WO2013018886A1 - 膵臓癌の治療及び／又は予防用医薬組成物 - Google Patents

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佳孝 南田
文義 岡野
孝則 齋藤
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use of an antibody against CAPRIN-1 or a fragment thereof as a therapeutic and / or prophylactic agent for pancreatic cancer.
  • Cancer is a disease that occupies the top cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified antibodies that react specifically with cancer, cancer antigens that are recognized by cytotoxic T cells, genes that encode cancer antigens, There is an increasing expectation for a specific cancer therapy targeting cancer antigens (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 4 to 4 9
  • clinical studies of cell therapy using immune cells that specifically react with cancer antigens and cancer-specific immunotherapy such as vaccines containing cancer antigens are being conducted targeting a part of them.
  • Cytoplasmic- and propagation-associated protein 1 (CAPRIN-1) is expressed when quiescent normal cells are activated or undergo cell division, and also forms RNA and intracellular stress granules within the cell to transport mRNA. It was known as an intracellular protein known to be involved in the regulation of translation, but was found to be specifically expressed on the surface of cancer cells such as breast cancer cells. Research is progressing as a target for antibody drugs (Patent Document 2). However, Patent Document 2 does not confirm that CAPRIN-1 is expressed on pancreatic cancer cells, and there is no description or suggestion that CAPRIN-1 can be an antigen protein of pancreatic cancer.
  • An object of the present invention is to identify a cancer antigen protein that is specifically expressed on the surface of pancreatic cancer cells, and to provide use of an antibody targeting the same as a therapeutic and / or prophylactic agent for pancreatic cancer. .
  • CAPRIN- having an amino acid sequence represented by an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30, based on the obtained gene and its human, bovine, horse, mouse, chicken homologous gene 1, and a number of antibodies against them CAPRIN-1. And it discovered that a part of CAPRIN-1 protein was specifically expressed on the cell surface of those pancreatic cancer cells, and found that the antibody against CAPRIN-1 impairs pancreatic cancer cells expressing CAPRIN-1. The present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • the present invention comprises CAPRIN-1 protein, or a fragment thereof containing 7 to 12 or more consecutive amino acid residues, and an antibody or fragment thereof specifically immunologically reactive as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing pancreatic cancer is provided.
  • the CAPRIN-1 protein is an amino acid sequence represented by an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30, or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence, More preferably, the amino acid sequence has a sequence identity of 95% or more, and even more preferably 97 to 99% or more.
  • the antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a multispecific antibody.
  • the antibody has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, or SEQ ID NO: 269, or 80% or more, preferably 85% or more with the amino acid sequence. More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 97 to 99% or more of an amino acid sequence having an amino acid sequence, or an antibody having immunological reactivity with a fragment thereof. is there.
  • the antibody is any one of the following (a) to (y), an antibody having immunological reactivity with the CAPRIN-1 protein, or the antibody as an active ingredient:
  • a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of pancreatic cancer comprising: (A) An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the complementarity determining regions (CDRs) of SEQ ID NOs: 37, 38 and 39 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 41, 42 and 43. (B) An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 47, 48 and 49 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 51, 52 and 53.
  • CDRs complementarity determining regions
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 117, 118 and 119 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 121, 122 and 123.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 127, 128 and 129 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 121, 122 and 123.
  • K An antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDRs of SEQ ID NOs: 132, 133 and 134 and a light chain variable region comprising CDRs of SEQ ID NOs: 136, 137 and 138.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 171, 172 and 173.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 177, 178 and 179.
  • Q An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 182, 183 and 184.
  • S An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 192, 193 and 194.
  • T An antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDRs of SEQ ID NOs: 197, 198 and 199 and a light chain variable region comprising CDRs of SEQ ID NOs: 201, 202 and 203.
  • V An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 217, 218 and 219 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 221, 222 and 223.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention is conjugated with an antitumor agent.
  • the present invention further provides a combined pharmaceutical comprising the above-described pharmaceutical composition of the present invention and a pharmaceutical composition containing an antitumor agent.
  • the present invention further provides a method for treating and / or preventing pancreatic cancer, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition or the combined pharmaceutical of the present invention.
  • the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention damages pancreatic cancer cells. Therefore, antibodies against CAPRIN-1 are useful for the treatment and prevention of pancreatic cancer.
  • the antitumor activity of an antibody against the CAPRIN-1 protein used in the present invention is borne in vivo as described later. Evaluation by examining suppression of tumor growth in cancer animals, or by examining whether or not tumor cells expressing the polypeptide in vitro exhibit cytotoxic activity via immune cells or complement. can do.
  • nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the proteins consisting of the amino acid sequences of even sequence numbers (ie, SEQ ID NOs: 2, 4, 6,. It is shown by the odd number sequence number (namely, sequence number 1,3,5..27,29) among 29.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, and 14 in the sequence listing are shown as polypeptides that specifically bind to antibodies present in sera from cancer-bearing dogs, and shown in SEQ ID NOs: 2 and 4.
  • the amino acid sequence shown is the human homologous factor (homolog or ortholog)
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16 is the bovine homologous factor
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 is the horse homologous factor
  • the amino acid sequence shown by 20 to 28 is the mouse homologous factor
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 is the amino acid sequence of CAPRIN-1 isolated as the chicken homologous factor (Example 1 described later). reference).
  • CAPRIN-1 is known to be expressed when quiescent normal cells are activated or undergo cell division.
  • CAPRIN-1 protein is expressed on the cell surface of pancreatic cancer cells.
  • an antibody that binds to a portion of the CAPRIN-1 protein molecule that is expressed on the cell surface of pancreatic cancer cells is preferably used.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 271 or SEQ ID NO: 273 (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 273 is represented by SEQ ID NO: 274 or SEQ ID NO: 275).
  • a partial peptide in the CAPRIN-1 protein expressed on the cell surface of cancer cells No. 266 (for example, among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 266, the region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 267 or SEQ ID NO: 268 is preferred) or SEQ ID NO: 270 or SEQ ID NO: 272 or SEQ ID NO: 269 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, such as 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the antibody used in the present invention includes all antibodies that bind to these peptides and exhibit antitumor activity.
  • the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention may be any kind of antibody as long as it can exhibit antitumor activity, such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a recombinant antibody such as a synthetic antibody, multispecificity, etc.
  • examples include antibodies (eg, diabodies, triabodies, etc.), humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies (scFv), and the like, and human antibodies, antibody fragments thereof, such as Fab, F (ab ′) 2 , Fv, and the like. These antibodies and fragments thereof can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • an antibody capable of specifically binding to the CAPRIN-1 protein is desirable, and a monoclonal antibody is preferable, but a polyclonal antibody may be used as long as a homogeneous antibody can be stably produced. .
  • a test subject is a human, it is desirable that it is a human antibody or a humanized antibody in order to avoid or suppress rejection.
  • CAPRIN-1 protein specifically binds to CAPRIN-1 protein and does not substantially bind to other proteins.
  • the antitumor activity of the antibody that can be used in the present invention is determined by examining the suppression of tumor growth in a cancer-bearing animal in vivo, or against tumor cells that express the polypeptide in vitro. Thus, it can be evaluated by examining whether it shows cytotoxic activity via immune cells or complement.
  • the subject who is the target of treatment and / or prevention of pancreatic cancer in the present invention is a mammal such as a human, a pet animal, livestock, a sport animal, etc., and a preferred subject is a human.
  • the protein or fragment thereof used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody against CAPRIN-1 used in the present invention is used for the animal species from which it is derived, such as humans, dogs, cows, horses, mice, rats, and chickens. Not limited. However, it is preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, a protein derived from a mammal is preferable, and a protein derived from a human is particularly preferable. For example, when CAPRIN-1 is human CAPRIN-1, human CAPRIN-1 protein, a partial peptide thereof, cells expressing human CAPRIN-1 and the like can be used.
  • GenBank GenBank
  • FASTA Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.
  • the base sequence or amino acid sequence of these ORFs or mature portions is 70% to 100%, preferably 80% to 100%, more preferably 90% to 100%, even more preferably 95% to 100%, such as 97% to 100%, 98% to 100%, 99% to 100% or 99.100%.
  • a target is a nucleic acid or protein consisting of a sequence having 5% to 100% sequence identity.
  • “% sequence identity” refers to an amino acid (or an alignment) when two sequences are aligned (aligned) for maximum similarity or identity with or without gaps. The percentage (%) of the same amino acid (or base) with respect to the total number of bases.
  • the CAPRIN-1 protein fragment has a length less than the total length of the protein from the amino acid length of the epitope (antigenic determinant), which is the smallest unit recognized by the antibody.
  • An epitope refers to a polypeptide fragment having antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and its minimum unit consists of about 7 to 12 amino acid residues, for example, 8 to 11 amino acid residues.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, or SEQ ID NO: 269, or the amino acid sequence is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90 %, More preferably 95% or more, and still more preferably 97-99% or more amino acid sequences having sequence identity.
  • polypeptides including human CAPRIN-1 protein and partial peptides thereof are synthesized according to chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), for example.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • the polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is subjected to PCR using a pair of primers designed to amplify the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, using human chromosomal DNA or cDNA library as a template.
  • PCR reaction conditions can be appropriately set. For example, using a thermostable DNA polymerase (eg, Taq polymerase) and a Mg 2+ -containing PCR buffer, the reaction temperature is 94 ° C.
  • the reaction process consisting of 1 minute (annealing) and 2 minutes (elongation) at 72 ° C. is defined as one cycle.
  • the reaction may be performed at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles, but is not limited thereto.
  • the PCR method, conditions, etc. are described in, for example, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), J ing.
  • probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 30 in the sequence listing in this specification, and a human or other cDNA library is screened using the probes and primers. By doing so, the desired DNA can be isolated.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing a protein having an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30. Examples of such cells and tissues are cells or tissues derived from cancer or tumors such as testis, leukemia, breast cancer, lymphoma, brain tumor, lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli
  • examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS1, Chinese hamster ovary cells.
  • examples include, but are not limited to, mammalian cells such as CHO, human fetal kidney cell line HEK293, mouse fetal skin cell line NIH3T3, yeast cells such as budding yeast and fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • the expression vector When a prokaryotic cell is used as a host cell, the expression vector includes an origin, promoter, ribosome binding site, multicloning site, terminator, drug resistance gene, auxotrophic complementary gene, etc. that can be replicated in the prokaryotic cell. Is used. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • a prokaryotic host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is cultured, the polypeptide encoded by the DNA is prokaryotic. It can be expressed in a host cell. In this case, the polypeptide can also be expressed as a fusion protein with another protein.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. is used as the expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pYES2, and the like.
  • pIND / V5-His pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc.
  • a His tag for example, (His) 6- (His) 10
  • FLAG tag FLAG tag
  • myc tag The polypeptide can be expressed as a fusion protein to which various tags such as HA tag and GFP are added.
  • a well-known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection, virus infection, lipofection, binding to a cell membrane-permeable peptide, etc. can be used. .
  • the target polypeptide from the host cell can be performed by combining known separation operations. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, sonication, enzyme digestion, salting out and solvent fractional precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include, but are not limited to, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
  • An antibody is usually a heteromultimeric glycoprotein comprising at least two heavy chains and two light chains. Apart from IgM, it is an approximately 150 kDa heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Typically, each light chain is linked to the heavy chain by one disulfide covalent bond, but the number of disulfide bonds between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes varies. Each heavy and light chain also has intrachain disulfide bonds. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH region) followed by several constant regions. Each light chain has a variable domain (VL region) and one constant region at the opposite end.
  • VH region variable domain
  • VL region variable domain
  • the constant region of the light chain is aligned with the first constant region of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • the variable domain of an antibody confers binding specificity on the antibody by exhibiting specific variability, in which a specific region is called a complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the relatively conserved portion of the variable region is called the framework region (FR).
  • the complete heavy and light chain variable domains each contain 4 FRs linked by 3 CDRs.
  • the three CDRs are called CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the N-terminal in the heavy chain, and similarly called CDRL1, CDRL2, CDRL3 in the light chain.
  • CDRH3 is most important for the binding specificity of the antibody to the antigen.
  • the CDRs of each chain are held together in a state closer to the FR region, and contribute to the formation of an antigen binding site of the antibody together with the CDR from the other chain.
  • the constant region does not contribute directly to the binding of the antibody to the antigen, but is involved in various effector functions such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), phagocytosis through binding to Fc ⁇ receptors,
  • Figure 6 shows half-life / clearance rate through neonatal Fc receptor (FcRn), complement dependent cytotoxicity (CDC) through the C1q component of the complement cascade.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody in the present invention means an antibody having immunological reactivity with the full length of a CAPRIN-1 protein or a fragment thereof.
  • immunological reactivity means the property of binding between an antibody and a CAPRIN-1 antigen in vivo, and damages the tumor through such binding (eg, death, suppression or regression). Function. That is, the antibody used in the present invention is not limited as long as it can bind to the CAPRIN-1 protein and damage pancreatic cancer.
  • antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, synthetic antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, antibody fragments (eg, Fab, F (ab ′) 2 , Fv, etc.) Etc.
  • the antibodies can be of any class of immunoglobulin molecules, e.g. IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY, or any subclass, such as IgG 1, IgG 2, IgG 3 , IgG 4, IgA 1, IgA 2 , etc. It is.
  • the antibody may be further modified by acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, or PEGylation.
  • the antibody is a monoclonal antibody
  • CAPRIN-1 protein, pancreatic cancer cell expressing CAPRIN-1 or a cell line thereof eg, Capan-2, etc.
  • the spleen is extracted, the cells are separated, the cells are fused with mouse myeloma cells, and a clone that produces an antibody having a cancer cell growth inhibitory action is selected from the obtained fused cells (hybridoma).
  • It can be prepared by isolating a monoclonal antibody-producing hybridoma having cancer cell growth inhibitory action, culturing the hybridoma, and purifying the antibody from the culture supernatant by a general affinity purification method.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can also be produced, for example, as follows.
  • an animal is immunized with a sensitizing antigen according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • the mammal is dosed several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Can be mentioned.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-511) (Margulies.
  • the cell fusion between the immune cell and myeloma cell is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46. ) And the like.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preliminarily heated to about 37 ° C. is usually 30 to 60% (
  • the desired hybridoma is formed by adding at a concentration of w / v) and mixing.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened and single-cloned.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. Lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, for example, U266 (Registration No. TIB196) to obtain a hybridoma that produces a human antibody having a desired activity (for example, cell growth inhibitory activity).
  • a desired activity for example, cell growth inhibitory activity
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. And can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells (hybridomas) by a normal screening method.
  • a polyclonal antibody can be obtained, for example, as follows.
  • This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with CAPRIN-1 protein or synthetic peptide, or the like.
  • a rabbit polyclonal antibody against the CAPRIN-1 protein was produced, and the antitumor effect was confirmed.
  • human antibody-producing mice for example, KM mice (Kirin Pharma / Medarex) and Xeno mice (Amgen) are known (for example, International Publication WO02 / 43478, WO02 / 092812, etc.).
  • KM mice Korean Pharma / Medarex
  • Xeno mice Amgen
  • spleen cells can be removed from the immunized mouse and a human monoclonal antibody can be prepared by a fusion method with myeloma cells.
  • the antigen can be prepared according to, for example, a method using animal cells (Special Table 2007-530068), a method using baculovirus (eg, International Publication WO98 / 46777).
  • immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique (for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL, ANTIBODIES, Published in the United KingdomMIMILLAN PUBLISHERS 19).
  • a gene recombination technique for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL, ANTIBODIES, Published in the United KingdomMIMILLAN PUBLISHERS 19.
  • V region an antibody variable region
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention is preferably a monoclonal antibody. However, it may be a polyclonal antibody, a genetically modified antibody (such as a chimeric antibody or a humanized antibody) and the like.
  • Monoclonal antibodies include human monoclonal antibodies, non-human animal monoclonal antibodies (eg, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.). Monoclonal antibodies can be produced by culturing hybridomas obtained by fusion of spleen cells and myeloma cells from non-human mammals (eg, mice, human antibody-producing mice, etc.) immunized with CAPRIN-1 protein. In the examples described later, monoclonal antibodies were prepared, and the antitumor effect against pancreatic cancer was confirmed.
  • non-human animal monoclonal antibodies eg, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.
  • Monoclonal antibodies can be produced by culturing hybridomas obtained by fusion of spleen cells and myeloma cells from non-human mammals (eg, mice, human antibody-producing mice, etc.)
  • These monoclonal antibodies are SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 135, A heavy chain variable (VH) region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 240 or SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, S
  • a chimeric antibody is an antibody produced by combining sequences derived from different animals, such as a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and human antibody heavy chain, light chain constant region antibody, etc. .
  • a chimeric antibody can be prepared using a known method. For example, a DNA encoding an antibody V region and a DNA encoding a human antibody C region are ligated, incorporated into an expression vector, and introduced into a host. It is obtained by producing.
  • Polyclonal antibodies include antibodies obtained by immunizing human antibody-producing animals (eg, mice) with CAPRIN-1 protein.
  • a humanized antibody is a modified antibody also called a reshaped human antibody.
  • Humanized antibodies are constructed by transplanting CDRs of antibodies from immunized animals into the complementarity determining regions of human antibodies. The general gene recombination technique is also known.
  • oligos were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with a DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Publication WO96 / 02576). As the FR of a human antibody linked through CDR, a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected.
  • the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato K. et al., Cancer Research). 1993, 53: 851-856). Moreover, you may substitute by the framework region derived from various human antibodies (refer international publication WO99 / 51743).
  • a region in which the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato K. et al., Cancer). Research 1993, 53: 851-856).
  • variable region e.g, FR
  • constant region amino acids in the variable region or constant region may be substituted with other amino acids.
  • Amino acid substitution is, for example, less than 15, less than 10, less than 8, less than 7, less than 6, less than 5, less than 4, less than 3, less than 2, or less than 2 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 or 2 amino acids
  • the substituted antibody should be functionally equivalent to the unsubstituted antibody.
  • the substitution is preferably a conservative amino acid substitution, which is a substitution between amino acids with similar properties such as charge, side chain, polarity, aromaticity and the like.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), nonpolar It can be classified into sex amino acids (leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine), branched chain amino acids (leucine, valine, isoleucine), aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine).
  • basic amino acids arginine, lysine, histidine
  • acidic amino acids aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine
  • modified antibody examples include antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • “functionally equivalent” means that the target antibody has the same biological or biochemical activity as the antibody used in the present invention, specifically, a function of damaging a tumor, to humans. This refers to the fact that rejection is not essentially caused at the time of application. Examples of such activity include cell growth inhibitory activity or binding activity.
  • an antibody that recognizes the epitope of the CAPRIN-1 protein recognized by the anti-CAPRIN-1 antibody can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • the epitope of the CAPRIN-1 protein recognized by the anti-CAPRIN-1 antibody is determined by an ordinary method (eg, epitope mapping), and an antibody is produced using a polypeptide having the amino acid sequence contained in the epitope as an immunogen.
  • This method can be obtained by a method, a method of determining an epitope of an antibody prepared by a usual method, and selecting an antibody having the same epitope as the anti-CAPRIN-1 antibody.
  • epitope refers to a polypeptide fragment having antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and its minimum unit consists of about 7 to 12 amino acids, preferably 8 to 11 amino acids.
  • the affinity constant Ka (kon / koff) of the antibody used in the present invention is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M ⁇ 1 , at least 10 9 M ⁇ 1 , At least 5 ⁇ 10 9 M ⁇ 1 , at least 10 10 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 10 M ⁇ 1 , at least 10 11 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 11 M ⁇ 1 , at least 10 12 M ⁇ 1 , or alternatively At least 10 13 M ⁇ 1 .
  • the antibody used in the present invention can be conjugated with an antitumor agent.
  • the bond between the antibody and the antitumor agent is a group reactive with an amino group, carboxyl group, hydroxy group, thiol group, etc. (for example, succinate imidyl group, formyl group, 2-pyridyldithio group, maleimidyl group, alkoxycarbonyl group). , A hydroxy group, etc.).
  • antitumor agents include the following antitumor agents known in the literature, such as paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, busulfan, improsulfan, piperosulfan, benzodopa (benzodopa) ), Carbocone, methredopa, uredopa, uretopa, altreamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, trimethylolothramine , Camptothecin, bryostatin, calistatin ( allystatin), cryptophycin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterbin, panclastatin, sarcodictin, spongestatin, chlorambucil, chloronaphazine, cholophosphamide, estram Ifosfamide, mechlore
  • a higher therapeutic effect can be obtained by co-administering the antibody used in the present invention and an antitumor agent.
  • This technique can be applied to cancer patients expressing CAPRIN-1 either before or after surgery. In particular, after surgery, cancer recurrence and longer survival can be obtained for cancers expressing CAPRIN-1, which have been treated with an antitumor agent alone.
  • antitumor agents used for combined administration include the following antitumor agents known in the literature, such as paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, busulfan, improsulfan, Piposulfan, benzodopa, carbocon, metredopa, uredopa, altreamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoromelamine ), Bratacin, bratacinone, camptothecin, briosta , Calystatin, cryptophysin 1, cryptophysin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterobin, pancratistatin, sarcodictin, spongestatin, chlorambucil, chloronaphazine, cholophosphamide, cholophosphamide Estramustine, ifosfamide, mech
  • the antibodies used in the present invention include 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 Sm, 212 Bi, 32 P, 175 Lu, 176 Lu, etc., which are known in the literature. It is also possible to bind the radioisotopes. It is desirable that the radioisotope is effective for tumor treatment and diagnosis.
  • the antibody used in the present invention is an antibody having immunological reactivity with CAPRIN-1, or an antibody that specifically binds to CAPRIN-1, and has a cytotoxic activity against pancreatic cancer, or a tumor growth inhibitory action, It is an antibody which shows.
  • the antibody should be an antibody having a structure such that little or no rejection is avoided in the subject animal to which it is administered. Examples of such antibodies include human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies (eg, human-mouse chimeric antibodies), single chain antibodies, multispecific antibodies (eg, diabodies, triabodies, etc.) when the target animal is a human. ).
  • the heavy and light chain variable regions are derived from human antibodies, or the heavy and light chain variable regions are derived from non-human animal antibody complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 non-human animal antibody complementarity determining regions
  • a framework region derived from a human antibody, or the variable regions of the heavy and light chains are derived from a non-human animal antibody, and the constant regions of the heavy and light chains are human antibodies. It is a recombinant antibody that is derived from.
  • Preferred antibodies are the previous two antibodies.
  • DNA encoding a monoclonal antibody against human CAPRIN-1 eg, human monoclonal antibody, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.
  • DNA encoding the light chain variable region and heavy chain variable region of the antibody was prepared by RT-PCR method and the like, and Kabat EU numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Institute, 5th Ed. of Health, Bethesda, Md. (1991)) to determine the sequence or sequences of the CDR1, CDR2, CDR3 of the variable region of the light and heavy chains based on.
  • DNA encoding each of these variable regions or DNA encoding each CDR can be obtained using a gene recombination technique (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)) or a DNA synthesizer. Make it.
  • the human monoclonal antibody-producing hybridoma is prepared by immunizing a human antibody-producing animal (eg, mouse) with human CAPRIN-1, and then fusing spleen cells excised from the immunized animal with myeloma cells. Can do.
  • DNA encoding the variable region and constant region of the light chain or heavy chain derived from a human antibody is prepared as necessary using a gene recombination technique or a DNA synthesizer.
  • the CDR coding sequence in the DNA encoding the variable region of the light chain or heavy chain derived from the human antibody is derived from a non-human animal (for example, mouse, rat, chicken, etc.) corresponding thereto.
  • a humanized antibody is encoded by preparing a DNA in which the CDR coding sequence of the antibody is substituted and ligating the DNA obtained thereby with a DNA encoding a constant region of a light chain or heavy chain derived from a human antibody, respectively. DNA can be produced.
  • DNA encoding the light chain or heavy chain variable region of an antibody derived from a non-human animal is used, respectively.
  • a DNA encoding a chimeric antibody can be prepared by linking with a DNA encoding a region.
  • this antibody is an antibody in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linearly linked via a linker, DNA encoding the heavy chain variable region, DNA encoding the linker And a DNA encoding a light chain variable region can be combined to produce a DNA encoding a single chain antibody.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • the linker is composed of 12 to 19 amino acids, and includes, for example, 15 amino acids (G 4 S) 3 (G.-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432). .
  • this antibody is an antibody that can specifically bind to two different epitopes, such as DNA encoding heavy chain variable region A, light chain variable region B.
  • DNA, DNA encoding heavy chain variable region B, and DNA encoding light chain variable region A are joined in this order (however, DNA encoding light chain variable region B and DNA encoding heavy chain variable region B) Are linked via a DNA encoding a linker as described above), whereby a DNA encoding a bispecific antibody can be prepared.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • Recombinant DNA produced as described above is incorporated into one or more appropriate vectors, introduced into host cells (eg, mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.), and (co) expressed
  • host cells eg, mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.
  • a recombinant antibody can be prepared (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. SNT. W. Gododing., Monoclonal Antibodies: principals and practices., 1993 ACADEMI PRESS).
  • Examples of the antibody of the present invention produced by the above method include the following antibodies (a) to (y).
  • CDRs complementarity determining regions
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 77, 78 and 79 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 81, 82 and 83 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 80 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 84).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 87, 88 and 89 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 91, 92 and 93 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 90 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 94).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 97, 98 and 99 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 101, 102 and 103 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 100 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 104).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 117, 118 and 119 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 121, 122 and 123 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 120 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 124).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 127, 128 and 129 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 121, 122 and 123 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 130 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 124).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 157, 158 and 159 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 161, 162 and 163 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 160 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 164).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 171, 172 and 173 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 174).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 177, 178 and 179 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 180).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 167, 168 and 169 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 182, 183 and 184 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 185).
  • T an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 197, 198 and 199 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 201, 202 and 203 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 200 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 204).
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 207, 208 and 209 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 211, 212 and 213 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 210 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 214).
  • V an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 217, 218 and 219 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 221, 222 and 223 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 220 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 224).
  • (X) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 237, 238 and 239 and a light chain variable region comprising the CDRs of SEQ ID NOs: 241, 242, and 243 (eg, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 240 and An antibody comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 244).
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, SEQ ID NOs: 47, 48 and 49, SEQ ID NOs: 57, 58 and 59 are CDR1, CDR2 and CDR3 of chicken antibody heavy chain variable region.
  • amino acid sequences shown in Nos. 41, 42 and 43, SEQ ID Nos. 51, 52 and 53 and SEQ ID Nos. 61, 62 and 63 are the CDR1, CDR2 and CDR3 of the chicken antibody light chain variable region, respectively.
  • the humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody or multispecific antibody used in the present invention is, for example, the following antibody (exemplified by antibody (a)).
  • the variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 37, 38 and 39 and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody
  • the variable region of the light chain is the amino acid of SEQ ID NOs: 41, 42 and 43
  • An antibody comprising a sequence and an amino acid sequence of a framework region derived from a human antibody.
  • variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 37, 38 and 39 and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody
  • constant region of the heavy chain comprises the amino acid sequence derived from a human antibody
  • light chain variable region comprises the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42 and 43 and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody
  • the light chain constant region comprises the amino acid sequence derived from a human antibody. antibody.
  • variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40
  • constant region of the heavy chain comprises the amino acid sequence derived from a human antibody
  • variable region of the light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44
  • An antibody comprising a light chain constant region comprising an amino acid sequence derived from a human antibody.
  • the constant regions and variable region sequences of human antibody heavy and light chains are available, for example, from NCBI (US: GenBank, UniGene, etc.).
  • NCBI GenBank, UniGene, etc.
  • human IgG 1 heavy chain constant region registration number J00228, human registration for IgG 2 heavy chain constant region numbers J00230, registration for the human IgG 3 heavy chain constant region number X03604, registration for the human IgG 4 heavy chain constant region number K01316, registration for the human light chain ⁇ constant region numbers V00557
  • the above antibody preferably has cytotoxic activity, and can thereby exert an antitumor effect.
  • a hybridoma capable of producing another human antibody or non-human animal antibody (eg, mouse antibody) against human CAPRIN-1 is prepared, and the monoclonal antibody produced by the hybridoma is recovered, and immunological binding to human CAPRIN-1 and It is determined whether or not the antibody is the target antibody using the cytotoxic activity as an index. After identifying the target monoclonal antibody-producing hybridoma, DNAs encoding the variable regions of the heavy and light chains of the target antibody were prepared from the hybridoma and sequenced as described above. Use for production.
  • the antibody used in the present invention has the specificity of specifically recognizing CAPRIN-1, particularly the framework region sequence and / or the constant region of each antibody of (i) to (iii) above.
  • this sequence 1 or several (preferably 1 or 2) amino acid substitutions, deletions or additions may be present.
  • the anti-tumor effect on CAPRIN-1-expressing pancreatic cancer cells by the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention is considered to occur by the following mechanism.
  • ADCC Effector cell antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the activity of the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention is evaluated by the above-mentioned ADCC activity or CDC activity against pancreatic cancer cells expressing CAPRIN-1 in vitro, as specifically shown in the Examples below. It can be evaluated by measuring.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention binds to the CAPRIN-1 protein on pancreatic cancer cells and exhibits an antitumor action due to the above activity, and thus is considered useful for the treatment or prevention of pancreatic cancer. . That is, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing pancreatic cancer comprising an anti-CAPRIN-1 antibody as an active ingredient.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody treatment), it is preferable to use a human antibody or a humanized antibody in order to reduce immunogenicity.
  • the binding constant (affinity constant) Ka is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M ⁇ 1.
  • ⁇ Binding to antigen-expressing cells The ability of an antibody to bind to CAPRIN-1 can be identified using binding assays such as those described in the Examples using, for example, ELISA, Western blotting, immunofluorescence and flow cytometry analysis.
  • Antibodies that recognize CAPRIN-1 are inoculated with tissue obtained from patients during surgery or cell lines expressing CAPRIN-1 naturally or after transfection by immunohistochemistry in a manner well known to those skilled in the art
  • tissue obtained from animals bearing selected xenografts using paraformaldehyde or acetone-fixed frozen sections or paraformaldehyde-fixed tissue sections Can do.
  • an antibody reactive to CAPRIN-1 can be stained by various methods. For example, it can be visualized by reacting horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody or goat anti-rabbit antibody.
  • pancreatic cancer a pancreatic cancer (cell) that expresses the CAPRIN-1 gene.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • pancreatic cancer As pancreatic cancer to be used in the present invention, an amino acid sequence having an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30 or a gene encoding a polypeptide containing a partial sequence consisting of 7 to 12 or more consecutive amino acids is expressed. Is pancreatic cancer.
  • pancreatic cancer examples include pancreatic ductal cancer (Pancreatic ductal carcinoma), invasive pancreatic ductal cancer (Invasive pancreatic ductal carcinoma), pancreatic cancer adenocarcinoma (Adenocarcinoma), acinar cell carcinoma (Acarinoma) Adenosquamous Carcinoma, Giant cell tumor, Intraductal papillary mucinous tumor (IPMN), Mucinous cystoblastoma (Mucinocystomacinoblastoma) Serous cystadenocarcinoma (Serous cy tadenocarcinoma), solid papillary carcinoma (SPT), gastrinoma (Gastrinomas (Zollinger-Elison syndrome)), glucagonoma (Glucagonoma), intrauloma (Insulinoma) 1 (MEN1) (Wermer syndrome)), non-functional island cell tumor (Tumor), somatostatinomas, and VIP-
  • the target animals are mammals, for example, mammals including primates, pet animals, domestic animals, sport animals and the like, and humans, dogs and cats are particularly preferable.
  • the antibody used in the present invention when used as a pharmaceutical composition, it can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
  • a pharmaceutical preparation by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-60 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • Administration is oral or parenteral, preferably parenteral administration. Specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. As an example of the injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age, weight, sex, symptoms, etc. of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, sex, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Pancreatic cancer can be treated and / or prevented by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • a method for treating and / or preventing pancreatic cancer comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject in combination with the antitumor agent or the pharmaceutical composition containing the antitumor agent as exemplified above.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention and the antitumor agent can be administered to a subject simultaneously or separately.
  • any pharmaceutical composition may be earlier or later, and the administration interval, dosage, administration route and frequency of administration can be appropriately selected by a specialist.
  • Another pharmaceutical dosage form to be administered at the same time includes, for example, a pharmaceutical composition obtained by mixing the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent in a pharmacologically acceptable carrier (or medium) and formulating it. Shall be included. Further, for any of the above pharmaceutical compositions and dosage forms containing an antitumor agent, the formulation, formulation, administration route, dose, cancer, etc. for the pharmaceutical composition and dosage form containing the antibody of the present invention The explanation can be applied. Therefore, the present invention relates to a combination pharmaceutical (“pharmaceutical kit”) for treating and / or preventing pancreatic cancer comprising the pharmaceutical composition of the present invention and a pharmaceutical composition comprising an antitumor agent as exemplified above. (Also called).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing pancreatic cancer comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent together with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the antitumor agent may be conjugated to the antibody of the present invention or a fragment thereof. Similar to the above, the conjugate can be mixed with a pharmacologically acceptable carrier (or medium) to prepare a pharmaceutical composition.
  • Example 1 Identification of pancreatic cancer antigen protein by SEREX method (1) Preparation of cDNA library Total RNA was extracted from testicular tissue of a healthy dog by acid guanidinium-phenol-chloroform method (Acid guanidinium-phenol-chloroform method) PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.
  • a dog testis cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 7.73 ⁇ 10 5 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. Specifically, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-Blue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, a buffer of 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5 M NaCl was added to the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E.
  • coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthcare Bio-Science) to immobilize the protein derived from E. coli / phage.
  • Serum dog serum was passed through and reacted with this protein-immobilized column, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • phagemid host Escherichia coli prepared to have an absorbance OD600 of 1.0 and 10 ⁇ l of purified phage solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml).
  • the purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer shown in SEQ ID NO: 31 and the T7 primer shown in SEQ ID NO: 32.
  • the gene sequences described in SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, and 13 were obtained by this sequence analysis.
  • the homology search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • sequence identity of this gene with the gene encoding the human homologous factor was 94% for the nucleotide sequence and 98% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequences of human homologous factors are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, and the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4.
  • the sequence identity of the obtained canine gene with the gene encoding the bovine homologous factor was 94% for the nucleotide sequence and 97% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequence of the bovine homologous factor is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the bovine homologous factor was 94% in the base sequence and 93-97% in the amino acid sequence in the region translated into the protein. Further, the sequence identity of the obtained canine gene with the gene encoding the equine homologous factor was 93% nucleotide sequence and 97% amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequence of the equine homologous factor is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the equine homologous factor was 93% nucleotide sequence and 96% amino acid sequence in the region translated into protein.
  • sequence identity of the obtained canine gene with the gene encoding the mouse homologous factor was 87 to 89% of the base sequence and 95 to 97% of the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the nucleotide sequence of the mouse homologous factor is shown in SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28.
  • the sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the mouse homologous factor was 89-91% of the base sequence and 95-96% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the sequence identity of the acquired canine gene with the gene encoding the chicken homologous factor was 82% for the nucleotide sequence and 87% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the nucleotide sequence of the chicken homologous factor is shown in SEQ ID NO: 29, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 30.
  • the sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the chicken homologous factor was 81 to 82% of the base sequence and 86% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the PCR reaction was performed as follows using the obtained gene-specific primers (described in SEQ ID NOs: 33 and 34). That is, 0.25 ⁇ l of the sample prepared by the reverse transcription reaction, 2 ⁇ M each of the above primers, 0.2 mM of each dNTP, 0.65 U of ExTaq polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), and each reagent and attached buffer were added to make a total volume of 25 ⁇ l. The cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times using a Thermal Cycler (manufactured by BIO RAD).
  • a Thermal Cycler manufactured by BIO RAD
  • the gene-specific primer was used to amplify a region of nucleotides 698 to 1124 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (human CAPRIN-1 gene).
  • GAPDH specific primers (described in SEQ ID NOs: 35 and 36) were also used. As a result, expression was confirmed in all human pancreatic cancer cell lines.
  • Example 2 Preparation of polyclonal antibody against human CAPRIN-1 1 mg of human CAPRIN-1 recombinant protein prepared according to Example 3 of WO2010 / 016526 was mixed with an equal volume of incomplete Freund's adjuvant (IFA) solution. Rabbits were administered subcutaneously 4 times every 2 weeks. Thereafter, blood was collected to obtain an antiserum containing a polyclonal antibody. Further, this antiserum was purified using a protein G carrier (GE Healthcare Bioscience) to obtain a polyclonal antibody against CAPRIN-1. Further, a serum obtained by purifying rabbit serum not administered with an antigen in the same manner as described above using a protein G carrier was used as a control antibody.
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • Example 3 Expression analysis of CAPRIN-1 protein in human pancreatic cancer (1) Expression analysis of CAPRIN-1 protein on human pancreatic cancer cells Human pancreatic cancer cell line 4 in which the expression of the CAPRIN-1 gene was confirmed Species (Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1, BxPC-3) were examined for the expression of CAPRIN-1 protein on their cell surfaces. 10 6 cells of each human pancreatic cancer cell line in which gene expression was observed above were centrifuged in a 1.5 ml microcentrifuge tube.
  • Example 2 To this was added 2 ⁇ g (5 ⁇ l) of a polyclonal antibody against CAPRIN-1 derived in Example 2, and the suspension was further suspended in PBS containing 95 ⁇ l of 0.1% fetal calf serum and allowed to stand on ice for 1 hour. After washing with PBS, the suspension was suspended in PBS containing 5 ⁇ l of FITC-labeled goat anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Santa Cruz) and 95 ⁇ l of 0.1% fetal bovine serum (FBS) and allowed to stand on ice for 1 hour. After washing with PBS, the fluorescence intensity was measured with a FACS caliber from Becton Dickinson.
  • FITC-labeled goat anti-rabbit IgG antibody manufactured by Santa Cruz
  • FBS fetal bovine serum
  • the same operation as described above was performed using the control antibody prepared in Example 2 instead of the polyclonal antibody against CAPRIN-1, and used as a control.
  • all the pancreatic cancer cells to which the anti-human CAPRIN-1 polyclonal antibody was added had a fluorescence intensity of 20% or higher compared to the control. From this, it was confirmed that the CAPRIN-1 protein was expressed on the cell membrane surface of the human pancreatic cancer cell line.
  • the enhancement rate of the fluorescence intensity is represented by the increase rate of the average fluorescence intensity (MFI value) in each cell, and was calculated by the following calculation formula.
  • Average fluorescence intensity increase rate (fluorescence intensity enhancement rate) (%) ((MFI value of cells reacted with anti-human CAPRIN-1 antibody) ⁇ (control MFI value)) ⁇ (control MFI value) ⁇ 100
  • Example 2 Place the polyclonal antibody prepared in Example 2 against CAPRIN-1 derived in PBS-T solution containing 5% FBS to 10 ⁇ g / ml, and let stand in a moist chamber at 4 ° C. overnight. After washing 3 times for 10 minutes, an appropriate amount of Peroxidase Labeled Polymer Conjugated (manufactured by DAKO) was dropped and allowed to stand at room temperature for 30 minutes in a moist chamber. After washing with PBS-T 3 times for 10 minutes, add DAB coloring solution (manufactured by DAKO), let stand at room temperature for about 10 minutes, discard the coloring solution, and wash with PBS-T for 3 minutes for 10 minutes.
  • DAB coloring solution manufactured by DAKO
  • Example 4 Anti-tumor effect of a polyclonal antibody against CAPRIN-1 on pancreatic cancer cells (ADCC activity) We examined whether antibodies against CAPRIN-1 can damage pancreatic cancer cells expressing CAPRIN-1. Evaluation was performed using the polyclonal antibody against human CAPRIN-1 obtained in Example 2. Collect caprin-1 expression is confirmed by being human pancreatic cancer cells Capan-2 and MIAPaCa-2 a centrifuge tube for each 10 6 50ml volumes and incubated for 2 hours at 37 ° C. was added chromium 51 100 .mu.Ci.
  • the plate was washed 3 times with RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, and 10 3 pieces were added per well of a 96-well V-bottom plate.
  • 1 ⁇ g each of the polyclonal antibody against human CAPRIN-1 was added, and 2 ⁇ 10 5 lymphocytes separated from human peripheral blood were added, respectively, at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cytotoxic activity was determined by mixing 10 3 tumor cells incorporating the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention, lymphocytes, and chromium 51, and culturing for 4 hours, followed by culture medium. This is the result of measuring the amount of chromium 51 released to the cell and showing the cytotoxic activity against tumor cells calculated by the following calculation formula * .
  • Cytotoxic activity (%) chromium 51 release from tumor cells upon addition of antibody against CAPRIN-1 and lymphocytes ⁇ chrome 51 release from tumor cells added with 1N hydrochloric acid ⁇ 100
  • Example 5 Preparation of mouse and chicken monoclonal antibody against CAPRIN-1 100 ⁇ g of the human CAPRIN-1 recombinant protein prepared in Example 2 was mixed with an equal amount of MPL + TDM adjuvant (manufactured by Sigma), and this was used for one mouse. The antigen solution was a hit. After the antigen solution was administered intraperitoneally to 6-week-old Balb / c mice (Japan SLC), immunization was completed by further 3 and 24 administrations per week.
  • MPL + TDM adjuvant manufactured by Sigma
  • the obtained spleen cells and mouse myeloma cells SP2 / 0 purchased from ATCC were mixed at a ratio of 10: 1, and 200 ⁇ l of RPMI 1640 medium containing 10% FBS heated to 37 ° C. and PEG 1500 (Boehringer) PEG solution prepared by mixing 800 ⁇ l was added and allowed to stand for 5 minutes for cell fusion.
  • the cells were suspended in 150 ml of RPMI 1640 medium (HAT selective medium) containing 15% FBS to which 2% equivalent of Gibco's HAT solution was added. 100 ⁇ l per well of (made) was seeded on 15 plates. By culturing under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 days, a hybridoma in which spleen cells and myeloma cells were fused was obtained.
  • RPMI 1640 medium HAT selective medium
  • FBS Gibco's HAT solution
  • Hybridomas were selected using as an index the binding affinity of the antibody produced by the prepared hybridomas to the CAPRIN-1 protein.
  • 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml of the CAPRIN-1 protein solution prepared in Example 2 was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. Each well was washed 3 times with PBS-T, and then added with 400 ⁇ l of 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA) solution (manufactured by Sigma) per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • hybridomas were added to the plate so that the number was 0.5 per well of the 96-well plate and cultured. One week later, hybridomas forming a single colony in the well were observed. The cells in these wells were further cultured, and hybridomas were selected using the binding affinity of the antibody produced by the cloned hybridomas to the CAPRIN-1 protein as an index. 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml of the CAPRIN-1 protein solution prepared in Example 2 was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. After washing each well 3 times with PBS-T, 400 ⁇ l of 0.5% BSA solution was added per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • mouse monoclonal antibodies those showing reactivity on the cell surface of cancer cells expressing CAPRIN-1 were selected.
  • 10 6 human breast cancer cell lines MDA-MB-231V were centrifuged in a 1.5 ml microcentrifuge tube, and 100 ⁇ l of the culture supernatant of each hybridoma was added thereto, and 1 1 on ice. Let stand for hours. After washing with PBS, FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Invitrogen) diluted 500-fold with PBS containing 0.1% FBS was added and allowed to stand on ice for 1 hour.
  • mice After washing with PBS, the fluorescence intensity was measured with a FACS caliber from Becton Dickinson.
  • the same operation as described above was performed using a serum of 6-week-old Balb / c mice that had not been treated in place of the antibody diluted 500-fold with a medium for hybridoma culture, and used as a control.
  • 22 mouse monoclonal antibodies (mouse monoclonal antibodies # 1 to # 22) having a higher fluorescence intensity than the control, that is, reacting with the cell surface of breast cancer cells were selected.
  • the obtained spleen cells were mixed with chicken myeloma cells lacking the light chain established by transformation from chickens using avian reticuloendotheliosis virus at a ratio of 5: 1.
  • a PEG solution prepared by mixing 200 ⁇ l of IMDM medium containing 10% FBS heated to 0 ° C. and 800 ⁇ l of PEG 1500 (manufactured by Boehringer) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes for cell fusion. After centrifuging at 1700 rpm for 5 minutes and removing the supernatant, the cells were suspended in 300 ml of IMDM medium (HAT selective medium) containing 10% FBS to which 2% equivalent of Gibco's HAT solution was added.
  • IMDM medium HAT selective medium
  • Hybridomas were selected using as an index the binding affinity of the antibody produced by the prepared hybridomas to the CAPRIN-1 protein.
  • 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml of the CAPRIN-1 protein solution prepared in Example 2 was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. Each well was washed 3 times with PBS-T, and then added with 400 ⁇ l of 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA) solution (manufactured by Sigma) per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • hybridomas were added to the plate so that the number was 0.5 per well of the 96-well plate and cultured. One week later, hybridomas forming a single colony in the well were observed. The cells in these wells were further cultured, and hybridomas were selected using the binding affinity of the antibody produced by the cloned hybridomas to the CAPRIN-1 protein as an index. 100 ⁇ l of human CAPRIN-1 protein solution (1 ⁇ g / ml) was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. After washing each well 3 times with PBS-T, 400 ⁇ l of 0.5% BSA solution was added per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • Example 6 Characterization of selected antibodies (1) Cloning of variable region genes of anti-CAPRIN-1 monoclonal antibody Each of the 22 mouse monoclonal antibodies and 3 chicken monoclonal antibodies selected in Example 5 MRNA is extracted from the hybridoma strain, and a primer specific for the mouse FR1-derived sequence and the mouse FR4-derived sequence is used for the hybridoma producing the mouse monoclonal antibody, and the chicken FR1-derived sequence is used for the hybridoma producing the chicken monoclonal antibody.
  • heavy chain variable (VH) region and light chain variable (VL) region genes of all anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies were obtained by RT-PCR using primers specific for the sequence derived from chicken FR4. The genes were cloned into pCR2.1 vector (Invitrogen) for sequencing.
  • mRNA was prepared using mRNA micro purification kit (manufactured by GE Healthcare), and obtained using SuperScript II 1st strand synthesis kit (manufactured by Invitrogen). MRNA was reverse transcribed to synthesize cDNA. These operations were performed according to the protocol attached to each kit. Antibody genes were amplified by PCR using the obtained cDNA. For obtaining the VH region gene, a primer specific for the mouse heavy chain FR1 sequence (SEQ ID NO: 257) and a primer specific for the mouse heavy chain FR4 sequence (SEQ ID NO: 258) were used.
  • a primer specific for the mouse light chain FR1 sequence (SEQ ID NO: 259) and a primer specific for the mouse light chain FR4 (SEQ ID NO: 260) were used to obtain the gene for the VL region.
  • SEQ ID NO: 259 a primer specific for the mouse light chain FR1 sequence
  • SEQ ID NO: 260 a primer specific for the mouse light chain FR4
  • a cDNA sample was added to 5 ⁇ l of 10 ⁇ EX Taq Buffer, 4 ⁇ l of dNTP Mixture (2.5 mM), 2 ⁇ l of each primer (1.0 ⁇ M) and 0.25 ⁇ l of Ex Taq (5 U / ⁇ l), and the total amount was made 50 ⁇ l with sterilized water. After treatment at 94 ° C. for 2 minutes, denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 58 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 1 minute were performed under 30 cycles.
  • PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara) was used. CDNA was synthesized. These operations were performed according to the protocol attached to each kit. Using the synthesized cDNA as a template, chicken antibody heavy chain gene variable region and chicken antibody light chain gene variable region were each amplified by PCR using KOD-Plus-DNA Polymerase (manufactured by TOYOBO) according to a conventional method. For obtaining the gene of the VH region of the chicken antibody, a primer specific for the chicken heavy chain FR1 sequence and a primer specific for the chicken heavy chain FR4 sequence were used. In addition, a primer specific for the chicken light chain FR1 sequence and a primer specific for the chicken light chain FR4 were used to obtain the gene for the VL region.
  • these monoclonal antibodies have SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 45), SEQ ID NO: 50 (SEQ ID NO: 55), SEQ ID NO: 60 (SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 70 (SEQ ID NO: 75), SEQ ID NO: 80 (SEQ ID NO: 85), SEQ ID NO: 90 (SEQ ID NO: 95), SEQ ID NO: 100 (SEQ ID NO: 105), SEQ ID NO: 110 (SEQ ID NO: 115), SEQ ID NO: 120 (SEQ ID NO: 125), SEQ ID NO: 130 (SEQ ID NO: 131), SEQ ID NO: 135 (SEQ ID NO: 140), SEQ ID NO: 145 (SEQ ID NO: 150), SEQ ID NO: 160 (SEQ ID NO: 165), SEQ ID NO: 170 (SEQ ID NO: 175), SEQ ID NO: 200 (SEQ ID NO: 205), SEQ ID NO: 210 (SEQ ID NO: 215) ), SEQ ID NO: 220 (SEQ
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the obtained monoclonal antibody is represented by SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 240 and SEQ ID NO: 250 include the light chain variable region
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, shown in SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 244 and SEQ ID NO: 254.
  • mouse monoclonal antibody # 1 includes a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 70 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 74
  • # 2 includes a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 80 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 84
  • # 3 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 90 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 94
  • # 4 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 100 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 104
  • # 5 represents the sequence
  • # 6 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 120 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 124
  • # 7 is the heavy chain variable of SEQ ID NO: 130.
  • a chain variable region and a light chain variable region of SEQ ID NO: 124, # 8 includes a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 135 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 139, and # 9 includes a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 145 Comprising the light chain variable region of SEQ ID NO: 149 , # 10 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 145 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 155, # 11 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 160 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 164, and # 12
  • the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 174, # 13 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 180, and # 14 of SEQ ID NO: 170 # 15 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 170 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 190
  • the light chain variable region of , # 19 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 220 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 224
  • # 20 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 230 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 234, and # 21
  • the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 240 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 244 are included
  • # 22 includes the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 250 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 254.
  • amino acid sequence of the heavy chain variable region of the obtained chicken monoclonal antibody is shown in SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, and the amino acid sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64.
  • chicken monoclonal antibody # 1 comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 40 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 44, of which CDR1-3 in the heavy chain variable region are SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, Consisting of the amino acid sequence of No.
  • CDRs 1 to 3 in the light chain variable region each consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and chicken monoclonal antibody # 2 is the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 50
  • the light chain variable region of SEQ ID NO: 54 wherein CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, and SEQ ID NO: 49, respectively.
  • SEQ ID NO: 51 consists of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, respectively
  • chicken monoclonal antibody # 3 is SEQ ID NO: 60 heavy chain variable regions and a light chain variable region of SEQ ID NO: 64, wherein CDRs 1 to 3 in the heavy chain variable region consist of amino acid sequences of SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, respectively, CDRs 1 to 3 in the variable region consist of amino acid sequences of SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, and SEQ ID NO: 63, respectively.
  • both ends of the gene amplified fragment of the light chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 shown in SEQ ID NO: 44 were treated with restriction enzymes and purified to obtain a chicken antibody-derived leader sequence containing SEQ ID NO: 263 and SEQ ID NO: 265.
  • L chain constant region of human IgG 1 containing already inserted in a conventional manner into already inserted pcDNA3.1 / myc-His (Invitrogen Corporation) vector.
  • the recombinant vector was introduced into CHO-K1 cells (obtained from Riken Cell Bank). Specifically, 2 ⁇ 10 5 CHO-K1 cells cultured in Ham's F12 medium (manufactured by Invitrogen) containing 1 ml of 10% FBS per well of a 12-well culture plate were added with PBS ( ⁇ ).
  • the CHO-K1 cell introduced with the above recombinant vector was seeded at 0.5 per well of the well plate, and human-chicken chimera antibody # 1 having the variable region of chicken monoclonal antibody # 1 (# A cell line stably producing 1) was prepared.
  • cell lines that stably produce human-chicken chimeric antibody # 2 (# 2) and human-chicken chimeric antibody # 3 (# 3) for chicken monoclonal antibodies # 2 and # 3 were prepared. did.
  • the prepared cell line is cultured for 5 days in 30 ml of OptiCHO medium (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / ml in a 150 cm 2 flask and containing no serum, and contains # 1, # 2 or # 3 A supernatant was obtained.
  • OptiCHO medium manufactured by Invitrogen
  • both ends of the gene amplified fragment of the heavy chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 represented by SEQ ID NO: 40 were treated with restriction enzyme and purified, and the chicken antibody-derived leader sequence and mouse IgG 1 heavy chain constant region were purified.
  • the prepared cell line was cultured for 5 days in 30 ml of OptiCHO medium (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / ml in a 150 cm 2 flask and containing no serum, mouse-chicken chimeric antibody # 1, mouse-chicken A culture supernatant containing chimeric antibody # 2 and mouse-chicken chimeric antibody # 3 was obtained.
  • OptiCHO medium manufactured by Invitrogen
  • mice monoclonal antibody against CAPRIN-1 of # 1 to # 22 and the mouse-chicken chimera antibody # 1 against CAPRIN-1 prepared in the above (2), which reacts with the cancer cell surface prepared in Example 4, and mouse- Culture supernatant (100 ⁇ l) containing chicken chimera antibody # 2 and mouse-chicken chimera antibody # 3 was added and allowed to stand on ice for 1 hour. After washing with PBS, the suspension was suspended in FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Invitrogen) diluted 500-fold with PBS containing 0.1% FBS, and allowed to stand on ice for 1 hour.
  • the fluorescence intensity was measured with a FACS caliber from Becton Dickinson.
  • the same operation as described above was performed on the culture containing mouse monoclonal antibody against CAPRIN-1 of # 1 to # 22, mouse-chicken chimera antibody # 1, mouse-chicken chimera antibody # 2, and mouse-chicken chimera antibody # 3.
  • An isotype control antibody was used instead of Sei, and used as a control.
  • the cells to which the monoclonal antibodies # 1 to # 22, mouse-chicken chimera antibody # 1, mouse-chicken chimera antibody # 2 and mouse-chicken chimera antibody # 3 were added were all fluorescent compared to the control. The strength was 20% or more.
  • ADCC activity Antitumor effect of antibodies against CAPRIN-1 on human pancreatic cancer cells (ADCC activity)
  • cytotoxic activity (ADCC activity) against human pancreatic cancer cells was evaluated using human-chicken chimeric antibody # 1.
  • the culture supernatant containing human-chicken chimera antibody # 1 obtained in (2) above was purified using Hitrap Protein A Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare), replaced with PBS (-), and a 0.22 ⁇ m filter ( The product filtered through Millipore was used as an antibody for activity measurement.
  • antibodies in which human peripheral blood mononuclear cells are labeled with a FITC fluorescent dye (anti-human CD3 antibody, anti-human CD20 antibody, anti-human CD19 antibody, anti-human CD11c antibody, anti-HLA-DR antibody (Becton & Dickinson) ), And using a cell sorter (FACS Vantage SE (Becton & Dickinson)), a cell population containing NK cells that do not stain with the above antibody, or a human NK cell isolation kit (NK cell isolation kit) (Milteny Co., Ltd.)) was obtained. 2 ⁇ 10 5 cells containing the obtained NK cells were added per well, and cultured for 4 hours under conditions of 37 ° C., 5%, CO 2 .
  • a FITC fluorescent dye anti-human CD3 antibody, anti-human CD20 antibody, anti-human CD19 antibody, anti-human CD11c antibody, anti-HLA-DR antibody (Becton & Dickinson)
  • FACS Vantage SE Bect
  • the amount of chromium 51 in the culture supernatant released from the damaged tumor cells was measured, and the ADCC activity against pancreatic cancer cells by the anti-CAPRIN-1 antibody was calculated.
  • the monoclonal antibody that reacts with the CAPRIN-1 protein itself but does not react with the cell surface of cancer cells and the cytotoxic activity when no antibody was added was less than 5%.
  • the human-chicken chimeric antibody # 1 obtained 32% cytotoxic activity.
  • the monoclonal antibody that reacts with the CAPRIN-1 protein itself but does not react with the cell surface of cancer cells and the cytotoxic activity when no antibody was added was less than 5%.
  • the human-chicken chimeric antibody # 1 obtained a cytotoxic activity of 20% or more.
  • mouse monoclonal antibodies against humans # 1 to # 22 CAPRIN-1, human-chicken chimera antibody # 2 and human-chicken chimera antibody # 3 have cytotoxic activity against MIAPaCa-2 and Capan-2.
  • the monoclonal antibody that reacts with the CAPRIN-1 protein itself but does not react with the cell surface of the cancer cells and the cytotoxic activity when no antibody was added were less than 5% in all pancreatic cancer cells. On the other hand, cytotoxic activity of 10% or more was observed.
  • the obtained anti-CAPRIN-1 monoclonal antibody damages cancer cells expressing CAPRIN-1 by ADCC activity.
  • the cytotoxic activity is obtained by mixing the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention, a cell population containing human NK cells, and 2 ⁇ 10 3 tumor cells into which chromium 51 has been incorporated. This is a result of measuring the amount of chromium 51 that has been cultured for a period of time and released into the culture medium after culturing, and showed cytotoxic activity against tumor cells calculated by the following calculation formula * .
  • Cytotoxic activity (%) Amount of chromium 51 released from tumor cells when adding a cell population containing an antibody against CAPRIN-1 and human NK cells ⁇ Amount of chromium 51 released from tumor cells added with 1N hydrochloric acid ⁇ 100
  • Example 7 Antitumor effect of anti-CAPRIN-1 monoclonal antibody in vivo in mouse
  • the antitumor effect in vivo of cancer-bearing mouse of the obtained monoclonal antibody against CAPRIN-1 was examined. evaluated.
  • the antibody used was a column purified culture supernatant as described above.
  • Antitumor effects of monoclonal antibodies against CAPRIN-1 were examined using tumor bearing Balb / c nude mice transplanted with a human pancreatic cancer cell line Capan-2 expressing CAPRIN-1. 6 ⁇ 10 6 Capan-2 cells (purchased from ATCC) were transplanted subcutaneously into the abdomen of 6 Balb / c nude mice (manufactured by Japan SLC), and the tumor was about 5 mm in diameter. Grown until. Among them, monoclonal antibodies against CAPRIN-1 were intraperitoneally administered to 3 cancer-bearing mice at 200 ⁇ g (200 ⁇ l) per mouse.
  • Example 8 Identification of peptide in CAPRIN-1 protein to which antibody against CAPRIN-1 reacts with cell surface of cancer cells binds CAPRIN of # 12 to # 22 that reacts with cell surface of cancer cells obtained above Using monoclonal antibodies against -1, identification of partial sequences in the CAPRIN-1 proteins that they recognize was performed.
  • DTT (manufactured by Fluka) was added to 100 ⁇ l of a recombinant CAPRIN-1 protein solution dissolved in PBS to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l so as to have a final concentration of 10 mM, and reacted at 95 ° C. for 5 minutes to cause CAPRIN- Reduction of disulfide bonds in one protein was performed, and then iodoacetamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having a final concentration of 20 mM was added, and a thiol group alkylation reaction was performed at 37 ° C. under light-shielding conditions for 30 minutes.
  • iodoacetamide manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • trypsin manufactured by Promega
  • PBS protein A-glass beads
  • NP-40 buffer 20 mM phosphate buffer (pH 7.4)
  • 5 mM EDTA 150 mM NaCl, 1% NP-40
  • the antigen-antibody complex was eluted with 100 ⁇ l of 0.1% formic acid, and Q-TOF Premier (Waters-MicroMass) was used for the eluate. LC-MS analysis was performed using this. Analysis followed the protocol attached to the instrument.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 273 was identified as a partial sequence of CAPRIN-1 recognized by any of the monoclonal antibodies against CAPRIN-1 of # 12 to # 22. Furthermore, the peptide of SEQ ID NO: 274 was identified as a partial sequence in the polypeptide of SEQ ID NO: 273 recognized by the monoclonal antibodies # 13 to # 16, # 17 to # 19 and # 21, and this partial sequence peptide It was found that monoclonal antibody # 13 to # 16 recognize the peptide of SEQ ID NO: 275.
  • human-chicken chimeric monoclonal antibody # 1 human-chicken chimeric monoclonal antibody # 3
  • epitope peptides in CAPRIN-1 proteins recognized by them were identified.
  • 93 candidate peptides consisting of 12 to 16 amino acids in the amino acid sequence of human CAPRIN-1 protein were synthesized and dissolved in DMSO to a concentration of 1 mg / ml each.
  • Each peptide was dissolved in 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.6) to a concentration of 30 ⁇ g / ml, and 100 ⁇ l was added per well of a 96-well plate (Nunc, product number: 436006). And left at 4 ° C. overnight. Discard the solution, add 200 ⁇ l of 10 mM ethanolamine / 0.1 M sodium carbonate buffer (PH 9.6) per well, let stand at room temperature for 1 hour, discard the solution, and PBS containing 0.5% Tween 20 By washing twice with (PBST), a plate on which each peptide was immobilized was prepared.
  • PBST PBS containing 0.5% Tween 20
  • human-chicken chimeric monoclonal antibody # 1 (# 1), human-chicken chimeric monoclonal antibody # 3 (# 3) and mouse monoclonal antibody (# 1, # 2, # 3, # 4, # 5, # 6 , # 7, # 8, # 9, # 10, # 11), add 50 ⁇ l per well, shake at room temperature for 1 hour, remove the solution, and wash 3 times with PBST did.
  • a TMB substrate solution (manufactured by Thermo) was added at 100 ⁇ l per well and allowed to stand for 15 to 30 minutes for color development reaction. After color development, 100 ⁇ l of 1N sulfuric acid was added per well to stop the reaction, and absorbance values at 450 nm and 595 nm were measured using an absorptiometer.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 266 as a partial sequence of CAPRIN-1 recognized by the monoclonal antibodies against anti-CAPRIN-1 human-chicken chimera monoclonal antibody # 1 and antibodies # 1 to # 5 of CAPRIN-1 was identified.
  • the peptide of SEQ ID NO: 267 was identified as a partial sequence in the polypeptide of SEQ ID NO: 266 recognized by human-chicken chimeric monoclonal antibody # 1, mouse monoclonal antibody # 3 and # 4, and mouse monoclonal antibody # 1,
  • the peptide of SEQ ID NO: 268 was identified as a partial sequence in the polypeptide of SEQ ID NO: 266 that is recognized by # 2 and # 5. Therefore, the polypeptide of SEQ ID NO: 266 contains the epitope regions of human-chicken chimeric monoclonal antibody # 1 of anti-CAPRIN-1 antibody, mouse monoclonal antibodies # 1, # 2, # 3, # 4 and # 5. understood.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 270 was identified as a partial sequence of CAPRIN-1 recognized by all of anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies # 6, # 7 and # 8. Therefore, it was found that the polypeptide of SEQ ID NO: 270 contains the epitope regions of anti-CAPRIN-1 antibodies # 6, # 7 and # 8.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 272 was identified as a partial sequence of CAPRIN-1 recognized by all of anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies # 9, # 10 and # 11. Therefore, it was found that the polypeptide of SEQ ID NO: 272 contains the epitope regions of anti-CAPRIN-1 antibodies # 9, # 10 and # 11.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 269 was identified as a partial sequence of CAPRIN-1 recognized by human-chicken chimeric monoclonal antibody # 3. Therefore, it was found that the polypeptide of SEQ ID NO: 269 contains the epitope region of human-chicken chimeric monoclonal antibody # 3.
  • the antibody of the present invention is useful for the treatment and / or prevention of pancreatic cancer.

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Abstract

　この発明は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、又は連続する７～１２以上のアミノ酸残基を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。

Description

膵臓癌の治療及び／又は予防用医薬組成物
　本発明は、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体又はそのフラグメントの、膵臓癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
　癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。
　癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４～９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。
　一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。従って、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。膵臓癌は治療困難であることが当業者の技術常識として知られており、これまでに膵臓癌に十分に効果のある有効な医薬は開発されていない。
　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ－　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＣＡＰＲＩＮ－１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質として知られていたが、乳癌細胞などの癌細胞の表面に特異的に発現することが見出されたため、癌治療のための抗体医薬のターゲットとして研究が進められている（特許文献２）。ただし、特許文献２ではＣＡＰＲＩＮ－１が膵臓癌細胞上に発現することは確認されておらず、ＣＡＰＲＩＮ－１が膵臓癌の抗原タンパク質となりうることについての記載も示唆もない。
米国特許第５６９８３９６号 国際公開ＷＯ２０１０／０１６５２６
秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１－５１９（癌と化学療法社、日本） Ｂｒｕｇｇｅｎ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５４：１６４３－１６４７（１９９１） Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９２：１１８１０－１１８１３（１９９５） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５－９７１（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８：１０３４－１０４１（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２－６５８（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３－７０８（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５６：４７６６－４７７２（１９９６） Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，　６：３３－３９（１９９７）
　本発明の目的は、膵臓癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、膵臓癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と特異的に結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得した遺伝子及びそのヒト、ウシ、ウマ、マウス、ニワトリ相同性遺伝子を基にして、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ－１、及びそれらＣＡＰＲＩＮ－１に対する多数の抗体を作製した。そしてＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の一部がそれら膵臓癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出し、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する膵臓癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
　本発明は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、又は連続する７～１２以上のアミノ酸残基を含むその断片、と特異的に免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。
　実施形態において、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質が、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７～９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するものである。
　別の実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
　別の実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は多重特異抗体である。
　別の実施形態において、上記抗体は、配列番号２７３又は配列番号２６６又は配列番号２７０又は配列番号２７２又は配列番号２６９で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７～９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチド又その断片と免疫学的反応性を有する抗体である。
　別の実施形態において、上記抗体は、以下の（ａ）～（ｙ）のいずれかの抗体であって、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体、又は該抗体を有効成分として含むことを特徴とする、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物である。
（ａ）配列番号３７、３８および３９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と配列番号４１、４２および４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｂ）配列番号４７、４８および４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号５１、５２および５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｃ）配列番号５７、５８および５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号６１、６２および６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｄ）配列番号６７、６８および６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号７１、７２および７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｅ）配列番号７７，７８および７９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号８１，８２および８３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｆ）配列番号８７，８８および８９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号９１，９２および９３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｇ）配列番号９７，９８および９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１０１，１０２および１０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｈ）配列番号１０７，１０８および１０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１１１，１１２および１１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｉ）配列番号１１７，１１８および１１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２および１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｊ）配列番号１２７，１２８および１２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２および１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｋ）配列番号１３２，１３３及び１３４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１３６，１３７及び１３８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｌ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１４６，１４７及び１４８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｍ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１５２，１５３及び１５４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｎ）配列番号１５７，１５８及び１５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１６１，１６２及び１６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｏ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７１，１７２及び１７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｐ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７７，１７８及び１７９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｑ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８２，１８３及び１８４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｒ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８７，１８８及び１８９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｓ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１９２，１９３及び１９４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｔ）配列番号１９７，１９８及び１９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２０１，２０２及び２０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｕ）配列番号２０７，２０８及び２０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２１１，２１２及び２１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｖ）配列番号２１７，２１８及び２１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２２１，２２２及び２２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｗ）配列番号２２７，２２８及び２２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２３１，２３２及び２３３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｘ）配列番号２３７，２３８及び２３９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２４１，２４２及び２４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（ｙ）配列番号２４７，２４８及び２４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２５１，２５２及び２５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
　本発明の別に実施形態において、本発明の抗体又はそのフラグメントが、抗腫瘍剤とコンジュゲートされている。
　本発明はさらに、本発明の上記医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを組み合わせて含む、組み合わせ医薬品を提供する。
　本発明はさらに、本発明の上記医薬組成物又は上記組み合わせ医薬品を被験者に投与することを含む、膵臓癌の治療及び／又は予防方法を提供する。
　本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は、膵臓癌細胞を障害する。従って、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は膵臓癌の治療や予防に有用である。
　本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、具体的には配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列を有するポリペプチド、に対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
　なお、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１～２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・２７，２９）に示されている。
　配列表の配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列は、担癌犬由来の血清中に存在する抗体と特異的に結合するポリペプチドとして、また配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ又はオーソログ）として、配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、そのウシ相同因子として、配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、そのウマ相同因子として、配列番号２０～２８で示されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として、配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、そのニワトリ相同因子として単離された、ＣＡＰＲＩＮ－１のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。ＣＡＰＲＩＮ－１は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現することが知られている。
　本検討により、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質が膵臓癌細胞の細胞表面に発現することが明らかになった。本発明では、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質分子の内、膵臓癌細胞の細胞表面に発現する部分に結合する抗体が好ましく用いられる。膵臓癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質中の部分ペプチドとして、配列表の配列番号２～３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号（ａａ）５０－９８、アミノ酸残基番号（ａａ）２３３－３４３、又はアミノ酸残基番号（ａａ）５２７－Ｃ末端の領域内の連続する７～１２個以上、例えば８～１１個以上、のアミノ酸残基から成るポリペプチドが挙げられ、具体的には例えば、配列番号２７１又は配列番号２７３（例えば、配列番号２７３で表されるアミノ酸配列の中でも、配列番号２７４又は配列番号２７５で表されるアミノ酸配列の領域が好ましい。）あるいは癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質中の部分ペプチドとして、配列番号２６６（例えば、配列番号２６６で表されるアミノ酸配列の中でも、配列番号２６７又は配列番号２６８で表されるアミノ酸配列の領域が好ましい。）又は配列番号２７０又は配列番号２７２又は配列番号２６９で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上など、の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、本発明で用いられる抗体は、これらペプチドに結合する、かつ、抗腫瘍活性を示すすべての抗体が含まれる。
　本発明で用いられる上記ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、例えば合成抗体、多重特異性抗体（例えばダイアボディ、トリアボディ、等）、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）など、ヒト抗体、それらの抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と特異的に結合することが可能な抗体が望ましいし、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であっても良い。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避もしくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
　ここで、「ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。
　本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
　さらにまた、本発明における膵臓癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
　以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。
＜抗体作製用抗原の作製＞
　本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１がヒトＣＡＰＲＩＮ－１の場合、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１を発現する細胞などを用いることができる。
　ヒトＣＡＰＲＩＮ－１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：５８７３－５８７７，１９９３；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２，　１９９７）を利用することによって入手することができる。
　本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１の塩基配列（配列番号１もしくは３）又はアミノ酸配列（配列番号２もしくは４）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％～１００％、好ましくは８０％～１００％、より好ましくは９０％～１００％、さらに好ましくは９５％～１００％、例えば９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％又は９９．５％～１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度又は一致度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
　ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸残基、例えば８～１１アミノ酸残基、からなる。具体例としては、配列番号２７３、配列番号２６６又は配列番号２７０又は配列番号２７２又は配列番号２６９で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７～９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　第２版，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　第３版，　Ａ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９５），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼなど）及びＭｇ２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　第３版，　Ａ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９５），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。
　また、本明細書中の配列表の配列番号１～３０に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、大腸癌、膵臓癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　第２版，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６～（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
＜抗体の構造＞
　抗体は通常少なくとも２本の重鎖および２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。
＜抗体の作製＞
　本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。
　ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ－１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と結合して膵臓癌を障害することができるならば、その種類を問わない。
　抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、等）などを含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などである。
　抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、またはペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
　以下に、種々の抗体の作製例を示す。
　抗体が、モノクローナル抗体であるときには、例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する膵臓癌細胞又はその細胞株（例えばＣａｐａｎ－２、等）などをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９７９）１２３，　１５４８－１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１９７８）８１，　１－７）、ＮＳ－１（Ｋｏｈｌｅｒ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９７６）６，　５１１－５１９）、ＭＰＣ－１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．　Ｄ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　（１９７６）８，　４０５－４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）２７６，　２６９－２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．　Ｇｒｏｔｈ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８０）３５，　１－２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，　Ｉ．Ｓ．　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　（１９７８）１４８，　３１３－３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）２７７，　１３１－１３３）等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８１）７３，　３－４６）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００～６０００程度）を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
　本発明で使用可能な抗体の別の例がポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
　天然のＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、あるいはＧＳＴなどとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。後述の実施例では、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認されている。
　ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開ＷＯ０２／４３４７８、同ＷＯ０２／０９２８１２など）。このようなマウスをＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。
　抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７－５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
　さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，　Ａ．Ｋ．　Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，　Ｊａｍｅｓ，　Ｗ．　Ｌａｒｒｉｃｋ，　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，　１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。しかし、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体など）などであってもよい。
　モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウスなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。後述の実施例では、モノクローナル抗体が作製され、膵臓癌に対する抗腫瘍効果が確認された。これらのモノクローナル抗体は、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１４５、配列番号１６０、配列番号１７０、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２２０、配列番号２３０、配列番号２４０又は配列番号２５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４，配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５５、配列番号１６４、配列番号１７４、配列番号１８０、配列番号１８５、配列番号１９０、配列番号１９５、配列番号２０４、配列番号２１４、配列番号２２４、配列番号２３４、配列番号２４４又は配列番号２５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３２、配列番号１４２、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７又は配列番号２４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１４３、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８又は配列番号２４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１４４、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９又は配列番号２４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域に配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１２１，配列番号１３６、配列番号１４６、配列番号１５２、配列番号１６１、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８２、配列番号１８７、配列番号１９２、配列番号２０１、配列番号２１１、配列番号２２１、配列番号２３１、配列番号２４１又は配列番号２５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２、配列番号１２２，配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５３、配列番号１６２、配列番号１７２、配列番号１７８、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２０２、配列番号２１２、配列番号２２２、配列番号２３２、配列番号２４２又は配列番号２５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１６３、配列番号１７３、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８９、配列番号１９４、配列番号２０３、配列番号２１３、配列番号２２３、配列番号２３３、配列番号２４３又は配列番号２５３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。
　キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
　ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質を免疫して得られる抗体が含まれる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
　具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；　ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９３，　５３：　８５１－８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開ＷＯ９９／５１７４３参照）。
　ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９３，　５３：　８５１－８５６）。
　キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
　アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１～５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
　抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明で用いられる抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
　ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明で用いられる抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１－２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，　ＭＪ．，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１００，　４６８－５００、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　９４４１－９４５６、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｚ，　ＨＪ．，　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３５０－３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，　ＴＡ．，　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８２，　４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　８５，　２７６３－２７６６）などを用いて、本発明で用いられる抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
　上記抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸、好ましくは８～１１アミノ酸からなる。
　本発明で用いられる抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１である。
　本発明で用いられる抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２－ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
　抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン　（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）並びにそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。
　また、本発明で用いられる抗体と、抗腫瘍剤を併用投与することで、より高い治療効果を得ることができる。本手法は、ＣＡＰＲＩＮ－１が発現している癌患者に対して、外科的手術前後どちらにおいても適応できる。特に手術後に、従来抗腫瘍剤単独で処置されていたＣＡＰＲＩＮ－１が発現している癌に対して、より高い癌再発防止や生存期間の延長が得られる。
　併用投与に用いられる抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン　（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。上記の内、特にシクロホスファミド、パクリタキセル、ドキセタキセル、ビノレルビンなどが好ましく用いられる。
　あるいは、本発明で用いられる抗体には、文献等で公知の、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１７５Ｌｕ、１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
　本発明で用いられる抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＣＡＰＲＩＮ－１と特異的に結合する抗体であって、膵臓癌に対する細胞障害活性、又は腫瘍増殖抑制作用、を示す抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト－マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えばダイアボディ、トリアボディ、等）などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
　これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ　ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈＥｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　Ｍｄ．　（１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。
　さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ－１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
　ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２～１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ．　－Ｂ．　Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　２００７，　２０（９）：　４２５－４３２）が挙げられる。
　二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
　上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ．　Ｄｅｌｖｅｓ．，　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，　１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．　Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．　Ｄｅａｎ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，　２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ；　Ｊ．Ｗ．　Ｇｏｄｉｎｇ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ．，　１９９３　ＡＣＡＤＥＭＩＣ　ＰＲＥＳＳ）。
　上記の方法によって作製される本発明の抗体は、例えば以下の（ａ）～（ｙ）の抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号３７，３８および３９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と配列番号４１，４２および４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号４０の重鎖可変領域および配列番号４４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｂ）配列番号４７，４８および４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号５１、５２および５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｃ）配列番号５７、５８および５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号６１、６２および６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号６０の重鎖可変領域および配列番号６４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｄ）配列番号６７、６８および６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号７１、７２および７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号７０の重鎖可変領域および配列番号７４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｅ）配列番号７７，７８および７９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号８１，８２および８３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号８０の重鎖可変領域および配列番号８４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｆ）配列番号８７，８８および８９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号９１，９２および９３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｇ）配列番号９７，９８および９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１０１，１０２および１０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１００の重鎖可変領域および配列番号１０４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｈ）配列番号１０７，１０８および１０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１１１，１１２および１１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１１０の重鎖可変領域および配列番号１１４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｉ）配列番号１１７，１１８および１１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２および１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１２０の重鎖可変領域および配列番号１２４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｊ）配列番号１２７，１２８および１２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２および１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１３０の重鎖可変領域および配列番号１２４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｋ）配列番号１３２，１３３及び１３４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１３６，１３７及び１３８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１３５の重鎖可変領域および配列番号１３９の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｌ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１４６，１４７及び１４８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１４５の重鎖可変領域および配列番号１４９の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｍ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１５２，１５３及び１５４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１４５の重鎖可変領域および配列番号１５５の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｎ）配列番号１５７，１５８及び１５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１６１，１６２及び１６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１６０の重鎖可変領域および配列番号１６４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｏ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７１，１７２及び１７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１７０の重鎖可変領域および配列番号１７４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｐ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７７，１７８及び１７９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１７０の重鎖可変領域および配列番号１８０の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｑ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８２，１８３及び１８４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１７０の重鎖可変領域および配列番号１８５の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｒ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８７，１８８及び１８９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１７０の重鎖可変領域および配列番号１９０の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｓ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１９２，１９３及び１９４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号１７０の重鎖可変領域および配列番号１９５の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｔ）配列番号１９７，１９８及び１９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２０１，２０２及び２０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２００の重鎖可変領域および配列番号２０４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｕ）配列番号２０７，２０８及び２０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２１１，２１２及び２１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２１０の重鎖可変領域および配列番号２１４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｖ）配列番号２１７，２１８及び２１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２２１，２２２及び２２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２２０の重鎖可変領域および配列番号２２４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｗ）配列番号２２７，２２８及び２２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２３１，２３２及び２３３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２３０の重鎖可変領域および配列番号２３４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｘ）配列番号２３７，２３８及び２３９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２４１，２４２及び２４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２４０の重鎖可変領域および配列番号２４４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
（ｙ）配列番号２４７，２４８及び２４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２５１，２５２及び２５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号２５０の重鎖可変領域および配列番号２５４の軽鎖可変領域を含む抗体）。
　ここで、配列番号６７、６８および６９、配列番号７７，７８および７９、配列番号８７，８８および８９、配列番号９７，９８および９９、配列番号１０７，１０８および１０９、配列番号１１７，１１８および１１９、配列番号１２７，１２８および１２９、配列番号１３２、１３３および１３４、配列番号１４２、１４３および１４４、配列番号１５７、１５８および１５９、配列番号１６７、１６８および１６９、配列番号１６７、１６８および１６９、配列番号１９７、１９８および１９９、配列番号２０７、２０８および２０９、配列番号２１７、２１８および２１９、配列番号２２７、２２８および２２９、配列番号２３７、２３８および２３９、配列番号２４７、２４８および２４９に示すアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号７１、７２および７３、配列番号８１，８２および８３、配列番号９１，９２および９３、配列番号１０１，１０２および１０３、配列番号１１１、１１２および１１３、配列番号１２１，１２２および１２３、配列番号１３６、１３７および１３８、配列番号１４６，１４７および１４８、配列番号１５２，１５３および１５４、配列番号１６１，１６２および１６３、配列番号１７１，１７２および１７３、配列番号１７７、１７８および１７９、配列番号１８２、１８３および１８４、配列番号１８７、１８８および１８９、配列番号１９２、１９３および１９４、配列番号２０１、２０２および２０３、配列番号２１１、２１２および２１３、配列番号２２１、２２２および２２３、配列番号２３１、２３２および２３３、配列番号２４１、２４２および２４３、配列番号２５１、２５２および２５３、に示すアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
　また、配列番号３７、３８及び３９、配列番号４７、４８及び４９、配列番号５７、５８及び５９に示すアミノ酸配列は、ニワトリ抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、さらにまた、配列番号４１、４２及び４３、配列番号５１、５２及び５３、配列番号６１、６２及び６３に示すアミノ酸配列はそれぞれ、ニワトリ抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
　また、本発明で用いられるヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体は、例えば以下の抗体である（抗体（ａ）で例示する）。
（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号４１、４２および４３のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４１、４２および４３のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。
（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号４０のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。
　なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えばＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。
　上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
　また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
　さらに本発明で用いられる上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１を特異的に認識するという特異性を有する限り、上記（ｉ）から（ｉｉｉ）等の各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２～５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
　本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体によるＣＡＰＲＩＮ－１発現膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序により起こると考えられる。
　ＣＡＰＲＩＮ－１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＣＡＰＲＩＮ－１発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）。
　従って、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＡＰＲＩＮ－１を発現する膵臓癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
　本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体は、膵臓癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、膵臓癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を有効成分とする、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
　なお、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体と膵臓癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。従って、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、膵臓癌の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１であることが望ましい。
＜抗原発現細胞への結合＞
　抗体がＣＡＰＲＩＮ－１に結合する能力は、実施例で述べられるようなたとえば　ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。
＜免疫組織化学染色＞
　ＣＡＰＲＩＮ－１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然にまたはトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ－１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒドまたはアセトン固定した凍結切片またはパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ－１との反応性に関して試験することができる。
　免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ－１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ウサギ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
＜医薬組成物＞
　本発明の膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子を発現する膵臓癌（細胞）であれば特に限定されない。
　本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　本発明において対象となる膵臓癌としては、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列又は７～１２以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している膵臓癌である。
　膵臓癌には、例えば、膵管癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、浸潤性膵管癌（Ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓癌の腺癌（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺房細胞癌（Ａｃｉｎａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺扁平上皮癌（Ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞腫（Ｇｉａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｔｕｍｏｒ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（Ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ　ｐａｐｉｌｌａｒｙ－ｍｕｃｉｎｏｕｓ　ｎｅｏｐｌａｓｍ（ＩＰＭＮ））、粘液性嚢胞腺癌（Ｍｕｃｉｎｏｕｓ　ｃｙｓｔｉｃ　ｎｅｏｐｌａｓｍ（ＭＣＮ））、膵芽腫（Ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）、漿液性嚢胞腺癌（Ｓｅｒｏｕｓ　ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、固体乳頭状癌（Ｓｏｌｉｄ－ｐｓｅｕｄｏｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｔｕｍｏｒ（ＳＰＴ））、ガストリノーマ（Ｇａｓｔｒｉｎｏｍａｓ(Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ－Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群)）、グルカゴノーマ（Ｇｌｕｃａｇｏｎｏｍａｓ）、インスリノーマ（Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ）、多発性内分泌腺腫症１（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ　Ｔｙｐｅ－１（ＭＥＮ１）（Ｗｅｒｍｅｒ症候群））、非機能性島細胞腫（Ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｉｓｌｅｔ　Ｃｅｌｌ　Ｔｕｍｏｒ）、ソマトスタチノーマ（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎｏｍａｓ）、ＶＩＰ産生腫瘍（ＶＩＰｏｍａｓ）が包含されるが、これらに限定されない。
　また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌおよびネコが好ましい。
　本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
　また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明の医薬組成物を被験者に投与することによって膵臓癌を治療及び／又は予防することができる。
　さらに、本発明の医薬組成物を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、膵臓癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、あるいは、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する別の医薬剤型には、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（もしくは媒体)中で混合し製剤化して得られる医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌などの説明を適用しうる。したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、膵臓癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品（「医薬キット」ともいう）も提供する。
　また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体とともに含む、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。
　或いは、抗腫瘍剤は、本発明の抗体又はそのフラグメントにコンジュゲートされてもよい。該コンジュゲートは、上記と同様に、薬理学上許容される担体（もしくは媒体)と混合し製剤化して医薬組成物とすることができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。
　[実施例１]　ＳＥＲＥＸ法による膵臓癌抗原タンパクの同定
　（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
　健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム－フェノール－クロロホルム法（Ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０　ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ　ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，　ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，　ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｃｌｏｎｉｇ　Ｋｉｔ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
　（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ　Ｅｘｔｒａ：　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ　ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｒｅ　ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｄｏｇ　ＩｇＧ－ｈ＋Ｉ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：　ＢＥＴＨＹＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン　ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。
　（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
　上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ－１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１，３に、アミノ酸配列を配列番号２，４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３～９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７～８９％、アミノ酸配列９５～９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９，２１，２３，２５，２７に、アミノ酸配列を配列番号２０，２２，２４，２６，２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９～９１％、アミノ酸配列９５～９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１～８２％、アミノ酸配列８６％であった。
　（４）ヒト膵臓癌細胞でのＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しヒトの各種膵臓癌細胞株４種（Ｃａｐａｎ－２、ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ－３）における発現をＲＴ－ＰＣＲ法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃－３０秒、６０℃－３０秒、７２℃－３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子）中の６９８番～１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５及び３６に記載）も同時に用いた。その結果、全てのヒト膵臓癌細胞株で発現が確認された。
　［実施例２］　ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体の作製
　ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３に従って作製したヒトＣＡＰＲＩＮ－１組換えタンパク質１ｍｇを等容量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、ウサギの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないウサギの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。
　[実施例３]　ヒト膵臓癌でのＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の発現解析
　（１）ヒト膵臓癌細胞上でのＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の発現解析
　ＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子の発現が確認されたヒト膵臓癌細胞株４種（Ｃａｐａｎ－２、ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ－３）について、その細胞表面上にＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質が発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト膵臓癌細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１由来に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体（サンタクルズ社製）及び９５μｌの０．１％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体の代わりに実施例２で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＣＡＰＲＩＮ－１ポリクローナル抗体を添加された膵臓癌細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が２０％以上強かった。このことから、上記ヒト膵臓癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ－１タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
　平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ－１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）－（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００
　（２）ヒト膵臓癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の発現
　パラフィン包埋されたヒト膵臓癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の膵臓癌組織４０検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト膵臓癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノールおよびＰＢＳ－Ｔで同様の操作を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト膵臓癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ－Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ－Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１由来に対するポリクローナル抗体を５％ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置し、ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は全膵臓癌組織４０検体の内、３６検体（９０％）で強い発現が認められた。
　[実施例４]　ＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体の膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
　ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する膵臓癌細胞を障害することができるかどうかを検討した。実施例２で得たヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体を用いて評価を行った。ＣＡＰＲＩＮ－１の発現が確認されているヒト膵臓癌細胞Ｃａｐａｎ－２とＭＩＡＰａＣａ－２をそれぞれ１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに、上記ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体をそれぞれ１μｇずつ添加し、さらにヒト末梢血から分離したリンパ球をそれぞれ２×１０５個ずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム（Ｃｒ）５１の量を測定し、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体による各膵臓癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、抗原が免疫されていないウサギの末梢血から調製したコントロール抗体を用いて同様の操作を行った場合、Ｃａｐａｎ－２とＭＩＡＰａＣａ－２それぞれに対して０．７％未満であり、抗体を添加しなかった場合においても０．５％未満であったのに対して、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するポリクローナル抗体を加えた場合には、Ｃａｐａｎ－２とＭＩＡＰａＣａ－２それぞれに対して１４％及び１１％のＡＤＣＣ活性が確認された。従って、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する膵臓癌細胞を障害することができることが明らかになった。なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体、リンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０３個の腫瘍細胞を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出した腫瘍細胞に対する細胞障害活性を示した結果である。
　＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体及びリンパ球を加えた際の腫瘍細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた腫瘍細胞からのクロミウム５１遊離量×１００
　[実施例５]　ＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウス及びニワトリモノクローナル抗体の作製
　実施例２で作製したヒトＣＡＰＲＩＮ－１組換えタンパク質１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回および２４回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から３日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（－）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。
　作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。
　選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに反応性を示すマウスモノクローナル抗体を産生する１５０個のハイブリドーマ株を得た。
　次にそれらマウスモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ－１が発現する癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに何も処理していない６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの血清をハイブリドーマ培養用培地で５００倍希釈したものを用いて行い、コントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するマウスモノクローナル抗体２２個（マウスモノクローナル抗体＃１～＃２２）を選抜した。
　また、ニワトリモノクローナル抗体を作製するために、実施例２で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク質（ヒトＣＡＰＲＩＮ－１）３００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、これをニワトリ１羽当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を７週齢のニワトリの腹腔内に投与後、４週間毎に７回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から４日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（－）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と、鳥類細網内皮症ウイルスを用いてニワトリから形質転換法により樹立した、軽鎖が欠損しているニワトリミエローマ細胞とを５：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％　ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて、５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（ＨＡＴ選択培地）３００ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート３０枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養することで、脾臓細胞とニワトリミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。
　作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。
　選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製））を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を複数個得た。
　次にそれらモノクローナル抗体のうち、ＣＡＰＲＩＮ－１が発現する癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、５×１０５個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで３０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ハイブリドーマ培養用培地を用いて行い、コントロールのサンプルとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体３個（ニワトリモノクローナル抗体＃１、＃２、＃３）を選抜した。
　[実施例６]　選抜した抗体の特徴付け
　（１）抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
　実施例５で選抜した２２個のマウスモノクローナル抗体ならびに３個のニワトリモノクローナル抗体をそれぞれ産生する各ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡを抽出し、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマにはマウスＦＲ１由来配列およびマウスＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用し、ニワトリモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマにはニワトリＦＲ１由来配列及びニワトリＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ法により、全ての抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン社製）にクローニングした。
　（１）－１　ＲＴ－ＰＣＲ
　１０６個のマウスモノクローナル抗体を産生する各ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡ　ｍｉｃｒｏ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてｍＲＮＡを調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法により抗体遺伝子の増幅を行った。ＶＨ領域の遺伝子取得のために、マウス重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー（配列番号２５７）およびマウス重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマー（配列番号２５８）を使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、マウス軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー（配列番号２５９）およびマウス軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマー（配列番号２６０）を使用した。これらプライマーはＪｏｎｅｓ，　Ｓ．Ｔ．　ａｎｄ　Ｂｅｎｄｉｎｇ，　Ｍ．Ｍ．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９，　８８－８９　（１９９１）を参考に設計した。ＰＣＲは、Ｅｘ－ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。１０×ＥＸ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（１．０μＭ）各２μｌ、Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）０．２５μｌにｃＤＮＡサンプルを加え、滅菌水により総量５０μｌとした。９４℃で２分処理後、変性９４℃１分、アニーリング５８℃３０秒、伸長反応７２℃１分の組み合わせで３０サイクルの条件で行った。
　また、１０６個のニワトリモノクローナル抗体を産生する各ハイブリドーマ株から、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。 　合成したｃＤＮＡを鋳型としＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(ＴＯＹＯＢＯ社製)を用いて、常法に従い、ＰＣＲ法にて、ニワトリ抗体重鎖遺伝子可変領域及びニワトリ抗体軽鎖遺伝子可変領域をそれぞれ増幅した。ニワトリ抗体のＶＨ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマーを使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマーを使用した。
　（１）－２　クローニング
　上記で得られた各ＰＣＲ産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、ＶＨ領域およびＶＬ領域それぞれのＤＮＡバンドを切り出した。ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各ＤＮＡはＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。連結したベクターをＤＨ５ａコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ１０クローンを培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃一晩培養後、各プラスミドＤＮＡをＱｉａｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
　（１）－３　配列決定
　上記で得られた各プラスミド中のＶＨ領域およびＶＬ領域の遺伝子配列解析は、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号２６１）およびＭ１３リバースプライマー（配列番号２６２）を用いて、蛍光シーケンサー（ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３１３０ＸＬ）により、ＡＢＩ社製のビッグダイターミネーターＶｅｒ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列およびアミノ酸配列が決定された。
　すなわち、これらのモノクローナル抗体は、配列番号４０（配列番号４５）、配列番号５０（配列番号５５）、配列番号６０（配列番号６５）、配列番号７０（配列番号７５）、配列番号８０（配列番号８５）、配列番号９０（配列番号９５）、配列番号１００（配列番号１０５）、配列番号１１０（配列番号１１５）、配列番号１２０（配列番号１２５）、配列番号１３０（配列番号１３１）、配列番号１３５（配列番号１４０）、配列番号１４５（配列番号１５０）、配列番号１６０（配列番号１６５）、配列番号１７０（配列番号１７５）、配列番号２００（配列番号２０５）、配列番号２１０（配列番号２１５）、配列番号２２０（配列番号２２５）、配列番号２３０（配列番号２３５）、配列番号２４０（配列番号２４５）又は配列番号２５０（配列番号２５５）のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域（括弧内は遺伝子配列の配列番号）と、配列番号４４（配列番号４６）、配列番号５４（配列番号５６）、配列番号６４（配列番号６６）、配列番号７４（配列番号７６）、配列番号８４（配列番号８６）、配列番号９４（配列番号９６）、配列番号１０４（配列番号１０６）、配列番号１１４（配列番号１１６）、配列番号１２４（配列番号１２６）、配列番号１３９（配列番号１４１）、配列番号１４９（配列番号１５１）、配列番号１５５（配列番号１５６）、配列番号１６４（配列番号１６６）、配列番号１７４（配列番号１７６）、配列番号１８０（配列番号１８１）、配列番号１８５（配列番号１８６）、配列番号１９０（配列番号１９１）、配列番号１９５（配列番号１９６）、配列番号２０４（配列番号２０６）、配列番号２１４（配列番号２１６）、配列番号２２４（配列番号２２６）、配列番号２３４（配列番号２３６）、配列番号２４４（配列番号２４６）又は配列番号２５４（配列番号２５６）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域（括弧内は遺伝子配列の配列番号）を含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３２、配列番号１４２、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７又は配列番号２４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１４３、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８又は配列番号２４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１４４、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９又は配列番号２４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域に配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１２１，配列番号１３６、配列番号１４６、配列番号１５２、配列番号１６１、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８２、配列番号１８７、配列番号１９２、配列番号２０１、配列番号２１１、配列番号２２１、配列番号２３１、配列番号２４１又は配列番号２５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２、配列番号１２２，配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５３、配列番号１６２、配列番号１７２、配列番号１７８、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２０２、配列番号２１２、配列番号２２２、配列番号２３２、配列番号２４２又は配列番号２５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１６３、配列番号１７３、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８９、配列番号１９４、配列番号２０３、配列番号２１３、配列番号２２３、配列番号２３３、配列番号２４３又は配列番号２５３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。
　得られたモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１４５、配列番号１６０、配列番号１７０、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２２０、配列番号２３０、配列番号２４０および配列番号２５０に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４，配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５５、配列番号１６４、配列番号１７４、配列番号１８０、配列番号１８５、配列番号１９０、配列番号１９５、配列番号２０４、配列番号２１４、配列番号２２４、配列番号２３４、配列番号２４４および配列番号２５４に示す。
　すなわちマウスモノクローナル抗体＃１は配列番号７０の重鎖可変領域と配列番号７４の軽鎖可変領域を含み、＃２は配列番号８０の重鎖可変領域と配列番号８４の軽鎖可変領域を含み、＃３は配列番号９０の重鎖可変領域と配列番号９４の軽鎖可変領域を含み、＃４は配列番号１００の重鎖可変領域と配列番号１０４の軽鎖可変領域を含み、＃５は配列番号１１０の重鎖可変領域と配列番号１１４の軽鎖可変領域を含み、＃６は配列番号１２０の重鎖可変領域と配列番号１２４の軽鎖可変領域を含み、＃７は配列番号１３０の重鎖可変領域と配列番号１２４の軽鎖可変領域を含み、＃８は配列番号１３５の重鎖可変領域と配列番号１３９の軽鎖可変領域を含み、＃９は配列番号１４５の重鎖可変領域と配列番号１４９の軽鎖可変領域を含み、＃１０は配列番号１４５の重鎖可変領域と配列番号１５５の軽鎖可変領域を含み、＃１１は配列番号１６０の重鎖可変領域と配列番号１６４の軽鎖可変領域を含み、＃１２は配列番号１７０の重鎖可変領域と配列番号１７４の軽鎖可変領域を含み、＃１３は配列番号１７０の重鎖可変領域と配列番号１８０の軽鎖可変領域を含み、＃１４は配列番号１７０の重鎖可変領域と配列番号１８５の軽鎖可変領域を含み、＃１５は配列番号１７０の重鎖可変領域と配列番号１９０の軽鎖可変領域を含み、＃１６は配列番号１７０の重鎖可変領域と配列番号１９５の軽鎖可変領域を含み、＃１７は配列番号２００の重鎖可変領域と配列番号２０４の軽鎖可変領域を含み、＃１８は配列番号２１０の重鎖可変領域と配列番号２１４の軽鎖可変領域を含み、＃１９は配列番号２２０の重鎖可変領域と配列番号２２４の軽鎖可変領域を含み、＃２０は配列番号２３０の重鎖可変領域と配列番号２３４の軽鎖可変領域を含み、＃２１は配列番号２４０の重鎖可変領域と配列番号２４４の軽鎖可変領域を含み、＃２２は配列番号２５０の重鎖可変領域と配列番号２５４の軽鎖可変領域を含む。
　得られたニワトリモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４に示す。
　すなわち、ニワトリモノクローナル抗体＃１は配列番号４０の重鎖可変領域と配列番号４４の軽鎖可変領域を含み、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列から成り、ニワトリモノクローナル抗体＃２は配列番号５０の重鎖可変領域と配列番号５４の軽鎖可変領域を含み、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３のアミノ酸配列から成り、ニワトリモノクローナル抗体＃３は配列番号６０の重鎖可変領域と配列番号６４の軽鎖可変領域を含み、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３のアミノ酸配列から成る。
　（２）ヒト－ニワトリキメラ組換え抗体及びマウス－ニワトリキメラ抗体の作製
　上記（１）で得られた、配列番号４０で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号２６３を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号２６４を含むヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号４４で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号２６３を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号２６５を含むヒトＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。
　次に、配列番号４０で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、配列番号４４で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養された２×１０５個のＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＢＳ（－）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍｌの１０％　ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μｌとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）並びに２００μｇ／ｍｌジェネチシン（ロシュ社製）を添加した１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養したのち、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１細胞を播種して、ニワトリモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するヒト－ニワトリキメラ抗体＃１（＃１）を安定的に産生する細胞株を作製した。上記方法と同様にして、ニワトリモノクローナル抗体＃２ならびに＃３についてもヒト－ニワトリキメラ抗体＃２（＃２）ならびにヒト－ニワトリキメラ抗体＃３（＃３）を安定的に産生する細胞株を作製した。
　作製した細胞株を１５０ｃｍ２フラスコを用いて５×１０５個／ｍｌで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍｌを用いて５日間培養し、＃１、＃２または＃３を含む培養上清を得た。
　同様にして、配列番号４０で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号４４で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。これらを上記と同様にＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入してニワトリモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するマウス－ニワトリキメラ抗体＃１を安定的に産生する細胞株を作製した。上記方法と同様にして、ニワトリモノクローナル抗体＃２ならびに＃３についてもマウス－ニワトリキメラ抗体＃２（＃２）ならびにマウス－ニワトリキメラ抗体＃３（＃３）を安定的に産生する細胞株を作製した。
　作製した細胞株を１５０ｃｍ２フラスコを用いて５×１０５個／ｍｌで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍｌを用いて５日間培養し、マウス－ニワトリキメラ抗体＃１、マウス－ニワトリキメラ抗体＃２ならびにマウス－ニワトリキメラ抗体＃３を含む培養上清を得た。
　（３）取得したモノクローナル抗体を用いた膵臓癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　次にＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子の発現が確認された膵臓癌細胞株４種（Ｃａｐａｎ－２、ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ－３）について、その細胞表面上にＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質が発現しているかどうかを調べた。各細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに実施例４で作製した癌細胞表面に反応する、＃１から＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウスモノクローナル抗体ならびに上記（２）で作製したＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウス－ニワトリキメラ抗体＃１、マウス－ニワトリキメラ抗体＃２、マウス－ニワトリキメラ抗体＃３を含む培養上清（１００μｌ）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％　ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）で懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、＃１から＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウスモノクローナル抗体ならびにマウス－ニワトリキメラ抗体＃１、マウス－ニワトリキメラ抗体＃２、マウス－ニワトリキメラ抗体＃３を含む培養上清の代わりにアイソタイプコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、＃１～＃２２のモノクローナル抗体、マウス－ニワトリキメラ抗体＃１、マウス－ニワトリキメラ抗体＃２、マウス－ニワトリキメラ抗体＃３を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が２０％以上強かった。具体的例を挙げると、マウス－ニワトリキメラ抗体＃１を用いた場合、Ｃａｐａｎ－２、ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ－３ともに２００％以上の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト膵臓癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ－１タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
　平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ－１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）－（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００
　（４）ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体のヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
　上記で得た抗体のうち、ヒト－ニワトリキメラ抗体＃１を用いてヒト膵臓癌細胞に対する細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を評価した。上記（２）で得たヒト－ニワトリキメラ抗体＃１を含む培養上清をＨｉｔｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（－）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。１０６個のヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ－２ならびにＣａｐａｎ－２を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり２×１０３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体を１穴あたり１．２μｇ添加した。さらに、ヒト末梢血リンパ球細胞から以下の手法を用いてヒトＮＫ細胞を含む細胞集団を分離した。すなわち、ヒト末梢血単核球細胞をＦＩＴＣ蛍光色素で標識された抗体（抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２０抗体、抗ヒトＣＤ１９抗体、抗ヒトＣＤ１１ｃ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ベクトンアンドディッキンソン社））で反応させ、セルソーター（ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ　ＳＥ（ベクトンアンドディッキンソン社））を用いて、上記抗体で染まらないＮＫ細胞を含んだ細胞集団を分離したもの、又はヒトＮＫ細胞分離キット（ＮＫセルアイソレーションキット（ミルテニー社製））を用いて分離したものを得た。得られたＮＫ細胞を含む細胞を１ウェル当たり２×１０５個添加して、３７℃、５％、ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体による膵臓癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、ＭＩＡＰａＣａ－２に対して、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体ならびに抗体を添加しなかった場合の細胞障害活性は５％未満であったのに対して、ヒト－ニワトリキメラ抗体＃１は、３２％の細胞障害活性が得られた。また、Ｃａｐａｎ－２に対して、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体ならびに抗体を添加しなかった場合の細胞障害活性は５％未満であったのに対して、ヒト－ニワトリキメラ抗体＃１は、２０％以上の細胞障害活性が得られた。なお、＃１～＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウスモノクローナル抗体、ヒト－ニワトリキメラ抗体＃２ならびにヒト－ニワトリキメラ抗体＃３についても上記と同様にしてＭＩＡＰａＣａ－２ならびにＣａｐａｎ－２に対する細胞障害活性を調べたところ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体ならびに抗体を添加しなかった場合の細胞障害活性はいずれの膵臓癌細胞ともに５％未満であったのに対して、１０％以上の細胞障害活性が見られた。以上の結果より、取得した抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体は、ＡＤＣＣ活性によってＣＡＰＲＩＮ－１を発現する癌細胞を障害することが示された。なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体、ヒトＮＫ細胞を含む細胞集団及びクロミウム５１を取り込ませた２×１０３個の腫瘍細胞を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出した腫瘍細胞に対する細胞障害活性を示した結果である。
　＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体及びヒトＮＫ細胞を含む細胞集団を加えた際の腫瘍細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた腫瘍細胞からのクロミウム５１遊離量×１００
　[実施例７]　マウス生体内における抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体の抗腫瘍効果
　次に、取得したＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体（ヒト－ニワトリキメラ抗体＃１）の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は上記と同様に培養上清をカラム精製したものを用いた。
　ＣＡＰＲＩＮ－１を発現するヒト膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－２を移植した担癌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを用いてＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を検討した。６匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹部皮下に、１匹あたり５×１０６個のＣａｐａｎ－２細胞（ＡＴＣＣより購入）を移植し、腫瘍が直径５ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。その内、３匹の担癌マウスに対して、ＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体を１匹あたり２００μｇ（２００μｌ）ずつ腹腔内投与した。その後、週に２回同量の抗体を担癌マウスの腹腔に投与し、毎日腫瘍の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方残りの３匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（－）を投与し、これをコントロール群とした。その結果、＃１～＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するマウスモノクローナル抗体を投与した群は、コントロール群の腫瘍体積を１００％とした場合に、抗体を投与してから２７日目には８４％にまで腫瘍が退縮し、３５日目には７５％にまで腫瘍の増殖が抑制された。ヒト－ニワトリキメラ抗体＃１、＃２ならびに＃３についても上記と同様に評価した結果、いずれも抗体投与後２７日目に８０％にまで腫瘍の増殖が抑制された。この結果から、取得したＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現するヒト膵臓癌細胞に対して、生体内で抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、腫瘍の大きさは、０．５×（長径×短径×短径）の計算式を用いて、体積を算出した。
　[実施例８]　癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体が結合するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質中のペプチドの同定
　上記で取得した、癌細胞の細胞表面に反応する＃１２～＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体を用いて、それらが認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質中の部分配列の同定を行った。
　まず、ＰＢＳで１μｇ／μｌの濃度に溶解した組換えＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質溶液１００μｌに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を添加し、９５℃、５分間反応させてＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質内のジスルフィド結合の還元を行い、次に終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬社製）を添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質４０μｇに、＃１２～＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体をそれぞれ５０μｇ添加し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌにメスアップして撹拌混合しながら４℃で一晩反応させた。
　次に、トリプシン（プロメガ社製）を終濃度０．２μｇとなるように添加し、３７℃１時間、２時間、４時間、１２時間反応させた後、予め１％ＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄したプロテインＡ－ガラスビーズ（ＧＥ社製）と１ｍＭ　炭酸カルシウム、ＮＰ－４０緩衝液（２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０）中で混合し、それぞれ３０分間反応させた。
　反応液を２５ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％　ギ酸１００μｌを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ－ＴＯＦ　Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ－ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ－ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコールに従った。
　その結果、＃１２～＃２２のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ－１の部分配列として、配列番号２７３のポリペプチドが同定された。さらに、モノクローナル抗体＃１３～＃１６、＃１７～＃１９および＃２１が認識する、上記配列番号２７３のポリペプチド中の部分配列として配列番号２７４のペプチドが同定され、さらにその部分配列ペプチドである配列番号２７５のペプチドをモノクローナル抗体＃１３～＃１６が認識することが判った。
　また、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃１、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃３、マウスモノクローナル抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１を用いて、それらが認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質中のエピトープペプチドの同定を行った。ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のアミノ酸配列中、１２～１６アミノ酸から成る、９３個の候補ペプチドを合成し、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯで溶解した。
　各ペプチドを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に３０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製、製品番号：４３６００６）の１穴あたり１００μｌずつ添加して４℃で一晩静置した。液を捨て、１０ｍＭエタノールアミン／０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９．６）を１穴あたり２００μｌずつ添加し、室温で１時間静置した後、液を捨て、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて２回洗浄することによって、各ペプチドが固相化されたプレートを作製した。
　これに、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃１（＃１）、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃３（＃３）及びマウスモノクローナル抗体（＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１）を含む細胞培養上清を１穴あたり５０μｌ添加し、室温で１時間振とうした後、液を除去し、ＰＢＳＴにて３回洗浄した。次に、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体ウェルにはＨＲＰが標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体をＰＢＳＴにて３０００～４０００倍希釈した２次抗体溶液を、マウスモノクローナル抗体にはＨＲＰが標識された抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体をＰＢＳＴにて３０００～４０００倍希釈した２次抗体溶液を、それぞれ５０μｌずつ添加した後、液を除去し、ＰＢＳＴにて６回洗浄を行った。
　ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体のヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃１、抗体＃１～＃５のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ－１の部分配列として、配列番号２６６のポリペプチドが同定された。さらに、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃１、マウスモノクローナル抗体＃３及び＃４が認識する、上記配列番号２６６のポリペプチド中の部分配列として配列番号２６７のペプチドが同定され、マウスモノクローナル抗体＃１、＃２及び＃５が認識する、上記配列番号２６６のポリペプチド中の部分配列として配列番号２６８のペプチドが同定された。したがって、配列番号２６６のポリペプチドが抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体のヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃１、マウスモノクローナル抗体＃１、＃２、＃３、＃４及び＃５のエピトープ領域を含んでいることが判った。また、抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体＃６、＃７及び＃８がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ－１の部分配列として、配列番号２７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドが同定された。従って配列番号２７０のポリペプチドが抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃６、＃７ならびに＃８のエピトープ領域を含んでいることが判った。さらにまた、抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体＃９、＃１０及び＃１１がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ－１の部分配列として、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが同定された。従って配列番号２７２のポリペプチドが抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃９、＃１０ならびに＃１１のエピトープ領域を含んでいることが判った。さらにまた、ヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃３が認識するＣＡＰＲＩＮ－１の部分配列として、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むポリペプチドが同定された。従って配列番号２６９のポリペプチドがヒト－ニワトリキメラモノクローナル抗体＃３のエピトープ領域を含んでいることが判った。
　本発明の抗体は、膵臓癌の治療及び／又は予防のため有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　配列番号３１～３６、１３０、２５７～２６２：プライマー

Claims (10)

  1. 　ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質、又は連続する７～１２以上のアミノ酸残基を含むその断片、と特異的に免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、膵臓癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
  2. 　前記ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質が、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の断片が、配列番号２～３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号５０－９８、アミノ酸残基番号２３３－３４３、又はアミノ酸残基番号５２７－Ｃ末端の領域内の連続する７個以上のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記抗体又はそのフラグメントが、配列番号２７３又は配列番号２６６又は配列番号２７０又は配列番号２７２又は配列番号２６９で表されるアミノ酸配列、或いは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＣＡＰＲＩＮ－１の部分ポリペプチド、又は連続する７～１２以上のアミノ酸残基を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントである、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 　前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記抗体又はそのフラグメントが、以下の（ａ）～（ｙ）のいずれかである、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
    　（ａ）配列番号３７，３８及び３９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と配列番号４１、４２及び４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｂ）配列番号４７，４８及び４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号５１，５２及び５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｃ）配列番号５７，５８及び５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号６１，６２及び６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｄ）配列番号６７，６８及び６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号７１，７２及び７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｅ）配列番号７７，７８及び７９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号８１，８２及び８３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｆ）配列番号８７，８８及び８９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号９１，９２及び９３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｇ）配列番号９７，９８及び９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１０１，１０２及び１０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｈ）配列番号１０７，１０８及び１０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１１１，１１２及び１１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｉ）配列番号１１７，１１８及び１１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２及び１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｊ）配列番号１２７，１２８及び１２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１２１，１２２及び１２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｋ）配列番号１３２，１３３及び１３４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１３６，１３７及び１３８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｌ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１４６，１４７及び１４８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｍ）配列番号１４２，１４３及び１４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１５２，１５３及び１５４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｎ）配列番号１５７，１５８及び１５９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１６１，１６２及び１６３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｏ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７１，１７２及び１７３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｐ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１７７，１７８及び１７９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｑ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８２，１８３及び１８４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｒ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１８７，１８８及び１８９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｓ）配列番号１６７，１６８及び１６９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号１９２，１９３及び１９４のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｔ）配列番号１９７，１９８及び１９９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２０１，２０２及び２０３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｕ）配列番号２０７，２０８及び２０９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２１１，２１２及び２１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｖ）配列番号２１７，２１８及び２１９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２２１，２２２及び２２３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｗ）配列番号２２７，２２８及び２２９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２３１，２３２及び２３３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｘ）配列番号２３７，２３８及び２３９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２４１，２４２及び２４３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
    　（ｙ）配列番号２４７，２４８及び２４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域と配列番号２５１，２５２及び２５３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント
  8. 　前記抗体又はそのフラグメントが、抗腫瘍剤とコンジュゲートされている、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを組み合わせて含む、組み合わせ医薬品。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物又は請求項９に記載の組み合わせ医薬品を被験者に投与することを含む、膵臓癌の治療及び／又は予防方法。
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