１回折格子１３１又は第２回折格子１３２から瞳共役面６Ａ’に向かった各次数の回折光束は、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された０次光カットマスク１４へ入射する。０次光カットマスク１４へ入射した回折光束のうち、±１次回折光束は、０次光カットマスク１４を通過し、それ以外の回折光束は、０次光カットマスク１４でカットされる。なお、０次光カットマスク１４は、マスク用の基板に複数の開口部又は透過部を形成したものであって、基板における開口部又は透過部の位置は、瞳共役面において±１次回折光が入射する位置に対応する。この０次光カットマスク１４を通過した波長λ１の±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で第１回折格子１３１と共役な面（第１回折格子１３１の像）を形成し、０次光カットマスク１４を通過した波長λ２の±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６近傍で第２回折格子１３２と共役な面（第２回折格子１３２の像）を形成する。
　視野絞り２６へ入射した±１次回折光束の一方及び他方は、フィールドレンズ２７により平行光に変換され、さらに励起フィルタ２８を経てから第１ダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａ上で光軸に関して互いに対称な位置に集光される。なお、この瞳面６Ａ上に形成される集光点には、波長λ１の集光点対と、波長λ２の集光点対とがある。
　上述したとおり第１回折格子１３１の格子ピッチと第２回折格子１３２の格子ピッチとの関係は最適化されているので、瞳面６Ａ上における波長λ１の集光点対の配列パターン（配置間隔）と、瞳面６Ａ上における波長λ２の集光点対の配列パターン（配置間隔）とは、同じになる（但し、波長λ１の集光点対の配列方向は、第１回折格子１３１の回動位置に依存し、波長λ２の集光点対の配列方向は、第２回折格子１３２の回動位置に依存する。）。
　瞳面６Ａ上に集光した±１次回折光束の一方及び他方は、対物レンズ６の先端から射出される際には平行光束となり、標本５の表面で互いに重なり合い、干渉縞を形成する。この標本５上に形成される干渉縞には、波長λ１の干渉縞と、波長λ２の干渉縞とがある。これらの干渉縞が、標本５を空間変調するための構造化照明光として使用される。
　このような干渉縞により標本５を照明すると、干渉縞の周期構造と標本５の（蛍光領域の）周期構造とがモアレ縞を生成するが、このモアレ縞においては、標本５の高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造に応じて発生した光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かうことになる。よって、干渉縞により標本５を照明すると、標本５の有する高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達され、超解像効果が得られる。
　なお、ここでいう超解像効果とは、標本５の非変調時における構造化照明顕微鏡装置１の解像度Ｒと、標本５の変調時における構造化照明顕微鏡装置１の解像度（Ｒ＋Ｋ）との比（Ｒ＋Ｋ）／Ｒである。
　このうち、非変調時の解像度Ｒは、対物レンズ６の開口数ＮＡ、使用波長λに対して、Ｒ＝２ＮＡ／λで表される。つまり、非変調時の解像度Ｒは、使用波長λに依存する（Ｒ＝Ｒ（λ））。
　一方、変調による解像度の増加分Ｋは、標本５の変調周期（＝干渉縞の空間周波数）に一致し、使用波長λには依存しない。つまり、変調による解像度の増加分Ｋは、使用波長λに依存せず、回折格子の格子ピッチＰに依存する（Ｋ＝Ｋ（Ｐ））。
　このため、仮に、第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の間で格子ピッチＰを共通にすると、超解像効果（Ｒ（λ）＋Ｋ（Ｐ））／Ｒ（λ）は、波長λ１、λ２の間で非共通となってしまう。
　そこで、本実施形態では、上述したとおり瞳面６Ａ上における波長λ１の集光点対の配列パターンと、瞳面６Ａ上における波長λ２の集光点対の配列パターンとが同じになるように第１回折格子１３１の格子ピッチＰ１と第２回折格子１３２の格子ピッチＰ２との間に適度な差異を与えた。
　これによって、波長λ１の干渉縞の空間周波数Ｋ１（Ｐ１）と波長λ２の干渉縞の空間周波数Ｋ２（Ｐ２）との間にも適度な差異が与えられ、その結果、波長λ１の干渉縞による超解像効果（Ｒ１（λ１）＋Ｋ１（Ｐ１））／Ｒ１（λ１）と、波長λ２の干渉縞による超解像効果（Ｒ２（λ２）＋Ｋ２（Ｐ２））／Ｒ２（λ２）とが等しくなる。
　また、本実施形態では、第１回折格子１３１の格子ピッチＰ１と第２回折格子１３２の格子ピッチＰ２とを独立に設定できるので、波長λ１と波長λ２との差が仮に大きかったとしても、波長λ１の集光点対と波長λ２の集光点対との双方を瞳面６Ａ内に収め、波長λ１の干渉縞と波長λ２の干渉縞との双方を確実に生成することができる。よって、波長λ１の干渉縞による超解像効果と波長λ２の干渉縞による超解像効果との双方を確実に得ることができる。
　次に、標本５は、例えば、平行平板状のガラス表面に滴下された培養液であって、その培養液におけるガラス界面の近傍には、蛍光性を有した細胞（蛍光色素で染色された細胞）が存在している。この細胞には、波長λ１の光によって励起される第１蛍光領域と、波長λ２の光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。第１蛍光領域では、波長λ１の光に応じて波長λ１’の蛍光が発生し、第２蛍光領域では、波長λ２の光に応じて波長λ２’の蛍光が発生する。
　標本５で発生した蛍光は、結像光学系３０へ入射する。結像光学系３０には、標本５の側から順に、対物レンズ６と、第１ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２と、第２ダイクロイックミラー３５とが配置される。
　標本５で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光に変換された後、第１ダイクロイックミラー７、バリアフィルタ３１、第２対物レンズ３２を介して第２ダイクロイックミラー３５へ入射する。
　第２ダイクロイックミラー３５へ入射した蛍光のうち、波長λ１’の蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を反射し、波長λ２’の蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を透過する。
　第２ダイクロイックミラー３５を反射した波長λ１’の蛍光は、第１撮像素子３５１の撮像面３６１上に第１蛍光領域の変調像を形成し、第２ダイクロイックミラー３５を透過した波長λ２’の蛍光は、第２撮像素子３５２の撮像面３６２上に第２蛍光領域の変調像を形成する。
　第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の電荷蓄積型の二次元撮像素子である。第１撮像素子３５１は、第１蛍光領域の変調像を撮像することで第１変調画像を取得して制御装置３９へ送出し、第２撮像素子３５２は、第２蛍光領域の変調像を撮像することで第２変調画像を取得して制御装置３９へ送出する。
　制御装置３９は、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３、１０４、第１並進機構１５１Ａ、第２並進機構１５２Ａ、第１回動機構１５１Ｂ、第２回動機構１５２Ｂ、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々を制御することで一連の第１変調画像及び一連の第２変調画像を取得すると、それら一連の第１変調画像及び一連の第２変調画像を画像記憶・演算装置４０へ与える。
　なお、制御装置３９は、第１レーザ光源１０１のオン／オフタイミング、シャッタ１０３の開／閉タイミングの組み合わせを制御することにより、標本５に対する波長λ１のレーザ光の照射タイミングを制御することができる。
　また、制御装置３９は、第２レーザ光源１０２のオン／オフタイミング、シャッタ１０４の開／閉タイミングの組み合せを制御することにより、標本５に対する波長λ２のレーザ光の照射タイミングを制御することができる。
　もっとも、シャッタ１０３、１０４が例えば、ＡＯＴＦ等の音響光学素子で構成される場合は、単にＡＯＴＦを制御することによって、標本５に対する波長λ１、波長λ２のレーザ光の照射タイミングをそれぞれ制御することができる。
　また、制御装置３９は、第１撮像素子３５１の電荷蓄積タイミング及び電荷読出タイミングを制御することにより、第１撮像素子３５１のフレーム周期を制御することができる。
　また、制御装置３９は、第２撮像素子３５２の電荷蓄積タイミング及び電荷読出タイミングを制御することにより、第２撮像素子３５２のフレーム周期を制御することができる。
　ここで、フレーム周期とは、撮像素子による、ある1枚の画像の撮像開始から次の画像の撮像開始までの時間をいう。
　また、制御装置３９は、第１撮像素子３５１のフレーム周期内の電荷蓄積期間と、第１撮像素子３５１と標本５との間に配置されたメカシャッタ（不図示）のフレーム周期内の開放期間との組み合わせを制御することにより、第１撮像素子３５１のフレーム周期内の露光時間（蛍光の受光時間）を制御することができる。
　また、制御装置３９は、第２撮像素子３５２のフレーム周期内の電荷蓄積期間と、第２撮像素子３５２と標本５との間に配置されたメカシャッタ（不図示）のフレーム周期内の開放期間と組み合わせを制御することにより、第２撮像素子３５２のフレーム周期内の露光時間（蛍光の受光時間）を制御することができる。
　画像記憶・演算装置４０は、制御装置３９から与えられた一連の第１変調画像に対して公知の復調演算を施し、第１復調画像（第１超解像画像）を生成すると共に、制御装置３９から与えられた一連の第２変調画像に対して公知の復調演算を施し、第２復調画像（第２超解像画像）を生成する。なお、公知の復調演算としては、例えば、ＵＳ８１１５８０６に開示された方法を用いることができる。そして、それらの第１超解像画像及び第２超解像画像を画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶するとともに、画像表示装置４５へと送出する。
　次に、本実施形態の制御装置３９の動作を詳しく説明する。制御装置３９は、復調演算に必要な一連の第１変調画像と、復調演算に必要な一連の第２変調画像とを、以下の手順（０）～（６）で取得する。
　（０）制御装置３９は、標本５に照射されるレーザ光の波長をλ１、λ２の双方に設定する。
　（１）制御装置３９は、第１回動機構１５１Ｂ、第２回動機構１５２Ｂを介して第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の回動位置を０°に設定することにより、干渉縞の方向を０°の方向に設定する。
　（２）制御装置３９は、第１並進機構１５１Ａ、第２並進機構１５２Ａを介して第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の並進移動を開始する。
　（３）制御装置３９は、第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の並進移動中に、標本５に対するレーザ光の照射を行い、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の双方の露光（撮像）を複数枚に亘って繰り返す。
　（４）制御装置３９は、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２による複数枚の撮像期間中、第１回折格子１３１の並進移動のピッチを第１撮像素子３５１のフレーム周期に応じたピッチに設定すると共に、第２回折格子１３２の並進移動のピッチを第２撮像素子３５２のフレーム周期に応じたピッチに設定することで、一連の第１変調画像の隣接画像間における干渉縞の位相差を２π未満の所定値Δφに設定すると共に、一連の第２変調画像の隣接画像間における干渉縞の位相差を２π未満の所定値Δφに設定する。
　（５）制御装置３９は、第１回動機構１５１Ｂ、第２回動機構１５２Ｂを介して第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の回動位置を１２０°に設定し、その状態で手順（２）～（４）を実行する。
　（６）制御装置３９は、第１回動機構１５１Ｂ、第２回動機構１５２Ｂを介して第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の回動位置を２４０°に設定し、その状態で手順（２）～（４）を実行する。
　以上の手順（０）～（６）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第１変調画像が、第１超解像画像の生成に必要な一連の第１変調画像である。
　それと並行して、以上の手順（０）～（６）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第２変調画像が、第２超解像画像の生成に必要な一連の第２変調画像である。
　以上、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、波長の異なる２種類の光束を個別に分岐する２つの光分岐部（１３１、１３２）と、２つの光分岐部（１３１、１３２）の各々で発生した複数の分岐成分を標本上で干渉させる光学系（１０）とを備える。
　このように、光分岐部（１３１、１３２）を波長毎に用意すれば、光束の分岐角度を波長毎に設定することが可能なので、波長の差異による分岐角度の差異を抑えることが可能である。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、波長差の大きい２つの使用波長の各々で超解像効果を得ることや、超解像効果を波長間で共通化することなどが可能である。よって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成は、使用波長域を拡大する上で有利である。
　また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの光分岐部（１３１、１３２）の各々は回折光学素子であり、２つの光分岐部（１３１、１３２）の間では構造周期が互いに異なり、２つの光分岐部の間の構造周期の関係は、超解像効果が波長間で等しくなるように設定される。
　具体的に、本実施形態の光学系（１０）は、２つの光分岐部（１３１、１３２）の各々で発生した複数の回折成分を対物レンズ（６）の瞳（６Ａ）上の互いに異なる位置へ集光させることにより、それらの回折成分を対物レンズの物体側で干渉させ、２つの光分岐部（１３１、１３２）の間の構造周期の関係は、複数の回折成分が瞳（６Ａ）上に形成する複数の集光点の配列パターンが、波長間で等しくなるように設定される。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の超解像効果は、使用波長に依らず不変である。
　また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの光分岐部（１３１、１３２）が２種類の光束の非共通光路へ個別に配置される。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの光分岐部（１３１、１３２）の各々に対して波長選択性を持たせる必要は無い。
　また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、検出光学系（３０）が標本（５）の像を波長毎に検出する。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２種類の使用波長で標本（５）を同時に照明（励起）し、それら２種類の使用波長に応じて形成される２種類の像を同時に検出することが可能である。
　また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの偏光板（２３１、２３２）が２種類の光束の非共通光路へ個別に配置される。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの偏光板（２３１、２３２）の一方の特性を、波長の異なる２種類の光束の一方にとって最適な特性にし、かつ、２つの偏光板（２３１、２３２）の他方の特性を、波長の異なる２種類の光束の他方にとって最適な特性にすることができる。
　［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　図２は、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。本実施形態は、第１実施形態の変形例であるので、ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。
　先ず、本実施形態では、１方向にかけて光を分岐する第１回折格子１３１、第２回折格子１３２の代わりに、３方向にかけて光を分岐する第１回折格子１３１’、第２回折格子１３２’と、必要な方向の回折光束を選択する光束選択部材１８とが配置される。このうち第１回折格子１３１’の配置箇所は、第１実施形態の第１回折格子１３１の配置箇所と同じであり、第２回折格子１３２’の配置箇所は、第１実施形態の第２回折格子１３２の配置箇所と同じであり、光束選択部材１８の配置箇所は、瞳共役面６Ａ’の近傍である。
　また、第１回折格子１３１’、第２回折格子１３２’の各々の姿勢は固定されており、光束選択部材１８は、回動機構１８Ａによって光軸の周りに１２０°のピッチで回動可能である。
　次に、本実施形態では、第１偏光板２３１、第２偏光板２３２の代わりに、１つの偏光板２３と、２つの液晶素子（第１の液晶素子６１、第２の液晶素子６２）とが配置される。このうち偏光板２３の配置箇所は、コレクタレンズ１２とダイクロイックミラー５５との間（波長λ１のレーザ光と波長λ２のレーザ光との共通光路）であり、第１の液晶素子６１、第２の液晶素子６２の各々の配置箇所は、瞳共役面６Ａ’の近傍である。
　次に、本実施形態では、第１並進機構１５１Ａ、第２並進機構１５２Ａの代わりに、１つの液晶素子（第３の液晶素子６３）が配置される。この第３の液晶素子６３の配置箇所は、瞳共役面６Ａ’の近傍である。
　以下、本実施形態で新たに配置された各光学要素の詳細を説明する。
　先ず、第１回折格子１３１’は、図３（Ａ）に示すとおり、０°の方向Ｖ０、１２０°の方向Ｖ１２０、２４０°の方向Ｖ２４０の各々にかけて周期構造を有しており、それら各方向の周期構造（格子線）の周期（格子ピッチ）は共通である。
　０°の方向Ｖ０にかけて配列された複数の格子線は、入射光束を０°の方向Ｖ０に分岐するための格子線であり、１２０°の方向Ｖ１２０にかけて配列された複数の格子線は、入射光束を１２０°の方向Ｖ１２０にかけて分岐するための格子線であり、２４０°の方向Ｖ２４０にかけて配列された複数の格子線は、入射光束を２４０°の方向Ｖ２４０にかけて分岐するための格子線である。
　以下、入射光束を０°の方向Ｖ０に分岐するための格子線を「０°分岐用の格子線」と称し、入射光束を１２０°の方向Ｖ１２０に分岐するための格子線を「１２０°分岐用の格子線」と称し、入射光束を２４０°の方向Ｖ２４０に分岐するための格子線を「２４０°分岐用の格子線」と称す。
　したがって、この第１回折格子１３１’は、入射光束を０°の方向Ｖ０、１２０°の方向Ｖ１２０、２４０°の方向Ｖ２４０の各々にかけて同時に分岐し、３対の±１次回折光束を同時に生成する。これら３対の±１次回折光束は、図３（Ｂ）に示すとおり、瞳共役面６Ａ’に３対の集光点対を形成する。０°の方向Ｖ０に配列された１対の集光点は、０°の方向Ｖ０に分岐した±１次回折光束が形成したものであり、１２０°の方向Ｖ１２０に配列された１対の集光点は、１２０°の方向Ｖ１２０に分岐した±１次回折光束が形成したものであり、２４０°の方向Ｖ２４０に配列された１対の集光点は、２４０°の方向Ｖ２４０に分岐した±１次回折光束が形成したものである。
　なお、第１回折格子１３１’の周期構造は、濃度（透過率）を利用して形成された濃度型の周期構造、または段差（位相差）を利用して形成された位相型の周期構造の何れであってもよいが、位相差型の周期構造の方が＋１次回折光の回折効率が高いという点で好ましい。
　次に、第２回折格子１３２’の構造は、第１回折格子１３１’の構造と同じであって、第２回折格子１３２’の格子線の方向は、第１回折格子１３１’の格子線に対応した方向）に設定されている。
　但し、第２回折格子１３２’の格子ピッチは、第１回折格子１３１’の格子ピッチとは相違しており、第２回折格子１３２’の格子ピッチと第１回折格子１３１’の格子ピッチとの関係は、第１実施形態における関係（第２回折格子１３２の格子ピッチと第１回折格子１３１の格子ピッチとの関係）と同じである。
　次に、偏光板２３の軸方向は、第１回折格子１３１’及び第２回折格子１３２’に対する入射光束の偏光方向が０°分岐用の格子線と同じ方向に整えられるように設定されている。
　次に、第１の液晶素子６１は、液晶の配向を電気的に制御することにより、屈折率異方性を制御できる素子であるので、駆動回路６１Ａによってオンされたときには、波長λ１、λ２の入射光束に対して１／２波長板として作用し、駆動回路６１Ａによってオフされたときには、波長λ１、λ２の入射光束に対して平行平板（屈折率異方性０、屈折率が等方的）として作用する。そして、オンされた状態における第１の液晶素子６１の進相軸の方向は、偏光板２３の軸方向に対して、時計回りを＋とすると、－３０°だけ回転した方向に設定されている。
　次に、第２の液晶素子６２の構造も、第１の液晶素子６１の構造と同様であり、駆動回路６２Ａによってオンされたときには、波長λ１、λ２の入射光に対して１／２波長板として作用し、駆動回路６２Ａによってオフされたときには、波長λ１、λ２の入射光に対して平行平板として作用する。但し、オンされた状態における第２の液晶素子６２の進相軸の方向は、第１の液晶素子６１の進相軸の方向とは相違しており、偏光板２３の軸方向に対して＋３０°だけ回転した方向に設定されている。
　ここでは、０°の方向Ｖ０に分岐した±１次回折光束（０°の方向Ｖ０に配列された１対の集光点）と、１２０°の方向Ｖ１２０に分岐した±１次回折光束（１２０°の方向Ｖ１２０に配列された１対の集光点）と、２４０°の方向Ｖ２４０に分岐した±１次回折光束（２４０°の方向Ｖ２４０に配列された１対の集光点）との各々の偏光状態を、標本５に照射される際にＳ偏光とする。つまり、１／２波長板を通過後における各光の偏光方向を、図３（ｃ）に示すような方向に設定する。
　そのために、１２０°の方向Ｖ１２０に分岐した±１次回折光束を使用する場合、１／２波長板（第１の液晶素子６１）の進相軸の方向は、１／２波長板を通過後における光の偏光方向（０°分岐用の格子線に対して－６０°）と１／２波長板を通過前における光の偏光方向（０°分岐用の格子線と同じ方向）とを２等分する方向、すなわち、偏光板２３の軸方向に対して－３０°だけ回転した方向（０°分岐用の格子線に対して－３０°）に設定される必要がある。
　また、２４０°の方向Ｖ２４０に分岐した±１次回折光束を使用する場合、１／２波長板（第２の液晶素子６２）の進相軸の方向は、１／２波長板を通過後における光の偏光方向（０°分岐用の格子線に対して＋６０°）と１／２波長板を通過前における光の偏光方向（０°分岐用の格子線と同じ方向）とを２等分する方向、すなわち、偏光板２３の軸方向に対して＋３０°だけ回転した方向（０°分岐用の格子線に対して＋３０°）に設定される必要がある。
　そこで、０°の方向Ｖ０に分岐した±１次回折光束を使用する場合、第１の液晶素子６１、第２の液晶素子６２のうち双方をオフすることにより、第２の液晶素子６２を通過したそれらの±１次回折光束の偏光方向を、０°分岐用の格子線と同じ方向とし、１２０°の方向Ｖ１２０に分岐した±１次回折光束を使用する場合、第１の液晶素子６１のみをオンすることにより、第２の液晶素子６２を通過したそれらの±１次回折光束の偏光方向を、１２０°分岐用の格子線と同じ方向とし、２４０°の方向Ｖ２４０に分岐した±１次回折光束を使用する場合、第２の液晶素子６２のみをオンすることにより、第２の液晶素子６２を通過したそれらの±１回折光束の偏光方向を、２４０°分岐用の格子線と同じ方向とすればよい。
　なお、ここでは、１／２波長板の進相軸の方向を説明するに当たり、１／２波長板を通過後における光の偏光方向と、１／２波長板を通過前における光の偏光方向（偏光板２３の軸方向）とが成す角を、鋭角と仮定したが、鈍角であってもよい（位相がπだけずれるだけで、Ｓ偏光になることに変わりない。）。
　次に、第３の液晶素子６３は、波長λ１、λ２の入射光束に対して位相板として作用し、駆動回路６３Ａから与えられる信号に応じて、入射光束の位相遅延量を領域毎に設定することが可能である。液晶素子６３において位相遅延量を個別に設定できる領域には、少なくとも図４に示した領域Ａと領域Ａ’とがある。
　一方の領域Ａは、０°の方向に分岐した±１次回折光束の一方の入射領域と、１２０°の方向に分岐した±１次回折光束の一方の入射領域と、２４０°の方向に分岐した±１次回折光束の一方の入射領域との集合である。
　他方の領域Ａ’は、０°の方向に分岐した±１次回折光束の他方の入射領域と、１２０°の方向に分岐した±１次回折光束の他方の入射領域と、２４０°の方向に分岐した±１次回折光束の他方の入射領域との集合である。
　よって、駆動回路６３Ａが領域Ａの位相遅延量と領域Ａ’の位相遅延量との間に差（位相遅延量差）を与えると、０°の方向に分岐した±１次回折光束の間に位相差が付与され、１２０°の方向に分岐した±１次回折光束の間に位相差が付与され、２４０°の方向に分岐した±１次回折光束の間に位相差が付与される。
　さらに、駆動回路６３Ａが領域Ａ、Ａ’の間の位相遅延量差をシフトさせれば、０°の方向に分岐した±１次回折光束の位相差がシフトし、１２０°の方向に分岐した±１次回折光束の位相差がシフトし、２４０°の方向に分岐した±１次回折光束の位相差がシフトする。これによって、０°の方向の干渉縞の位相がシフトし、１２０°の方向の干渉縞の位相がシフトし、２４０°の方向の干渉縞の位相がシフトする。
　次に、光束選択部材１８の開口パターンは、図５に示すとおり、或る方向に分岐した±１次回折光束の一方及び他方を個別に通過させる第１の開口部１９及び第２の開口部２０からなり、これら第１の開口部１９と第２の開口部２０との各々の光軸周りの長さは、直線偏光した±１次回折光束が通過できるような長さに設定されている。よって、第１の開口部１９及び第２の開口部２０の各々の形状は、部分輪帯状に近い形状である。
　また、この光束選択部材１８は、回動機構１８Ａによって光軸の周りに１２０°のピッチで回動可能である。
　この光束選択部材１８の回動位置が０°に設定されると、０°、１２０°、２４０°の各方向に分岐した±１次回折光束のうち、０°の方向に分岐した±１次回折光のみが光束選択部材１８を通過するので、標本５に形成される干渉縞の方向は、０°の方向となる。
　また、光束選択部材１８の回動位置が１２０°に設定されると、０°、１２０°、２４０°の各方向に分岐した±１次回折光束のうち、１２０°の方向に分岐した±１次回折光のみが光束選択部材１８を通過するので、標本５に形成される干渉縞の方向は、１２０°の方向となる。
　また、光束選択部材１８の回動位置が２４０°に設定されると、０°、１２０°、２４０°の各方向に分岐した±１次回折光束のうち、２４０°の方向に分岐した±１次回折光のみが光束選択部材１８を通過するので、標本５に形成される干渉縞の方向は、２４０°の方向となる。
　なお、光束選択部材１８の外周部には、図５に示すように複数の（図５に示す例では６個の）切り欠き２１が形成されており、光束選択部材１８の近傍において切り欠き２１の軌跡に正対する位置には、これらの切り欠き２１の有無を検出するためのセンサ２２が配置される。このセンサ２２は、フォトインタラプタなどで構成され、センサ２２に切り欠き２１が正対しているときには、センサ２２の検出信号の値は大きくなり、センサ２２に切り欠き２１が正体していないときには、センサ２２の検出信号の値は小さくなる。よって、センサ２２の検出信号は、光束選択部材１８の回動位置を示す信号（角度信号）として使用可能である。
　次に、本実施形態の制御装置３９の動作を詳しく説明する。制御装置３９は、復調演算に必要な一連の第１変調画像と、復調演算に必要な一連の第２変調画像とを、以下の手順（０）～（６）で取得する。
　（０）制御装置３９は、標本５に照射されるレーザ光の波長をλ１、λ２の双方に設定する。
　（１）制御装置３９は、回動機構１８Ａを介して光束選択部材１８の回動位置を０°の方向に設定することにより、干渉縞の方向を０°の方向に設定する。また、制御装置３９は、駆動回路６１Ａ、６２Ａを介して液晶素子６１、６２の双方をオフすることにより、干渉縞に寄与する±１次回折光束をｓ偏光に設定する。
　（２）制御装置３９は、駆動回路６３Ａを介して液晶素子６３の領域Ａ、Ａ’の位相遅延量差のシフトを開始する。
　（３）制御装置３９は、位相遅延量差のシフト中に、標本５に対するレーザ光の照射を行い、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の双方の露光（撮像）を複数枚に亘って繰り返す。なお、第１撮像素子３５１のフレーム周期と第２撮像素子３５２のフレーム周期とは、共通に設定される。
　（４）制御装置３９は、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２による複数枚の撮像期間中、位相遅延量差のシフトピッチを第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２のフレーム周期に応じたピッチに設定することで、一連の第１変調画像の隣接画像間における干渉縞の位相差を２π未満の所定値Δφに設定すると共に、一連の第２変調画像の隣接画像間における干渉縞の位相差を、２π未満の所定値Δφに設定する。
　（５）制御装置３９は、回動機構１８Ａを介して光束選択部材１８の回動位置を１２０°の方向に設定することにより、干渉縞の方向を１２０°の方向に設定する。また、制御装置３９は、駆動回路６１Ａ、６２Ａを介して液晶素子６１、６２のうち前者のみをオンすることにより、干渉縞に寄与する±１次回折光束をｓ偏光に設定する。その状態で、制御装置３９は手順（２）～（４）を実行する。
　（６）制御装置３９は、回動機構１８Ａを介して光束選択部材１８の回動位置を２４０°の方向に設定することにより、干渉縞の方向を２４０°の方向に設定する。また、制御装置３９は、駆動回路６１Ａ、６２Ａを介して液晶素子６１、６２のうち後者のみをオンすることにより、干渉縞に寄与する±１次回折光束をｓ偏光に設定する。その状態で、制御装置３９は手順（２）～（４）を実行する。
　以上の手順（０）～（６）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第１変調画像が、第１超解像画像の生成に必要な一連の第１変調画像である。
　それと並行して、以上の手順（０）～（６）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第２変調画像が、第２超解像画像の生成に必要な一連の第２変調画像である。
　以上、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、干渉縞の方向を切り替える方式と、干渉縞の位相をシフトさせる方式と、干渉縞に寄与する回折光束の偏光方向を整える方式とが第１実施形態とは異なるものの、その他の点については第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１と同様である。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１と同様、波長差の大きい２つ使用波長の各々で超解像効果を得ることや、超解像効果を波長間で共通化することなどが可能である。
　［第３実施形態］
　以下、本発明の第３実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　図６は、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。本実施形態は、第１実施形態の変形例であるので、ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。
　図６に示すとおり本実施形態では、波長の異なる２つのレーザ光の間に非共通光路を設けない代わりに、波長λ１の光にのみ作用する第１回折格子１３１”と、波長λ２の光にのみ作用する第２回折格子１３２”との双方が２つのレーザ光の共通光路に配置される。
　このため、本実施形態では、ダイクロイックミラー５５、５７、ミラー５６、５８は省略され、波長λ１のレーザ光の偏光方向の調整と波長λ２のレーザ光の偏光方向の調整とに１枚の偏光板２３が兼用される。
　また、第１回折格子１３１”の配置箇所と第２回折格子１３２の配置箇所とは互いに近接しており、両者の配置箇所から集光レンズ１６までの距離は、集光レンズ１６の焦点距離に相当し、第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の光軸方向の幅は十分に小さく、集光レンズ１６の焦点深度内に収まっている。
　また、第１回折格子１３１”と第２回折格子１３２”とは互いの格子線を同じ方向に向けた姿勢で接着層を介して互いに固定されており、第１回折格子１３１”の並進移動と第２回折格子１３２”の並進移動とに１つの並進機構１５Ａが兼用され、第１回折格子１３１”の回動と第２回折格子１３２”の回動とに１つの回動機構１５Ｂが兼用される。
　また、本実施形態では、第１変調画像の取得と第２変調画像の取得とは、１つの撮像素子３５を兼用する。このため、第２ダイクロイックミラー５５は省略される。
　また、本実施形態では、図示省略したが、第２ダイクロイックミラー５５を省略する代わりに、励起フィルタ２８、第１ダイクロイックミラー７、バリアフィルタ３１からなるユニット（キューブ）が２つ用意され、光路に配置されるユニットをそれら２つユニットの間で切り換えるユニット切り換え機構が備えられる。なお、これらの２つのユニットの一方は、使用波長がλ１であるときに適したユニット（波長λ１用のユニット）であり、他方は、使用波長がλ２であるときに適したユニット（波長λ２用のユニット）である。制御装置３９は、このユニット切り換え機構を介して、光路に配置されるユニットを波長λ１用のユニットと波長λ２用のユニットとの間で切り換える。
　以下、本実施形態で新たに配置された各光学要素の詳細を説明する。
　先ず、第１回折格子１３１”は、フォトポリマーなどで作製されたホログラム回折格子である。ホログラム回折格子は、図７に示すとおり、感光剤を混ぜたモノマーなどの基板に対して、互いに異なる角度から１対の可干渉光（物体光及び参照光）を同時に照射することで、その基板へ干渉縞を投影し、その干渉縞のパターンに対応した構造を基板に定着（記録）させたものである。
　図７に示すとおり、ホログラム回折格子の作製時、１対の可干渉光の光源Ｐ０、Ｐｒを感光剤の同じ側に配置すれば、ホログラム回折格子は、本実施形態の回折格子として適したタイプ（透過型）となる。また、１対の可干渉光の波長と、１対の可干渉光の間の角度（物体光に対する参照光の角度θｒ）とを適切に設定すれば、ホログラム回折格子の選択波長域（ホログラム回折格子で回折する光の波長域）を、所望の波長域に制限することができる。
　例えば、ホログラム回折格子の作製時における１対の可干渉光の波長を４０５ｎｍに設定し、１対の可干渉光の角度（物体光に対する参照光の角度θｒ）を６０°に設定したならば、ホログラム回折格子の法線から３０°の角度（＝物体光に対する参照光の角度θｒ：６０°の１／２倍）で±５°以下の角度幅を持って入射した光であって、中心波長が４０５ｎｍであり±８０ｎｍ以下の波長幅を持った光に対して、回折格子として機能することができる。
　なお、図８に示した図は１対の可干渉光の角度（物体光に対する参照光の角度θｒ）と、使用光束の角度幅Δθと、使用光束の選択波長域の波長幅Δλとの関係を示している。図８に示す例は、使用波長の中心波長を４０５ｎｍとするために１対の可干渉光の波長を４０５ｎｍにした場合の例であるが、これらの波長を他の値に設定した場合にも、図８に示す関係と類似した関係が得られると考えられる。
　したがって、本実施形態の第１回折格子１３１”としては、波長λ１の可干渉光で作製されたホログラム回折格子が使用される。
　次に、第２回折格子１３２”も、第１回折格子１３１”と同様のホログラム回折格子である。但し、第２回折格子１３２”の作製で使用される可干渉光の波長は、λ２に設定される。
　したがって、第１回折格子１３１”には、波長λ１の入射光束を選択的に回折する機能が付与され、第２回折格子１３２”には、波長λ２の入射光束を選択的に回折する機能が付与される。
　なお、ホログラム回折格子の選択波長域の波長幅Δλは、図８にも示したとおり完全にゼロとはならないので、本実施形態の波長λ１と波長λ２との間には、一定の以上の差が設けられることが望ましい。例えば、λ１＝６４０ｎｍ、λ２＝４０５ｎｍなどと設定されることが望ましい。
　また、本実施形態では、第１回折格子１３１”、第２回折格子１３２”の間で波長以外の作製条件（θｒ）は共通化される。これによって、第２回折格子１３２”の格子ピッチと第１回折格子１３１”の格子ピッチとの関係は、第１実施形態における関係（第２回折格子１３２の格子ピッチと第１回折格子１３１の格子ピッチとの関係）と同じになる。
　次に、本実施形態の制御装置３９の動作を詳しく説明する。制御装置３９は、復調演算に必要な一連の第１変調画像と、一連の第２変調画像とを、以下の手順（０）～（７）で取得する。
　（０）制御装置３９は、標本５に照射されるレーザ光の波長をλ１に設定すると共に、光路に設定されるユニットを波長λ１用のユニットに設定する。
　（１）制御装置３９は、回動機構１５Ｂを介して第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の回動位置を０°に設定する。
　（２）制御装置３９は、並進機構１５Ａを介して第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の並進移動を開始する。
　（３）制御装置３９は、第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の並進移動中に、標本５に対するレーザ光の照射を行い、撮像素子３５の露光（撮像）を複数枚に亘って繰り返す。
　（４）制御装置３９は、撮像素子３５による複数枚の撮像期間中、第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の並進移動のピッチを撮像素子３５のフレーム周期に応じたピッチに設定することで、手順（３）で取得される一連の変調画像の隣接画像間における干渉縞の位相差を、２π未満の所定値Δφに設定する。
　（５）制御装置３９は、回動機構１５Ｂを介して第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の回動位置を１２０°に設定し、その状態で手順（２）～（４）を実行する。
　（６）制御装置３９は、回動機構１５Ｂを介して第１回折格子１３１”及び第２回折格子１３２”の回動位置を２４０°に設定し、その状態で手順（２）～（４）を実行する。
　（７）制御装置３９は、標本５に照射されるレーザ光の波長をλ２に設定すると共に、光路に設定されるユニットを波長λ２用のユニットに設定し、その状態で手順（１）～（６）を実行する。
　以上の手順（０）～（６）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第１変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第１変調画像が、第１超解像画像の生成に必要な一連の第１変調画像である。
　また、以上の手順（７）により、制御装置３９は、干渉縞の方向が０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が１２０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像と、干渉縞の方向が２４０°であって干渉縞の位相がΔφずつずれた少なくとも３枚の第２変調画像とを順に取得する。これらの少なくとも９枚の第２変調画像が、第２超解像画像の生成に必要な一連の第２変調画像である。
　以上、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、２つの光分岐部（１３１”、１３２”）が２種類の光束の共通光路へ配置され、２つの光分岐部の一方は、２種類の光束の一方を選択的に分岐する波長選択性を有し、２つの光分岐部の他方は、２種類の光束の他方を選択的に分岐する波長選択性を有する点において、第１実施形態とは異なるものの、その他の点については第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１と同様である。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１と同様、波長差の大きい２つ使用波長の各々で超解像効果を得ることや、超解像効果を波長間で共通化することなどが可能である。
　［各実施形態の変形例］
　なお、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、干渉縞の方向を切り替えるために、回動可能な回折格子を使用したが、電気信号に応じて格子方向を切り替えることが可能な回折格子（空間光変調素子）などを使用してもよい。
　また、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、干渉縞の位相をシフトさせるために、並進移動可能な回折格子を使用したが、電気信号に応じて格子位置をシフトさせることが可能な回折格子（空間光変調素子）などを使用してもよい。
　また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、干渉縞の方向を切り替えるために、回動可能な光束選択部材を使用したが、電気信号に応じて開口パターンを切り替えることが可能な光束選択部材（液晶素子）などを使用してもよい。
　また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１において、干渉縞の方向の切り替え方式、干渉縞の位相シフト方式、偏光方向の調整方式の全てを変形したものであるが、一部のみを変形した構造化照明顕微鏡装置も実現可能である。
　また、第１実施形態又は第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、波長の異なる２つの変調像を並行して撮像するために、撮像素子の個数を２つとしたが、波長の異なる２つの変調像を順次に撮像する場合は、撮像素子の個数を１としてもよい。
　その場合は、第２ダイクロイックミラー３５及び撮像素子３５１を省略すると共に、励起フィルタ２８、第１ダイクロイックミラー７、バリアフィルタ３１からなるユニット（キューブ）を２つ用意し、光路に配置されるユニットをそれら２つのユニットの間で切り換え、切り換えの前後の各々で撮像素子３５２を駆動すればよい。
　また、第１実施形態又は第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、第１回折格子で発生した波長λ１の回折光束が瞳面６Ａに形成する集光点の配列パターン（±１次回折光束の集光点の間隔）と、第２回折格子で発生した波長λ２の回折光束が瞳面６Ａに形成する集光点の配列パターン（±１次回折光束の集光点の間隔）とを同じにするために、第１回折格子の格子ピッチと第２回折格子の格子ピッチとの間に差異を与えた。つまり、第１回折格子における波長λ１の光の回折角度と第２回折格子における波長λ２の光の回折角度とを同じにした。しかし、第１回折格子の格子ピッチと第２回折格子の格子ピッチとの間に差異を与える代わりに（或いは差異を与えるのに加えて）、視野絞り面に投影される第１回折格子の像の投影倍率と、視野絞り面に投影される第２回折格子の像の投影倍率との間に差異を与えてもよい。
　なお、第１回折格子の像の投影倍率と第２回折格子の像の投影倍率との間に差異を与えるためには、第１回折格子から視野絞り面に至る波長λ１のレーザ光の単独光路と、第２回折格子から視野絞り面に至る波長λ２のレーザ光の単独光路との少なくとも一方に、レンズを挿入すればよい。
　また、第３実施形態の構造化照明顕微鏡では、使用波長の切り換えを、一連の第１変調画像の全てが取得し終わったタイミングで行ったが、干渉縞の位相をシフトさせる度に行ってもよいし、干渉縞の方向を切り換える度に行ってもよい。
　また、第３実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、撮像素子の個数を１として、波長の異なる２つの変調像を順次に撮像したが、撮像素子の個数を２とし、波長の異なる２つの変調像を並行に撮像してもよい。但し、干渉縞の位相を所定量だけシフトさせるために必要な回折格子の移動量は、回折格子の格子ピッチに依存するので、その場合は、２つの回折格子を互いに固定することなく、上述した並進機構を２つの回折格子の各々に対して個別に用意することが望ましい。
　また、第３実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、第１回折格子又は第２回折格子として特定波長の光を１方向にかけて分岐するホログラム回折格子を使用したが、このホログラム回折格子の代わりに、特定波長の光を複数方向（第２実施形態と同様の３方向）にかけて同時に分岐するホログラム回折格子を使用してもよい。このようなホログラム回折格子の作製では、３対の可干渉光束を３方向から同時に基板へ照射すればよい。
　また、第３実施形態のホログラム回折格子として、分岐方向が複数化されたホログラム回折格子を使用する場合は、回動機構１５Ｂの代わりに、第２実施形態で説明した光束選択部材１８（光軸の周りを回動可能な光束選択部材）又はそれと同じ機能を有した光学要素を瞳共役面６Ａ’の近傍に配置すればよい。
　また、上述した何れかの実施形態では、２つの回折格子の各々に割り当てる光の波長を単波長としたが、２つの回折格子の少なくとも一方に割り当てる光の波長を、ブロード波長としてもよい。例えば、レーザユニットのレーザ光源の個数を３以上に増設すると共に、レーザユニットが出射するレーザ光のうち、比較的長い波長域に属するレーザ光については第１回折格子に割り当て、比較的短い波長域に属するレーザ光については第２回折格子に割り当ててもよい。
　また、上述した何れかの実施形態では、干渉縞の方向が同一であり干渉縞の位相のみが異なる一連の第１変調画像の枚数を「少なくとも３」と説明したが、例えば、３枚、又は５枚などと設定される。その場合、第１超解像画像の生成に使用される一連の第１変調画像の枚数は、９枚又は１５枚となる。
　同様に、上述した何れかの実施形態では、干渉縞の方向が同一であり干渉縞の位相のみが異なる一連の第２変調画像の枚数を「少なくとも３」と説明したが、例えば、３枚、又は５枚などと設定される。その場合、第２超解像画像の生成に使用される一連の第２変調画像の枚数は、９枚又は１５枚となる。
　また、上述した何れかの実施形態では、回折格子の個数を２としたが、使用波長域の更なる拡大を図る場合には、回折格子の個数を３以上に拡張してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態では、透過型の回折格子を使用したが、反射型の回折格子を使用してもよいことは言うまでもない。
　また、上述した何れかの実施形態では、構造化照明顕微鏡装置を２次元構造化照明顕微鏡装置として使用する場合を説明したが、構造化照明顕微鏡装置を３次元構造化照明顕微鏡装置（３Ｄ－ＳＩＭ：3D-Structured Illumination Microscopy）として利用することもできる。
　その場合は、０次光カットマスク１４の代わりに、高次光カットマスクが使用される。高次光カットマスクは、０次光カットマスク１４において０次回折光束を通過するための開口部が更に設けられたものである。この開口部の形成先は、光軸の近傍であって、この開口部の形状は、例えば円形である。同様に、光束選択部材１８にも、０次回折光束を通過させるための開口部が更に設けられる。この開口部の形成先は、光軸の近傍であって、この開口部の形状は、例えば円形である。このような高次光カットマスク、光束選択部材によると、±１次回折光束だけでなく０次回折光束をも干渉縞に寄与させることができる。
　このように、３つの回折光束の干渉（３光束干渉）によって生成される干渉縞は、標本５の表面方向だけでなく、標本５の深さ方向にも空間変調されている。よって、この干渉縞によると、標本５の３次元超解像画像を生成することが可能となる。
　また、上述した何れかの実施形態では、構造化照明顕微鏡装置を２次元構造化照明顕微鏡装置として使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と－１次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
　また、上述した何れかの実施形態では、構造化照明顕微鏡装置を３次元構造化照明顕微鏡装置として使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と－１次回折光束と０次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
　さらに、本発明の実施形態では、超解像画像（復調画像）を取得するために、一連の変調画像を用いて公知の演算を行う例を記載しているが、これに限られず、例えば、米国特許８０８１３７８に記載された光学的復調によって復調画像（超解像画像）を取得してもよい。
　その場合、第１の実施形態（図１）では、ダイクロイックミラー７をミラーに置き換えるとともに、ダイクロイックミラー５５と第１回折格子１３１の間の光路と、ダイクロイックミラー５５と第２回折格子１３２の間の光路との各々に対して、各励起光（λ１、λ２）に応じて発生した蛍光をその各励起光から分離するダイクロイックミラー、その蛍光を受光する撮像素子を配置すればよい。また、コレクタレンズ１２とダイクロイックミラー５５との間の光路に対して、励起光（λ１、λ２）に応じて発生した蛍光をその励起光から分離するダイクロイックー、その蛍光を受光する撮像素子等を配置すればよい。
　さらに、第３の実施形態（図６）では、ダイクロイックミラー７をミラーに置き換えるとともに、コレクタレンズ１２とホログラム回折格子との間の光路に対して、励起光（λ１、λ２）に応じて発生した蛍光をその励起光から分離するダイクロイックー、その蛍光を受光する撮像素子等を配置すればよい。
　１…構造化照明顕微鏡装置、１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、３０…結像光学系、３５１…第１撮像素子、３５２…第２撮像素子、３９…制御装置、４０…画像記憶・演算装置、４５…画像表示装置、１２…コレクタレンズ、２３…偏光板、１３１…第１回折格子、１３２…第２回折格子、１６…集光レンズ、１４…０次光カットマスク、２５…レンズ、２６…視野絞り、２７…フィールドレンズ、２８…励起フィルタ、７…第１ダイクロイックミラー、６…対物レンズ、５…標本
 

Claims (9)

  1. 　波長の異なる２種類の光束を個別に分岐する２つの光分岐部と、
    　前記２つの光分岐部の各々で発生した複数の分岐成分を標本上で干渉させる光学系と、
    　を備えたことを特徴とする構造化照明装置。
  2. 　請求項１に記載の構造化照明装置において、
    　前記２つの光分岐部の各々は、
    　回折光学素子を含む
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の構造化照明装置において、
    　前記２つの光分岐部の一方に形成された構造周期と、他方に形成された構造周期とは、互いに異なる
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  4. 　請求項１～請求項３の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記２つの光分岐部の各々に形成された構造周期は、
    　前記構造化照明装置の超解像効果が、前記２種類の光束で互いに等しくなるように設定される
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  5. 　請求項１～請求項４の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記光学系は、対物レンズを含み、
    　前記２つの光分岐部の各々で発生した複数の分岐成分を前記対物レンズの瞳の互いに異なる位置へ集光させることにより、それらの分岐成分を前記対物レンズの物体側で干渉させるものであり、
    　前記２つの光分岐部の各々に形成された構造周期は、
    　前記２種類の光束の一方が前記瞳に形成する複数の集光点の配列パターンと、他方が前記瞳に形成する複数の集光点の配列パターンとが、互いに等しくなるように設定される
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  6. 　請求項１～請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記２つの光分岐部は、
    　前記２種類の光束の非共通光路へ個別に配置される
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  7. 　請求項１～請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記２つの光分岐部は、
    　前記２種類の光束の共通光路へ配置され、
    　前記２つの光分岐部の一方は、
    　前記２種類の光束の一方を選択的に分岐する波長選択性を有し、
    　前記２つの光分岐部の他方は、
    　前記２種類の光束の他方を選択的に分岐する波長選択性を有する
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  8. 　請求項１～請求項７の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
    　前記光学系で照明された前記標本の像を検出する検出光学系と、
    　を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡。
  9. 　請求項８に記載の構造化照明顕微鏡において、
    　前記検出光学系は、
    　前記標本の像を波長毎に検出する
    　ことを特徴とする構造化照明顕微鏡。
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