KR20090097068A

KR20090097068A - 조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제조방법

Info

Publication number: KR20090097068A
Application number: KR1020080022694A
Authority: KR
Inventors: 이용근; 임진익
Original assignee: 이용근; 임진익
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2009-09-15

Abstract

본 발명은 일반적인 생체 조직과 체내 이식용 합성 및 천연 고분자의 3차원 다공성 구조물들을 포함하여 일반적인 고정화 방법으로는 제대로 고정화 되지 않는 경우 또는 파라핀을 포매용 레진으로 사용했을 시 온전한 슬라이드를 얻지 못하는 경우 새로운 방법의 포매용 레진조성 및 레진의 제거방법을 적용하여 효과적으로 조직의 절편을 만들기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로는 파라핀과 비닐아세테이트가 1 ∼ 80％가 포함된 에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 40 ∼ 100℃에서 2 ∼ 50％ 용융 혼합시킨 후 용융액에 검체를 가하여 파라핀과 에틸렌계 공중합체 혼합용액을 침투시키는 것을 포함하는 것으로 이 방법에 따르면, 여러 종류의 체내 조직에서부터 다양한 재질의 조직공학용 지지체의 조직학적 분석이 용이해질 뿐만 아니라 조직의 절편 효율 또한 더욱 증가시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

포매용 레진, 조직공학, 지지체, 조직검사, 에틸렌비닐아세테이트(EVA)

Description

조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의 새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제조방법{Composition of embedding resin for histological analysis of scaffold for tissue engineering and manufacturing method of slide}

본 발명은 일반 생체조직 뿐만 아니라 이식을 위한 합성 및 천연 고분자의 3차원 다공성 구조물들을 포함하여 일반적인 조직 고정화 방법으로는 제대로 고정화 되지 않거나 파라핀을 포매용 레진으로 사용했을 시 온전한 슬라이드를 얻지 못하는 경우 새로운 방법의 포매용 레진조성 및 레진의 제거방법을 적용하여 효과적으로 조직의 절편을 만들기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로는 파라핀과 에틸렌계 공중합체를 40 ∼ 100℃에서 용융 혼합시킨 후 용융액에 검체를 가하여 파라핀과 에틸렌계 공중합체 혼합용액을 침투시키는 것을 포함하는 것으로 이 방법에 따르면, 여러 종류의 체내 조직에서부터 다양한 재질의 조직공학용 지지체의 조직학적 분석이 용이해질 뿐만 아니라 조직의 절편 효율 또한 더욱 증가시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

인체의 각종 질환에 관련한 검사방법은 시대가 변함에 따라 끊임없이 발전하 고 있으며, 최근에는 관련 분야에 첨단 영상기술을 접목시켜 조직에 대해 3차원 영상화 기술을 적용하고자 하는 방향으로 전문화를 모색하고 있다. 보편적이며, 오래된 방법인 조직검사법(Histological analysis)의 경우 비교적 단순한 실험기법 및 실험결과의 재연성과 그 결과에 대한 정확성에 힘입어 그 사용처와 필요성이 꾸준히 증가되고 있는 것이 현실이다. 최근에는 일반 조직의 병리학적 검사뿐만 아니라 조직공학 분야의 발전과 각종 의공학 분야의 활발해진 연구개발 성과들로 인해 조직학 검사에 있어 다양한 조직들의 특성에 알맞은 검사 방법들이 절실히 필요해지고 있는 시점이다.

조직검사방법에 있어 가장 핵심적이라 할 수 있는 것은 침투가 잘된 시료의 블록을 제조하고 조직의 절편을 만드는 과정이라 할 수 있다. 일반적인 방법으로는 4 ∼ 10 ％(v/v) 알데히드 용액에서 24시간동안 고정시켜 단단해진 조직을 알코올로 탈수시키고 60 ℃로 녹여진 파라핀 용액에 2시간 이상 담궈 조직내에 파라핀을 침투시키는 방법을 이용하여 시료조직과 파라핀이 잘 융합된 시료-파라핀 블록을 만든다. 그 후 시료절편을 얻기 위해 절편제조장치인 마이크로텀(microtome)내에서 예리한 칼날로 원하는 두께 (4 ∼ 10 um) 의 절편을 만들고 이를 유리 슬라이드에 붙이게 된다. 그 후 파라핀만 자일렌 용액에 녹여내면 슬라이드 위에는 얇게 썰어진 조직만 펴진 상태로 붙어 있게 되며, 이 상태로부터 여러 가지 염색을 할 수 있게 된다.[1,2]

그러나 유연성이 있는 일반 고분자 또는 키토산이나 히알루론산 등의 천연고분자로 구성된 조직공학용 지지체의 경우 체내의 조직과는 달리 4 ∼ 10 ％(v/v) 포르말린 용액에서 제대로 고정이 되지 않기 때문에 유연성 및 탄성과 약한 기계적 강도 등으로 인해 칼날이 지지체를 제대로 자르지 못하는 문제점이 발생한다. 뿐만 아니라 합성고분자의 경우 자일렌이나 톨루엔과 같이 파라핀을 제거하기 위한 유기용매에 매우 잘 녹기 때문에 힘들게 얻은 시료가 순식간에 녹아 사라지는 문제가 발생하게 된다. 해결 방도로 가장 널리 사용되는 방법으로는 높은 강도와 침투력을 가지고 있는 에폭시 또는 그 변성 아크릴 수지를 이용하여 블록을 제조하고[3], 고가의 특수한 칼날을 사용해 절편을 얻는 것이지만 워낙 고가이며, 절편 제조 시 많은 시간이 소요됨이 큰 단점으로 지적되고 있다. 이를 해결하기 위하여 본 발명에서는 파라핀 자체의 물성에 일정한 탄성과 응집성을 부여 하고자 에틸렌계 공중합체를 파라핀에 대해 적당히 섞어 파라핀-에틸렌계 공중합체의 혼합 블록을 제조하고, 이를 이용하여 각종 구조물에 대해 원하는 두께의 절편을 효율적으로 제조 할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 또한 슬라이드상의 파라핀-폴리에틸렌계 고분자 혼합수지를 용해 제거시키기 위해 자일렌 뿐만 아니라 몇 가지 용매를 이용하여 사용하고자 하는 시료의 특성을 최대한 유지할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

[참고문헌]

1. Journal of Neuroscience Methods, 26, 2, 1988, P129-132

2. Atherosclerosis, 27, 3, 1977, P333-338

3. Micron, 32, 2, 2001, P147-151

본 발명의 목적은 조직공학에 사용되는 합성 및 천연 구조물들 중 알데히드에 의해 제대로 고정화 되지 않거나 파라핀을 포매용 레진으로 사용시 온전한 슬라이드를 얻을 수 없는 경우 조직의 절편을 효과적으로 얻을 수 있는 새로운 포매용 레진의 조성과 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 파라핀과 에틸렌계 공중합체 용융용액에 있어 최적의 조성비율을 찾아내어 시료내로 침투력이 뛰어나며, 시료부분과 레진의 융합을 최적화하고, 각 물성의 차이를 최소화 하여 절편효율의 감소 인자를 완전히 없앨 수 있도록 새로운 포매용 레진의 조성을 제공하는 것이다.

본 발명은 자연계에 존재하거나 합성된 생체 이식용 구조물들 중 일반적인 고정화 방법으로는 제대로 고정 되지 않거나 파라핀을 포매용 레진으로 사용 시 온전한 슬라이드를 얻기 어려운 경우 다양한 구조물의 조직학적 검사를 가능하게 하기 위해 파라핀과 에틸렌계 공중합체를 혼합시킨 포매용 레진을 제조하여 성공적으로 시료의 절편을 제공하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 생체 내 조직은 알데히드용액 내에서 세포와 함께 가교화 내지 고정화하여 그 강도에 변화를 가져오게 된다. 따라서 일반 시판되고 있는 파라핀으로 블록을 제조하여 절편을 만드는데 파라핀의 용융용액에 고정화된 조직을 담그고 경우에 따라서 진공을 걸면서 파라핀 용액이 조직 내로 침투 할 수 있도록 해주고 있다. 고르게 침투된 파라핀의 물성과 고정화된 조직의 물성에 있어 큰 차이가 없는바 지금까지는 큰 불편 없이 절편을 제조할 수 있었다. 그러나 최근 들어 조직공학 분야의 눈부신 발달에 힘입어 조직검사를 위한 블록제조 방법은 더 이상 생체내 조직의 검사만을 목적으로 하는 데에서 보다 다양한 종류의 시료 절편을 만들어야 할 상황에 이르게 되었다. 이에 따른 포매용 레진 조성의 개선 및 개발이 더욱 시급해지고 있는 상황이다. 이에 본 연구실은 다년간 천연 및 합성 고분자 지지체의 조직공학적 응용에 관해 연구를 수행해 오던 바 파라핀을 사용하는 기존 조직의 절편방법이 비효율적임을 깨닫고, 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 근본적인 문제의 해결을 위해 시료와 파라핀의 물성 차이를 극복 하고자 파라핀과 비슷한 물리화학적 특성을 가지면서 제조된 블록 전체에 응집력과 탄성을 부여하고자 하였다. 그러나 응집력이나 탄성도가 향상되게 되면 레진용액이 시료내부로의 침투력이 낮아질 수 있는바 본 발명에서는 파라핀과 거의 동등한 침투 시간 및 온도조건을 얻을 수 있었다. 이를 만족하기 위해 에틸렌비닐아세테이트(EVA) 공중합체를 이용하였으며, 공중합체내 비닐아세테이트 함량은 80％를 넘지 않는 조건에서 본 발명을 완성하였다.

조직학적 검사법은 오랜 기간 동안 조직분석에 있어 가장 정확하고 신속한 방법으로 자리 메김 되어 왔으며 매우 널리 사용되는 보편적인 방법이다. 최근 의공학 분야의 발달로 일반조직 뿐만 아니라 다양한 재질로 구성된 조직의 이식이나 보철등의 시술이 활발해 짐에 따라 일반조직에 적용하는 검사방법으로 제대로 된 결과를 얻기 어려운 경우가 있다. 또한 고가의 레진을 구입하거나 고가의 칼날을 사용하는바 유지비 및 재료비등 소요되는 시간까지 포함하면 매우 비효율적이라 할 수 있다. 본 발명은 이러한 문제를 해결할 수 있는 매우 경제적이고 효율적인 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따르면 파라핀과 에틸렌계 공중합체 수지를 용융 혼합 해준 후 시료를 가해주는 단계, 시료를 가하여 제조된 블록의 절편화 단계, 그리고 조직절편으로부터 파라핀과 폴리에틸렌계 수지를 제거해주는 단계를 포함하는 블록 및 절편 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면 폴리에틸렌계 수지로는 분자량 범위가 1,000에서 5,000,000사이이며, 폴리에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 포함하는 에틸렌계 공중합체로서 보다 상세하게는 비닐아세테이트 함량이 1 ∼ 80％인 폴리에틸렌비닐아세테트 공중합체이며, 파라핀과의 비율은 2％에서 50％(w/w)사이가 적당하다. 파라핀에 에틸렌계 고분자의 양이 과도하게 증가하게 되면 경도 및 표면 마찰이 커지게 되는바 절편 제조 시 칼날의 손상을 초래할 수 있으며, 만들어진 절편에 칼날이 지나간 긁힌 자국이 남게 된다. 또한 파라핀과 폴리에틸렌계 공중합체의 제거를 위해서는 n-헥산, 시클로헥산, n-헵탄, 시클로헵탄, n-옥탄, 등을 포함하는 탄소(C)수 4개에서 10개인 비극성인 탄화수소용매를 의미한다. 본 발명에 의해 제조된 블록과 기존 파라핀 블록을 이용하여 동일한 마이크로텀 내에서 4um 두께로 10장의 연속적인 절편화 작업을 수행 시 부스러짐 없이 온전하게 얻을 수 있는 절편의 수를 몇 가지 고분자시료와 천연물시료 및 일반조직을 이용하여 비교해 보았다.[표 1] 그 결과 일반 조직의 절편에 있어서 100％에 가까운 우수한 효과를 확인 했으며, 합성 및 천연고분자 지지체의 경우 그 효율이 파라핀 방법보다 절대적인 우위에 있음을 확인 하였다. 또한 에틸렌계 고분자중 33％의 비닐아세테이트 함량을 가진 폴리에틸렌비닐아세테이트의 함량을 15％에서 50％로 변화시키면서 블록의 강도변화를 측정한 결과 파라핀 대비 에틸렌계 수지의 증가에 비례하게 강도가 증가함을 관찰한바 있다. 이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[표1] 기존방법과 본 발명에 따른 블록의 절편화 성공률(체내조직, 합성고분자, 천연고분자)

[실시예 1] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 방법 1

비닐아세테이트 함량이 33％인 에틸렌비닐아세테이트를 파라핀에 대해 각각 7, 17, 25％(w/w)의 비율로 60 ∼ 80 ℃에서 혼합 용융하고, 미리 자일렌에 1시간동안 담근 3차원다공성 키토산 지지체를 이 혼합 용액 속에 방치하였다. 충분히 침투되도록 1시간 동안 방치한 후 블록을 제조하고, 마이크로텀을 이용하여 절편을 얻을 수 있었다. 슬라이드상의 절편에서 이 혼합레진의 효과적인 제거를 위하여 상온에서 자일렌 용액에 1시간이상 방치 하게 되면 시료만 남겨진 슬라이드를 얻을 수 있다. 혼합레진의 제거 전 비교예 1과 비교군으로 AFM측정을 통하여 절편된 표면에서 시료부위와 레진부위의 거침도를 측정하였다. [표2]

[실시예 2] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 방법 2

비닐아세테이트 함량이 20％인 에틸렌비닐아세테이트를 파라핀에 50％(w/w)의 비율로 70 ℃에서 혼합 용융하고, 톨루엔에 미리 1시간 동안 담근 염 침출법을 이용하여 제조된 90％의 공극률을 갖는 Poly(Lactide-co-e-caprolactone) PLCL 지지체를 이 혼합용 용액 속에 방치하였다. 1시간 동안 방치한 후 블록을 제조하고, 절편을 얻을 수 있었다. 이 용융혼합물의 효과적인 제거를 위하여 60 ℃로 가열된 노르말 헥산용매에 1시간이상 방치하면 시료만 남겨진 슬라이드를 얻을 수 있다.이 슬라이드를 현미경 사진으로 나타내었으며, 동일한 시료를 이용하되 실시예 1의 방법과 비교하였다. [도 1]에서와 같이 파라핀 방법의 경우 기공과 기공 사이의 벽이 구분 없이 무너져 있는 형태가 관찰된다. 반면, 본 발명에 의한 방법으로 만든 슬라이드는 형태가 그대로 유지되고 있는 것을 저배율(40배)상에서 관찰할 수 있다.

[실시예 3] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 방법 3

비닐아세테이트 33％인 EVA를 파라핀에 17％ (w/w)의 비율로 80℃에서 혼합 용융하고, 이 혼합액에 로진을 전체 수지에 대해 0.5％(w/w)가하였다. 미리 헥산용액에 1시간 동안 담근 키토산 지지체를 이 혼합 용액 속에 방치하였다. 1시간 동안 방치한 후 블록을 제조하고, 마이크로텀을 이용하여 절편을 얻을 수 있었다. 이 용융혼합물의 제거를 위하여 55℃로 미리 가열된 벤젠용매에 30분 이상 방치하면 시료만 남겨진 슬라이드를 얻을 수 있다.

[실시예 4] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 방법 4

비닐아세테이트 함량이 33％인 에틸렌비닐아세테이트를 파라핀에 5％(w/w)의 비율로70 ℃에서 혼합 용융하고, 헵탄에 미리 1시간 동안 담근 히알루론산 지지체를 이 용융혼합 용액속에 방치하였다. 1시간 동안 방치한 후 블록을 제조하고, 파라핀법과 동일한 방법으로 절편을 얻을 수 있다. 이 용융혼합물의 효과적인 제거를 위하여 시클로헥산용매에 1시간이상 방치하면 시료만 남겨진 슬라이드를 얻을 수 있다.

[실시예 5] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 방법 5

비닐아세테이트 함량이33％인 에틸렌비닐아세테이트를 파라핀에 대해 15％(w/w)의 비율로 60 ∼ 80 ℃에서 혼합 용융하고, 대조군으로는 파라핀 용융용액을 준비하였다. 토끼로부터 적출한 동맥혈관을 4％ 포르말린에 24시간 고정화 시킨 후 탈수과정을 거쳐 자일렌에 1시간 동안 담근 실제 조직을 이 각각의 고분자 용융액속에 방치하였다. 1시간 동안 동일하게 방치한 후 블록을 제조하고, 절편을 얻을 수 있다. 고분자의 제거를 위하여 상온에서 자일렌용액에 1시간이상 방치한 후 핵 염색을 위한 DAPI염색 및 액틴에 대한 면역화학적염색을 실시하여 비교해 보았다. [도 2] 에서와 같이 현미경상에서 에틸렌비닐아세테이트가 들어있는 것이나 그렇지 않은 조직의 염색 효율에서 차이가 나타나지 않았다. 이는 에틸렌비닐아세테이트 또는 기타 용매조건이 조직의 염색에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있다.

[비교예 1] 조직공학용 지지체의 포매용레진의 조성 및 절편화 비교 1

파라핀을 60℃에서 완전히 용해시키고, 미리 자일렌에 1시간동안 담근 키토 산 지지체를 이 용액 속에 방치하였다. 1시간 동안 방치한 후 블록을 제조하고, 절편을 얻을 수 있다. 절편으로부터 파라핀의 제거를 위하여 상온에서 자일렌용매에 1시간이상 방치하면 시료만 남겨진 슬라이드를 얻을 수 있다. 파라핀 제거 전 만들어진 절편의 파라핀 부분의 표면분석을 위하여 AFM 측정을 시도하였다. [표2] 에서와 같이 에틸렌비닐아세테이트의 양에 의존성 있게 표면이 매끄럽게 바뀌는 것을 알 수 있다. 이는 얇게 만들어진 절편의 표면 거침도와 비례하며, 나아가 영상의 질적인 문제와도 연관된다고 할 수 있다.

[표 2] 파라핀에 폴리에틸렌계 고분자의 양에 따라 제조된 절편의 표면거침도 측정

최근 의공학분야의 발달로 일반조직 뿐만 아니라 다양한 재질로 구성된 조직의 이식 및 보철 시술이 활발해 짐에 따라 관련 벤처기업 및 연구소등에서 활발한 연구가 진행되고 있으며, 시판되고 있는 제품도 늘어나고 있는 실정이다. 그러나 일반조직에 적용하는 검사방법으로 제대로 된 결과를 얻기 어려운 경우가 있다. 또한 고가의 레진을 구입하거나 고가의 칼날을 사용하는바 유지비 및 재료비등 소요되는 시간까지 포함하면 매우 비효율적이라 할 수 있다. 본 발명은 이러한 문제를 해결하고 매우 경제적이고 효율적인 방법으로써 산업 경제 전반적인 사용이 가능한 방법을 제공하고자 한다.

도 1은 본 발명에 의한 방법과 파라핀을 사용한 고탄성 합성 고분자인 Poly(L-lactide-co-caprolactone), PLCL로 만들어진 3차원 다공성 지지체의 절편을 위상차 현미경으로 비교한 사진이다.

도 2는 기존 파라핀 방법과 본 발명에 의한 토끼혈관 절편의 위상차 및 핵과 액틴에 대한 면역화학적 염색을 비교한 것이다.

Claims

본 발명은 파라핀과 폴리에틸렌계 공중합체의 용융혼합물과 함께 시료의 블록을 제조하고, 시료에 따른 유기용매를 이용하여 파라핀과 폴리에틸렌 공중합체 혼합물의 제거단계를 포함하는 다양한 종류의 시료에 대한 효과적인 절편제조방법을 제공 한다.
청구 제 1항에 있어 폴리에틸렌계 수지로는 분자량 범위가 1,000에서 5,000,000사이이며, 비닐아세테이트의 함량이 1％ ∼ 80％인 폴리에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 포함하는 에틸렌계 공중합체로써 파라핀과의 비율은 2％에서 50％(w/w)사이를 특징으로 하는 블록-절편의 제조방법.
청구 제 1항에 있어 파라핀과 폴리에틸렌계 수지의 제거를 위해서는 n-헥산, 시클로헥산, n-헵탄, 시클로헵탄, n-옥탄, 등을 포함하는 탄소(C)수 4개에서 10개인 비극성인 탄화수소용매를 의미하며, 섭씨 4 ∼ 80도에서 혼합수지를 제거함을 특징으로 하는 블록-절편의 제조방법
청구 제 1항에 있어 폴리에틸렌계 공중합체에 경우에 따라 로진이나 석유수지를 전체 수지함량의 0.1 ∼ 50％까지 첨가하여 접착성을 향상시킬 수 있는 시료절편용 레진의 조성 및 슬라이드 제조방법
파라핀에 2％ ∼ 50％ w/w까지 용융 혼합된 비닐아세테이트 함량이 1 ∼ 80％인 에틸렌계 공중합체를 용융 혼합시켜 제조된 시료블록의 제조 및 섭씨 4도에서 80도 사이에서 탄소 수 4 ∼ 10개의 비극성 탄화수소 용매에 의한 고분자혼합물의 제거단계로 구성 된 방법으로 청구 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 포매용 레진조성 및 절편의 제조방법.