WO2013115476A1 - 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법 - Google Patents

검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법 Download PDF

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paraffin
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송강원
김연희
김인후
이진수
이건국
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Definitions

  • the present invention collects specimens, such as biological tissue, biological fluids, or single cells, into masses, assemblies and aggregates to produce microscopic observations, biomonitoring, testing, and disease.
  • Composition used in the manufacture of paraffin blocks for diagnosis, prediction, verification, detection, identification or screening of diseases, and monitoring of diseases (hereinafter referred to as 'composition for aggregating a sample'), and a composition for aggregating the sample
  • the present invention relates to a method for microscopic observation of a specimen sample.
  • the present invention also provides a method for producing a cell microarray cell population sample comprising the step of aggregating a cell sample, such as tissue cells (culture tissue) or cultured cells (cultured cells) using the composition for aggregation of the sample sample and It relates to a cell block sample for cell microarray prepared by the above method.
  • a cell sample such as tissue cells (culture tissue) or cultured cells (cultured cells) using the composition for aggregation of the sample sample and It relates to a cell block sample for cell microarray prepared by the above method.
  • Pathological biopsy is a test that determines the disease name of a disease, such as cancer, through microscopic observation by removing or inhaling human tissue with a disease.
  • Biological or cellular testing is based on observing and determining the morphological changes of tissue or cells, unlike other clinicopathological methods.
  • Today with the tendency to want objective data, many efforts are being made to obtain such data, and various special methods are used for this purpose.
  • immunohistochemical staining or molecular pathologic evaluation.
  • immunohistochemical staining confirms the origin of undifferentiated cells, estimates the presence or absence of enzymes, hormones, tumor markers and prognostic factors, distinguishes between carcinomas and sarcomas, and estimates the primary lesions for differential metastasis between benign and malignant tumors. It is used efficiently.
  • Immunohistochemical staining is a highly sensitive and specific test that has been used for diagnostic pathology and morphological studies in recent 20-30 years.
  • Diagnostic cytology is a field of pathology that determines the presence or content of lesions in terms of morphology on the basis of cellular findings, and uses cells or instruments that are naturally removed from various parts of the human body by various clinical procedures. Refers to clinical laboratory medicine that analyzes cells removed from the surface or inside of a tissue under a microscope.
  • Diagnostic cytology includes: i) spontaneous shedding diagnostic cytology, in which cells spontaneously depleted by normal or pathological causes are plated on a slide by a predetermined method, fixed stained and then examined; ii) cell inhalation biopsy diagnostic cytology, in which the needle is attached to the lesion using a needle and inhaled, the cells are forcibly harvested, plated on a slide, and stained after fixation staining; iii) direct adherent smear cytology, in which the slides are directly contacted with a slide to the lesions visible to the naked eye in order to quickly recognize the diagnosis result during or after the operation, and then stained by fixation staining; iv) cell smear examination by taking a sample of cells and spreading them thinly on a glass slide and observing under a microscope; v) cell population sectioning method in which paraffin and the like are infiltrated into cellular precipitates obtained from liquid test specimens, and then sections are prepared and examined; And vi) a sputum
  • cell population fragmentation has superior advantages over other methods, and special staining for identifying other cell products, bacteria, and fungi is possible when needed, and direct preparation of flowable specimens is possible. And significant diagnostic value in that valuable diagnostic evidence that cannot be observed in other methods can be observed.
  • a method for making conventional cell population samples comprising: i) sediment fixation using centrifugation and precipitation with formalin; ii) egg albumin usage using the principle of egg albumin coagulation in ethanol; iii) agar usage; iv) plasma-thrombin clotting; v) the use of a collodion bag; And vi) the Millpore filter method.
  • the paraffin block manufacturing method is used for the purpose of diagnosing, treating and researching diseases such as special staining and immunohistochemical staining based on the identification of biological tissues or cells, but when the amount of cells is small or the samples are small.
  • diseases such as special staining and immunohistochemical staining based on the identification of biological tissues or cells
  • the production of paraffin blocks has been difficult or impossible.
  • the shape or shape is small or small, so that the tissue or cells are interspersed or difficult to distinguish from paraffin after embedding the paraffin. There were problems that were impossible.
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2009-97068 discloses a new composition of embedding resin for histological examination of a support for tissue engineering and a method for manufacturing the slide according thereto. Specifically, 1-80% of paraffin and vinyl acetate are included. It is disclosed that the ethylene vinyl acetate copolymer is melt-mixed at 40-100 to 2-50%, and then a sample is added to the melt to infiltrate the mixed solution of paraffin and ethylene copolymer.
  • Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2007-046988 discloses a method for manufacturing a embedding block for biological tissue specimens and an information display label for embedding blocks
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2005-46826 discloses a tissue-specific fixative paraffin block using LEM.
  • Intact RNA extraction method in US Patent Application Publication No. WO 08/038813 discloses a method for performing a deparaffin process from a paraffin-embedded sample and analyzing it.
  • the cell microarray is used to treat various substances, for example, antibodies, proteins, lipids or stains, by using a cell population sample in the form of dot arrays of various kinds of tissue cells or cultured cells on a solid support surface.
  • a cell population sample in the form of dot arrays of various kinds of tissue cells or cultured cells on a solid support surface.
  • it refers to an experimental device that can obtain multiple information on protein and gene changes, cell responses or interactions of various cells (Chen DS et al., Curr Opin Chem Biol (2006), 10: 28-34).
  • a sample for cell microarray is prepared by microarraying cell pellets obtained from cell blocks prepared as described above in a fixed case and then blocking and fragmenting again. Therefore, the result may depend greatly on the aggregation and embedding process in the cell population preparation process.
  • the present invention solves the problems of the prior art to provide microscopic observation, biomonitoring, testing, diagnosis, prediction of diseased specimens, such as trace amounts of biological tissue, biological fluids or single cells.
  • manufacture of paraffin blocks for the verification, detection, identification or screening and disease monitoring the production of mass, assembly and formation (hereinafter referred to as 'sample complex') It is made in the separator tube, which minimizes the loss or loss of the sample, reduces background staining, makes the paraffin block fabrication process very simple, saves the time and cost of making the paraffin block, and It is possible to improve the quality of sliced slides and to optimize the speculum area during microscopy of the specimen.
  • the present invention provides a method of microscopic observation of a specimen sample to distinguish between tissue that is not, tissue that is diseased, or cells that are not.
  • the present invention provides a method for preparing a cell population sample for cell microarrays and a cell population sample for cell microarrays prepared according to the method.
  • the present invention to solve the first problem
  • Polyvinyl alcohol polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinylpyrrolidon, polyacrylic acid, polyethyleneimine, polyamines, poly A first composition comprising any one or more water-soluble polymer and distilled water selected from the group consisting of polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride;
  • Any one or more organic adhesives selected from the group consisting of alcohols, xylenes and acetones and any one or more medical adhesives selected from the group consisting of cyanoacrylates, fibrin glues, protein glues, polyurethanes and polyethylene glycol (PEG) -containing sealants It provides a composition for aggregation of a specimen sample comprising a second composition comprising.
  • the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol)
  • the organic solvent is acetone
  • the medical adhesive is characterized in that the cyanoacrylate.
  • the first composition may further include carboxymethyl cellulose and dimethyl sulfoxide
  • the second composition may further include concentrated formalin. have.
  • the first composition may include 1.5 to 2.0 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of distilled water.
  • the first composition may be used in an amount of 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample to be aggregated.
  • the second composition may include 100 to 200 medical adhesive for 100 mL of the organic solvent.
  • the second composition may be used in an amount of 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample to be aggregated.
  • Polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinylpyrrolidon, polyacrylic acid, polyethyleneimine, polyamines on the precipitate Preparing a first sample solution by adding a first composition comprising at least one water-soluble polymer selected from the group consisting of polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride and distilled water;
  • At least one organic solvent selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone and cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant in the first sample solution.
  • It provides a method for producing a paraffin block of a sample comprising a; preparing a paraffin block by performing an automatic infiltration process for the aggregated sample precipitate.
  • the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol)
  • the organic solvent is acetone
  • the medical adhesive is characterized in that the cyanoacrylate.
  • the first composition may further include carboxymethyl cellulose and dimethyl sulfoxide
  • the second composition may further include concentrated formalin. have.
  • the fixation of the sample may be performed using formalin or alcohol.
  • the first composition comprises 1.5 to 2.0 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of distilled water
  • the second composition comprises 100 to 200 medical adhesives based on 100 mL of the organic solvent.
  • the first composition and the second composition may be used in an amount of 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample.
  • the second sample solution may be stirred.
  • the automatic permeation process may be performed by wrapping the aggregated sample precipitate in paper and then treating with alcohol, xylene and paraffin.
  • the alcohol treatment, xylene treatment and paraffin treatment may each be performed a plurality of times.
  • the present invention to achieve the third object,
  • It provides a method for microscopic observation of a specimen comprising a; stained paraffin block and observing with a microscope.
  • the medical adhesive may be one or more selected from the group consisting of cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane, and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant.
  • the organic solvent may be alcohol, xylene, acetone or a mixed solvent of one or more thereof.
  • the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol, PVA), polyethylene oxide (polyethylene oxide), polyacrylamide, polyvinylpyrrolidon (polyvinylpyrrolidon), polyacrylic acid (polyacrylic acid), polyethyleneimine, polyamines, polyamideamines, polyamideamines, and polydiallyldimethylammonium chloride.
  • the medical adhesive is cyanoacrylate (cyanoacrylate)
  • the organic solvent is acetone
  • the water-soluble polymer may be polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol, PVA).
  • the cyanoacrylate may be ethyl-2-cyanoacrylate.
  • the present invention provides a cell block sample for cell microarray prepared according to the method.
  • the water-soluble polymer and the medical adhesive and the sample are strongly bound in the centrifuge tube to form a sample complex, so that the loss of the sample or Loss can be minimized, paraffin block manufacturing process can be easily performed, time and cost required for paraffin block manufacturing can be saved, and the physical and chemical properties and adhesion of the water-soluble polymer support the sample.
  • the microscope can optimize the speculum site and reduce the background staining and improve the quality when staining with slides cut from the paraffin block due to the physical and chemical properties of the water-soluble polymer.
  • a method for preparing a cell microarray cell population sample comprising a step of aggregating cell samples such as tissue cells and culture cells by treating a medical adhesive-containing organic solvent and an aqueous solution containing a water-soluble polymer may contain a small amount of a fluid sample.
  • a cell microarray sample for the cell microarray excellent in morphological stability and density of cells through an efficient and economical process while minimizing the loss of the target sample.
  • the composition for aggregation, the preparation method of the paraffin block, the microscopic observation method and the preparation method of the cell block sample for cell microarray (cell microarray) according to the present invention histochemical examination (histochemical examination), immunohistochemistry It can be used and applied to the method (immunohistochemistry), in situ hybridization, cell culture (molecular study), observation using an electron microscope (electron microscope).
  • SEM scanning electron microscope
  • TEM transmission electron microscope
  • FIG. 2 is a process chart illustrating a process of aggregating a sample sample using the composition for aggregation of a sample sample according to the present invention.
  • FIG. 3 is a paraffin block prepared using an ascitic fluid aggregated by a composition for agglomeration of a specimen according to an embodiment of the present invention before (A) and after (B) staining with hematoxylin & eosin (B). ) Is a photomicrograph (arrow shows a sample).
  • Figure 4 is a conventional cell block manufacturing method and hematoxylin & eosin staining (H & E staining), plate cytokeratin (Pan cytokeratin) for paraffin sections prepared using ascites fluid in accordance with an embodiment of the present invention ) Microscopy taken after immunostaining and Ki-67 immunostaining.
  • H & E staining hematoxylin & eosin staining
  • vimentin hematoxylin & eosin staining
  • Immunohistochemical staining 200-fold magnification
  • pan-cytokeratin immunohistochemical staining 200-fold magnification
  • PAS histochemical staining 400-fold magnification
  • FIG. 6 shows photographs observed using a microscope after E-cadeherin immunostaining was performed on paraffin fragments prepared from pancreatic cancer tumor cells according to a conventional method for preparing a cell block and an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows photographs of paraffin sections prepared with cerebrospinal fluid of lung cancer patients at 100-fold magnification and 400-fold magnification, respectively, according to a conventional method for preparing a cell block and a lung cancer patient.
  • FIG. 8 shows hematoxylin & eosin staining (H & E staining), CD3 immunohistochemical staining, and PAS tissue for paraffin sections prepared from whole blood buffy coats of breast cancer patients according to one embodiment of the present invention. Chemical staining and pan-cytokeratin Immunohistochemical staining was performed and photographs were observed using a microscope.
  • FIG. 9 shows H & E staining and PCNA immunohistochemical staining of paraffin flakes prepared using a mouse adenocarcinoma cell line (MC 38 mouse colon adenocarcinoma cell line) and MCF cell line according to an embodiment of the present invention, followed by using a microscope. H & E staining and alcian blue staining were performed on the photographs observed and the oocyte samples of rats, and the photographs were observed using a microscope.
  • FIG. 10 illustrates H & E staining, PAP immunohistochemical staining, and E-cadherin immunohistochemical staining of paraffin sections prepared from pancreatic adenocarcinoma cells of patients with pancreatic adenocarcinoma, respectively, according to an embodiment of the present invention. The photograph was observed.
  • FIG. 11 is a photograph of DNA isolated from paraffin fragments prepared from lung adenocarcinoma cells and confirming the integrity of the isolated DNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows H & E staining and AFB staining for paraffin sections prepared from a human neck mass taken with a conventional needle slide method and fine needle aspiration biopsy according to an embodiment of the present invention. Next, the photographs observed using a microscope.
  • FIG. 13 shows H & E staining for paraffin sections prepared from thyroid samples collected by a fine needle aspiration biopsy according to a conventional AGAR cell block and a paraffin block manufacturing method according to an embodiment of the present invention. After PAP staining, the pictures were observed using a microscope.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating processes for preparing a cell block sample for cell microarray from cultured cells according to one embodiment of the present invention.
  • H & A hematoxylin and eosin staining
  • C-erb B2 protein in a cell population for cell microarray prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Immunohistochemistry (IHC) analysis using the result is a photograph.
  • 17 is a histochemical assay using a primary antibody against ⁇ -catenin and C-erb B2 protein in a cell microarray sample prepared according to an embodiment of the present invention. And immunohistochemical assays are the results of the analysis.
  • FIG. 18 is a photograph showing the results of fluorescence in situ hybridization (FISH) and silver in situ hybridization (SISH) analysis on a cell population for cell microarray prepared according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a composition for agglomeration of a specimen sample comprising a water-soluble polymer, distilled water, an organic solvent and a medical adhesive, a method for preparing a paraffin block using the same, and a method for observing a specimen sample using the paraffin block.
  • the present invention provides a method for preparing a cell microarray cell population sample including a step of aggregating cell samples such as tissue cells or cultured cells using the composition for aggregation of the sample sample.
  • the composition for agglomeration of a specimen sample according to the present invention comprises a first composition and a second composition, wherein the first composition is polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polyacrylamide, poly Any selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidon, polyacrylic acid, polyethyleneimine, polyamines, polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride One or more water soluble polymers and distilled water.
  • the first composition includes polyvinyl alcohol and distilled water, more preferably polyvinyl alcohol, distilled water, carboxymethyl cellulose and dimethyl sulfoxide. It further includes.
  • the water-soluble polymers are unique polymer materials that are soluble in water, and can be applied very widely from high-strength fibers to medical materials through the control of molecular variables, and have expensive stereoregularity from low-molecular weight polymers having low-cost hybrid arrays. It can be said to be an attractive material that is widely used because it can be used in various forms ranging from high molecular weight polymers.
  • polyvinyl alcohol and polyethylene oxide have properties that are not soluble in organic solvents such as alcohol, xylene, acetone, but soluble in water, which is polyvinyl alcohol and polyethylene oxide ( This is because polyethylene oxide) has a -OH group which is a hydrophilic group in its molecular structure.
  • the chemical properties of these water-soluble polymers were applied to the composition for embedding a specimen sample. That is, the above-mentioned water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol and polyethylene oxide do not dissolve in organic solvents such as alcohol, xylene, or paraffin, but dissolve in water. Thus, water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol and polyethylene oxide in distilled water.
  • the water-soluble polymer solution in which the solution is dissolved is used together with alcohol, xylene or acetone for sample aggregation, the sample and the water-soluble polymer form a complex upon aggregation and become harder as they precipitate during centrifugation.
  • the water-soluble polymer in the complex is removed from the water by reacting with water, and only the sample to be observed on the glass slide is left alone. You will not give.
  • the carboxymethyl cellulose of the present invention is obtained by replacing a hydroxy group (cellulose-OH) on C6 of a glucose residue constituting cellulose with a carboxymethyl group (-CH 2 COOH), and at least 40% of the hydroxy group by carboxy Substituted with methyl group is dissolved in water to make a stable gel.
  • carboxymethyl cellulose is used for research, such as isolation and purification of proteins as a food viscous agent or stabilizer.
  • Such carboxymethyl cellulose plays a role of assisting the water-soluble polymer when forming a complex with a biological sample.
  • dimethyl sulfoxide of the present invention is an aprotic polar solvent, which is generally used for the study of organic reactions and organic synthesis.
  • the dimethyl sulfoxide is strengthened with a biological sample. Do not allow the water-soluble polymer to separate easily.
  • the content ratio of each component of the first composition may include 1.5 to 2 parts by weight of the water-soluble polymer with respect to 100 parts by weight of distilled water.
  • the content of the water-soluble polymer exceeds the above range, there is a problem that ubiquitous aggregation of the sample occurs. And, if less than the above range there is a problem that the sample cohesion may be weakened.
  • the first composition may be used in an amount of 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample to be agglomerated, and in case of using the first composition in excess of the content, slight collapse of the sample due to over aggregation.
  • the sample cohesion is weakened or the sample coagulation is delayed, which is not preferable.
  • the composition for agglomeration of the specimen sample comprises a second composition, in addition to the first composition, the second composition is any one or more organic solvents and cyano selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone At least one medical adhesive selected from the group consisting of acrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane, and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant.
  • the second composition is any one or more organic solvents and cyano selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone
  • At least one medical adhesive selected from the group consisting of acrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane, and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant.
  • water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol and polyethylene oxide are well soluble in water, but are not soluble in organic solvents such as alcohol and xylene and are not deteriorated during storage.
  • polyvinyl alcohol forms a white sediment when agitated after adding acetone, and has a tendency to aggregate.
  • chemical properties as acetone, polyvinyl alcohol and / or polyethylene oxide and cyanoacrylate are applied.
  • a second composition including acetone was added to the sample complex formed by using the first composition to agglomerate the sample complex to form an aggregate sample precipitate.
  • the aggregated sample precipitate is formed into hard pellets through a centrifugation process, etc., and the paraffin block can be produced by further processing on these pellets.
  • cyanoacrylate also known as medical adhesive or adhesive
  • cyanoacrylate is used in a wide range of fields, from packaging medical instruments to surgical adhesive or adhesive and hemostasis, and has properties such as biocompatibility, biodegradability, and sterilization.
  • the cyanoacrylate has a property of solidifying by forming a polymer upon contact with water or a weak base, and in the present invention, by applying the chemical properties of such cyanoacrylate included in the second composition, the first composition In order to facilitate the aggregation of the sample complex formed by using.
  • the second composition may include a medical adhesive 100 to 200 with respect to 100 mL of the organic solvent, when the content of the medical adhesive exceeds the above range, the crystals in the washing process with water during dyeing after the production of paraffin block glass slides This is a problem because there is a possibility that it may remain in a small amount, and if it is less than the above range, there is a problem that the binding force is weak when forming the sample complex.
  • the medical adhesive is preferably cyanoacrylate at a concentration of 95-96% (volume / volume).
  • the second composition may be used in an amount of 300 to 500 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the sample to be aggregated.
  • the sample aggregation complex may be larger than the sample amount. Since there exists a possibility, it becomes a problem and when it uses below the said range, the possibility of lack of the aggregate which supports a sample becomes a problem.
  • Figure 1 shows a scanning electron micrograph of lung adenocarcinoma (Lung Adenocarcinoma) A549 cells aggregated by the composition for aggregation of a sample sample according to the present invention.
  • the spherical shape refers to lung adenocarcinoma A549 cells
  • the tangled material refers to the composition for aggregation according to the present invention.
  • FIG. 1 even cells that were not easily aggregated can be aggregated using the composition for aggregation of a sample sample according to the present invention. A more detailed description will be described in the following examples.
  • the present invention provides a method for producing a paraffin block of a specimen using the composition for aggregation, the method according to the invention,
  • a sample precipitate Preparing a first sample solution by adding a first composition comprising at least one water-soluble polymer selected from the group consisting of polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride and distilled water; At least one organic solvent selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone and cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant in the first sample solution.
  • a first composition comprising at least one water-soluble polymer selected from the group consisting of polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride and distilled water
  • At least one organic solvent selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone and cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant in the first sample solution.
  • Preparing a second sample solution by adding a second composition including any one or more medical adhesives; Centrifuging the second sample solution, removing the supernatant, and obtaining aggregated sample precipitate; And preparing a paraffin block by performing an auto-infiltration process for the aggregated sample precipitate.
  • FIG. 2 is a process chart illustrating a process of aggregating a sample sample using the composition for aggregation of a sample sample according to the present invention.
  • cells or other specimen samples are fixed using a fixative (step 1).
  • the fixing step of the specimen sample may be performed using a method conventionally used in the art, for example, formalin or alcohol, but is not limited thereto.
  • the fixed sample having a small amount or a small size is separated into a supernatant and a sample precipitate through centrifugation, and after separation, the supernatant is removed to obtain a sample precipitate (step 2).
  • the supernatant removal process it is preferable to carefully drain the supernatant so that the deposited sample is not lost.
  • the first composition of the flocculating composition according to the present invention is added to the precipitate obtained by pouring the supernatant (step 3), and the first composition is made of polyvinyl alcohol, polyethylene oxide ( polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinylpyrrolidon, polyacrylic acid, polyethyleneimine, polyamines, polyamideamine and polydiallyldimethylammonium Chloride (polydiallyldimethylammonium chloride) may include at least one water-soluble polymer and distilled water selected from the group consisting of, and may include 1.5 to 2.0 parts by weight of the water-soluble polymer with respect to 100 parts by weight of distilled water, the amount of the first composition used is It may be 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample.
  • the amount of the first composition to be added in consideration of the block size in the production of paraffin block in the future, when the sample amount is large, although a small amount may be used, it is preferable to use a large amount when the sample amount is small.
  • the second step according to the present invention is added relatively quickly. Perform the steps (step 4).
  • the second composition is a group consisting of any one or more organic solvents selected from the group consisting of alcohol, xylene and acetone and cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane, and polyethylene glycol (PEG) -containing sealant as described above. It includes at least one medical adhesive selected from, it is preferable to include a medical adhesive 100 to 200 with respect to 100 mL of the organic solvent, it can be used in an amount of 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample to be aggregated. . By this process, the sample is agglomerated to form a precipitate in a solution obtained by the addition of the second composition (referred to herein as "second sample solution" for convenience of description).
  • second sample solution a precipitate in a solution obtained by the addition of the second composition
  • the sample aggregation solution is stirred by a tapping method to facilitate mixing of the first sample solution and the second composition and consequently It may further promote formation of aggregates (step 5).
  • the second sample solution is centrifuged to further precipitate the precipitate into the lower portion of the vessel (step 6), and finally, the supernatant in the solution is removed to obtain a precipitate of the aggregate sample,
  • the automatic permeation process can be carried out by wrapping the aggregated sample precipitate in paper and treating it in the order of alcohol, xylene and paraffin.
  • Basic reasons for the automatic infiltration process are as follows. That is, in order to thinly slice tissue or cells to be microscopically observed, first, water of tissues or cells should be removed using alcohol from a sample fixed in a fixed solution to enable paraffin penetration (alcohol treatment step).
  • the alcohol treatment step may be performed in several steps, for example, by first treating a low concentration of alcohol (multiple times) and then processing a high concentration of alcohol (multiple times). May be performed. Such multiple treatments may be equally applied to the xylene treatment step and the paraffin treatment step.
  • the present invention provides a method for observing a specimen sample under a microscope using a paraffin block prepared by the method described above, which is cut into pieces of a suitable size of the paraffin block prepared by the above-described method, and Staining and observing the chopped paraffin block.
  • the cutting step may be performed using a conventional cutting device such as a microtome (microtome), and the dyeing process may be performed using a dyeing reagent commonly used in the art.
  • the paraffin block according to the present invention due to the physical properties of the water-soluble polymer contained in the paraffin block during the dyeing process, the water-soluble polymer reacts with water to form a water-soluble polymer, water and acetic acid. Therefore, by removing the water-soluble polymer and acetic acid produced using the flowing water there is an advantage that only the sample is present on the glass slide on which the sample to be observed is placed, and consequently does not interfere with the dye during dyeing.
  • the present invention provides a method for producing a cell block (cell block) sample for cell microarray using a paraffin block of the sample sample, the method according to the invention, as shown in Figure 14,
  • step 1 of Figure 14 1) collecting and fixing a plurality of cell samples to be sampled (step 1 of Figure 14);
  • the cell sample in step 1) may be tissue cells or cultured cells, in which case, the tissue cells may be naturally removed by various clinical procedures such as surgery or treatment, or may be cells detached from the tissue using a device.
  • Cells recovered from experimental animals can be used, and in the case of cultured cells, mainly cell line cells can be used.
  • the process of recovering the cultured cells may be performed by washing and centrifuging the flowable cells, and fixing cells by trysin treatment, washing and centrifugation according to a conventional method in the art.
  • the fixing process in step 1) uses formalin, Bowin's solution, Zenker, Susa, Carnoy, etc. according to a conventional method. It can be performed by, but is not limited thereto.
  • a preferred embodiment of the present invention after recovering 13 gastric cancer cell lines (GC cell lines) through trypsin treatment in 10% neutral buffered formalin (NBF) for 24 hours or more Reaction and fixation were carried out, and the fixation reaction was replaced with fresh NBF every 12 hours.
  • NBF neutral buffered formalin
  • any of the medical adhesives commonly used as the medical adhesive may be used, for example cyanoacrylate, fibrin glue, protein glue, polyurethane, and PEG (polyethylene glycol) -containing sealants may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • the organic solvent may be used as long as it is a conventional organic solvent, for example, alcohol, xylene, acetone, etc. may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • the water-soluble polymer may be used as long as it is a water-soluble polymer commonly used in film formation, for example, polyvinyl alcohol (polyvinylalcohols, PVAs), polyethylene oxide (polyethylene oxide), polyacrylamide, poly One or more from the group comprising polyvinylpyrrolidon, polyacrylic acid, polyethyleneimine, polyamines, polyamideamine and polydiallyldimethylammonium chloride The selected one can be used but is not limited thereto.
  • the medical adhesive may be cyanoacrylate (cyanoacrylate), the organic solvent may be acetone (acetone), the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (polyvinylalcohols, PVAs) Can be.
  • the cyanoacrylate may be ethyl-2-cyanoacrylate.
  • Polyvinylalcohols are synthetic polymers that are used in many fields such as industry, commerce, medicine and food. They are tasteless, translucent and non-toxic when they are not hydrolyzed. It is characterized by a non-toxic, white or off-white granular powder, and when hydrolyzed, shows excellent film-forming, emulsifying and adhesive properties. PVA also exhibits good chemical / physical stability, resistance to degradation and degradation that may occur during cleaning, and is suitable for easy application of plastic base surfaces.
  • the embedding can be easily performed in the process of paraffin embedding the cell aggregate according to a conventional method by aggregating cells using PVA, but also due to the excellent adhesion and water solubility of PVA as a whole.
  • Cell population sample preparation for cell microarrays can be performed via easy and simple processes.
  • the cyanoacrylate was mixed with PVA to induce insolubilizing through copolymerization, grafting and crosslinking of PVA and cyanoacrylate.
  • Cyanoacrylate is a generic name for fast-acting adhesives, and these adhesives are constantly being researched and developed as industrial and cosmetic closure tools due to their excellent aesthetic properties (transparency) and adhesion.
  • adhesion was improved from derivatives of 2-octyl cyanoacrylate (OC), also known as instant adhesive, crazy glue or super glue.
  • OC 2-octyl cyanoacrylate
  • New cyanoacrylate derivatives have been developed and are commercially available and used as wet adhesives and wound closures with the approval of the US Food and Drug Administration.
  • the medical adhesive-containing organic solvent preferably contains 0.004 to 0.008% by weight of a medical adhesive, the aqueous solution containing a water-soluble polymer is 3 to 5 It is preferable to contain by weight%.
  • the water-soluble polymer-containing aqueous solution may be used in an amount of 5 to 10 times by volume of the medical adhesive-containing organic solvent, but is not limited thereto.
  • the medical adhesive-containing organic solvent 1 ml of acetone containing 0.006% by weight of ethyl-2-cyanoacrylate was used, 3% by weight of PVA as the aqueous solution containing a water-soluble polymer
  • aqueous solution containing a water-soluble polymer 5-10 ml of aqueous solution was used, this is only to exemplify the present invention, and the concentration and amount of the treatment solution may be appropriately adjusted according to the type, state, and number of sample cells.
  • step 3) of the present invention is carried out a process for obtaining a cell block by embedding each cell aggregate obtained in step 2), wherein the embedding process is a paraffin (paraffin), cellloidine according to a conventional method (Celloidin), carbowax (carbowax), gelatin (gelatin) or synthetic resins may be carried out by infiltration or freezing, preferably by paraffin embedding method.
  • the embedding process is a paraffin (paraffin), cellloidine according to a conventional method (Celloidin), carbowax (carbowax), gelatin (gelatin) or synthetic resins
  • step 4) of the present invention cell pellets are stamped out from each of these embedded cell blocks and arranged in a fixed mold, and the fixed mold includes a fixed paraffin block case. And the like can be used.
  • step 5 of the present invention the mold in which the cell pellets are arranged is again solidified (blocked) and fragmented to obtain a cell population sample for cell microarrays. It can be carried out through conventional paraffin infiltration method, the fragmentation is 3 to 5 using a microtome (LECEA, GERMANY) It can be carried out by cutting to thickness.
  • a microtome LCEA, GERMANY
  • the cell precipitate contains 0.006% by weight of ethyl-2-cyanoacrylate and 3% by weight of acetone and polyvinyl alcohol (PVA).
  • PVA polyvinyl alcohol
  • H & E hematoxylin and eosin staining
  • ⁇ -catenin and C- cell population for cell microarray prepared according to the present invention.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • SISH silver in situ hybridization
  • the present invention provides a cell microarray cell population sample prepared by the above method, and when using the cell microarray cell population sample according to the present invention is a fluid cell or the like of fine or numerically inferior in size Even if it is a target, it is a cell population sample for cell microarray that has excellent morphological stability and density, and thus can provide effective multiple information through excellent sensitivity for various cell morphological, histochemical, immunohistochemical, and molecular biological analysis. It can be widely used in the field of cell diagnostics based on findings or electron microscopy studies using trace samples.
  • Example 1 Fabrication process of paraffin fragments using the composition for aggregation according to the present invention
  • a sample (biotissue or cell) immobilized in formalin or alcohol is centrifuged at 13,000 rpm to 15,000 rpm for 1 minute to 3 minutes using a centrifuge tube (rpm and centrifugation time depending on the sample sample). May be appropriately selected), and the supernatant is removed to obtain a sample precipitate.
  • the first composition is prepared by mixing 1.5 to 2.0 parts by weight of the water-soluble polymer with respect to 100 parts by weight of distilled water.
  • the prepared first composition is added to the centrifuge tube at 300 to 500 parts by weight to 100 parts by weight of the sample precipitate.
  • a second composition in which 100 to 200 of the medical adhesive is added to 100 mL of the organic solvent is prepared, and the prepared second composition is added to the centrifuge tube at 300 to 500 parts by weight based on 100 parts by weight of the sample precipitate.
  • centrifuge the tube After tapping the centrifuge tube lightly for 30 seconds and then seeing the precipitate begin to form, centrifuge the tube at 13,000 rpm to 15,000 rpm for 1 minute to 3 minutes (rpm and centrifugation time). Silver may be appropriately selected depending on the specimen sample) and the supernatant is removed to obtain a precipitate.
  • the resulting precipitate is wrapped in microscope lens paper and then placed in a tissule capsule and soaked in alcohol for 1 hour. This process is repeated five times.
  • paraffin blocks may be prepared by repeating the above process three times for the same time, respectively, for the same volume of xylene and paraffin.
  • the paraffin block produced through the above process is prepared into paraffin sections having a thickness of about 4 to 6 using a microtome (LECEA, GERMANY).
  • Example 2 Confirmation of function of the composition for aggregation of the present invention using a scanning electron microscope and a transmission electron microscope
  • Lung Adenocarcinoma A549 cells immobilized in formalin (10% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA) were centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute using a centrifuge tube, and then the supernatant was removed to remove the sample precipitate. Obtained. 1.0 g of polyvinyl alcohol (PVA) was mixed well with 100 mL of distilled water to prepare a first composition. The prepared first composition was added to the sample precipitate present in the centrifuge tube at three times the weight of the sample precipitate.
  • formalin 50% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA
  • FIGS. 1A to 1D show scanning electron micrographs of lung adenocarcinoma A549 cells aggregated by a composition for aggregation of a specimen sample according to an embodiment of the present invention.
  • A represents the mass formed by the composition of the sample of the present invention and lung adenocarcinoma A549 cells
  • Figure 1B shows the assembly formed by the composition of the sample of the present invention and lung adenocarcinoma A549 cells
  • Figure 1C shows the formation of the composition of the sample of the sample and lung adenocarcinoma A549 cells entangled (formation)
  • Figure 1D is a somewhat tangled shape of the composition of the sample of the invention and pulmonary adenocarcinoma A549 cells tangled together It is enlarged.
  • 1E shows a transmission electron micrograph of lung adenocarcinoma A549 cells aggregated by the composition for agglomeration of the sample sample according to an embodiment of the present invention, the composition of the sample sample of the present invention and lung adenocarcinoma A549 cells are entangled It can be confirmed that it is attached (in the figure, the white part is a composition for aggregation of a sample sample, and the dark part is lung adenocarcinoma A549 cells).
  • Example 3 Confirmation of the function of the composition for aggregation of the present invention using ascites fluid of the patient
  • Ascitic fluids from peritoneal malignancies were fixed with formalin (10% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA), and then centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute using a centrifuge tube. The supernatant was removed to obtain a sample precipitate.
  • a first composition was prepared by mixing 2.0 g of polyvinyl alcohol (DUSAN KOREA), 1.0 g of carboxymethyl cellulose, and 2.0 g of dimethyl sulfoxide in 100 mL of distilled water.
  • the prepared first composition was added to the centrifuge tube at three times the weight of the sample precipitate.
  • a second composition was then prepared by adding 95% (vol / vol) cyanoacrylate (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100, concentrated formalin 200 to 100 mL acetone (SIGMA USA).
  • the prepared second composition was added to the centrifuge tube containing the first composition and the sample precipitate at three times the weight of the sample precipitate. After tapping the centrifuge tube lightly for 30 seconds, it was confirmed that a precipitate began to form, the tube was centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a precipitate.
  • paraffin blocks were prepared by repeating the above procedure three times for the same time, respectively, for the same volume of xylene and paraffin.
  • the paraffin block produced through the above process was prepared into paraffin sections having 4 thicknesses using microtomes (LECEA, GERMANY).
  • FIG. 3 is a photomicrograph comparing (A) and (B) before and after hematoxylin & eosin staining of the prepared paraffin flakes.
  • Fig. 3A is a photograph of paraffin flakes before staining with hematoxylin & eosin
  • the arrow means the ascitic fluid (sample)
  • the arrow head means the composition for aggregation of the present invention.
  • 3B is a photograph of the paraffin flakes of FIG. 3A washed with distilled water to remove the agglomeration composition of the present invention and then stained with hematoxylin & eosin.
  • the agglomerate can be formed even in the ascending fluid, which is a biological fluid.
  • the sample can be stained with little background staining.
  • Ascitic fluid fixed in formalin (10% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA) was centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute using a centrifuge tube, and then the supernatant was removed to obtain a sample precipitate.
  • 2.0 g of polyvinyl alcohol (DUSAN KOREA) was mixed well with 100 mL of distilled water to prepare a first composition. The prepared first composition was added to the sample precipitate at three times the weight of the sample precipitate.
  • a second composition was prepared by adding 95% (volume / volume) cyanoacrylate (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 to 100 mL acetone (SIGMA USA).
  • the prepared second composition was added to the centrifuge tube containing the first composition and the sample precipitate at three times the weight of the sample precipitate. After tapping the centrifuge tube lightly for 30 seconds, it was confirmed that a precipitate began to form, the tube was centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a precipitate.
  • the resulting precipitate was wrapped in a microscope lens paper and then placed in a tissule capsule and soaked in alcohol for 1 hour, and this process was repeated five times.
  • paraffin blocks were prepared by repeating the above procedure three times for the same time, respectively, for the same volume of xylene and paraffin.
  • the paraffin block produced through the above process was prepared into paraffin sections having 4 thicknesses using microtomes (LECEA, GERMANY).
  • FIG. 4 shows hematoxylin & eosin staining (a, b), pan cytokeratin immunostaining (c, d) and Ki-67 immunostaining (e, f) on the prepared paraffin flakes. Then, the images were observed using a microscope at 40 times magnification (a, b) and 200 times magnification (c to f), respectively (pictures inserted in the drawing are 100 times magnification).
  • the right panel photo (b, d, f) is a photo of the paraffin flakes prepared by the novel paraffin block manufacturing method of the present invention
  • the left panel photo (a, c, e) is a conventional paraffin block manufacturing method It is a photograph of the prepared paraffin flakes. It can be seen that the sample of the right panel photo is much smaller and more dense than the sample of the left panel photo, and there is almost no background staining, so it is easy to observe. In other words, it can be seen that the paraffin fragments prepared according to the present invention had a very small amount of sample lost, almost no background staining, and had a wise resolution.
  • Ascitic fluid from patients with malignant tumors that had metastasized to the peritoneum was collected by fine needle aspiration, and paraffin blocks were prepared by the same method as in Example 4 and observed.
  • FIG. 5A to 5D show hematoxylin & eosin staining (H & E staining) for paraffin sections prepared with ascitic fluid of patients with malignant tumors that have metastasized to the peritoneum, respectively, according to one embodiment of the invention (FIG. 5A).
  • vimentin immunohistochemical staining FIG. 5B
  • pan-cytokeratin immunohistochemical staining FIG. 5C
  • PAS histochemical staining FIG. 5D
  • paraffin block manufacturing method can be performed histochemical and immunohistochemical analysis with high-quality staining.
  • paraffin fragments with minimal sample loss, no background staining, and clear resolution can be prepared.
  • Tumor cells from pancreatic cancer patients were collected and cultured, fixed with formalin (10% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA), centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute using a centrifuge tube, and then the supernatant was removed. A sample precipitate was obtained.
  • 1.0 g of polyvinyl alcohol and 1.0 g of polyethylene oxide were mixed well with 100 mL of distilled water to prepare a first composition. The prepared first composition was added to the centrifuge tube containing the sample precipitate at three times the weight of the sample precipitate.
  • paraffin blocks were prepared by repeating the above procedure three times for the same time, respectively, for the same volume of xylene and paraffin.
  • the paraffin block produced through the above process was prepared into paraffin sections having 4 thicknesses using microtomes (LECEA, GERMANY).
  • Figure 6 is a conventional cell block manufacturing method and E-cadeherin immunostaining for the prepared paraffin flakes according to the present invention, and then using a microscope 40 times magnification (Fig. 6 (a), Fig. 6 (b)) ) And 200 times magnification (FIG. 6 (c), FIG. 6 (d)).
  • Figure 6 (a) failed to identify pancreatic cancer tumor cells by photographs of paraffin flakes prepared by the conventional cell block manufacturing method.
  • 6 (b) and 6 (c) on the other hand, clearly show pancreatic cancer tumor cells in photographs of paraffin flakes prepared by the method of the present invention.
  • 6 (b) and 6 (c) arrows indicate pancreatic cancer tumor cells. Therefore, according to the present invention, it can be seen that according to the present invention, a paraffin fragment with digested loss, no background staining, and a clear resolution can be produced.
  • Cerebrospinal fluid (CSF) from lung cancer patients fixed in formalin (10% neutral buffered formalin, purchased from MDPOS KOREA) was centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute using a centrifuge tube, and then the supernatant was removed to obtain a sample precipitate. It was.
  • a first composition was prepared by mixing 2.0 g of polyvinyl alcohol (DUSAN KOREA), 1.0 g of carboxymethyl cellulose, and 2.0 g of dimethyl sulfoxide in 100 mL of distilled water. The prepared first composition was added to the centrifuge tube three times the weight of the sample precipitate.
  • DUSAN KOREA polyvinyl alcohol
  • carboxymethyl cellulose carboxymethyl cellulose
  • dimethyl sulfoxide dimethyl sulfoxide
  • a second composition was prepared in which 95% (volume / volume) cyanoacrylate (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 and concentrated formalin 200 were added to 100 mL acetone (SIGMA USA).
  • the prepared second composition was added to the centrifuge tube three times the weight of the sample precipitate. After tapping the centrifuge tube lightly for 30 seconds, it was confirmed that a precipitate began to form, the tube was centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a precipitate.
  • paraffin blocks were prepared by repeating the above procedure three times for the same time, respectively, for the same volume of xylene and paraffin.
  • the paraffin block produced through the above process was prepared into paraffin sections having 4 thicknesses using microtomes (LECEA, GERMANY).
  • Figure 7 (a) is not a paraffin block fabrication method of the present invention, the fab smear (PAP smear) was performed, the density of atypical cells was very low, and failed to identify the desired cells.
  • Fig. 7 (b) performing the H & E staining
  • Fig. 7 (c) performing the Cytokeratin-5 staining
  • Fig. 7 (d) performing the TFF staining for the paraffin fragment prepared according to the present invention
  • a number of atypical The cells can be clearly identified (magnification of the picture inserted in the drawing is 400 times). Therefore, it can be seen that the paraffin sections prepared according to the present invention have a very small amount of sample lost, almost no background staining, and a wise resolution.
  • a buffy coat of whole blood taken from a breast cancer patient was observed after the paraffin block was prepared by the same method as in Example 4.
  • FIG. 8A to 8D are hematoxylin & eosin staining (H & E staining) (FIG. 8A), CD3 immunohistochemical staining (FIG. 8A) for paraffin sections prepared with whole blood buffy coats of breast cancer patients, respectively, according to one embodiment of the invention. 8B), PAS histochemical staining (FIG. 8C) and pan-cytokeratin immunohistochemical staining (FIG. 8D) were performed and photographs were observed using a microscope.
  • the whole blood buffy coat which could not be confirmed at all by the conventional cell block manufacturing method, can be identified according to the present invention, has almost no background staining, and has a clear resolution. It can be seen that paraffin sections can be produced.
  • a mouse adenocarcinoma cell line (MC 38 mouse colon adenocarcinoma) obtained from a mouse cell line) and MCF cell lines cultured in vitro were observed after the paraffin block was produced by the same method as in Example 4.
  • 9A and 9B are subjected to H & E staining (FIG. 9A) and PCNA immunohistochemical staining (FIG. 9B) on paraffin flakes prepared using a mouse adenocarcinoma cell line (MC 38 mouse colon adenocarcinoma cell line) taken in vivo. The images were observed at 400 times magnification using a microscope.
  • 9C and 9D are photographs observed at 400-fold magnification using a microscope after H & E staining (FIG. 9C) and Tubulin staining (FIG. 9D) on paraffin flakes using MCF cell lines cultured in vitro.
  • FIGS. 9E and 9F show ovarian samples collected from rats, respectively, prepared by the method of the present invention. Micrographs taken at 100x magnification after H & E staining (FIG. 9E) and alcian blue (FIG. 9F) were made with blocks, and FIGS. 9G and 9H are micrographs taken at 10x magnification. .
  • FIG. 10A, 10B and 10D are H & E staining (FIG. 10A) and PAP immunohistochemical staining (FIG. 10B) for paraffin sections prepared from pancreatic adenocarcinoma cells taken from pancreatic adenocarcinoma patients, respectively, according to one embodiment of the present invention.
  • E-cadherin immunohistochemical staining (FIG. 10D) and then photographs observed using a microscope, and FIG. 10C is an enlarged image of FIG. 10A.
  • pancreatic adenocarcinoma cells which could not be identified at all by the conventional fine needle aspiration cytology, can be identified according to the present invention, have little background staining, and also have a clear resolution. It can be seen that the paraffin fragment having the same can be produced.
  • paraffin blocks were prepared by the same method as in Example 4 using Lung Adenocarcinoma cells.
  • FIG. 11A shows H & E staining of paraffin blocks of lung adenocarcinoma cells prepared according to the paraffin block manufacturing method of the present invention
  • FIG. 11B shows TTF-1 immunohistochemical staining
  • FIG. DNA is isolated and electrophoresis is performed
  • FIG. 11D is a histogram showing the result after epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation is performed on the isolated DNA.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the samples collected in the paraffin block for example, completely preserve the morphology and molecular characteristics of the cells and the like. It can be seen that even DNA is completely preserved.
  • FIGS. 12A and 12B show the results of H & F staining and AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively.
  • FIGS. 12C and 12D show the results of H & F staining and AFB staining for the paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • 12E and 12F are micrographs (FIG. 12E) of 1000 ⁇ magnification after H & F staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000 ⁇ magnification after H & F staining for paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • 12G and 12H are micrographs (FIG.
  • FIG. 12G magnified 1000x after AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000x magnification after AFB staining for the paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • FIG. 12H magnified 1000x after AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000x magnification after AFB staining for the paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • FIG. 12H magnified 1000x after AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000x magnification after AFB staining for the paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • FIG. 12H magnified 1000x after AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000x magnification after AFB staining for the paraffin blocks prepared according to the present invention.
  • FIG. 12H magnified 1000x after AFB staining for the slides prepared by the smear slide method, respectively, and 1000x magn
  • the smear slide method is a test technique that has been practiced for a long time in the field of cytology. It is used for early cancer screening and specific material test. However, this test method is easy and useful, but because it is not a method of manufacturing a paraffin block, there is a detection limit for a small sample or a very small sample sample.
  • the slide prepared by the conventional smear slide method is strong in spreading and cannot detect cells to be identified from the human neck mass, whereas the paraffin block prepared according to the present invention Clear resolution makes it possible to detect cells from human neck mass.
  • the slides prepared by the conventional smear slide method is not clear the shape of the cells even when H & F staining or AFB staining, while the paraffin block prepared according to the present invention is H & F staining Or AFB staining, the shape of the cells is clear. Therefore, according to the method for preparing a paraffin block of a sample sample according to the present invention, cells which could not be detected by the conventional method may be detected, and detection of desired cells can be made easier.
  • a sample was taken from the thyroid gland using fine-needle aspiration biopsy, and then a block was prepared using the AGAR cell block method, followed by H & F staining or PAP staining.
  • the paraffin block was prepared by the same method as in Example 4, and then H & F staining or PAP staining was performed.
  • FIGS. 13A and 13C show the results of H & F staining and PAP staining on the block of the thyroid sample prepared by the AGAR cell block method, respectively.
  • FIGS. 13B and 13D show the H & F staining on the paraffin block of the thyroid sample prepared according to the present invention. Is the result of
  • the method for preparing a paraffin block of a sample according to the present invention has almost no background staining and shows clear resolution. Therefore, according to the present invention, even a small cell which has not been detected conventionally can be detected from a sample sample.
  • GC gastric cancer
  • Each obtained cell aggregate was wrapped in a microscope lens paper and then embedded by paraffin infiltration.
  • Each embedded cell pellet was taken with a sharp skin puncher having a size of 2-3 mm.
  • Cell pellets were listed in a fixed paraffin block case (stamped out) (steps 3 and 4 of FIG. 14).
  • the A549 adenocarcinoma cell aggregate obtained by treating an aqueous solution containing 0.006% by weight of ethyl-2-cyanoacrylate with 3% by weight of acetone and polyvinyl alcohol (PVA) was prepared. Through scanning microscope (FE SEM S-800, Hitachi, Japan) Scanning electron microscopy (SEM) analysis was performed.
  • Hematoxylin and eosin staining (H & E) and C-erb B2 protein-specific primary antibodies were used for the cell population samples prepared in Example 14 according to a conventional method as follows. Cell morphology analysis was performed through immunohistochemistry (IHC).
  • the cell population samples contain 5% anhydrous ethanol, 10% aluminum potassium sulfate (containing 0.5% Harris hematoxylin, Merck). aluminum potassium sulfate, Sigma) and 0.25% mercury (II) oxide red, Aldrich) were reacted for 3 minutes, rinsed with water and stirred for 1 minute, and washed with 70% alcohol containing 0.1% HCl. After passing quickly, the mixture was washed with water for 1 minute, immersed five times in deionized water containing 0.1% NH 4 OH, and rinsed with water.
  • the sample was reacted with 60% acidic alcohol containing 0.25% Iosin Y (eosin Y, Sigma) for 15 seconds, washed with water, and treated with 70% ethanol, 3 times 90% ethanol and 3 times 100% ethanol. Dehydrated through. The dehydrated samples were treated three times in a xylene bath and then mounted using Canadian balsam (Merck).
  • 60% acidic alcohol containing 0.25% Iosin Y eosin Y, Sigma
  • Anti- ⁇ -catenin monoclonal antibodies Transduction Laboratories, Lexington, KY
  • anti-C-erb B2 monoclonals as primary antibodies, as described above, according to a conventional method for the cell population samples prepared in the above preparation
  • Immunohistochemistry analysis was performed by treating antibodies (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) at dilution ratios of 1: 250 and 1: 100, respectively, and the degree of antigenicity of each cell to the antibody ( IHC grade) was identified and evaluated as shown in FIG. 4 and shown in Table 1 below.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • ISH silver-enhanced in-situ hybridization
  • the Dako Histology FISH Accessory Kit Dako Histology FISH
  • PathVysion HER2 DNA probe kit Vysis, Downers Grove, IL, USA
  • the Accessory kit the following process was performed according to the manufacturer's instructions.
  • the cell population samples prepared in the above preparation were reacted overnight at 56, deparaffinized in xylol, and then ethanol dehydration was performed. It was soaked in pre-treatment solution for 10 minutes in 97 water bath and treated with Ready-to-Use Pepsin for 3 minutes at room temperature (Cell samples were recovered from endoscopic biopsy).
  • the pretreatment was carried out using a reaction buffer containing ISH Protease 3 for 12 minutes, cross-reaction was carried out by reacting for 56 to 6 hours after denaturation at 95 to 15 minutes, string washing was 72 to 8 After the reaction was performed three times, anti-DNP (dinitrophenol) antibody was treated for 20 minutes. Thereafter, the sample was reacted with a horseradish peroxidase (HRP) -bound anti-rabbit antibody for 16 minutes, followed by sequential silver reactions (Silver C incubation) for 4 minutes to detect the silver signal to HER2. . Counterstaining was performed by treating Hematoxylin II for 8 minutes and Bluing Reagent for 4 minutes, and the obtained sample was covered with cytosyl mount medium.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the cell population for cell microarray prepared according to the present invention has excellent sensitivity not only to protein antigenicity in IHC analysis but also to molecular biological analysis including genetic testing.
  • composition for agglomeration of a specimen sample according to the present invention a method for producing a paraffin block using the same, a microscopic observation method for a specimen sample using the paraffin block, and a method for producing a cell microarray cell population sample using the paraffin block is a hospital and its It is generally useful in various institutions and laboratories performing microscopic observations using tissues or cells, such as affiliated laboratories, medical schools, biology departments, engineering biotechnology, and stem cell culture research.

Abstract

본 발명은 검체 시료의 관찰을 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 사용되는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물; 및 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록 제작방법 및 제작된 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 미량의 유동성 검체인 조직이나 세포를 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 검체복합체의 제작과정이 원심분리기를 이용한 원심분리 튜브안에서 이루어지므로 검체의 손실이나 소실을 최소화할 수 있으며, 배경염색을 감소시키고, 파라핀 블록 제작 과정을 용이하게 수행할 수 있으며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 박절된 슬라이드의 질을 개선할 수 있다.

Description

검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법
본 발명은 생체 조직, 생물학적 유체(biological fluids) 또는 단일 세포와 같은 검체 시료를 수거하여 덩어리(mass), 집합체(assemblage) 및 응집체(formation)로 만들어 현미경 관찰, 생물학적 감시(biomonitoring), 테스트, 질병의 진단, 예측, 검증, 검출, 확인 또는 선별, 질병 감시를 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 사용되는 조성물(이하, '검체 시료의 응집용 조성물'이라 한다), 상기 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 검체 시료의 연구에 사용하기 위한 파라핀 블록을 제작하는 방법 및 상기 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 후 파라핀 블록에 고정된 질병에 걸린 조직, 그렇지 않은 조직, 질병에 걸린 세포 또는 그렇지 않은 세포를 구별하기 위한한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 조직세포(tissue cells) 또는 배양세포(cultured cells) 등의 세포 검체들을 응집시키는 공정을 포함하는 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집(cell block) 표본에 관한 것이다.
본 발명의 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 미량의 검체, 유동성 검체에 대한 조직학적, 세포학적 진단의 정확성을 향상시키고, 상기 검체로 이용하여 제작된 파라핀 블록의 항원성을 유지시켜 보존적 진단 접근(conservative diagnostic approaches)을 가능하게 하기 위하여 세포군집 기술을 고품질의 세포군집 시스템으로 개선할 수 있다.
생체 조직 또는 세포 검사는 진단 의학 분야에 있어서 매우 중요한 위치를 차지할 뿐 아니라 임상에서 이루어지는 질병진단의 최종적인 결정을 내리거나 연구에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 병리조직검사는 질병을 있는 인체조직을 떼어내거나 흡입을 하여 현미경 관찰을 통해 암 등의 질병의 질환명을 결정 받는 검사이다. 생체 조직 또는 세포 검사는 다른 임상병리학적 방법과는 달리 조직 또는 세포의 형태학적 변화를 관찰하여 판단하는데 기초를 두고 있다. 오늘날에는 객관적인 데이터를 원하는 경향에 따라, 이러한 자료를 얻기 위한 많은 노력이 경주되고 있으며, 이를 위해서 다양한 특수한 방법들이 이용되고 있다.
특히, 근래에는 객관적 진단의 정확성을 높이기 위해 조직화학검사(histochemical examination), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 특수 염색, 분자 병리 검사 방법들이 대거 등장하고 있다. 질병의 정확한 진단과 적절한 치료에 대한 연구를 위해서는 병소에서 채취한 검체(생체 조직이나 세포 등)의 형태학적 소견을 관찰하는 것이 중요하다. 이러한 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 연구자들은 기본적으로 헤마톡시린-에오진 염색표본을 이용하고 있다. 그러나, 각종 질환은 점차 세분화되고, 새로운 진단기술이 소개되고 있으며, 종양의 진단에 도움을 주는 종양표시자, 예후를 판정할 수 있는 예후인자들이 알려지고 있어서 통상적인 헤마톡시린-에오진 염색표본으로는 종합적인 정보를 얻기가 어렵다. 이러한 문제점들을 보완해주는 검사방법으로는 면역조직화학 염색법 또는 분자병리검사법(molecular pathologic evaluation)이 있다. 그 중 면역조직화학 염색법은 미분화 세포의 기원을 확인해 주거나, 효소, 호르몬, 종양표시자 및 예후인자의 존재 유무, 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 감별 전이암의 원발병소를 추정하는데 효율적으로 이용되고 있다. 면역조직화학 염색법은 민감성과 특이성이 매우 높은 검사법으로 최근 20-30년 사이 진단병리학과 형태학적 연구 등에 필수적인 검사법으로 이용되고 있다.
진단세포학 (diagnostic cytology)이란 세포 소견을 기초로 형태학적 측면에서 병변의 유무나 내용을 판정하는 병리학의 한 분야로서, 여러 임상적인 처치에 의하여 인체의 다양한 부위로부터 자연적으로 탈락된 세포 또는 기구를 이용하여 조직 표면이나 내부로부터 떼어낸 세포를 현미경으로 해석하는 임상 검사의학을 말한다. 진단세포학에는 i) 정상적 또는 병적인 원인에 의해서 자연탈락된 세포들을 소정 방법에 의해서 슬라이드 위에 도말시키고 고정염색시킨 다음 검경하는 자연탈락 진단세포학; ii) 세침을 부착한 주사기를 사용하여 병소에 찔러서 흡입한 다음 세포를 강제적 채취하고 슬라이드에 도말시켜 고정염색 후 검경하는 세포흡입생검 진단세포학; iii) 수술 중이나 수술 후에 진단 결과를 신속히 알기 위해서 육안으로 보여지는 병소에 슬라이드를 직접 밀착접촉시켜 도말한 후 고정염색하여 검경하는 직접 밀착도말 진단세포학; iv) 대상 세포를 채취하여 유리 슬라이드 위에 얇게 도말한 후 현미경으로 관찰하는 세포 도말검사; v) 액체성 검사물로부터 얻은 세포성 침전물에 파라핀 등을 침투시킨 후 절편을 제작하여 검경하는 세포군집 절편법; 및 vi) 객담 검사 등의 방법이 존재한다. 상기 다양한 세포 진단 방법들 중에서도 세포군집 절편법은 타 방법들에 비해서 우수한 장점들 보유하는데, 필요시 기타 세포 생성물, 세균 및 진균 등을 동정하기 위한 특수 염색이 가능하며, 유동성 검체의 직접 제작이 가능하고, 다른 방법들에서 관찰되지 못하는 가치 있는 진단적 증거가 관찰될 수 있다는 점에서 현저한 진단적 가치를 보유한다.
세포군집 절편법을 적용함에 있어서, 액체성 검사물은 신체의 여러 부위로부터 채취되는데, 호흡기도, 위장관계, 비뇨기계로부터의 유출액 등은 고정액에 고정하여 파라핀을 이용하여 세포 군집 표본 (cell block)을 만든 다음, 파라핀 절편으로 제작된다. 종래 세포 군집 표본을 만들기 위한 방법으로서, i) 원심분리 및 포르말린을 이용한 침전 방법을 사용하는 침전물 고정법; ii) 에탄올 속에서 에그 알부민이 응고되는 원리를 이용하는 에그 알부민 사용법; iii) 아가(agar) 사용법; iv) 혈장-트롬빈 응고법; v) 콜로디온 백 (collodion bag) 사용법; 및 vi) 밀포어 필터 (Millpore filter) 방법 등이 사용되어 왔다.
그러나, 이러한 종래의 방법들은 배경 염색으로 인한 슬라이드 판독의 어려움, 한천 젤을 이용할 때 발생되는 검체 지지 한천의 수축, 배경 염색, 파라핀 블록 제작시 소요되는 시간 및 고비용의 문제점 등으로 아직까지 만족할 만한 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
한편, 파라핀 블록 제작 방법은 생체 조직이나 세포의 형태를 파악하고 이를 기초로 특수염색, 면역조직화학 염색 등 질병의 진단, 치료 및 연구목적에 이용되고 있지만, 세포의 양이 적거나 검체가 작을 경우 지금까지는 파라핀 블록 제작이 어렵거나 불가능하였다. 또한, 조직이나 세포 부유액을 원심분리 방법을 통해 파라핀 블록 제작을 할 경우, 형태나 모양 등이 작거나 적어서 조직이나 세포가 산재되거나, 파라핀 침투 후에 파라핀과의 구분이 어렵고 포매 시 핀셋으로 포매하기가 불가능하다는 문제점들이 있었다.
대한민국 공개특허공보 제2009-97068호는 조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의 새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제작방법을 개시하고 있으며, 구체적으로는, 파라핀과 비닐아세테이트가 1-80% 포함된 에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 40-100 에서 2-50% 용융 혼합시킨 후 용융액에 검체를 가하여 파라핀과 에틸렌계 공중합체 혼합용액을 침투시키는 것을 포함하는 것을 개시하고 있다.
또한, 일본국 공개특허공보 제2007-046988호는 생물조직 표본용 포매 블록의 제작방법 및 포매 블록용 정보 표시 라벨을, 대한민국 공개특허공보 제2005-46826호는 엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법을, 국제 공개특허공보 WO 08/038813호는 파라핀 잠적된 표본으로부터 탈파라핀 공정을 수행하고 이를 분석하는 방법을 개시하고 있다.
한편, 세포 마이크로어레이는 여러 종류의 조직세포 또는 배양된 세포들을 고체 지지체 표면에 점 배열시킨 형태의 세포군집 표본을 사용하여 다양한 물질들 예를 들면, 항체, 단백질, 지질 또는 염색물질 등의 처리를 통해 분석함으로써 여러 세포들의 단백질 및 유전자 변화, 세포 반응 또는 상호작용 등에 대한 다중 정보를 획득할 수 있도록 하는 실험적 장치를 의미한다[Chen DS 등, CurrOpinChemBiol (2006), 10:28-34]. 통상적으로 세포 마이크로어레이용 표본은 상기에서와 같이 제조된 세포군집(cell block)들로부터 얻어진 세포 펠렛(pellet)들을 고정된 케이스(case)에 미세배열시킨 후 다시 블록화 및 절편화하는 과정을 통해 제작되므로, 세포군집 제조과정에서의 응집 및 포매 공정에 따라 그 결과가 크게 좌우될 수 있다.
지금까지의 세포 마이크로어레이 관련 세포군집 표본 제조에 관한 연구들을 살펴보면, 문헌 [Waterworth A 등, In Vitro Cell DevBiolAnim (2005), 41(7): 185-187] 및 미국특허공개 제2010/0323907호, 제2006/0160169호 및 제2003/0157523호 등에서 제시된 바와 같이, 통상적인 방법에 따라 포르말린, 아가 등을 사용하여 고정 후 파라핀 침투 또는 동결절편법 등을 통한 세포 마이크로어레이 기술들만이 제시되어 있을 뿐 기존의 문제점들을 해소할 수 있는 세포군집 표본의 제작방법에 대한 연구가 아직까지는 부족한 실정이다.
따라서, 크기가 작거나 수적으로 열세한 세포 검체를 대상으로 만족할 만한 다중 진단 정보를 제공할 수 있는 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제작방법에 대한 개발이 당 분야에 지속적으로 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여, 미량의 유동성 생체 조직, 생물학적 유체(biological fluids) 또는 단일 세포와 같은 검체 시료의 현미경 관찰, 생물학적 감시(biomonitoring), 테스트, 질병의 진단, 예측, 검증, 검출, 확인 또는 선별, 질병 감시를 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 , 검체 시료의 덩어리(mass), 집합체(assemblage) 및 응집체(formation)(이하, '검체 복합체'라 한다) 제작이 원심분리기 튜브 내에서 이루어지므로 검체의 소실이나 손실을 최소화할 수 있으며, 배경염색을 감소시키고, 파라핀 블록 제작 과정이 매우 단순하며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 박절된 슬라이드의 질을 개선할 수 있으며, 검체의 현미경 검경시 검경 부위를 최적화 할 수 있는 검체 시료의 응집용 조성물, 상기 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 검체 시료의 연구에 사용하기 위한 파라핀 블록을 제작하는 방법 및 상기 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 후 파라핀 블록에 고정된 질병에 걸린 조직, 그렇지 않은 조직, 질병에 걸린 세포 또는 그렇지 않은 세포를 구별하기 위한한 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 미량의 유동성 세포, 조직 세포 또는 배양 세포 등의 여러 세포 검체들을 대상으로 하는 세포 마이크로어레이 분석에 있어서, 검체 소실 및 배경 염색의 문제를 최소화하면서 용이하고 경제적인 공정을 통해 세포군집(cell block) 표본을 제조할 수 있도록 하는 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법 및 이러한 방법에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,
폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물; 및
알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물;을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 조성물은 카르복시메틸 세룰로오스(carboxymethyl cellulose) 및 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide)를 추가로 포함하고, 상기 제2 조성물은 농축 포르말린을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 상기 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 2 조성물은 유기용매 100 mL에 대해서 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위해서,
고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계;
상기 침전물에 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물을 가하여 제1 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제 1 검체용액에 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물을 가하여 제2 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제 2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및
상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 조성물은 카르복시메틸 세룰로오스(carboxymethyl cellulose) 및 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide)를 추가로 포함하고, 상기 제 2 조성물은 농축 포르말린을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 검체의 고정은 포르말린 또는 알코올을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 상기 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하며, 상기 제 2 조성물은 유기용매 100 mL에 대해서 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함하고, 상기 제 1 조성물 및 상기 제 2 조성물은 상기 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 2 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 제 2 검체용액을 교반할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 자동침투과정은 상기 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 알코올 처리, 자일렌 처리 및 파라핀 처리는 각각 복수 회 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위해서,
상기 파라핀 블록을 박절하는 단계; 및
상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 현미경으로 관찰하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공한다.
본 발명은 상기 네 번째 과제를 달성하기 위해서,
1) 표본 대상인 여러 세포 검체들을 회수하여 각각 고정하는 단계;
2) 고정된 각 세포 침전물에 의료용 접착제 함유 유기용매 및 수용성 고분자 함유 수용액을 처리하여 세포 응집물을 수득하는 단계;
3) 수득한 각 세포 응집물들을 포매하여 세포군집(cell block)을 수득하는 단계;
4) 수득한 각 세포군집들로부터 포매된 세포 펠렛(pellets)을 찍어내어(stamped out) 고정된 틀에 배열하는 단계; 및
5) 배열된 틀을 블록화 및 절편화하는 단계를 포함하는, 세포 마이크로어레이(cell microarray)용 세포군집(cell block) 표본의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트, 피브린글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유기용매는 알코올, 자일렌, 아세톤 또는 이들 중 하나 이상의 혼합용매일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 시아노아크릴에이트는 에틸-2-시아노아크릴레이트(ethyl-2-cyanoacrylate)일 수 있다
또한, 상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 세포 마이크로어레이(cell microarray)용 세포군집(cell block) 표본을 제공한다.
본 발명에 따르면, 생체 조직이나 세포와 같은 미량의 유동성 검체를 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 수용성 고분자 및 의료용 접착제와 검체가 원심분리기 튜브 내에서 강하게 결합하여 검체 복합체를 형성함으로써 검체의 손실이나 소실을 최소화할 수 있고, 파라핀 블록 제작 과정을 용이하게 수행할 수 있으며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 수용성 고분자의 물리적, 화학적 특성 및 접착력이 검체를 지지하여, 검체의 현미경 관찰시 검경 부위를 최적화 할 수 있으며, 파라핀 블록으로부터 수용성 고분자의 물리적, 화학적 특성으로 박절된 슬라이드를 이용한 염색시 배경염색을 감소시키고 질을 개선할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 조직세포, 배양세포 등의 세포 검체들을 의료용 접착제 함유 유기용매 및 수용성 고분자 함유 수용액을 처리하여 응집시키는 공정을 포함하는 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법은 미량의 유동성 검체를 그 대상으로 하는 경우에도 대상 검체의 소실을 최소화하면서 효율적이고 경제적인 공정을 통해 세포의 형태안정성 및 밀집성이 우수한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 응집용 조성물, 파라핀 블록의 제작방법, 현미경 관찰방법 및 세포 마이크로어레이(cell microarray)용 세포군집(cell block) 표본의 제조방법은 조직화학검사(histochemical examination), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 현장혼성화(in situ hybridization), 세포배양(cell culture), 분자 연구(molecular study), 전자현미경(electron microscope)을 이용한 관찰 등에 이용 및 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 폐 선암 A549 세포의 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM) 사진들이다
도 2는 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 검체 시료를 응집시키는 과정을 도시한 공정도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 복수액(ascitic fluid)를 이용하여 파라핀 블록을 제작한 후 헤마톡실린 & 에오신 염색 전(A)과 후(B)를 비교한 현미경 사진이다(화살표는 검체를 나타낸다).
도 4는 종래 세포 블록 제조방법 및 본 발명의 일 실시예에 따라 복수액(ascitic fluid)을 이용하여 제조된 파라핀 절편에 대해서 헤마톡실린 & 에오신 염색(H&E 염색), 판 싸이토케라틴(Pan cytokeratin) 면역염색 및 Ki-67 면역염색을 수행한 다음 촬영한 현미경 사진들이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라서 복막으로 전이된 악성종양 환자의 복수액(ascitic fluid)으로 제조한 파라핀 절편에 대해서 각각 헤마토실린 & 에오신 염색 (H&E 염색) (200 배 배율), vimentin 면역조직화학 염색 (200 배 배율), 판 싸이토케라틴(pan-cytokeratin) 면역조직화학 염색 (200 배 배율) 및 PAS 조직화학 염색 (400 배 배율)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진이다.
도 6은 종래 세포 블록 제조방법 및 본 발명의 일 실시예에 따라서 췌장암(pancreatic cancer) 종양 세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 E-cadeherin 면역 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진들이다.
도 7은 종래 세포 블록 제작방법 및 본 발명의 일 실시예에 따라서 폐암 환자의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 제작된 파라핀 절편에 대해서 현미경을 사용하여 각각 100 배 배율 및 400 배 배율로 관찰한 사진들이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라서 유방암 환자의 전혈 버피 코트(whole blood buffy coat)부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 각각 헤마토실린 & 에오신 염색 (H&E 염색), CD3 면역조직화학 염색, PAS 조직화학 염색 및 판 싸이토케라틴(pan-cytokeratin) 면역조직화학 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 선암종 세포주(MC 38 mouse colon adenocarcinoma cell line) 및 MCF 세포주를 이용하여 제작된 파라핀 박편에 대해서 H&E 염색 및 PCNA 면역조직화학 염색을 수행한 다음 현미경을 사용하여 관찰한 사진들 및 쥐의 난자 샘플에 대해서 H&E 염색 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진들이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라서 췌관선암 환자의 췌관선암 세포로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 각각 H&E 염색, PAP 면역조직화학 염색 및 E-cadherin 면역조직화학 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라서 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) 세포로부터 제작된 파라핀 절편에서 DNA를 분리하고 그 분리된 DNA의 완전성(integrity)를 확인한 사진들이다.
도 12는 종래의 스미어 슬라이드법(smear slide method) 및 본 발명의 일 실시예에 따라서 미세바늘 흡인 생검(fine needle aspiration biopsy)으로 채취한 Human neck mass로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 및 AFB 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진들이다.
도 13은 종래 AGAR cell block 및 본 발명의 일 실시예에 따른 파라핀 블록 제작방법에 따라서 미세바늘 흡인 생검(fine needle aspiration biopsy)으로 채취한 갑상선(thyroid) 시료로부터 제작된 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 및 PAP 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진들이다.
도 14은 본 발명의 일실시예에 따라 배양 세포들로부터 세포 마이크로어레이(cell microarray)용 세포군집(cell block) 표본을 제조하는 공정들을 설명하는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 세포 침전물에 에틸-2-시아노아크릴레이트(ethyl-2-cyanoacrylate) 함유 아세톤(acetone) 및 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol, PVA) 함유 수용액을 처리하여 수득한 세포(A549 Adenocarcinoma cell line) 응집물에 대한 SEM(scanning electron microscopy) 분석 결과 사진이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 대상으로 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&A)(위에서 왼쪽 사진), 그리고 C-erb B2 단백질에 특이적인 1차 항체를 이용한 면역조직화학(IHC) 분석을 수행한 결과 사진이다.
도 17는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 대상으로 β-카테닌(β-catenin) 및 C-erb B2 단백질에 대한 1차 항체를 이용한 조직화학(histochemical assay) 및 면역조직화학(immunohistochemical assay) 분석을 수행한 결과 사진이다.
도 18는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 대상으로 FISH(fluorescence in situ hybridization) 및 SISH(silver in situ hybridization) 분석을 수행한 결과 사진이다.
이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 수용성 고분자, 증류수, 유기용매 및 의료용 접착제를 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공한다. 또한 상기 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 조직세포(tissue cells) 또는 배양세포(cultured cells) 등의 세포 검체들을 응집시키는 공정을 포함하는 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물은 제 1 조성물 및 제 2 조성물을 포함하고, 상기 제 1 조성물은 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함한다.
바람직하게는 상기 제 1 조성물은 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 및 증류수를 포함하며, 보다 바람직하게는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 증류수 외에 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 및 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide)를 추가로 포함한다.
상기 수용성 고분자들은 물에 녹는 특이한 고분자 물질로, 분자변수의 조절을 통하여 고강력 섬유에서 의료용 재료까지 매우 광범위하게 응용될 수 있고, 저가의 혼성배열을 갖는 저분자량 고분자로부터 고가의 입체 규칙성을 지니는 고분자량 고분자에 이르기까지 매우 다양한 형태로 활용될 수 있기 때문에 매우 광범위하게 활용되고 있는 매력적인 물질이라고 할 수 있다. 특히, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 및 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide)는 알코올, 자일렌, 아세톤 등 유기용매에는 잘 녹지 않고 물에 잘 녹는 특성을 갖는데, 이는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 및 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide)가 분자 구조에 친수성기인 -OH기를 갖기 때문이다.
본 발명에서는 이러한 수용성 고분자들의 화학적 특성들을 검체 시료의 포매용 조성물에 응용해 보았다. 즉, 상기한 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌 옥사이드 등의 수용성 고분자는 알코올, 자일렌, 또는 파라핀 등과 같은 유기용매에는 용해되지 않고 물에는 용해되는 특성을 갖기 때문에 증류수에 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌 옥사이드 등의 수용성 고분자가 용해된 수용성 고분자 용액을 알코올, 자일렌 또는 아세톤과 함께 검체 응집용으로 사용하게 되면 응집 시에 검체와 수용성 고분자가 복합체를 형성하고 원심분리시 침전되면서 더욱 단단해진다.
이러한 검체 복합체는 추후 염색 과정 시에는 수용성 고분자가 갖는 물리적 특성 때문에 흐르는 물에서 복합체 중의 수용성 고분자는 물과 반응하여 제거되고 유리 슬라이드 위에 관찰대상인 검체만 단독으로 남게 되므로 이를 이용한 염색시 염색에 아무런 지장을 주지 않게 되는 것이다.
또한 본 발명의 카르복시메틸 셀룰로오스는 셀룰로오스(cellulose)를 구성하고 있는 글루코오스 잔기의 C6 위의 히드록시기(cellulose-OH)를 카르복시메틸기(-CH2COOH)로 치환한 것으로, 상기 히드록시기의 40% 이상을 카르복시메틸기로 치환한 것은 물에 녹아 안정된 젤을 만든다. 이러한 카르복시메틸 세룰로오스는 식품점조제 또는 안정제로서, 단백질의 분리 및 정제 등 연구용에 이용되고 있다. 이러한 카르복시메틸 셀룰로오스는 상기한 수용성 고분자가 생체 시료와 복합체를 형성할 때 이를 보조하는 역할을 수행한다.
또한 본 발명의 디메틸 설폭시드는 비프로톤성 극성 용매로서 일반적으로 유기반응의 연구와 유기합성에 사용되며, 본 발명에서는 생체 시료와 수용성 고분자가 복합체를 형성할 때 양자의 결합을 강화하여 생체 시료와 수용성 고분자가 쉽게 분리되지 않도록 한다.
상기 제 1 조성물의 각 성분별 함량비는 증류수 100 중량부에 대해서 수용성 고분자 1.5 내지 2 중량부가 포함될 수 있는데, 수용성 고분자의 함량이 상기 범위를 초과하는 경우에는 검체의 편재된 응집이 발생한다는 문제점이 있고, 상기 범위 미만인 경우에는 검체 응집력이 약화될 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 제 1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있는데, 상기 제 1 조성물을 상기 함량을 초과하여 사용하는 경우에는 과응집으로 인한 검체의 미미한 붕괴 가능성의 문제점이 있고, 상기 범위 미만으로 사용하는 경우에는 검체 응집력이 약화되거나 검체 응집이 지연된다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
한편, 본 발명은 검체 시료의 응집용 조성물은 상기 제 1 조성물 이외에도, 제 2 조성물을 포함하며, 상기 제 2 조성물은 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함한다.
폴리비닐알코올 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 수용성 고분자는 전술한 바와 같이 물에는 잘 녹지만, 알코올, 자일렌 등의 유기용매에는 잘 녹지 않고 저장 중에 변질되지 않는 특징을 가지고 있다. 특히, 폴리비닐알코올은 아세톤을 첨가한 후 흔들어주면 백색 앙금을 형성하며 응집되는 성향이 있는데, 본 발명에서는 이러한 아세톤, 폴리비닐알코올 및/또는 폴리에틸렌 옥사이드 및 시아노아크릴레이트 등의 화학적 특성을 응용하여, 상기 제 1 조성물을 사용하여 형성된 검체 복합체에 아세톤을 포함하는 제 2 조성물을 가해주어 상기 검체 복합체를 응집시킴으로써 응집 검체 침전물을 형성하고자 하였다. 상기 응집 검체 침전물은 추후 원심분리 과정 등을 통하여 단단한 펠렛으로 형태화되며, 이러한 펠렛에 대해서 추후 과정을 거침으로써 파라핀 블록을 제작할 수 있게 된다.
또한, 의료용 점착 또는 접착제로 알려진 시아노아크릴레이트는 의료용구의 포장에서부터 외과용 점착 또는 접착 및 지혈 등에 이르기까지 광범위한 분야에 사용되며, 생체 적합성, 생분해성 및 멸균성 등의 특성을 갖는다. 특히, 시아노아크릴레이트는 물 또는 약염기와 접촉시 순식간에 중합체를 형성하여 고형화되는 특성을 갖는데, 본 발명에서는 제 2 조성물에 포함되는 이러한 시아노아크릴레이트의 화학적 특성을 응용하여, 상기 제 1 조성물을 사용하여 형성된 검체 복합체의 응집을 더욱 용이하게 하고자 하였다.
상기 제 2 조성물은 유기용매 100 mL에 대해서 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함할 수 있는데, 의료용 접착제의 함량이 상기 범위를 초과하는 경우에는 파라핀 블록제작 후 염색시 물에 의한 수세 과정에서 결정체가 유리 슬라이드에 미미하게 잔존할 수 있는 가능성이 있기 때문에 문제가 되고, 상기 범위 미만인 경우에는 검체 복합체 형성시 결합력이 약해지는 문제점이 있다. 특히 상기 의료용 접착제는 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트가 바람직하다.
또한, 상기 제 2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있는데, 상기 응집용 조성물을 상기 함량을 초과하여 사용하는 경우에는 검체량에 비해서 검체 응집 복합체가 커질 가능성이 있기 때문에 문제가 되고, 상기 범위 미만으로 사용하는 경우에는 검체를 지지하는 응집체의 부족 가능성이 문제가 된다.
도 1에는 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) A549 세포들의 주사전자현미경 사진을 도시하였다. 구형 모양은 폐 선암 A549 세포를 의미하고, 엉겨붙어 있는 물질은 본 발명에 따른 응집용 조성물을 의미한다. 상기 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종래 응집이 용이하지 않았던 세포까지도 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물을 사용하면 응집할 수 있게 되었다. 보다 구체적인 설명은 하기 실시예에서 설명하기로 한다.
한편, 본 발명은 상기 응집용 조성물을 이용한 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 제공하는데, 본 발명에 따른 방법은,
고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계; 상기 침전물에 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물을 가하여 제 1 검체용액을 제작하는 단계; 상기 제 1 검체용액에 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물을 가하여 제 2 검체용액을 제작하는 단계; 상기 제 2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및 상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함한다.
도 2는 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물을 이용하여 검체 시료를 응집시키는 과정을 도시한 공정도이다. 도 2를 참조하면, 세포 또는 그 외 검체 시료는 고정액을 사용하여 고정된다 (단계 1). 이러한 검체 시료의 고정 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 포르말린 또는 알코올 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다음으로, 소량이거나 작은 크기를 갖는 고정된 검체는 원심분리 과정을 거쳐서 상층액 및 검체 침전물로 분리되며, 분리 이후에는 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하게 된다 (단계 2). 특히, 상층액 제거 과정 중에는 침전된 검체가 소실되지 않도록 조심스럽게 상층액을 따라 내는 것이 바람직하다.
이어서, 상층액을 따라 내고 얻어진 침전물에 본 발명에 따른 응집용 조성물 중 제 1 조성물을 가해주게 되는데 (단계 3), 상기 제 1 조성물은 전술한 바와 같이 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하며, 증류수 100 중량부에 대해서 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 포함할 수 있고, 사용되는 제 1 조성물의 양은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부일 수 있다.
특히, 첨가해주는 제 1 조성물의 양은 추후 파라핀 블록 제작시 블록 크기를 고려하여, 검체량이 많을 때에는 작은 양을 사용하여도 무방하지만, 검체량이 작을 때에는 많은 양을 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 검체 침전물에 제 1 조성물을 가해줌으로써 얻어진 용액 (설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 "제 1 검체용액"이라 한다)에 대해서, 다음 단계로 본 발명에 따른 제 2 조성물을 비교적 빠르게 가해주는 단계를 수행하게 된다 (단계 4).
상기 제 2 조성물은 전술한 바와 같이 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하며, 유기용매 100 mL에 대해서 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함하는 것이 바람직하고, 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다. 이러한 과정에 의해서, 상기 제 2 조성물의 첨가에 의해서 얻어진 용액 (설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 "제 2 검체용액"이라 한다) 중에서 검체가 응집되어 침전물을 형성하게 된다.
바람직하게는, 상기 응집용 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 검체 응집용액을 가볍게 두드려주는 (tapping) 방식에 의해서 교반함으로써, 제 1 검체용액과 제 2 조성물의 혼합을 용이하게 하고 결과적으로 응집 형성을 더욱 촉진해줄 수도 있다 (단계 5).
다음 단계로, 상기 제 2 검체용액에 대해서 원심분리를 수행하면 침전물이 용기 하층부로 더욱 응집되며 (단계 6), 마지막으로 용액 중 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하고, 얻어진 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행하게 되면 본 발명에 따른 파라핀 블록을 제작할 수 있다.
상기한 자동침투과정은 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 상기 자동침투과정이 필요한 기본적 이유는 다음과 같다. 즉, 현미경 관찰 대상이 되는 조직 또는 세포를 얇게 박절하기 위해서는 먼저 파라핀 침투가 가능하도록 고정액에 고정된 검체로부터 알코올을 이용하여 조직이나 세포의 물을 제거하여야 한다 (알코올 처리단계).
다음으로, 처리된 알코올에 의해서 검체 내의 수분은 제거된다 하더라도 알코올과 파라핀이 서로 섞이지 않기 때문에 자일렌을 이용하여 알코올을 제거하여야 한다 (자일렌 처리단계).
마지막으로, 검체시료의 현미경 관찰을 위해서는 검체시료를 얇게 박절하는 과정이 수행되어야 하기 때문에, 박절 과정의 수행을 위해서 검체시료 중의 알코올 제거 및 파라핀 침투 과정을 수행하게 된다 (파라핀 처리단계).
이때, 검체의 양이나 크기에 따라서, 알코올 처리단계는 여러 단계로 나누어 수행될 수 있는데, 예를 들어 먼저 저농도 알코올을 처리하고 (복수 회 가능) 이어서 고농도 알코올을 처리하는 (복수 회 가능) 방식으로 수행될 수도 있다. 이러한 복수 회에 걸친 처리는 자일렌 처리단계 및 파라핀 처리단계의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해서 제작된 파라핀 블록을 사용하여 검체 시료를 현미경으로 관찰하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 서술된 방법으로 제작된 파라핀 블록을 적당한 크기로 박절하여 절편화하고, 상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 관찰하는 단계를 포함한다. 상기 박절 단계는 마이크로톰 (microtome) 등과 같은 통상적인 박절 기기를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염색시약을 사용하여 염색과정이 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 파라핀 블록은 염색 과정 중, 파라핀 블록에 포함된 수용성 고분자의 물리적 특성으로 인하여 수용성 고분자가 물과 반응하여 수용성 고분자, 물 및 초산을 형성하게 된다. 따라서, 흐르는 물을 사용하여 생성된 수용성 고분자 및 초산을 제거하면 관찰 대상이 되는 검체가 놓여진 유리 슬라이드 상에는 검체만 존재하게 되고, 결과적으로 염색시 염색에 아무런 지장을 주지 않는다는 장점이 있다.
한편, 본 발명은 상기 검체 시료의 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이(cell microarray)용 세포군집 (cell block) 표본의 제조방법을 제공하는데, 본 발명에 따른 방법은, 도 14에 나타낸 바와 같이,
1) 표본 대상인 여러 세포 검체들을 회수하여 각각 고정하는 단계(도 14의 단계 1);
2) 고정된 각 세포 침전물에 의료용 접착제 함유 유기용매 및 수용성 고분자 함유 수용액을 처리하여 세포 응집물을 수득하는 단계(도 14의 단계 2);
3) 수득한 각 세포 응집물들을 포매하여 세포군집(cell block)을 수득하는 단계(도 14의 단계 3);
4) 수득한 각 세포군집들로부터 포매된 세포 펠렛(pellets)을 찍어내어(stamped out) 고정된 틀에 배열하는 단계(도 14의 단계 4); 및
5) 배열된 틀을 블록화 및 절편화하는 단계(도 14의 단계 5)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 단계 1)에서의 세포 검체는 조직세포 또는 배양세포일 수 있는데, 이때 조직세포의 경우에는 수술, 치료 등의 여러 임상적인 처치에 의해 자연적으로 탈락되거나 기구를 이용하여 조직으로부터 떼어낸 세포들이거나 실험동물로부터 회수된 세포들을 사용할 수 있으며, 배양세포의 경우에는 주로 세포주(cell lines) 세포를 사용할 수 있다. 배양세포를 회수하는 공정은 당 분야에 통상적인 방법에 따라 유동성 세포는 세척 및 원심분리과정을 통해, 고정성 세포는 트립신(trysin) 처리, 세척 및 원심분리 과정 등을 통해 이루어질 수 있다.
상기 단계 1)에서의 고정(fixation) 공정은 통상적인 방법에 따라 포르말린(formalin), 보우인 용액(Bouin's solution), 젠커액(Zenker), 수사액(Susa), 카노이액(Carnoy) 등을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 13 종의 위암 세포주(gastric cancer cell lines, GC cell lines)들을 트립신(trypsin) 처리를 통해 회수한 후 10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin, NBF)에서 24시간 이상 반응시켜 고정하는 공정을 수행하였으며, 이때 고정반응시 12시간 마다 신선한 NBF로 교체해주었다.
본 발명의 특징적인 구성에 해당하는 상기 단계 2)에서는, 상기 의료용 접착제로 통상적으로 사용되는 의료용 접착제라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들면 시아노아크릴레이트, 피브린글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트 등을 단독으로 또는 2개 이상 혼합하여 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유기용매는 통상적인 유기용매라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들면 알코올, 자일렌, 아세톤 등을 단독으로 또는 2개 이상 혼합하여 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 수용성 고분자는 통상적으로 필름 형성 등에 사용되는 수용성 고분자라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들면 폴리비닐알코올(polyvinylalcohols, PVAs), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)를 포함하는 군으로부터 하나 이상 선택된 것을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것을 아니다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)일 수 있고, 상기 유기용매는 아세톤(acetone)일 수 있으며, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinylalcohols, PVAs)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 시아노아크릴레이트는 에틸-2-시아노아크릴레이트(ethyl-2-cyanoacrylate)일 수 있다.
폴리비닐알코올(polyvinylalcohols, PVAs)은 공업, 상업, 의료 및 식품 등의 여러 분야에서 사용되고 있는 합성 중합체(synthetic polymers)로서, 가수분해되지 않은 형태일 때는 무미(tasteless), 반투명(translucent), 비독성(non-toxic), 백색 또는 미색의 과립 가루형태(granular powder)의 특징을 가지며, 가수분해되는 경우에는 우수한 필름형성능(film-forming), 유화능(emulsifying) 및 접착능(adhesive)을 나타낸다. PVA는 또한 우수한 화학/물리적 안정성을 나타내어 세척과정 동안 발생할 수 있는 분해 및 질 저하에 대한 저항성을 나타내며, 플라스틱 베이스 표면을 용이하게 도포하는데 적합하다. 본 발명의 세포군집 표본 제조방법에서는 PVA를 사용하여 세포를 응집시킴으로써 통상적인 방법에 따라 세포 응집물을 파라핀 포매하는 과정에서 용이하게 포매를 수행할 수 있을 뿐 아니라 PVA의 우수한 접착능 및 수용성으로 인해 전체적으로 용이하고 간단한 공정들을 통해 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본 제조를 수행할 수 있다.
그러나, 세포군집 표본의 제조방법에서는 수용성 공정들을 수행해야 하기 때문에 이러한 PVA의 수용성은 검체 손실을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 따라서, 이를 극복하기 위해 본 발명의 일실시예에서는 PVA에 시아노아크릴레이트를 혼합 처리하여 PVA와 시아노아크릴레이트와의 공중합체, 접목 및 가교결합을 통한 불용성화(insolubilizing)를 유도하였다.
시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)는 고속-작용 접착제(fast-acting adhesives)의 일반적 명칭으로, 이러한 접착제들은 우수한 심미적 특성(투명성) 및 접착력으로 인해 산업용 및 가내용 봉합 도구로서 지속적으로 연구 개발되고 있다. 1990년대 후반에는, 순간 접착체(instant adhesive), 크레이지 글루(crazy glue) 또는 수퍼글루(super glue)로 알려진, 2-옥틸 시아노아크릴레이트(2-octyl cyanoacrylate, OC)의 유도체로부터 접착력이 향상된 신규 시아노아크릴레이트 유도체가 개발되었으며, 미국 식품의약품안전청의 승인 하에 습윤 접착제 및 상처 봉합제로서 시판 및 사용되고 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서 사용된 의료용 접착제, 유기용매 및 수용성 고분자의 종류는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이들의 종류를 한정하는 것은 아니며, 따라서 구체적으로 제시된 PVA, 아세톤 및 시아노아크릴레이트와 유사한 물리화학적 특성 및 효과를 나타낼 수 있는 수용성 고분자, 유기용매 및 의료용 접착제라면 어느 것이든 대체 및 혼합되어 사용할 수 있음이 자명하다.
상기 의료용 접착제 함유 유기용매는 의료용 접착제를 0.004 내지 0.008 중량% 함유하는 것이 바람직하고, 상기 수용성 고분자 함유 수용액은 수용성 고분자를 3 내지 5 중량% 함유하는 것이 바람직하다. 상기 수용성 고분자 함유 수용액은 상기 의료용 접착제 함유 유기용매의 5 내지 10 부피배의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 의료용 접착제 함유 유기용매로는 에틸-2-시아노아크릴레이트를 0.006 중량% 함유한 아세톤 1 ml을 사용하였고, 상기 수용성 고분자 함유 수용액으로는 PVA를 3 중량% 함유한 수용액 5 내지 10 ml을 사용하였으나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이러한 처리 용액의 농도 및 처리양은 검체 세포의 종류, 상태, 수 등에 따라 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 단계 3)에서는 상기 단계 2)에서 수득한 각 세포 응집물들을 포매하여 세포 블록을 수득하는 공정을 수행하는데, 이때 상기 포매 공정은 통상적인 방법에 따라 파라핀(paraffin), 셀로이딘(celloidin), 카보왁스(carbowax), 젤라틴(gelatin) 또는 합성수지 등을 침투시켜 수행하거나 동결시켜 수행할 수 있으며, 바람직하게는 파라핀 포매법을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 단계 4)에서는 이렇게 포매된 각 세포 블록들로부터 세포 펠렛(pellets)을 찍어내어(stamped out) 고정된 틀에 배열하게 되며, 이러한 고정된 틀로는 고정 파라핀 블록 케이스(fixed paraffin block case) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 단계 5)에서는 상기 세포 펠렛들이 배열된 틀을 다시 고형화(블록화) 및 절편화시켜 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 수득하게 되는데, 이때 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고형화는 통상적인 파라핀 침투법을 통해 수행될 수 있고, 상기 절편화는 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 3 내지 5 두께로 박절하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 세포군집 표본의 제조과정에서 세포 침전물에 에틸-2-시아노아크릴레이트를 0.006 중량% 함유한 아세톤 및 폴리비닐알코올(PVA)을 3 중량% 함유한 수용액을 처리하여 수득한 세포 응집물을 SEM 분석을 통해 확인한 결과, 세포들이 손상 없이 그 형태를 유지하면서 PVA 및 시아노아크릴레이트와 복합체를 형성하여 조밀하게 응집한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 대상으로 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색(H&E)을 통한 세포 형태 분석, β-카테닌(β-catenin) 및 C-erb B2 단백질에 특이적인 1차 항체들을 이용한 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석(IHC)과 특정 DNA 염기서열에 동소결합하는 탐침자를 이용하는 FISH(fluorescence in situ hybridization) 및 SISH(silver in situ hybridization) 등의 분자생물학적 분석을 수행한 결과, 세포군집 표본 내 세포들이 그 형태를 유지하면서 조밀하게 응집되어있을 뿐 아니라 기존 세포 마이크로어레이 방법에서의 단점인 검체 소실, 검체와 지지체 간의 분리 또는 배경 염색의 문제를 해소하여 선명한 염색결과를 얻을 수 있으며, 세포 내 단백질 및 유전자들의 항체에 대한 항원성 및 유전자 탐침자(probe)에 대한 민감성이 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 상기 제조방법에 의해 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 제공하며, 본 발명에 따른 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 사용하는 경우 크기가 미세하거나 수적으로 열세한 유동성 세포 등을 그 대상으로 하는 경우에도 형태안정성 및 밀집성이 우수한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본으로서 여러 세포형태학적, 조직화학적, 면역조직화학적, 분자생물학적 분석 등에 우수한 민감성을 통한 효과적인 다중 정보를 제공할 수 있으므로, 세포 소견을 기초로 하는 세포 진단 분야 또는 미량검체를 이용한 전자 현미경 연구 등에 광범위하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 목적으로 서술된 것이다.
<실시예>
실시예 1. 본 발명에 따른 응집용 조성물을 이용한 파라핀 절편의 제작 과정
이하에서는 본 발명의 이론적 배경에 대한 이해를 돕기 위하여, 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물을 사용하여 검체 시료의 파라핀 절편을 제작하는 과정에 대하여 설명하기로 한다.
먼저, 포르말린이나 알코올에 고정된 검체(생체 조직이나 세포 등)를 원심분리 튜브를 사용하여 13,000rpm 내지 15,000rpm으로 1분 내지 3분 동안 원심분리한 다음(rpm 및 원심 분리 시간은 검체 시료에 따라 적절히 선택 가능하다), 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득한다. 증류수 100 중량부에 대하여 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 잘 혼합하여 제 1 조성물을 제조한다. 제조된 제 1 조성물을 상기 검체 침전물 100 중량부에 300 내지 500 중량부로 원심분리 튜브에 가한다.
이어서, 유기용매 100 mL에 의료용 접착제를 100 내지 200를 첨가한 제 2 조성물을 제조하고, 제조된 제 2 조성물을 상기 검체 침전물 100 중량부에 대하여 300 내지 500 중량부로 원심분리 튜브에 가한다.
원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 다음, 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하면, 상기 튜브를 13,000rpm 내지 15,000rpm으로 1분 내지 3분 동안 원심분리한 다음(rpm 및 원심 분리 시간은 검체 시료에 따라 적절히 선택 가능하다), 상층액을 제거하여 침전물을 수득한다.
결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두며, 이러한 과정을 5 회 정도 반복한다.
다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작할 수 있다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 약 4 내지 6 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작한다.
실시예 2. 주사전자현미경 및 투과전자현미경을 이용한 본 발명의 응집용 조성물의 기능 확인
본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물이 검체 시료를 어떻게 응집시키는지 확인하기 위하여, 이하와 같은 실험을 하였다.
포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)에 고정된 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) A549 세포들을 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 1.0 g의 폴리비닐알코올(PVA)를 잘 혼합하여 제 1 조성물을 제조하였다. 제조된 제 1 조성물을 원심분리 튜브 내에 존재하는 검체 침전물에 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 가하였다.
이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 를 잘 혼합하여 제 2 조성물을 제조하였다. 제조된 제 2 조성물을 검체 침전물의 3배 중량으로 제 1 조성물과 검체 침전물이 들어있는 상기 원심분리 튜브 내에 가하였다. 원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 후 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하고, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다. 결과물인 침전물을 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM)으로 촬영하였다.
도 1 A 내지 도 1D는 본 발명의 일 실시예에 따른 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 폐 선암 A549 세포들의 주사전자현미경 사진을 도시한 것이다. 특히 A는 본 발명의 검체 시료의 조성물과 폐 선암 A549 세포들이 형성한 덩어리(mass)를 나타내고, 도 1B는 본 발명의 검체 시료의 조성물과 폐 선암 A549 세포들이 형성한 집합체(assemblage)를 나타내며, 도 1C는 본 발명의 검체 시료의 조성물과 폐 선암 A549 세포들이 엉겨 붙어 있는 형성물(formation)을 나타내며, 도 1D는 본 발명의 검체 시료의 조성물과 폐 선암 A549 세포들을 서로 엉겨 붙어 있는 모양을 다소 확대한 것이다.
또한, 1E는 본 발명의 일 실시예에 따른 검체 시료의 응집용 조성물에 의해 응집된 폐 선암 A549 세포들의 투과전자현미경 사진을 도시한 것으로, 본 발명의 검체 시료의 조성물과 폐 선암 A549 세포들이 엉겨 붙어 있음을 확인할 수 있다(상기 도면에서 흰색 부분이 검체 시료의 응집용 조성물이고, 어두운 부분이 폐 선암 A549 세포들이다).
상기 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종래 응집이 용이하지 않았던 세포까지도 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물을 사용하면 쉽게 응집할 수 있게 되었다.
실시예 3. 환자의 복수액을 이용한 본 발명의 응집용 조성물의 기능 확인
복막으로 전이된 악성종양 환자로부터 채취한 복수액(ascitic fluid)을 포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)으로 고정한 후, 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 2.0 g의 폴리비닐알코올(DUSAN KOREA), 1.0 g의 카르복시메틸 셀룰로오스 및 2.0 g의 디메틸 설폭시드를 잘 혼합하여 제 1 조성물을 제조하였다.
제조된 제 1 조성물을 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 원심분리 튜브에 가하였다. 이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 , 농축 포르말린 200를 첨가하여 제 2 조성물을 제조하였다. 제조된 제 2 조성물을 검체 침전물의 3배 중량으로 제 1 조성물과 검체 침전물이 들어있는 상기 원심분리 튜브 내에 가하였다. 원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 후 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하고, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다.
결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두었으며, 이러한 과정을 5 회 반복하였다. 다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을, 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 4 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작하였다.
도 3은 상기 제작된 파라핀 박편에 대해서 헤마톡실린 & 에오신 염색 전(A)과 후(B)를 비교한 현미경 사진이다. 특히 도 3A는 헤마톡실린 & 에오신으로 염색하기 전의 파라핀 박편 사진으로, 화살표는 검체인 복수액(ascitic fluid)을 의미하고, 화살표 헤드는 본 발명의 응집용 조성물을 의미한다. 또한 도 3B는 도 3A의 파라핀 박편을 증류수로 씻어 본 발명의 응집용 조성물을 제거한 후 헤마톡실린 & 에오신으로 염색한 사진이다.
상기 도 3으로부터 본 발명의 응집용 조성물을 이용하면 생물학적 유체(biological fluids)인 복수액(ascetic fluid)에 대하여도 응집체를 형성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 배경 염색이 거의 없이 검체를 염색할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 4. 종래 파라핀 블록 제작 방법과 본 발명의 파라핀 블록 제작 방법의 비교
포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)에 고정된 복수액(ascitic fluid)을 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 2.0 g의 폴리비닐알코올(DUSAN KOREA)을 잘 혼합하여 제 1 조성물을 제조하였다. 제조된 제 1 조성물을 검체 침전물에 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 가하였다.
이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 를 첨가하여 제 2 조성물을 제조하였다. 제조된 제 2 조성물을 검체 침전물의 3배 중량으로 제 1 조성물과 검체 침전물이 들어있는 상기 원심분리 튜브 내에 가하였다. 원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 후 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하고, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다. 결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두었으며, 이러한 과정을 5 회 반복하였다.
다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 4 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작하였다.
도 4는 상기 제작된 파라핀 박편에 대해서 헤마토실린 & 에오신 염색(a,b), 판싸이토케라틴(Pan cytokeratin) 면역염색(c,d) 및 Ki-67 면역염색(e,f)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 각각 40 배 배율(a,b) 및 200 배 배율(c 내지 f)로 관찰한 사진들이다(도면에 삽입된 사진은 100배 배율).
상기 도 4에서 오른쪽 패널 사진(b,d,f)은 본 발명의 새로운 파라핀 블록 제조방법으로 제조된 파라핀 박편에 대한 사진이고, 왼쪽 패널 사진(a,c,e)은 종래 파라핀 블록 제조방법으로 제조된 파라핀 박편의 사진이다. 상기 오른쪽 패널 사진의 검체가 왼쪽 패널 사진의 검체 보다 훨씬 더 작고 더 밀집되어 있으며, 배경 염색이 거의 없어 관찰이 용이함을 알 수 있다. 즉 본 발명에 따라서 제작된 파라핀 절편은 손실된 검체의 양이 매우 작고, 배경염색이 거의 관찰되지 않으며, 현명한 해상도를 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5. 본 발명에 따른 복막으로 전이된 악성종양환자의 복수액 관찰
복막으로 전이된 악성종양 환자의 복수액(ascitic fluid)을 세침 흡입법(Fine needle aspiration)으로 채취하여, 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.
도 5A 내지 도 5D는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라서 복막으로 전이된 악성종양 환자의 복수액(ascitic fluid)으로 제조한 파라핀 절편에 대해서 헤마토실린 & 에오신 염색 (H&E 염색) (도 5A), vimentin 면역조직화학 염색 (도 5B), 판 싸이토케라틴(pan-cytokeratin) 면역조직화학 염색 (도 5C) 및 PAS 조직화학 염색 (도 5D)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진이다.
상기 도 5A 내지 도 5D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종래 파라핀 블록 제작방법에 의한 것보다 본 발명에 의할 경우 고품질의 염색으로 조직화학분석 및 면역조직화학 분석을 실행할 수 있다. 또한 본 발명에 따를 경우 손실 검체량이 최소화되고, 배경염색이 전무하며, 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 본 발명에 따른 췌장암 종양 세포의 관찰
췌장암 환자의 종양 세포를 채취하여 배양한 후, 포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)으로 고정한 후 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 1.0 g의 폴리비닐알코올 및 1.0g의 폴리에틸렌 옥사이드를 잘 혼합하여 제1 조성물을 제조하였다. 제조된 제1 조성물을 검체 침전물이 들어 있는 원심분리 튜브에 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 가하였다.
이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 를 첨가하여 제 2 조성물을 제조하였다. 제조한 제 2 조성물을 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 상기 원심분리 튜브에 가하였다.
상기 원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 후 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인한 다음, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다. 결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두었으며, 이러한 과정을 5 회 반복하였다.
다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 4 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작하였다.
도 6은 종래 세포 블록 제작 방법 및 본 발명에 따라 상기 제작된 파라핀 박편에 대해서 E-cadeherin 면역 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 각각 40 배 배율(도 6(a),도 6(b)) 및 200 배 배율(도 6(c), 도 6(d))로 관찰한 사진들이다. 도 6(a)는 종래 세포 블록 제작 방법에 의해 제조된 파라핀 박편의 사진으로 췌장암 종양 세포를 확인하는데 실패하였다. 반면 도 6(b) 및 도 6(c)는 본 발명의 방법에 의해 제조된 파라핀 박편의 사진으로 췌장암 종양 세포를 명확히 나타내고 있다. 도 6(b) 및 도 6(c)에서 화살표가 췌장암 종양 세포를 나타낸다. 따라서 상기 결과로부터, 본 발명에 따르면 손실 검체량이 소화되고, 배경염색이 전무하며, 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. 본 발명에 따른 폐암 환자의 뇌척수액 관찰
포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)에 고정된 폐암환자의 뇌척수액(CSF)을 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 2.0 g의 폴리비닐알코올(DUSAN KOREA), 1.0 g의 카르복시메틸 셀룰로오스 및 2.0 g의 디메틸 설폭시드를 잘 혼합하여 제 1 조성물을 제조하였다. 제조된 제 1 조성물을 상기 원심분리 튜브에 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 가하였다.
이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 , 농축 포르말린 200를 첨가한 제 2 조성물을 제조하였다. 제조된 제 2 조성물을 상기 원심분리 튜브에 상기 검체 침전물의 3배 중량으로 가하였다. 상기 원심분리 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)한 후 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하고, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다.
결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두었으며, 이러한 과정을 5 회 반복하였다. 다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을, 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 4 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작하였다.
도 7(a)는 본 발명의 파라핀 블록 제작 방법이 아닌 팹스미어(PAP smear)가 행해진 것으로 비정형 세포의 밀도가 아주 낮게 나타났으며, 원하는 세포를 확인하는데 실패하였다. 반면, 본 발명에 따라서 제작된 파라핀 절편에 대하여 H&E 염색을 수행한 도 7(b), Cytokeratin-5 염색을 수행한 도 7(c) 및 TFF 염색을 수행한 도 7(d)에서는 다수의 비정형 세포를 명확히 확인할 수 있다(도면에 삽입된 사진의 배율은 400 배). 따라서 본 발명에 따라서 제작된 파라핀 절편은 손실된 검체의 양이 매우 작고, 배경염색이 거의 관찰되지 않으며, 현명한 해상도를 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 8. 본 발명에 따른 유방암 환자의 전혈 버피 코트(whole blood buffy coat) 관찰
유방암 환자로부터 채취한 전혈(whole blood)의 버피 코트(buffy coat)를 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.
도 8A 내지 도 8D는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라서 유방암 환자의 전혈 버피코트로 제조한 파라핀 절편에 대해서 헤마토실린 & 에오신 염색 (H&E 염색) (도 8A), CD3 면역조직화학 염색 (도 8B), PAS 조직화학 염색 (도 8C) 및 판 싸이토케라틴(pan-cytokeratin) 면역조직화학 염색 (도 8D)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진이다.
상기 도 8A 내지 도 8D에 따르면, 실시예 4에서와 마찬가지로, 종래 세포 블록 제조방법으로는 전혀 확인할 수 없었던 전혈 버피 코트를 본 발명에 따르면 확인가능하고, 배경염색이 거의 없으며, 또한 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9. 배양세포 및 생체에서 채취한 세포에 대한 본 발명의 활용 가능성
본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법을 생체 외에서(in vitro) 배양된 세포 및 생체에서(in vivo) 채취한 세포에도 적용할 수 있는지 확인하기 위하여, 쥐로부터 채취한 마우스 선암종 세포주(MC 38 mouse colon adenocarcinoma cell line) 및 생체 외에서 배양한 MCF 세포주를, 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.
도 9A 및 9B는 생체에서 채취한 마우스 선암종 세포주(MC 38 mouse colon adenocarcinoma cell line)를 이용하여 제작된 파라핀 박편에 대해서 H&E 염색(도 9A) 및 PCNA 면역조직화학 염색(도 9B)을 수행한 다음 현미경을 사용하여 400 배 배율로 관찰한 사진들이다. 또한, 도 9C 및 9D는 생체 외에서 배양한 MCF 세포주를 이용하여 파라핀 박편에 대해서 H&E 염색(도 9C) 및 Tubulin 염색(도 9D)을 수행한 다음 현미경을 사용하여 400 배 배율로 관찰한 사진들이다.
도 9A 내지 도 9D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법에 의하면 생체에서 채취한 시료든, 생체 외에서 배양한 시료든 모두 선명한 세포와 세포질을 관찰할 수 있었으며 조밀한 세포의 응집을 관찰할 수 있었다.
또한, 쥐로부터 채취한 난소 샘플에 대하여, 실시예 7과 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.도 9E 및 도 9F는 각각 쥐로부터 채취한 난소 샘플을 본 발명의 방법으로 제작된 파라핀 블록으로 제작하여 H&E 염색(도 9E) 및 알시안 블루(alcian blue)(도 9F) 염색한 후 100 배 배율로 촬영한 현미경 사진이며, 도 9G 및 도 9H는 10배 배율로 촬영한 현미경 사진이다.
상기 도 9E 내지 9H에 따르면, 손실 검체량이 최소화되고, 배경염색이 거의 없으며, 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 10. 본 발명에 따른 췌관선암(ductal adenocarcinoma) 세포의 관찰
췌관선암(ductal adenocarcinoma)에 걸린 환자로부터 초음파내시경-미세침흡인법(EUS-fine needle aspiration)으로 채취한 췌관선암세포를 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.
도 10A, 도 10B 및 도 10D는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라서 췌관선암 환자로부터 채취한 췌관선암 세포로 제조한 파라핀 절편에 대해서 H&E 염색 (도 10A), PAP 면역조직화학 염색 (도 10B) 및 E-cadherin 면역조직화학 염색 (도 10D)을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 관찰한 사진들이고, 도 10C는 도 10A를 보다 확대한 사진이다.
상기 도 10A 내지 도 10D에 따르면, 본 발명에 종래 미세침흡인세포검사(fine needle aspiration cytology)로는 전혀 확인할 수 없었던 췌관선암 세포를 본 발명에 따르면 확인가능하고, 배경염색이 거의 없으며, 또한 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 11. 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) 세포를 이용한 본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법의 성능 확인
본 발명에 따른 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법의 성능을 확인하기 위하여, 우선 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) 세포를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작하였다.
도 11A는 본 발명의 파라핀 블록 제작방법에 따라 제작된 폐 선암(Lung Adenocarcinoma) 세포의 파라핀 블록을 H&E 염색한 것이고, 도 11B는 TTF-1 면역조직화학 염색한 것이며, 도 11C는 상기 파라핀 블록으로부터 DNA를 분리하여 전기영동(electrophoresis)를 수행한 결과이며, 도 11D는 상기 분리된 DNA에 대하여 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 돌연변이를 수행한 후 그 결과를 나타낸 히스토그램이다.
상기 도 11A 내지 도 11D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법에 의하면, 파라핀 블록에 포집되는 검체들, 예를 들어 세포 등의 형태 및 분자 특성을 완전하게 보존하며, 또한 검체의 DNA까지도 완전하게 보존되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 12. 종래의 스미어 슬라이드법(smear slide method) 및 본 발명의 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법의 비교
Human neck mass 의 needle aspiration biopsy에서 고전적인 방법인 smear slide method와 본 발명에 따른 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 서로 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
우선, needle aspiration biopsy을 이용하여 Human neck mass로부터 시료를 채취하여 슬라이드를 만들었다. 다음으로, 상기 시료를 상기 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 H&F 염색 또는 AFB 염색을 실행하였다.
도 12A 및 12B는 각각 smear slide method으로 제조된 슬라이드에 대하여 H&F 염색 및 AFB 염색을 수행한 결과이고, 도 12C 및 12D는 본 발명에 따라 제작된 파라핀 블록에 대하여 H&F 염색 및 AFB 염색을 수행한 결과이며, 도 12E 및 12F는 각각 smear slide method으로 제조된 슬라이드에 대하여 H&F 염색한 후 1000배로 확대한 현미경 사진(도 12E)이고, 본 발명에 따라 제작된 파라핀 블록에 대하여 H&F 염색한 후 1000배 확대한 현미경 사진이다(도 12F). 또한, 도 12G 및 12H는 각각 smear slide method으로 제조된 슬라이드에 대하여 AFB 염색한 후 1000배로 확대한 현미경 사진(도 12G)이고, 본 발명에 따라 제작된 파라핀 블록에 대하여 AFB 염색한 후 1000배 확대한 현미경 사진이고(도 12H), 도 12I는 본 발명에 따라 제작된 파라핀 블록으로부터 추출한 DNA의 전기영동(electrophoresis) 사진이다.
smear slide method은 세포학 분야에서 오랫동안 실시되어온 검사기법으로 조기 암 검진이나 특정 물질의 검사 등에 이용되고 있다. 그러나 이 검사법은 쉽고 유용한 점은 있으나, 파라핀 블록을 제작하는 방법은 아니기 때문에 검체 시료의 양이 적거나, 아주 작은 검체 시료에 대해서는 검출 한계가 있다.
상기 도 12A 내지 도 12D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종래 smear slide method으로 제조된 슬라이드는 퍼짐 현상이 강하여 Human neck mass로부터 확인하고자 하는 세포를 검출할 수 없는데 비해, 본 발명에 따라 제조된 파라핀 블록은 또렷한 해상도를 나타내어 Human neck mass로부터 확인하고자 하는 세포의 검출이 가능하다.
또한, 도 12E 내지 도 12H에서도 확인할 수 있는 바와 같이, 종래 smear slide method으로 제조된 슬라이드는 H&F 염색이나 AFB 염색을 하더라도 세포들의 형태가 명확하지 않은 반면, 본 발명에 따라 제조된 파라핀 블록은 H&F 염색이나 AFB 염색을 한 경우 세포들의 형태가 명확하다. 따라서 본 발명에 따른 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법에 의할 때 종래 방법으로 검출할 수 없었던 세포를 검출할 수도 있고, 또 원하는 세포의 검출을 보다 용이하게 해준다.
실시예 13. 종래의 AGAR cell block 및 본 발명의 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법의 비교
AGAR cell block법과 본 발명에 따른 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 서로 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
우선, fine-needle aspiration biopsy을 이용하여 갑상선으로부터 시료를 채취한 후 AGAR cell block법으로 블록을 제작한 후 H&F 염색 또는 PAP 염색을 실행하였다. 다음으로, 상기 시료를 상기 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 H&F 염색 또는 PAP 염색을 실행하였다.
도 13A 및 13C는 각각 AGAR cell block법으로 제조된 갑상선 시료의 블록에 대하여 H&F 염색 및 PAP 염색을 수행한 결과이고, 도 13B 및 13D는 본 발명에 따라 제작된 갑상선 시료의 파라핀 블록에 대하여 H&F 염색을 수행한 결과이다.
상기 도 13A 내지 13D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종래의 AGAR cell block법에 비해 본 발명에 따른 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법은 배경염색이 거의 없고, 또렷한 해상도를 나타낸다. 따라서 검체 시료로부터 종래에는 검출할 수 없었던 미세한 세포까지도 본 발명에 따르면 검출할 수 있다.
실시예 14. 본 발명에 따른 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조
총 13종의 위암(gastic cancer, GC) 관련 세포주들, 즉 AGS, IM95M, MKN-1, MKN-28, MKN-45, MKN-74, N87, NCC-19, NCC-20, NCC-24, NCC-59, NUGC-3 및 NUGC-4 세포들을 대상으로 다음과 같이 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본 제조를 수행하였으며, 각 과정을 도 14에 간략히 나타내었다.
각 세포들을 통상적인 트립신(trypsin) 처리를 통해 부유시켜 회수한 후, 세포수를 확인하고 원심분리하여 세포 침전물(pellets)을 수득하였다. 수득한 각 세포 침전물에 10% 중성 완충포르말린(neutral buffered formalin(NBF), MDPOS KOREA) 1.5 ml을 가하여 재현탁시켜 24시간 이상 반응시킨 후(재현탁 12시간 후에 신선한 NBF로 교체) 이를 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다(도 14의 단계 1).
와트만 여과지(Whatman filter paper)를 이용하여 잔여 NBF를 완전히 제거한 후 수득한 세포 침전물에 에틸-2-시아노아크릴레이트를 0.006 중량% 함유한 아세톤 1 ml 및 폴리비닐알코올(PVA)을 3 중량% 함유한 수용액 5 ml을 가하여 10분간 반응시킨 후 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 응집물을 수득하였다(도 14의 단계 2).
수득한 각 세포 응집물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 후 파라핀 침투(infiltration)를 수행하여 포매시켰으며, 포매된 각 세포 펠렛(pellets)을 2-3 mm 크기의 샤프 스킨 펀치(sharp skin puncher)로 찍어내어(stamped out) 고정 파라핀 블록 케이스(fixed paraffin block case)에 세포 펠렛들을 나열시켰다(도 14의 단계 3 및 4).
이를 다시 파라핀 블록화 한 후 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 5 두께로 박절하여 본 발명에 따른 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 제조하였다(도 14의 단계 5).
시험예: 세포 마이크로어레이 분석
상기 실시예 14예에서 제작된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 대상으로 하기와 같이 형태학적(morphological study), 조직화학적(histochemical study) 및 면역조직화학적(immunohistochemical study) 분석 및 FISH(fluorescence in situ hybridization) 및 SISH(silver in situ hybridization) 등의 분자생물학적 분석(molecular study)을 수행하였다.
1) 세포 응집물 확인 - SEM 분석
상기 제조예에 따라 에틸-2-시아노아크릴레이트를 0.006 중량% 함유한 아세톤 및 폴리비닐알코올(PVA)을 3 중량% 함유한 수용액을 처리하여 수득한 A549 Adenocarcinoma 세포 응집물을 대상으로 전자 주사 현미경(FE SEM S-800, Hitachi, Japan)을 통한 SEM(scanning electron microscopy) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포들이 손상 없이 그 형태를 유지하면서 PVA 및 시아노아크릴레이트와 복합체를 형성하여 조밀하게 응집한 것을 확인할 수 있었다.
2) 형태학적 분석 - H&E 염색 및 면역조직화학분석(IHC)을 통한 확인
상기 실시예 14에서 제조된 세포군집 표본을 대상으로 통상적인 방법에 따라 다음과 같이 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색(H&E) 및 C-erb B2 단백질에 특이적인 1차 항체를 이용한 면역조직화학분석(immunohistochemistry, IHC)을 통해 세포 형태 분석을 수행하였다.
헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색(H&E)을 수행하기 위해, 우선 세포군집 표본에 0.5% 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Merck 사) 함유 5% 무수에탄올, 10% 알루미늄 포타슘 설페이트(aluminum potassium sulfate, Sigma 사) 및 0.25% 산화제2수은(mercury (II) oxide red, Aldrich 사)을 처리하여 3분간 반응시킨 후 물로 헹구고 1분간 교반시켜 세척하였으며, 이를 0.1% HCl 함유 70% 알코올에 신속히 통과시킨 후 1분간 물로 세척하고 0.1% NH4OH 함유 탈이온수에 5회 담근 후 물로 헹구었다. 그 후, 상기 표본을 0.25% 이오신 Y(eosin Y, Sigma 사) 함유 60% 산성 알코올에 15초간 반응시킨 후 물로 세척하였으며, 70% 에탄올, 90% 에탄올 3회 및 100% 에탄올 3회 처리를 통해 탈수시켰다. 탈수된 표본을 자일렌(xylene) 배스(bath)에서 각 3회 처리한 후 캐나다 발삼(Canada balsam, Merck 사)을 사용하여 마운트(mounting)를 수행하였다.
또한, C-erb B2 단백질에 특이적인 1차 항체를 이용한 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하기 위해, 우선 상기 제조예에서 제조된 세포군집 표본을 탈파라핀화한 후 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate buffer, pH 6.0) 내에서 30분간 극초단파(microwave)로 반응시켜 항원성을 복구하였다. 이후 상기 표본에 항 C-erb B2 단일클론 항체(DAKO Corporation, Carpinteria, CA)를 1:100 희석 처리하여 4에서 12 시간 반응시킨 다음, Poly-HRP(DAKO Corporation, Carpinteria, CA)를 이용한 EnVision 방법을 통해 발색시켰다.
그 결과, 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 세포군집 표본을 제조하는 경우 세포들이 그 형태를 유지하면서 조밀하게 응집되어 형태학적 및 세포조직화학적 분석에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였으며, 세포 손실도 최소화된 것을 확인하였다. 또한, 기존 제조방법들에서 문제시되던 배경 염색도 거의 일어나지 않아 선명한 분석 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
3) 면역조직화학적 분석 - β-카테닌 및 C-erb B2 항체에 대한 항원성 확인
상기 제조예에서 제조된 세포군집 표본을 대상으로 통상적인 방법에 따라 상기에서 설명된 바와 같이 1차 항체로 항 β-카테닌 단일클론 항체(Transduction Laboratories, Lexington, KY) 및 항 C-erb B2 단일클론 항체(DAKO Corporation, Carpinteria, CA)를 각각 1:250 및 1:100의 희석비로 처리하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석(IHC)을 수행하였으며, 항체에 대한 각 세포들의 항원성(antigenicity) 정도(IHC grade)를 도 4에서와 같이 확인 및 평가하여 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
위암 세포주 β-카테닌 C-erb B2
AGS +3 -
IM95M +2 +2
MKN-1 - -
MKN-28 +2 -
MKN-45 +2 -
MKN-74 +2 -
N87 - +3
NCC-19 - +1
NCC-20 +2 +1
NCC-24 +3 -
NCC-59 +3 -
NUGC-3 +1 -
NUGC-4 - +2
그 결과, 상기 표 1 및 도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본을 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하는 경우 항원성을 그대로 유지하여 선명한 분석 결과를 얻을 수 있음을 확인하였으며, 이러한 분석에 대한 민감성은 각 세포의 단백질 발현 유무뿐 아니라 그 정도도 육안으로 식별 가능할 정도로 우수한 것을 확인하였다.
4) 분자생물학적 분석 - FISH 및 SISH 분석에 대한 민감성 확인
상기 실시예 14에서 제조된 세포군집 표본을 대상으로 통상적인 방법에 따라 다음과 같이 HER2(C-erb B2) 유전자 발현에 대한 FISH(fluorescence in situ hybridization) 및 SISH(silver-enhanced in-situ hybridization) 분석을 수행하여 그 결과를 도 5에서와 같이 상기 IHC 분석 결과와 비교하였다.
HER2(C-erb B2) 유전자 발현에 대한 FISH 분석을 수행하기 위해, PathVysion HER2 DNA 프로브 키트(PathVysion HER2 DNA probe kit, Vysis, Downers Grove, IL, USA)와 함께 Dako 조직학 FISH 액세서리 키트(Dako Histology FISH Accessory kit)를 사용하여 제조사 설명서에 따라 다음과 같은 과정을 수행하였다. 상기 제조예에서 제조된 세포군집 표본을 56에서 밤새 반응시키고, 자일롤(xylol) 내에서 탈파라핀화한 후, 에탄올 탈수반응을 수행하였다. 이를 전처리용액(Pre-treatment Solution)에 담가 97 수조에서 10분간 중탕반응시킨 후, 레디-투-유즈 펩신(Ready-to-Use Pepsin)을 처리하여 상온에서 3분간(세포 검체가 내시경 생검으로부터 회수된 경우) 또는 37에서 6분간(세포 검체가 외과적 검체로부터 회수된 경우) 반응시켜 효소처리하였다. 그 후, 농도구배를 통한 에탄올 탈수화를 진행한 다음 표본에 HER2/CEP17 프로브 믹스(HER2/CEP17 probe mix) 10 를 처리하였으며, 이를 80에서 5분간 변성반응시켜 후, 다코 하이브리다이저(Dako Hybridizer) 내에 넣고 37에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 표본을 스트링전트 워시 버퍼(Stringent Wash Buffer)에 담가 65에서 10분간 수조에서 중탕반응시킨 후 농도구배를 통한 에탄올 탈수화를 수행하였으며, 여기에 DAPI(4',6-diamino-2-phenylindole) 함유 형광 마운트 배지(fluorescence mounting medium) 10 를 처리하였다.
또한, HER2(C-erb B2)의 발현에 대한 SISH 분석을 수행하기 위해, 다음과 같이 벤타나 벤치마크 XT(Ventana Benchmark XT, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) 상에서 자동화 SISH 분석을 수행하였으며, 이때 인폼 HER2 DNA 프로브(INFORM HER2 DNA Probe)를 제조사 프로토콜(protocols)에 따라 가시화시켰다. 우선, 상기 제조예에서 제조된 세포군집 표본을 대상으로 통상적인 방법에 따라 탈파라핀화(deparaffinization), 전처리(pretreatment), 교차반응(hybridization), 스트링전트 세척(stringency wash), 신호검출(signal detection) 및 대조염색(counterstaining)을 자동화 반응시켰다. 이때, 상기 전처리는 ISH 단백질 분해효소(Protease) 3 함유 반응버퍼를 이용하여 12분간 수행되었고, 교차반응은 95에서 15분간 변성 후 56에서 6시간 동안 반응시켜 수행하였으며, 스트링전트 세척은 72에서 8분간 3회 수행한 후 항-DNP(dinitrophenol) 항체를 처리하여 20분간 반응시켰다. 그 후, 상기 표본을 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-토끼 항체로 16분간 반응시킨 다음, 순차적 은 반응(sequential silver reactions, Silver C incubation)을 4분간 수행하여 HER2에 대한 은 신호를 검출하였다. 대조염색은 헤마톡실린 II(Hematoxylin II)를 8분간 처리하고 블루잉 시약(Bluing Reagent)을 4분간 처리하여 수행하였으며, 수득한 표본을 사이토실 마운트 배지로 커버하였다.
그 결과, 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, IHC 분석에서 음성 반응을 보인 세포의 경우(도 5(b)), FISH(도 5(c)) 또는 SISH 분석(도 5(d))에서도 동일하게 음성 반응을 나타내는 것을 확인하였다. 이로써 본 발명에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본은 IHC 분석에서의 단백질 항원성뿐만 아니라 유전자 검사법을 포함하는 분자생물학적 분석에 대해서도 우수한 민감성을 갖는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 , 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 세포 마이크로어레이용 세포군집 표본의 제조방법은 병원 및 그 부속 연구소, 의과대학, 생물학과, 공대 생명공학, 줄기세포배양 연구 등 조직 또는 세포를 이용하여 현미경 관찰을 수행하는 다양한 기관 및 연구소에서 일반적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물; 및
    알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물;을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 조성물은 카르복시메틸 세룰로오스 및 디메틸 설폭시드를 추가로 포함하고, 상기 제 2 조성물은 농축 포르말린을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 상기 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제 2 조성물은 유기용매 100 mL에 대해서 상기 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제 2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물.
  8. 고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계;
    상기 침전물에 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 수용성 고분자 및 증류수를 포함하는 제 1 조성물을 가하여 제 1 검체용액을 제작하는 단계;
    상기 제 1 검체용액에 알코올, 자일렌 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매 및 시아노아크릴레이트, 피브린 글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 의료용 접착제를 포함하는 제 2 조성물을 가하여 제2 검체용액을 제작하는 단계;
    상기 제 2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및
    상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 조성물은 카르복시메틸 세룰로오스 및 디메틸 설폭시드를 추가로 포함하고, 상기 제2 조성물은 농축 포르말린을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 검체의 고정은 포르말린 또는 알코올을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 상기 수용성 고분자 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하고, 상기 제 2 조성물은 유기용매 100 mL에 대해서 상기 의료용 접착제 100 내지 200 를 포함하며, 상기 제 1 조성물 및 상기 제 2 조성물은 상기 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 제 2 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 제 2 검체용액을 교반하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 자동침투과정은 상기 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 알코올 처리, 자일렌 처리 및 파라핀 처리는 각각 복수 회 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법.
  16. 제8항에 따라서 제작된 검체 시료의 파라핀 블록을 박절하는 단계; 및
    상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 현미경으로 관찰하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 현미경 관찰방법.
  17. 1) 표본 대상인 여러 세포 검체들을 회수하여 각각 고정하는 단계;
    2) 고정된 각 세포 침전물에 의료용 접착제 함유 유기용매 및 수용성 고분자 함유 수용액을 처리하여 세포 응집물을 수득하는 단계;
    3) 수득한 각 세포 응집물들을 포매하여 세포군집(cell block)을 수득하는 단계;
    4) 수득한 각 세포군집들로부터 포매된 세포 펠렛(pellets)을 찍어내어(stamped out) 고정된 틀에 배열하는 단계; 및
    5) 배열된 틀을 블록화 및 절편화하는 단계를 포함하는, 세포 마이크로어레이용(cell microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트, 피브린글루, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG(polyethylene glycol) 함유 실란트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것임을 특징으로 하는, 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 유기용매는 알코올, 자일렌, 아세톤 또는 이들 중 하나 이상의 혼합용매인 것을 특징으로 하는, 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidon), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드아민(polyamideamine) 및 폴리디알릴디메틸암모늄클로라이드(polydiallyldimethylammonium chloride)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것임을 특징으로 하는, 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 의료용 접착제는 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)이고, 상기 유기용매는 아세톤이며, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA)인 것을 특징으로 하는, 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 시아노아크릴레이트는 에틸-2-시아노아크릴레이트(ethyl-2-cyanoacrylate)인 것을 특징으로 하는, 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집(cell block) 표본의 제조방법.
  23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 세포 마이크로어레이용 세포군집(cell block) 표본의 제조방법에 따라 제조된 세포 마이크로어레이용(cellular microarray) 세포군집 표본.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170025775A (ko) 2015-08-31 2017-03-08 계명대학교 산학협력단 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201415409D0 (en) * 2014-09-01 2014-10-15 Univ St Andrews Particle counting and characterisation
CN106769278B (zh) * 2016-11-18 2019-08-20 阎树昕 一种细胞蜡块制备试剂盒及其制备方法
IT201700085124A1 (it) * 2017-07-26 2019-01-26 I R C C S Saverio De Bellis Procedimento per la conservazione a lungo termine di pezzi anatomici di particolare interesse
CN115532331A (zh) * 2022-09-20 2022-12-30 上海昂玳医学技术有限公司 一种离心管、离心机以及样本物处理方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513123A (ja) * 1996-08-02 1999-11-09 ミレストーン エッセ エレ エル 生物検体の処理方法
US20030157523A1 (en) 2001-11-20 2003-08-21 Genentech, Inc. Cell and tissue arrays and microarrays and methods of use
KR20050046826A (ko) 2003-11-13 2005-05-19 최제용 엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법
US20060160169A1 (en) 2004-12-03 2006-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Cell microarray for profiling of cellular phenotypes and gene function
JP2007500009A (ja) * 2003-07-25 2007-01-11 アンビオン インコーポレーティッド 固定試料からｒｎａを調製するための方法および組成物
JP2007046988A (ja) 2005-08-09 2007-02-22 Matsunami Glass Kogyo Kk 生物組織標本用包埋ブロックの製造方法および包埋ブロック用情報表示ラベル
WO2008038813A1 (fr) 2006-09-28 2008-04-03 Shimadzu Corporation Procédé de déparaffinage d'un échantillon noyé dans de la paraffine et procédé d'analyse d'un échantillon noyé dans de la paraffine
KR20090097068A (ko) 2008-03-10 2009-09-15 이용근 조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제조방법
KR100926485B1 (ko) * 2007-07-27 2009-11-12 가톨릭대학교 산학협력단 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법
US20100323907A1 (en) 2006-10-27 2010-12-23 Long Ai Ton-That Frozen cell and tissue microarrays
KR20110013365A (ko) * 2008-04-04 2011-02-09 주식회사 프로셀제약 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
KR20110130857A (ko) * 2010-05-28 2011-12-06 정종문 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4880660A (en) * 1987-08-28 1989-11-14 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method for priming hard tissue
US5411885A (en) * 1993-12-17 1995-05-02 New York Blood Center, Inc. Methods for tissue embedding and tissue culturing
US6296604B1 (en) * 1999-03-17 2001-10-02 Stereotaxis, Inc. Methods of and compositions for treating vascular defects
US6174683B1 (en) 1999-04-26 2001-01-16 Biocept, Inc. Method of making biochips and the biochips resulting therefrom
US20010039262A1 (en) * 2000-04-26 2001-11-08 Balaji Venkataraman Methods and compositions for the treatment of cardiac indications
WO2003096308A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Nagoya Industrial Science Research Institute Three-dimensional model
KR20090022639A (ko) 2007-08-31 2009-03-04 엘지전자 주식회사 환기장치의 댐퍼조립체
WO2009064291A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Spartan Medical Products, Llc Cyanoacrylate tissue adhesives
KR101091084B1 (ko) 2008-11-07 2011-12-09 한국과학기술연구원 연골 손상의 치료를 위한 세포군집체-하이드로겔-고분자 지지체 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 연골 손상 치료용 조성물
KR101150840B1 (ko) 2012-01-31 2012-06-13 국립암센터 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513123A (ja) * 1996-08-02 1999-11-09 ミレストーン エッセ エレ エル 生物検体の処理方法
US20030157523A1 (en) 2001-11-20 2003-08-21 Genentech, Inc. Cell and tissue arrays and microarrays and methods of use
JP2007500009A (ja) * 2003-07-25 2007-01-11 アンビオン インコーポレーティッド 固定試料からｒｎａを調製するための方法および組成物
KR20050046826A (ko) 2003-11-13 2005-05-19 최제용 엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법
US20060160169A1 (en) 2004-12-03 2006-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Cell microarray for profiling of cellular phenotypes and gene function
JP2007046988A (ja) 2005-08-09 2007-02-22 Matsunami Glass Kogyo Kk 生物組織標本用包埋ブロックの製造方法および包埋ブロック用情報表示ラベル
WO2008038813A1 (fr) 2006-09-28 2008-04-03 Shimadzu Corporation Procédé de déparaffinage d'un échantillon noyé dans de la paraffine et procédé d'analyse d'un échantillon noyé dans de la paraffine
US20100323907A1 (en) 2006-10-27 2010-12-23 Long Ai Ton-That Frozen cell and tissue microarrays
KR100926485B1 (ko) * 2007-07-27 2009-11-12 가톨릭대학교 산학협력단 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법
KR20090097068A (ko) 2008-03-10 2009-09-15 이용근 조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제조방법
KR20110013365A (ko) * 2008-04-04 2011-02-09 주식회사 프로셀제약 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
KR20110130857A (ko) * 2010-05-28 2011-12-06 정종문 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN DS ET AL., CURROPINCHEMBIOL, vol. 10, 2006, pages 28 - 34
See also references of EP2811281A4 *
WATERWORTH A ET AL., IN VITRO CELL DEVBIOLANIM, vol. 41, no. 7, 2005, pages 185 - 187

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170025775A (ko) 2015-08-31 2017-03-08 계명대학교 산학협력단 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법

Also Published As

Publication number Publication date
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US9880078B2 (en) 2018-01-30
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EP2811281A4 (en) 2015-09-23

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