TW202045923A - 具有線掃描的結構化照明顯微鏡 - Google Patents

Abstract

本發明描述經由使用圖案化流量槽以用於減小生物樣品之結構化照明成像中所需之角度數目的技術，其中該些圖案化流量槽中之奈米井以例如正方形陣列或非對稱陣列配置。因此，減小了解析該些生物樣品之細節所需之影像的數目。本發明亦描述利用該些圖案化流量槽以用於組合結構化照明成像與線掃描的技術。

Description

具有線掃描的結構化照明顯微鏡

本發明關於一種具有線掃描的結構化照明顯微鏡。 相關申請案之交叉參考

本申請案主張2018年1月24日申請且標題為「Structured Illumination Microscopy With Line Scanning」之美國臨時專利申請案第62/621,570號及2018年3月20日申請且標題為「Structured Illumination Microscopy With Line Scanning」之荷蘭專利申請案第N2020623號的優先權。前述申請案中之每一者的全部內容以引用之方式併入本文中。

生物學研究之多個最新進步已受益於用於對核酸進行分析及定序的改良型方法。舉例而言，人類基因圖譜定序計劃已判定人類基因組之完整序列，希望其將產生範圍介於治療疾病至基礎科學進步之領域中的進一步發現。最近已係基於對呈平面陣列形式或呈珠粒之未經放大或經放大單個分子之大規模平行分析的數種新DNA定序技術。

用以在此類新定序技術中分析核酸序列之方法常常係基於對螢光核苷酸或寡核苷酸之偵測。結構化照明顯微鏡（structured illumination microscopy；SIM）描述一種定序技術，其便於空間結構化（亦即，圖案化）光可用以對樣品進行成像以便按兩倍或更多倍之因子增加顯微鏡之側向解析度。在樣品之成像期間，可在各種圖案相位（例如，在0°、120°及240°下）下獲取樣品之影像，藉由圍繞光軸旋轉圖案定向（例如，旋轉60°及120°）來重複該程序。擷取到之影像（例如，九個影像，各圖案相位之各定向角一個影像）可彙編成具有延伸空間頻率頻帶之單個影像。單個影像可重新變換成真實空間以產生比可通常可由顯微鏡解析具有更高解析度的影像。

在SIM系統之典型實施方案中，將經線性偏振光光束導引穿過將光束繞射至兩個或更多個單獨階中之光學繞射光柵，該些階可作為正弦干涉條紋圖案投影於成像樣品上。在此等實施方案中，藉由圍繞光軸旋轉光學繞射來控制所投影光學繞射光柵圖案之定向，而藉由移動光學繞射光柵橫向地跨越軸線來調整圖案之相位。在此類系統中，光學繞射光柵安裝於平移台上，該平移台又安裝於旋轉台上。另外，此類系統使用線形偏振器以在其接收於光柵處之前偏振由光源發射之光。

圖1A說明樣品100及投影至樣品100上之光學繞射光柵圖案102的一實例。儘管樣品100可包含非可解析更高空間頻率，但樣品100上之具有已知更低空間頻率的上覆光學繞射光柵圖案102產生莫耳條紋。此有效地將非可解析、更高空間頻率移動到可由顯微鏡解析之較低的空間頻率。如上文所描述，相對於樣品100以光學繞射光柵圖案102之不同定向/角度及相位擷取樣品100之影像產生多個影像，所述多個影像可組合成單個影像，所述單個影像被重新變換成真實空間以產生具有更高解析度之影像。

本文中所揭示之系統及方法的實例涉及用於減小經由尤其圖案化之流量槽來使用SIM來解析螢光樣品所需之影像數目及尺寸的技術，及相對於該螢光樣品利用光束移動以達成可與線掃描技術一起使用之SIM的一實施方案。

根據一個實施方案，一種對生物樣品進行成像之方法包含將光導引穿過靜止光學繞射光柵、及將由經導引穿過該靜止光學繞射光柵之該光產生的光學繞射光柵圖案投影至該生物樣品上。該方法可進一步包含線掃描該生物樣品、及相對於該光學繞射光柵圖案移動該生物樣品或移動經導引穿過該靜止光學繞射光柵之該光。另外，該方法可包含重建代表該生物樣品之高解析度影像。

在一些實例中，該光包含自兩個各別雷射源輸出之紅色及綠色波長光。該兩個雷射源中之每一者可以脈衝方式輸出該光。在一些實例中，該線掃描該生物樣品包含在激發該兩個雷射源從而照明該生物樣品之後即刻擷取該生物樣品之一部分的影像。

在一些實施方案中，相對於該光學繞射光柵圖案移動該生物樣品或相對於該光學繞射光柵圖案移動該光會產生該光學繞射光柵圖案之複數個相移。

在一些實施方案中，該複數個相移包含該光學繞射光柵圖案之至少三個相移。

在一些實施方案中，該光學繞射光柵圖案包含至少實質上垂直於複數個細長奈米井定向的複數個縱向條紋，該些細長奈米井包含含有該生物樣品之流量槽。可根據基於由包含該流量槽之該複數個細長奈米井與該光學繞射光柵圖案之組合產生的空間頻率之解析度增大來解析沿著該流量槽之第一軸線之代表該生物樣品的資訊。可根據非增大解析度而解析沿著至少實質上垂直於該第一軸線之第二軸線之代表該生物樣品的資訊。

在一些實例中，該光學繞射光柵圖案包含至少實質上平行於複數個細長奈米井定向的複數個縱向條紋，該些細長奈米井包含含有該生物樣品之流量槽。可沿著與該複數個細長奈米井對準之方向執行該線掃描。

在一些實施方案中，該生物樣品之該線掃描包含該生物樣品之時間延遲積分線掃描。

根據另一實例，一種系統可包含至少兩個雷射源，其分別發射至少兩個波長之光束、及靜止光學繞射光柵，其經調適以在所發射光束通過該靜止光學繞射光柵之後即刻產生光學繞射光柵圖案。此外，該系統可包含線掃描部件，其用以：相對於該光學繞射光柵圖案移動生物樣品；或相對於該光學繞射光柵圖案移動該至少兩個雷射源；擷取代表該生物樣品之部分的複數個影像；及基於該複數個影像而重建代表該生物樣品之高解析度影像。

在一些實例中，該線掃描部件包含至少兩個相機，該些相機各自具有經調適以感測螢光生物樣品之至少一個影像感測器。相對於該光學繞射光柵圖案移動該生物樣品或該移動該至少兩個雷射源可產生該光學繞射光柵圖案之複數個相移。該複數個相移可包含光學繞射光柵圖案之至少三個相移。該光學繞射光柵圖案包含相對於複數個細長奈米井定向的複數個縱向條紋，該些細長奈米井包含含有該生物樣品之流量槽。

在一些實例中，該線掃描部件沿著與該複數個細長奈米井對準之方向擷取代表該生物樣品之該些部分的該複數個影像。在一些實例中，該至少兩個雷射源中之每一者以一脈衝方式發射該些光束。在一些實例中，該線掃描部件在激發該至少兩個雷射源從而產生該生物樣品之螢光之後即刻擷取代表該生物樣品之該些部分之該複數個影像中的每一者。

應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合（只要這些概念不相互矛盾）經涵蓋作為本文中所揭示之發明主題的部分。詳言之，在本發明結尾處出現之所主張標的的全部組合預期為本文所揭示發明性標的的部分。

結合藉助於實例說明根據所揭示技術之實施方案之特徵的附圖，所揭示技術之其他特徵及態樣將自以下實施方式變得顯而易見。概述不意欲限制本文中所描述之任何發明的範圍，該些發明由申請專利範圍及等效物來界定。

如本文用以指代由繞射光柵發射之繞射光，術語「階」或「階數」欲意謂代表光與繞射光柵之用於相長干擾的鄰近縫隙之路徑長度差之整數波長的數目。術語「零階」或「零階最大」意欲指代由繞射光柵發射之不存在繞射的中心明亮條紋。術語「一階」意欲指代零階條紋之任一側上發射的兩個明亮條紋，其中路徑長度差係±1個波長。

如本文中用以指代樣品，術語「光點」或「特徵」意欲意謂圖案中可根據相對部位區別於其他點或區域的點或區域。個別光點可包括特定類型之一或多個分子。舉例而言，光點可包括具有特定序列之單一目標核酸分子，或光點可包括具有相同序列（及/或其互補序列）之若干核酸分子。

如本文中所使用，術語「影像塊」一般係指樣品之相同區的一或多個影像，其中一或多個影像中之每一者代表各別色彩通道。影像塊可形成一個成像循環之成像資料集的成像資料子集。

如本文中所使用，術語「x-y平面」意欲代表笛卡爾座標系中由直線軸線x及y界定之2維區域。當參考偵測器及由偵測器觀測到之物件而使用時，區域可進一步指定為正交於偵測器與正在偵測之物件之間的觀測方向。當在本文中使用線掃描儀時，術語「y方向」是指掃描方向。

如本文所使用，術語「z座標」欲意謂指定沿著正交於x-y平面之軸線之點、線或區域之位置的資訊。在特定實施方案中，z軸正交於由偵測器觀測之物件的區域。舉例而言，光學系統之焦點方向可沿著z軸指定。

如本文中所使用，術語「掃描線」意欲意謂偵測物件在x-y平面中之2維橫截面，該橫截面係矩形或長方形，且引起橫截面與物件之間的相對移動。舉例而言，在螢光成像之狀況下，在掃描中之給定時間點，可特定地激發物件之具有矩形或長方形形狀的區域（排除其他區域）及/或可特定地獲取來自該區域之發射（排除其他區域）。

本文中所揭示之實施方案涉及經組態以具有正方形或非對稱圖案之流量槽。前已述及，SIM依賴於空間結構化（亦即，圖案化）光以對樣品進行成像以便按兩倍或更多倍之因子增加顯微鏡之側向解析度。亦前已述及，傳統上，多圖案相位及多個定向/角度下之樣品的影像用以達成側向解析度之期望增加。

圖1B在一個實例中大體上說明由顯微鏡物鏡（類似於其繞射圖案）產生之倒晶格空間的可觀測區域及其如何在邊緣處受物鏡可透射之最高空間頻率限制（2NA / A（圖形120）。如所說明，中心光點代表零階分量。在圖形122中說明代表平行線之圖案的零階及一階繞射分量。若圖案間隔處於解析度極限下，則在可觀測場之邊緣處（k₀ 邊界上）發生一階光點。歸因於頻率混合，除了空間頻率（中心圓）之正常影像以外，可觀測區域亦含有在原始場之邊緣上居中之兩個新偏移頻率影像（圖形124）。此等偏移影像含有不可使用習知顯微鏡觀測到的更高空間頻率。如由圖形126所說明，在120°定向下自三個相位製備之一組影像最終在處理之後得到含有如可在寬場螢光顯微鏡中觀測到之空間解析度兩倍的真實影像。

然而，藉由將流量槽組態成具有正方形或非對稱圖案（而非例如六邊形圖案），需要更少影像以達成側向解析度之相同增加。亦即，具有正方形或非對稱奈米井圖案之流量槽允許具有較緊密間距（即，緊鄰奈米井之間的距離）且涉及增加之解析度之流量槽的軸線，以與其解析度應增加之軸線對準。在正方形圖案化流量槽之一個實例中，僅關於兩個軸線需要增加之解析度。因此，僅需要六個影像（跨越三個相位在兩個角度中之每一者下有一影像）。在非對稱圖案化流量槽之狀況下，僅需要樣品之三個影像以達成增加之解析度（跨越三個相位在一個角度下有一影像）。

藉由減小以期望程度解析樣品所需之角度的數目，減小了完成樣品之成像所需之影像的數目。舉例而言，在4染料化學方法之內容背景中，系統可能需要獲取36個影像以便產生4個影像以供鹼基識別（在下文解釋）。亦可減小儲存或緩衝擷取到之影像所需之儲存裝置（例如，磁盤）的量。又另外，亦可減少將影像彙編成單個影像且接著將此單個影像重變換/重建成期望解析度之一個影像所需之處理及/或計算功率。

另外，SIM之習知實施方案不與利用線掃描技術以對樣品進行成像之定序系統相容。線掃描可以是指使用對流量槽逐行進行成像以構建連續影像（相對於具有擷取整個物件，例如流量槽，之靜態影像之二維像素陣列的相機或感測器）之影像的像素線。適用於定序系統之一種特定類型的線掃描是時間延遲積分（time delay integration；TDI）線掃描。

在多角度SIM實施方案之情況下，需要固定視野以獲取角度/相位影像組合中之每一者。然而，當僅相對於單個角度拍攝影像，如同本文所揭示之非對稱圖案化流量槽用作樣品基材之實施方案中的狀況時，TDI線掃描可用以擷取樣品之覆蓋三個SIM圖案相位的影像。亦即，可相對於非對稱圖案化流量槽移動SIM圖案以產生僅沿著一個軸線以增加之解析度解析流量槽中之樣品所需的三個相位。

在一些實施方案中，TDI線掃描可結合SIM技術使用以藉由使用TDI線掃描相機或感測器以沿著流量槽（被稱作「條帶」）擷取之影像來對樣品進行成像。亦即，可對在第一相位中以SIM圖案圖案化之流量槽執行TDI線掃描。SIM圖案可經移位至第二相位，且可重複TDI線掃描。SIM圖案可經移位至第三相位，且可再次重複TDI線掃描。以此方式，擷取到各圖案相位下之樣品的影像。

或者是，可以SIM圖案之不同相位來圖案化流量槽之不同部分。舉例而言，在流量槽之第一部分處，SIM圖案可定位於第一位置中，在流量槽之第二部分處，SIM圖案可經移位至第二位置，且在流量槽之第三部分處，SIM圖案可經移位至第三位置。因此，當相機或感測器擷取條帶時，在單次TDI線掃描中擷取跨越三個SIM圖案相位中之每一者之樣品的影像。

在又其他實施方案中，而非相對於樣品/流量槽使SIM圖案移位，移動樣品/流量槽同時SIM圖案保持靜止。當然，樣品定位/置放於流量槽中，從而使得根據組成流量槽之奈米井而圖案化樣品。當實施TDI線掃描時，如上文所提及，樣品/流量槽已移動。因此，可利用樣品/流量槽之此移動以避免必須使SIM圖案移位。亦即，相對於靜止SIM圖案移動樣品/流量槽（給定適當定向）會產生解析樣品所需之必備相位。

在描述本文中所詳細揭示之系統及方法的各種實施方案之前，描述可實施本文中所揭示之技術的實例環境係有用的。一個此實例環境是圖2中所說明之結構化照明成像系統200的實例環境，其以空間結構化光照明樣品。舉例而言，系統200可以是利用空間結構化激發光以對生物樣品進行成像之結構化照明螢光顯微鏡系統。

在圖2之實例中，光發射器250經組態以輸出由準直透鏡251準直之光束。準直光由光結構化光學部件255結構化（圖案化）且由雙色鏡260導引穿過物鏡242至樣品容器210之樣品上，其定位於台270上。在螢光樣品之狀況下，樣品回應於結構化激發光而發螢光，且所得光由物鏡242收集且由相機系統240之影像感測器導引以偵測螢光。

在下文進一步所描述的各種實施方案中之光結構化光學部件255包括一或多個光學繞射光柵以產生投影至樣品容器210之樣品上之繞射光（例如，條紋）的正弦圖案。繞射光柵可係一維或二維透射性、反射性或相位光柵。如下文參考特定實施方案進一步描述，在系統200中繞射光柵不一定涉及旋轉台。在一些實施方案中，繞射光柵可在成像系統之操作期間固定（例如，不旋轉或線性移動）。舉例而言，在下文進一步所描述之特定實施方案中，繞射光柵可包括實質上或精確地/極佳地垂直於彼此定向的兩個固定一維透射繞射光柵（例如，水平繞射光柵及豎直繞射光柵）。

在各成像循環期間，系統200利用光結構化光學部件255以在各種相位下獲取沿著樣品平面（例如，沿著x-y平面）橫向位移之複數個影像，藉由圍繞光軸（亦即，相對於樣品之x-y平面）旋轉圖案定向來重複此程序一或多次。可接著將擷取到之影像在空間上重建以產生更高解析度影像（例如，具有個別影像之側向空間解析度之約兩倍的影像）。

在系統200中，光發射器250可以是非相干光發射器（例如，發射由一或多個激發二極體輸出之光束），或相干光發射器，諸如由一或多個雷射器或雷射二極體輸出光之發射器。如系統200之實例中所說明，光發射器250包括用於導引待輸出之光束的光纖252。然而，可使用光發射器250之其他組態。在利用多通道成像系統（例如，利用多個光波長之多通道螢光顯微鏡）中之結構化照明的實施方案中，光纖252可以光學方式耦接至複數個不同光源（圖中未示），各光源發射具有不同波長之光。儘管系統200說明為具有單個光發射器250，但在一些實施方案中可包括多個光發射器250。舉例而言，在下文進一步論述之利用多個臂之結構化照明成像系統的狀況下，可包括多個光發射器。舉例而言，可發射對應於不同波長之光，諸如藍色、綠色、紅色或其他顏色。在一些實例中，可使用一個光發射器/光源。在一些實例中，可使用兩個或更多個光發射器/光源。

在一些實施方案中，系統200可包括管透鏡256，該該管透鏡256可包括沿著z軸鉸接的透鏡元件以調整結構化光束形狀及路徑。舉例而言，管透鏡之組件可以是鉸接式的計算為在容器210中之樣品的樣品厚度（例如，不同防護玻璃罩厚度）範圍。

在系統200之實例中，流體遞送模組或裝置290可將試劑流（例如，經螢光標記之核苷酸、緩衝劑、酶類、裂解試劑等等）導引至（及穿過）樣品容器210及放泄閥220。樣品容器210可包括一或多個基材，其上提供有樣品。舉例而言，在系統要分析大量不同的核酸序列之狀況下，樣品容器210可包括一或多個基材，待定序之核酸係結合、附接或關聯於該一或多個基材上。基質可包括任何惰性基材或核酸可附接至之基質，諸如玻璃表面、塑膠表面、乳膠、聚葡萄糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯醯胺凝膠、金表面及矽晶圓。在一些應用中，所述基材在形成為橫跨樣品容器210的矩陣或陣列的複數個部位處的通道或其他區域內。系統200亦可包括溫度台致動器230及可視情況調節樣品容器210內之流體之條件溫度的加熱器/冷卻器235。

在特定實施方案中，樣品容器210可實施為包括半透明蓋板、基材及含於其間之液體的圖案化流量槽，且生物樣品可位於半透明蓋板之內表面或基材之內表面處。流量槽可包括大量（例如，數千、數百萬或數十億或更多）井或區，該些井或區係經界定陣列（例如，六邊形陣列、矩形陣列等）圖案化至基材中。各區可形成諸如DNA、RNA或可例如使用合成定序來進行定序之另一基因體材料之生物樣品的簇(cluster)（例如，單克隆簇(monoclonal cluster)）。流量槽可進一步劃分成數個隔開的通路（例如，八個通路），各通路包括簇之六邊形陣列。

樣品容器210可安裝於樣品台270上，以提供樣品容器210相對於物鏡242之移動及對準。樣品台可具有一或多個致動器以允許樣品台在三個維度中之任一者中移動。舉例而言，就笛卡爾座標系而言，可提供致動器可經提供以允許台相對於物鏡在X、Y及Z方向上移動。此可允許樣品容器210上之一或多個樣品部位定位成與物鏡242光學對準。樣品台270相對於物鏡242之移動可藉由移動樣品台本身、物鏡、成像系統之某一其他組件或前述各者之任何組合來達成。其他實施方案亦可包括使整個成像系統在靜止樣品上方移動。替代地，樣品容器210可在成像期間固定。

在一些實施方案中，聚焦（z軸）組件275可經包括以控制光學組件相對於樣品容器210在聚焦方向（典型地稱為z軸或z方向）上的定位。聚焦組件275可包括實體上耦接至光學台或樣品台或兩者之一或多個致動器，以相對於光學組件（例如，物鏡242）移動樣品台270上之樣品容器210以為成像操作提供恰當聚焦。舉例而言，致動器可諸如藉由與各別台直接或間接地進行機械、磁性、流體或其他附接或接觸而在實體上耦接至該台。一或多個致動器可經組態以在z方向上移動台，同時在同一平面上維持樣品台（例如，維持齊平或水平姿態實質上或極佳地垂直於光軸）。可瞭解，根據一些實例或實施方案，完美的垂直性、平行性或其他定向可能歸因於例如製造容限、操作限制等等而並非可達成的。然而，出於本文所揭示之技術的目的，實質上垂直、平行或其他定向應被理解為意謂足以達成期望解析度或如在本文中所描述及/或涵蓋之其他相關效應的定向。該一或多個致動器亦可經組態以使台傾斜。舉例而言，該傾斜動作可以使得樣品容器210可依照其表面中之任何斜坡進行動態調整。

自來自經成像樣品位置處置測試樣品發出的結構化光可經導引穿過雙色鏡260至相機系統240之一或多個偵測器。在一些實施方案中，可包括具有一或多個發射濾光片之濾光片切換部件265，其中一或多個發射濾光片可用以通過特定發射波長且阻擋（或反射）其他波長。舉例而言，一或多個發射濾光片可用以在成像系統之不同通道之間切換。在特定實施方案中，發射濾光片可實施為將具有不同波長之發射光導引至相機系統240之不同影像感測器的雙色鏡。

相機系統240可包括一或多個影像感測器以監視且追蹤樣品容器210之成像（例如，定序）。相機系統240可實施為例如電荷耦合裝置（charge-coupled device；CCD）影像感測器相機，但可使用其他影像感測器技術（例如，主動像素感測器） 可將來自相機系統240之輸出資料（例如，影像）傳達至可實施為軟體應用程式之即時分析模組（圖中未示），如下文進一步描述，該軟體應用程式可重建在各成像循環期間擷取之影像以產生具有更高空間解析度之影像。如下文將描述，相機系統240亦可實施為TDI CCD相機以實現線掃描技術。

儘管未說明，但可提供控制器以控制結構化照明成像系統200之操作，包括同步系統200之各種光學組件。可實施控制器以控制系統操作之態樣，諸如對光結構化光學部件255（例如，繞射光柵之選擇及/或線性轉換）進行組態、移動管透鏡256、聚焦、台移動及成像操作。在各種實施方案中，控制器可使用硬體、演算法（例如，機器可執行指令）或前述各者之組合來實施。舉例而言，在一些實施方案中，控制器可包括一或多個CPU或處理器以及相關聯記憶體。作為另一實例，控制器可包含用以控制操作之硬體或其他電路系統，諸如電腦處理器及其上儲存有機器可讀取指令之非暫時性電腦可讀取媒體。舉例而言，此電路系統可包括以下各者中之一或多者：場可程式化閘陣列（field programmable gate array；FPGA）、特殊應用積體電路（application specific integrated circuit；ASIC）、可程式化邏輯裝置（programmable logic device；PLD）、複雜可程式化邏輯裝置（complex programmable logic device；CPLD）、可程式化邏輯陣列（programmable logic array；PLA）、可程式化陣列邏輯（programmable array logic；PAL）或其他類似的處理裝置或電路系統。作為又一實例，控制器可包含此電路系統與一或多個處理器之組合。

圖3A說明可根據本文中所揭示之實施方案成像的圖案化流量槽300之實例組態。在此實例中，流量槽300經圖案化有可在成像運程期間同時成像之有序光點或特徵302的六邊形陣列（見304）。為易於說明，流量槽300說明為具有數十至數百個光點302。然而，如熟習此項技術者可瞭解，流量槽300可具有經成像之數千、數百萬或數十億個光點302。此外，在一些情況下，流量槽300可係包含光點302之在成像運程期間經採樣之多個平面（實質上或極佳地垂直於聚焦方向）的多平面樣品。在特定實施方案中，流量槽300可圖案化有劃分成通路之數百萬或數十億個井。在此特定實施方案中，流量槽之各槽可含有使用合成定序進行定序之生物材料。

如上所述，在一些實例中，為了使用圖案化流量槽300來解析樣品，需要至少九個影像以達成必備的解析度。此係因為圖案化流量槽300中之六邊形奈米井陣列係高頻圖案，其中奈米井之間的間距係緊密且非可解析的。特定言之，在此實例中，存在可決定需要多少影像以充分地解析樣品之兩個因素。

第一因子是所要光學通帶之複本數。返回參考圖1B，圖形122展示未使用SIM之情況下的正常通帶。圖形124說明產生光學通帶之一個複本的實例。此可提高一個維度中之解析度，而圖形126/圖形306（圖3A）說明產生光學通帶之三個複本的實例，此在兩個維度中產生相當均勻之解析度提高。

第二因子是用以解調各光學通帶之相位之影像的數目。儘管在理論上僅需要兩個影像（以獲得真實及虛數部分），但典型地使用三個影像以獲得更佳雜訊平均化。

應理解，當將影像自空間頻率轉譯成傅立葉空間（在物鏡後聚焦平面處對由顯微鏡產生之原始資料的分析係基於傅立葉分析）時，傅立葉變換含有3個分量或軸線。亦即，物鏡後聚焦平面處之光的繞射產生在側向（x, y）維度中指定大致200 nm之最大解析度且在軸向（z）維度中指定500 nm之最大解析度的繞射壘，此取決於物鏡數值孔徑及平均照明波長。因此，當使用圖案化流量槽300中之六邊形奈米井陣列時，使用SIM來在三個角度下拍攝影像。如上文亦論述，為了獲得必備的解析度，必須在三個角度中之每一者下跨越三個相位拍攝影像，其中需要三個相位以確保觀測到成像區域上之所有部分（亦即，以覆蓋SIM圖案之整個波長），由此產生九個影像。此在所有三個軸線308中產生增加之解析度。

然而，在一個實例中，使用另一類型之圖案化流量槽，例如流量槽310，當奈米井312圖案化至正方形陣列（見314）上時，僅需要兩個角度以達成增加之解析度，增加之解析度沿著正方形陣列之軸線對準。圖形316說明此情況之實例，其中僅產生且需要光學通帶之兩個複本以達成所需解析度增加。換言之，在此狀況下，沿著正方形陣列之兩個軸線（x及y），可藉由使SIM圖案或條紋與需要解析度增加之彼等方向對準來解析諸如流量槽310之正方形圖案化流量槽。可瞭解，沿著相鄰奈米井312之間的任何對角線路徑，將存在一些解析度增強以使得將可自彼此解析對角相鄰之奈米井。然而，沿著x軸及y軸在奈米井312之間，間距（P_x 、P_y ）足夠窄，使得需要使用SIM來提昇解析度，即，x軸及y軸中之空間頻率過高而無法被解析。

藉由使用正方形圖案化流量槽，諸如流量槽310，使用SIM之習知定序系統的維度要求可減少一個維度，其中在僅兩個軸線318中增加解析度。亦即，而非擷取遍及三個相位覆蓋三個角度之九個影像，遍及三個相位覆蓋兩個角度之僅六個影像各自需要經擷取以便充分地解析含於流量槽310內之樣品。儘管流量槽310之填集密度的減小，但這樣是有利的。舉例而言，遍及具有相同間距之六邊形陣列，填集密度之減小可僅係11%。然而，相比於具有700 nm間距之非SIM六邊形陣列，根據各種實例而實施SIM會引起具有350 nm間距之正方形圖案化陣列之例如356%的填集密度增大。

藉由使用又另一種類型之圖案化流量槽，在此實例中非對稱圖案化流量槽，可使得使用SIM之習知定序系統的維度要求又減少一個維度。圖3C說明其奈米井非對稱地圖案化之圖案化流量槽320。在此實施方案中，各奈米井322經整形或經組態以形成細長結構。如本文中所用，術語細長結構指代沿著第一軸線之維度大於沿著第二軸線之尺寸的形狀。在此實例中，x軸沿著另一軸線（在此實例中y軸）比奈米井322之長度或高度窄。應理解，儘管圖3C中所說明之實施方案使用橢圓形奈米井，但可使用其他類型之細長奈米井，例如矩形。可使用產生圖案藉此沿著僅一個軸線之樣品與使用SIM之解析度增加相關聯的任何奈米井形狀。在一些實施方案中，與條紋寬度w實質上相同或比其略微更小之圖案化特徵的尺寸可係圓形特徵之直徑、正方形特徵之一側的長度、矩形特徵之較長側或較短側的長度、橢圓形特徵之沿著其長軸或短軸的直徑、或不規則形狀特徵之沿著其一個軸線（例如，x或y軸）的最長尺寸。在一些實施方案中，奈米井可替代地整形為正方形或圓形，但在其間具有非對稱間隔。

以此方式，可沿著一個軸線方向，即y軸，解析樣品，而沿著另一方向或軸線，即x軸，SIM用以增加解析度以便解析樣品。亦即，沿著x軸，非對稱圖案化流量槽320之間距P_x 係窄或緊密的，從而需要解析度增加，而沿著y軸，非對稱圖案化流量槽320之間距P_y 更大。因此，解析度僅在一個方向上/沿著一個軸線318增加，且僅擷取三個影像以便充分地解析含於流量槽320之奈米井內的樣品。因此，如由圖形352說明，僅產生且需要光學通帶之一個複本以增加解析度。

圖4係說明可在諸如圖2之結構化照明成像系統200之定序系統中執行以使用正方形或非對稱圖案化流量槽來對樣品進行序列之實例操作的流程圖。在操作400處，可接通對應於定向於第一相位中之第一光學繞射光柵圖案的光源。在操作410處，將第一定向上之光學繞射光柵圖案投影至樣品上且擷取影像。亦即，返回參考圖2，光發射器250可輸出由準直透鏡251準直之光束。準直光由光結構化光學部件255結構化（圖案化）且由雙色鏡260導引穿過物鏡242至樣品容器210之樣品上，其定位於台270上。在此實施方案中，樣品容器210包含具有正方形或非對稱圖案之圖案化流量槽，分別諸如流量槽310或320（圖3B及圖3C）。在螢光樣品之狀況下，含於正方形或非對稱圖案化流量槽中之樣品回應於結構化激發光而發螢光，且所得光由物鏡242收集且由相機系統240之影像感測器導引以偵測螢光。

在操作420處，可執行檢查以判定是否需要額外相移。若如此，在操作430處，使光學繞射光柵相移，且操作返回至操作410，其中將（經相移）光學繞射光柵圖案投影至樣品上，且擷取影像。如先前所描述，大體上執行三相移位以擷取整個成像區域，在此實施方案中，正方形圖案化流量槽之整個區域。

若不需要額外相移，則在操作440處，可執行檢查以判定是否需要額外角度，且在操作450處改變光學繞射光柵之角度。操作返回至操作410，其中將光學繞射光柵圖案（在改變角度之後）投影至樣品上，且擷取影像。操作繼續進行至操作420，其中若在420處需要額外相移，則在操作430處使光學繞射光柵相移。又，操作返回至操作410，其中將光學繞射光柵圖案（處於新角度及新相位下）投影至樣品上，且擷取影像。又，在此實施方案中，需要遍及三個相位之影像以擷取正方形經圖案化流量槽之整個區域。應理解，用以控制結構化照明成像系統200之系統操作之態樣的前述控制器可經組態有用以執行上述功能之指令，例如檢查是否需要光學繞射光柵圖案之額外相移或定向以對正使用之特定類型的流量槽進行成像。

在正方形圖案化流量槽，例如流量槽310（圖3），之狀況下，需要兩個角度下之影像所需的沿著流量槽310之兩個軸線的解析度。因此，在擷取具有在對應於兩個角度之兩個定向上投影之光學繞射光柵圖案的影像（跨光學繞射光柵圖案之三個相移）之後，在操作460處重建高解析度影像（藉由組合六個總影像且將其重變換成真實空間）。可在系統中完成此高解析度影像重建，或在一些實例中，可使用單獨處理實體來執行重建。

在圖案化流量槽係非對稱流量槽之實施方案中，上述方法不必涉及改變角度。又，在非對稱流量槽之情況下，SIM用以增加僅沿著一個軸線之解析度。因此，光學繞射光柵僅需要相移三次，從而允許歷時三個相移而擷取影像。因此，一旦在操作420處不需要其他相移，則方法繼續進行至操作460，其中可僅使用三個擷取到之影像來重建構高解析度影像。

如先前指示，當使用可利用降維SIM實施方案之特定圖案化流量槽時，諸如TDI線掃描之線掃描技術可用以對含於彼等圖案化流量槽中之樣品進行成像。圖5係說明各種實施方案中之可用以對樣品進行成像之實例雙通道線掃描成像系統500的方塊圖。

如在圖2之結構化照明成像系統200的狀況下，線掃描成像系統500可用於對核酸進行定序，其中彼等核酸以陣列方式附接於固定位置處（即，諸如流量槽320之流量槽的井）且陣列可反覆地成像。在此等實施方案中，線掃描成像系統500可獲得兩個不同色彩通道中之影像，該些色彩通道可用以彼此區分特定核苷酸鹼基類型。更特定言之，線掃描成像系統500可實施被稱作「鹼基識別」之程序，其一般指代在成像循環時判定影像之給定光點位置的鹼基識別（例如，腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）或胸嘧啶（T））之程序。在雙通道鹼基識別期間，自兩個影像提取之影像資料可用以藉由將鹼基身分編碼為兩個影像之強度的組合來判定四個鹼基類型中之一者的存在。對於兩個影像中之每一者中的給定光點或位置，可基於信號識別項之組合係[接通，接通]、[接通，斷開]、[斷開，接通]抑或[斷開，斷開]而判定鹼基識別項。

再次參考線掃描成像系統500，該系統包括在其中安置有兩個光源511及512之線產生模組LGC 510。光源511及512可係相干光源，諸如輸出雷射光束之雷射二極體。光源511可發射第一波長（例如，紅色波長）下之光，且光源512可發射第二波長（例如，綠色波長）下之光。自雷射源511及512輸出之光束可被導引穿過一或多個光束塑形透鏡513。在一些實施方案中，單一光整形透鏡可用以對自兩個光源輸出之光束進行整形。在其他實施方案中，單獨光束整形透鏡可用於各光束。在一些實例中，光束整形透鏡係鮑威爾透鏡（Powell lens），以使得光束經整形成線型圖案。LGC 510或其他光學組件成像系統之光束塑形透鏡經組態以將由光源511及512發射之光塑形成線圖案（例如，藉由使用一或多個鮑威爾透鏡或其他光束塑形透鏡、繞射或散射組件）。舉例而言，在一些實施方案中由光源511及512發射之光可經發送穿過光學繞射光柵以產生可投影至樣品上之光學繞射光柵圖案（SIM圖案）。

LGC 510可進一步包括經組態以將光束導引穿過單個界面通口到達發射光學模組（emission optics module；EOM）530之鏡面514及半反射鏡面515。光束可通過光束可穿過快門元件516。EOM 530可包括物鏡535及將物鏡535更接近或更遠離目標550縱向移動之z台536。舉例而言，目標（例如，圖案化流量槽）550可包括液體層552及半透明蓋板551，且生物樣品可定位於半透明蓋板之內表面以及基材層之位於液體層下方的內表面處。z台接著可使物鏡移動以便將光束聚焦至流量槽之任一內表面上（例如，聚焦於生物樣品上）。如此項技術中已知的，生物樣品可係回應於光學定序的DNA、RNA、蛋白質或其他生物材料。

EOM 530可包括半反射鏡面533以將自焦點追蹤模組（focus tracking module；FTM）540發射之焦點追蹤光束反射至目標550上，接著將自目標550返回之光反射回至FTM 540中。FTM 540可包括聚焦追蹤光學感測器，以偵測返回的聚焦追蹤光束之特性且產生回饋信號以最佳化物鏡535在目標550上之聚焦。

EOM 530亦可包括半反射鏡面534以導引光穿過物鏡535，同時允許自目標550返回之光通過。在一些實施方案中，EOM 530可包括管透鏡532。穿過管透鏡532透射之光可通過濾光片元件531且至相機部件520中。相機部件520可包括一或多個光學感測器521，例如TDI線掃描感測器，以回應於入射光光束偵測自生物樣品發射之光（例如，回應於自光源511及512接收到之紅光及綠光而偵測螢光）。在一個實例中，LGC（諸如上文所描述之LGC）可將光投影穿過繞射光柵以產生線性條紋圖案。

來自相機部件520之感測器的輸出資料可經傳達至即時分析電路525。在各種實施方案中，即時分析電路525執行用於分析影像資料（例如，影像品質計分、鹼基識別等等）、向圖形使用者介面（graphical user interface；GUI）等等報告或顯示光束之（例如，聚焦、形狀、強度、功率、亮度、位置）特性的電腦可讀取指令。此等操作可在成像循環期間即時地執行以最少化下游分析時間且在成像運作期間提供即時回饋及故障診斷。在實施方案中，即時分析電路525可係以通信方式耦接至成像系統500且控制該成像系統之計算裝置（例如，計算裝置1100）。在下文進一步描述之實施方案中，即時分析電路525可另外執行用於修正自相機部件520接收到之輸出影像資料中之失真的電腦可讀取指令。

圖6A至圖6C表示非對稱圖案化流量槽之TDI線掃描的實例表示，其中SIM係用以增加沿著流量槽之一個軸線的解析度。特定言之，圖6A說明上面重疊SIM圖案630之非對稱圖案化流量槽620（其可係非對稱圖案化流量槽320（圖3C）之實施方案）。可沿著y軸執行TDI線掃描，以擷取非對稱圖案化流量槽620之逐列影像。在第一相位中運用SIM圖案630擷取在圖6A中擷取到之影像。

作為實例，線掃描成像系統500可使用LGC 510來與系統之光學件協調以運用具有紅色光譜內之波長的光對樣品進行線掃描（與SIM圖案，即光學繞射光柵圖案重疊）且運用綠色光譜內之波長的光對樣品進行線掃描。回應於線掃描，位於樣品之不同光點處的螢光染料可發螢光，且所得光可由物鏡535收集且經導引至相機部件520之影像感測器以偵測螢光。舉例而言，各光點之螢光可由相機部件520之幾個像素偵測到。可接著將自相機組部件520輸出影像數據傳達至即時分析電路525以供處理，例如以組合影像來形成條帶。

圖6B說明與SIM圖案630重疊之非對稱圖案化流量槽620。然而，在圖6B中，SIM圖案630已沿著x軸相移（與軸線對準，從而需要解析度增加以解析樣品）。如上文所描述，線掃描成像系統500可使用LGC 510來與系統之光學件協調以對樣品進行線掃描（與經相移SIM圖案630重疊）。可自相機部件520擷取且輸出影像，且在此將影像傳達至即時分析電路525以供處理。

圖6C說明與SIM圖案630重疊之非對稱圖案化流量槽620。在圖6C中，SIM圖案630已沿著x軸相移至第三相位（與軸線對準，從而需要解析度增加以解析樣品）。又，線掃描成像系統500可使用LGC 510來與系統之光學件協調以對樣品進行線掃描（與經相移SIM圖案630重疊）。可自相機部件520擷取且輸出影像，且在此將影像傳達至即時分析電路525以供處理。根據各相位/相移所擷取之影像可由即時分析電路525組合成單個影像，且重變換成真實空間以在此實例中沿著x軸產生具有更高解析度之影像。

在另一實施方案中，如圖6D中所說明，流量槽620之不同部分可在其不同相位中與SIM圖案630重疊。亦即，第一相位630A中之SIM圖案沿著流量槽620之下部部分重疊，第二相位630B中之相同SIM圖案沿著流量槽620之中間部分重疊，且又，第三相位630C中之相同SIM圖案沿著流量槽620之上部部分重疊。因此線掃描成像系統500對與SIM圖案（630A至630B）之不同相位重疊之流量槽620進行線掃描，使得線掃描成像系統500可在單次運程中根據SIM圖案之各必備相位而對整個流動進行成像。在一些實施方案中，線掃描成像系統500可經修改以具有多個LGC及多個，例如三個，相機或感測器/相機部件，其各者穿過三個光學繞射光柵（相同但定向於不同相位中）產生且輸出光以產生SIM圖案之三個相位。以此方式，各相機或感測器/相機部件能夠同時擷取流量槽620之影像連同不同SIM圖案相位。

如上所述，在又其他實施方案中，可移動樣品/流量槽，同時SIM圖案保持靜止。當實施TDI線掃描時，樣品/流量槽已移動。因此，可利用樣品/流量槽之此移動以避免必須使SIM圖案移位。亦即，相對於靜止SIM圖案移動樣品/流量槽會產生解析樣品所需之必備相位。

圖7說明類似於六邊形陣列圖案化流量槽300（圖3A）之另一實例圖案化流量槽720。在習知結構化照明成像系統中，可例如在y軸之方向上對流量槽720進行線掃描。由LGC，例如LGC 510（圖5），輸出至流量槽720中之樣品上之光束的強度展示為沿著x軸（圖中未示，但實質上或恰好垂直於線掃描方向）係寬且均質的。然而，沿著y軸，光束之強度係窄的。當雷射光束相對於流量槽720移動時，藉由線掃描相機或感測器擷取螢光影像，例如光束由照明之對應區域中的相機部件520（圖5）。

然而，利用樣品/流量槽720已移動之實情，且僅需要一維SIM以解析非對稱圖案化流量槽，例如流量槽320（圖3C），中之樣品，可使產生SIM圖案之光學繞射光柵保持靜止。亦即，需要必備的多個（例如，三個）相位以充分地解析樣品。因此，在此實施方案中，在習知線掃描成像系統中不需要移動台或其他元件來移動，例如旋轉或平移光學繞射光柵。

圖8說明使用靜止光學繞射光柵之實例線掃描成像系統800。應注意，為了易於解釋，圖8係並非展示所有特徵/元件之簡化圖示。然而，線掃描系統800可係使用靜止光學繞射光柵以使所得光學繞射光柵圖案/SIM圖案保持靜止之線掃描成像系統500的一個實施方案。

在圖8之實例中，光發射器，例如雷射器802，經組態以輸出由準直透鏡804準直之光束。在一個實施方案中，雷射器802發射綠色波長光。準直光由雙色濾光片806經由另一雙色濾光片828導引穿過靜止光學繞射光柵812至物鏡830至樣品容器832之樣品上。在此實施方案中，樣品容器830係非對稱圖案化流動槽，諸如流量槽320（圖3C）。

第二光發射器，例如雷射器808，穿過靜止光學繞射光柵812向物鏡830發射光（例如紅色波長光），且亦經由雙色濾光片828將光發射至樣品容器832之樣品上。樣品容器832定位於可遠離雷射器802及808相對於光束移動樣品容器832之台840上。在螢光樣品之狀況下，樣品回應於結構化激發光（來自雷射器802及808之雷射光束）而發螢光，且所得光由物鏡828收集且經導引至相機814及820之影像感測器。

雙色濾光片806用以傳遞來自雷射器802之綠色光束以繼續通過至靜止光學繞射光柵812，同時朝向靜止光學繞射光柵812反射來自雷射器808之紅色光束。雙色濾光片828類似地起作用，原因在於其允許來自雷射器802及808之紅色及綠色光束經反射至物鏡830，同時允許相機814及820分別擷取以綠色及紅色光發出螢光之影像。雙色濾光片816將來自發螢光之樣品的綠光發射導引至相機814，而雙色濾光片822將來自發螢光之樣品的紅光發射導引至相機820。透鏡818及824分別係用於相機814及820之準直透鏡。雙色鏡826將來自發螢光之樣品的綠光及紅光發射導引至適當相機。

在線掃描系統800中，光學繞射光柵812係靜止的。亦即，如先前論述，藉由使用非對稱圖案化流量槽結合SIM，僅需要一個結構化照明維度，且可藉由沿著流量槽移動光束來達成多個相位。換言之，需要雷射光束相對於樣品/流量槽之移動或樣品/流量槽相對於雷射光束之移動從而引起樣品與條紋激發圖案之間的相對移動，以產生不同相位。

圖9說明可運用諸如線掃描系統800之線掃描成像系統線掃描的圖案化流量槽920。光學繞射光柵圖案可投影至流量槽920上，而流量槽920根據線掃描成像技術而移動。流量槽920相對於靜止光學繞射光柵圖案之移動產生必需相移，且一旦組合且重變換成真實空間，則在線掃描期間擷取到之影像會增加解析度，如先前論述。

特定言之，光束在y軸之方向上移動。又，光束之強度沿著x軸（圖中未示）均質，但沿著y軸之強度歸因於通過靜止光學繞射光柵，例如靜止光學繞射光柵812（圖8）而得以調變。當光束相對於流量槽920移動時，光學繞射光柵圖案移位。實際上，可產生多於三個或甚至幾十個相移。結果，藉由移動樣品/流量槽920而非光學繞射光柵，可達成沿著線掃描之軸線的解析度增加。在一些實施方案中，如上文所描述，此方向上之解析度可在具有兩個隨機特徵或週期性圖案之表面上增加至少兩倍。應理解，因為解析度可增加例如至少兩倍，所以流量槽920中之奈米井的密度可按兩倍或更多倍之因子增加。

圖10係說明可在諸如線掃描成像系統500（圖5）或線掃描成像系統800（圖8）之線掃描成像系統中執行以使用非對稱圖案化流量槽來對樣品進行序列之實例操作的流程圖。在操作1000處，穿過靜止光學繞射光柵輸出來自雷射源，例如雷射源802及808，的光束，例如，可接通對應於第一光學繞射光柵圖案定向的靜止光學繞射光柵812。在操作1010處，將光學繞射光柵圖案投影至樣品上，且在操作1020處，對樣品進行線掃描。可如先前關於線掃描成像系統800（圖8）所描述而執行線掃描。在操作1030處，根據前述線掃描技術而移動樣品，或可如上文所描述而移動經導引光以達成樣品與光學繞射光柵圖案之間的相對運動。

操作1020及1030可視需要重複多次以擷取代表整個樣品之影像。又，由於相對於靜止光學繞射光柵圖案移動樣品，可跨越增加解析度所需之必備相移擷取樣品及光學繞射光柵圖案之影像。在操作1040處，可重建高解析度影像。

應注意，為了防止線掃描期間的光學繞射光柵圖案與樣品之間的運動模糊，雷射源可以脈衝方式操作。亦即，雷射源，例如雷射源802及808，可經脈衝以使得在每次激發時，可擷取線掃描影像。在一些實施方案中，光學繞射光柵圖案相對於樣品/流量槽之定向可移位90°。在其他實施方案中，如圖6A至圖6C所說明，若光學繞射光柵圖案之定向係使得樣品不移動穿過明及暗區域（如同光學繞射光柵圖案之定向移位90°的情況下可能的狀況），則可不需要雷射源之脈衝，此係因為樣品相對於光學繞射光柵圖案之移動移動穿過相同條紋強度。

圖11說明可用以實施本文所揭示之系統及方法之各種特徵的實例計算組件，諸如圖4及圖10中所說明之實施於系統200、500及/或800中及本文中所描述之方法之一或多個態樣的前述特徵及功能性。舉例而言，計算組件可實施為即時分析電路525。

如本文所使用，術語電路可描述可根據本申請案之一或多個實施方案而執行之給定功能性單元。如本文所使用，可利用任何形式之硬體或硬體與軟體之一組合來實施電路。舉例而言，一個或多個處理器、控制器、ASIC、PLA、PAL、CPLD、FPGA、邏輯組件、軟體常式或其他機構可經實施以組成電路。在實施方案中，本文中所描述之各種電路可實施為離散電路，或所描述功能及特徵可在一或多個電路當中部分或完整地共用。換言之，在閱讀本說明書之後，一般熟習此項技術者可瞭解本文中所描述之各種特徵及功能性可實施於任何給定應用中，且可以各種組合及排列實施於一或多個單獨或經共用電路中。即使功能性之各種特徵或要素可個別地描述或主張為單獨模組，但一般熟習此項技術者將理解，此等特徵及此功能性可在一或多個共同軟體及硬體元件間共用，且此描述不應需要或暗示單獨硬體或軟體組件用以實施此等特徵或此功能性。

在使用軟體全部或部分地實施本申請案之組件或電路的情況下，在一個實施方案中，可實施此等軟體元件以藉由能夠進行關於其所描述之功能性的計算或處理模組操作。在圖13中展示一個此實例計算組件。各種實施方案係關於此實例計算組件1000而描述。在閱讀本說明書之後，如何使用其他計算模組或架構來實施本申請案對於相關領域之技術人員將變得顯而易見。

現參看圖13，計算組件1000可代表例如可見於以下各者內的計算或處理能力：桌上型電腦、膝上型電腦、筆記型電腦及平板電腦；手持型計算裝置（平板電腦、PDA、智慧型手機、蜂巢式電話、掌上型電腦等）；大型電腦、超級電腦、工作站或伺服器；或任何其他類型之專用或通用計算裝置，如可能為給定應用或環境所需或適合的。計算組件1000亦可代表嵌入於給定裝置內或以其他方式可用於給定裝置之計算能力。舉例而言，計算組件可見於諸如以下各者之其他電子裝置中：數位相機、導航系統、蜂巢式電話、攜帶型計算裝置、數據機、路由器、WAP、終端機及可包括某一形式之處理能力的其他電子裝置。

計算組件1000可包括例如一或多個處理器、控制器、控制模組或其他處理裝置，諸如處理器1004。可使用諸如微處理器、控制器或其他邏輯控制之通用或專用處理引擎來實施處理器1004。在所說明實例中，處理器1004連接至匯流排1002，但任何通信媒體可用以便於與計算組件1000之其他組件交互或在外部通信。

計算組件1000亦可包括一或多個記憶體模組，其在本文中被簡單地稱作主記憶體1008。舉例而言，隨機存取記憶體（random access memory；RAM）或其他動態記憶體較佳地可用於儲存資訊及待由處理器1004執行之指令。主記憶體1008亦可用於在待由處理器1004執行之指令之執行期間儲存暫時性變數或其他中間資訊。計算組件1000同樣可包括耦接至匯流排1002以用於儲存用於處理器1004之靜態資訊及指令的唯讀記憶體（「read only memory；ROM」）或其他靜態儲存裝置。

計算組件1000亦可包括一或多個各種形式之資訊儲存機構1010，其可包括例如媒體驅動器1012及儲存單元介面1020。媒體驅動器1012可包括驅動器或其他機構以支援固定或抽取式儲存媒體1014。舉例而言，可提供硬碟機、固態磁碟機、磁帶機、光碟機、CD或DVD驅動機（R或RW）或其他抽取式或固定媒體驅動機。因此，儲存媒體1014可包括例如硬碟、固態磁碟機、磁帶、卡匣、光碟、CD、DVD或藍光，或藉由媒體驅動機1012讀取、寫入至媒體驅動機或由媒體驅動機存取之其他固定或抽取式媒體。如此等實例說明，儲存媒體1014可包括電腦可用儲存媒體，其中儲存有電腦軟體或資料。

在替代性實例中，資訊儲存機構1010可包括用於允許電腦程式或其他指令或資料載入至計算組件1000中的其他類似工具。此類工具可包括例如固定或抽取式儲存單元1022及介面1020。此等儲存單元1022及介面1020之實例可包括程式卡匣及卡匣介面、抽取式記憶體（例如，快閃記憶體或其他抽取式記憶體模組）及記憶體槽、PCMCIA槽及卡，以及允許軟體及資料自儲存單元1022傳送至計算組件1000的其他固定或抽取式儲存單元1022及介面1020。

計算組件1000亦可包括通信介面1024。通信介面1024可用以允許軟體及資料在計算組件1000與外部裝置之間傳送。通信介面1024之實例可包括數據機或軟數據機、網路介面（諸如，乙太網路、網路介面卡、WiMedia、IEEE 802.XX或其他介面）、通信埠（諸如USB埠、IR埠、RS232埠、Bluetooth®介面或其他埠）或其他通信介面。經由通信介面1024傳送之軟體及資料可典型地攜載於信號上，該些信號可係能夠藉由給定通信介面1024進行交換之電子、電磁（包括光學）或其他信號。可經由通道1028將此等信號提供至通信介面1024。此通道1028可攜載信號且可使用有線或無線通信媒體來實施。通道之一些實例可包括電話線、蜂巢式鏈路、RF鏈路、光學鏈路、網路介面、區域或廣域網路，及其他有線或無線通信通道。

在此文件中，術語「電腦可讀取媒體」、「電腦可用媒體」及「電腦程式媒體」一般用以指非暫時性的揮發性或非揮發性媒體，諸如記憶體1008、儲存單元1022及媒體1014。此等及其他各種形式之電腦程式媒體或電腦可用媒體可與載運一或多個指令之一或多個序列至處理裝置以供執行有關。具體化於媒體上之此等指令通常被稱為「電腦程式碼」或「電腦程式產品」（其可以電腦程式或其他分組之形式來分組）。此等指令在執行時可使計算模組1000能夠執行如本文中所論述的本申請案之特徵或功能。

儘管上文就各種實例及實施方案進行了描述，但應理解，在個別實施方案中之一或多者中所描述之各種特徵、態樣及功能性在其適用性上不限於對其進行描述時所涉及之特定實施方案，而是可單獨或以各種組合應用於本申請案之其他實施方案中之一或多者，無論此等實施方案是否進行了描述，以及此等特徵是否作為所描述實施方案之一部分而呈現。因此，本申請案之廣度及範圍不應受上述實例實施方案中之任一者限制。

應瞭解，前述概念（假設此類概念並非相互不一致）之所有組合預期為本文所揭示之發明性主題的部分。詳言之，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合預期為本文所揭示發明性主題的部分。

貫穿包括申請專利範圍之本發明所使用的術語「實質上」及「約」用以描述且考量諸如歸因於處理中之變化的小波動。舉例而言，其可指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%、諸如小於或等於±1%、諸如小於或等於±0.5%、諸如小於或等於±0.2%、諸如小於或等於±0.1%、諸如小於或等於±0.05%。

在適用範圍內，術語「第一」、「第二」、「第三」等在本文中僅用以展示藉由此等術語描述為單獨實體的各別物件，且並不意圖意味著時間次序之意義，除非本文中以其他方式明確地陳述。

除非另有明確規定，否則本文件中所使用之術語及片語及其變體應解釋為與限制性相反之開放式。作為前述內容之實例：術語「包括」應理解為意謂「包括但不限於」或其類似者；術語「實例」用以提供所論述之項目的範例性實施例，而非該項目之詳盡或限制性清單；術語「一（a或an）」應理解為意謂「至少一個」、「一或多個」或其類似者；且諸如「習知」、「傳統」、「常規」、「標準」、「已知」及具類似含義之術語的形容詞不應解釋為將所描述項目限於給定時間段或限於截至給定時間可獲得之項目，而是應理解為涵蓋現在或在未來之任何時間可獲得或已知的習知、傳統、常規或標準技術。同樣，在本文件提及一般熟習此項技術者可顯而易見或已知之技術時，此等技術涵蓋現在或在未來之任何時間對熟練技術人員顯而易見或已知之技術。

在一些情況下，拓寬詞語及片語，諸如「一或多個」、「至少」、「但不限於」或其他類似片語，之存在不應理解為意謂在可能不存在此等拓寬片語之例子中預期或需要較狹窄情況。

另外，本文所闡述之各種實施方案係關於實例方塊圖、流程圖及其他說明而描述。如一般熟習此項技術者在閱讀本文件之後將變得顯而易見，可實施所說明實施方案及其各種替代例而不限於所說明實例。舉例而言，方塊圖及其隨附描述不應被視為要求特定架構或組態。

雖然上文已描述了本發明之各種實施方案，但應理解，該些實施已藉由實例呈現且並非限制性的。同樣地，各圖可描繪用於本發明之實例架構或其他組態，可進行描繪以輔助理解可包括於本發明中之特徵及功能性。本發明不限於所說明實例架構或組態，但所要特徵可使用多種替代性架構及組態來實施。實際上，熟習此項技術者將顯而易見可如何實施替代性功能性、邏輯或實體分割及組態以實施本發明之所要特徵。又，除本文中所描繪之名稱外的眾多不同構成組件名稱可應用於各種分區。另外，關於流程圖、操作描述及方法請求項，除非上下文另外規定，否則步驟在本文中呈現之次序不應要求各種實施方案經實施為以相同次序執行所敍述功能性。

100:樣品 102:光學繞射光柵圖案 120:圖形 122:圖形 124:圖形 126:圖形 200:結構化照明成像系統 210:樣品容器 220:放泄閥 230:溫度台致動器 235:加熱器/冷卻器 240:相機系統 242:物鏡 250:光發射器 251:準直透鏡 252:光纖 255:光結構化光學部件 256:管透鏡 260:雙色鏡 265:濾光片切換部件 270:樣品台 275:聚焦組件 290:流體遞送模組/裝置 300:流量槽 302:光點 304:六邊形陣列 306:圖形 308:軸線 310:流量槽 312:奈米井 314:正方形陣列 316:圖形 318:軸線 320:圖案化流量槽 322:奈米井 352:圖形 400:操作 410:操作 420:操作 430:操作 440:操作 450:操作 460:操作 500:線掃描成像系統 510:線產生模組 511:光源 512:光源 513:光束塑形透鏡 514:鏡面 515:半反射鏡面 516:快門元件 520:相機部件 521:光學感測器 525:即時分析電路 530:發射光學模組（EOM） 531:濾光片元件 532:管透鏡 533:半反射鏡面 534:半反射鏡面 535:物鏡 536:z台 540:焦點追蹤模組（FTM） 550:目標 551:半透明蓋板 552:液體層 620:非對稱圖案化流量槽 630:結構化照明顯微鏡（SIM）圖案 630A:第一相位 630B:第二相位 630C:第三相位 720:流量槽 800:線掃描成像系統 802:雷射器/雷射源 804:準直透鏡 806:雙色濾光片 808:雷射器/雷射源 812:光學繞射光柵 814:相機 816:雙色濾光片 818:透鏡 820:相機 822:雙色濾光片 824:透鏡 826:雙色鏡 828:雙色濾光片 830:樣品容器 832:樣品容器 840:台 920:流量槽 1000:操作 1010:操作 1020:操作 1030:操作 1040:操作 1100:計算裝置/計算組件 1102:匯流排 1104:處理器 1108:記憶體 1110:儲存裝置 1112:媒體驅動器 1114:媒體 1120:儲存單元介面 1122:儲存單元 1124:通信介面 1128:通道 P_x:間距 P_y:間距

參看以下圖式詳細地描述根據一或多個各種實施方案的本發明。僅出於說明之目的提供諸圖，且其僅描繪典型或實例實施方案。 [圖1A]說明用以降低樣品之頻率模式從而允許增大之解析度之結構化照明的一個實例。 [圖1B]在一個實例中說明解析樣品以供成像所需之角度的數目。 [圖2]說明結構化照明成像系統之一個實例。 [圖3A]說明六邊形流量槽圖案之一實例。 [圖3B]說明正方形陣列流量槽圖案之一實例，其之使用導致降低維度的結構化照明成像。 [圖3C]說明非對稱陣列流量槽圖案之一實例，其之使用導致降低維度的結構化照明成像。 [圖4]係說明可針對降低維度的結構化照明成像實施之實例操作的流程圖。 [圖5]說明線掃描成像系統之一個實例。 [圖6A至圖6C]在一個實例中說明一個維度中之結構化照明圖案的相移。 [圖6D]說明具有同時與經相移結構化照明圖案重疊之不同部分之非對稱圖案化流量槽的一個實例。 [圖7]說明使用以習知方式圖案化之流量槽之線掃描操作的一實例。 [圖8]說明使用靜止結構化照明圖案之線掃描成像系統的一實例。 [圖9]說明使用調變照明光束之靜止結構化照明圖案之線掃描操作的一實例。 [圖10]係說明可針對結合線掃描成像使用之降維結構化照明成像實施之實例操作的流程圖。 [圖11]說明可用以實施描述於本發明中之實施方案之各種特徵的實例計算組件。 諸圖並非詳盡的且不將本發明限於所揭示精確形式。

1000:操作

1010:操作

1020:操作

1030:操作

1040:操作

Claims (20)

1. 一種對生物樣品進行成像之方法，其包含： 藉由將光導引穿過靜止光學繞射光柵而線掃描生物樣品以將光學繞射光柵圖案投影至所述生物樣品上，該生物樣品的至少一部分被放置在多個奈米井之中，所述多個奈米井被定向為非對稱圖案； 在所述生物樣品上相移被投影的所述光學繞射光柵圖案；以及 重建代表該生物樣品之影像。
2. 如請求項1所述之方法，其中該光包含在第一波長中的光以及在第二波長中的光。
3. 如請求項2所述之方法，其中該第一波長是綠色光譜波長。
4. 如請求項1所述之方法，其進一步包含來自第一雷射和第二雷射的發射光。
5. 如請求項1所述之方法，其中相移被投影的所述光學繞射光柵圖案包括將所述生物樣品相對於所述光學繞射光柵圖案而移動，或者是將所述光相對於所述光學繞射光柵圖案而移動。
6. 如請求項1所述之方法，在所述生物樣品上相移被投影的所述光學繞射光柵圖案包括至少三個相移。
7. 如請求項1所述之方法，其中所述光學繞射光柵圖案包括複數個縱向條紋。
8. 如請求項1所述之方法，其中所述多個奈米井被定向為非對稱圖案包括沿著第一軸的細長奈米井。
9. 如請求項8所述之方法，其中線掃描所述生物樣品包括平行於所述第一軸而將所述生物樣品相對於所述光學繞射光柵圖案而移動。
10. 如請求項8所述之方法，其中線掃描所述生物樣品包括垂直於所述第一軸而將所述生物樣品相對於所述光學繞射光柵圖案而移動。
11. 如請求項1所述之方法，其中所述生物樣品的掃瞄包括該生物樣品之時間延遲積分線掃描。
12. 一種系統，包含: 線掃描部件，其包括靜止光學繞射光柵，所述靜止光學繞射光柵被調適以在所發射光束通過該靜止光學繞射光柵之後即刻產生光學繞射光柵圖案，所述線掃描部件投影所述光學繞射光柵圖案於生物樣品上，所述生物樣品的至少一部分被放置在多個奈米井之中，所述多個奈米井被定向為非對稱圖案; 一個或多個光學感測器，以用於擷取代表該生物樣品之影像； 分析電路，其根據由所述一個或多個光學感測器所擷取的所述影像來重建代表該生物樣品之影像。
13. 如請求項12所述之系統，其中所述線掃描部件包括第一光源及第二光源，所述第一光源輸出第一波長的第一光束，所述第二光源輸出第二波長的第二光束。
14. 如請求項12所述之系統，其中該第一波長是綠色光譜波長。
15. 如請求項12所述之系統，其進一步包括載台，被放置在所述多個奈米井中的所述生物樣品被放置在所述載台上。
16. 如請求項15所述之系統，其中所述載台相對所述光學繞射光柵圖案而移動所述生物樣品以產生複數個相移。
17. 如請求項16所述之系統，其中所述複數個相移包含所述光學繞射光柵圖案之至少三個相移。
18. 如請求項12所述之系統，所述光學繞射光柵圖案包括複數個縱向條紋。
19. 如請求項12所述之系統，其中所述多個奈米井被定向為非對稱圖案包括沿著第一軸的細長奈米井。
20. 如請求項12所述之系統，其中所述一個或多個光學感測器包括時間延遲積分感測器。

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