KR20050046826A

KR20050046826A - 엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법

Info

Publication number: KR20050046826A
Application number: KR1020030080155A
Authority: KR
Inventors: 최제용
Original assignee: 최제용
Priority date: 2003-11-13
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2005-05-19

Abstract

본 발명은 조직 고정액의 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 각각의 유기용매 조성물에 유효한 만큼을 함유 시켜 제조한 본 발명 고정액은 Laser Capture Microdissection을 이용하여 기존의 실온에서 추출하지 못했던 온전한 RNA을 추출할 뿐 아니라 기존의 고정액이 지니지 못한 파라핀 포매 조직에서도 뛰어난 온전한RNA를 추출하는 효과도 있어, 암의 전이 및 분자 의학적인 질환 유전자 발현양상을 연구하는데 획기적인 효과를 가지고 있다. 또한 본 발명으로 정확한 진단뿐만 아니라 비용 절감의 효과도 제공한다.

Description

엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법{The method of using laser capture microdissection extracted in pure RNA that obtained from paraffin block through tissue specific fixing agent }

본 발명은 조직 고정액의 조성물 및 제조 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 methacarn(메탄올 60퍼센트 클로로포름 30퍼센트 아세틱엑시드 10퍼센트)을 함유한 조직 고정액으로서 실온에서도 Laser Capture Microdissection을 이용하여 온전한 RNA추출이 용이하며, methacarn으로 고정된 파라핀 포매 조직에서Laser Capture Microdissection을 이용이여 얻은 세포를 유전자 발현양상을 통해 암과 같은 각종 질환의 분자 의학적인 접근이 용이한 유기용매 함유 조직 고정액의 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 이와 같은 기술에 대해서 이미 논문으로 출간되었다(Je-Yong Choi et al., Journal of Cellular Biochemistry, 2003). 의학 분자생물학적인 면에서 각 종양의 유전자 변화에 대한 연구는 질병이 걸리는 전반적인 과정을 연구하는 학문이다. 어떤 종양에 특이한 유전자 변화를 알아내려면 정상조직과 이상조직 간의 분자 구조를 비교함으로써 질병의 발병 양상을 연구 하고 있다. 이때 실험 재료로는 파라핀 포매 조직을 가장 많이 이용하는데 그 이유는 짧은 시간에 대량의 재료를 손쉽게 구할 수 있기 때문이다(Shibutani et al., 2000). 이러한 일련의 연구의 최종 목표는 적은 양의 전이된 세포를 사용하여 질병에 대한 정확한 정보를 얻어내어 환자 개개인에 맞는 적합한 치료를 하기 위함이다. 향후의 의학계의 새로운 흐름으로 자리잡아 가고 있다.

고정이라 함은 살아있는 상태에서 관찰하기 어려운 경우에 세포 조직 생체를 순간적으로 죽여서 살아있는 상태에 가깝게 응고시키는 것을 말한다. 이때 쓰이는 시약이 고정액(fixing agent)이며, 세포 생체 조직을 고정시키는 이상적인 고정액은 조직 내에 빠르게 침투하여 세포를 죽여야 되며, 살아있는 상태에 가까워야 되며, 응용성 및 염색에 지장에 없어야 된다. 다음은 몇 가지 고정액에 대하여 나타낸 표이다.

표 1

고정액의 종류

성분

비고

카루노아액camors solution	100 알코올 3 빙초산 1	20분-3시간 고정,핵 염색체
크롬초산액chrom acetic acid solution	크롬산0.7g 빙초산0.5초 물100cc	24시간 이내,조류
젠커액 Zenkers solution	중크롬산칼리 2, 2.5g 유산소오다 1g 증류수 100cc 빙초산5cc 승홍 5g	12시간 고정, 동물조직
포르말린 초산 알코올 혼합액 formalin acetic alchol	70 알코올: 90cc 포르말린5cc 빙초산 5cc	48시간 고정, 식물병리조직
부안액 Bouins soiution	피크린산 포화수용액5cc formalin25cc 빙초산5cc	24시간 고정, 동물조직, 식물병리조직
알렌액 Allens soiution	크롬산 1g 빙초산 1cc 요소0.5g 증류수100cc	48시간 고정, 식물조직, 식물병리조직
포르말린 formalin	formaldehyde의 포화용액-40	동물표본 저장 및 고정

그러나, 기존의 고정액인 에탄올, 포름알데하이드 및 메탄올은 동결 파라핀 포매 조직에서 핵산 추출이 가능하지만, 손상되지 않고 RNA를 추출하기가 어려웠다. 또한 기존의 고정액이 아주 유용하든지, 파라핀 포매 조직에서 RNA를 추출한다든지 하는 일련의 과정이 성립되지 못한 실정이다. 또한 각 고정액마다 가지고 있는 유용한 고정 조직의 범위는 특정한 연구 및 실험을 하기 위하여 최상의 배합 조성물 이므로 모든 원하는 연구를 하기 위한 고정액은 기술의 발달과 더불어 생겨나게 되었다.

최근의 연구로는 환자로부터 전이된 세포는 그 양이나 크기가 제한되어 있어서 기존의 도구로는 시료를 채취하는데 어려움이 있었다. 따라서 현미경을 이용하여 세포를 관찰 하면서, 원하는 세포만을 얻어내는 Laseer Capture microdissection 첨단의학 방법이 개발되게 되었다. laser를 이용한 microdissection방법은 다양하게 개발되고 있으며, 그 방법 중에 하나는 조직절편이 있는 슬라이드 위에 투명한 열점성(thermoplastic) 필름을 올린 후 CO2 laser를 원하는 세포 위의 필름에 조사하면 필름이 녹으면서 점성력이 생겨 아래쪽에 있는 표적세포를 쉽게 얻을 수 있다. 또 다른 방법으로는 표적세포 주위의 원하지 않는 세포나 조직을 UV laser로 완전히 파괴한 후 컴퓨터로 조정되는 미세조종기로 세포를 수거하는 방법이 있다.

LM 방법은 여러 종류의` 세포들이 모여 있는 조직으로부터 특수 조직만을 잘라내어 분자 의학적인 분석(Molecular analysis)을 가능하게 한다. 핵산(Nucleic Acid Analysis), 단백질체(Proteomics)분석에는 DNA chip, RT-PCR을 이용한 유전자발현(Gene expression) 및 이종접합자의 손실(Loss of heterozygosity) 과Proteomics에는 2D Protein gels, Western Blotting, Protein chip Target molecule 의 molecular sequence 나 structure 등 응용범위가 다양하다.

현재 고정액을 이용한 조직 병리학의 암 연구에서 가장 흥미로운 분야 중 하나는, 정상조직과 종양조직을 순수하게 분리하는 것이 제일 처음 하여야 할 일이다. 기존의 미세절제술(microdissection technique)은 파라핀 포매조직으로 부터 5내지 10장의 연속절편을 얻어서 그중 1개를 H & E 염색을 하여 종양부위와 정상부위를 현미경으로 구분한 뒤 나머지 염색되지 않은 슬라이드에서 동일부위의 조직을 예리한 수술용 칼이나 주사 바늘로 긁어내고 여기서 추출한 DNA를 중합효소반응( polymerase chain reaction; PCR)에 사용하고있다. 그러나 생검조직이 너무 적어 충분한 양의 DNA나 RNA를 얻을 수 없거나, 종양세포보다도 주위의 간질세포나 염증세포의 침윤이 많은 경우나, 종양의 구조가 복잡하여 순수한 종양세포의 분리가 불가능한 경우에는 종양세포에 특이한 유전자 변화를 찾아내기가 쉽지 않았다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 보다 정교한 미세절제술이 요구되어 왔으며 현재 많은 연구자들에 의해 여러 가지 방법이 시도되고 있는 중이다.

종래의 고정액의 문제점을 극복하면서 RNA가 손상되지 않고 실온에서도 추출이 용이한 고정액을 개발하고자 여러 가지 유기용매의 활성을 측정한 결과 특히 메탄올이 주요성분으로 함유된 고정액 조성물을 제조하여 Laser Capture Microdissection방법을 이용하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 메탄올이 유효성분으로 함유된 된 고정액 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고정액 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고정액 조성물로 고정된 파라핀 포매 조직에서 Laser microdissection을 사용하여 원하는 세포를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고정액 조성물로 고정된 파라핀 포매 조직에서 Laser Capture Microdissection을 이용하여 실온에서도 손상되지않은 온전한 RNA를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명 구성을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 메탄올, 클로로포름 및 아세틱엑시드 이들의 혼합물의 유효성분을 함유함을 특징으로 하며, 고정액은 이들 유효성분의 작용에 의해 Laser Capture Microdissection 방법에 의해서, 실온에서도 손상되지 않은 온전한 RNA 추출 및 세포의 분자의학적 양상실험에 효과를 나타낸다.

메탄올은 특징적인 알코올향을 가진 투명의 무색의 액체로서 물질명은 메틸 알코올(METHYL ALCOHOL), 분자량이32.04이며, 분자식은 C-H3-O-H이다. 끓는점 149 F(65도), 녹는점 137 F(-93도), 증기압 97.25mmHg, 증기밀도 1.11, 비중 0.7914, 점도 0.59cP, 용해도는 물에 잘 녹는다.

현재, 고정액의 조성은 메탄올, 클로로포름 및 아세틱엑시드가 혼합되어 엘시엠용 고정액으로의 용도에 관한 문헌 및 사용은 개시된 바 없었다. 이에 메탄올이 유기용매로서 연료전지 및 일반적인 유기용매로서의 역할로 알려져 있으며, 조직의 고정 및 염색과정에서의 안정성 및 유용성에 대한 본격적인 연구가 되어 있지 않음을 착안하고, 메탄올의 검색결과, 메탄올 단일 성분 보다는 메탄올을 포함한 각각의 성분들이 서로 결합하여 전체로서 RNA 의 안정성 및 손상을 최소화 한다는 것을 확인하고, 통상의 고정액 조성물에 유효성분으로 함유시킴 으로써 분자 의학의 기본이 되는 분자생물학적인 탐색을 위한 고정액으로서의 용도로 개발하게 된 것이다.

본 발명에서는 여러 가지 대조군 고정액을 사용하여 파리핀 포매 조직에서 RNA을 추출하기 위하여, 마우스 조직을 사용하였다. 일반적인 파라핀 포매 조직을 만드는데 방법에는 고정, 수세, 탈수, 침투의 4가지의 기본적인 과정이 있다. 본 발명에서 RNA추출을 위하여 에탄올 100%, 에탄올 70%, 아이소프로판올 100%, 아이소프로판올 50% 및 methacarn 고정액을 가지고 성체 마우스 간, 폐 및 태아 사지의 조직을 고정시킨 후 RNA을 추출을 시도하였으며, ethidium bromide염색에 의한 손상되지 않은 ribosomal RNA은 전기영동으로 확인 한 결과, 에탄올 100%, 에탄올 70%, 아이소프로판올 100%, 아이소프로판올 50% 과 같은 고정액 보다 methacarn이 다른고정액보다 우수한 양상을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 가장 중요한 단계는 조직의 처음 단계인 고정 단계이며, 고정단계에서의 고정액의 종류에 따라 RNA 추출이 가능하다는 것이 증명되었다.

본 발명자들은 본 발명의 한 실시예 도 2의 예에서 냉동된 마우스 간 조직에서의 RNA 추출의 유무를 조사하기 위하여, 에탄올 100%, 에탄올 70%, 아이소프로판올 100%, 아이소프로판올 50% methacarn과 같이 RNA추출을 통하여 전기영동으로 확인한 결과, 에탄올 100%, 에탄올 70%, 아이소프로판올 100%, 아이소프로판올 50%보다 월등하게 손상 없는 RNA을 얻을 수 가 있어 냉동 조직절편에서도 고정액의 종류에 따라 RNA 안정성에 영향이 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 간, 폐, 비장, 뼈, 사지 에서도 손상 없는 RNA를 추출할 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 한 실시예 도 3의 예에서 methacarn으로 고정하지 않은 냉동 조직과 methacarn으로 고정된 파리핀 포매 조직에서의 RNA 추출 및 정제 상태를 전기영동으로 평가 확인 한 결과, methacarn으로 고정된 파라핀 포매조직과 고정되지 않고 냉동된 조직과의 RNA 손상 및 안정성 면에서 차이가 없는 것을 확인 할 수 있었으며, 추출된 RNA를 이용한 RT-PCR에서도 GAPDH와 같은 housekeeping gene, Col2a1, ColXa1, ALP, ON과 같은 유전자의 DNA가 잘 발현되는 것을 확인 하였으며, 유전자 수준에서의 관찰이 가능하다는 것을 보여주고 있는 것이다.

따라서, 본 발명은 methacarn 고정액이 파라핀 포매조직으로부터 RNA의 추출 및 이를 이용한 분자 유전자 수준의 발현 양상을 확인하는데 있어서의 중요한 요소임을 기초로 하여 파라핀 포매 조직에서 RNA추출에 있어서의 상기 고정액의 조성물의 용도를 제공한다. 즉, methacarn 조성물, 또는 그에 대한 제조 방법을 이용하여 파라핀 포매 조직에서의 RNA추출 방법을 제공한다. 파라핀 포매 조직에서 RNA추출의 결정적 인자인 methacarn과 같은 고정액을 이용한 조직 병리학적인 진단 및 방법은 당업계에 충분히 공지되어있다.

본 발명자들은, 본 발명의 한 실시예 도 4의 예에서 파라핀 포매 조직에서의 RNA 보존 및 안정성을 다른 방법으로 확인하기 위하여 마우스 태아 15일된 사지에서, 비대성(Hypertrophic) 연골세포에서만 발현되는 Type X collagen과 비대성(Hypertrophic) 연골세포를 포함한 모든 세포에서 발현되는 Type II collagen을 In situ hybridization방법으로 파라핀 포매 조직에서 확인결과 methacarn으로 고정된 파라핀 포매 조직에서 Type X collagen과 Type II collagen이 검출 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 개별적 및 포괄적인 조직 특이하게 발현되는 유전자라고 할지라도, methacarn 고정액을 이용하면, 유전자 분자 수준에서의 진단 및 전이된 유전자도 확인 가능하다는 것을 보여주고 있다.

본 발명자들은 methacarn이 RNA를 손상되지 않게 고정한다는 것과 관련하여 파라핀 포매 조직에서의 세포를 분리하는 방법중에 하나인 Laser Capture Microdissection 방법을 이용하여 RNA을 추출할 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 한 실시예에 있어서 15일된 마우스 태아의 사지를 파라핀 포매 조직을 제작하여, Type X collagen과 Type II collagen의 유전자를 확인한 결과 모든 세포에서 발현되는 Type II collagen은 모두 발현된 것을 보여주는 반면, 비대성(Hypertrophic) 연골세포에서만 발현되는 Type X collagen는 비대성(Hypertrophic) 연골세포에서만 발현되는 것을 확인하였으며, 냉동 조직과 methacarn 고정 파라핀 포매 조직과의 RNA 추출 뒤 안정성 및 농도 순수한 상태 모두 우수한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명은 암 종양과 같은 유전자 발현 이상이나 새로운 타입의 암 진단 표지자로서 이용한다면 매우 유용할 것이다.

Methacarn 고정액을 특정 질환의 병변 세포를 추출하고 그것에서 핵산 및 단백질을 분석하여 질환의 진단, 치료 및 치료 반응성에 유용한 생물활성 마커를 찾아 임상응용에 필요한 제품생산에 이용될 수 있다. 쉽게는 발암원인 유전자 및 유전자 이상에 의한 암의 진행에 관여하는 유전자를 스크린하고, 그것에 얻어지는 후보 유전자 물질을 유효성분으로 포함하는 의약품 제조도 가능할 것이다. 또한 스크린된 유전자중에서 강력한 후보 유전자일 경우에는 유전자가 녹아웃 되거나 또는 돌연변이된 유전자를 제조하고 이를 유전자의 발현이나 기능, 약제의 스크리닝 등에 이용한다면 매우 유용할 것이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 파라핀 포매 조직

조직 샘플을 얻기 위하여 2개월된 ICR마우스를 구입하였다. 상기 마우스에서 각 실험에 필요한 조직을 얻었다. 각각의 조직을 고정하기 위하여 대조군(70% 에탄올, 100% 에탄올, 50% 아이소프로판올, 100% 아이소프로판올, 10% 포르말린, 4% 파라포르말린, 아세톤)과 methacarn을 4°C 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 에탄올을 이용하여 탈수를 실시하였다. 탈수는 70% 에탄올에서 100% 에탄올까지 저농도에서 고농도까지 조직의 수축을 방지하면서 탈수를 유도 하였다. 탈수 및 침투가 용이하게 위하여 xylene을 사용하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 조직을 투명하게 하고, 투명속도가 빠르게 하였다. 마지막으로 파라핀을 60°C에서 1시간동안 반응시켜 완전하게 xylene을 제거하였다.

실시예 2 : RNA 추출

RNA 추출을 실시하기 전 2가진 유형으로 샘플을 준비하였다. 첫번째는 파라핀 포매 조직에 여러 가지 다양한 고정액을 사용하기 위하여 5-10μm 두께로 절단하였다. 두번째 조직 샘플은 Laser Capture Microdissection을 사용하기 위하여 샘플을 준비하였다. 첫번째 샘플의 RNA추출방법은 다음과 같다. 파라핀 포매 조직을 마이크로 튜브에 넣고, xylene 1,200μL을 파라핀 포매 조직이 들어있는 튜브에 넣고 강하게 흔들어주고, 14,000rpm에서 2분동안 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거하고 난 다음 100% 에탄올1,200μL을 튜브에 넣고 강하게 흔들어주고, 14,000rpm에서 2분동안 원심분리를 실시하였다. 상기 위와 같은 반응을 3번 실시하였다. 그런 다음 튜브 바닥에 침전된 작은 알갱이와 같은 하얀 침전물을 실온에서 건조시켰다. 건조된 작은 침전물을 제조사가 권하는 조건에서 Tri reagent(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, U.S.A.)를 사용하여 상온에서 강하게 흔들어서 균일화 시킨 다음 상온에서 10분 동안 보관하여 핵질단백질(nucleoprotein)들이 완전히 분리되도록 하였다.

그 다음, 균질물을 4°C 에서 15분동안 12,000rpm으로 원심분리시켜, 침전물을 제거하고 상층액을 수집하였다. Tri reagent 1mL당 0.2mL의 클로로포름을 상층액에 첨가하고 20초동안 강하게 흔들었다. 이 혼합물을 상온에서 10분 동안 보관한 다음 4°C 에서 15분동안 12,000rpm에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 혼합물은 하단의 붉은 페놀-클로로포름층, 중간층 및 무색의 상단 수용액층으로 분리되었다. RNA은 배타적으로 수용액층에서 발견되었으며, DNA와 단백질은 중간층 및 유기용매 층에 분포하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고, 여기에 이소프로판올과 혼합함 으로서 수용액 층으로부터 RNA를 침전시켰다. 그런 다음 샘플을 상온에서 5분 동안 보관한 후에 4°C 에서 10분동안 12,000rpm에서 원심분리 시켰다. RNA침전은 튜브의 측면 및 바닥에 백색의 알갱이을 형성하였다. 상층액을 제거하고, 75% 에탄올로 한번 3번 세척하였다. 끝으로 RNA 를 실온에서 건조시켰다.전체 RNA 농도는 스텍트로포토메타를 사용하여 측정하였다(Ultraspec 2000 UV/Visible Spectrophotometer, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, U.S.A.).

두번째 샘플의 RNA추출방법은 다음과 같다. 제조사에서 권하는 RNA추출방법과 조건에 따라 RNA isolation kit(Stratagene, La Jolla, U.S.A.)을 사용하여 실시하였다. 마지막으로 DEPC처리된 3차 증류수를 사용하여 RNA를 반응시킨 후 RNA 젤 전기영동을 사용하여 ribosome RNA의 18S 및 28S의 선명도 및 농도를 확인하였다.

실시예 3 : Laser Capture Microdissection

파라된 포매 조직을 회전식 미세절단기(Leica, Germany)를 이용하여 5-10㎕ 두께로 절단하였다. 섹션 절단된 파라핀은 Superfrost/Plus slide(Fisher scientific, Pittsburgh, PA, U.S.A.)에 1.35㎛ polyethylene 전달 멤브레인과 함께 고착시켰다. 1.35㎛ polyethylene 전달 멤브레인은 Fixogum(Marabuwerke, Germany)으로 고정되었으며, DEPC로 처리된 증류수로 코팅되었다. 파라핀 포매 섹션은 xylene으로 파라핀을 제거하고, 에탄올로 1분동안 탈수반응을 거쳐다. 섹션은 85% 에탄올로 고정된 다음 헤마톡시린으로 3분 동안 염색을 실시하였다. 그런다음 85% 에탄올로 씻어 준 다음 에오신 Y 용액을 사용하여 염색하였다. Vanadyl Ribonucleotide Complex(VRC) 및 Rnase inhibitor(NEB, Beverly, U.S.A.)을 염색 용액에 미리 첨가하여 RNA가 공격받는 것을 차단하였다. 염색된 섹션은 85% 에탄올부터 100% 에탄올까지 씻어준 다음 공기중에서 건조 시켰다. 당 업계에서 사용되고 있는 Robot-MicroBeam(PALM, Bernried, Germany)을 사용하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 섹션에서 세포를 추출하였다. 추출된 세포는 미세튜브에 넣고 Micro-RNA isolation kit(Straatgene La Jolla, U.S.A.)을 사용하여 RNA을 분리하였다.

실시예 4 : RT-PCR

Laser Capture Microdissection으로 얻어진 RNA에서 유전자 발현 분석을 위하여 AMV reverse Transferase XL PCR(Takara, Kyoto, Japan)을 수행하였다. 먼저 20㎕RT-mixture(50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH 8.3, 1U Rnase inhibitor, 0.125 pM Oligo dT primer, 1mM dNTP mixture)를 혼합한 뒤에 42°C 에서 90분동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기 반응물은 taq DNA 중합효소(50U/ul)를 사용한 PCR에서 템플레이트로 사용하였다. PCR 반응조건은 92°C 에서 2분동안 전체 DNA를 변성시킨 후에, 온도는 94°C 에서 30초, 45초 동안 각 표본에 대해 30회 사이클링 하였다. 상기 PCR에서 변성 및 가열조건은 Col10α1에 적용되었으며, Col2 α2, alkaline phosphate 및 osteonectin의 변성 및 가열조건은 60°C 이고, GAPDH, Col10 α1의 변성 및 가열조건은 55°C 이다. PCR 결과의 산물은 1.5% 아가로스 젤 상에서 전개시켰다.

표 2 Primers condition

이름 서열	염기서열
GAPDH	5 TGAGAACGGGAAGTTGTCA 35 GGAAGGCCATGCCAGTGA 3
Col2 α1	5 CACACTGGTAAGTGGGGCAAGACCG 35 GGATTGTGTTGTTTCAGGGTTCGGG 3
Col10 α1	5 CCACCTGGGTTAGATGGAAAA 35 AATCTCATAAATGGGATGGG 3
ALP	5 GCCCTTCCAAGACATATA 35 CCATGATCACGTCGATATCC 3
osteonectin	5 GATGAGGACAACAACCTTCTGAC 35 TTAGATCACAAGATCCTTGTCGAT 3

실시예 5 : Hematoxyline and Eosin (H&E) 염색

H&E 염색을 위하여 파라핀을 xylene을 이용하여 실온에서 2분 동안 3번씩 번갈아 가면서 파라핀을 제거하였다. 그런 다음 에탄올을 이용하여 70% 에서 100%까지 순차적으로 에탄올을 이용하여 탈수 과정을 거쳤다. 염색에 들어가기 전 증류수를 사용하여 2분동안 씻어 준 다음 헤마톡시린(Sigma, U.S.A.)을 사용하여 2분동안 염색하고, 증류수로 씻어준 다음 에오신 Y(Sigma, U.S.A.)을 사용하여 염색을 카운터 염색시켰다. 70%에서 100%까지 에탄올을 사용하여 탈수 시킨 후 마지막으로 섹션을 xylene으로 4분 동안 2번씩 투명화 시킨 후 2분 동안 건조 시킨 다음 mount용액으로 슬라이드를 고정시켰다.

실시예 6 : In situ hybridization

xylene과 에탄올을 이용한 투명화 및 탈수 과정을 거친 섹션에 DEPC-PBS용액으로 5분 처리한 후에, 표본을 프로테아제 K와 상온에서 5분동안 방치하였다. 10분 도안 4% 파라포름 알데하이드 용액으로 1시간 동안 처리한후 0.2N HCl 용액, 5분동안 DEPC-PBS 용액 및 10분 동안 0.1M TEA(triethanolamine)용액에 처리하였다. 0.1M TEA 용액과 0.25% 아세트산에 10분 동안 처리한 후 10분 동안 DEPC-PBS용액에 처리하였다. 용액을 가열 및 하이브리다이제이션 한 후에, 이들을 Digioxigenin-11-UTP 프로브로 표지된 특이적 DIG RNA Labeling Kit(Roche, Mannheim,Germany)용액으로 표지 혼합하였다.

상기 인사이투 하이브리다이제이션에 의한 실험 결과를 도4내에 도시하였다.

도4는 methacarn으로 고정된 파라핀 포매 조직에서 Type X collagen과 Type II collagen이 검출 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 개별적 및 포괄적인 조직 특이하게 발현되는 유전자라고 할지라도, methacarn 고정액을 이용하면, RNA를 손상되지 않게 고정한다는 것을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 기존 사용되는 고정액과, methanol이 유효성분으로 함유된 methacarn 고정액를 사용하여 파라핀 포매 조직 에서의 RNA 추출을 조사한 결과, methacarn 고정액만이 실온에서 손상 없이 RNA 추출이 가능함을 발견하였으며, 또한 조직 특이한 유전자의 발현과, 모든 세포에서 발현되는 유전자의 발현에서도 손상 없이 RNA가 보존되고 있는 것이 밝혀졌기 때문에, 실온에서도 RNA추출이 용이하며, methacarn 고정된 파라핀 포매 조직에서 Laser Capture Microdissection을 이용하는 방법을 통해 암 종양에 대한 분자 의학적인 접근 및 진단이 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 본 발명을 통해서 질환의 정확한 진단뿐만 아니라 시간 단축 효과까지 기대할 수 있으므로 결과적으로 비용 절감의 이득까지 얻을 수 있게 된다.

도1은 조직 표본제작 과정부터 Laser Capture Microdissection방법을 이용한 온전한 RNA추출 실험과정을 간략하게 나타내었다

도2는 냉동된 마우스 간 조직으로부터, 에탄올, 아이소프로판올, methacarn과 같이 여러 가지 고정액을 이용하여 파라핀 포매 조직에서 RNA을 추출한 그림을 나타내었다.

도3는 methacarn을 이용하여 고정한 파라핀 포매 조직과 methacarn으로 고정하지 않은 조직에서 RNA을 추출한 후 RT-PCR을 이용하여 분석한 사진이다.

도4는 파라핀 포매 조직에서의 RNA 보존 및 안정성을 확인하기 위하여 15일된 마우스 태아를 Laser Capture Microdissection을 이용하여 파라핀 포매 조직에서 얻은 세포에서 유전자 발현양상을 조직 특이하게 본 사진이다.

Claims

통상의 고정액 조성물에 있어서, 메탄올, 클로로포름, 아세틱엑시드을 유효성분으로 함유하는 조직 고정액 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 메탄올, 클로로포름, 아세틱엑시드을 의 비율이 60%: 30%:10%임을 특징으로 하는 조직 고정액 조성물.
제 1항에 있어서, 조직을 고정하기 위한 고정액으로서, 메탄올이 주요 성분임을 특징으로 하는 조직 고정액 조성물.
제 1항에 있어서, Methacarn으로 고정된 파라핀 블록에서 Laser Capture Microdissection을 사용하여 온전한 RNA를 추출하는 방법.