CN104833659B - 一种生物样品断层显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物样品断层显微成像系统。所述成像系统包括弱光成像子系统以及样品平面加工子系统；所述弱光成像子系统，用于在样品进行平面加工的同时，进行积分成像；所述样品平面加工子系统，用于加工样品表面形成断层，供弱光成像系统成像；所述弱光成像子系统包括线扫描模块和光斑整形模块；所述线扫描模块包括线探测器和成像镜头；所述光斑整形模块，按照光路方向依次包括扩束单元和缩束单元。本发明将切削模块与成像系统分离，设计了弱光成像系统，适用于多种树脂包埋样品，切削速度与成像速度互相分离，可以进行纵向低采样的快速图像获取，并且能对弱光物体例如荧光生物组织进行快速三维信息的获取。
Description
技术领域
本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种生物荧光样品断层显微成像系统。
背景技术
显微光学断层层析成像系统，是一种生物样品断层显微成像系统，能自动获取生物样品较为精细的三维结构信息。其原理如下：样品装在一个可以三维移动的电动平台上；在X方向移动平台可以切出条状的切片，条带状的切片沿着刀面前移，这些切片在刀面上同时被成像。照明光束通过分光镜、反射镜和物镜，最后照亮切片。切片通过物镜和筒镜成像在一个线阵列CCD上。成像的质量、切片的质量和样品的切削性能有关。序列的条带图片拼接出整个断面的图像，序列的断面图像最后重建出三维的结构。
但是现有的显微光学断层层析成像系统，存在以下技术问题：1、在刀面边缘成像，需要切片有很好的贴刀性能，适应的材料有限，只有某些树脂(如spurr树脂)才有这么好的切片性能，不能对其他材料(如石蜡)包埋的样品进行成像；2、将成像与切削耦合在一起，切片速度与成像速度相互制约；3、切片的厚度很小，一般为5μm以下，不利于纵向采样率低的快速图像获取；4、进行弱光特别是荧光成像时速度较慢。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种生物样品断层显微成像系统，其目的在于将成像模块与切削模块分离，先对样品进行加工，然后对加工过的样品表面进行成像，与此同时设计了弱光成像系统，由此解决原有系统适用的样品有限、切片速度与成像速度相互制约、不能纵向低采样、弱光成像特别是荧光成像时成像速度较慢的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种生物样品断层显微成像系统，包括弱光成像子系统以及样品平面加工子系统，其中：
所述弱光成像子系统包括线扫描模块和光斑整形模块；
所述线扫描模块包括线探测器和成像镜头；
所述光斑整形模块，按照光路方向依次包括扩束单元和缩束单元；所述扩束单元为一对共焦点共光轴设置的透镜，使得光斑二维扩大；所述缩束单元为一对共焦点共光轴设置的柱面镜，其中包括第一柱面镜和第二柱面镜，第一、第二柱面镜的母线平行，使得光斑一维压缩；
准直光束通过光斑整形模块形成椭圆光斑，用于照明样品；样品产生光信号，经所述线扫描模块的成像镜头聚焦后，被所述线扫描模块的线探测器采集成像，样品和所述线探测器相对运动扫描，所述线探测器的扫描方向与椭圆光斑长轴垂直，椭圆光斑的长轴大于线探测器的成像区域长度，椭圆光斑的短轴和线探测器的成像区域宽度比在0.8～1.5之间。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其所述扩束单元的一对透镜，按照光路方向包括第一透镜和第二透镜，其中第一透镜为凹透镜或者凸透镜，第二透镜为凸透镜。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其所述光斑整形模块还包括平面反射镜，用于调整光路方向。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其所述椭圆光斑经分光镜反射垂直照明样品，样品光信号经所述分光镜透射被线扫描模块采集。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其所述线探测器固定，样品沿扫描方向运动。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，按照光路方向，其所述光斑整形模块与样品之间，设置有显微物镜。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其所述样品光信号经过滤光后，被所述线扫描模块采集。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其样品平面加工子系统包括金刚石刀头、刀架、三维精密移动平台和支架座，所述三维精密移动平台带动样品分别沿X、Y和Z方向运动，X方向为进刀方向，Y方向为换刀方向，Z方向为样品切除方向；所述金刚石刀以XZ平面作为接触面装配在所述刀架上，刀刃沿Y方向设置，所述金刚石刀的刀头的刀角角度在30度到45度之间，所述金刚石刀的第一后刀面和XY平面交角在8度到10度之间；所述刀架以XZ平面作为接触面装配在支架座的横梁上，之间设置有垫片微调装置。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其垫片微调装置，用于调节刀刃和Y方向的夹角θ，使得θ不超过0.25mrad。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其垫片调微调装置，采用硬塑料纸作为垫片。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其三维精密移动平台Z方向为步进运动装置，步长在0.2微米至5微米之间。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其三维精密移动平台Y方向为步进运动装置，切削样本时步长在1毫米至2毫米之间，成像过程中步长在0.3毫米至2.5毫米之间。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，还包括液位控制子系统，所述液位控制子系统，包括吸水管、水泵、储液器和出水管；所述吸水管与水泵相连，水泵与储液器相连，储液器和出水管相连；所述吸水管的吸水口设置于样品槽内，其高度为目标液位高度，所述储液器具有开口，与空气连通；所述出水管的出口设置与样品槽内，单位时间内，其出水体积低于水泵抽取体积。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其水泵的功率可调。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其储液器内设置有滤网。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其出水管的出水口设置在样品槽底部。
优选地，所述生物样品断层显微成像系统，其出水管上设置有流量控制器。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于切削模块与成像模块分离，设计了弱光成像系统，能够取得下列有益效果：
1、可以适用于多种树脂包埋的样品，如石蜡、MMA树脂、spurr树脂等。
2、切削速度与成像速度互相分离，互不影响。我们可以通过提高切削速度、切削厚度、切削宽度的方式来减少切削的时间，而通过使用弱光成像系统的方法来减少成像时间。
3、可以进行纵向低采样的快速图像获取。
4、可以对弱光物体例如荧光生物组织进行快速三维信息的获取。
附图说明
图1是本发明的整体系统架构示意图；
图2是本发明的弱光成像子系统的光斑整形模块示意图；
图3是本发明的弱光成像子系统的扫描成像模块示意图；
图4是本发明的样品平面加工子系统的金刚石刀安装示意图；
图5是本发明的样品平面加工子系统的金刚石刀刀角示意图；
图6是本发明的液位控制子系统示意图。在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：
001为精密三维平移台，002为照明器，003为光斑整形模块，004为三目镜筒，005为CCD接口，101为激光器，102为衰减片，103为平面反射镜，104为第一透镜，105为第二透镜，106为第一柱面镜，107为第二柱面镜，108为光路提升架，109为椭圆光斑，110为线探测器，112为分光镜(二向色镜)，113为成像镜头，114为显微物镜，115为样品，201为刀头，202为支架座，203为金刚石刀，204为刀架，205为垫片微调装置，301为水泵，302为样品槽，303为吸水管，304为出水管，305为液面，306为储液器，307为滤网。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下为实施例：
本发明提供的生物样品断层显微成像系统，如图1所示，包括弱光成像子系统、样品平面加工子系统以及液面控制子系统。所述弱光成像子系统，用于在样品进行平面加工的同时，进行积分成像；所述样品平面加工子系统，用于加工样品表面形成断层，供弱光成像系统成像；所述液位控制子系统，用于维持样品浸没液的高度并对样品浸没液进行循环过滤。
图1中，大理石支架座202用来安装支撑整个系统，精密三维平移台001安装在大理石支架座202上，其上安装样品槽302，样品槽302里面可以固定样品115。照明器002用一定的机械机构固定在支架座202的横梁上，其上安装三目镜筒004以及内部可以安装滤光片的CCD接口110。弱光成像子系统的光斑整形模块003固定在支架座202的横梁上，整形好的光束经过CCD接口005里面的二向色镜反射照明样品。金刚石刀203属于样品加工子模块，通过刀架安装在支架座202上。水泵301和储液槽306属于液面控制子模块。
所述弱光成像子系统，如图2和3所示，包括光斑整形模块和线扫描成像模块；
所述线扫描成像模块包括线探测器110、成像镜头113和显微物镜114；
所述光斑整形模块，按照光路方向依次包括扩束单元和缩束单元，用于对激光器101的输出光斑进行整形；所述扩束单元为一对共焦点共光轴设置的透镜，使得光斑二维扩大；所述缩束单元为一对共焦点共光轴设置的柱面镜，其中包括第一柱面镜106和第二柱面镜107，第一、第二柱面镜、的母线平行，使得光斑一维压缩；所述扩束单元的一对透镜，按照光路方向包括第一透镜104和第二透镜105，其中第一透镜为凹透镜或者凸透镜，第二透镜为凸透镜。优选地，所述光斑整形模块还包括平面反射镜103，用于调整光路方向；衰减片102用来调整激光光强；提升架108用来将光斑整形模块输出的光导入显微光路。
准直光束通过光斑整形模块形成椭圆光斑109，经过二向色镜112发射后照明样品115，样品表面的照明区域如图116所示。样品产生荧光信号，经所述线扫描模块的成像镜头113聚焦后，经过二向色镜112以及截止滤光片111，被所述线扫描模块的线探测器110采集成像，样品115和所述线探测器110相对运动扫描，所述线探测器的扫描方向与样品面上的椭圆光斑长轴垂直，椭圆光斑的长轴大于线探测器的成像区域长度，椭圆光斑的短轴和线探测器的成像区域宽度比在0.8～1.5。所述椭圆光斑经分光镜反射垂直照明样品，样品光信号经所述分光镜透射被线扫描模块采集。优选地，所述线探测器固定，样品沿扫描方向运动。
所述样品平面加工子系统，结构如图4所示，金刚石刀203以XZ平面作为接触面装配在所述刀架204上，刀刃沿Y方向设置。
所述支架座202，用来安装精密三维平移台以及刀架204。
所述刀架204，安装在支架座202横梁上，用于装配金刚石刀203。
所述金刚石刀203的刀头201的刀角α，其角度在30度到45度之间，所述金刚石刀203的第一后刀面和XY平面交角β，其角度在8度到10度之间。所述金刚石刀203和所述刀架204之间设置有垫片微调装置205，所述垫片微调装置205，用于调节刀刃和Y方向的夹角θ，使得θ不超过0.25mrad。所述垫片调微调装置，采用100μm左右的硬塑料纸作为垫片。
所述三维精密移动平台001，其上设有样品槽302，带动样品槽302分别沿X、Y和Z方向运动，X方向为进刀方向，Y方向为换刀方向，Z方向为样品切除方向。X方向为连续运动装置，Y方向为步进运动装置，切削样本时步长在1毫米至2毫米之间，成像时步长在0.3毫米至2.5毫米，Z方向为步进运动装置，步长在0.2微米至5微米之间。
所述支架座202基座上设置三维精密移动平台001，横梁上固定有所述刀架204，所述金刚石刀203以XZ平面作为接触面装配在所述刀架204上，刀刃沿Y方向设置。刀架204通过固定在支架座202的横梁上。在三维精密移动平台001上安装有样品槽302，可以把样品固定在样品槽中，这样就可以控制三维精密移动平台001对样品进行三维的移动。
本发明的金刚石刀203安装时的刀角示意图，如图5所示。图示为金刚石刀203的刀头部分，有时为了减少切削时间，我们要使用大刀宽来加工样品。同时需要金刚石刀203有一定的耐用性。这些都对金刚石刀203及其安装方式有一定的要求。我们经过大量测试，金刚石刀203的第一前刀面和第一后刀面的夹角α需要在30度到45度之间。在微米量级加工时，我们通常选取α为45度，既满足表面加工精度要求也有较好的耐用性。金刚石刀203安装的时候，第一后刀面和加工平面的夹角β为8度到10度之间。
由于我们要对样品表面进行显微成像，需要样品表面非常平整，否则进行显微成像时会出现有的区域在焦面而有的区域不在焦面的情况。这就需要刀刃与Y轴夹角θ尽可能的小，使得θ不超过0.25mrad。图所示为通过放置垫片来调节刀刃与Y轴夹角的示意图。对于不同的表面起伏的需求，我们可以通过调节切削厚度和切削宽度来实现。本发明采用垫片调节装置，实现保证刀架204稳定性的前提下，精细微调，相对于一般的无级调节装置，更加稳固，才能适应成像样品加工；相对于一般的分级调节装置，更加精细，才能满足本发明加工平整性的要求。
所述本发明提供的液位控制子系统，结构如图6所示，包括吸水管303、水泵301、储液器306和出水管304。所述吸水管303与水泵301相连，水泵301与储液器306相连，储液器306和出水管308相连。
所述吸水管303的吸水口设置于样品槽302内，其高度为目标液位高度。
所述储液器306具有开口，与空气连通。
所述出水管308的出口设置于样品槽302内，单位时间内，其出水体积低于水泵301抽取体积。优选地，所述出水管308上可以设置流量控制器，调节出水流量。
所述水泵301，其功率可调，水泵301抽取水的体积为水泵301工作时设定的泵水体积。优选地，为了不使装置笨重，水泵301使用的是微型齿轮泵，齿轮泵的转速可调。
所述储液器306内可设置滤网307，用于过滤循环液体。储液器306中设有可以放置滤网的隔板，隔板中间有洞可以漏水。滤网307可以根据切屑的大小以及抗腐蚀性的要求使用海绵、纱布、铜网、银网等材料。过滤后的液体经过水管304进入样品槽302。
工作时，将吸水管303的吸水口固定在样品槽302目标液位高度，维持水泵301吸水的速度比出水管308出水的速度快。样品槽302中的液位如果高于目标液位，样品槽302中的液位就会一直降低到吸水口的位置。所以我们对管口位置进行控制，就可以轻松控制样品槽302中的液面305，抽水管管口的高度就是目标液位高度；当样品槽302中液位高度下降到吸水口的位置时，出水管308会吸入一部分空气，一部分水，达到一种平衡状态；当样品槽302中的液位下降到吸水口以下时，储液器306中的液体流出量大于吸水口吸取的液体量，液体流入样品槽302，液位升高。理论上，单位时间内，出水管308的出水体积低于水泵301的抽取体积，则液面会维持在目标液位高度。
液面的稳定方式主要依靠样品槽302中进水量与出水量的协调，如果能够保证进水量的大小刚好等于出水量与蒸发量的和，那么样品槽302中的液面就一定能够保持稳定。该装置就利用水循环达到了这样的效果。装置中，我们将水泵301放在水循环中特定的部分，使其位于水循环的吸水环节，负责将样品槽302中的水抽出到储液器306中。同时，将水泵301吸水速度设定到特定的参数上，使单位时间水泵301抽取体积大于储液器306出水体积。然后，对吸水口位置进行控制，将吸水管303的管口控制在合适的高度就可以轻松控制样品槽302中的液面，此时液面的高度就是吸水管303管口的高度。理论上水循环部分的抽取速度大于进水速度，样品槽302中的水会一直减少，但由于管口并没有放入样品槽302底部，所以当液位下降到管口的位置时，吸水管303会吸入一部分空气，一部分水，达到一种平衡状态，使得水泵301的吸水量刚好等于样品槽302进水量与其蒸发量的差值。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种成像模块与切削模块分离的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，包括弱光成像子系统以及样品平面加工子系统；所述弱光成像子系统，用于在样品进行平面加工的同时，进行积分成像；所述样品平面加工子系统，用于加工样品表面形成断层，供弱光成像系统成像；其中：
所述弱光成像子系统包括线扫描模块和光斑整形模块(003)；
所述线扫描模块包括线探测器(110)和成像镜头(113)；
所述光斑整形模块(003)，按照光路方向依次包括扩束单元和缩束单元；所述扩束单元为一对共焦点共光轴设置的透镜，使得光斑二维扩大；所述缩束单元为一对共焦点共光轴设置的柱面镜，其中包括第一柱面镜(106)和第二柱面镜(107)，第一、第二柱面镜(107)的母线平行，使得光斑一维压缩；
准直光束通过光斑整形模块(003)形成椭圆光斑(109)，用于照明样品；样品产生光信号，经所述线扫描模块的成像镜头(113)聚焦后，被所述线扫描模块的线探测器(110)采集成像，样品和所述线探测器(110)相对运动扫描，所述线探测器(110)的扫描方向与椭圆光斑(109)长轴垂直，椭圆光斑(109)的长轴大于线探测器(110)的成像区域长度，椭圆光斑(109)的短轴和线探测器(110)的成像区域宽度比在0.8～1.5之间；
所述扩束单元的一对透镜，按照光路方向包括第一透镜(104)和第二透镜(105)，其中第一透镜(104)为凹透镜或者凸透镜，第二透镜(105)为凸透镜。
2.如权利要求1所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述样品平面加工子系统包括金刚石刀(203)、刀架(204)、三维精密移动平台和支架座(202)，所述三维精密移动平台带动样品槽(302)分别沿X、Y和Z方向运动，X方向为进刀方向，Y方向为换刀方向，Z方向为样品切除方向；所述金刚石刀(203)以XZ平面作为接触面装配在所述刀架(204)上，刀刃沿Y方向设置，所述金刚石刀(203)的刀头(201)的刀角角度在30度到45度之间，所述金刚石刀(203)的第一后刀面和XY平面交角在8度到10度之间；所述刀架(204)以XZ平面作为接触面装配在支架座(202)的横梁上，之间设置有垫片微调装置(205)。
3.如权利要求1或2所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述光斑整形模块(003)还包括平面反射镜(103)，用于调整光路方向。
4.如权利要求1或2所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述椭圆光斑(109)经分光镜(112)反射垂直照明样品，样品光信号经所述分光镜(112)透射被线扫描模块采集。
5.如权利要求2所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述垫片微调装置(205)，用于调节刀刃和Y方向的夹角θ，使得θ不超过0.25mrad。
6.如权利要求2所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述垫片调微调装置，采用硬塑料纸作为垫片。
7.如权利要求1所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，还包括液位控制子系统，用于维持样品浸没液高度，包括吸水管(303)、水泵(301)、储液器(306)和出水管(304)；所述吸水管(303)与水泵(301)相连，水泵(301)与储液器(306)相连，储液器(306)和出水管(304)相连；所述吸水管(303)的吸水口设置于样品槽(302)内，其高度为目标液位高度，所述储液器(306)具有开口，与空气连通；所述出水管(304)的出口设置于样品槽(302)内，单位时间内，其出水体积低于水泵(301)抽取体积。
8.如权利要求7所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于，所述储液器(306)内设置有滤网(307)。
9.如权利要求7所述的生物样品断层显微成像系统，其特征在于所述出水管(304)的出水口设置在样品槽(302)底部。
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