BR112019027629B1

BR112019027629B1 - Método de formação de imagem de uma amostra biológica e sistema

Info

Publication number: BR112019027629B1
Application number: BR112019027629-7A
Authority: BR
Inventors: Minghao Guo
Original assignee: Illumina, Inc
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2023-05-09
Also published as: CA3066382C; RU2736104C1; TW202045923A; IL271090B1; TWI770530B; KR102306769B1; PT3628066T; TW201940877A; JP2020531795A; US20190226992A1; CN111094933A; EP3628066B1; LT3628066T; NL2020623B1; DK3628066T3; PL3628066T3; SG11201911592RA; MX2019014280A; AU2019211234A1; IL271090A

Abstract

Técnicas são descritas para reduzir o número de ângulos necessários na geração de imagens de iluminação estruturada de amostras biológicas através do uso de células de fluxo padronizadas, em que os nanopoços das células de fluxo padronizadas são dispostos em, por exemplo, uma matriz quadrada ou uma matriz assimétrica. Consequentemente, o número de imagens necessárias para resolver os detalhes das amostras biológicas é reduzido. Também são descritas técnicas para combinar imagens de iluminação estruturada com varredura de linha usando as células de fluxo padronizadas

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 62/621,570 depositado em 24 de janeiro de 2018 e intitulado "Microscopia de Iluminação Estruturada com Varredura de Linha" e o Pedido de Patente Holandês N2020623 depositado em 20 de março de 2018 e intitulado "Microscopia de Iluminação Estruturada com Varredura de linha". Todo o conteúdo de cada um dos pedidos mencionados acima é incorporado aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Numerosos avanços recentes no estudo da biologia se beneficiaram de métodos aprimorados para a análise e sequenciamento de ácidos nucléicos. Por exemplo, o Projeto Genoma Humano determinou a sequência completa do genoma humano que, espera-se, levará a novas descobertas em campos que vão do tratamento de doenças a avanços na ciência básica. Recentemente, várias novas tecnologias de sequenciamento de DNA foram baseadas na análise massivamente paralela de moléculas únicas não amplificadas ou amplificadas, na forma de arranjos planos ou em beads.

[003] A metodologia usada para analisar a sequência dos ácidos nucleicos nessas novas técnicas de sequenciamento é frequentemente baseada na detecção de nucleotídeos ou oligonucleotídeos fluorescentes. A Microscopia de Iluminação Estruturada (SIM) descreve uma dessas técnicas de sequenciamento pela qual a luz estruturada espacialmente (isto é, padronizada) pode ser usada para criar uma imagem de uma amostra, a fim de aumentar a resolução lateral do microscópio por um fator de dois ou mais. Durante a geração de imagens da amostra, as imagens da amostra podem ser obtidas em várias fases padrão (por exemplo, a 0°, 120° e 240°), com o procedimento repetido girando a orientação do padrão em torno do eixo óptico (por exemplo, por 60° e 120°). As imagens capturadas (por exemplo, nove imagens, uma imagem para cada ângulo de orientação em cada fase do padrão) podem ser montadas em uma única imagem tendo uma largura de banda de frequência espacial estendida. A imagem única pode ser retransformada no espaço real para gerar uma imagem com uma resolução mais alta do que normalmente pode ser resolvida pelo microscópio.

[004] Em concretizações típicas de sistemas SIM, um feixe de luz polarizado linearmente é direcionado através de uma grade de difração óptica que difrata o feixe em duas ou mais ordens separadas que podem ser projetadas na amostra refletida como um padrão de franja de interferência sinusoidal. Nessas concretizações, a orientação do padrão de grade de difração óptica projetada é controlada girando a grade de difração óptica em torno do eixo óptico, enquanto a fase do padrão é ajustada movendo a grade de difração óptica lateralmente através do eixo. Em tais sistemas, a grade de difração óptica é montada em um estágio de translação, que por sua vez é montado em um estágio de rotação. Além disso, esses sistemas usam um polarizador linear para polarizar a luz emitida pela fonte de luz antes de ser recebida na grade.

[005] A FIG. 1A ilustra um exemplo de uma amostra (100) e um padrão de grade de difração óptica (102) projetada na amostra (100). Embora a amostra (100) possa compreender, frequências espaciais mais altas não resolvíveis, a sobreposição do padrão de grade de difração óptica (102) que tem uma frequência espacial conhecida e mais baixa na amostra (100) resulta em franjas de Moiré. Isso efetivamente move as frequências espaciais mais altas e não resolvíveis para as frequências espaciais mais baixas que são resolvidas por um microscópio. Como descrito acima, capturar imagens da amostra (100) com diferentes orientações/ângulos e fases do padrão de grade de difração óptica (102) em relação à amostra (100), resulta em imagens que podem ser combinadas em uma única imagem que é retransformada no espaço real para gerar uma imagem tendo uma resolução maior.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Exemplos de sistemas e métodos aqui divulgados são direcionados a técnicas para reduzir o número de imagens e dimensões necessárias para resolver amostras fluorescentes usando SIM através de células de fluxo particularmente padronizadas e a alavancagem do movimento do feixe de luz em relação às amostras fluorescentes para alcançar uma concretização do SIM que pode ser usado com técnicas de varredura de linha.

[007] De acordo com uma concretização, um método de geração de imagens de uma amostra biológica compreende direcionar a luz através de uma grade de difração óptica estacionária e projetar um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz sendo direcionada através da grade de difração óptica estacionária para a amostra biológica. O método pode ainda compreender a varredura em linha da amostra biológica e o movimento da amostra biológica em relação ao padrão de grade de difração óptica ou o movimento da luz sendo direcionada através da grade de difração óptica estacionária. Além disso, o método pode compreender a reconstrução de uma imagem de alta resolução representativa da amostra biológica.

[008] Em alguns exemplos, a luz compreende luz nos comprimentos de onda vermelho e verde emitidos por duas respectivas fontes de laser. Cada uma das duas fontes de laser pode emitir a luz de maneira pulsada. Em alguns exemplos, a varredura de linha da amostra biológica compreende capturar uma imagem de uma porção da amostra biológica mediante excitação das duas fontes de laser, resultando em iluminação da amostra biológica.

[009] Em algumas concretizações, o movimento da amostra biológica em relação ao padrão de grade de difração óptica ou o movimento da luz em relação ao padrão de grade de difração óptica gera uma pluralidade de mudanças de fase do padrão de grade de difração óptica.

[010] Em algumas concretizações, a pluralidade de mudanças de fase compreende, pelo menos, três mudanças de fase do padrão de grade de difração óptica.

[011] Em algumas concretizações, o padrão de grade de difração óptica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas, pelo menos, substancialmente perpendicularmente a uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica. Informações representativas da amostra biológica ao longo de um primeiro eixo da célula de fluxo podem ser resolvidas de acordo com um aumento de resolução com base em uma frequência espacial criada por uma combinação da pluralidade de nanopoços alongados compreendendo a célula de fluxo e o padrão de grade de difração óptica. Informações representativas da amostra biológica ao longo de um segundo eixo que é, pelo menos, substancialmente perpendicular ao primeiro eixo podem ser resolvidas de acordo com uma resolução não aumentada.

[012] Em alguns exemplos, o padrão de grade de difração óptica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas, pelo menos, substancialmente em paralelo com uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica. A varredura de linha pode ser realizada ao longo de uma direção alinhada com a pluralidade de nanopoços alongados.

[013] Em algumas concretizações, a varredura de linha da amostra biológica compreende uma varredura de linha de integração com atraso de tempo da amostra biológica.

[014] De acordo com outro exemplo, um sistema pode compreender, pelo menos, duas fontes de laser que emitem feixes de luz em, pelo menos, dois comprimentos de onda, respectivamente, e uma grade de difração óptica estacionária adaptada para gerar um padrão de grade de difração óptica após a passagem dos feixes de luz emitidos através da grade de difração óptica estacionária. Além disso, o sistema pode compreender a montagem de varredura de linha para: mover uma amostra biológica em relação ao padrão de grade de difração óptica; ou mover, pelo menos, as duas fontes de laser em relação ao padrão de grade de difração óptica; capturar uma pluralidade de imagens representativas de porções da amostra biológica; e reconstruir uma imagem de alta resolução representativa da amostra biológica com base na pluralidade de imagens.

[015] Em alguns exemplos, o conjunto de varredura de linha compreende, pelo menos, duas câmeras, cada uma tendo, pelo menos, um sensor de imagem adaptado para detectar a amostra biológica fluorescente. O movimento da amostra biológica em relação ao padrão de grade de difração óptica ou o movimento de, pelo menos, duas fontes de laser podem gerar uma pluralidade de mudanças de fase do padrão de grade de difração óptica. A pluralidade de mudanças de fase pode compreender, pelo menos, três mudanças de fase do padrão de grade de difração óptica. O padrão de grade de difração óptica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas em relação a uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica.

[016] Em alguns exemplos, conjunto de varredura de linha captura a pluralidade de imagens representativas das porções da amostra biológica ao longo de uma direção alinhada com a pluralidade de nanopoços alongados. Em alguns exemplos, cada uma das pelo menos, duas fontes de laser emite os feixes de luz de maneira pulsada. Em alguns exemplos, a montagem de varredura de linha captura cada uma das várias de imagens representativas das porções da amostra biológica por excitação de, pelo menos, duas fontes de laser, resultando em fluorescência da amostra biológica.

[017] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores e conceitos adicionais discutidos em mais detalhes abaixo (desde que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) sejam contemplados como parte do objeto inventivo divulgado neste documento. Em particular, todas as combinações da matéria reivindicada que aparecem no final desta divulgação são contempladas como parte do objeto inventivo divulgado neste documento.

[018] Outras características e aspectos da tecnologia divulgada tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, a título de exemplo, as características de acordo com as concretizações da tecnologia divulgada. O sumário não se destina a limitar o escopo de quaisquer invenções aqui descritas, que são definidas pelas reivindicações e equivalentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] A presente divulgação, de acordo com uma ou mais concretizações, é descrita em detalhes com referência às figuras a seguir. As figuras são fornecidas apenas para fins ilustrativos e apenas representam concretizações típicas ou de exemplo.

[020] A FIG. 1A ilustra um exemplo de iluminação estruturada sendo usada para diminuir o padrão de frequência de uma amostra, permitindo maior resolução.

[021] A FIG. 1B ilustra, em um exemplo, o número de ângulos necessários para resolver uma amostra para geração de imagens.

[022] A FIG. 2 ilustra um exemplo de um sistema de imagem de iluminação estruturado.

[023] A FIG. 3A ilustra um exemplo de um padrão de célula de fluxo hexagonal.

[024] A FIG. 3B ilustra um exemplo de um padrão de célula de fluxo de arranjo quadrado, cujo uso resulta em imagens de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[025] A FIG. 3C ilustra um exemplo de um padrão de célula de fluxo de arranjo assimétrico, cujo uso resulta em imagens de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[026] A FIG. 4 é um diagrama de fluxo que ilustra operações de exemplo que podem ser concretizadas para geração de imagens de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[027] A FIG. 5 ilustra um exemplo de um sistema de imagem de varredura de linha.

[028] As FIGS. 6A-6C ilustram, em um exemplo, mudança de fase de um padrão de iluminação estruturado em uma dimensão.

[029] A FIG. 6D ilustra um exemplo de uma célula de fluxo padronizada assimetricamente, com diferentes porções sobrepostas simultaneamente com padrões de iluminação estruturados com fase deslocada

[030] A FIG. 7 ilustra um exemplo de uma operação de varredura de linha usando uma célula de fluxo convencionalmente padronizada.

[031] A FIG. 8 ilustra um exemplo de um sistema de imagem de varredura de linha usando um padrão de iluminação estruturado estacionário.

[032] A FIG. 9 ilustra um exemplo de uma operação de varredura de linha usando um padrão de iluminação estruturado estacionário que modula um feixe de luz de iluminação.

[033] A FIG. 10 é um fluxograma que ilustra operações de exemplo que podem ser concretizados para imagens de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida usadas em conjunto com imagens de varredura de linha.

[034] A FIG. 11 ilustra um componente de computação de exemplo que pode ser usado para concretizar várias características das concretizações descritas na presente divulgação.

[035] Os números não são exaustivos e não limitam a presente divulgação à forma precisa divulgada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[036] Como aqui utilizado para se referir à luz difratada emitida por uma grade de difração, o termo "ordem" ou "número da ordem" pretende significar o número de comprimentos de onda inteiros que representam a diferença de comprimento do caminho da luz das fendas adjacentes da grade de difração para interferência construtiva. O termo “ordem zero” ou “ordem máxima zero” se refere à franja brilhante central emitida por uma grade de difração na qual não há difração. O termo “primeira ordem” pretende se referir às duas franjas brilhantes emitidas em ambos os lados da franja de ordem zero, onde a diferença de comprimento do caminho é de ± 1 comprimentos de onda.

[037] Como aqui utilizado para se referir a uma amostra, o termo "ponto" ou "característica" pretende significar um ponto ou área em um padrão que pode ser diferenciado de outros pontos ou áreas de acordo com a localização relativa. Um ponto individual pode incluir uma ou mais moléculas de um tipo particular. Por exemplo, um ponto pode incluir uma molécula de ácido nucleico alvo única com uma sequência particular ou um ponto pode incluir várias moléculas de ácido nucleico com a mesma sequência (e/ou sequência complementar da mesma).

[038] Como usado aqui, o termo "bloco" geralmente se refere a uma ou mais imagens da mesma região de uma amostra, onde cada uma ou mais imagens representam um respectivo canal de cores. Um bloco pode formar um subconjunto de dados de imagem de um conjunto de dados de imagem de um ciclo de imagem.

[039] Como aqui utilizado, o termo "plano x-y" pretende significar uma área bidimensional definida pelos eixos das retas x e y em um sistema de coordenadas cartesianas. Quando usada em referência a um detector e a um objeto observado pelo detector, a área pode ser ainda especificada como sendo ortogonal à direção da observação entre o detector e o objeto sendo detectado. Quando usado aqui para se referir a uma varredura de linha, o termo "direção y" refere-se à direção da varredura.

[040] Como aqui utilizado, o termo "coordenada z" destina-se significar informações que especificam a localização de um ponto, linha ou área ao longo de um eixo que é ortogonal a um plano x-y. Em concretizações particulares, o eixo z é ortogonal a uma área de um objeto que é observado por um detector. Por exemplo, a direção do foco para um sistema óptico pode ser especificada ao longo do eixo z.

[041] Como usado aqui, o termo "varredura de uma linha" destina-se significar a detecção de uma seção transversal bidimensional no plano x-y de um objeto, a seção transversal sendo retangular ou oblonga e causando movimento relativo entre a seção transversal e o objeto. Por exemplo, no caso de imagens por fluorescência, uma área de um objeto com formato retangular ou oblongo pode ser especificamente excitada (com exclusão de outras áreas) e/ou a emissão da área pode ser especificamente adquirida (com exclusão de outras áreas) em um determinado momento da verificação.

[042] As concretizações divulgadas aqui são direcionadas para células de fluxo configuradas para ter padrões quadrados ou assimétricos. Lembre-se de que o SIM depende da luz espacialmente estruturada (isto é, padronizada) para criar uma imagem de uma amostra, a fim de aumentar a resolução lateral do microscópio por um fator de dois ou mais. Lembre-se também de que tradicionalmente, imagens da amostra em múltiplas fases do padrão e múltiplas orientações/ângulos são usadas para alcançar o aumento desejado na resolução lateral.

[043] A FIG. 1B ilustra geralmente, em um exemplo, a região observável do espaço recíproco produzido por uma objetiva de microscópio (que é análoga ao seu padrão de difração) e como é limitada nas bordas pelas frequências espaciais mais altas que a objetiva pode transmitir (2NA/À(gráfico 120). Como ilustrado, um ponto central representa o componente de ordem zero. Os componentes de difração de ordem zero e primeira ordem representam um padrão de linhas paralelas são ilustrados no gráfico 122. Se os espaçamentos do padrão estiverem nos limites de resolução, os pontos de primeira ordem ocorrem na borda do campo observável (no limite k0). Devido à mistura de frequências, as regiões observáveis também contêm, em adição a imagem normal das frequências espaciais (círculo central), duas novas imagens de frequência de deslocamento (gráfico 124) que estão centralizadas na borda do campo original. Essas imagens de deslocamento contêm frequências espaciais mais altas que não são observáveis usando microscópios convencionais. Como ilustrado pelo gráfico 126, um conjunto de imagens preparadas a partir de três fases com orientações de 120°, finalmente após o processamento, produz uma imagem real que contém o dobro da resolução espacial, como pode ser observado na microscopia de fluorescência de campo amplo.

[044] No entanto, configurando as células de fluxo para terem padrões quadrados ou assimétricos (em vez de padrões hexagonais, por exemplo), são necessárias menos imagens para obter o mesmo aumento na resolução lateral. Ou seja, células de fluxo com padrões quadrados ou assimétricos de nanopoços permitem que o eixo/eixos de uma célula de fluxo com um pitch mais apertado (ou seja, a distância entre nanopoços imediatamente adjacentes) e envolvendo resolução aumentada, seja alinhado com o eixo/eixos cuja resolução deve ser aumentada. Em um exemplo de célula de fluxo quadrada padronizada, maior resolução é necessária apenas em relação a dois eixos. Assim, são necessárias apenas seis imagens (uma imagem em cada um dos dois ângulos em três fases). No caso de uma célula de fluxo com padrão assimétrico, são necessárias apenas três imagens de uma amostra para obter maior resolução (uma imagem em um ângulo em três fases).

[045] Ao reduzir o número de ângulos necessários para resolver uma amostra no grau desejado, o número de imagens necessárias para concluir a geração de imagens da amostra é reduzido. Por exemplo, no contexto da química de 4 corantes, um sistema pode precisar adquirir 36 imagens para gerar 4 imagens para chamadas de base (explicadas abaixo). A quantidade de espaço de armazenamento (por exemplo, disco) necessária para armazenar ou armazenar em cache as imagens capturadas também pode ser reduzida. Além disso, o processamento e/ou o poder computacional necessário para montar as imagens em uma única imagem e depois retransformar/reconstruir essa imagem única em uma com a resolução desejada também pode ser reduzida.

[046] Além disso, as concretizações convencionais do SIM são incompatíveis com os sistemas de sequenciamento que utilizam técnicas de varredura de linha para criar imagens de uma amostra. A varredura de linha pode se referir ao uso de uma linha de pixels que cria uma imagem de uma célula de fluxo linha por linha para criar uma imagem contínua (em oposição a uma câmera ou sensor com um arranjo bidimensional de pixels que captura uma imagem estática de um objeto inteiro, por exemplo, uma célula de fluxo). Um tipo particular de varredura de linha que se presta a sistemas de sequenciamento é a varredura de linha de integração com atraso de tempo (TDI).

[047] Com concretizações SIM multi-ângulo, é necessário um campo de visão fixo para adquirir cada uma das combinações de imagem de ângulo/fase. No entanto, quando as imagens são tiradas com relação a apenas um único ângulo, como é o caso das concretizações aqui divulgadas, nas quais uma célula de fluxo padronizada assimetricamente é usada como substrato de amostra, a varredura de linha TDI pode ser usada para capturar imagens da amostra que cobre as três fases do padrão SIM. Ou seja, um padrão SIM pode ser movido em relação à célula de fluxo padronizada assimetricamente para gerar as três fases necessárias para resolver a amostra na célula de fluxo com resolução aumentada em apenas um eixo.

[048] Em algumas concretizações, a varredura de linha TDI pode ser usada em conjunto com as técnicas SIM para criar imagens de uma amostra usando uma câmera ou sensor de varredura de linha TDI para capturar uma imagem ao longo de uma célula de fluxo (denominada “faixa”). Ou seja, a varredura de linha TDI pode ser realizada em uma célula de fluxo padronizada com um padrão SIM em uma primeira fase. O padrão SIM pode ser alterado para uma segunda fase e a varredura de linha TDI pode ser repetida. O padrão SIM pode ser alterado para uma terceira frase e a varredura de linha TDI pode ser repetida novamente. Dessa maneira, as imagens da amostra em cada fase do padrão são capturadas.

[049] Alternativamente, diferentes partes da célula de fluxo podem ser padronizadas com diferentes fases do padrão SIM. Por exemplo, em uma primeira parte da célula de fluxo, o padrão SIM pode ser localizado em uma primeira posição, em uma segunda porção da célula de fluxo, o padrão SIM pode ser deslocado para uma segunda posição e em uma terceira porção da célula de fluxo, o padrão SIM pode ser deslocado para uma terceira posição. Assim, conforme a câmera ou o sensor captura a faixa, as imagens da amostra em cada uma das três fases do padrão SIM são capturadas em uma única varredura de linha TDI.

[050] Ainda em outras concretizações, em vez de alterar o padrão SIM em relação à amostra/célula de fluxo, a amostra/célula de fluxo é movida enquanto o padrão SIM permanece estacionário. Entende-se que a amostra está localizada/colocada na célula de fluxo, resultando na padronização da amostra de acordo com os nanopoços que compõem a célula de fluxo. Ao concretizar a varredura de linha TDI, como observado acima, a amostra/célula de fluxo já está em movimento. Portanto, esse movimento da amostra/célula de fluxo pode ser alavancado para evitar a necessidade de mudar o padrão do SIM. Ou seja, o movimento da amostra/célula de fluxo em relação ao padrão SIM estacionário (dada a orientação apropriada) gera as fases necessárias para resolver a amostra.

[051] Antes de descrever várias concretizações dos sistemas e métodos aqui divulgados em detalhes, é útil descrever um exemplo de ambiente com o qual a tecnologia aqui divulgada pode ser concretizada. Um exemplo de ambiente é o de um sistema estruturado de geração de imagens de iluminação 200, ilustrado na FIG. 2, que ilumina uma amostra com luz espacialmente estruturada. Por exemplo, o sistema 200 pode ser um sistema de microscopia de fluorescência de iluminação estruturada que utiliza luz de excitação estruturada espacialmente para gerar imagens de uma amostra biológica.

[052] No exemplo da FIG. 2, um emissor de luz 250 é configurado para emitir um feixe de luz que é colimado pela lente de colimação 251. A luz colimada é estruturada (padronizada) pela montagem óptica de estruturação da luz 255 e direcionada pelo espelho dicróico 260 através da lente objetiva 242 para uma amostra de um recipiente de amostra 210, que está posicionado no estágio 270. No caso de uma amostra fluorescente, a amostra fluorescente em resposta à luz de excitação estruturada, e a luz resultante é coletada por lente objetiva 242 e direcionada para um sensor de imagem do sistema de câmera 240 para detectar fluorescência.

[053] A montagem óptica de estruturação de luz 255 em várias concretizações, ainda descrito abaixo, inclui uma ou mais grades de difração óptica para gerar um padrão sinusoidal de luz difratada (por exemplo, franjas) que é projetada nas amostras de um recipiente de amostra 210. As grades de difração podem ser grades unidimensionais ou bidimensionais transmissivas, reflexivas ou de fase. Conforme descrito abaixo com referência a concretizações particulares, no sistema 200 as grades de difração não envolvem necessariamente um estágio de rotação. Em algumas concretizações, as grades de difração podem ser fixadas (por exemplo, não giradas ou movidas linearmente) durante a operação do sistema de imagem. Por exemplo, em uma concretização particular, ainda descrita abaixo, as grades de difração podem incluir duas grades de difração transmissivas unidimensionais fixas orientadas substancialmente ou exatamente/perfeitamente perpendiculares uma à outra (por exemplo, uma grade de difração horizontal e uma grade de difração vertical).

[054] Durante cada ciclo de geração de imagens, o sistema 200 utiliza a montagem óptica de estruturação de luz 255 para adquirir uma pluralidade de imagens em várias fases, deslocadas lateralmente ao longo do plano de amostra (por exemplo, ao longo do plano x-y), com este procedimento repetido uma ou mais vezes girando a orientação do padrão em relação ao eixo óptico (ou seja, com relação ao plano x-y da amostra). As imagens capturadas podem então ser reconstruídas espacialmente para gerar uma imagem de resolução mais alta (por exemplo, uma imagem com cerca de duas vezes a resolução espacial lateral de imagens individuais).

[055] No sistema 200, o emissor de luz 250 pode ser um emissor de luz incoerente (por exemplo, emitir feixes de luz emitidos por um ou mais diodos de excitação) ou um emissor de luz coerente, como emissor de saída de luz por um ou mais lasers ou diodos a laser. Como ilustrado no exemplo do sistema 200, o emissor de luz 250 inclui uma fibra óptica 252 para guiar um feixe óptico a ser emitido. No entanto, outras configurações de um emissor de luz 250 podem ser usadas. Em concretizações que utilizam iluminação estruturada em um sistema de imagem multicanal (por exemplo, um microscópio de fluorescência multicanal que utiliza múltiplos comprimentos de onda da luz), a fibra óptica 252 pode acoplar opticamente a uma pluralidade de fontes de luz diferentes (não mostradas), cada fonte de luz emitindo luz de um comprimento de onda diferente. Embora o sistema 200 seja ilustrado como tendo um único emissor de luz 250, em algumas concretizações múltiplos emissores de luz 250 podem ser incluídos. Por exemplo, múltiplos emissores de luz podem ser incluídos no caso de um sistema estruturado de geração de imagens de iluminação que utiliza múltiplos braços, discutido mais adiante. Por exemplo, pode ser emitida luz correspondente a diferentes comprimentos de onda, como azul, verde, vermelho ou outras cores. Em alguns exemplos, um emissor/fonte de luz pode ser usado. Em alguns exemplos, dois ou mais emissores/fontes de luz podem ser usados.

[056] Em algumas concretizações, o sistema 200 pode incluir uma lente de tubo 256 que pode incluir um elemento de lente para articular ao longo do eixo z para ajustar a forma e o caminho do feixe estruturado. Por exemplo, um componente da lente do tubo pode ser articulado para explicar uma gama de espessuras de amostra (por exemplo, diferentes espessuras de lamínulas de vidro) da amostra no recipiente 210.

[057] No exemplo do sistema 200, o módulo ou dispositivo de entrega de fluido 290 pode direcionar o fluxo de reagentes (por exemplo, nucleotídeos marcados com fluorescência, tampões, enzimas, reagentes de clivagem, etc.) para (e através) o recipiente de amostra 210 e a válvula de descarte 220. O recipiente de amostra 210 pode incluir um ou mais substratos sobre os quais as amostras são fornecidas. Por exemplo, no caso de um sistema para analisar um grande número de diferentes sequências de ácidos nucleicos, o recipiente de amostra 210 pode incluir um ou mais substratos nos quais os ácidos nucleicos a serem sequenciados estão ligados, aderidos ou associados. O substrato pode incluir qualquer substrato inerte ou matriz à qual os ácidos nucleicos possam ser aderidos, como por exemplo superfícies de vidro, superfícies de plástico, látex, dextrano, superfícies de poliestireno, superfícies de polipropileno, géis de poliacrilamida, superfícies de ouro e pastilhas de silício. Em algumas concretizações, o substrato está dentro de um canal ou outra área em uma pluralidade de locais formados em uma matriz ou arranjo através do recipiente de amostra 210. O sistema 200 também pode incluir um atuador de estação de temperatura 230 e aquecedor/resfriador 235 que pode opcionalmente regular a temperatura das condições dos fluidos dentro do recipiente de amostra 210.

[058] Em concretizações particulares, o recipiente de amostra 210 pode ser concretizado como uma célula de fluxo padronizada incluindo uma placa de cobertura translúcida, um substrato e um líquido contido entre elas, e uma amostra biológica pode estar localizada em uma superfície interna da placa de cobertura translúcida ou uma superfície interna do substrato. A célula de fluxo pode incluir um grande número (por exemplo, milhares, milhões ou bilhões ou mais) de poços ou regiões que são padronizados em um arranjo definido (por exemplo, um arranjo hexagonal, arranjo retangular, etc.) no substrato. Cada região pode formar um aglomerado (por exemplo, um aglomerado monoclonal) de uma amostra biológica como DNA, RNA ou outro material genômico que pode ser sequenciado, por exemplo, usando sequenciamento por síntese. A célula de fluxo pode ser ainda dividida em um número de lanes espaçadas (por exemplo, oito lanes), cada lane incluindo um arranjo hexagonal de aglomerados.

[059] O recipiente de amostra 210 pode ser montado em um estágio de amostra 270 para fornecer movimento e alinhamento do recipiente de amostra 210 em relação à lente objetiva 242. O estágio de amostra pode ter um ou mais atuadores para permitir que ele se mova em qualquer uma das três dimensões. Por exemplo, em termos do sistema de coordenadas cartesianas, os atuadores podem ser fornecidos para permitir que o estágio se mova nas direções X, Y e Z em relação à lente objetiva. Isso pode permitir que um ou mais locais de amostra no recipiente de amostra 210 sejam posicionados em alinhamento óptico com a lente objetiva 242. O movimento do estágio de amostra 270 em relação à lente objetiva 242 pode ser alcançado movendo o próprio estágio de amostra, a lente objetiva, algum outro componente do sistema de imagem ou qualquer combinação dos itens anteriores. Outras concretizações também podem incluir mover todo o sistema de imagem sobre uma amostra estacionária. Alternativamente, o recipiente de amostra 210 pode ser fixado durante a geração de imagens.

[060] Em algumas concretizações, um componente de foco (eixo z) 275 pode ser incluído para controlar o posicionamento dos componentes ópticos em relação ao recipiente de amostra 210 na direção do foco (normalmente referido como eixo z ou direção z). O componente de foco 275 pode incluir um ou mais atuadores fisicamente acoplados ao estágio óptico ou ao estágio de amostra, ou ambos, para mover o recipiente de amostra 210 no estágio de amostra 270 em relação aos componentes ópticos (por exemplo, a lente objetiva 242) para fornecer foco adequado para a operação de imagem. Por exemplo, o atuador pode ser fisicamente acoplado ao estágio respectivo, como, por exemplo, por ligação mecânica, magnética, fluídica ou outra ou contato direto ou indireto com o estágio. Um ou mais atuadores podem ser configurados para mover o estágio na direção z, mantendo o estágio de amostra no mesmo plano (por exemplo, mantendo uma atitude nivelada ou horizontal, substancialmente ou perfeitamente perpendicular ao eixo óptico). Pode-se apreciar que perfeita perpendicularidade, paralelismo ou outra orientação pode não ser alcançável de acordo com alguns exemplos ou concretizações devido a, por exemplo, tolerâncias de fabricação, limitações operacionais, etc. No entanto, para os fins das tecnologias aqui divulgadas, orientação substancialmente perpendicular, paralela ou outra é entendida como significando uma orientação suficiente para alcançar uma resolução desejada ou outro efeito relevante, conforme descrito e/ou contemplado neste documento. Um ou mais atuadores também podem ser configurados para inclinar o estágio. Isso pode ser feito, por exemplo, para que o recipiente de amostra 210 possa ser nivelado dinamicamente para dar conta de qualquer inclinação em suas superfícies.

[061] A luz estruturada que emana de uma amostra de teste em um local de amostra que está sendo fotografado pode ser direcionada através do espelho dicróico 260 para um ou mais detectores do sistema de câmeras 240. Em algumas concretizações, uma montagem de comutação de filtro 265 com um ou mais filtros de emissão pode estar incluído, onde os um ou mais filtros de emissão podem ser usados para passar por comprimentos de onda de emissão particular e bloquear (ou refletir) outros comprimentos de onda. Por exemplo, um ou mais filtros de emissão podem ser usados para alternar entre diferentes canais do sistema de imagem. Em uma concretização particular, os filtros de emissão podem ser concretizados como espelhos dicróicos que direcionam a emissão de luz de diferentes comprimentos de onda para diferentes sensores de imagem do sistema de câmera 240.

[062] O sistema de câmera 240 pode incluir um ou mais sensores de imagem para monitorar e rastrear a imagem (por exemplo, sequenciamento) do recipiente de amostra 210. O sistema de câmera 240 pode ser concretizado, por exemplo, como uma câmera sensor de imagem de dispositivo acoplado a carga (CCD), mas outras tecnologias de sensor de imagem (por exemplo, sensor de pixel ativo) podem ser usadas. Os dados de saída (por exemplo, imagens) do sistema de câmera 240 podem ser comunicados a um módulo de análise em tempo real (não mostrado) que pode ser concretizado como um pedido de software que, conforme descrito a seguir, pode reconstruir as imagens capturadas durante cada ciclo de criação de imagens para criar uma imagem com uma resolução espacial mais alta. Como será descrito abaixo, o sistema de câmera 240 também pode ser concretizado como uma câmera CCD TDI para efetivar técnicas de varredura de linha.

[063] Embora não ilustrado, um controlador pode ser fornecido para controlar a operação do sistema de imagens de iluminação estruturada 200, incluindo a sincronização dos vários componentes ópticos do sistema 200. O controlador pode ser concretizado para controlar aspectos da operação do sistema, como, por exemplo, configuração da montagem óptica de estruturação de luz 255 (por exemplo, seleção e/ou tradução linear de grades de difração), movimento da lente de tubo 256, focalização, movimento de estágio e operações de imagem. Em várias concretizações, o controlador pode ser concretizado usando hardware, algoritmos (por exemplo, instruções executáveis por máquina) ou uma combinação dos itens anteriores. Por exemplo, em algumas concretizações, o controlador pode incluir uma ou mais CPUs ou processadores com memória associada. Como outro exemplo, o controlador pode compreender hardware ou outros circuitos para controlar a operação, como um processador de computador e um meio legível por computador não transitório com instruções legíveis por máquina armazenadas no mesmo. Por exemplo, esse circuito pode incluir um ou mais dos seguintes itens: arranjo de porta programável em campo (FPGA), circuito integrado específico de aplicação (ASIC), dispositivo lógico programável (PLD), dispositivo lógico programável complexo (CPLD), um arranjo lógico programável (PLA), lógico arranjo programável (PAL) ou outro dispositivo ou circuito de processamento similar. Como outro exemplo, o controlador pode compreender uma combinação desse circuito com um ou mais processadores.

[064] A FIG. 3A ilustra um exemplo de configuração de uma célula de fluxo padronizada 300 que pode ser visualizada de acordo com as concretizações divulgadas neste documento. Neste exemplo, a célula de fluxo 300 é padronizada com um arranjo hexagonal (ver 304) de pontos ou características ordenadas 302 que podem ser visualizados simultaneamente durante uma execução de imagem. Para facilitar a ilustração, a célula de fluxo 300 é ilustrada como tendo dezenas a centenas de pontos 302. No entanto, como pode ser apreciado por um técnico versado no assunto, a célula de fluxo 300 pode ter milhares, milhões ou bilhões de pontos 302 que são fotografados. Além disso, em alguns casos, a célula de fluxo 300 pode ser uma amostra de multiplanos compreendendo múltiplos planos (substancialmente ou perfeitamente perpendicular à direção do foco) dos pontos 302 que são amostrados durante uma execução de imagem. Em uma concretização particular, a célula de fluxo 300 pode ser padronizada com milhões ou bilhões de poços que são divididos em lanes. Nesta concretização particular, cada poço da célula de fluxo pode conter material biológico que é sequenciado usando o sequenciamento por síntese.

[065] Como mencionado acima, em alguns exemplos, a fim de resolver uma amostra usando a célula de fluxo padronizada 300, são necessárias, pelo menos, nove imagens para alcançar a resolução necessária. Isso ocorre porque o arranjo hexagonal de nanopoços na célula de fluxo padronizada 300 é um padrão de alta frequência, em que o pitch entre os nanopoços é apertado e não solucionável. Em particular, neste exemplo, existem dois fatores que podem determinar quantas imagens são necessárias para resolver suficientemente uma amostra.

[066] O primeiro fator é o número de cópias da banda passante óptica desejadas. Voltando à FIG. 1B, o gráfico 122 mostra a banda passante normal sem o uso do SIM. O gráfico 124 ilustra um exemplo em que uma cópia da banda passante óptica é criada. Isso pode melhorar a resolução em uma dimensão, enquanto o gráfico 126/gráfico 306 (FIG. 3A) ilustra um exemplo em que são criadas três cópias da banda passante óptica, o que resulta em uma melhoria de resolução bastante uniforme em duas dimensões.

[067] O segundo fator é o número de imagens usadas para desmodular fases para cada banda passante óptica. Embora teoricamente sejam necessárias apenas duas imagens (para obter as partes reais e imaginárias), três imagens são normalmente usadas para obter uma melhor média de ruído.

[068] Deve-se entender que, ao converter uma imagem da frequência espacial para o espaço de Fourier (a análise dos dados brutos gerados por um microscópio no plano focal posterior objetivo é baseada na análise de Fourier), a transformação de Fourier contém 3 componentes ou eixos. Ou seja, a difração da luz no plano focal posterior objetivo cria uma barreira de difração que determina uma resolução máxima de aproximadamente 200 nm na dimensão lateral (x, y) e 500 nm na dimensão axial (z), dependendo da abertura numérica objetiva e o comprimento de onda média da iluminação. Por conseguinte, ao usar o arranjo hexagonal de nanopoços em células de fluxo padronizadas 300, imagens são tiradas em três ângulos usando SIM. Como também discutido acima, para obter a resolução necessária, as imagens devem ser capturadas em três fases em cada um dos três ângulos, onde as três fases são necessárias para garantir que todas as partes na área de imagem sejam observadas (ou seja, para cobrir todo o comprimento de onda do padrão SIM), resultando em nove imagens. Isso resulta em maior resolução nos três eixos 308.

[069] No entanto, em um exemplo, usando outro tipo de célula de fluxo padronizada, por exemplo, uma célula de fluxo 310, em que os nanopoços 312 são padronizadas em um arranjo quadrado (ver 314), são necessários apenas dois ângulos para obter maior resolução, sendo a maior resolução alinhada ao longo dos eixos do arranjo quadrado. O gráfico 316 ilustra um exemplo disso, onde apenas duas cópias da banda passante óptica são criadas e necessárias para alcançar o aumento de resolução necessário. Em outras palavras, uma célula de fluxo padronizada quadrada, como a célula de fluxo 310, pode ser resolvida alinhando o padrão SIM ou a franja às direções nas quais é desejado um aumento na resolução, neste caso, ao longo dos dois eixos (x e y) do arranjo quadrado. Pode-se apreciar que, ao longo de qualquer caminho diagonal entre os nanopoços vizinhos 312, haverá algum aprimoramento da resolução, de modo que os nanopoços vizinhos na diagonal sejam resolvíveis um do outro. No entanto, entre os nanopoços 312 ao longo dos eixos x e y, o pitch (Px, Py) é estreito o suficiente para que a resolução precise ser aumentada usando SIM, ou seja, a frequência espacial nos eixos x e y é muito alta para ser resolvida.

[070] Ao usar uma célula de fluxo padronizada quadrada, como a célula de fluxo 310, o requisito de dimensionalidade dos sistemas de sequenciamento convencionais usando SIM pode ser reduzido em uma dimensão, em que a resolução é aumentada em apenas dois eixos 318. Ou seja, em vez de capturar nove imagens que cobrem três ângulos em três fases cada, apenas seis imagens que abrangem dois ângulos em três fases precisam ser capturadas para resolver adequadamente uma amostra contida na célula de fluxo 310. Isso é vantajoso, apesar de uma redução na densidade de empacotamento da célula de fluxo 310. Por exemplo, a redução na densidade de empacotamento pode ser de apenas 11% em um arranjo hexagonal com o mesmo pitch. No entanto, concretizar o SIM de acordo com vários exemplos pode resultar em um aumento da densidade de empacotamento de, por exemplo, 356% para um arranjo quadrado com um pitch de 350 nm, em comparação com um arranjo hexagonal não SIM com um pitch de 700 nm.

[071] Usando ainda outro tipo de célula de fluxo padronizada, neste exemplo, uma célula de fluxo padronizada assimetricamente, o requisito de dimensionalidade dos sistemas de sequenciamento convencionais usando SIM pode ser reduzido em mais uma dimensão. FIG. 3C ilustra uma célula de fluxo padronizada 320 cujos nanopoços são padronizados assimetricamente. Nesta concretização, cada nanopoço 322 é formado ou configurado para formar uma estrutura alongada. Conforme utilizado aqui, o termo estrutura alongada refere- se a uma forma em que a dimensão ao longo de um primeiro eixo é maior que as dimensões ao longo de um segundo eixo. Neste exemplo, o eixo x é mais estreito que o comprimento ou a altura do nanopoço 322 ao longo de outro eixo (neste exemplo, o eixo y). Deve ser entendido que, embora a concretização ilustrada na FIG. 3C usa nanopoços elípticos, outros tipos de nanopoços alongados, por exemplo, retângulos, podem ser usados. Qualquer forma de nanopoço pode ser usado que resulte em um padrão pelo qual a amostra ao longo de apenas um eixo é associada a um aumento de resolução usando SIM. Em algumas concretizações, a dimensão dos recursos padronizados de que a largura da franja w é, pelo menos, substancialmente igual ou ligeiramente maior que o diâmetro de um recurso circular, o comprimento de um lado de um recurso quadrado, o comprimento do lado mais longo ou lado mais curto de um recurso retangular, um diâmetro de um recurso elíptico ao longo de seu eixo principal ou eixo menor ou a dimensão mais longa de um recurso de formato irregular ao longo de um eixo da recurso (por exemplo, eixo x ou y). Em algumas concretizações, os nanopoços podem alternativamente ser moldados como quadrados ou círculos, mas com espaçamento assimétrico entre eles.

[072] Desta maneira, a amostra pode ser resolvida ao longo de uma direção ou eixo, isto é, o eixo y, enquanto que ao longo de outra direção ou eixo, isto é, o eixo x, SIM é usado para aumentar a resolução a fim de resolver a amostra. Ou seja, ao longo do eixo x, o pitch, Px, da célula de fluxo padronizada assimetricamente 320 é estreito ou apertado, implicando um aumento na resolução, enquanto ao longo do eixo y, pitch, Py, do fluxo padronizado assimetricamente 320 é maior. Por conseguinte, a resolução é aumentada em apenas uma direção/ao longo de um eixo 318, e apenas três imagens são capturadas com a finalidade de resolver adequadamente uma amostra contida nos nanopoços da célula de fluxo 320. Assim, como ilustrado pelo gráfico 352, apenas uma cópia da banda passante óptica é criada e necessária para aumentar a resolução.

[073] A FIG. 4 é um fluxograma que ilustra operações de exemplo que podem ser executadas em um sistema de sequenciamento, como o sistema de imagem de iluminação estruturada 200 da FIG. 2, para sequenciar uma amostra usando uma célula de fluxo padronizada quadrada ou assimétrica. Na operação 400, uma fonte de luz correspondente a um primeiro padrão de grade de difração óptica orientada em uma primeira fase pode ser ligada. Na operação 410, o padrão de grade de difração óptica em uma primeira orientação é projetado em uma amostra e uma imagem é capturada. Ou seja, voltando à FIG. 2, o emissor de luz 250 pode emitir um feixe de luz que é colimado pela lente de colimação 251. A luz colimada é estruturada (padronizada) pela montagem óptica de estruturação da luz 255 e direcionada pelo espelho dicróico 260 através da lente objetiva 242 para uma amostra do recipiente de amostra 210, que está posicionado em um estágio 270. Nesta concretização, o recipiente de amostra 210 compreende uma célula de fluxo padronizada tendo um padrão quadrado ou assimétrico, tal como células de fluxo 310 ou 320, respectivamente (FIGS. 3B e 3C). No caso de uma amostra fluorescente, a amostra contida na célula de fluxo padronizada quadrada ou assimetricamente fluoresce em resposta à luz de excitação estruturada, e a luz resultante é coletada pela lente objetiva 242 e direcionada para um sensor de imagem do sistema de câmera 240 para detectar fluorescência.

[074] Na operação 420, uma verificação pode ser realizada para determinar se é necessária uma mudança de fase adicional. Se sim, na operação 430, a grade de difração óptica é deslocada de fase, e a operação retorna à operação 410, onde o padrão de grade de difração óptica (mudança de fase) é projetado na amostra e uma imagem é capturada. Como descrito anteriormente, três mudanças de fases são geralmente realizadas para capturar uma área de imagem inteira, nesta concretização, toda a área da célula de fluxo padronizada quadrada.

[075] Se nenhuma mudança de fase adicional for necessária, na operação 440, uma verificação pode ser realizada para determinar se um ângulo adicional é necessário, e o ângulo da grade de difração óptica é alterado na operação 450. A operação retorna à operação 410, onde o padrão de grade de difração óptica (após a alteração dos ângulos) é projetado na amostra e uma imagem é capturada. A operação prossegue para a operação 420, onde, se for necessária uma mudança de fase adicional em 420, a grade de difração óptica é deslocada na fase na operação 430. Novamente, a operação retorna à operação 410, onde o padrão de grade de difração óptica (em um novo ângulo e nova fase) é projetado na amostra e uma imagem é capturada. Novamente, nesta concretização, são necessárias imagens em três fases para capturar toda a área da célula de fluxo padronizada quadrada. Deve ser entendido que o controlador mencionado acima usados para controlar aspectos da operação do sistema do sistema de imagens de iluminação estruturada 200 pode ser configurado com instruções para executar as funções descritas acima, por exemplo, verificar se há ou não mudanças de fase adicionais ou orientações do padrão de grade de difração óptica são necessários para a imagem do tipo particular de célula de fluxo que está sendo usada.

[076] No caso de uma célula de fluxo padronizada quadrada, por exemplo, célula de fluxo 310 (FIG. 3), são necessárias imagens em dois ângulos para aumentar a resolução ao longo dos dois eixos da célula de fluxo 310. Consequentemente, após capturar imagens com o padrão de grade de difração óptica projetada em duas orientações correspondentes aos dois ângulos (ao longo de três trocas de fases do padrão de grade de difração óptica), uma imagem de alta resolução é reconstruída na operação 460 (combinando as seis imagens totais e retransformando-as no espaço real. Esta reconstrução de imagem de alta resolução pode ser feita no sistema ou, em alguns exemplos, a reconstrução pode ser realizada usando uma entidade de processamento separada.

[077] Em uma concretização em que a célula de fluxo padronizada é uma célula de fluxo assimétrica, o método descrito acima não precisa envolver a mudança de ângulos. Novamente, com uma célula de fluxo assimétrica, o SIM é usado para aumentar a resolução ao longo de apenas um eixo. Consequentemente, a grade de difração óptica precisa ser deslocada de fase apenas três vezes, permitindo que as imagens sejam capturadas para as três trocas de fase. Por conseguinte, uma vez que nenhuma outra mudança de fase é necessária na operação 420, o método prossegue para a operação 460, onde uma imagem de alta resolução pode ser reconstruída usando apenas as três imagens capturadas.

[078] Como indicado anteriormente, ao usar células de fluxo padronizadas particularmente que podem tirar vantagem de concretizações SIM de dimensionalidade reduzida, técnicas de varredura de linha, como varredura de linha TDI, podem ser usadas para criar imagens de amostras contidas nessas células de fluxo padronizadas. FIG. 5 é um diagrama de blocos que ilustra um exemplo de dois canais, sistema de geração de imagens de varredura de linha 500 que pode ser usado para criar uma imagem de uma amostra em várias concretizações.

[079] Como no caso do sistema de geração de imagens de iluminação estruturada 200 da FIG. 2, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode ser usado para o sequenciamento de ácidos nucleicos, onde aqueles onde os ácidos nucleicos estão aderidos em locais fixos em uma matriz (isto é, os poços de uma célula de fluxo, tal como a célula de fluxo 320) e a matriz pode ser visualizada repetidamente. Em tais concretizações, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode obter imagens em dois canais de cores diferentes, que podem ser usados para distinguir um tipo de base de nucleotídeo particular de outro. Mais particularmente, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode concretizar um processo referido como "chamada de base", que geralmente se refere a um processo de determinação de uma chamada de base (por exemplo, adenina (A), citosina (C), guanina (G), ou timina (T)) para um determinado ponto no local de uma imagem em um ciclo de geração de imagens. Durante a chamada de base de dois canais, os dados de imagem extraídos de duas imagens podem ser usados para determinar a presença de um dos quatro tipos de base, codificando a identidade de base como uma combinação das intensidades das duas imagens. Para um determinado ponto ou local em cada uma das duas imagens, a identidade base pode ser determinada com base em se a combinação de identidades de sinal é [ativada, ativada], [ativada, desativada], [desativada, ativada] ou [desativada, desativada]].

[080] Referindo-se novamente ao sistema de imagem de varredura de linha 500, o sistema inclui um módulo de geração de linha LGC 510 com duas fontes de luz, 511 e 512, dispostas no mesmo. As fontes de luz 511 e 512 podem ser fontes de luz coerentes, como diodos de laser que emitem raios laser. A fonte de luz 511 pode emitir luz em um primeiro comprimento de onda (por exemplo, um comprimento de onda de cor vermelha) e a fonte de luz 512 pode emitir luz em um segundo comprimento de onda (por exemplo, um comprimento de onda de cor verde). Os feixes de luz emitidos pelas fontes de laser 511 e 512 podem ser direcionados através de uma lente de modelagem de feixe ou lentes 513. Em algumas concretizações, uma única lente de modelagem de luz pode ser usada para modelar os feixes de luz de saída de ambas as fontes de luz. Em outras concretizações, uma lente de modelagem de feixe separada pode ser usada para cada feixe de luz. Em alguns exemplos, a lente de modelagem de feixe é uma lente Powell, de modo que os feixes de luz são modelados em padrões de linhas. As lentes para modelagem de feixe do LGC 510 ou outro sistema de imagem de componentes ópticos devem ser configuradas para moldar a luz emitida pelas fontes de luz 511 e 512 em padrões de linha (por exemplo, usando uma ou mais lentes Powel ou outras lentes para modelagem de feixe, componentes difrativos ou dispersantes). Por exemplo, em algumas concretizações, a luz emitida pelas fontes de luz 511 e 512 pode ser enviada através de uma grade de difração óptica para gerar um padrão de grade de difração óptica (padrão SIM) que pode ser projetado em uma amostra.

[081] LGC 510 pode ainda incluir espelho 514 e espelho semi-reflexivo 515 configurado para direcionar os feixes de luz através de uma única porta de interface para um módulo de emissão óptica (EOM) 530. Os feixes de luz podem passar através de um elemento de obturador 516. EOM 530 pode incluir objetiva 535 e um estágio z 536 que move a objetiva 535 longitudinalmente para mais perto ou mais longe de um alvo 550. Por exemplo, o alvo (por exemplo, uma célula de fluxo padronizada) 550 pode incluir uma camada líquida 552 e uma placa de cobertura translúcida 551, e uma amostra biológica pode estar localizada em uma superfície interna da placa de cobertura translúcida, bem como em uma superfície interna da camada de substrato localizada abaixo da camada líquida. O estágio z pode então mover a objetiva para focar os feixes de luz em qualquer superfície interna da célula de fluxo (por exemplo, focada na amostra biológica). A amostra biológica pode ser DNA, RNA, proteínas ou outros materiais biológicos responsivos ao sequenciamento óptico, como conhecido no estado da técnica.

[082] A EOM 530 pode incluir espelho semi-reflexivo 533 para refletir um feixe de luz de rastreamento de foco emitido por um módulo de rastreamento de foco (FTM) 540 no alvo 550 e, em seguida, para refletir a luz retornada do alvo 550 de volta ao FTM 540. O FTM 540 pode incluir um sensor óptico de rastreamento de foco para detectar características do feixe de luz de rastreamento de foco retornado e gerar um sinal de feedback para otimizar o foco da objetiva 535 no alvo 550.

[083] A EOM 530 também pode incluir espelho semi- reflexivo 534 para direcionar a luz através da objetiva 535, enquanto permite que a luz retornada do alvo 550 passe. Em algumas concretizações, o EOM 530 pode incluir uma lente de tubo 532. A luz transmitida através da lente de tubo 532 pode passar através do elemento de filtro 531 e no conjunto da câmera 520. O conjunto da câmera 520 pode incluir um ou mais sensores ópticos 521, por exemplo, sensores de varredura de linha TDI, detectar a luz emitida a partir da amostra biológica em resposta aos feixes de luz incidentes (por exemplo, fluorescência em resposta à luz vermelha e verde recebida das fontes de luz 511 e 512). Em um exemplo, um LGC (como o descrito acima) pode projetar luz através de uma grade de difração para gerar um padrão de franja linear.

[084] Os dados de saída dos sensores do conjunto da câmera 520 podem ser comunicados a um circuito de análise em tempo real 525. O circuito de análise em tempo real 525, em várias concretizações, executa instruções legíveis por computador para analisar os dados da imagem (por exemplo, pontuação da qualidade da imagem, chamada de base, etc.), relatando ou exibindo as características do feixe (por exemplo, foco, forma, intensidade, potência, brilho, posição) a uma interface gráfica do usuário (GUI), etc. Essas operações podem ser executadas em tempo real durante ciclos de geração de imagens para minimizar o tempo de análise a jusante e fornecer feedback e solução de problemas em tempo real durante uma execução de geração de imagens. Em concretizações, o circuito de análise em tempo real 525 pode ser um dispositivo de computação (por exemplo, dispositivo de computação 1100) que é comunicativamente acoplado e controla o sistema de imagem 500. Nas concretizações descritas a seguir, o circuito de análise em tempo real 525 pode executar adicionalmente instruções legíveis por computador para corrigir distorção nos dados da imagem de saída recebidos do conjunto da câmera 520.

[085] As FIGS. 6A-6C representam um exemplo de representação da varredura de linha TDI de uma célula de fluxo padronizada assimetricamente, em que o SIM é usado para aumentar a resolução ao longo de um eixo da célula de fluxo. Em particular, a FIG. 6A ilustra uma célula de fluxo padronizada assimetricamente 620 (que pode ser uma concretização da célula de fluxo padronizada assimetricamente 320 (FIG. 3C) na qual um padrão SIM 630 é sobreposto. A varredura de linha TDI pode ser realizada ao longo do eixo y, para capturar imagens linha por linha da célula de fluxo padronizada assimetricamente 620. As imagens capturadas na FIG. 6A são capturadas com o padrão SIM 630 em uma primeira fase.

[086] A título de exemplo, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode usar LGC 510 em coordenação com a óptica do sistema para varrer em linha a amostra (sobreposta com um padrão SIM, isto é, um padrão de grade de difração óptica) com luz tendo comprimentos de onda dentro do espectro de cores vermelhas e para varrer em linha a amostra com luz tendo comprimentos de onda dentro do espectro de cores verdes. Em resposta à varredura de linha, corantes fluorescentes situados nos diferentes pontos da amostra podem fluorescer e a luz resultante pode ser coletada pela lente objetiva 535 e direcionada para um sensor de imagem do conjunto de câmera 520 para detectar florescência. Por exemplo, a fluorescência de cada ponto pode ser detectada por alguns pixels do conjunto da câmera 520. Os dados de imagem emitidos pela montagem da câmera 520 podem então ser comunicados ao circuito de análise em tempo real 525 para processamento, por exemplo, para combinar as imagens para formar uma faixa.

[087] A FIG. 6B ilustra uma célula de fluxo padronizada assimetricamente 620 sobreposta ao padrão SIM 630. No entanto, na FIG. 6B, o padrão SIM 630 foi deslocado de fase ao longo do eixo x (em alinhamento com o eixo que precisa de um aumento de resolução para resolver a amostra). Como descrito acima, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode usar o LGC 510 em coordenação com a óptica do sistema para varrer em linha a amostra (sobreposta ao padrão SIM de fase deslocada 630). As imagens podem ser capturadas e enviadas do conjunto de câmera 520 e novamente comunicadas ao circuito de análise em tempo real 525 para processamento.

[088] A FIG. 6C ilustra uma célula de fluxo padronizada assimetricamente 620 sobreposta ao padrão SIM 630. Na FIG. 6C, o padrão SIM 630 foi deslocado de fase para uma terceira fase ao longo do eixo x (em alinhamento com o eixo que precisa de um aumento de resolução para resolver a amostra). Mais uma vez, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode usar LGC 510 em coordenação com a óptica do sistema para varrer em linha a amostra (sobreposto ao padrão SIM de fase deslocada 630). As imagens podem ser capturadas e enviadas o conjunto de câmera 520 e novamente comunicadas ao circuito de análise em tempo real 525 para processamento. As imagens capturadas de acordo com cada fase/deslocamento de fase podem ser combinadas pelo circuito de análise em tempo real 525 em uma única imagem e retransformadas no espaço real para gerar uma imagem com uma resolução mais alta, neste exemplo, ao longo do eixo x.

[089] Em outra concretização, como ilustrado na FIG. 6D, diferentes porções da célula de fluxo 620 podem ser sobrepostas com o padrão SIM 630 em suas diferentes fases. Ou seja, um padrão SIM em uma primeira fase 630A é sobreposto ao longo de uma porção inferior da célula de fluxo 620, o mesmo padrão SIM em uma segunda fase 630B é sobreposto em uma porção média da célula de fluxo 620 e, novamente, o mesmo padrão SIM em uma terceira a fase 630C é sobreposto ao longo de uma porção superior da célula de fluxo 620. Consequentemente, o sistema de geração de imagens de varredura de linha 500 varre em linha a célula de fluxo 620 sobreposta às diferentes fases de um padrão SIM (630A-630B), de modo que o sistema de geração de imagens de varredura de linha 500 possa gerar imagens de todo o fluxo , de acordo com cada fase necessária do padrão SIM, em uma única execução. Em algumas concretizações, o sistema de imagem de varredura de linha 500 pode ser modificado para ter múltiplos LGCs e múltiplas câmeras ou sensores/conjunto de câmeras, por exemplo, três, cada um dos quais gera e emite luz através de três grades de difração óptica (a mesma mas orientada em diferentes fases) para gerar as três fases do padrão SIM. Dessa maneira, cada câmera ou sensor/montagem de câmera é capaz de capturar uma imagem da célula de fluxo 620 junto com uma fase de padrão SIM diferente simultaneamente.

[090] Como mencionado acima, em outras concretizações ainda, uma amostra/célula de fluxo pode ser movida enquanto o padrão SIM permanece estacionário. Ao concretizar a varredura de linha TDI, a amostra/célula de fluxo já está em movimento. Portanto, esse movimento da amostra/célula de fluxo pode ser alavancado para evitar a necessidade de mudar o padrão do SIM. Ou seja, o movimento da amostra/célula de fluxo em relação ao padrão estacionário do SIM gera as fases necessárias para resolver a amostra.

[091] A FIG. 7 ilustra outro exemplo de célula de fluxo padronizada 720, semelhante à célula de fluxo padronizada de arranjo hexagonal 300 (FIG. 3A). Em um sistema de geração de imagens de iluminação estruturada convencional, a célula de fluxo 720 pode ser varrida em linha, por exemplo, na direção do eixo y. A intensidade de um feixe de luz emitido por um LGC, por exemplo, LGC 510 (FIG. 5) para a amostra na célula de fluxo 720 é mostrada como sendo ampla e homogênea ao longo do eixo x (não mostrado, mas substancialmente ou exatamente perpendicular à direção de varredura de linha). Ao longo do eixo y, no entanto, a intensidade do feixe de luz é estreita. À medida que o feixe de laser se move em relação à célula de fluxo 720, as imagens de fluorescência são capturadas por uma câmera ou sensor de varredura de linha, por exemplo, conjunto de câmera 520 (FIG. 5) na área correspondente sendo iluminada pelo feixe de luz.

[092] No entanto, tirando vantagem pelo fato de que a amostra /célula de fluxo 720 já está em movimento e porque apenas um SIM dimensional é necessário para resolver amostras em uma célula de fluxo padronizada assimetricamente, por exemplo, célula de fluxo 320 (FIG. 3C), a grade de difração óptica que produz o padrão SIM pode ser mantida imóvel. Ou seja, as múltiplas fases necessárias (por exemplo, três) para resolver adequadamente a amostra. Por conseguinte, estágios móveis ou outros elementos necessários para mover, por exemplo, uma rotação ou translação da grade de difração óptica, em um sistema de geração de imagens de varredura de linha convencional não são necessários nessa concretização.

[093] A FIG. 8 ilustra um exemplo de sistema de imagem de varredura de linha 800 que usa uma grade de difração óptica estacionária. Deve-se notar que, para facilitar a explicação, a FIG. 8 é uma ilustração simplificada na qual nem todos os recursos/elementos são mostrados. No entanto, o sistema de varredura de linha 800 pode ser uma concretização do sistema de imagem de varredura de linha 500 que usa uma grade de difração óptica estacionária para manter o padrão de grade de difração óptica resultante/padrão SIM imóvel.

[094] No exemplo da FIG. 8, um emissor de luz, por exemplo, laser 802, está configurado para emitir um feixe de luz que é colimado pela lente de colimação 804. Em uma concretização, o laser 802 emite luz no comprimento de onda verde. A luz colimada é direcionada pelo filtro dicróico 806 através de uma grade de difração óptica estacionária 812 para a lente objetiva 830 através de outro filtro dicroico 828 sobre uma amostra de um recipiente de amostra 832. Nesta concretização, o recipiente de amostra 830 é uma célula de fluxo padronizada assimetricamente, tal como célula de fluxo 320 (FIG. 3C).

[095] Um segundo emissor de luz, por exemplo, laser 808, emite luz (no comprimento de onda vermelho, por exemplo) através da grade de difração óptica estacionária 812 para a lente objetiva 830, também via filtro dicroico 828, e para a amostra do recipiente de amostra 832. O recipiente de amostra 832 está posicionado em um estágio 840 que pode mover o recipiente de amostra 832 em relação aos feixes de luz dos lasers 802 e 808. No caso de uma amostra fluorescente, a amostra fluoresce em resposta à luz de excitação estruturada (feixes de laser dos lasers 802 e 808), e a luz resultante é coletada pela lente objetiva 828 e direcionada para um sensor de imagem das câmeras 814 e 820.

[096] O filtro dicróico 806 é usado para passar o feixe de luz verde do laser 802 para passar para a grade de difração óptica estacionária 812, enquanto reflete o feixe de luz vermelho do laser 808 em direção à grade de difração óptica estacionária 812. O filtro dicroico 828 funciona de maneira semelhante em que permite que os feixes de luz vermelha e verde dos lasers 802 e 808 sejam refletidos na lente objetiva 830, enquanto permite que as câmeras 814 e 820 capturem, respectivamente, imagens fluorescentes com a luz verde e vermelha. O filtro dicróico 816 direciona as emissões de luz verde da amostra fluorescente para a câmera 814, enquanto o filtro dicróico 822 direciona as emissões de luz vermelha da amostra fluorescente para a câmera 820. As lentes 818 e 824 são lentes colimadoras para as câmeras 814 e 820, respectivamente. O espelho dicróico 826 direciona as emissões de luz verde e vermelha da amostra fluorescente para as câmeras apropriadas.

[097] No sistema de varredura em linha 800, a grade de difração óptica 812 é estacionária. Isto é, como discutido anteriormente, usando células de fluxo padronizadas assimetricamente em conjunto com o SIM, apenas uma dimensão de iluminação estruturada é necessária e múltiplas fases podem ser alcançadas movendo o feixe ao longo da célula de fluxo. Em outras palavras, o movimento do raio de laser em relação à amostra/célula de fluxo ou o movimento da amostra/célula de fluxo em relação ao raio de laser, resultando no movimento relativo entre a amostra e os padrões de excitação da franja é tudo o que é necessário para gerar as diferentes fases.

[098] A FIG. 9 ilustra uma célula de fluxo padronizada 920 que pode ser varrida em linha com um sistema de imagem de varredura de linha, tal como o sistema de varredura de linha 800. Um padrão de grade de difração óptica pode ser projetado na célula de fluxo 920, enquanto a célula de fluxo 920 se move de acordo com as técnicas de imagem de varredura de linha. O movimento da célula de fluxo 920 em relação ao padrão de grade de difração óptica estacionária cria as mudanças de fase necessárias e as imagens capturadas durante a varredura de linha, uma vez combinadas e retransformadas no espaço real, aumentam a resolução, como discutido anteriormente.

[099] Em particular, o feixe de luz se move na direção do eixo y. Mais uma vez, a intensidade do feixe de luz é homogênea ao longo do eixo x (não mostrado), mas a intensidade ao longo do eixo y é modulada devido à passagem através de uma grade de difração óptica estacionária, por exemplo, grade de difração óptica estacionária 812 (FIG. 8). À medida que o feixe de luz se move em relação à célula de fluxo 920, o padrão de grade de difração óptica muda. De fato, mais de três ou mesmo dezenas de mudanças de fase podem ser geradas. Como resultado, movendo a amostra/célula de fluxo 920 em vez da grade de difração óptica, é possível obter um aumento na resolução ao longo do eixo da varredura de linha. Em algumas concretizações, como descrito acima, a resolução nessa direção pode ser aumentada em, pelo menos, duas vezes em superfícies com características aleatórias ou padrões periódicos. Deve ser entendido que, como a resolução pode ser aumentada, por exemplo, pelo menos, duas vezes, a densidade dos nanopoços na célula de fluxo 920 pode ser aumentada por um fator de dois ou mais.

[100] A FIG. 10 é um fluxograma que ilustra operações de exemplo que podem ser executadas em um sistema de imagem de varredura de linha, tal como o sistema de imagem de varredura de linha 500 (FIG. 5) ou sistema de imagem de varredura de linha 800 (FIG. 8), para sequenciar uma amostra usando uma célula de fluxo método padronizada assimetricamente. Na operação 1000, os feixes de luz de fontes de laser, por exemplo, fontes de laser 802 e 808, são emitidos através de uma grade de difração óptica estacionária, por exemplo, grade de difração óptica estacionária 812, correspondente a uma primeira orientação de padrão de grade de difração óptica pode ser ativada. Na operação 1010, o padrão de grade de difração óptica é projetado em uma amostra e, na operação 1020, a amostra é varrida em linha. A varredura de linha pode ser realizada conforme descrito anteriormente em relação ao sistema de imagem de varredura de linha 800 (FIG. 8). Na operação 1030, a amostra é movida de acordo com as técnicas de varredura de linha acima mencionadas ou a luz direcionada pode ser movida como também descrito acima para alcançar um movimento relativo entre a amostra e o padrão de grade de difração óptica.

[101] As operações 1020 e 1030 podem ser repetidas quantas vezes forem necessárias para capturar imagens representativas de toda a amostra. Novamente, como resultado da amostra ser movida em relação ao padrão de grade de difração óptica estacionário, imagens da amostra e padrão de grade de difração óptica podem ser capturadas através das mudanças de fase necessárias para aumentar a resolução. Na operação 1040, uma imagem de alta resolução pode ser reconstruída.

[102] Deve-se notar que, a fim de evitar o desfoque de movimento entre o padrão de grade de difração óptica e a amostra durante a varredura de linha, as fontes de laser podem operar de maneira pulsada. Ou seja, as fontes de laser, por exemplo, as fontes de laser 802 e 808 podem ser pulsadas para que, a cada excitação, uma imagem de varredura de linha possa ser capturada. Em algumas concretizações, a orientação do padrão de grade de difração óptica em relação à amostra/célula de fluxo pode ser alterada em 90°. Em outras concretizações, como ilustrado nas FIGS 6A-6C, se a orientação do padrão de grade de difração óptica for tal que a amostra não se mova através de áreas claras e escuras (como pode ser o caso se a orientação do padrão de grade de difração óptica foi deslocada em 90°), a pulsação das fontes de laser pode não ser necessária porque o movimento da amostra em relação ao padrão de grade de difração óptica se move pela mesma intensidade da franja.

[103] A FIG. 11 ilustra um exemplo de componente de computação que pode ser usado para concretizar várias características do sistema e métodos aqui divulgados, tais como as características e funcionalidade acima mencionadas de um ou mais aspectos dos métodos ilustrados nas FIGS. 4 e 10 concretizados nos sistemas 200, 500, e/ou 800 e aqui descritos. Por exemplo, o componente de computação pode ser concretizado como um circuito de análise em tempo real 525.

[104] Como aqui utilizado, o termo circuito pode descrever uma determinada unidade de funcionalidade que pode ser executada de acordo com uma ou mais concretizações do presente pedido. Como usados aqui, um circuito pode ser concretizado utilizando qualquer forma de hardware ou uma combinação de hardware e software. Por exemplo, um ou mais processadores, controladores, ASICs, PLAs, PALs, CPLDs, FPGAs, componentes lógicos, rotinas de software ou outros mecanismos podem ser concretizados para formar um circuito. Na concretização, os vários circuitos descritos aqui podem ser concretizados como circuitos discretos ou as funções e recursos descritos podem ser compartilhados em parte ou no total entre um ou mais circuitos. Em outras palavras, um técnico versado no assunto após ler esta descrição, pode entender que os vários recursos e funcionalidades descritos aqui podem ser concretizados em qualquer pedido e podem ser concretizados em um ou mais circuitos separados ou compartilhados em várias combinações e permutações. Embora vários recursos ou elementos de funcionalidade possam ser individualmente descritos ou reivindicados como módulos separados, um técnico versado no assunto entenderá que esses recursos e funcionalidades podem ser compartilhados entre um ou mais elementos de software e hardware comuns, e essa descrição não deve exigir ou implicar que componentes de hardware ou software separados sejam usados para concretizar esses recursos ou funcionalidades.

[105] Quando componentes ou circuitos do pedido são concretizados no todo ou em parte usando software, em uma concretização, esses elementos de software podem ser concretizados para operar com um módulo de computação ou processamento capaz de executar a funcionalidade descrita em relação a ele. Um exemplo de componentes de computação é mostrado na FIG. 13. Várias concretizações são descritas em termos deste componente de computação de exemplo 1000. Depois de ler esta descrição, ficará claro para um técnico versado no assunto como concretizar o pedido usando outros módulos ou arquiteturas de computação.

[106] Com referência agora à FIG. 13, o componente de computação 1000 pode representar, por exemplo, capacidades de computação ou processamento encontrados em computadores desktop, laptop, notebook e tablet; dispositivos portáteis de computação (tablets, PDAs, smartphones, telefones celulares, palmtops, etc.); mainframes, supercomputadores, estações de trabalho ou servidores; ou qualquer outro tipo de dispositivo de computação para fins especiais ou para uso geral que seja desejável ou apropriado para uma determinada aplicação ou ambiente. O componente de computação 1000 também pode representar capacidades de computação incorporados ou disponíveis para um determinado dispositivo. Por exemplo, um componente de computação pode ser encontrado em outros dispositivos eletrônicos tal como, por exemplo, câmeras digitais, sistemas de navegação, telefones celulares, dispositivos de computação portáteis, modems, roteadores, WAPs, terminais e outros dispositivos eletrônicos que podem incluir alguma forma de capacidade de processamento.

[107] O componente de computação 1000 pode incluir, por exemplo, um ou mais processadores, controladores, módulos de controle ou outros dispositivos de processamento, tal como um processador 1004. O processador 1004 pode ser concretizado usando um mecanismo de processamento de uso geral ou de uso especial, tal como, por exemplo, um microprocessador, controlador ou outra lógica de controle. No exemplo ilustrado, o processador 1004 está conectado a um bus 1002, embora qualquer meio de comunicação possa ser usado para facilitar a interação com outros componentes do componente de computação 1000 ou para se comunicar externamente.

[108] O componente de computação 1000 também pode incluir um ou mais módulos de memória, simplesmente referidos aqui como memória principal 1008. Por exemplo, de preferência a memória de acesso aleatório (RAM) ou outra memória dinâmica, pode ser usada para armazenar informações e instruções a serem executadas pelo processador 1004. A memória principal 1008 também pode ser usada para armazenar variáveis temporárias ou outras informações intermediárias durante a execução de instruções a serem executadas pelo processador 1004. O componente de computação 1000 também pode incluir uma memória somente leitura (“ROM”) ou outro dispositivo de armazenamento estático acoplado ao bus 1002 para armazenar informações estáticas e instruções para o processador 1004.

[109] O componente de computação 1000 também pode incluir uma ou mais variadas formas de mecanismo de armazenamento de informação 1010, que podem incluir, por exemplo, uma mídia drive 1012 e uma interface de unidade de armazenamento 1020. A mídia drive 1012 pode incluir um drive ou outro mecanismo para suportar mídia de armazenamento fixo ou removível 1014. Por exemplo, um drive de disco rígido, um drive de estado sólido, um drive de fita magnética, um drive de disco óptico, um drive de CD ou DVD (R ou RW) ou outro drive de mídia removível ou fixo pode ser fornecido. Por conseguinte, a mídia de armazenamento 1014 pode incluir, por exemplo, um disco rígido, um drive de estado sólido, fita magnética, cartucho, disco óptico, um CD, DVD ou Blu-ray ou outro meio fixo ou removível que é lido por escrito ou acessado pelo drive de mídia 1012. Como esses exemplos ilustram, a mídia de armazenamento 1014 pode incluir um meio de armazenamento utilizável por computador que armazena nele software ou dados de computador.

[110] Em exemplos alternativos, o mecanismo de armazenamento de informações 1010 pode incluir outros instrumentos semelhantes para permitir que programas de computador ou outras instruções ou dados sejam carregados no componente de computação 1000. Tais instrumentos podem incluir, por exemplo, uma unidade de armazenamento fixo ou removível 1022 e uma interface 1020. Exemplos dessas unidades de armazenamento 1022 e interfaces 1020 podem incluir um cartucho de programa e uma interface de cartucho, uma memória removível (por exemplo, uma memória flash ou outro módulo de memória removível) e slot de memória, um slot e cartão PCMCIA e outras unidades de armazenamento fixas ou removíveis 1022 e interfaces 1020 que permitem que software e dados sejam transferidos da unidade de armazenamento 1022 para o componente de computação 1000.

[111] O componente de computação 1000 também pode incluir uma interface de comunicação 1024. A interface de comunicação 1024 pode ser usada para permitir que software e dados sejam transferidos entre o componente de computação 1000 e dispositivos externos. Exemplos de interface de comunicação 1024 podem incluir um modem ou softmodem, uma interface de rede (como Ethernet, placa de interface de rede, WiMedia, IEEE 802.XX ou outra interface), uma porta de comunicação (como, por exemplo, uma porta USB, porta IR,, interface RS232 da porta Bluetooth® ou outra porta) ou outra interface de comunicação. O software e os dados transferidos via interface de comunicação 1024 podem tipicamente ser transmitidos por sinais, que podem ser eletrônicos, eletromagnéticos (que incluem ópticos) ou outros sinais capazes de serem trocados por uma determinada interface de comunicações 1024. Esses sinais podem ser fornecidos à interface de comunicações 1024 via um canal 1028. Este canal 1028 pode transmitir sinais e pode ser concretizado usando um meio de comunicação com ou sem fio. Alguns exemplos de um canal podem incluir uma linha telefônica, um link de celular, um link de RF, um link óptico, uma interface de rede, uma rede local ou de área ampla e outros canais de comunicação com ou sem fio.

[112] Neste documento, os termos "meio legível por computador", "meio utilizável por computador" e "meio de programa de computador" são usados para se referir geralmente a mídias não transitórias, voláteis ou não voláteis, como, por exemplo, memória 1008, unidade de armazenamento 1022 e mídia 1014. Essas e outras várias formas de mídia de programa de computador ou mídia utilizável por computador podem estar envolvidas no transporte de uma ou mais sequências de uma ou mais instruções para um dispositivo de processamento para execução. Tais instruções incorporadas no meio são geralmente chamadas de "código de programa de computador" ou "produto de programa de computador" (que podem ser agrupadas na forma de programas de computador ou outros agrupamentos). Quando executadas, essas instruções podem permitir que o módulo de computação 1000 execute recursos ou funções do presente pedido, conforme discutido aqui.

[113] Embora descrito acima em termos de vários exemplos e concretizações, deve-se entender que os vários recursos, aspectos e funcionalidades descritos em uma ou mais concretizações individuais não são limitados em sua aplicabilidade à concretização particular com a qual são descritos , mas, em vez disso, pode ser aplicado, sozinho ou em várias combinações, a uma ou mais das outras concretizações do pedido, se essas concretizações são ou não descritas se esses recursos são ou não apresentados como parte de uma concretização descrita. Assim, a amplitude e o escopo do presente pedido não devem ser limitados por nenhuma das concretizações de exemplo descritas acima.

[114] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores (desde que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) sejam contempladas como parte da matéria inventiva divulgado neste documento. Em particular, todas as combinações da matéria reivindicada que aparecem no final desta divulgação são contempladas como parte do objeto inventivo divulgado neste documento.

[115] Os termos "substancialmente" e "sobre" usados ao longo desta divulgação, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e contabilizar pequenas flutuações, como devido a variações no processamento. Por exemplo, eles podem se referir a menor ou igual a ± 5%, como menor ou igual a ± 2%, como menor ou igual a ± 1%, como menor ou igual a ± 0,5%, como menor ou igual a ± 0,2%, como menor ou igual a ± 0,1%, como menor ou igual a ± 0,05%.

[116] Na medida do aplicável, os termos "primeiro", "segundo", "terceiro", etc., aqui são meramente empregados para mostrar os respectivos objetos descritos por esses termos como entidades separadas e não se destinam a conotar um senso de ordem cronológica, salvo indicação explícita contrária neste documento.

[117] Os termos e frases usados neste documento, e suas variações, a menos que expressamente indicado de outra forma, devem ser interpretados como abertos em oposição à limitação. Como exemplos do exposto acima: o termo "incluindo" deve ser lido como significando "incluindo, sem limitação" ou similar; o termo "exemplo" é usado para fornecer exemplos de instâncias do item em discussão, não uma lista exaustiva ou limitativa; os termos "um" ou "uma" devem ser lidos como significando "pelo menos um (uma)", "um ou mais" ou similares; e adjetivos como “convencional”, “tradicional”, “normal”, “padrão”, “conhecido” e termos de significado semelhante não devem ser interpretados como limitando o item descrito a um determinado período de tempo ou a um item disponível a partir de um determinado período, em vez disso, deve ser lido para abranger tecnologias convencionais, tradicionais, normais ou padrão que possam estar disponíveis ou conhecidas agora ou a qualquer momento no futuro. Da mesma forma, quando este documento se refere a tecnologias que podem ser aparentes ou conhecidas para um técnico versado no assunto, essas tecnologias abrangem aquelas aparentes ou conhecidas para o técnico versado no assunto agora ou a qualquer momento no futuro.

[118] A presença de palavras e frases ampliadas, como "uma ou mais", "pelo menos", "mas não se limitando a" ou outras frases semelhantes em alguns casos, não deve ser lido como significando que o caso mais restrito é intencional ou necessário nos casos em que essas frases de ampliação possam estar ausentes.

[119] Além disso, as várias concretizações estabelecidas neste documento são descritas em termos de exemplo de diagramas de blocos, fluxogramas e outras ilustrações. Como ficará evidente para um técnico versado no assunto após a leitura deste documento, as concretizações ilustradas e suas várias alternativas podem ser concretizadas sem limitação aos exemplos ilustrados. Por exemplo, os diagramas de blocos e sua descrição acompanhada não devem ser interpretados como exigindo uma arquitetura ou configuração específica.

[120] Embora várias concretizações da presente divulgação tenham sido descritas acima, deve-se entender que elas foram apresentadas apenas a título de exemplo, e não de limitação. Da mesma forma, os vários diagramas podem representar um exemplo de configuração arquitetônica ou outra para a divulgação, que é feita para ajudar no entendimento dos recursos e funcionalidades que podem ser incluídos na divulgação. A divulgação não está restrita às arquiteturas ou configurações de exemplo ilustradas, mas os recursos desejados podem ser concretizados usando uma variedade de arquiteturas e configurações alternativas. De fato, será evidente para um técnico versado no assunto como particionamento e configurações funcionais, lógicas ou físicas alternativas podem ser concretizadas para concretizar os recursos desejados da presente divulgação. Além disso, uma infinidade de nomes de componentes constituintes diferentes dos representados neste documento pode ser aplicada às várias partições. Além disso, com relação aos diagramas de fluxo, descrições operacionais e reivindicações do método, a ordem na qual as etapas são apresentadas neste documento não exige que várias concretizações sejam concretizadas para executar a funcionalidade recitada na mesma ordem, a menos que o contexto determine o contrário.

Claims

1. Método de formação de imagem de uma amostra biológica caracterizado pelo fato de que compreende: direcionar luz através de uma rede de difração ótica estacionária; projetar um padrão de rede de difração ótica gerado pela luz sendo direcionada através da rede de difração ótica estacionária para a amostra biológica; varredura de linha da amostra biológica; mover a amostra biológica em relação ao padrão de rede de difração ótica ou mover a luz que está sendo direcionada através da rede de difração ótica estacionária; e reconstruir uma imagem de alta resolução representativa da amostra biológica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a luz compreende luz em comprimentos de onda vermelho e verde emitidos a partir de duas fontes de laser respectivas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada uma das duas fontes de laser emite a luz de uma maneira pulsada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a varredura de linha da amostra biológica compreende a captura de uma imagem de uma porção da amostra biológica mediante excitação das duas fontes de laser resultando em iluminação da amostra biológica.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o movimento da amostra biológica em relação ao padrão de rede de difração ótica ou o movimento da luz em relação ao padrão de rede de difração ótica gera uma pluralidade de deslocamentos de fase do padrão de rede de difração ótica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de deslocamentos de fase compreende pelo menos três deslocamentos de fase do padrão de rede de difração ótica.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o padrão de rede de difração ótica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas pelo menos substancialmente perpendicularmente a uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a informação representativa da amostra biológica ao longo de um primeiro eixo da célula de fluxo é resolvida de acordo com um aumento de resolução com base em uma frequência espacial criada por uma combinação da pluralidade de nanopoços alongados compreendendo a célula de fluxo e o padrão de rede de difração ótica.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a informação representativa da amostra biológica ao longo de um segundo eixo que é pelo menos substancialmente perpendicular ao primeiro eixo é resolvida de acordo com uma resolução não aumentada.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o padrão de rede de difração ótica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas pelo menos substancialmente em paralelo com uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a varredura de linha é realizada ao longo de uma direção alinhada com a pluralidade de nanopoços alongados.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a varredura de linha da amostra biológica compreende uma varredura de linha de integração de atraso de tempo da amostra biológica.

13. Sistema caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos duas fontes de laser emitindo feixes de luz em pelo menos dois comprimentos de onda, respectivamente; uma rede de difração ótica estacionária adaptada para gerar um padrão de rede de difração ótica mediante a passagem dos feixes de luz emitidos através da rede de difração ótica estacionária; e um conjunto de varredura de linha para: mover uma amostra biológica em relação ao padrão de rede de difração ótica; ou mover as pelo menos duas fontes de laser em relação ao padrão de rede de difração ótica; capturar uma pluralidade de imagens representativas de porções da amostra biológica; e reconstruir uma imagem de alta resolução representativa da amostra biológica com base na pluralidade de imagens.

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o conjunto de varredura de linha compreende pelo menos duas câmeras, cada uma tendo pelo menos um sensor de imagem adaptado para detectar a amostra biológica fluorescente.

15. Sistema, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o movimento da amostra biológica em relação ao padrão de rede de difração ótica ou o movimento de pelo menos duas fontes de laser gera uma pluralidade de deslocamentos de fase do padrão de rede de difração ótica.

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de deslocamentos de fase compreende pelo menos três deslocamentos de fase do padrão de rede de difração ótica.

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o padrão de rede de difração ótica compreende uma pluralidade de franjas longitudinais orientadas em relação a uma pluralidade de nanopoços alongados compreendendo uma célula de fluxo contendo a amostra biológica.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o conjunto de varredura de linha captura a pluralidade de imagens representativas das porções da amostra biológica ao longo de uma direção alinhada com a pluralidade de nanopoços alongados.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que cada uma das duas fontes de laser emite os feixes de luz de forma pulsada.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o conjunto de varredura de linha captura cada uma da pluralidade de imagens representativas das porções da amostra biológica mediante excitação das pelo menos duas fontes de laser que resultam em fluorescência da amostra biológica.