KR102306769B1 - 라인 스캐닝을 이용한 구조화 조명 현미경법 - Google Patents

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Abstract

패턴화된 플로우셀을 사용하여 생물학적 샘플의 구조화 조명 이미지화에 필요한 각도들의 수를 감소시키기 위한 기술이 설명되는데, 이때 패턴화된 플로우셀의 나노웰은 예컨대 정사각형 어레이 또는 비대칭형 어레이로 배열된다. 따라서, 생물학적 샘플의 세부사항을 분해하는데 필요한 이미지의 수가 감소된다. 또한, 패턴화된 플로우셀을 사용하여 라인 스캐닝과 구조화된 조명 이미지화를 조합하는 기술도 설명된다.

Description

라인 스캐닝을 이용한 구조화 조명 현미경법
본 출원은 2018년 1월 24일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Structured Illumination Microscopy With Line Scanning"인 미국 가특허출원 제62/621,570호 및 2018년 3월 20일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Structured Illumination Microscopy With Line Scanning"인 네덜란드 특허출원 제N2020623호에 대한 우선권을 주장한다. 상술한 출원들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
생물학 연구에서 최근에 수많은 진보는 핵산의 분석 및 시퀀스 분석을 위한 개선된 방법으로부터 이익을 얻었다. 예를 들어, 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)는 질병의 치료에서 기초 과학의 발전에 이르기까지 다양한 분야의 발견을 이끌어 낼 인간 게놈의 전체 시퀀스를 결정했다. 평면 어레이 또는 비드 형태 중 하나에서 증폭되지 않거나 증폭되는 단일 분자의 대규모 병렬 분석에 기초한 다수의 새로운 DNA 시퀀싱 기술이 최근에 보고되었다.
이러한 새로운 시퀀싱 기술에서 핵산의 시퀀스를 분석하기 위해 사용되는 방법은 종종 형광성 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 검출에 기초한다. 구조화 조명 현미경법(Structured illumination microscopy, SIM)은 공간적으로 구조화된 (즉, 패턴화된) 광이 현미경의 측면 해상도를 2배 이상 증가시키기 위해 샘플을 이미지화하는데 사용될 수 있는 이러한 하나의 시퀀싱 기술을 말한다. 샘플의 이미지화 동안, 샘플의 이미지는 다양한 패턴 위상(예를 들어, 0°, 120° 및 240°)에서 획득될 수 있으며, 절차는 광축 주위로 패턴 배향을 회전시킴으로써 (예를 들어, 60° 및 120°만큼) 반복된다. 캡처된 이미지(예를 들어, 9개의 이미지, 각 패턴 위상에서 각 배향 각도에 대한 하나의 이미지)는 확장된 공간 주파수 대역폭을 갖는 단일 이미지로 조립될 수 있다. 단일 이미지는 현미경에 의해 정상적으로 분해될 수 있는 것보다 더 높은 해상도를 갖는 이미지를 생성하기 위해 실제 공간으로 재변환될 수 있다.
SIM 시스템의 전형적인 구현에서, 선형 편광 빔은 정현파 간섭 프린지 패턴으로서 이미지화된 샘플 상에 투영될 수 있는 2 이상의 개별 차수로 빔을 회절시키는 광학 회절 격자를 통해 지향된다. 이러한 구현들에서, 투영된 광학 회절 격자 패턴의 배향은 광학 축을 중심으로 광학 회절 격자를 회전시킴으로써 제어되는 반면, 패턴의 위상은 축을 가로질러 측방향으로 광학 회절 격자를 이동시킴으로써 조정된다. 이러한 시스템에서, 광학 회절 격자는 병진 스테이지에 장착되며, 이는 결국 회전 스테이지에 장착된다. 또한, 이러한 시스템은 선형 편광자를 사용하여 광원에서 방출되는 광을 격자에서 수신하기 전에 편광시킨다.
도 1a는 샘플(100) 및 샘플(100)에 투영되는 광학 회절 격자 패턴(102)의 예를 도시한다. 비록 샘플(100)은 분해될 수 없는 고차 공간 주파수를 포함할 수 있지만, 샘플(100)에 대해 공지된 저차 공간 주파수를 가지는 중첩하는 광학 회절 격자 패턴(102)은 모아레 무늬(Moire fringes)를 발생시킨다. 이는 현미경에 의해 분해될 수 없는 고차 공간 주파수를 분해가능한 저차 공간 주파수로 효과적으로 이동시킨다. 상술한 바와 같이, 샘플(100)에 대하여 광학 회절 격자 패턴(102)의 상이한 배향/각도 및 위상을 가지는 샘플(100)의 이미지들을 캡처하면, 실제 공간으로 재변환되는 하나의 이미지로 이미지들이 결합되어서 더 높은 해상도를 갖는 이미지를 생성할 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법의 예는 특히 패턴화된 플로우셀을 통해 SIM을 사용하여 형광성 샘플을 분해하는데 필요한 이미지 및 차원의 수를 감소시키고, 라인 스캐닝 기술과 함께 사용될 수 있는 SIM의 구현을 달성하도록 형광성 샘플에 대해 광 빔 이동을 레버리지하는 기술에 관한 것이다.
하나의 구현에 따라, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법은 고정식 광학 회절 격자를 통해 광을 지향시키는 단계 및 고정식 광학 회절 격자를 통해 생물학적 샘플로 지향되는 광에 의해 생성되는 광학 회절 격자 패턴을 투영시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 생물학적 샘플을 라인 스캐닝하는 단계 및 광학 회절 격자 패턴에 대하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 고정식 광학 회절 격자를 통해 지향되는 광을 이동시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 이 방법은 생물학적 샘플을 나타내는 고해상도 이미지를 재구성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 광은 2개의 개별적인 레이저 소스로부터 출력된 적색 및 녹색 파장의 광을 포함한다. 2개의 레이저 소스들 각각은 펄스형 광을 출력할 수 있다. 일부 예에서, 생물학적 샘플의 라인 스캐닝은 2개의 레이저 소스가 여기되어 생물학적 샘플의 조명이 이루어질 때 생물학적 샘플의 일부의 이미지를 캡처하는 단계를 포함한다.
일부 구현에서, 광학 회절 격자 패턴에 대한 생물학적 샘플의 이동 또는 광학 회절 격자 패턴에 대한 광의 이동은 광학 회절 격자 패턴의 복수의 위상 변이를 생성한다.
일부 구현에서, 복수의 위상 변이는 광학 회절 격자 패턴의 적어도 3개의 위상 변이를 포함한다.
일부 구현에서, 광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰과 적어도 실질적으로 수직으로 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함한다. 플로우셀의 제1 축을 따라 생물학적 샘플을 나타내는 정보는 플로우셀과 광학 회절 격자 패턴을 포함하는 복수의 세장형 나노웰의 조합에 의해 생성된 공간 주파수에 기반한 해상도 증가에 따라 분해될 수 있다. 제1 축과 적어도 실질적으로 수직인 제2 축을 따라 생물학적 샘플을 나타내는 정보는 비-증가 해상도에 따라 분해될 수 있다.
일부 예에서, 광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰과 적어도 실질적으로 평행하게 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함한다. 라인 스캐닝은 복수의 세장형 나노웰과 정렬되는 방향을 따라 수행될 수 있다.
일부 구현에서, 생물학적 샘플의 라인 스캐닝은 생물학적 샘플의 시간 지연 적분 라인 스캐닝(time delay integration line scanning)을 포함한다.
또 다른 예에 따라, 본 시스템은 적어도 2개의 파장으로 광 빔을 각각 방출하는 적어도 2개의 레이저 소스 및 고정식 광학 회절 격자를 통해 방출된 광 빔이 지나가면 광학 회절 격자 패턴을 생성하도록 형성된 고정식 광학 회절 격자를 포함할 수 있다. 게다가, 이 시스템은 광학 회절 격자 패턴에 관계하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 광학 회절 격자 패턴에 관계하여 적어도 2개의 레이저 소스를 이동시키고, 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지를 캡처하며, 복수의 이미지에 기반하여 생물학적 샘플을 나타내는 고해상도 이미지를 재구성하는 라인 스캐닝 어셈블리를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 라인 스캐닝 어셈블리는 형광성 생물학적 샘플을 감지하도록 형성된 적어도 하나의 이미지 센서를 각각 가지는 적어도 2개의 카메라를 포함한다. 광학 회절 격자 패턴에 관계하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 적어도 2개의 레이저 소스를 이동시키는 것은 광학 회절 격자 패턴의 복수의 위상 변이를 생성할 수 있다. 복수의 위상 변이는 광학 회절 격자 패턴의 적어도 3개의 위상 변이를 포함할 수 있다. 광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰와 관련하여 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함한다.
일부 예에서, 라인 스캐닝 어셈블리는 복수의 세장형 나노웰과 정렬되는 방향을 따라 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지를 캡처한다. 일부 예에서, 적어도 2개의 레이저 소스 각각은 펄스형 광 빔을 방출한다. 일부 예에서, 라인 스캐닝 어셈블리는 적어도 2개의 레이저 소스의 여기가 생물학적 샘플을 형광시키면 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지 각각을 캡처한다.
하기에 더 상세히 논의되는 상술한 개념 및 추가 개념들(이러한 개념들이 서로 일치하는 경우)의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 명세서의 말단에 나타나는 청구된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다.
개시된 기술의 다른 특징 및 태양은 첨부도면과 관련하여 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이며, 이는 개시된 기술의 본 명세서에 기술된 일부 구현에 따른 특징을 예로서 도시한 것이다. 요약은 청구범위 및 등가물에 의해 정의되는 본원에 기재된 임의의 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 명세서는 하나 이상의 다양한 구현에 따라 하기의 도면을 참조로 상세히 설명된다. 도면은 단지 예시용으로 제공되며 단지 일반적이거나 예시적인 구현을 도시한 것이다.
도 1a는 증가된 해상도를 고려한 샘플의 주파수 패턴을 낮추는데 사용되는 구조화 조명의 일 예를 도시한다.
도 1b는 일 예로 이미지화를 위해 샘플을 분해하는데 필요한 각도의 수를 도시한다.
도 2는 구조화 조명 이미지화 시스템의 일 예를 도시한다.
도 3a는 육각형의 플로우셀 패턴의 예를 도시한다.
도 3b는 사용시 감소한 차원의 구조화 조명 이미지화를 발생시키는 정사각형 어레이 플로우셀 패턴의 예를 도시한다.
도 3c는 사용시 감소한 차원의 구조화 조명 이미지화를 발생시키는 비대칭형 어레이 플로우셀 패턴의 예를 도시한다.
도 4는 감소한 차원의 구조화 조명 이미지화를 위해 구현될 수 있는 동작들의 예를 도시한 흐름도이다.
도 5는 라인 스캐닝 이미지화 시스템의 일 예를 도시한다.
도 6a 내지 6c는 일 예에서 하나의 차원에서의 구조화 조명 패턴의 위상 변이를 도시한다.
도 6d는 위상 변이된 구조화 조명 패턴과 동시에 중첩되는 상이한 부분들을 갖는 비대칭적으로 패턴화된 플로우셀의 일 예를 도시한다.
도 7은 종래의 패턴화된 플로우셀을 사용하는 라인 스캐닝 동작의 예를 도시한다.
도 8은 고정식 구조화 조명 패턴을 사용한 라인 스캐닝 이미지화 시스템의 예를 도시한다.
도 9는 조명 광 빔을 변조하는 고정식 구조화 조명 패턴을 사용한 라인 스캐닝 동작의 예를 도시한다.
도 10은 라인 스캐닝 이미지화와 함께 사용되는 감소한 차원의 구조화 조명 이미지화를 위해 구현될 수 있는 동작들의 예를 도시한 흐름도이다.
도 11은 본 명세서에 기술된 구현들의 다양한 특징들을 구현하는데 사용될 수 있는 컴퓨팅 구성요소의 예를 도시한다.
도면은 완전한 것이 아니며, 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하지 않는다.
회절격자에 의해 방출된 회절 광을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "차(order)" 또는 "차수(order number)"라는 용어는 보강간섭을 위한 회절격자의 인접한 슬릿으로부터의 광의 경로 길이 차이를 나타내는 정수 파장의 수를 의미하는 것으로 의도된다. "0차" 또는 "0차 최대"라는 용어는 회절이 없는 회절격자에 의해 방출되는 중앙의 밝은 프린지를 지칭하도록 의도된다. "1차"라는 용어는 경로 길이 차이가 ±1 파장인 0차 프린지의 어느 한쪽으로 방출된 2개의 밝은 프린지를 지칭하는 것으로 되어 있다.
본 명세서에서 샘플을 지칭하기 위해 사용되는 바와 같이, "스팟" 또는 "피처"라는 용어는 상대 위치에 따라 다른 점 또는 영역과 구별될 수 있는 패턴의 점 또는 영역을 의미하는 것으로 의도된다. 개별 스팟은 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스팟은 특정 서열을 갖는 단일 표적 핵산 분자를 포함할 수 있거나, 스팟은 동일한 서열(및/또는 이의 상보적 서열)을 갖는 다수의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "타일(tile)"이라는 용어는 일반적으로 샘플의 동일한 영역의 하나 이상의 이미지를 지칭하는데, 이때 하나 이상의 이미지 각각은 각각의 컬러 채널을 나타낸다. 타일은 하나의 이미지화 사이클의 이미지화 데이터 세트의 이미지화 데이터 서브세트를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "x-y 평면"이라는 용어는 직교 좌표계에서 직선 축 x 및 y에 의해 정의된 2차원 영역을 의미하는 것으로 의도된다. 검출기 및 검출기에 의해 관찰된 물체와 관련하여 사용될 때, 영역은 빔 축에 직교하는 것으로, 또는 검출기와 피검출 물체 사이의 관찰 방향으로 더 특정될 수 있다. 라인 스캐너를 지칭하는 것으로 본 명세서에서 사용될 때, "y 방향"이라는 용어는 스캐닝의 방향을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "z 좌표"라는 용어는 x-y 평면에 직교하는 축을 따라 점, 선 또는 영역의 위치를 지정하는 정보를 의미하는 것으로 의도된다. 특정 구현들에서, z축은 검출기에 의해 관찰되는 물체의 영역에 직교한다. 예를 들어, 광학 시스템에 대한 초점의 방향은 z축을 따라 지정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "라인 스캔(scan a line)"이라는 용어는 물체의 x-y 평면에서 직사각형 또는 장방형인 2차원 단면을 검출하고, 단면과 물체 사이의 상대적 이동을 야기하는 것을 의미한다. 예를 들어, 형광 이미지화의 경우, 직사각형 또는 장방형 형태를 갖는 물체의 영역은 (다른 영역들을 제외하고) 구체적으로 여기될 수 있고/있거나 그 영역으로부터의 방출은 (다른 영역들을 제외하고) 스캔의 소정의 시점에서 구체적으로 획득될 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현은 정사각형 또는 비대칭 패턴을 갖도록 구성된 플로우셀에 관한 것이다. SIM은 공간적으로 구조화된 (즉, 패턴화된) 광에 의존하여 현미경의 측면 해상도를 2배 이상 증가시키기 위해 샘플을 이미지화한다는 것을 기억하자. 또한, 통상적으로 다중 패턴 위상 및 다중 배향/각도에서의 샘플 이미지는 원하는 측면 해상도의 증가를 달성하기 위해 사용된다는 것도 기억하자.
도 1b는 일반적으로 일 예에서 현미경 목표에 의해 생성된 왕복 공간의 관찰 가능한 영역(그 회절 패턴과 유사함) 및 목표가 투과할 수 있는 최고 공간 주파수(2NA/λ(그래프 120))에 의해 가장자리에서 어떻게 제한되는지를 도시한다. 도시된 바와 같이, 중심 스팟은 0차 성분을 나타낸다. 평행 라인의 패턴을 나타내는 0차 및 1차 회절 성분은 그래프 122에 도시되어 있다. 패턴 간격이 해상도 한계에 있다면, 1차 스팟은 관찰가능 필드의 가장자리(k0 경계에서)에서 발생한다. 주파수 혼합으로 인해, 관찰가능 영역은 또한 공간 주파수의 일반 이미지(중심 원) 외에 본래의 필드의 가장자리에서 중심에 있는 2개의 새로운 오프셋 주파수 이미지(그래프 124)도 포함한다. 이런 오프셋 이미지는 종래의 현미경으로는 관찰할 수 없는 더 높은 공간 주파수를 포함한다. 그래프 126에 의해 도시된 바와 같이, 120°배향에서 3상으로부터 제조된 일련의 이미지는 궁극적으로 처리 이후 광 시야 형광성 현미경법으로 관찰될 수 있는 2배의 공간 해상도를 포함하는 실제 이미지를 생성한다.
그러나, 플로우셀이 (예를 들어, 육각형 패턴이 아닌) 정사각형 또는 비대칭 패턴을 갖도록 구성함으로써, 측면 해상도에서 동일한 증가를 달성하기 위해 더 적은 이미지가 요구된다. 즉, 정사각형 또는 비대칭 나노웰 패턴을 갖는 플로우셀은 더 타이트한 피치(즉, 인접한 나노웰 사이의 거리)를 가지며 증가된 해상도를 포함하는 플로우셀의 축/축들이 그 해상도가 증가되는 축/축들과 정렬될 수 있게 한다. 정사각형 패턴의 플로우셀의 일 예에서, 증가된 해상도는 2축에 대해서만 필요하다. 따라서, 단지 6개의 이미지(3개의 위상에 걸쳐 2개의 각도 각각의 이미지)만이 필요하다. 비대칭적으로 패턴화된 플로우셀의 경우, 증가된 해상도(3상에 걸쳐 하나의 각도의 이미지)를 달성하기 위해 샘플의 3개의 이미지만이 필요하다.
샘플을 원하는 정도로 분해하는데 필요한 각도의 수를 감소시킴으로써, 샘플의 이미지화를 완료하는데 필요한 이미지의 수가 감소된다. 예를 들어, 4-염료 화학의 맥락에서, 시스템은 베이스-콜(하기에 설명됨)을 위해 4개의 이미지를 생성하기 위해 36개의 이미지를 획득해야 할 수 있다. 또한, 캡처된 이미지를 저장하거나 캐시하는데 필요한 저장소(예컨대, 디스크) 공간의 양도 줄일 수 있다. 또한, 이미지들을 단일 이미지로 어셈블링한 다음, 그 단일 이미지를 원하는 해상도를 갖는 이미지로 재변환/복원하는데 필요한 처리 및/또는 계산 능력도 또한 감소될 수 있다.
또한, 종래의 SIM 구현은 샘플을 이미지화하는 라인 스캐닝 기술을 이용하는 시퀀싱 시스템과 호환되지 않는다. 라인 스캐닝은 (예컨대, 플로우셀과 같이 전체 물체의 정지 이미지를 캡처하는 2차원 픽셀 어레이를 갖는 카메라 또는 센서와는 달리) 라인별로 플로우셀을 이미지화하는 픽셀 라인을 사용하여 연속 이미지를 구축하는 것을 지칭할 수 있다. 시퀀싱 시스템에 적합한 하나의 특정 유형의 라인 스캐닝은 시간 지연 적분(Time Delay Integration, TDI) 라인 스캐닝이다.
다중 각도 SIM 구현에서, 각각의 각도/위상 이미지 조합을 획득하기 위해 고정된 시야가 필요하다. 그러나, 비대칭으로 패턴화된 플로우셀이 샘플 기판으로서 사용되는 본 명세서에 개시된 구현에서와 같이, 단일 각도에 대해서만 이미지가 촬영될 때, TDI 라인 스캐닝은 3개의 SIM 패턴 위상을 커버하는 샘플의 이미지를 캡처하는데 사용될 수 있다. 즉, SIM 패턴은 비대칭으로 패턴화된 플로우셀에 대해 이동되어 단지 하나의 축을 따라 증가된 해상도로 플로우셀에서 샘플을 분해하는데 필요한 3개의 위상을 생성할 수 있다.
일부 구현에서, TDI 라인 스캐닝은 ("스웨트(swath)"라고 하는) 플로우셀에 따라 이미지를 캡처하도록 TDI 라인 스캐닝 카메라 또는 센서를 사용함으로써 샘플을 이미지화하는 SIM 기술과 함께 사용될 수 있다. 즉, 제1 위상에서 SIM 패턴으로 패턴화된 플로우셀에 대해 TDI 라인 스캐닝이 수행될 수 있다. SIM 패턴은 제2 위상으로 이동될 수 있고, TDI 라인 스캐닝이 반복될 수 있다. SIM 패턴은 제3 위상으로 이동될 수 있고, TDI 라인 스캐닝을 다시 반복할 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 패턴 단계에서 샘플의 이미지가 캡처된다.
대안으로, 플로우셀의 상이한 부분은 상이한 위상의 SIM 패턴으로 패턴화될 수 있다. 예를 들어, 플로우셀의 제1 부분에서, SIM 패턴은 제1 위치에 위치될 수 있고, 플로우셀의 제2 부분에서, SIM 패턴은 제2 위치로 이동될 수 있고, 플로우셀의 제3 부분에서 SIM 패턴은 제3 위치로 이동될 수 있다. 따라서, 카메라 또는 센서가 스웨트를 캡처함에 따라, 3개의 SIM 패턴 위상 각각에 걸친 샘플의 이미지가 단일 TDI 라인 스캔으로 캡처된다.
또 다른 구현에서, 샘플/플로우셀에 대해 SIM 패턴을 이동시키는 대신에, 샘플/플로우셀은 SIM 패턴이 정지된 상태로 유지되는 동안 이동된다. 샘플이 플로우셀 내에 위치/배치되어 플로우셀을 구성하는 나노웰에 따라 샘플이 패터닝되는 것으로 이해된다. 위에서 언급한 것처럼, TDI 라인 스캐닝을 구현할 때, 샘플/플로우셀은 이미 이동하고 있다. 따라서, 샘플/플로우셀의 이러한 이동은 SIM 패턴을 이동시키지 않아도 되도록 활용될 수 있다. 즉, 고정식 SIM 패턴에 대한 샘플/플로우셀의 이동은 (적절한 배향을 고려하면) 샘플을 해결하는데 필요한 필수 위상들을 생성한다.
본 명세서에 상세히 개시된 시스템 및 방법의 다양한 구현을 설명하기 전에, 본 명세서에 개시된 기술이 구현될 수 있는 예시적인 환경을 설명하는 것이 유용하다. 이러한 예시적인 환경 중 하나는 공간적으로 구조화된 빛으로 샘플을 비추는 도 2에 도시된 구조화 조명 이미징 시스템(200)의 환경이다. 예를 들어, 시스템(200)은 생물학적 샘플을 이미지화하기 위해 공간적으로 구조화된 여기 광을 이용하는 구조적 조명 형광 현미경 시스템일 수 있다.
도 2의 예에서, 광이미터(250)는 시준 렌즈(251)에 의해 시준된 광빔을 출력하도록 구성된다. 시준된 광은 광 구조화 광학 어셈블리(255)에 의해 구조화되고(패턴화되고) 다이크로익 미러(260)에 의해 대물렌즈(242)를 거쳐 이동 스테이지(270) 상에 위치된 샘플 컨테이너(210)의 샘플에 지향된다. 형광 샘플의 경우, 샘플은 구조화된 여기 광에 응답하여 형광을 발하고, 결과적인 광이 대물렌즈(242)에 의해 수집되어 카메라 시스템(240)의 이미지 센서로 지향되어 형광을 감지한다.
이하에 추가로 설명되는 다양한 구현들에서의 광 구조화 광학 어셈블리(255)는 회절된 광의 정현파 패턴(예를 들어, 프린지)을 생성하기 위한 하나 이상의 광학 회절 격자를 포함한다. 회절 격자는 1차원 또는 2차원 투과형, 반사형 또는 위상 격자일 수 있다. 특정 구현을 참조로 하기에 더 기술된 바와 같이, 시스템(200)에서 회절격자는 회전 스테이지를 반드시 포함하지는 않는다. 일부 구현들에서, 회절격자들은 이미징 시스템의 동작 동안 고정될 수 있다(즉, 회전 또는 선형 운동을 하지 않는다). 예를 들어, 하기에 추가로 설명된 특정 구현에서, 회절격자는 서로 실질적으로 또는 정확히/완전히 직각으로 배향된 2개의 고정된 1차원 투과형 회절격자(예를 들어, 수평 회절격자 및 수직 회절격자)를 포함할 수 있다.
각각의 이미징 사이클 동안, 이미징 시스템(200)은 샘플 평면을 따라 (예를 들어, x-y 평면을 따라) 측방향으로 변위된 다양한 위상에서 복수의 이미지를 획득하기 위해 광 구조화 광학 어셈블리(255)를 이용하며, 이 절차는 광축에 대하여(즉, 샘플의 x-y 평면에 대해) 패턴 배향을 회전시킴으로써 1회 이상 반복된다. 그 후, 캡처된 이미지는 더 높은 해상도 이미지(예를 들어, 개별 이미지의 측면 공간 해상도의 약 2배를 갖는 이미지)를 생성하도록 공간적으로 재구성될 수 있다.
시스템(200)에서, 광이미터(250)는 비간섭성 광이미터일 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 여기 다이오드에 의해 출력된 광빔을 방출할 수 있거나), 하나 이상의 레이저 또는 레이저 다이오드에 의해 출력된 광의 이미터와 같은 간섭성 광이미터일 수 있다. 시스템(200)의 예에 도시된 바와 같이, 광이미터(250)는 피출력 광빔을 가이드하기 위한 광섬유(252)를 포함한다. 그러나, 광이미터(250)의 다른 구성도 사용될 수 있다. 멀티 채널 이미징 시스템(예를 들어, 다중 파장의 광을 이용하는 멀티 채널 형광 현미경)에서 구조화 조명을 이용하는 구현에서, 광섬유(252)는 복수의 상이한 광원(미도시)에 광학적으로 결합될 수 있으며, 각각의 광원은 다른 파장의 광을 방출한다. 시스템(200)이 하나의 광이미터(250)를 갖는 것으로 도시되어 있지만, 일부 구현에서 여러 광이미터들(250)이 포함될 수 있다. 예를 들어, 다수의 암을 이용하는 구조화 조명 이미징 시스템의 경우 다수의 광이미터가 포함될 수 있으며, 하기에 더 언급된다. 예를 들어, 가령 청색, 녹색, 적색 또는 다른 색상과 같이 서로 다른 파장에 대응하는 광이 방출될 수 있다. 일부 예에서, 하나의 광 이미터/소스가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 2 이상의 광 이미터/소스가 사용될 수 있다.
일부 구현들에서, 시스템(200)은 구조화된 빔 형상 및 경로를 조정하기 위해 z-축을 따라 관절식으로 되는 렌즈 소자를 포함할 수 있는 튜브 렌즈(256)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 튜브 렌즈의 구성요소는 용기(210) 내의 샘플의 샘플 두께 범위(예를 들어, 상이한 커버 유리 두께)를 설명하기 위해 관절식일 수 있다.
시스템(200)의 예에서, 유체 전달 모듈 또는 장치(290)는 시약(예를 들어, 형광 표지된 뉴클레오타이드, 버퍼, 효소, 절단 시약 등)의 유량을 샘플 용기(210) 및 폐기물 밸브(220)로(및 통해) 보낼 수 있다. 샘플 용기(210)는 샘플이 제공되는 하나 이상의 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 매우 많은 상이한 핵산 서열을 분석하기 위한 시스템의 경우, 샘플 용기(210)는 시퀀싱될 핵산이 결합, 부착 또는 관련되는 하나 이상의 기판을 포함할 수 있다. 기판은 핵산이 부착될 수 있는 임의의 불활성 기판 또는 매트릭스, 예를 들어 유리 표면, 플라스틱 표면, 라텍스, 덱스 트란, 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아미드 겔, 금 표면 및 실리콘 웨이퍼를 포함할 수 있다. 일부 응용에서, 기판은 샘플 용기(210)를 가로 질러 매트릭스 또는 어레이로 형성된 복수의 위치에서 채널 또는 다른 영역 내에 있다. 시스템(200)은 샘플 용기(210) 내의 유체의 온도 조건을 선택적으로 제어할 수 있는 온도 조절기(230) 및 가열기/냉각기(235)를 선택적으로 조절할 수 있다.
특정 구현들에서, 샘플 용기(210)는 반투명 커버 플레이트, 기판, 및 그 사이에 함유된 액체를 포함하는 패턴화된 플로우셀로서 구현될 수 있고, 생물학적 샘플은 반투명 커버 플레이트의 내부면 또는 기판의 내부면에 위치될 수 있다. 플로우셀은 기판에 정의된 어레이(예를 들어, 육각형 어레이, 직사각형 어레이 등)로 패터닝된 매우 많은 (예를 들어, 수천, 수백만 또는 수십억 또는 그 이상)의 웰 또는 영역을 포함할 수 있다. 각 영역은 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱될 수 있는 DNA, RNA 또는 다른 게놈 물질과 같은 생물학적 샘플의 클러스터(예를 들어, 모노클론 클러스터)를 형성할 수 있다. 플로우셀은 다수의 이격된 레인(예를 들어, 8개의 레인)으로 더 분할될 수 있으며, 각 레인은 육각형 클러스터 어레이를 포함한다.
샘플 용기(210)는 대물렌즈(242)에 대한 상기 샘플 용기(210)의 이동 및 정렬을 제공하기 위해 샘플 스테이지(270)에 장착될 수 있다. 샘플 스테이지는 3차원 중 어느 하나의 차원으로 이동할 수 있게 하는 하나 이상의 액추에이터를 가질 수 있다. 예를 들어, 직교 좌표계의 관점에서, 스테이지가 대물렌즈에 대해 X, Y 및 Z 방향으로 이동하도록 액추에이터가 제공될 수 있다. 이는 샘플 용기(210)상의 하나 이상의 샘플 위치가 대물렌즈(242)와 광학적으로 정렬되도록 위치될 수 있게 한다. 대물렌즈(242)에 대한 샘플 스테이지(270)의 이동은 샘플 스테이지 자체, 대물렌즈, 이미징 시스템의 일부 다른 구성요소 또는 상술한 바의 임의의 조합을 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 추가 구현은 또한 전체 이미징 시스템을 정지 샘플 위로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 대안으로, 샘플 용기(210)는 이미징 동안 고정될 수 있다.
일부 구현들에서, 초점(z-축) 구성요소(275)는 초점방향(전형적으로 z 축 또는 z 방향으로 지칭됨)에서의 샘플 용기(210)에 대한 광학적 구성요소들의 위치를 제어하도록 포함될 수 있다. 초점 구성요소(275)는 이미징 시행을 위한 적절한 포커싱을 제공하기 위해 광학 스테이지(예를 들어, 대물렌즈(242))에 대해 샘플 스테이지(270)상의 샘플 컨테이너(210)를 이동시키기 위한 광학 스테이지 또는 샘플 스테이지, 또는 둘 모두에 물리적으로 결합된 하나 이상의 액츄에이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 액츄에이터는 가령 스테이지에 직간접적으로 또는 스테이지와의 함께 기계적, 자기적, 유체적 또는 기타 부착이나 접촉과 같이 각 스테이지에 물리적으로 결합될 수 있다. 하나 이상의 액츄에이터들은 동일면에 동일 스테이지를 유지하면서 (가령, 광축에 실질적으로 또는 완전히 직각인 수위 또는 수평 높이를 유지하면서) z 방향으로 스테이지를 이동시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 제조 공차, 작동 제한 등으로 인해 일부 예 또는 구현에 따라 완벽한 직각도, 평행도 또는 다른 배향이 달성되지 않을 수 있음을 이해할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 개시된 기술의 목적상, 실질적으로 직각, 평행 또는 다른 배향이 본 명세서에 기술되고/되거나 고려되는 바와 같이 원하는 해상도 또는 다른 관련 효과를 달성하기에 충분한 배향을 의미하는 것으로 이해된다. 하나 이상의 액추에이터는 또한 스테이지를 기울이도록 구성될 수 있다. 이는 예를 들어 샘플 용기(210)가 표면의 임의의 경사를 고려하기 위해 동적으로 레벨링될 수 있도록 수행될 수 있다.
이미징되는 샘플 위치에서 테스트 샘플로부터 나오는 구조화된 광은 다이크로익 미러(260)를 통해 카메라 시스템(240)의 하나 이상의 감지기로 지향될 수 있다. 일부 구현에서, 하나 이상의 방출 필터를 갖는 필터 스위칭 어셈블리(265)가 포함될 수 있고, 상기 하나 이상의 방출 필터는 특정 방출 파장을 통과시키고 다른 파장을 차단(또는 반사)하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 방출 필터는 이미징 시스템의 상이한 채널 사이를 전환하는데 사용될 수 있다. 특정 구현에서, 방출 필터는 상이한 파장의 방출 광을 카메라 시스템(240)의 상이한 이미지 센서로 지향시키는 다이크로익 미러(dichroic mirrors)로서 구현될 수 있다.
카메라 시스템(240)은 샘플 용기(210)의 이미징(예를 들어, 시퀀싱)을 모니터링 및 추적하기 위한 하나 이상의 이미지 센서를 포함할 수 있다. 카메라 시스템(240)은 예를 들어, CCD(charge-coupled device) 이미지 센서 카메라로서 구현될 수 있으나, 다른 이미지 센서 기술(예컨대, 액티브 픽셀 센서)이 사용될 수 있다. 카메라 시스템(240)으로부터의 출력 데이터(예컨대, 이미지)는 하기에 더 기술되는 바와 같이 각각 이미징 사이클 동안 캡처된 이미지를 재구성하여 더 높은 공간 해상도를 갖는 이미지를 생성할 수 있는 소프트웨어 애플리케이션으로서 구현될 수 있는 실시간 분석 모듈(미도시)과 통신될 수 있다. 하기에 기술되는 바와 같이, 카메라 시스템(240)은 라인 스캐닝 기술을 수행하기 위해 TDI CCD 카메라로서 구현될 수 있다.
비록 도시하지는 않았으나, 시스템(200)의 다양한 광학 구성요소를 동기화하는 것을 포함하여 구조화 조명 이미징 시스템(200)의 동작을 제어하기 위해 컨트롤러가 제공될 수 있다. 컨트롤러는, 예를 들어, 광 구조화 광학 어셈블리(255)의 구성(예를 들어, 회절격자의 선택 및/또는 선형 병진이동), 튜브 렌즈(256)의 이동, 포커싱, 스테이지 이동 및 이미징 작업과 같이 시스템 작업의 태양을 제어하도록 구현될 수 있다. 다양한 구현에서, 컨트롤러는 하드웨어, 알고리즘(예를 들어, 기계 실행 가능 명령어) 또는 상술한 바의 조합을 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현들에서, 컨트롤러는 연관된 메모리를 갖는 하나 이상의 CPU 또는 프로세서를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 컨트롤러는 컴퓨터 프로세서 및 수록된 기계 판독 가능 명령어들을 갖는 비일시적 컴퓨터 판독 가능매체와 같은 동작을 제어하기 위한 하드웨어 또는 기타 회로를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 회로는 FPGA(Field Programmable Gate Array), ASIC(application specific integrated circuit), PLD(programmable logic device), CPLD(complex programable logic device), PLA(programmable logic array), PAL(programmable array logic) 또는 기타 유사한 처리 장치 또는 회로 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 컨트롤러는 이 회로와 하나 이상의 프로세서의 조합을 포함할 수 있다.
도 3a는 본 명세서에 개시된 구현에 따라 이미지화될 수 있는 패턴화된 플로우셀(300)의 예시적인 구성을 도시한다. 이 예에서, 플로우셀(300)은 이미지화 실행 동안 동시에 이미지화될 수 있는 정렬된 스팟 또는 피처(302)의 육각형 어레이(304 참조)로 패턴화된다. 설명의 편의를 위해, 플로우셀(300)은 수십 내지 수백 개의 스팟(302)을 갖는 것으로 도시되어 있다. 그러나, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 플로우셀(300)은 이미지화되는 수천, 수백만 또는 수십억 개의 스팟(302)을 가질 수 있다. 더욱이, 일부 예에서, 플로우셀(300)은 이미지화 실행 동안 샘플링되는 스팟(302)의 (실질적으로 또는 완전히 초점 방향과 수직인) 다수의 평면을 포함하는 다중-평면 샘플일 수 있다. 특정 구현에서, 플로우셀(300)은 레인으로 분할된 수백만 또는 수십억 개의 웰로 패턴화될 수 있다. 이러한 특정 구현에서, 플로우셀의 각 웰은 합성에 의한 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱되는 생물학적 물질을 함유할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 일부 예에서, 패턴화된 플로우셀(300)을 사용하여 샘플을 분해하기 위해, 필요한 해상도를 달성하기 위해 적어도 9개의 이미지가 필요하다. 이는 패턴화된 플로우셀(300)에서 나노웰의 육각형 어레이가 고주파 패턴이기 때문인데, 이때 나노웰들 사이의 피치가 타이트하고 분해될 수 없다. 특히, 이 예에서는 샘플을 충분히 분해하는데 필요한 이미지의 수를 결정할 수 있는 2가지 인자가 있다.
제1 인자는 원하는 광학 통과 대역의 사본 수이다. 다시 도 1b를 참조하면, 그래프 122는 SIM을 사용하지 않는 정상 통과 대역을 도시한다. 그래프 124는 광학 패스 대역의 하나의 사본이 생성되는 예를 도시한다. 이것은 1차원에서 해상도를 향상시킬 수 있는 반면, 그래프 126/ 그래프 306(도 3a)은 3개의 광학 통과 대역의 사본이 생성되는 예를 도시하며, 이는 2차원에서 상당히 균일한 해상도 개선을 초래한다.
제2 인자는 각각의 광학 통과 대역에 대한 위상을 복조하는데 사용되는 이미지의 수이다. 비록 이론적으로는 (실수와 허수 부분을 얻기 위해) 2개의 이미지만 필요하지만, 일반적으로 더 나은 잡음 평균을 얻기 위해 3개의 이미지가 사용된다.
공간 주파수로부터 푸리에(Fourier) 공간으로 이미지를 변환할 때 (객관적인 후방 초점면에서 현미경에 의해 생성된 미가공 데이터의 분석은 푸리에 분석에 기초한다), 푸리에 변환은 3개의 성분 또는 축을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 즉, 대물렌즈 후면 초점면에서의 광의 회절은 대물렌즈 개구 수 및 조명의 평균 파장에 따라 측면(x, y) 차원에서 약 200nm 그리고 축(z) 차원에서 500nm의 최대 해상도를 나타내는 회절 장벽을 만든다. 따라서, 패턴화된 플로우셀(300)에서 나노웰의 육각형 어레이를 사용할 때, SIM을 사용하여 3개의 각도로 이미지가 촬영된다. 또한, 앞서 논의된 바와 같이, 필요한 해상도를 얻기 위해, 이미지는 3개의 각도 각각에서 3개의 위상으로 촬영되어야 하며, 여기서 3개의 위상은 이미지화 영역의 모든 부분이 관찰됨을 (즉, SIM 패턴의 전체 파장을 커버함을) 보장하는 것이 필요하며, 이로써 9개의 이미지를 생성한다. 이는 3개의 축(308) 모두에서 해상도를 증가시킨다.
그러나, 일 예에서, 나노웰(312)이 정사각형 어레이로 패턴화되는(314 참조), 플로우셀(310)과 같은 또 다른 유형의 패턴화된 플로우셀을 사용하면, 정사각형 어레이의 축들을 따라 정렬되는 증가한 해상도를 달성하는데 단지 2개의 이미지만이 필요하다. 그래프 316은 이것의 예를 도시하는데, 여기서 광학 통과 대역의 2개의 사본만이 생성되고 필요한 해상도 증가를 달성하는데 필요하다. 다시 말해, 플로우셀(310)과 같은 정사각형 패턴화된 플로우셀은 SIM 패턴 또는 프린지를 해상도의 증가가 요구되는 방향, 이 경우에 정사각형 어레이의 2개의 축(x 및 y)을 따라 정렬함으로써 분해될 수 있다. 이웃하는 나노웰들(312) 사이의 임의의 대각선 경로를 따라, 대각선으로 이웃하는 나노웰들이 서로 분해될 수 있도록 약간의 해상도 향상이 있을 것임을 이해할 수 있다. 그러나, x 및 y 축을 따라 나노웰들(312) 사이에서, 피치(Px, Py)는 SIM을 사용하여 해상도를 증가해야 할 정도로 충분히 좁다. 즉, x 및 y 축의 공간 주파수가 너무 높아서 분해될 수 없다.
가령 플로우셀(310)과 같은 정사각형 패턴화된 플로우셀을 사용함으로써, SIM을 사용하는 종래의 시퀀싱 시스템의 치수 요건(dimensionality requirement)은 하나의 치수만큼 감소될 수 있으며, 여기서 2개의 축(318)에서만 해상도가 증가된다. 3개의 위상 각각에 걸쳐 3개의 각도를 커버하는 9개의 이미지를 캡처하는 대신, 3개의 위상 각각에 걸쳐 2개의 각도를 커버하는 6개의 이미지만이 플로우셀(310) 내에 포함된 샘플을 적절하게 분해하기 위해 캡처될 필요가 있다. 이는 플로우셀(310)의 패킹 밀도(packing density)의 감소에도 불구하고 이점적이다. 예컨대, 패킹 밀도의 감소는 동일한 피치를 갖는 육각형 어레이에 비해 단지 11%일 수 있다. 그러나, 다양한 예에 따라 SIM을 구현하면 700nm 피치를 갖는 비-SIM 육각형 어레이에 비해 350nm 피치를 갖는 정사각형 패턴화된 어레이에 대해 예를 들어 356%의 패킹 밀도 증가가 발생할 수 있다.
또 다른 유형의 패턴화된 플로우셀, 이 예에서는 비대칭으로 패턴화된 플로우셀을 사용함으로써, SIM을 사용하는 종래의 시퀀싱 시스템의 치수 요건은 하나 이상의 치수만큼 감소될 수 있다. 도 3c는 나노웰이 비대칭으로 패턴화되는 패턴화된 플로우셀(320)을 도시한다. 이 구현에서, 각각의 나노웰(322)은 세장형 구조를 형성하도록 형상화되거나 구성된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 세장형 구조라는 용어는 제1 축을 따른 치수가 제2 축을 따른 치수보다 큰 형상을 지칭한다. 이 예에서, x축은 다른 축(이 예에서는 y축)을 따른 나노웰(322)의 길이 또는 높이보다 더 좁다. 비록 도 3c에 도시된 구현이 타원형 나노웰을 사용하지만, 다른 유형의 세장형 나노웰, 예를 들어 직사각형이 사용될 수 있다고 이해해야 한다. 하나의 축만을 따라 샘플이 SIM을 사용하여 분해능 증가와 관련되는 패턴을 생성하는 임의의 형태의 나노웰이 사용될 수 있다. 일부 구현들에서, 프린지의 폭(w)이 적어도 실질적으로 동일하거나 약간 더 큰 패턴화된 피처들의 치수는 원형 피처의 직경, 정사각형 피처의 측면의 길이, 직사각형 피처의 더 긴 측면 또는 더 짧은 측면의 길이, 장축 또는 단축에 따른 타원형 피처의 직경 또는 피처의 한 축(예컨대, x축 또는 y축)에 따른 불규칙 형상의 피처의 가장 긴 치수일 수 있다. 일부 구현에서, 나노웰은 대안으로 정사각형 또는 원형으로 형성될 수 있지만, 그 사이에는 비대칭 간격이 있다.
이러한 방식으로, 샘플은 한 방향 또는 축, 즉 y축을 따라 분해될 수 있는 한편, 다른 방향 또는 축, 즉 x축을 따라 SIM은 샘플을 분해하기 위해 해상도를 높이는데 사용된다. 즉, x축을 따라, 비대칭 패턴화된 플로우셀(320)의 피치(Px)는 좁거나 타이트해서 해상도의 증가를 수반하는 한편, y축을 따라, 비대칭 패턴화된 플로우(320)의 피치(Py)는 더 크다. 따라서, 단지 하나의 방향/하나의 축(318)을 따라 해상도가 증가되고, 플로우셀(320)의 나노웰 내에 포함된 샘플을 적절하게 분해하기 위해 3개의 이미지만이 캡처된다. 따라서, 그래프 352에 의해 도시된 바와 같이, 광학 통과 대역의 하나의 사본만이 생성되고 해상도를 높이는데 필요하다.
도 4는 정사각형 또는 비대칭 패턴화된 플로우셀을 사용하여 샘플을 시퀀싱하는 도 2의 구조화 조명 이미징 시스템(200)과 같은 시퀀싱 시스템에서 수행될 수 있는 예시적인 동작을 도시하는 흐름도이다. 동작 400에서, 제1 위상으로 배향된 제1 광학 회절 격자 패턴에 대응하는 광원이 켜질 수 있다. 동작 410에서, 제1 배향의 광학 회절 격자 패턴이 샘플 상에 투영되고 이미지가 캡처된다. 즉, 다시 도 2를 참조하면, 광 이미터(250)는 시준 렌즈(251)에 의해 시준된 광 빔을 출력할 수 있다. 시준된 광은 광 구조화 광학 어셈블리(255)에 의해 구조화되고(패턴화되고) 대물렌즈(242)를 통해 샘플 용기(210)의 샘플 상으로 다이크로익 미러(260)에 의해 지향되는데, 이는 스테이지(270)에 위치한다. 이 구현에서, 샘플 용기(210)는 각각 플로우셀(310 또는 320)과 같은 정사각형 또는 비대칭 패턴을 갖는 패턴화된 플로우셀을 포함한다(도 3b 및 3c). 형광 샘플의 경우, 정사각형 또는 비대칭으로 패턴화된 플로우셀에 포함된 샘플은 구조화된 여기 광에 응답하여 형광되고, 그 결과로 인한 광은 대물렌즈(242)에 의해 수집되고 형광을 검출하기 위해 카메라 시스템(240)의 이미지 센서로 향한다.
동작 420에서, 추가적인 위상 변이가 필요한지 여부를 결정하기 위한 검사가 수행될 수 있다. 그렇다면, 동작 430에서, 광학 회절 격자는 위상 변이되고, 동작은 동작 410으로 되돌아가는데, 이때 광학 회절 격자 패턴(위상 변이됨)이 샘플 상에 투영되고, 이미지가 캡처된다. 전술한 바와 같이, 3개의 위상 변이는 일반적으로 전체 이미징 영역, 이 구현에서는 정사각형 패턴화된 플로우셀의 전체 영역을 캡처하도록 수행된다.
추가적인 위상 변이가 필요하지 않으면, 단계 440에서, 추가의 각도가 필요한지 여부를 결정하기 위한 검사가 수행될 수 있고, 단계 450에서 광학 회절 격자의 각도가 변경된다. 동작은 동작 410으로 되돌아가는데, 이때 광학 회절 격자 패턴(각도 변경 후)은 샘플 상에 투영되고 이미지가 캡처된다. 동작은 동작 420으로 진행하고, 이때 420에서 추가적인 위상 변이가 필요한 경우, 광학 회절 격자는 동작 430에서 위상 변이된다. 다시, 동작은 동작 410으로 되돌아가는데, 이때 광학 회절 격자 패턴은 (새로운 각도 및 새로운 위상에서) 샘플로 투영되고 이미지가 캡처된다. 다시, 이 구현에서, 정사각형 패턴화된 플로우셀의 전체 영역을 캡처하기 위해 3개의 위상에 걸친 이미지가 필요하다. 구조화 조명 이미징 시스템(200)의 시스템 동작의 양태를 제어하는데 사용되는 상술된 컨트롤러가 전술한 기능을 수행하기위한 명령, 예를 들어 광학 회절 격자 패턴의 추가적인 위상 변이 또는 배향이 사용되는 특정 유형의 플로우셀을 이미지화하는데 필요한지를 검사하는 명령으로 구성될 수 있음을 이해해야 한다.
정사각형 패턴화된 플로우셀, 예를 들어 플로우셀(310)(도 3)의 경우, 플로우셀(310)의 두 축을 따라 해상도를 증가시키기 위해 2개의 각도에서의 이미지가 필요하다. 따라서, (광학 회절 격자 패턴의 3개의 위상 변이에 걸쳐) 2개의 각도에 대응하는 2개의 배향으로 투영되는 광학 회절 격자 패턴으로 이미지를 캡처한 후, 고해상도 이미지가 (6개의 총 이미지를 조합하고 실제 공간으로 재변환함으로써) 동작 460에서 재구성된다. 이런 고해상도 이미지 재구성은 시스템 내에서 수행될 수 있거나, 일부 예에서, 재구성은 별도의 처리 엔티티를 사용하여 수행될 수 있다.
패턴화된 플로우셀이 비대칭 플로우셀인 구현에서, 전술한 방법은 각도 변경을 포함할 필요가 없다. 다시, 비대칭 플로우셀에서 SIM은 단지 하나의 축을 따라 해상도를 높이는데 사용된다. 따라서, 광학 회절 격자는 3번만 위상 변이될 필요가 있어, 3 위상 변이를 위해 이미지가 캡처될 수 있도록 한다. 따라서, 동작 420에서 다른 위상 변이가 필요하지 않으면, 방법은 동작 460으로 진행하는데, 이때 3개의 캡처된 이미지만을 사용하여 고해상도 이미지를 재구성할 수 있다.
전술한 바와 같이, 감소된 차수 SIM 구현을 이용할 수 있는 패턴화된 플로우셀을 사용할 때, TDI 라인 스캐닝과 같은 라인 스캐닝 기술이 이런 패턴화된 플로우셀에 포함된 샘플을 이미지화하는데 사용될 수 있다. 도 5는 다양한 구현들에서 샘플을 이미징하는데 사용될 수 있는 예시적인 2-채널 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)을 도시하는 블록도이다.
도 2의 구조화 조명 이미징 시스템(200)의 경우에서와 같이, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 핵산의 시퀀싱을 위해 사용될 수 있으며, 이런 핵산은 어레이의 고정된 위치(즉, 플로우셀(320)과 같은 플로우셀의 웰)에 부착되고 어레이는 반복하여 이미지화될 수 있다. 이러한 구현에서, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 2개의 상이한 컬러 채널에서 이미지를 얻을 수 있으며, 이는 특정 뉴클레오티드 염기 유형을 다른 것과 구별하기 위해 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 일반적으로 이미징 사이클에서 이미지의 소정의 스팟 위치를 위해 염기 호출(예를 들어, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 티민(T))을 결정하는 프로세스를 지칭하는 "염기 호출(base calling)"이라고 하는 프로세스를 구현할 수 있다. 2-채널 염기 호출 동안, 2개의 이미지로부터 추출된 이미지 데이터는 2개의 이미지의 강도의 조합으로서 염기 아이덴티티를 인코딩함으로써 4개의 기본 염기 유형 중 하나의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 두 이미지 각각의 소정의 스팟 또는 위치에 대해, 염기 아이덴티티는 신호 아이템티티의 조합이 [온, 온], [온, 오프], [오프, 온] 또는 [오프, 오프]인지에 기초하여 결정될 수 있다.
라인 스캐닝 이미징 시스템(500)을 다시 참조하면, 시스템은 그 안에 배치된 2개의 광원(511 및 512)을 갖는 라인 생성 모듈 LGC(510)를 포함한다. 광원(511 및 512)은 레이저 빔을 출력하는 레이저 다이오드와 같은 코히어런트(coherent) 광원일 수 있다. 광원(511)은 제1 파장(예를 들어, 적색 파장)에서 광을 방출할 수 있고, 광원(512)은 제2 파장(예를 들어, 녹색 파장)에서 광을 방출할 수 있다. 레이저 소스들(511 및 512)로부터 출력된 광 빔들은 빔 성형 렌즈 또는 렌즈들(513)을 통해 지향될 수 있다. 일부 구현에서, 단일 광 성형 렌즈는 2개의 광원들로부터 출력된 광 빔들을 성형하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현들에서, 별개의 빔 성형 렌즈가 각각의 광 빔에 대해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 빔 성형 렌즈는 파웰 렌즈(Powell lens)이고, 그에 따라 광 빔은 라인 패턴으로 형성된다. LGC(510) 또는 다른 광학 부품 이미징 시스템의 빔 성형 렌즈는 광원(511 및 512)에 의해 라인 패턴으로 방출된 광을 (예를 들어, 하나 이상의 파웰 렌즈 또는 다른 빔 성형 렌즈, 회절 또는 산란 부품들을 사용하여) 성형하도록 구성된다. 예를 들어, 일부 구현에서, 광원(511 및 512)에 의해 방출된 광은 광학 회절 격자를 통해 전송되어 샘플 상에 투영될 수 있는 광학 회절 격자 패턴(SIM 패턴)을 생성할 수 있다.
LGC(510)는 단일 인터페이스 포트를 통해 광 빔을 방출 광학 모듈(EOM)(530)로 지향시키도록 구성된 미러(514) 및 반-반사 미러(515)를 더 포함할 수 있다. 광 빔은 셔터 요소(516)를 통과할 수 있다. EOM(530)은 대물렌즈(535) 및 타겟(550)과 길이방향으로 더 가깝게 또는 타겟에서 더 멀리 대물렌즈(535)을 이동시키는 z-스테이지(536)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 타겟(예를 들어, 패턴화된 플로우셀)(550)은 액체 층(552) 및 반투명 커버 플레이트(551)를 포함할 수 있고, 생물학적 샘플은 반투명 커버 플레이트의 내부면뿐만 아니라 액체 층 아래에 위치한 기판 층의 내부면에 위치될 수 있다. 이후, z-스테이지는 (예컨대, 생물학적 샘플에 집속되는) 플로우셀의 내부면 중 하나에 광 빔을 집속시키도록 대물렌즈를 이동시킬 수 있다. 생물학적 샘플은 당업계에 공지된 바와 같이 광학 시퀀싱에 반응하는 DNA, RNA, 단백질 또는 다른 생물학적 물질일 수 있다.
EOM(530)은 초점 추적 모듈(FTM)(540)로부터 방출된 초점 추적 광 빔을 타겟(550)으로 반사한 다음, 타겟(550)으로부터 되돌아온 광을 FTM(540)으로 다시 반사시키기 위해 반-반사 미러(533)를 포함할 수 있다. FTM(540)은 반환된 초점 추적 광 빔의 특성을 검출하고 타겟(550) 상의 대물렌즈(535)의 초점을 최적화하기 위한 피드백 신호를 생성하는 초점 추적 광학 센서를 포함할 수 있다.
또한, EOM(530)은 타겟(550)으로부터 복귀된 광이 통과되게 하면서 대물렌즈(535)를 통해 광을 지향시키는 반-반사 미러(534)를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, EOM(530)은 튜브 렌즈(532)를 포함할 수 있다. 튜브 렌즈(532)를 통해 투과된 광은 필터 요소(531)를 통과하여 카메라 어셈블리(520)로 들어갈 수 있다. 카메라 어셈블리(520)는 입사 광 빔에 응답하여 생물학적 샘플로부터 방출된 광(예컨대, 광원(511 및 512)으로부터 수신된 적색 및 녹색 광에 응답한 형광)을 검출하는 하나 이상의 광학 센서(521), 예를 들어 TDI 라인 스캐닝 센서를 포함할 수 있다. 일 예에서, (상술한 바와 같은) LGC는 선형 프린지 패턴을 생성하도록 회절 격자를 통해 광을 투영할 수 있다.
카메라 어셈블리(520)의 센서로부터의 출력 데이터는 실시간 분석 회로(525)와 통신될 수 있다. 실시간 분석 회로(525)는 다양한 구현에서 이미지 데이터(예를 들어, 이미지 품질 스코어링, 염기 호출 등)를 분석하고, 빔의 특성(예를 들어, 초점, 형상, 강도, 전력, 밝기, 위치)을 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 등에 보고 또는 디스플레이하는 컴퓨터 판독가능 명령어를 실행한다. 이러한 동작은 다운스트림 분석 시간을 최소화하고 이미지 실행 동안 실시간 피드백 및 문제해결을 제공하도록 이미징 사이클 동안 실시간으로 수행될 수 있다. 구현들에서, 실시간 분석 회로(525)는 이미징 시스템(500)과 통신 가능하게 연결되고 제어되는 컴퓨팅 장치(예를 들어, 컴퓨팅 장치(1100))일 수 있다. 하기에 더 설명되는 구현들에서, 실시간 분석 회로(525)는 카메라 어셈블리(520)로부터 수신된 출력 이미지 데이터의 왜곡을 정정하기 위한 컴퓨터 판독가능 명령어를 추가로 실행할 수 있다.
도 6a-6c는 비대칭으로 패턴화된 플로우셀의 TDI 라인 스캐닝의 예시적인 표현을 나타내는데, 여기서 SIM은 플로우셀의 한 축을 따라 해상도를 증가시키기 위해 사용된다. 특히, 도 6a는 SIM 패턴(630)이 중첩되는 (비대칭으로 패턴화된 플로우셀(320)의 구현(도 3c)일 수 있는) 비대칭으로 패턴화된 플로우셀(620)을 도시한다. 비대칭으로 패턴화된 플로우셀(620)의 이미지를 행마다 캡처하기 위해 y축을 따라 TDI 라인 스캐닝이 수행될 수 있다. 도 6a에서 캡처된 이미지는 제1 위상에서 SIM 패턴(630)으로 캡처된다.
예로서, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 시스템의 광학계와 협력하여 LGC(510)를 사용하여 적색 스펙트럼 내 파장을 갖는 광으로 (SIM 패턴, 즉 광학 회절 격자 패턴으로 중첩되는) 샘플을 라인 스캐닝하고 녹색 스펙트럼 내 파장을 갖는 광으로 샘플을 라인 스캐닝할 수 있다. 라인 스캐닝에 응답하여, 샘플의 상이한 스팟에 위치된 형광 염료가 형광을 낼 수 있고, 그 결과로 인한 광은 대물렌즈 (535)에 의해 수집되고 형광을 검출하기 위해 카메라 어셈블리(520)의 이미지 센서로 향할 수 있다. 예를 들어, 각각의 스팟의 형광은 카메라 어셈블리(520)의 몇몇 픽셀에 의해 검출될 수 있다. 카메라 어셈블리(520)로부터 출력된 이미지 데이터는 예를 들어 이미지를 결합하여 스웨트(swath)를 형성하는 것과 같은 처리를 위해 실시간 분석 회로(525)에 전달될 수 있다.
도 6b는 SIM 패턴(630)과 중첩된 비대칭으로 패턴화된 플로우셀(620)을 도시한다. 도 6b에서, SIM 패턴(630)은 (샘플을 분해하기 위해 해상도 증가를 필요로 하는 축과 정렬하여) x축을 따라 위상 변이되었다. 전술한 바와 같이, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 (위상 변이된 SIM 패턴(630)과 중첩되는) 샘플을 라인 스캐닝하기 위해 시스템의 광학계와 협력하여 LGC(510)를 사용할 수 있다. 이미지는 카메라 어셈블리(520)로부터 캡처 및 출력될 수 있고 처리를 위해 실시간 분석 회로(525)로 다시 전달될 수 있다.
도 6c는 SIM 패턴(630)과 중첩되는 비대칭으로 패턴화된 플로우셀(620)을 도시한다. 도 6c에서, SIM 패턴(630)은 (샘플을 분해하도록 해상도 증가를 필요로 하는 축과 정렬하여) x축을 따라 제3 위상으로 위상 변이되었다. 다시, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 (위상 변이된 SIM 패턴(630)과 중첩되는) 샘플을 라인 스캐닝하기 위해 시스템의 광학계와 협력하여 LGC(510)를 사용할 수 있다. 이미지는 카메라 어셈블리(520)로부터 캡처 및 출력될 수 있고 처리를 위해 실시간 분석 회로(525)로 다시 전달될 수 있다. 각각의 위상/위상 변이에 따라 캡처된 이미지는 실시간 분석 회로(525)에 의해 단일 이미지로 결합되고 실제 공간으로 재변환되어이 예에서는 x축을 따라 더 높은 해상도를 갖는 이미지를 생성할 수 있다.
또 다른 구현에서, 도 6d에 도시된 바와 같이, 플로우셀(620)의 상이한 부분은 상이한 위상에서 SIM 패턴(630)으로 중첩될 수 있다. 즉, 제1 위상(630A)에서의 SIM 패턴은 플로우셀(620)의 하부를 따라 중첩되고, 제2 위상(630B)에서의 동일한 SIM 패턴은 플로우셀(620)의 중간부를 따라 중첩되며, 다시 제3 위상(630C)에서의 동일한 SIM 패턴은 플로우셀(620)의 상부를 따라 중첩된다. 따라서, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)이 SIM 패턴의 각각의 필요한 위상에 따라 단일의 실행에 전체 플로우를 이미지화할 수 있도록 SIM 패턴(630A-630B)의 상이한 위상으로 중첩되는 플로우셀(620)을 라인 스캔한다. 일부 구현에서, 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)은 예컨대 3개의 같이 다수의 LGC 및 다수의 카메라 또는 센서/카메라 어셈블리를 갖도록 수정될 수 있는데, 각각이 SIM 패턴의 3개의 위상을 생성하도록 (동일하지만 상이한 위상으로 배향되는) 3개의 광학 회절 격자를 통해 광을 생성하고 출력한다. 이러한 방식으로, 각각의 카메라 또는 센서/카메라 어셈블리는 상이한 SIM 패턴 위상과 함께 플로우셀(620)의 이미지를 동시에 캡처할 수 있다.
전술한 바와 같이, 또 다른 구현에서, 샘플/플로우셀은 SIM 패턴이 정지 상태로 유지되는 동안 이동될 수 있다. TDI 라인 스캐닝을 구현할 때, 샘플/플로우셀은 이미 이동 중이다. 따라서, 샘플/플로우셀의 이러한 이동은 SIM 패턴을 이동하지 않아도 되도록 활용될 수 있다. 즉, 고정 SIM 패턴에 대한 샘플/플로우셀의 이동은 샘플을 분해하는데 필요한 필수 위상을 생성한다.
도 7은 육각형 어레이 패턴화된 플로우셀(300)(도 3a)과 유사한 다른 예시적인 패턴화된 플로우셀(720)을 도시한다. 종래의 구조화 조명 이미징 시스템에서, 플로우셀(720)은 예를 들어 y축 방향으로 라인 스캔될 수 있다. 플로우셀(720) 내의 샘플로 LGC(예를 들어, LGC 510(도 5))에 의해 출력되는 광 빔의 강도는 x축(도시되지 않았지만, 라인 스캐닝 방향에 실질적으로 또는 정확히 수직임)을 따라 넓고 균일한 것으로 도시된다. 그러나 y축을 따라 광 빔의 강도는 좁다. 레이저 빔이 플로우셀(720)에 대해 이동함에 따라, 형광 이미지는 라인 스캐닝 카메라 또는 센서, 예를 들어 광 빔에 의해 조명되는 대응 영역의 카메라 어셈블리(520)(도 5)에 의해 캡처된다.
그러나, 샘플/플로우셀(720)이 이미 이동하고 있고, 비대칭으로 패턴화된 플로우셀, 예컨대 플로우셀(320)(도 3C)에서 샘플을 분해하는데 1차원 SIM만이 필요하기 때문이라는 사실을 이용하면, SIM 패턴을 생성하는 광학 회절 격자는 여전히 유지될 수 있다. 즉, 필요한 여러 위상(예컨대, 3개)이 샘플을 적절하게 분해하는 데 필요했다. 따라서, 종래의 라인 스캐닝 이미징 시스템에서 광학 회절 격자를 회전시키거나 병진시키는 것과 같이 이동하기 위해 필요한 이동 스테이지 또는 다른 요소들이 이러한 구현에서 필요하지 않다.
도 8은 고정식 광학 회절 격자를 사용하는 예시적인 라인 스캐닝 이미징 시스템(800)을 도시한다. 설명의 편의를 위해, 도 8은 모든 특징/요소가 도시되지 않은 단순화된 도면이다. 그러나, 라인 스캐닝 시스템(800)은 결과적인 광학 회절 격자 패턴/SIM 패턴을 여전히 유지하기 위해 고정식 광학 회절 격자를 사용하는 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)의 일 구현일 수 있다.
도 8의 예에서, 예를 들어 레이저(802)와 같은 광 이미터는 시준 렌즈(804)에 의해 시준된 광 빔을 출력하도록 구성된다. 일 구현에서, 레이저(802)는 녹색 파장의 광을 방출한다. 시준된 광은 고정식 광학 회절 격자(812)를 통한 이색성 필터(806)에 의해 샘플 용기(832)의 샘플 상으로 다른 이색성 필터(828)를 통한 대물렌즈(830)로 지향된다. 이 구현에서, 샘플 용기(830)는 비대칭으로 패턴화된 플로우셀, 예컨대 플로우셀(320)(도 3c)이다.
제2 광 이미터, 예를 들어 레이저(808)는 또한 이색 필터(828)를 통해 샘플 용기(832)의 샘플로 고정식 광학 회절 격자(812)를 통해 대물렌즈(830)로 (예컨대, 적색 파장의) 광을 방출한다. 샘플 용기(832)는 레이저들(802 및 808)로부터의 광 빔에 대해 샘플 용기(832)를 이동시킬 수 있는 스테이지(840) 상에 위치된다. 형광 샘플의 경우, 샘플은 구조화 여기 광(레이저들(802 및 808)로부터의 레이저 빔)에 응답하여 형광을 발하며, 그 결과로 인한 광은 대물렌즈(828)에 의해 수집되고 카메라들(814 및 820)의 이미지 센서로 향한다.
이색성 필터(806)는 레이저(802)로부터의 녹색 광선을 통과하여 고정식 광학 회절 격자(812)를 통과하는데 사용되는 한편, 레이저(808)로부터의 적색 광선을 고정식 광학 회절 격자(812)를 향해 반사시킨다. 이색성 필터(828)는 레이저(802 및 808)로부터의 적색 및 녹색 광 빔이 대물렌즈(830)에 반사될 수 있게 하는 한편, 카메라(814 및 820)는 녹색 및 적색 광으로 형광 처리된 이미지를 각각 캡처할 수 있게 한다는 점에서 유사하게 기능한다. 이색성 필터(816)는 형광 샘플로부터 카메라(814)로 녹색 광 방출을 지향시키는 한편, 이색성 필터(822)는 형광 샘플에서 카메라(820)로 적색 광 방출을 지향시킨다. 렌즈들(818 및 824)은 각각 카메라들(814 및 820)을 위한 시준 렌즈이다. 다이크로익 미러(826)는 형광 샘플로부터 녹색 및 적색 광 방출을 적절한 카메라로 향하게 한다.
라인 스캐닝 시스템(800)에서, 광학 회절 격자(812)는 정지되어 있다. 즉, 전술한 바와 같이, SIM과 함께 비대칭으로 패턴화된 플로우셀을 사용함으로써, 1차원의 구조화 조명만 필요하며, 플로우셀을 따라 빔을 이동시킴으로써 다중 위상이 달성될 수 있다. 다시 말해, 샘플/플로우셀에 대한 레이저 빔의 이동 또는 레이저 빔에 대한 샘플/플로우셀의 이동으로 인해 샘플과 프린지 여기 패턴 사이의 상대적 이동이 다른 위상을 생성하는데 필요한 전부이다.
도 9는 라인 스캐닝 시스템(800)과 같은 라인 스캐닝 이미징 시스템으로 라인 스캐닝될 수 있는 패턴화된 플로우셀(920)을 도시한다. 광학 회절 격자 패턴은 플로우셀(920) 상에 투영될 수 있는 한편, 플로우셀(920)은 라인 스캐닝 이미징 기술에 따라 이동한다. 고정식 광학 회절 격자 패턴에 대한 플로우셀(920)의 이동은 필요한 위상 변이를 생성하고 라인 스캐닝 동안 캡처된 이미지는 일단 실제 공간으로 결합 및 재변환되면 앞서 논의된 바와 같이 해상도를 증가시킨다.
특히, 광 빔은 y축 방향으로 이동한다. 다시, 광 빔의 강도는 x축(미도시)을 따라 균일하지만, y축에 따른 강도는 고정식 광학 회절 격자, 예컨대 고정식 광학 회절 격자(812)(도 8)를 통한 통과로 인해 변조된다. 광 빔이 플로우셀(920)에 대해 이동함에 따라, 광학 회절 격자 패턴이 이동한다. 실제로, 3개 이상 또는 심지어 수십 개의 위상 변이가 생성될 수 있다. 그 결과, 광학 회절 격자 대신에 샘플/플로우셀(920)을 이동시킴으로써, 라인 스캐닝의 축에 따른 해상도의 증가가 달성될 수 있다. 일부 구현에서, 전술한 바와 같이, 이 방향에서의 해상도는 임의의 특징들 또는 주기적인 패턴들 둘 중 하나를 갖는 표면들에서 적어도 2배 증가될 수 있다. 해상도는 예를 들어 적어도 2배 증가될 수 있기 때문에 플로우셀(920) 내의 나노웰의 밀도는 2배 이상 증가될 수 있음을 이해해야 한다.
도 10은 비대칭으로 패턴화된 플로우셀을 사용하여 샘플을 시퀀싱하기 위해 라인 스캐닝 이미징 시스템(500)(도 5) 또는 라인 스캐닝 이미징 시스템(800)(도 8)과 같은 라인 스캐닝 이미징 시스템에서 수행될 수 있는 예시적인 동작을 도시하는 흐름도이다. 동작 1000에서, 레이저 소스들, 예를 들어 레이저 소스들(802 및 808)로부터의 광 빔들은 고정식 광학 회절 격자, 예를 들어 고정식 광학 회절 격자(812)를 통해 출력되며, 배향이 턴온될 수 있는 제1 광학 회절 격자 패턴에 대응할 수 있다. 동작 1010에서, 광학 회절 격자 패턴이 샘플 상에 투영되고, 동작 1020에서 샘플이 라인 스캔된다. 라인 스캐닝은 라인 스캐닝 이미징 시스템(800)(도 8)과 관련하여 전술한 바와 같이 수행될 수 있다. 동작 1030에서, 샘플은 전술한 라인 스캐닝 기술에 따라 이동되거나, 지향된 광은 샘플과 광학 회절 격자 패턴 사이의 상대적 운동을 달성하기 위해 전술한 바와 같이 이동될 수 있다.
단계 1020 및 1030은 전체 샘플을 나타내는 이미지를 캡처하기 위해 필요한 만큼 반복될 수 있다. 다시, 샘플이 고정식 광학 회절 격자 패턴에 대해 이동한 결과, 샘플 및 광학 회절 격자 패턴의 이미지는 해상도를 증가시키는데 필요한 필수 위상 변이를 가로질러 캡처될 수 있다. 단계 1040에서, 고해상도 이미지가 재구성될 수 있다.
라인 스캐닝 동안 광학 회절 격자 패턴과 샘플 사이의 모션 블러(motion blur)를 방지하기 위해, 레이저 소스는 펄스 방식으로 동작할 수 있음에 유의해야 한다. 즉, 레이저 소스, 예를 들어 레이저 소스(802 및 808)는 모든 여기 상태에서 라인 스캐닝 이미지가 캡처될 수 있도록 펄스화될 수 있다. 일부 구현들에서, 샘플/플로우셀에 대한 광학 회절 격자 패턴의 배향은 90°만큼 변이될 수 있다. 다른 구현에서, 도 6a 내지 도 6c에 도시된 바와 같이, 광학 회절 격자 패턴의 배향이 샘플이 밝고 어두운 영역을 통해 이동하지 않는 경우 (광학 회절 격자 패턴의 배향이 90°만큼 변이되는 경우와 같이) 광학 회절 격자 패턴에 대한 샘플의 움직임이 동일한 프린지 강도를 통해 이동하기 때문에 레이저 소스의 펄스화가 필요하지 않을 수 있다.
도 11은 시스템들(200, 500 및/또는 800)에서 구현되고 본 명세서에 기술되는 도 4 및 도 10에 도시된 방법들의 하나 이상의 태양들의 전술한 특징 및 기능과 같이 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법의 다양한 특징을 구현하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨팅 컴포넌트를 도시한다. 예를 들어, 컴퓨팅 컴포넌트는 실시간 분석 회로(525)로서 구현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 회로라는 용어는 본 출원의 하나 이상의 구현에 따라 수행될 수 있는 주어진 기능 단위를 기술할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 회로는 임의의 형태의 하드웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 프로세서, 컨트롤러, ASICs, PLAs, PALs, CPLDs, FPGAs, 논리 컴포넌트, 소프트웨어 루틴 또는 기타 메커니즘이 회로를 구성하도록 구현될 수 있다. 구현에서, 본 명세서에 기술된 다양한 회로는 개별 회로로서 구현될 수 있거나, 기술된 기능 및 특징은 하나 이상의 회로 사이에서 부분적으로 또는 전체적으로 공유될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서를 읽은 후 당업자는 본 명세서에 기술된 다양한 특징 및 기능은 임의의 주어진 애플리케이션에서 구현될 수 있고, 하나 이상의 개별 또는 공유 회로에서 다양한 조합 및 순열로 구현될 수 있다고 이해할 수 있다. 기능의 다양한 특징 또는 요소가 개별 모듈로서 개별적으로 설명되거나 청구될 수 있지만, 당업자는 이들 특징 및 기능이 하나 이상의 공통 소프트웨어 및 하드웨어 요소 간에 공유될 수 있다는 것을 이해할 것이며, 그러한 설명은 이러한 특징 또는 기능을 구현하기 위해 별도의 하드웨어 또는 소프트웨어 구성요소가 사용됨을 요구하거나 암시하는 것은 아니다.
애플리케이션의 컴포넌트들 또는 회로들이 소프트웨어를 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 구현되는 경우, 일 구현에서, 이들 소프트웨어 요소들은 이와 관련하여 설명된 기능을 수행할 수 있는 컴퓨팅 또는 프로세싱 모듈로 동작하도록 구현될 수 있다. 하나의 이러한 예시적인 컴퓨팅 컴포넌트는 도 13에 도시되어 있다. 이런 예시적인 컴퓨팅 컴포넌트(1000)의 관점에서 다양한 구현이 설명된다. 이 설명을 읽은 후, 다른 컴퓨팅 모듈 또는 아키텍처를 사용하여 애플리케이션을 구현하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
이제 도 13을 참조하면, 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 예를 들어 데스크탑, 랩톱, 노트북 및 태블릿 컴퓨터 내에서 발견된 컴퓨팅 또는 프로세싱 능력; 핸드-헬드 컴퓨팅 장치(태블릿, PDA, 스마트폰, 휴대폰, 팜탑 등); 메인 프레임, 슈퍼 컴퓨터, 워크스테이션 또는 서버; 또는 소정의 애플리케이션 또는 환경에 바람직하거나 적절한 임의의 다른 유형의 특수 목적 또는 범용 컴퓨팅 장치를 나타낼 수 있다. 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 또한 소정의 디바이스 내에 내장되거나 다른 방식으로 이용가능한 컴퓨팅 능력을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 컴퓨팅 컴포넌트는 예컨대 디지털 카메라, 내비게이션 시스템, 셀룰러 전화기, 휴대용 컴퓨팅 장치, 모뎀, 라우터, WAP, 단말기 및 어떤 형태의 처리를 포함할 수 있는 다른 전자 장치와 같은 다른 전자 장치들에서 발견될 수 있다.
컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 예를 들어 하나 이상의 프로세서, 컨트롤러, 컨트롤 모듈 또는 프로세서(1004)와 같은 다른 처리 장치를 포함할 수 있다. 프로세서(1004)는 예를 들어 마이크로프로세서, 컨트롤러 또는 기타 제어 로직과 같이 범용 또는 특수목적의 프로세싱 엔진을 사용하여 구현될 수 있다. 도시된 예에서, 프로세서(1004)는 버스(1002)에 연결되지만, 임의의 통신 매체는 컴퓨팅 컴포넌트(1000)의 다른 컴포넌트와의 상호작용을 용이하게 하거나 외부와 통신하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 본 명세서에서 간단히 메인 메모리(1008)로 지칭되는 하나 이상의 메모리 모듈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 랜덤 액세스 메모리(RAM) 또는 다른 동적 메모리는 프로세서(1004)에 의해 실행될 정보 및 명령을 저장하기 위해 사용될 수 있다. 메인 메모리(1008)는 또한 프로세서(1004)에 의해 실행될 명령의 실행 동안 임시 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하는데 사용될 수 있다. 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 마찬가지로 프로세서(1004)용 명령 및 정적 정보를 저장하기 위한 판독 전용 메모리("ROM") 또는 버스(1002)와 연결된 다른 정적 저장 장치를 포함할 수 있다.
또한, 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 예를 들어 매체 드라이브(1012) 및 저장 유닛 인터페이스(1020)를 포함할 수 있는 하나 이상의 다양한 형태의 정보 저장 메커니즘(1010)을 포함할 수 있다. 매체 드라이브(1012)는 고정식 또는 착탈식 저장매체(1014)를 지원하는 드라이브 또는 다른 메커니즘을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하드 디스크 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광 디스크 드라이브, CD 또는 DVD 드라이브(R 또는 RW) 또는 기타 착탈식 또는 고정식 매체 드라이브가 제공될 수 있다. 따라서, 저장 매체(1014)는 예를 들어 하드 디스크, 솔리드 스테이트 드라이브, 자기 테이프, 카트리지, 광 디스크, CD, DVD 또는 블루레이, 또는 미디어 드라이브(1012)에 의해 판독되거나 기록되거나 액세스되는 다른 고정식 또는 착탈식 매체를 포함할 수 있다. 이들 예가 도시하는 바와 같이, 저장 매체(1014)는 내부에 컴퓨터 소프트웨어 또는 데이터가 저장된 컴퓨터 사용 가능한 저장 매체를 포함할 수 있다.
대안적인 예에서, 정보 저장 메커니즘(1010)은 컴퓨터 프로그램들 또는 다른 명령어들 또는 데이터가 컴퓨팅 컴포넌트(1000)에 로딩될 수 있게 하는 다른 유사한 수단들을 포함할 수 있다. 이러한 수단들은 예를 들어 고정식 또는 착탈식 저장 유닛(1022) 및 인터페이스(1020)를 포함할 수 있다. 이러한 저장 유닛들(1022) 및 인터페이스들(1020)의 예는 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스, 착탈식 메모리(예를 들어, 플래시 메모리 또는 다른 착탈식 메모리 모듈) 및 메모리 슬롯, PCMCIA 슬롯 및 카드 및 소프트웨어와 데이터가 저장 유닛(1022)에서 컴퓨팅 컴포넌트(1000)로 전송되게 할 수 있는 기타 고정식 또는 착탈식 저장 유닛(1022)과 인터페이스(1020)를 포함할 수 있다.
또한, 컴퓨팅 컴포넌트(1000)는 통신 인터페이스(1024)를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(1024)는 소프트웨어 및 데이터가 컴퓨팅 컴포넌트(1000)와 외부 장치 사이에서 전송될 수 있게 하는데 사용될 수 있다. 통신 인터페이스(1024)의 예는 모뎀 또는 소프트모뎀, 네트워크 인터페이스(예컨대, 이더넷, 네트워크 인터페이스 카드, WiMedia, IEEE 802.XX 또는 기타 인터페이스), 통신 포트(예컨대, USB 포트, IR 포트, RS232 포트 Bluetooth® 인터페이스 또는 기타 포트) 또는 기타 통신 인터페이스를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(1024)를 통해 전송된 소프트웨어 및 데이터는 전형적으로 전자, 전자기(광학 포함) 또는 소정의 통신 인터페이스(1024)에 의해 교환될 수 있는 다른 신호일 수 있는 신호들을 통해 전달될 수 있다. 이들 신호는 채널(1028)을 통해 통신 인터페이스(1024)에 제공될 수 있다. 이 채널(1028)은 신호를 전달할 수 있고 유선 또는 무선 통신 매체를 사용하여 구현될 수 있다. 채널의 일부 예는 전화선, 셀룰러 링크, RF 링크, 광 링크, 네트워크 인터페이스, 근거리 또는 광역 네트워크 및 기타 유무선 통신 채널을 포함할 수 있다.
본 문서에서, "컴퓨터 판독 가능 매체", "컴퓨터 사용 가능 매체"및 "컴퓨터 프로그램 매체"라는 용어는 예를 들어, 예를 들어 메모리(1008), 저장장치(1022) 및 미디어(1014)와 같이 휘발성 또는 비휘발성의 비일시적 매체를 일반적으로 지칭하기 위해 사용된다. 이들 및 다른 다양한 형태의 컴퓨터 프로그램 매체 또는 컴퓨터 사용 가능 매체는 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스를 실행을 위한 처리 장치로 전달하는 데 관여할 수 있다. 매체에 구현된 이러한 명령어는 일반적으로 (컴퓨터 프로그램 또는 다른 그룹의 형태로 그룹화될 수 있는) "컴퓨터 프로그램 코드" 또는 "컴퓨터 프로그램 제품"으로 지칭된다. 실행될 때, 이런 명령은 본 명세서에 논의된 바와 같이 컴퓨팅 모듈(1000)이 본 출원의 특징 또는 기능을 수행하게 할 수 있다.
다양한 예들 및 구현들의 관점에서 위에서 설명되었지만, 하나 이상의 개별 구현에서 설명된 다양한 특징, 태양 및 기능은 이들이 기술된 특정 구현에 대한 적용에 국한되지 않고, 대신 그러한 구현이 기술되는지 여부와 그러한 특징이 기술된 구현의 일부로서 제공되는지의 여부에 관계없이, 단독으로 또는 다양한 조합으로, 애플리케이션의 다른 구현들 중 하나 이상에 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 출원의 폭 및 범위는 상술된 예시적인 구현들 중 어느 하나에 국한되지 않아야 한다.
(이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우) 상술한 개념의 모든 조합이 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 개시의 말미에 나타난 청구된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다.
청구범위를 포함하여 본 개시 전반에 걸쳐 사용된 "실질적으로" 및 "약"이라는 용어는 처리에 있어 변화로 인한 작은 변동을 기술하고 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이들은 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 ±0.2 % 이하, 예컨대 ±0.1 % 이하, 예컨대 ±0.05 % 이하를 나타낼 수 있다.
적용 가능한 범위에서, 본 명세서에서 "제1", "제2", "제3" 등의 용어는 이들 용어에 의해 설명된 각각의 목적을 별개의 실체로서 나타내기 위해 사용되며 명시적으로 다르게 명시되지 않는 한 연대순의 의미를 수반하는 것으로 의도되어 있지 않다.
달리 명시되지 않는 한, 본 문서에 사용된 용어 및 문구 및 그 변형은 제한이 아니라 개방된 것으로 해석되어야 한다. 상기의 예로서: "포함하는"이라는 용어는 "제한없이 포함하는" 등을 의미하는 것으로 이해되어야 하고; "예"라는 용어는 그 전체 목록 또는 제한 목록이 아니라 논의중인 항목의 예들을 제공하기 위해 사용되며; "a" 또는 "an"이라는 용어는 "적어도 하나", "하나 이상" 등을 의미하는 것으로 이해되어야 하고; "전통적", "종래적", "일반적", "표준의", "기지(旣知)의"와 같은 형용사 및 유사한 의미의 용어는 주어진 기간 또는 주어진 시간으로서 현재 사용 가능한 항목으로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며 대신에 현재 또는 미래에 언제든지 이용 가능하거나 알려진 기존의, 전통적, 일반적 또는 표준 기술을 포괄하도록 읽혀져야 한다. 마찬가지로, 이 문서가 당업자에게 명백하거나 알려진 기술을 언급하는 경우, 이러한 기술은 현재 또는 미래에 언제든지 당업자에게 명백하거나 알려진 기술을 포함한다.
일부 경우에 "하나 이상", "적어도", "그러나 이에 국한되지 않는" 또는 다른 유사한 문구와 같은 확장형 단어 및 문구의 존재는 그러한 확장형 문구가 없을 수 있는 경우에 더 좁은 경우가 의도되거나 요구되는 것을 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
또한, 본 명세서에 제시된 다양한 구현은 예시적인 블록도, 흐름도 및 다른 예시의 관점에서 설명된다. 본 명세서를 읽은 후 당업자에게 명백한 바와 같이, 예시된 구현 및 그들의 다양한 대안은 예시된 예에 국한됨이 없이 구현될 수 있다. 예를 들어, 블록 다이어그램 및 해당 설명은 특정 아키텍처 또는 구성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시의 다양한 구현들을 상술하였지만, 이들은 제한이 아니라 단지 예로서 제시된 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 다양한 다이어그램은 본 개시에 대한 예시적인 아키텍처 또는 다른 구성을 도시할 수 있으며, 이는 본 개시에 포함될 수 있는 특징 및 기능을 이해하는 것을 돕기 위해 행해진다. 본 개시는 도시된 예시적인 아키텍처 또는 구성으로 국한되는 것이 아니라, 다양한 대안적인 아키텍처 및 구성을 사용하여 원하는 대안적인 특징이 구현될 수 있다. 실제로, 대안적인 기능적, 논리적 또는 물리적 분할 및 구성이 본 개시의 원하는 특징을 구현하기 위해 어떻게 구현될 수 있는지가 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 명세서에 도시된 것 이외의 다수의 상이한 구성 요소 이름이 다양한 부분에 적용될 수 있다. 또한, 흐름도, 동작 설명 및 방법 청구 범위와 관련하여, 본 명세서에 제시된 단계의 순서는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 인용된 기능을 수행하기 위해 다양한 구현이 동일한 순서로 구현되도록 요구하지 않아야 한다.

Claims (20)

  1. 고정식 광학 회절 격자를 통해 광을 지향시키는 단계;
    고정식 광학 회절 격자를 통해 생물학적 샘플로 지향되는 광에 의해 생성되는 광학 회절 격자 패턴을 투영시키는 단계;
    생물학적 샘플을 라인 스캐닝하는 단계;
    광학 회절 격자 패턴에 대하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 고정식 광학 회절 격자를 통해 지향되는 광을 이동시키는 단계; 및
    생물학적 샘플을 나타내는 고해상도 이미지를 재구성하는 단계를 포함하며,
    상기 생물학적 샘플의 적어도 일부는 복수의 나노웰 내에 위치하고, 복수의 나노웰은 정사각형 패턴으로 배향되는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 광은 2개의 개별적인 레이저 소스로부터 출력된 적색 및 녹색 파장의 광을 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    2개의 레이저 소스들 각각은 펄스형 광을 출력하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    생물학적 샘플의 라인 스캐닝은 2개의 레이저 소스가 여기되어 생물학적 샘플의 조명이 이루어질 때 생물학적 샘플의 일부의 이미지를 캡처하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    광학 회절 격자 패턴에 대한 생물학적 샘플의 이동 또는 광학 회절 격자 패턴에 대한 광의 이동은 광학 회절 격자 패턴의 복수의 위상 변이를 생성하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    복수의 위상 변이는 광학 회절 격자 패턴의 적어도 3개의 위상 변이를 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰과 적어도 수직으로 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    플로우셀의 제1 축을 따라 생물학적 샘플을 나타내는 정보는 플로우셀과 광학 회절 격자 패턴을 포함하는 복수의 세장형 나노웰의 조합에 의해 생성된 공간 주파수에 기반한 해상도 증가에 따라 분해되는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제1 축과 적어도 수직인 제2 축을 따라 생물학적 샘플을 나타내는 정보는 비-증가 해상도(non-increased resolution)에 따라 분해되는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰과 적어도 평행하게 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    라인 스캐닝은 복수의 세장형 나노웰과 정렬되는 방향을 따라 수행되는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    생물학적 샘플의 라인 스캐닝은 생물학적 샘플의 시간 지연 적분 라인 스캐닝(time delay integration line scanning)을 포함하는, 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법.
  13. 적어도 2개의 파장으로 광 빔을 각각 방출하는 적어도 2개의 레이저 소스;
    고정식 광학 회절 격자를 통해 방출된 광 빔이 지나가면 광학 회절 격자 패턴을 생성하도록 형성된 고정식 광학 회절 격자; 및
    광학 회절 격자 패턴에 관계하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 광학 회절 격자 패턴에 관계하여 적어도 2개의 레이저 소스를 이동시키고, 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지를 캡처하며, 복수의 이미지에 기반하여 생물학적 샘플을 나타내는 고해상도 이미지를 재구성하는 라인 스캐닝 어셈블리를 포함하며,
    상기 생물학적 샘플의 적어도 일부는 복수의 나노웰 내에 위치하고, 복수의 나노웰은 정사각형 패턴으로 배향되는, 시스템.
  14. 제 13 항에 있어서,
    라인 스캐닝 어셈블리는 형광성 생물학적 샘플을 감지하도록 형성된 적어도 하나의 이미지 센서를 각각 가지는 적어도 2개의 카메라를 포함하는 시스템.
  15. 제 14 항에 있어서,
    광학 회절 격자 패턴에 관계하여 생물학적 샘플을 이동시키거나 적어도 2개의 레이저 소스를 이동시키는 것은 광학 회절 격자 패턴의 복수의 위상 변이를 생성하는 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서,
    복수의 위상 변이는 광학 회절 격자 패턴의 적어도 3개의 위상 변이를 포함하는 시스템.
  17. 제 13 항에 있어서,
    광학 회절 격자 패턴은 생물학적 샘플을 담은 플로우셀을 포함하는 복수의 세장형 나노웰와 관련하여 지향되는 복수의 길이방향의 프린지를 포함하는 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서,
    라인 스캐닝 어셈블리는 복수의 세장형 나노웰과 정렬되는 방향을 따라 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지를 캡처하는 시스템.
  19. 제 13 항에 있어서,
    적어도 2개의 레이저 소스 각각은 펄스형 광 빔을 방출하는 시스템.
  20. 제 19 항에 있어서,
    라인 스캐닝 어셈블리는 적어도 2개의 레이저 소스의 여기가 생물학적 샘플을 형광시키면 생물학적 샘플의 부분들을 나타내는 복수의 이미지 각각을 캡처하는 시스템.
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