JP6947855B2 - ラインスキャンによる構造化照明顕微鏡法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年１月２４日に出願され、「ラインスキャンによる構造化照明顕微鏡法」と題された米国仮特許出願第６２／６２１，５７０号と、２０１８年３月２０日に出願され、「ラインスキャンによる構造化照明顕微鏡法」と題されたオランダ特許出願第Ｎ２０２０６２３号に対する優先権を主張する。上記出願のそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

生物学の研究における多くの近年の進歩は、核酸の分析およびシーケンシング方法の改善の恩恵を受けている。例えば、ヒトゲノムプロジェクトは、ヒトゲノムの全配列を決定し、疾患の治療から基礎科学の進歩に至るまでの分野でのさらなる発見につながることが期待されている。増幅されていない、または増幅された単一分子の、平面アレイまたはビーズのいずれかの形での超並列分析に基づく多くの新しいＤＮＡシーケンシング技術が近年報告されている。

そのような新しいシーケンシング法で核酸の配列を分析するために使用される方法論は、多くの場合、蛍光ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出に基づいている。構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、顕微鏡の方位分解能を２倍以上高めるために、空間的に構造化された（すなわち、パターン化された）光を使用して試料をイメージングすることができるそのようなシーケンシング法の１つである。試料のイメージング中に、試料の画像を様々なパターン位相で（例えば、０°、１２０°、および２４０°で）取得することができ、光軸を中心にパターンの配向を（例えば、６０°および１２０°）回転させることでその手順が繰り返される。取り込まれた画像（例えば、９つの画像、各パターン位相における各配向角に対して１つの画像）は、拡張された空間周波数帯域幅を有する単一の画像に組み立てられ得る。単一の画像を実空間に再変換し、顕微鏡で通常解像され得るよりも高い解像度を持つ画像を生成することができる。

ＳＩＭシステムの典型的な実装形態では、直線偏光線は、光線を２つ以上の次数に回折する光回折格子を通して向けられ、正弦波干渉縞パターンとしてイメージング試料に投影され得る。これらの実装形態では、投影された光回折格子パターンの配向は光軸を中心に光回折格子を回転させることで制御されるのに対し、パターンの位相は光回折格子を、軸をはさんで横方向に動かすことで調整される。そのようなシステムでは、光回折格子は並進ステージに取り付けられ、並進ステージは回転ステージに取り付けられている。さらに、そのようなシステムは、直線偏光子を使用して、光源から放射された光を格子が受け取る前に偏光する。

図１Ａは、試料１００および試料１００に投影された光回折格子パターン１０２の例を示す。試料１００は、解像不可能な高空間周波数を含み得るが、試料１００上に既知の低空間周波数を持つ光回折格子パターン１０２を重ねることにより、モアレ縞が生じる。これにより、解像不可能な高空間周波数が、顕微鏡で解像可能な低空間周波数に効果的に移動する。上述のように、試料１００に対して光回折格子パターン１０２の異なる配向／角度および位相で試料１００の画像を取り込むと、画像が組み合わされて単一の画像になり、それを実空間に再変換してより高い解像度の画像を生成することができる。

本明細書で開示されるシステムおよび方法の例は、ＳＩＭを使用して特にパターン化フローセルを通して蛍光試料を分解するために必要な画像および次元の数を減らすための技法と、蛍光試料に対する光線の移動を活用してラインスキャン技術で使用することができるＳＩＭの実装形態を達成するための技法に関する。

一実施形態によれば、生体試料をイメージングする方法は、固定光回折格子を通して光を向ける工程と、固定光回折格子を通して向けられた光によって生成された光回折格子パターンを生体試料に投影する工程を含む。本方法は、生体試料をラインスキャンする工程と、生体試料を光回折格子パターンに対して移動させるか、固定光回折格子を通して向けられた光を移動させる工程をさらに含み得る。さらになお、本方法は、生体試料を表す高解像度画像を再構成する工程を含み得る。

いくつかの例では、光は、２つの個別のレーザー源から出力される赤色および緑色波長の光を含む。２つのレーザー源のそれぞれは、パルス方式で光を出力し得る。いくつかの例では、生体試料のラインスキャンは、生体試料の照射をもたらす２つのレーザー源の励起時に、生体試料の一部の画像を取り込む工程を含む。

いくつかの実装形態では、光回折格子パターンに対する生体試料の移動、または光回折格子パターンに対する光の移動により、光回折格子パターンの複数の位相シフトが生成される。

いくつかの実装形態では、複数の位相シフトは、光回折格子パターンの少なくとも３つの位相シフトを含む。

いくつかの実装形態では、光回折格子パターンは、生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルに対して少なくとも実質的に垂直に配向された複数の縦縞を含む。フローセルの第１軸に沿った生体試料を表す情報は、フローセルを含む複数の細長いナノウェルと光回折格子パターンとの組み合わせによって生じる空間周波数に基づく解像度の増加に従って分解され得る。第１軸に少なくとも実質的に垂直である第２軸に沿った生体試料を表す情報は、増加していない解像度に従って分解され得る。

いくつかの例では、光回折格子パターンは、生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルと少なくとも実質的に平行に配向された複数の縦縞を含む。ラインスキャンは、複数の細長いナノウェルに沿った方向で実行され得る。

いくつかの実装形態では、生体試料のラインスキャンは、生体試料の時間遅延積分ラインスキャンを含む。

別の例によれば、システムは、以下を備え得る：少なくとも２つの波長の光線をそれぞれ放射する少なくとも２つのレーザー源と、固定光回折格子であって、放射光線が固定光回折格子を通過する際に光回折格子パターンを生成するように構成された、固定光回折格子。さらに、システムは、以下の工程を行うためのラインスキャンアセンブリを備え得る：光回折格子パターンに対して生体試料を移動する工程；または、光回折格子パターンに対して少なくとも２つのレーザー源を移動する工程と；生体試料の一部を表す複数の画像を取り込む工程と；複数の画像に基づいて、生体試料を表す高解像度画像を再構成する工程。

いくつかの例では、ラインスキャンアセンブリは少なくとも２つのカメラを備え、各カメラは、蛍光生体試料を感知するように構成された少なくとも１つの画像センサーを有する。光回折格子パターンに対する生体試料の移動、または少なくとも２つのレーザー源の移動は、光回折格子パターンの複数の位相シフトを生成し得る。複数の位相シフトは、光回折格子パターンの少なくとも３つの位相シフトを含み得る。光回折格子パターンは、生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルに対して配向された複数の縦縞を含む。

いくつかの例では、ラインスキャンアセンブリは、生体試料の一部を表す複数の画像を、複数の細長いナノウェルに沿った方向で取り込む。いくつかの例では、少なくとも２つのレーザー源のそれぞれは、パルス方式で光線を放射する。いくつかの例では、ラインスキャンアセンブリは、生体試料の蛍光をもたらす少なくとも２つのレーザー源の励起時に、生体試料の一部を表す複数の画像のそれぞれを取り込む。

前述の概念および以下でより詳細に説明する追加の概念の全ての組み合わせは（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられることが理解されるだろう。特に、本開示の最後に現れるクレームされた主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示された本発明の主題の一部であると考えられる。

開示された技術の他の特徴および態様は、例として、開示された技術の実装形態による特徴を示す添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。この要約は、特許請求の範囲および等価物によって定義される本明細書に記載の発明の範囲を限定することを意図したものではない。

本開示は、１つまたは複数の様々な実装形態に従って、以下の図を参照して詳細に説明される。これらの図は、例示のみを目的として提供されており、典型的な実装形態または例示的な実装形態を示しているにすぎない。

試料の周波数パターンを下げて解像度の増加を可能にするために使用される構造化照明の一例を示している。 一例において、イメージングのために試料を分解するのに必要な角度の数を示している。 構造化照明イメージングシステムの一例を示している。 図３Ａは、六角形フローセルパターンの例を示している。図３Ｂは、正方形アレイフローセルパターンの例を示しており、その使用によって次元が削減された構造化照明イメージングがもたらされる。図３Ｃは、非対称アレイフローセルパターンの例を示しており、その使用によって次元が削減された構造化照明イメージングがもたらされる。 次元が削減された構造化照明イメージングのために実装され得る例示的な動作を示すフローチャートである。 ラインスキャンイメージングシステムの一例を示している。 図６Ａ〜図６Ｃは、一例において、一次元での構造化照明パターンの位相シフトを示している。図６Ｄは、位相シフトされた構造化照明パターンが同時に重ねられた異なる部位を有する非対称パターン化フローセルの一例を示す。 従来のパターン化フローセルを使用するラインスキャン動作の例を示している。 固定構造化照明パターンを使用するラインスキャンイメージングシステムの例を示している。 照明光線を変調する固定構造化照明パターンを使用するラインスキャン動作の例を示している。 ラインスキャンイメージングと併せて使用される次元が削減された構造化照明イメージングのために実装され得る例示的な動作を示すフローチャートである。 本開示で説明される実装形態の様々な特徴を実施するために使用され得る例示的なコンピューティングコンポーネントを示している。

図は網羅的ではなく、本開示を正確な開示の形態に限定するものではない。

回折格子によって放射された回折光を指すために本明細書で使用される場合、「次数」（“ｏｒｄｅｒ”または“ｏｒｄｅｒ ｎｕｍｂｅｒ”）という用語は、建設的干渉を起こす回折格子の隣接スリットからの光の経路差を表す整数波長の数を意味するものとする。「ゼロ次」または「ゼロ次最大」という用語は、回折格子によって放射された回折のない中央の明るい縞を指すものとする。「１次」という用語は、経路差が±１波長である、ゼロ次縞の両側に放射される２つの明るい縞を指すものとする。

本明細書で試料に言及するために使用される場合、「スポット」または「特徴」という用語は、相対的な位置に応じて他のポイントまたは領域と区別することができるパターン内のポイントまたは領域を意味するものとする。個々のスポットは、特定のタイプの１つまたは複数の分子を含むことができる。例えば、スポットは特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含むことができ、またはスポットは同じ配列（および／またはその相補配列）を有するいくつかの核酸分子を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「タイル」という用語は、一般に、試料の同じ領域の１つまたは複数の画像を指し、１つまたは複数の画像のそれぞれは、個々のカラーチャネルを表す。タイルは、１つのイメージングサイクルのイメージングデータセットのイメージングデータサブセットを形成し得る。

本明細書で使用される場合、「ｘ−ｙ平面」という用語は、デカルト座標系の直線軸ｘおよびｙによって定義される２次元領域を意味するものとする。検出器および検出器によって観察される物体に関連して使用される場合、その領域を、検出器と検出される物体との間の観察の方向に直交するようにさらに指定することができる。本明細書でラインスキャナに言及するために使用される場合、「ｙ方向」という用語はスキャンの方向を指す。

本明細書で使用される場合、「ｚ座標」という用語は、ｘ−ｙ平面に直交する軸に沿った点、線または領域の位置を指定する情報を意味するものとする。特定の実装形態では、ｚ軸は、検出器によって観察される物体の領域に直交する。例えば、光学システムの焦点の方向は、ｚ軸に沿って指定され得る。

本明細書で使用される「ラインをスキャンする」という用語は、物体のｘｙ平面での２次元断面を検出することを意味するものとし、断面は長方形または長楕円形であり、断面と物体間の相対的な移動を引き起こす。例えば、蛍光イメージングの場合、長方形または長楕円形の形状を有する物体の領域を特異的に励起することができる（他の領域を除外して）および／またはスキャンの特定の時点でその領域からの放射を特異的に取得することができる（他の領域を除外して）。

本明細書で開示される実施は、正方形または非対称パターンを有するように構成されたフローセルを対象とする。ＳＩＭは、顕微鏡の方位分解能を２倍以上高めるために、空間的に構造化された（すなわち、パターン化された）光に頼って試料をイメージングすることを想起されたい。また、従来は、複数のパターン位相および複数の配向／角度での試料の画像を使用して、方位分解能の望ましい増加が達成されることを想起されたい。

図１Ｂは概して、一例として、顕微鏡対物レンズによって生成される逆格子空間（その回折パターンに相似）の観察可能な領域と、対物レンズが透過することができる最高空間周波数（２ＮＡ／λ（グラフ１２０）によってそれが端でどのように制限されるかを示している。図示のように、中央のスポットはゼロ次成分を表す。平行線のパターンを表すゼロ次および１次回折成分をグラフ１２２に示す。パターン間隔が解像限界にある場合、１次スポットは観測可能なフィールドの端（ｋ_０境界上）に発生する。周波数混合により、観測可能な領域には、空間周波数の通常の画像（中央の円）に加えて、元のフィールドの端を中心とする２つの新しいオフセット周波数画像（グラフ１２４）も含まれる。これらのオフセット画像には、従来の顕微鏡を使用しても観察することができない高い空間周波数が含まれている。グラフ１２６に示されるように、１２０°の配向で３つの位相から作られた画像のセットは、最終的には処理後、広視野蛍光顕微鏡で観察され得る２倍の空間解像度を含む実画像を生成する。

ただし、フローセルを（例えば、六角形パターンではなく）正方形または非対称パターンを持つように構成することにより、同じように方位分解能を高めるために必要な画像は少なくなる。すなわち、正方形または非対称パターンのナノウェルを有するフローセルは、詰まったピッチ（すなわち、隣接するナノウェル間の距離）を有し、解像度の増加に関わるフローセルの軸／複数の軸を、解像度を増加させる対象の軸／複数の軸に合わせることができる。正方形パターン化フローセルの一例では、２つの軸に関してのみ解像度を上げる必要がある。したがって、必要な画像は６つだけである（３つの位相にわたって２つの角度それぞれの画像）。非対称パターン化フローセルの場合、解像度を高めるために必要な試料の画像は３つだけである（３つの位相にわたって１つの角度の画像）。

試料を所望の程度に分解するために必要な角度の数を減らすことにより、試料のイメージングを完了するために必要な画像の数が削減される。例えば、４染料化学の状況では、システムは、ベースコール用に４つの画像を生成するために３６個の画像を取得する必要がある場合がある（以下で説明する）。取り込んだ画像を保存またはキャッシュするために必要な記憶（例えば、ディスク）空間の容量も削減できる。さらに、複数画像を単一の画像に組み立ててから、その単一画像を所望の解像度を持つ画像に再変換／再構成するために必要な処理および／または計算能力も削減することができる。

さらに、ＳＩＭの従来の実装形態は、ラインスキャン技術を使用して試料をイメージングするシーケンシングシステムと互換性がない。ラインスキャンとは、フローセルを１行ずつイメージングするピクセルのラインを使用して連続画像を構築することを指す（フローセルなどの物体全体の静止画像を取り込むピクセルの２次元アレイを持つカメラまたはセンサーとは対照的）。シーケンシングシステムに適している特定のタイプのラインスキャンは、時間遅延積分（ＴＤＩ）ラインスキャンである。

マルチアングルＳＩＭの実装形態では、角度／位相画像の各組み合わせを取得するために固定視野が必要である。ただし、非対称パターン化フローセルが試料基板として使用される本明細書に開示の実装形態の場合のように、単一の角度に関してのみ画像が撮影される場合、ＴＤＩラインスキャンを使用して３つのＳＩＭパターン位相をカバーする試料の画像を取り込むことができる。すなわち、非対称パターン化フローセルに対してＳＩＭパターンを移動し、フローセル内の試料を１つの軸のみに沿って高めた分解能で分解するために必要な３つの位相を生成することができる。

一部の実装形態では、ＴＤＩラインスキャンをＳＩＭ技術と組み合わせて使用し、ＴＤＩラインスキャンカメラまたはセンサーを使用してフローセル（「スワス」と呼ばれる）に沿って画像を取り込み、試料をイメージングすることができる。すなわち、ＴＤＩラインスキャンを、第１位相のＳＩＭパターンでパターン化したフローセルにおいて実行することができる。ＳＩＭパターンを第２位相にシフトし、ＴＤＩラインスキャンを繰り返すことができる。ＳＩＭパターンを第３位相にシフトし、ＴＤＩラインスキャンを再度繰り返すことができる。このようにして、各パターン位相での試料の画像が取り込まれる。

あるいは、フローセルの異なる部位を、ＳＩＭパターンの異なる位相でパターン化することができる。例えば、フローセルの第１部位では、ＳＩＭパターンを第１の位置に配置することができ、フローセルの第２部位では、ＳＩＭパターンを第２の位置にシフトすることができ、フローセルの第３部位では、ＳＩＭパターンを第３の位置にシフトすることができる。したがって、カメラまたはセンサーがスワスを取り込むと、３つのＳＩＭパターン位相のそれぞれにわたる試料の画像が１回のＴＤＩラインスキャンで取り込まれる。

さらに他の実装形態では、試料／フローセルに対してＳＩＭパターンをシフトする代わりに、ＳＩＭパターンが固定したままで試料／フローセルを移動させる。試料がフローセル内に配置／位置され、その結果、試料がフローセルを構成するナノウェルに従ってパターン化されることが理解される。上記のようにＴＤＩラインスキャンを実装するとき、試料／フローセルはすでに移動している。したがって、試料／フローセルのこの移動を活用して、ＳＩＭパターンをシフトする必要がなくなる。すなわち、固定ＳＩＭパターンに対する試料／フローセルの移動（適切な配向が与えられた場合）により、試料の分解に必要な位相が生成される。

本明細書で開示されるシステムおよび方法の様々な実装形態を詳細に説明する前に、本明細書で開示される技術が実装され得る例示的な環境を説明することが有用となり得る。そのような例示的な環境の１つは、図２に示される構造化照明イメージングシステム２００の環境であり、これは空間的に構造化された光で試料を照射する。例えば、システム２００は、空間的に構造化された励起光を利用して生体試料をイメージングする構造化照明蛍光顕微鏡システムであってもよい。

図２の例では、発光器２５０は、コリメーションレンズ２５１によってコリメートされる光線を出力するように構成される。コリメートされた光は、光構造化光学アセンブリ２５５によって構造化（パターン化）され、ダイクロイックミラー２６０によって対物レンズ２４２を通って、ステージ２７０に配置された試料容器２１０の試料に向けられる。蛍光試料の場合、試料は構造化された励起光に応答して蛍光を発し、その結果生じる光は対物レンズ２４２によって収集され、蛍光を検出するカメラシステム２４０の画像センサーに向けられる。

以下でさらに説明する様々な実装形態における光構造化光学アセンブリ２５５は、１つまたは複数の光回折格子を含み、試料容器２１０の試料に投影される回折光（例えば、縞）の正弦波パターンを生成する。回折格子は、一次元もしくは二次元の透過型、反射型、または位相格子であり得る。特定の実装形態を参照して以下でさらに説明するように、システム２００では、回折格子は必ずしも回転ステージを必要としない。いくつかの実装形態では、回折格子は、イメージングシステムの動作中に固定されていてもよい（例えば、回転されないまたは直線的に動かされない）。例えば、以下でさらに説明する特定の実装形態では、回折格子は、互いに実質的にまたは正確に／完全に垂直に配向された２つの固定１次元透過型回折格子（例えば、水平回折格子および垂直回折格子）を含み得る。

各イメージングサイクル中に、システム２００は、光構造化光学アセンブリ２５５を利用して、試料平面に沿って（例えば、ｘｙ平面に沿って）横方向に変位した様々な位相で複数の画像を取得し、この手順は光軸を中心にパターンの配向を回転させることにより（すなわち、試料のｘｙ平面に関して）１回または複数回繰り返される。次いで、取り込まれた画像は空間的に再構成され、より高い解像度の画像（例えば、個々の画像の約２倍の横方向の空間解像度を有する画像）を生成し得る。

システム２００において、発光器２５０は、インコヒーレント発光器（例えば、１つもしくは複数の励起ダイオードにより出力される光線を放射する）、あるいは１つもしくは複数のレーザーまたはレーザーダイオードにより出力される光の発光器などのコヒーレント発光器であり得る。システム２００の例に示されるように、発光器２５０は、出力される光線を導くための光ファイバ２５２を含む。しかしながら、他の構成の発光器２５０が使用されてもよい。マルチチャネルイメージングシステム（例えば、複数の波長の光を利用するマルチチャネル蛍光顕微鏡）で構造化照明を利用する実装形態では、光ファイバ２５２は、複数の異なる光源（図示せず）に光学的に結合していてもよく、各光源は異なる波長の光を発光する。システム２００は、単一の発光器２５０を有するものとして示されているが、いくつかの実装形態では、複数の発光器２５０を含めることができる。例えば、以下でさらに説明する複数のアームを利用する構造化照明イメージングシステムの場合、複数の発光器を含めることができる。例えば、青、緑、赤、または他の色など、異なる波長に対応する光が放射される場合がある。いくつかの例では、１つの発光器／光源を使用してもよい。いくつかの例では、２つ以上の発光器／光源を使用してもよい。

いくつかの実装形態では、システム２００は、構造化された光線形状および経路を調整するためにｚ軸に沿って接合するレンズ素子を含み得るチューブレンズ２５６を含み得る。例えば、容器２１０内の試料の試料厚さ（例えば、異なるカバーガラス厚さ）の範囲を考慮するために、チューブレンズのコンポーネントを接合させることができる。

システム２００の例では、流体送達モジュールまたはデバイス２９０は、試薬（例えば、蛍光標識ヌクレオチド、緩衝液、酵素、切断試薬など）の流れを試料容器２１０および廃棄弁２２０に（およびそれらを通して）導くことができる。容器２１０は、試料が設置される１つまたは複数の基板を含み得る。例えば、多数の異なる核酸配列を分析するシステムの場合、試料容器２１０は、配列決定される対象の核酸が結合、付着または会合する１つまたは複数の基板を含み得る。基板には、例えばガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、およびシリコンウェーハなど、核酸を付着させることができる不活性基板またはマトリックスが含まれ得る。いくつかの用途では、基板は、試料容器２１０にわたるマトリックスまたはアレイに形成された複数の位置のチャネルまたは他の領域内にある。システム２００は、試料容器２１０内の流体の温度条件を任意に調整することができる温度ステーションアクチュエータ２３０および加熱器／冷却器２３５も備え得る。

特定の実装形態では、試料容器２１０を、半透明カバープレート、基板、およびそれらの間に含まれる液体を含むパターン化フローセルとして実装してもよく、生体試料は半透明カバープレートの内面または基板の内面に配置され得る。フローセルは、基板に画定されたアレイ（例えば、六角形アレイ、長方形アレイなど）にパターン化された多数（例えば、数千、数百万、もしくは数十億以上）のウェルまたは領域を含み得る。各領域は、例えば、合成時解読法を使用して配列決定され得るＤＮＡ、ＲＮＡ、または別のゲノム物質などの生体試料のクラスター（例えば、モノクローナルクラスター）を形成し得る。フローセルは、複数の相隔たるレーン（例えば、８レーン）にさらに分割されてもよく、各レーンはクラスターの六角形アレイを含む。

試料容器２１０は、対物レンズ２４２に対する試料容器２１０の移動および調整を提供する試料ステージ２７０に取り付けられ得る。試料ステージは、三次元のいずれかで移動することを可能にする１つまたは複数のアクチュエータを有し得る。例えば、デカルト座標系に関しては、ステージを対物レンズに対してＸ、ＹおよびＺ方向に移動することを可能にするアクチュエータが備えられ得る。これにより、試料容器２１０上の１つまたは複数の試料位置を対物レンズ２４２と光学的に位置合わせすることができる。対物レンズ２４２に対する試料ステージ２７０の移動は、試料ステージ自体、対物レンズ、イメージングシステムのいくつかの他のコンポーネント、または前述の任意の組み合わせを動かすことにより達成することができる。さらなる実装形態には、固定試料上でイメージングシステム全体を移動させることも含まれ得る。あるいは、試料容器２１０は、イメージング中に固定されていてもよい。

いくつかの実施形態では、焦点（ｚ軸）コンポーネント２７５が含まれ、焦点方向（通常ｚ軸、またはｚ方向と呼ばれる）における試料容器２１０に対する光学コンポーネントの位置決めを制御することができる。焦点コンポーネント２７５は、光学ステージもしくは試料ステージ、または両方に物理的に結合した１つもしくは複数のアクチュエータを含み、光学コンポーネント（例えば、対物レンズ２４２）に対して試料ステージ２７０上の試料容器２１０を移動させてイメージング操作に適切な焦点を合わせることができる。例えば、アクチュエータは、それぞれのステージに物理的に結合していてもよく、例えば、機械的、磁気的、流体的、または他の取り付けもしくは接触により直接的にまたは間接的にステージに結合していてもよい。試料ステージを同じ平面に維持しながら（例えば、光軸に対して実質的または完全に垂直な水平面または水平姿勢を維持しながら）、ステージをｚ方向に移動するように１つまたは複数のアクチュエータを構成することができる。完全な垂直性、平行性、または他の配向は、例えば、製作公差、動作上の制限などのために、いくつかの例または実装形態に従って達成することができない場合があることが理解され得る。しかし、本明細書に開示される技術の目的のために、実質的に垂直、平行または他の配向は、本明細書に記載および／もしくは企図される所望の解像度または他の関連する効果を達成するのに十分な配向を意味すると理解される。ステージを傾けるように１つまたは複数のアクチュエータを構成することもできる。これは、例えば、試料容器２１０を動的に水平にしてその表面の傾斜を考慮することができるように行われ得る。

イメージングされる試料位置で試験試料から発する構造化光を、ダイクロイックミラー２６０を通ってカメラシステム２４０の１つまたは複数の検出器に向けることができる。いくつかの実装形態では、１つまたは複数の放射フィルタを備えたフィルタ切り替えアセンブリ２６５を含めることができ、ここで１つまたは複数の放射フィルタを使用して特定の放射波長を通過させ、他の波長を遮断（または反射）することができる。例えば、１つまたは複数の放射フィルタを使用して、イメージングシステムの異なるチャネル間で切り替えることができる。特定の実装形態では、放射フィルタは、異なる波長の放射光をカメラシステム２４０の異なる画像センサーに向けるダイクロイックミラーとして実装され得る。

カメラシステム２４０は、１つまたは複数の画像センサーを含み、試料容器２１０のイメージング（例えば、シーケンシング）をモニターおよび追跡することができる。カメラシステム２４０は、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサーカメラとして実装することができるが、他の画像センサー技術（例えば、アクティブピクセルセンサー）を使用することができる。カメラシステム２４０からの出力データ（例えば、画像）は、以下でさらに説明するように、各イメージングサイクル中に取り込まれた画像を再構成して高い空間解像度を持つ画像を作製することができるソフトウェアアプリケーションとして実装され得るリアルタイム分析モジュール（図示せず）に通信され得る。以下で説明するように、カメラシステム２４０は、ラインスキャン技術を実現するためのＴＤＩ ＣＣＤカメラとしても実装され得る。

図示されていないが、システム２００の様々な光学コンポーネントの同期を含む、構造化照明イメージングシステム２００の動作を制御するためのコントローラが提供され得る。コントローラは、例えば、光構造化光学アセンブリ２５５の構成（例えば、回折格子の選択および／または線形変換）、チューブレンズ２５６の移動、焦点合わせ、ステージ移動、およびイメージング操作などのシステム動作の態様を制御するために実装することができる。様々な実装形態において、コントローラは、ハードウェア、アルゴリズム（例えば、機械実行可能命令）、または前述の組み合わせを使用して実装され得る。例えば、いくつかの実装形態では、コントローラは、１つもしくは複数のＣＰＵまたはプロセッサを関連するメモリとともに含み得る。別の例として、コントローラは、コンピュータプロセッサ、および機械可読命令が格納された非一時的コンピュータ可読媒体など、動作を制御するハードウェアまたは他の回路を含み得る。例えば、この回路には、以下の１つ以上を含めることができる：フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、複合プログラマブルロジックデバイス（ＣＰＬＤ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、プログラマブルアレイロジック（ＰＡＬ）または他の同様の処理デバイスもしくは回路。さらに別の例として、コントローラは、この回路と１つまたは複数のプロセッサの組み合わせを含み得る。

図３Ａは、本明細書に開示される実装形態に従ってイメージングされ得るパターン化フローセル３００の例示的な構成を示す。この実施例では、フローセル３００は、イメージング実行中に同時にイメージングされ得る規則的なスポットまたは特徴３０２の六角形アレイ（３０４を参照）でパターン化される。説明を容易にするために、フローセル３００は、数十〜数百のスポット３０２を有するように示されている。しかしながら、当業者には理解され得るように、フローセル３００は、数千、数百万、または数十億のイメージングされるスポット３０２を有し得る。さらに、いくつかの例では、フローセル３００は、イメージング実行中にサンプリングされるスポット３０２の複数の平面（焦点方向に実質的にまたは完全に垂直）を含む多平面試料であり得る。特定の実施において、フローセル３００は、レーンに分割された数百万または数十億のウェルでパターン化され得る。この特定の実装形態では、フローセルの各ウェルに、合成時解読法を使用して配列決定される生物学的物質を含めることができる。

上記で示唆したように、いくつかの例では、パターン化フローセル３００を使用して試料を分解するために、必要な解像度の達成に少なくとも９つの画像が必要とされる。これは、パターン化フローセル３００内のナノウェルの六角形アレイが高周波パターンであり、ナノウェル間のピッチが詰まっており、分解できないためである。特に、この例では、試料を十分に分解するために必要な画像の数を決定することができる２つの要因がある。

最初の要因は、希望する光通過帯域のコピー数である。図１Ｂに戻り、グラフ１２２は、ＳＩＭを使用しない通常の通過帯域を示している。グラフ１２４は、光通過帯域の１つのコピーが作成された例を示している。これにより、一次元の解像度を向上させることができる一方で、グラフ１２６／グラフ３０６（図３Ａ）は、光通過帯域の３つのコピーが作製された例を示し、二次元でかなり均一な解像度の向上がもたらされる。

２番目の要因は、各光通過帯域の位相の復調に使用される画像の数である。理論的には、必要な画像は２つだけであるが（実部と虚部を取得するため）、通常は３つの画像を使用してノイズの平均化を改善する。

画像を空間周波数からフーリエ空間に変換する際（対物レンズ後側焦点面で顕微鏡によって生成された生データの解析はフーリエ解析に基づく）、フーリエ変換には３つの成分または軸が含まれることを理解する必要がある。すなわち、対物レンズの後側焦点面での光の回折は、対物レンズの開口数と照明の平均波長に応じて、横（ｘ、ｙ）次元で約２００ｎｍ、軸（ｚ）次元で５００ｎｍの最大解像度を規定する回折限界を与える。したがって、パターン化フローセル３００で六角形アレイのナノウェルを使用すると、ＳＩＭを使用して３つの角度で画像が撮影される。また、上記で説明したように、必要な解像度を得るために、３つの角度のそれぞれで３つの位相にわたって画像を撮影する必要があり、ここでイメージング領域の全ての部位が確実に観察されるように３つの位相が必要であり（すなわち、ＳＩＭパターンの波長全体をカバーするため）、したがって９つの画像という結果になる。これにより、３つの軸３０８の全てで解像度が増加する。

しかし、一例では、別のタイプのパターン化フローセル、例えば、ナノウェル３１２が正方形アレイ（３１４を参照）にパターン化されているフローセル３１０を使用すると、解像度を上げるために必要な角度は２つだけであり、解像度は正方形アレイの軸に沿って増加する。グラフ３１６は、この例を示しており、ここでは光通過帯域のコピーが２つだけ作られ、必要な解像度の増加を達成するためにはそれだけが必要である。言い換えれば、フローセル３１０などの正方形パターン化フローセルの分解は、ＳＩＭパターンまたは縞を、解像度の増加が望まれる方向に、この場合は正方形アレイの２つの軸（ｘおよびｙ）に沿って整列させることで達成することができる。隣接するナノウェル３１２間の任意の対角線経路に沿って、対角線上に隣接するナノウェルが互いに分解可能となるようなある程度の解像度の向上があることが理解できる。しかしながら、ｘ軸およびｙ軸に沿ったナノウェル３１２の間では、ピッチ（Ｐ_ｘ、Ｐ_ｙ）が十分に狭いため、ＳＩＭを使用して解像度を上げる必要があり、すなわち、ｘ軸およびｙ軸の空間周波数が高すぎて分解できない。

フローセル３１０などの正方形パターン化フローセルを使用することにより、ＳＩＭを使用する従来のシーケンシングシステムの次元要件を１次元減らすことができ、解像度は２つの軸３１８のみで増加する。すなわち、フローセル３１０内に含有される試料を適切に分解するために、３つの位相それぞれにわたって３つの角度をカバーする９つの画像を取り込むのではなく、３つの位相それぞれにわたって２つの角度をカバーする６つの画像のみを取り込む必要がある。これは、フローセル３１０の充填密度の減少にもかかわらず、有利である。例えば、充填密度の減少は、同じピッチを有する六角形アレイに対してわずか１１％であり得る。しかしながら、様々な例に従ってＳＩＭを実装すると、例えば、３５０ｎｍピッチの正方形パターンアレイの充填密度は、７００ｎｍピッチの非ＳＩＭ六角形アレイに対して３５６％増加する可能性がある。

さらに別のタイプのパターン化フローセル、この例では非対称パターン化フローセルを使用することにより、ＳＩＭを使用する従来のシーケンシングシステムの次元要件をさらに１次元減らすことができる。図３Ｃは、ナノウェルが非対称にパターン化されたパターン化フローセル３２０を示す。この実装形態では、各ナノウェル３２２は、細長い構造を形成するように成形または構成される。本明細書で使用される場合、細長い構造という用語は、第１軸に沿った寸法が第２軸に沿った寸法よりも長い形状を指す。この例では、ｘ軸は、別の軸（この例では、ｙ軸）に沿ったナノウェル３２２の長さまたは高さよりも狭い。図１に示された実施形態は、以下のことを理解されたい。図３Ｃに示す実装形態では楕円形のナノウェルを使用しているが、他のタイプ、例えば長方形の細長いナノウェルも使用され得ることを理解されたい。１つの軸のみに沿った試料がＳＩＭを使用した解像度の増加に関連付けられるパターンをもたらす任意の形状のナノウェルが使用され得る。いくつかの実装形態では、縞幅ｗが少なくとも実質的に同じであるか、わずかに大きいパターン化された特徴の寸法は、円形特徴の直径、正方形特徴の辺の長さ、長方形特徴の長辺または短辺の長さ、長軸または短軸に沿った楕円形特徴の直径、あるいは特徴の１つの軸（例えば、ｘまたはｙ軸）に沿った不規則な形状の特徴の最長寸法であり得る。あるいは、いくつかの実装形態では、ナノウェルは正方形または円として形成されてもよいが、それらの間には非対称の間隔がある。

このようにして、試料を１つの方向または軸、すなわちｙ軸に沿って分解することができる一方で、別の方向または軸、すなわちｘ軸に沿って、ＳＩＭを使用して試料を分解するために解像度を増加させる。すなわち、ｘ軸に沿って、非対称パターン化フローセル３２０のピッチＰ_ｘは狭くまたは詰まっており、解像度の増加を伴う一方、ｙ軸に沿っては、非対称パターン化フロー３２０のピッチＰ_ｙは大きい。したがって、フローセル３２０のナノウェル内に含有される試料を適切に分解するために、解像度は一方向のみ／１つの軸３１８に沿って増加し、３つの画像のみが取り込まれる。したがって、グラフ３５２に示すように、光通過帯域のコピーは１つだけ作られ、解像度を上げるためにはそれだけが必要である。

図４は、図２の構造化照明イメージングシステム２００などのシーケンシングシステムで実行され得る例示的な動作を示すフローチャートであり、正方形または非対称パターン化フローセルを使用して試料をシーケンスする。動作４００では、第１位相に配向された第１光回折格子パターンに対応する光源をオンにすることができる。動作４１０では、第１の配向の光回折格子パターンが試料に投影され、画像が取り込まれる。すなわち、図２に戻り、発光器２５０は、コリメーションレンズ２５１によってコリメートされた光線を出力することができる。コリメートされた光は、光構造化光学アセンブリ２５５によって構造化（パターン化）され、ダイクロイックミラー２６０によって対物レンズ２４２を通って、ステージ２７０に配置された試料容器２１０の試料に向けられる。この実装形態において、試料容器２１０は正方形または非対称パターンを有するパターン化フローセルを含み、例えばそれぞれフローセル３１０または３２０（図３Ｂおよび３Ｃ）などである。蛍光試料の場合、正方形または非対称パターン化フローセルに含有される試料は、構造化された励起光に応答して蛍光を発し、その結果生じる光は対物レンズ２４２によって収集され、蛍光を検出するカメラシステム２４０の画像センサーに向けられる。

動作４２０では、追加の位相シフトが必要かどうかを判断するためのチェックを行うことができる。必要な場合、動作４３０で、光回折格子は位相シフトされ、動作は動作４１０に戻り、光回折格子パターン（位相シフトされた）が試料に投影され、画像が取り込まれる。前述のように、３回の位相シフトが通常実行され、イメージング領域全体、この実装形態では正方形パターン化フローセルの領域全体を取り込む。

追加の位相シフトが必要でない場合、動作４４０で、追加の角度が必要かどうかを判断するためのチェックを行うことができ、動作４５０で光回折格子の角度が変更される。動作は動作４１０に戻り、光回折格子パターン（角度を変更した後）が試料に投影され、画像が取り込まれる。動作は動作４２０に進み、４２０で追加の位相シフトが必要な場合、動作４３０で光回折格子が位相シフトされる。再び、動作は動作４１０に戻り、光回折格子パターンが（新しい角度および新しい位相で）試料に投影され、画像が取り込まれる。繰り返すが、この実装形態では、正方形パターン化フローセルの領域全体を取り込むために、３つの位相にわたる画像が必要となる。構造化照明イメージングシステム２００のシステム動作の態様を制御するために使用される前述のコントローラは、例えば、使用されている特定のタイプのフローセルをイメージングするために追加の位相シフトまたは光回折格子パターンの配向が必要かどうかをチェックするなど、上記の機能を実行する命令で構成され得ることを理解されたい。

正方形パターン化フローセル、例えばフローセル３１０（図３）の場合、フローセル３１０の２つの軸に沿った解像度を高めるために２つの角度の画像が必要である。したがって、（光回折格子パターンの３つの位相シフトにわたって）２つの角度に対応する２つの配向に投影された光回折格子パターンで画像を取り込んだ後、動作４６０で高解像度画像が再構成される（６つの合計画像を結合させて、実空間に再変換する。この高解像度画像再構成はインシステムで実行することができ、または一部の例では、別個の処理エンティティを使用して再構成を実行することができる。

パターン化フローセルが非対称フローセルである実装形態では、上記の方法は角度を変えることを必要としない。繰り返すが、非対称フローセルでは、ＳＩＭを使用して１つの軸のみに沿って分解能を高める。したがって、光回折格子は３回位相シフトするだけでよく、画像が３つの位相シフトで取り込まれるようにする。したがって、動作４２０で他の位相シフトが不要になると、方法は動作４６０に進み、３つの取り込まれた画像のみを使用して高解像度画像を再構成することができる。

前述のように、次元の削減されたＳＩＭ実装形態を利用することができる特別にパターン化されたフローセルを使用する場合、ＴＤＩラインスキャンなどのラインスキャン技術を使用して、これらのパターン化フローセルに含有される試料をイメージングすることができる。図５は、様々な実装形態で試料をイメージングするために使用され得る例示的な２チャネルラインスキャンイメージングシステム５００を示すブロック図である。

図２の構造化照明イメージングシステム２００の場合のように、ラインスキャンイメージングシステム５００を核酸のシーケンシングに使用することができ、そこでは、核酸はアレイの固定位置（すなわち、フローセル３２０などのフローセルのウェル）に付着しており、アレイを繰り返しイメージングすることができる。そのような実施形態では、ラインスキャンイメージングシステム５００は、特定のヌクレオチド塩基タイプを別のものから区別するために使用され得る２つの異なるカラーチャネルで画像を取得し得る。より詳細には、ラインスキャンイメージングシステム５００は、「ベースコール」と呼ばれるプロセスを実装することができ、これは一般に、イメージングサイクルでの画像の所与のスポット位置について、ベースコール（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ））を判定するプロセスを指す。２チャネルベースコール中に、２つの画像から抽出された画像データを使用して、２つの画像の強度の組み合わせとして塩基アイデンティティをエンコードすることにより、４つの塩基タイプのうちのいずれかの存在を判定することができる。２つの画像のそれぞれの所与のスポットまたは位置について、シグナルアイデンティティの組み合わせが［ｏｎ、ｏｎ］、［ｏｎ、ｏｆｆ］、［ｏｆｆ、ｏｎ］、または［ｏｆｆ、ｏｆｆ］であるかどうかに基づいて塩基アイデンティティを判定することができる。

再びラインスキャンイメージングシステム５００を参照すると、システムは、２つの光源５１１および５１２が内部に配置されたライン生成モジュールＬＧＣ５１０を含む。光源５１１および５１２は、レーザー光線を出力するレーザーダイオードなどのコヒーレント光源であり得る。光源５１１は、第１波長（例えば、赤色波長）の光を発することができ、光源５１２は、第２波長（例えば、緑色波長）の光を発することができる。レーザー源５１１および５１２から出力される光線は、１つまたは複数の光線整形レンズ５１３を通して向けられ得る。いくつかの実装形態では、単一の光整形レンズを使用して両方の光源から出力される光線を整形することができる。他の実施形態では、各光線に対して別個の光線整形レンズが使用され得る。いくつかの例では、光線整形レンズはパウエルレンズであり、光線はラインパターンに整形される。ＬＧＣ ５１０または他の光学コンポーネントイメージングシステムの光線整形レンズは、光源５１１および５１２によって発せられた光をラインパターンに整形するように構成される（例えば、１つもしくは複数のパウエルレンズ、または他の光線整形レンズ、回折もしくは散乱コンポーネントを使用して）。例えば、いくつかの実装形態では、光源５１１および５１２によって発せられた光を光回折格子に送り、試料に投影され得る光回折格子パターン（ＳＩＭパターン）を生成することができる。

ＬＧＣ５１０は、単一のインターフェースポートを通って放射光学モジュール（ＥＯＭ）５３０に光線を向けるように構成されたミラー５１４および半反射ミラー５１５をさらに含み得る。光線はシャッター要素５１６を通過し得る。ＥＯＭ５３０は、対物レンズ５３５と、対物レンズ５３５をターゲット５５０に長手方向に近づけたり遠ざけたりするｚステージ５３６とを含み得る。例えば、ターゲット（例えば、パターン化フローセル）５５０は、液体層５５２と、半透明のカバープレート５５１とを含む場合があり、生物試料は、液体層の下に位置する基板層の内面と同様に、半透明のカバープレートの内面に位置していてもよい。次いで、光線をフローセルのいずれかの内面に集束させる（例えば、生体試料に集束させる）ように、ｚステージは対物レンズを移動させることができる。生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、または当該技術分野で知られている光学的シーケンシングに応答する他の生物学的物質であり得る。

ＥＯＭ５３０は、焦点追跡モジュール（ＦＴＭ）５４０から放射された焦点追跡光線をターゲット５５０に反射させ、次いでターゲット５５０から返された光を反射してＦＴＭ５４０に戻す半反射ミラー５３３を含み得る。ＦＴＭ５４０は、返された焦点追跡光線の特性を検出し、フィードバック信号を生成し、対物レンズ５３５の焦点をターゲット５５０に最適化する焦点追跡光学センサーを含み得る。

ＥＯＭ５３０は、光を対物レンズ５３５に通して向けると同時に、ターゲット５５０から返された光を通過させる半反射鏡５３４を含み得る。いくつかの実装形態では、ＥＯＭ５３０はチューブレンズ５３２を含み得る。チューブレンズ５３２を透過した光は、フィルタ要素５３１を通過してカメラアセンブリ５２０に進入し得る。カメラアセンブリ５２０は、入射光線に応答して生体試料から放射された光（例えば、光源５１１および５１２から受け取った赤色光および緑色光に応答した蛍光）を検出するための１つ以上の光学センサー５２１、例えば、ＴＤＩラインスキャンセンサーを含み得る。一例では、ＬＧＣ（上述のものなど）は、回折格子を通して光を投影し、線形縞パターンを生成し得る。

カメラアセンブリ５２０のセンサーからの出力データは、リアルタイム分析回路５２５に通信され得る。リアルタイム分析回路５２５は、様々な実装形態において、画像データを分析するためのコンピュータ可読命令（例えば、画質スコアリング、ベースコールなど）を実行し、光線の特性（例えば、焦点、形状、強度、出力、輝度、位置）を報告するまたはグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）などに表示する。これらの動作は、イメージングサイクル中にリアルタイムで実行することができ、ダウンストリーム分析時間を最小化し、イメージング実行中にリアルタイムのフィードバックとトラブルシューティングを提供する。実装形態において、リアルタイム分析回路５２５は、イメージングシステム５００に通信可能に接続され、それを制御するコンピューティングデバイス（例えば、コンピューティングデバイス１１００）であり得る。以下でさらに説明する実装形態では、リアルタイム分析回路５２５は、カメラアセンブリ５２０から受信した出力画像データの歪みを補正するためのコンピュータ可読命令をさらに実行し得る。

図６Ａ〜６Ｃは、非対称パターン化フローセルのＴＤＩラインスキャンの例示的な描写を表し、ここではＳＩＭを使用して、フローセルの１つの軸に沿って解像度を高める。具体的には、図６Ａは、ＳＩＭパターン６３０を重ね合わせた非対称パターン化フローセル６２０（非対称パターン化フローセル３２０（図３Ｃ）の実装形態であり得る）を示している。ＴＤＩラインスキャンをｙ軸に沿って実行し、非対称パターン化フローセル６２０の行ごとの画像を取り込むことができる。図６Ａの取り込まれた画像は、第１位相のＳＩＭパターン６３０で取り込まれる。

例として、ラインスキャンイメージングシステム５００は、システムの光学系と連携してＬＧＣ５１０を使用し、（ＳＩＭパターン、すなわち、光回折格子パターンを重ね合わた）試料を赤色スペクトル内の波長を持つ光でラインスキャンすることができ、試料を緑色スペクトル内の波長を持つ光でラインスキャンすることができる。ラインスキャンに応じて、試料の異なるスポットに位置する蛍光色素が蛍光を発し、その結果生じる光は対物レンズ５３５によって収集されてカメラアセンブリ５２０の画像センサーに向けられ、蛍光を検出する。例えば、各スポットの蛍光は、カメラアセンブリ５２０の数ピクセルによって検出され得る。次いで、カメラアセンブリ５２０からの画像データ出力は、例えば画像を結合させてスワスを形成する処理のためにリアルタイム分析回路５２５に通信され得る。

図６Ｂは、ＳＩＭパターン６３０を重ね合わせた非対称パターン化フローセル６２０を示している。しかしながら、図６Ｂでは、ＳＩＭパターン６３０は、ｘ軸に沿って（試料を分解するために解像度の増加を必要とする軸と一直線になって）位相シフトされている。上述のように、ラインスキャンイメージングシステム５００は、システムの光学系と連携してＬＧＣ ５１０を使用し、（位相シフトされたＳＩＭパターン６３０を重ね合わた）試料をラインスキャンすることができる。画像は取り込まれてカメラアセンブリ５２０から出力され、処理のために再びリアルタイム分析回路５２５に通信され得る。

図６Ｃは、ＳＩＭパターン６３０を重ね合わせた非対称パターン化フローセル６２０を示している。図６Ｃでは、ＳＩＭパターン６３０は、ｘ軸に沿って（試料を分解するために解像度の増加を必要とする軸と一直線になって）第３位相に位相シフトされている。繰り返すが、ラインスキャンイメージングシステム５００は、システムの光学系と連携してＬＧＣ ５１０を使用し、（位相シフトされたＳＩＭパターン６３０を重ね合わた）試料をラインスキャンすることができる。画像は取り込まれてカメラアセンブリ５２０から出力され、処理のために再びリアルタイム分析回路５２５に通信され得る。各位相／位相シフトに従って取り込まれた画像は、リアルタイム解析回路５２５によって単一の画像に結合され、実空間に再変換され、この例ではｘ軸に沿って高い解像度を有する画像を生成する。

別の実施形態では、図６Ｄに示すように、フローセル６２０の異なる部位に、ＳＩＭパターン６３０をその異なる位相で重ね合わせることができる。すなわち、第１位相のＳＩＭパターン６３０Ａはフローセル６２０の下部に沿って重ね合わされ、第２位相の同じＳＩＭパターン６３０Ｂはフローセル６２０の中央部に沿って重ね合わされ、再び、第３位相の同じＳＩＭパターン６３０Ｃはフローセル６２０の上部に沿って重ね合わされる。したがって、ラインスキャンイメージングシステム５００が各必須位相のＳＩＭパターンに従って、１回の実行でフロー全体をイメージングすることができるように、ラインスキャンイメージングシステム５００は異なる位相のＳＩＭパターン（６３０Ａ〜６３０Ｂ）を重ね合わせたフローセル６２０をラインスキャンする。いくつかの実装形態では、ラインスキャンイメージングシステム５００は、複数のＬＧＣおよび複数のカメラまたはセンサー／カメラアセンブリ、例えば３つを有するように修正することができ、そのそれぞれが３つの光回折格子（同じだが異なる位相に配向されている）を通して光を生成および出力し、３つの位相のＳＩＭパターンを生成する。このようにして、各カメラまたはセンサー／カメラアセンブリは、フローセル６２０の画像を異なるＳＩＭパターン位相とともに同時に取り込むことができる。

上記で言及したように、さらに他の実装形態では、ＳＩＭパターンを固定したままで試料／フローセルを移動させることができる。ＴＤＩラインスキャンを実装する際、試料／フローセルはすでに移動している。したがって、試料／フローセルのこの移動を活用して、ＳＩＭパターンをシフトする必要がなくなる。すなわち、固定ＳＩＭパターンに対する試料／フローセルの移動により、試料の分解に必要な位相が生成される。

図７は、六角形アレイパターン化フローセル３００（図３Ａ）と類似の、別の例のパターン化フローセル７２０を示す。従来の構造化照明イメージングシステムでは、フローセル７２０は、例えばｙ軸の方向にラインスキャンすることができる。ＬＧＣ、例えばＬＧＣ ５１０（図５）によってフローセル７２０内の試料上に出力される光線の強度は、ｘ軸に沿って（図示しないが、ラインスキャン方向に実質的にまたは正確に垂直に）広く均一であるように示される。ただし、ｙ軸に沿って、光線の強度は狭くなる。レーザー光線がフローセル７２０に対して移動すると、蛍光線画像は、光線に照らされている対応領域においてラインスキャンカメラまたはセンサー、例えばカメラアセンブリ５２０（図５）によって取り込まれる。

しかしながら、試料／フローセル７２０が既に動いているという事実を利用して、ならびに非対称パターン化フローセル、例えばフローセル３２０（図３Ｃ）内の試料を分解するのに一次元ＳＩＭのみが必要であるため、ＳＩＭパターンを生成する光回折格子を固定したままにすることができる。すなわち、試料を適切に分解するために必要な複数（例えば３つ）の位相が必要である。したがって、従来のラインスキャンイメージングシステムにおいて、光学回折格子の移動、例えば回転もしくは並進に必要な移動ステージまたは他の要素は、この実装形態では必要ではない。

図８は、固定光回折格子を使用する例示的なラインスキャンイメージングシステム８００を示している。説明を簡単にするために、図８は簡略図であり、全ての特徴／要素が示されているわけではないことに留意されたい。しかしながら、ラインスキャンシステム８００は、得られる光回折格子パターン／ＳＩＭパターンを動かさない固定光回折格子を使用するラインスキャンイメージングシステム５００の一実装形態であり得る。

図８の例では、発光器、例えばレーザー８０２は、コリメーションレンズ８０４によりコリメートされた光線を出力するように構成される。一実装形態では、レーザー８０２は緑色波長の光を放射する。コリメートされた光は、ダイクロイックフィルタ８０６により固定光回折格子８１２を通って対物レンズ８３０に、別のダイクロイックフィルタ８２８を介して試料容器８３２の試料に向けられる。この実装形態では、試料容器８３０は、フローセル３２０（図３Ｃ）などの非対称パターン化フローセルである。

第２発光器、例えば、レーザー８０８は、（例えば、赤色波長の）光を、固定光回折格子８１２を通って対物レンズ８３０に、またダイクロイックフィルタ８２８を介して試料容器８３２の試料に放射する。試料容器８３２は、レーザー８０２および８０８からの光線に対して試料容器８３２を移動させることができるステージ８４０上に配置される。蛍光試料の場合、試料は構造化された励起光（レーザー８０２および８０８からのレーザー光線）に応答して蛍光を発し、その結果生じる光は、対物レンズ８２８によって収集され、カメラ８１４および８２０の画像センサーに向けられる。

ダイクロイックフィルタ８０６を使用してレーザー８０２からの緑色光線を通過させて固定光回折格子８１２に通し、レーザー８０８からの赤色光線を固定光回折格子８１２に向けて反射させる。ダイクロイックフィルタ８２８は、レーザー８０２および８０８からの赤色および緑色光線を対物レンズ８３０に反射させると同時に、カメラ８１４および８２０がそれぞれ緑色および赤色光で蛍光を発した画像を取り込むようにするという点で同様に機能する。ダイクロイックフィルタ８１６は、蛍光試料からの緑色光放射をカメラ８１４に向け、ダイクロイックフィルタ８２２は、蛍光試料からの赤色光放射をカメラ８２０に向ける。レンズ８１８および８２４は、それぞれカメラ８１４および８２０用のコリメートレンズである。ダイクロイックミラー８２６は、蛍光試料からの緑色および赤色発光を適切なカメラに向ける。

ラインスキャンシステム８００では、光回折格子８１２は固定されている。すなわち、前述のように、非対称パターン化フローセルをＳＩＭと組み合わせて使用することで、１次元の構造化照明のみが必要になり、フローセルに沿って光線を移動することで複数の位相を実現することができる。言い換えると、異なる位相を生成するために必要なのは、試料／フローセルに対するレーザー光線の移動、またはレーザー光線に対する試料／フローセルの移動、その結果としての試料と縞励起パターンとの間の相対的な移動である。

図９は、ラインスキャンシステム８００などのラインスキャンイメージングシステムでラインスキャンされ得るパターン化フローセル９２０を示す。フローセル９２０をラインスキャンイメージング技術に従って移動させながら、光回折格子パターンをフローセル９２０に投影することができる。固定光回折格子パターンに対するフローセル９２０の移動は必要な位相シフトを生じさせ、ラインスキャン中に取り込まれた画像は、結合されて実空間に再変換されると、前述のように解像度が向上する。

特に、光線はｙ軸の方向に移動する。繰り返すが、光線の強度はｘ軸に沿って均一であるが（図示せず）、ｙ軸に沿った強度は、固定光回折格子、例えば固定光回折格子８１２（図８）を通過することにより変調される。光線がフローセル９２０に対して移動すると、光回折格子パターンがシフトする。実際、３つを超える、さらには数十の位相シフトが生成され得る。結果として、光回折格子の代わりに試料／フローセル９２０を移動させることにより、ラインスキャンの軸に沿った解像度の向上を達成することができる。いくつかの実装形態では、上述したように、この方向の解像度は、ランダムな特徴または周期的パターンの一方もしくは両方を持つ表面上で少なくとも２倍高めることができる。解像度を、例えば少なくとも２倍高めることができるため、フローセル９２０内のナノウェルの密度を２倍以上増加させることができることを理解されたい。

図１０は、ラインスキャンイメージングシステム５００（図５）またはラインスキャンイメージングシステム８００（図８）などのラインスキャンイメージングシステムで実行され、非対称パターン化フローセルを使用して試料をシーケンスすることができる例示的な動作を示すフローチャートである。動作１０００では、レーザー源、例えばレーザー源８０２および８０８からの光線は、固定光回折格子、例えば固定光回折格子８１２を通るよう出力され、第１光回折格子パターンの配向に応じてオンにすることができる。動作１０１０では、光回折格子パターンが試料上に投影され、動作１０２０では、試料がラインスキャンされる。ラインスキャンは、ラインスキャンイメージングシステム８００（図８）に関して前述したように実行され得る。動作１０３０では、試料を前述のラインスキャン技術に従って移動させるか、または上記のように向けられた光を移動させて試料と光回折格子パターンとの間の相対的移動を実現することができる。

動作１０２０および１０３０は、試料全体を表す画像を取り込むために必要な回数繰り返され得る。繰り返しになるが、固定光回折格子パターンに対して試料が移動する結果として、試料および光回折格子パターンの画像を、解像度を高めるために必要な位相シフトにわたって取り込むことができる。動作１０４０で、高解像度画像を再構成することができる。

ラインスキャン中の光回折格子パターンと試料の間のモーションブラーを防ぐために、レーザー源はパルス方式で動作され得ることに留意されたい。すなわち、励起のたびにラインスキャン画像が取り込まれ得るように、レーザー源、例えばレーザー源８０２および８０８はパルスを発生させ得る。いくつかの実装形態では、試料／フローセルに対する光回折格子パターンの配向を９０°シフトさせることができる。他の実装形態では、図６Ａ〜６Ｃに示すように、光回折格子パターンの配向が、試料が明暗の領域を移動しないようなものである場合（光回折格子パターンの配向が９０°シフトした場合のように）、光回折格子パターンに対する試料の移動は同じ縞強度で移動するため、レーザー源のパルス化は必要ない場合がある。

図１１は、本明細書に開示されるシステムならびに方法の様々な特徴、例えば、システム２００、５００、および／または８００で実施され、本明細書で説明される図４および図１０に示される方法の１つまたは複数の態様の前述の特徴ならびに機能性などを実装するために使用され得る例示的なコンピューティングコンポーネントを示す。例えば、コンピューティングコンポーネントは、リアルタイム分析回路５２５として実装され得る。

本明細書で使用される場合、回路という用語は、本出願の１つまたは複数の実装形態に従って実行することができる機能の所与のユニットを説明し得る。本明細書で使用される場合、回路は、任意の形式のハードウェアまたはハードウェアとソフトウェアの組み合わせを利用して実装され得る。例えば、１つまたは複数のプロセッサ、コントローラ、ＡＳＩＣ、ＰＬＡ、ＰＡＬ、ＣＰＬＤ、ＦＰＧＡ、論理コンポーネント、ソフトウェアルーチン、またはその他のメカニズムを実装して、回路を構成する場合がある。実装形態において、本明細書で説明される様々な回路は、個別の回路として実装される場合があり、または記述の機能および特徴は、１つまたは複数の回路間で部分的または全体的に共有され得る。言い換えれば、当業者は、この説明を読んだ後、本明細書で説明される様々な特徴および機能を任意の所与のアプリケーションで実装することができ、様々な組み合わせおよび順列で１つもしくは複数の個別のまたは共有の回路において実装することができることを理解することができる。様々な特徴または機能の要素が個別のモジュールとして個々に説明またはクレームされ得る場合でも、これらの特徴および機能を１つもしくは複数の共通ソフトウェアおよびハードウェア要素間で共有することができ、そのような説明は、個別のハードウェアあるいはソフトウェアコンポーネントを使用してそのような特徴または機能を実装することを要求もしくは暗示するものではないことを当業者は理解するであろう。

アプリケーションのコンポーネントまたは回路の全体または一部がソフトウェアを使用して実装されている場合、一実装形態では、これらのソフトウェア要素は、それに関して説明した機能を実行する能力があるコンピューティングまたは処理モジュールで動作するように実装され得る。そのような例示的なコンピューティングコンポーネントの１つを図１３に示す。この例示的なコンピューティングコンポーネント１０００に関して様々な実装形態が説明される。この説明を読んだ後、他のコンピューティングモジュールまたはアーキテクチャを使用してアプリケーションを実装する方法が当業者に明らかになるであろう。

図１３に示されるように、コンピューティングコンポーネント１０００は、例えば、以下の中に見られるコンピューティングまたは処理機能を表し得る：デスクトップ、ラップトップ、ノートブック、およびタブレットコンピュータ；ハンドヘルドコンピューティングデバイス（タブレット、ＰＤＡ、スマートフォン、携帯電話、パームトップなど）；メインフレーム、スーパーコンピュータ、ワークステーションもしくはサーバー；あるいは、所与のアプリケーションもしくは環境に望ましいもしくは適切となり得るような他の種類の専用または汎用コンピューティングデバイス。コンピューティングコンポーネント１０００は、所定のデバイス内に埋め込まれた、または他の方法で所定のデバイスが利用可能なコンピューティング機能を表すこともある。例えば、コンピューティングコンポーネントは、例えばデジタルカメラ、ナビゲーションシステム、携帯電話、ポータブルコンピューティングデバイス、モデム、ルーター、ＷＡＰ、端末、および何らかの処理機能を含み得るその他の電子デバイスなどの他の電子デバイス内に見られる場合がある。

コンピューティングコンポーネント１０００は、例えば、１つまたは複数のプロセッサ、コントローラ、制御モジュール、または他の処理デバイス、例えばプロセッサ１００４などを含む場合がある。プロセッサ１００４は、例えば、マイクロプロセッサ、コントローラ、もしくはその他の制御ロジックなどの汎用または専用処理エンジンを使用して実装され得る。図示の例では、プロセッサ１００４はバス１００２に接続されているが、任意の通信媒体を使用して、コンピューティングコンポーネント１０００の他のコンポーネントとの相互作用を促進したり、外部と通信することができる。

コンピューティングコンポーネント１０００は、本明細書で単にメインメモリ１００８と呼ばれる１つまたは複数のメモリモジュールも含み得る。例えば、プロセッサ１００４によって実行される情報および命令を格納するために、好ましくはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他のダイナミックメモリが使用され得る。プロセッサ１００４によって実行される命令の実行中に一時変数または他の中間情報を格納するために、メインメモリ１００８も使用され得る。コンピューティングコンポーネント１０００は、同様に、プロセッサ１００４への静的情報および命令を格納するためにバス１００２に結合した読み取り専用メモリ（「ＲＯＭ」）または他の静的記憶装置を含み得る。

コンピューティングコンポーネント１０００は、１つまたは複数の様々な形態の情報記憶メカニズム１０１０も含む場合が有り、これには例えば、メディアドライブ１０１２および記憶ユニットインターフェース１０２０が含まれ得る。メディアドライブ１０１２は、固定またはリムーバブル記憶媒体１０１４をサポートするドライブまたは他のメカニズムを含み得る。例えば、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、ＣＤもしくはＤＶＤドライブ（ＲもしくはＲＷ）、または他のリムーバブルもしくは固定メディアドライブが備えられている場合がある。したがって、記憶媒体１０１４には、例えば、ハードディスク、ソリッドステートドライブ、磁気テープ、カートリッジ、光ディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、もしくはブルーレイ、またはメディアドライブ１０１２によって読み取り、書き込み、またはアクセスされるその他の固定もしくはリムーバブルメディアが含まれ得る。これらの例が示すように、記憶媒体１０１４には、コンピュータソフトウェアまたはデータを記憶しているコンピュータ使用可能記憶媒体が含まれ得る。

代替例では、情報記憶メカニズム１０１０は、コンピュータプログラムまたは他の命令もしくはデータがコンピューティングコンポーネント１０００にロードされるようにする他の同様の手段を含み得る。そのような手段には、例えば、固定またはリムーバブル記憶ユニット１０２２およびインターフェース１０２０が含まれ得る。そのような記憶ユニット１０２２およびインターフェース１０２０の例には、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース、リムーバブルメモリ（例えば、フラッシュメモリまたは他のリムーバブルメモリモジュール）およびメモリスロット、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカード、ならびに他の固定またはリムーバブル記憶ユニット１０２２およびソフトウェアとデータが記憶ユニット１０２２からコンピューティングコンポーネント１０００に転送されるようにするインターフェース１０２０が含まれ得る。

コンピューティングコンポーネント１０００は、通信インターフェース１０２４も含み得る。通信インターフェース１０２４を使用して、ソフトウェアおよびデータがコンピューティングコンポーネント１０００と外部デバイスとの間で転送されるようにすることができる。通信インターフェース１０２４の例には、モデムまたはソフトモデム、ネットワークインターフェース（イーサネット、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＭｅｄｉａ、ＩＥＥＥ ８０２．ＸＸまたはその他のインターフェースなど）、通信ポート（例えば、ＵＳＢポート、ＩＲポート、ＲＳ２３２ポートＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）インターフェース、もしくはその他のポートなど）、またはその他の通信インターフェースが含まれる。通信インターフェース１０２４を介して転送されるソフトウェアおよびデータは、典型的には信号で伝送され、信号は電子、電磁気（光を含む）、または所与の通信インターフェース１０２４によって交換可能なその他の信号である。これらの信号は、チャネル１０２８を介して通信インターフェース１０２４に提供され得る。このチャネル１０２８は信号を伝送する場合があり、有線または無線の通信媒体を使用して実装される場合がある。チャネルのいくつかの例には、電話回線、セルラーリンク、ＲＦリンク、光リンク、ネットワークインターフェース、ローカルまたはワイドエリアネットワーク、およびその他の有線または無線通信チャネルが含まれる。

この文書では、「コンピュータ可読媒体」、「コンピュータ使用可能媒体」および「コンピュータプログラム媒体」という用語は、一般に、揮発性または不揮発性の非一時的なメディア、例えばメモリ１００８、記憶ユニット１０２２、およびメディア１０１４などを指すために使用される。コンピュータプログラム媒体またはコンピュータ使用可能媒体のこれらおよび他の様々な形態は、１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを実行するために処理デバイスに運ぶことに関与し得る。媒体上で具体化されるそのような命令は、一般に「コンピュータプログラムコード」または「コンピュータプログラム製品」（これらはコンピュータプログラムまたは他のグループ分けの形でグループ化され得る）と呼ばれる。実行されると、そのような命令は、コンピューティングモジュール１０００が本明細書で記載される本出願の特徴または機能を実行することを可能にする。

様々な例および実装形態に関して上記で説明したが、１つまたは複数の個々の実装形態で説明される様々な特徴、態様および機能は、それらが説明される特定の実装形態への適用可能性に限定されず、単独または様々な組み合わせでアプリケーションの１つまたは複数の他の実装形態に、そのような実装形態が記述されているかどうかに関わりなく、およびそのような機能が記述された実装形態の一部として提示されているかどうかに関わりなく適用され得ることを理解されたい。したがって、本出願の広さおよび範囲は、上記の例示的な実装形態のいずれによっても制限されるべきではない。

前述の概念の全ての組み合わせは（そのような概念が相互に矛盾しない限り）、本明細書で開示される本発明の主題の一部として考慮されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れるクレームされた主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される本発明の主題の一部であると考えられる。

特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」および「約」という用語は、処理の変動などによる小さな変動を記載および説明するために使用される。例えば、それらは±５％以下、例えば±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．２％以下、±０．１％以下、±０．０５％以下を指すことができる。

該当する範囲で、本明細書の「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、これらの用語で記述されたそれぞれの対象物を個別のエンティティとして示すために使用されているだけであり、本明細書で明示的に述べられていない限り、時系列の意味を含意するものではない。

この文書で使用されている用語およびフレーズ、ならびにそれらの変形形態は、特に明記されていない限り、限定的ではなくオープンエンドと解釈される必要がある。前述の例として：「含む」という用語は、「含むが、限定されない」などの意味として読まれる必要がある；「例」という用語は、議論中のアイテムの例のインスタンスを提供するために使用され、その網羅的または限定的なリストではない；「ａ」または「ａｎ」という用語は、「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」などを意味するものとして読まれる必要がある；「従来の」、「伝統的な」、「通常の」、「標準の」、「既知」などの形容詞、および同様の意味の用語は、記載されているアイテムを特定の期間に、または特定の時点で利用可能なアイテムに限定するものと解釈されるべきではなく、現在または将来いつでも利用可能であり得るまたは既知であり得る従来の、伝統的な、通常の、または標準の技術を包含するように読まれるべきである。同様に、この文書が当業者にとって明らかなまたは既知の技術に言及する場合、そのような技術は、現在または将来いつでも当業者にとって明らかなまたは既知の技術を包含する。

「１つまたは複数」、「少なくとも」、「ただし限定されない」などの広範な語句またはいくつかの例における他の同様のフレーズの存在は、そのような広義のフレーズが存在しない場合にはより狭いケースが意図または要求されることを意味するものと解釈されてはならない。

加えて、本明細書で説明される様々な実装形態は、例示的なブロック図、フローチャート、および他の図に関して説明される。当業者にはこの文書を読んだ後に明らかになるように、図示された実装形態およびそれらの様々な代替は、図示された例に限定されることなく実装され得る。例えば、ブロック図とそれに付随する説明は、特定のアーキテクチャまたは構成を強制するものと解釈されるべきではない。

本開示の様々な実装形態が上記で説明されたが、それらは例としてのみ提示されており、限定的ではないことを理解されたい。同様に、様々な図は、本開示の例示的なアーキテクチャまたは他の構成を示してもよく、これは、本開示に含めることができる特徴および機能の理解を助けるために行われる。本開示は、示された例示的なアーキテクチャまたは構成に限定されないが、所望の特徴は、様々な代替のアーキテクチャおよび構成を使用して実装され得る。実際、本開示の所望の特徴を実装するために、代替の機能的、論理的または物理的なパーティショニングおよび構成をどのように実装できるかは、当業者には明らかであろう。また、本明細書に示されているもの以外の多数の異なる構成要素名を様々なパーティションに適用することができる。さらに、フロー図、動作説明、および方法クレームに関して、本明細書で工程が提示される順序は、文脈が別段の指示をしない限り、様々な実装形態を実装して列挙された機能を同じ順序で実行することを強制するものではない。

Claims (21)

1. 生体試料をイメージングする方法であって、
   固定光回折格子を通して光を向ける工程と、
   前記固定光回折格子を通して向けられた前記光によって生成された光回折格子パターンを生体試料に投影する工程であって、前記生体試料の少なくとも一部が複数のナノウェル内に配置され、該複数のナノウェルが正方形パターンに配向された、工程と、
   前記生体試料をラインスキャンする工程と、
   前記生体試料を前記光回折格子パターンに対して移動させるか、前記固定光回折格子を通して向けられた前記光を移動させる工程と、
   前記生体試料を表す高解像度画像を再構成する工程と、
   を含む、方法。
2. 前記光が、２つの個別のレーザー源から出力される赤色および緑色波長の光を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記２つのレーザー源のそれぞれが、パルス方式で前記光を出力する、請求項２に記載の方法。
4. 前記生体試料のラインスキャンが、前記生体試料の照射をもたらす前記２つのレーザー源の励起時に、前記生体試料の一部の画像を取り込む工程を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記光回折格子パターンに対する前記生体試料の移動、または前記光回折格子パターンに対する前記光の移動により、前記光回折格子パターンの複数の位相シフトが生成される、請求項１に記載の方法。
6. 前記複数の位相シフトが、前記光回折格子パターンの少なくとも３つの位相シフトを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記光回折格子パターンが、前記生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルに対して少なくとも実質的に垂直に配向された複数の縦縞を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記フローセルの第１軸に沿った前記生体試料を表す情報が、前記フローセルを含む前記複数の細長いナノウェルと前記光回折格子パターンとの組み合わせによって生じる空間周波数に基づく解像度の増加に従って分解される、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１軸に少なくとも実質的に垂直である第２軸に沿った前記生体試料を表す情報が、増加していない解像度に従って分解される、請求項８に記載の方法。
10. 前記光回折格子パターンが、前記生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルと少なくとも実質的に平行に配向された複数の縦縞を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ラインスキャンが、前記複数の細長いナノウェルに沿った方向で実行される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記生体試料のラインスキャンが、前記生体試料の時間遅延積分ラインスキャンを含む、請求項１に記載の方法。
13. 少なくとも２つの波長の光線をそれぞれ放射する少なくとも２つのレーザー源と、
    固定光回折格子であって、放射光線が前記固定光回折格子を通過する際に光回折格子パターンを生成するように構成された、固定光回折格子と、
    ラインスキャンアセンブリであって、
    前記光回折格子パターンに対して生体試料を移動する工程、または、前記光回折格子パターンに対して前記少なくとも２つのレーザー源を移動する工程であって、前記生体試料の少なくとも一部が複数のナノウェル内に配置され、該複数のナノウェルが正方形パターンに配向された、工程と、
    前記生体試料の一部を表す複数の画像を取り込む工程と、
    前記複数の画像に基づいて、前記生体試料を表す高解像度画像を再構成する工程と、を行うためのラインスキャンアセンブリと、
    を備える、システム。
14. 前記ラインスキャンアセンブリが少なくとも２つのカメラを備え、各カメラが、前記生体試料を表す放出された蛍光を感知するように構成された少なくとも１つの画像センサーを有する、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記光回折格子パターンに対する前記生体試料の移動、または前記少なくとも２つのレーザー源の移動が、前記光回折格子パターンの複数の位相シフトを生成する、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記複数の位相シフトが、前記光回折格子パターンの少なくとも３つの位相シフトを含む、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記光回折格子パターンが、前記生体試料を含有するフローセルを含む複数の細長いナノウェルに対して配向された複数の縦縞を含む、請求項１３に記載のシステム。
18. 前記ラインスキャンアセンブリが、前記生体試料の一部を表す複数の画像を、前記複数の細長いナノウェルに沿った方向で取り込む、請求項１７に記載のシステム。
19. 前記少なくとも２つのレーザー源のそれぞれが、パルス方式で前記光線を放射する、請求項１３に記載のシステム。
20. 前記ラインスキャンアセンブリが、前記生体試料の蛍光をもたらす少なくとも２つのレーザー源の励起時に、前記生体試料の一部を表す複数の画像のそれぞれを取り込む、請求項１９に記載のシステム。
21. 生体試料をイメージングする方法であって、
    固定光回折格子を通して光を向ける工程であって、前記光が、２つの個別のレーザー源から出力される赤色および緑色波長の光を含み、前記２つのレーザー源のそれぞれが、パルス方式で前記光を出力する工程、と、
    前記固定光回折格子を通して向けられた前記光によって生成された光回折格子パターンを生体試料に投影する工程と、
    前記生体試料をラインスキャンする工程であって、前記生体試料のラインスキャンが、前記生体試料の照射をもたらす前記２つのレーザー源の励起時に、前記生体試料の一部の画像を取り込むことを含む工程と、
    前記生体試料を前記光回折格子パターンに対して移動させるか、前記固定光回折格子を通して向けられた前記光を移動させる工程と、
    前記生体試料を表す高解像度画像を再構成する工程と、
    を含む、方法。
    
    

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