WO2012147965A1 - 生物材料を透明化する方法、及びその利用 - Google Patents

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urea
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solution
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宮脇　敦史
裕 濱
裕 黒川
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method for making a biological material transparent and its use.
  • a pretreatment (clearing treatment) using a clearing reagent is performed.
  • a tissue-clearing-method is known as a typical one. All of these are used for the purpose of observing fluorescent substances present in the tissue by making the tissue transparent.
  • an organic solvent is indispensable as an active ingredient for the clarification treatment, so that it is difficult to use it in a living tissue, and there is a problem that the application target is limited to an immobilized sample. In addition, there is a problem that the biological material to be transparentized can be contracted.
  • urea is a component with excellent biocompatibility
  • the above problem can be solved by using urea or a urea derivative as an effective component for the clarification treatment.
  • the inventors of the present application have further started to develop a more efficient biological material clarification method using urea or urea derivatives.
  • the present invention has been made in order to solve the above-described problems, and an object thereof is to provide a more efficient method for transparentizing a biological material using a component having excellent biocompatibility and use thereof.
  • a first infiltration step of infiltrating a biological material with a solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and a urea derivative at a predetermined concentration A second infiltration step of infiltrating the biological material with a solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives at a higher concentration than the solution used in the first infiltration step; It is characterized by that.
  • the clearing method according to the present invention further includes a solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives at a lower concentration than the solution used in the second infiltration step following the second infiltration step. May include a third infiltration step for infiltrating the biological material.
  • the solution used in the first infiltration step and the solution used in the third infiltration step contain the compound in substantially the same concentration.
  • the solution used in the first infiltration step and the solution used in the third infiltration step are preferably the same solution.
  • any of the solutions used in the first infiltration step, the second infiltration step, and the third infiltration step performed as necessary in the above method contains urea as the compound. Is preferred.
  • At least one of the solutions used in the first infiltration step, the second infiltration step, and the third infiltration step performed as necessary is an aqueous solution.
  • At least one of the solutions used in the first infiltration step, the second infiltration step, and the third infiltration step performed as necessary includes a surfactant. Is preferred.
  • the surfactant is preferably a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant is selected from the group consisting of TritonX (registered trademark), Tween (registered trademark), and NP-40 (trade name). It is preferable to be at least one kind.
  • the aqueous solution preferably further contains a water-soluble polymer compound.
  • the clarification method according to the present invention is the above-described method, wherein at least one of the solutions used in the first infiltration step, the second infiltration step, and the third infiltration step which is performed as necessary is further glycerol, carboxy It is preferable to include at least one selected from the group consisting of vinyl polymer, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, and macrogol.
  • the transparent method according to the present invention is preferably a method for transparentizing a tissue or organ derived from a multicellular animal or a multicellular animal excluding humans as the biological material in the above method.
  • the clarification method according to the present invention is such that the concentration of the compound in the solution used in the first infiltration step is in the range of 2.5 M to 5.5 M, and the second infiltration step. It is preferable that the concentration of the compound in the solution used in 1 is in the range of 6M to 8.5M.
  • the biological material clearing treatment kit includes a first solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and a urea derivative at a predetermined concentration, and urea and a higher concentration than the first solution. And a second solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea derivatives.
  • the first solution has a urea concentration of 2.5 M or more and 5.5 M or less and a surfactant of 0.025 (w / v)%. It is preferable to contain each at a concentration within the range of 5 (w / v)% or less.
  • the second solution contains urea at a concentration in the range of 5.5 M to 8.5 M and a surfactant of 0.025 (w / v)%. It is preferable to contain each at a concentration within the range of 5 (w / v)% or less.
  • the first solution preferably contains at least one selected from the group consisting of glycerol, carboxyvinyl polymer, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, and macrogol.
  • the present invention has an effect that it is possible to provide a more efficient method for clarification of a biological material using a component excellent in biocompatibility, and use thereof.
  • the clearing treatment method according to the present invention is a method for transparentizing a biological material, and includes a first infiltration step and a second infiltration step described below in this order. It is preferable that the clearing treatment method according to the present invention further includes a third infiltration step after the second infiltration step.
  • a solution containing a predetermined concentration of at least one compound selected from the group consisting of urea and a urea derivative (sometimes collectively referred to as a urea-based compound) (“clearing reagent for first biological material”) A first infiltration process that infiltrates into the material, 2) A solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and a urea derivative at a higher concentration than the solution used in the first infiltration step (“clearing reagent for second biological material”) is added to the biological material.
  • a second infiltration process that infiltrates in, 3) A solution containing at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives at a lower concentration than the solution used in the second infiltration step ("clarification reagent for third biological material") is added to the biological material.
  • the third infiltration process that infiltrates inside.
  • the biological material clearing treatment method according to the present invention infiltrates “biological material” in a predetermined order with “biological material clearing reagents” having different concentrations of urea-based compounds as active ingredients of the clearing treatment.
  • biological material clearing reagents having different concentrations of urea-based compounds as active ingredients of the clearing treatment.
  • the first infiltration step and the second infiltration step in this order, it is possible to achieve both suppression of an undesired volume change of the biological material and a significant reduction in the time required for the clearing treatment.
  • the third infiltration step it is possible to more reliably suppress an undesirable volume change of the biological material, and even when the ambient temperature is low (when cold), the urea compound The possibility of damaging the biological material due to the occurrence of crystal precipitation or the like can be more reliably suppressed.
  • the first infiltration step is a step of infiltrating the first biological material clearing reagent into the biological material. More specifically, for example, the “biological material clearing reagent” is infiltrated into the “biological material” in a container for clearing treatment.
  • the treatment temperature at which the first infiltration step is performed is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the treatment time for performing the first infiltration step is not particularly limited, but is preferably within a range of 2 hours or longer and within 1 month, and more preferably within a range of 12 hours or longer and within 3 days.
  • the pressure which performs a transparency process is not specifically limited.
  • the concentration of the urea compound contained in the first biological material clearing reagent is not particularly limited as long as it is lower than the concentration of the urea compound contained in the second biological material clearing reagent.
  • the concentration of the urea compound is preferably in the range of 1M to 5.5M, more preferably in the range of 2.5M to 5.5M, and more preferably to 3.5M. More preferably, it is in the range of 4.5M or less, and particularly preferably in the range of 3.7M or more and 4.3M or less.
  • the “concentration of urea-based compound” refers to the total concentration of urea-based compounds as essential active ingredients to be clarified when plural types of urea-based compounds are included in the clarification reagent for biological materials. .
  • the second infiltration step is a step of infiltrating the clearing reagent for the second biological material into the biological material. More specifically, for example, the “biological material clearing reagent” is infiltrated into the “biological material” in a container for clearing treatment.
  • the second biological material clearing reagent contains a urea-based compound for the biological material by containing the urea-based compound in a higher concentration than the first biological material clearing reagent and the third biological material clearing reagent used as necessary. It is estimated to promote the penetration of
  • the treatment temperature at which the second infiltration step is performed is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the treatment time for performing the second infiltration step is not particularly limited, but is preferably within a range of 2 hours or longer and within 1 month, and more preferably within a range of 12 hours or longer and within 3 days.
  • the pressure which performs a transparency process is not specifically limited.
  • the concentration of the urea compound contained in the clearing reagent for the second biological material is not particularly limited as long as it satisfies the premise that the concentration of the urea compound contained in the clearing reagent for the first biological material is higher than the concentration of the urea compound.
  • it satisfies the premise and is preferably in the range of 5.5M or more and 8.5M or less, more preferably 6M or more and 8.5M or less, and more preferably 6.5M or more and 8M or less. More preferably, it is within the range of 0.5M or less, and particularly preferably within the range of 7.7M or more and 8.2M or less.
  • the clearing reagent for the second biological material preferably contains the urea compound at a concentration higher by 2M or higher, and at a concentration higher by 3M or higher. More preferably, the urea-based compound is included, and the urea-based compound is more preferably included at a concentration of 3.5 M or more.
  • the 3rd infiltration process performed as needed is a process of infiltrating said transparent reagent for 3rd biological materials in a biological material. More specifically, for example, the “biological material clearing reagent” is infiltrated into the “biological material” in a container for clearing treatment.
  • the treatment temperature at which the third infiltration step is performed is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the treatment time for performing the third infiltration step is not particularly limited, but is preferably within a range of 2 hours or longer and within 1 month, and more preferably within a range of 12 hours or longer and within 3 days.
  • the pressure which performs a transparency process is not specifically limited.
  • the concentration of the urea compound contained in the clearing reagent for the third biological material is not particularly limited as long as it is lower than the concentration of the urea compound contained in the clearing reagent for the second biological material.
  • the concentration of the urea compound is preferably in the range of 1M to 5.5M, more preferably in the range of 2.5M to 5.5M, and more preferably to 3.5M. More preferably, it is in the range of 4.5M or less, and particularly preferably in the range of 3.7M or more and 4.3M or less.
  • the first biological material clearing reagent and the third biological material clearing reagent contain the urea compound at substantially the same concentration.
  • substantially the same concentration preferably means that the concentration difference is within 0.5M, more preferably within 0.3M, and even more preferably within 0.1M. Point to.
  • the first biological material clearing reagent and the third biological material clearing reagent are the same solution.
  • the order of storing the “biological material clearing reagent” and the “biological material” in the clearing treatment container is not particularly limited.
  • the “first biological material clearing reagent” is stored in the container, and then “biological material” is stored. .
  • the first biological material clearing reagent waste liquid, the second biological material clearing reagent storage in the container, the second biological material clearing reagent waste liquid, the third biological material clearing reagent into the container Processing is performed in the order of storage.
  • the processing container storing the biological material subjected to the transparent treatment used in each of the above infiltration steps may be stored, for example, at room temperature or in a low temperature environment until it is used for the observation step described later (cleared sample). Preservation step).
  • a solution containing “urea” is used as an essential active ingredient for clarifying the biological material.
  • a solution containing a “urea derivative” is used as an essential active ingredient for clarifying a biological material.
  • the type of the urea derivative is not particularly limited, but specifically, for example, various ureins or compounds represented by the following general formula (1).
  • a part of uraine is contained in the compound shown in General formula (1).
  • the clearing reagent for biological material used in the present invention may contain at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives as an active ingredient, and it is more preferable that urea is contained among them. .
  • R1, R2, R3, and R4 are each independently a hydrogen atom (however, when all of R1 to R4 are hydrogen atoms, they are excluded because they correspond to urea itself), halogen An atom or a hydrocarbon group, and when there are a plurality of carbon atoms constituting the hydrocarbon group, a part of the carbon atom may be substituted with a heteroatom such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. Good.
  • the hydrocarbon group include a chain hydrocarbon group and a cyclic hydrocarbon group.
  • Examples of the chain hydrocarbon group include a chain alkyl group, a chain alkenyl group, and a chain alkynyl group.
  • the number of carbon atoms constituting the chain hydrocarbon group is not particularly limited, and examples thereof include a straight chain or branched chain having 6 or less, preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom, for example.
  • Examples of chain alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, hexyl, octyl and the like.
  • Examples of the cyclic hydrocarbon group include a cycloalkyl group and a cycloalkenyl group.
  • the cyclic hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom.
  • Examples of the cycloalkyl group include those having 3 or more carbon atoms, preferably 6 or less, such as a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • Examples of the cycloalkenyl group include those having 3 or more carbon atoms, preferably 6 or less, such as a cyclohexenyl group.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • urea derivative represented by the general formula (1) are as shown in the following 1) to 2).
  • Any three groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining one group is a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining one group is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • Any two groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining two groups are each independently a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining two groups are each an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • it is more preferable that one of the two groups to be a hydrogen atom is selected from any of R1 and R2, and the other is selected from any of R3 and R4.
  • Urea is a component derived from a living body having extremely low toxicity. Therefore, the “clearing reagent for biological material” used in the present invention can be used not only for 1) immobilized biological material, but also for clarification of non-immobilized (live) biological material. 2) Urea has relatively little damage to the fluorescent protein and disappearance of the fluorescence, and it can be applied to observation of biological materials using the fluorescent protein. 3) Urea is extremely inexpensive and easily available, and is excellent in handleability, so that it can be transparentized at a very low cost and with a simple procedure.
  • the white matter layer which has been a barrier for deep observation until now, can be made transparent, and the region located deeper than the white matter layer (for example, the corpus callosum) can be observed.
  • the clearing treatment according to the present invention is reversible. Specifically, it is possible to return to the state before the clearing treatment only by immersing the biological material after the clearing treatment in the balanced salt solution. Since the antigenicity of the protein and the like is preserved before and after the clearing treatment, analysis using a normal tissue staining and immunostaining technique is possible.
  • the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention may contain a surfactant as necessary.
  • a nonionic surfactant is preferable because it gradually improves the penetration of the reagent into a biological tissue.
  • Nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, and polyoxyethylene sorbitan monooleate; fatty acid systems such as polyvinyl alcohol Higher alcohol type; alkylphenol type surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether.
  • TritonX® series such as TritonX-100 and TritonX-140
  • Tween® series such as Tween-20, Tween-40, Tween-60, and Tween-80
  • NP -40 trade name
  • two or more kinds of surfactants can be mixed and used as necessary.
  • the “clearing reagent for biological material” preferably contains a surfactant.
  • the said surfactant can improve the permeability
  • the clearing reagent for biological material contains a surfactant
  • the clearing reagent for the first biological material, the clearing reagent for the second biological material, and the clearing reagent for the third biological material used as necessary It is sufficient that at least one of the surfactants contains a surfactant.
  • the first to second biological material clearing reagents or the first to third biological material clearing reagents
  • substantially the same concentration means that the concentration difference is within 0.01 (w / v)%.
  • the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention may further contain a water-soluble polymer compound as necessary.
  • the polymer compound has a molecular weight of, for example, about 50,000 to 60,000 or more and does not substantially enter the cell.
  • the polymer compound is preferably one that does not cause denaturation of biological materials.
  • Specific examples of water-soluble polymer compounds include, for example, cross-linked sucrose polymer materials, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, or percoll (trade name: polymer material obtained by coating colloidal silica with a polyvinyl pyrrolidone film). Is mentioned.
  • cross-linked sucrose polymer substance specifically, a polymer substance having a weight average molecular weight of about 70,000 obtained by cross-linking (copolymerizing) sucrose with epichlorohydrin, such as Ficoll PM70 (trade name). Etc.
  • water-soluble polymer compounds unlike urea and urea derivatives, do not substantially penetrate into cells and are water-soluble, and thus are thought to contribute to the adjustment of the osmotic pressure difference inside and outside the cells. Therefore, it contributes to the maintenance of the prototype of the biological material to be transparentized, and in particular to the prevention of the expansion of the biological material.
  • the reagent preferably contains these water-soluble polymer compounds.
  • the “clearing reagent for biological material” contains the water-soluble polymer, the clearing reagent for the first biological material, the clearing reagent for the second biological material, and the third biological material used as necessary It is sufficient that at least one of the clarifying reagents contains the polymer. However, since the clearing reagent for the second biological material contains the urea-based compound at a higher concentration than the clearing reagent for the first and third biological materials, at least the first from the viewpoint of more reliably suppressing the swelling of the biological material. It may be preferred that the biliary material clearing reagent comprises the water-soluble polymer compound.
  • first to second biological material clearing reagents or the first to third biological material clearing reagents all contain the above-mentioned polymer, it is preferable that both contain the same polymer. More preferably, the polymer is contained at substantially the same concentration. Here, “substantially the same concentration” means that the concentration difference is within 0.01M.
  • the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention contains, as necessary, at least one compound selected from glycerol, carboxyvinyl polymer, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, and macrogol as “drying inhibiting component”.
  • drying inhibiting component prevents the drying of the biological material to be subjected to the clearing treatment.
  • the reagent of the present invention contains the above-mentioned drying inhibiting component. It is preferable to contain.
  • the above-described dryness-suppressing components adjust the osmotic pressure of the biological material clearing reagent and also show an effect of suppressing the swelling of the biological material to some extent.
  • the “clearing reagent for biological material” includes the above-described drying inhibitor components, the clearing reagent for the first biological material, the clearing reagent for the second biological material, and the third biological material used as necessary It suffices that at least one of the clarifying reagents contains the drying inhibiting component. Moreover, in addition to the drying suppression effect, the above-mentioned drying suppression is applied only to the first biological material clearing reagent and the third biological material clearing reagent to be used as necessary from the viewpoint of suppressing slight swelling of the biological material. Ingredients may be added.
  • any of the first to second biological material clearing reagents includes the above-described drying inhibiting component
  • all of them may include the same drying inhibiting component.
  • the same drying inhibiting component is contained at substantially the same concentration.
  • the “clearing reagent for biological material” used in the present invention is, for example, a pH adjuster. And additives such as an osmotic pressure adjusting agent may be included as necessary.
  • the “clearing reagent for biological material” used in the present invention is a solution containing a solvent in which urea is soluble.
  • the type of the solvent is not particularly limited as long as urea is soluble, but it is preferable to use water as the main solvent, and it is particularly preferable to use only water as the solvent.
  • “use water as the main solvent” means that the proportion of the volume of water in the total solvent used is the largest compared to other solvents, and preferably the total solvent used. The amount of water used is more than 50% and not more than 100% of the total volume.
  • a “biological material clearing reagent” prepared using water as a main solvent is referred to as a “biological material clearing reagent” as an aqueous solution.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • water for example, dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • effects such as improvement of the permeability of the reagent to the biological material and promotion of the clearing treatment of the tissue having a keratinous surface are expected.
  • Main advantages of using water as a solvent are as follows. 1) Since urea, which is an active ingredient of the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention, is excellent in solubility in water, the preparation of the clearing reagent for biological material is easy and inexpensive. 2) Compared with the case where an organic solvent is used as the main solvent, the biological material to be treated is not dehydrated during the clarification treatment. Therefore, the problem that the biological material contracts can be suppressed. 3) Compared with the case where an organic solvent is used as the main solvent, the possibility of damaging the fluorescent protein is significantly reduced. Therefore, the biological material that has undergone the clearing treatment can be observed using the fluorescent protein.
  • the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention may be a buffer solution capable of maintaining a pH suitable for a biological material to be transparentized.
  • the “clearing reagent for biological material” according to the present invention does not cause deformation of the biological material to be transparentized, and its osmotic pressure is such that urea penetrates sufficiently into the biological material. It may be adjusted.
  • the “clearing reagent for biological material” is an aqueous solution
  • the clearing reagent for the first biological material, the clearing reagent for the second biological material, and the clearing reagent for the third biological material is an aqueous solution, Good.
  • it is preferable that all of the first to second biological material clearing reagents (or the first to third biological material clearing reagents) are aqueous solutions.
  • the content of “urea” in the above-mentioned “clearing reagent for biological material” used in the present invention is not particularly limited as long as the biological material clearing treatment advances.
  • the upper limit of the content of “urea”, that is, the upper limit of the urea content in the clarifying reagent for the second biological material is determined by the solubility of urea in the solvent used.
  • the treatment time is lengthened, and the urea content is relatively high. The required transparency can be performed by shortening the processing time.
  • the “surfactant” when used, its content is not particularly limited, but it is preferably contained at a concentration in the range of 0.025 (w / v)% to 5 (w / v)%. , 0.05 (w / v)% or more and 0.5 (w / v)% or less, and more preferably 0.05 (w / v)% or more and 0.2 (w / V) It is particularly preferred to contain at a concentration within the range of% or less.
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the surfactant to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”.
  • the “water-soluble polymer compound” when used, its content is not particularly limited, but it is contained at a concentration in the range of 2.5 (w / v)% to 40 (w / v)%. It is preferable.
  • the content is a concentration in the range of 5 (w / v)% to 25 (w / v)%. More preferably, it is contained at a concentration in the range of 10 (w / v)% or more and 20 (w / v)% or less, more preferably 10 (w / v)% or more and 15 (w / v).
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the “water-soluble polymer compound” to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”. It is.
  • the content is not particularly limited, but it is contained at a concentration in the range of 2.5 (w / v)% to 20 (w / v)%. Preferably, it is contained at a concentration within the range of 5 (w / v)% to 15 (w / v)%, more preferably 8 (w / v)% to 12 (w / v)%. It is particularly preferable to include it at a concentration within the range.
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the “drying suppression component” to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”.
  • the kind of the biological material to be subjected to the clearing treatment using the above-mentioned “clearing reagent for biological material” is not particularly limited, but a plant-derived material or an animal-derived material is preferable, and fish, amphibians, reptiles, birds or mammals are preferable.
  • An animal-derived material such as (mammal) is more preferred, and a mammal-derived material is particularly preferred.
  • the type of mammal is not particularly limited, but laboratory animals such as primates excluding mice, rats, rabbits, guinea pigs and humans; pets such as dogs and cats (pets); domestic animals such as cows and horses; humans; Is mentioned.
  • the biological material may be an individual itself (excluding a living human individual itself) or an organ, tissue, or cell obtained from an individual of a multicellular organism. Since the “clearing reagent for biological material” used in the present invention has excellent clearing ability, the biological material excludes a tissue or organ derived from a multicellular animal (for example, the whole brain or a part thereof) or a human. The clearing treatment can be applied even to an individual (for example, an embryo) of a multicellular animal itself.
  • the biological material may be a material that has been fixed for microscopic observation, or may be a material that has not been fixed.
  • an immobilized material it is preferable to perform a treatment that is sufficiently immersed in a 20 (v / w)% sucrose-PBS solution (for example, 24 hours or more) after the immobilization treatment.
  • the material is preferably embedded in OCT compund, frozen in liquid nitrogen, thawed in PBS, and fixed again with 4 (v / w)% PFA-PBS solution.
  • the biological material is, for example, a biological tissue injected with a fluorescent chemical substance, a biological tissue stained with a fluorescent chemical substance, a biological tissue transplanted with cells expressing a fluorescent protein, or a fluorescent protein expressed It may be a living tissue of a genetically modified animal.
  • the preparation method of “clearing reagent for biological material” used in the present invention includes “urea and / or urea derivative”, and “surfactant”, “water-soluble polymer compound”, and “ It is prepared by dissolving the “drying inhibiting component” and the like in a solvent.
  • the procedure for dissolving or mixing in the solvent is not particularly limited.
  • observation process of transparent biological material The biological material that has been subjected to the clearing treatment is then subjected to an observation step using an optical microscope, for example. If necessary, the biological material to be subjected to the observation process may be subjected to a visualization process such as staining or marking before the transparentization process or after the transparentization process and before the observation process. .
  • the fluorescent protein gene is introduced into a living biological material before the transparentization processing step to express the fluorescent protein.
  • a visualization process step when the injection of a fluorescent chemical substance (excluding fluorescent protein) into a biological material or the staining of a biological material using a fluorescent chemical substance, the above transparentization process step is performed in advance. Although it is preferable to carry out, it can also carry out after the said transparentization process process. Furthermore, as a visualization process step, staining using a chemical substance other than the fluorescent chemical substance can be performed.
  • the observation process can be performed using any kind of optical microscope.
  • the observation step can be performed by applying a three-dimensional super-resolution microscope technique (for example, STED, 3D PALM, FPALM, 3D STROM, and SIM).
  • the observation step is preferably performed by applying a multiphoton excitation type (generally, a two-photon excitation type) optical microscope technique.
  • the biological material subjected to the clearing treatment can be returned to the state before the clearing treatment by removing the components of the biological material clearing reagent by, for example, immersing in a balanced salt solution.
  • the balanced salt solution specifically refers to, for example, a balanced salt solution buffered with a phosphate such as PBS or HBSS; a balanced salt solution (TBS) buffered with Tris hydrochloride; an artificial cerebrospinal fluid. (ACSF); basal media for cell culture such as MEM, DMEM, and Ham's F-12;
  • the protein contained in the biological material is denatured. do not do. Therefore, the antigenicity of proteins and the like contained in biological materials is preserved without change. Therefore, for example, after making a biological material transparent and observing it with an optical microscope, the biological material is returned to the state before the transparent treatment and a detailed analysis using a general tissue staining or immunostaining technique is performed. It can also be done.
  • the “clearing treatment kit for biological material” includes a first solution containing the urea compound at a predetermined concentration and a second solution containing the urea compound at a higher concentration than the first solution.
  • the first solution corresponds to the clearing reagent for the first and third biological materials
  • the second solution corresponds to the clearing reagent for the second biological material.
  • the “biological material clarification treatment kit” contains the urea compound at a lower concentration than the second solution. You may provide the 3rd solution from which a composition differs.
  • the “clearing treatment kit for biological material” further includes a “processing container”, a “biological material gripping device (tweezers, etc.)” used in the above-described transparentizing process, and a biological material after the transparentizing treatment before the transparentizing treatment.
  • You may provide at least one selected from the "balance salt solution” which returns to a state, and the "instruction manual of a kit.”
  • the clarification reagent for the first to second biological materials more preferably the first to third organisms, as described in the above section (Outline of clarification method), is preferable. The procedure of the clarification processing method using the clarification reagent for materials is described.
  • First solution (1) or third solution (1) An aqueous solution in which urea is dissolved in water at a concentration in the range of 2.5M to 5.5M. More preferably, the urea concentration is in the range of 3.5 M or more and 4.5 M or less, and more preferably, the urea concentration is in the range of 3.7 M or more and 4.3 M or less.
  • First solution (2) or third solution (2) In water, the concentration of urea is 2.5 M or more and 5.5 M or less, and a nonionic surfactant (for example, TritonX-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2. (W / v)% or less in concentration, and “drying inhibiting component (eg, glycerol)” is included at a concentration in the range of 8 (w / v)% to 12 (w / v)%.
  • First solution (3) or third solution (3) In water, the concentration of urea is 2.5 M or more and 5.5 M or less, and a nonionic surfactant (for example, TritonX-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2. (W / v)% or less in a range of “w / v)% or more and a concentration within the range of 8 (w / v)% or more and 12 (w / v)% or less” An aqueous solution containing “water-soluble polymer compound (for example, Ficoll)” at a concentration in the range of 5 (w / v)% to 25 (w / v)%.
  • a nonionic surfactant for example, TritonX-100
  • the urea concentration is in the range of 3.5 M or more and 4.5 M or less, and more preferably, the urea concentration is in the range of 3.7 M or more and 4.3 M or less.
  • -1st solution (4) or 3rd solution (4) In water, the concentration of urea is 2.5 M or more and 5.5 M or less, and a nonionic surfactant (for example, Triton X-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Second solution (1) An aqueous solution in which urea is dissolved in water at a concentration in the range of 5.5M to 8.5M. More preferably, the urea concentration is in the range of 6M or more and 8.5M or less, and more preferably, the urea concentration is in the range of 7.7M or more and 8.2M or less.
  • Second solution (2) In water, the concentration of urea is 5.5 M or more and 8.5 M or less, and a nonionic surfactant (for example, Triton X-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2.
  • a nonionic surfactant for example, Triton X-100
  • the first and third solutions (1) to (1) to (3) are used by using the urea derivative at the same concentration as the above urea. 4) and second solutions (1) to (2) may be prepared.
  • the biological material clarification treatment system comprises the “clearing reagent for biological material” used in the present invention and the isolated “biological material”, and clarifies the “biological material”. Therefore, the “biological material clearing reagent” has infiltrated into the “biological material”. That is, the said processing system is a concept including the processing system containing the biological material in the middle stage of a transparentization process, or the processing system containing the biological material which the transparentization process was completed for example.
  • the present invention will be described more specifically based on the following reference examples, examples, and comparative examples, but the present invention is not limited thereto.
  • the clearing reagent for biological material containing urea as an active ingredient shown in each Reference Example can be suitably used as the clearing reagent for first to third biological materials in the present invention.
  • the mouse skull was then removed and the hippocampus was carefully removed.
  • the excised hippocampus was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde-PBS, pH 7.4) overnight at 4 ° C. Thereafter, the hippocampus was transferred into a 20% sucrose-PBS solution and gently shaken in an environment of 4 ° C. for 24 hours.
  • the hippocampal tissue was completely replaced with 20% sucrose-PBS solution, embedded in OCT-compound, and frozen using liquid nitrogen.
  • the frozen hippocampus was transferred into PBS and thawed at room temperature.
  • the hippocampus after thawing was again fixed in 4% paraformaldehyde-PBS for 1 hour.
  • the clearing reagent for biological material is an aqueous solution in which 4M concentration urea is dissolved in pure water.
  • the clearing reagent for biological material is an aqueous solution in which 4M concentration urea is dissolved in pure water.
  • FIG. 2 a depth of about 2 mm covering the hippocampal surface, CA1, dentate gyrus (DG), and hippocampal base by performing the clearing treatment with the biomaterial clearing reagent according to this reference example. Clear observation was possible over (equivalent to the thickness of biological material).
  • FIG. 3 As shown in FIG. 3, by performing the clearing treatment with the biomaterial clearing reagent according to this reference example, the cerebral cortex and V-VI layer as well as the white matter region (corpus callosum) below the cerebral cortex, Furthermore, clear observation is possible over a depth of about 3 mm (operational limit of the objective lens) covering the cell group constituting CA1 and dentate gyrus (DG) beyond the fiber tract of the hippocampus. It was.
  • FIG. 4 As shown in FIG. 4, as compared with the control (shown as PBS in the figure), the treatment of 1) above (shown as SCALE-A2 in the figure) swells and the treatment of 2) above. As for what was done, swelling was suppressed according to the addition amount of Ficoll. In particular, by using a clearing reagent to which 20% (w / v) concentration of Ficoll was added, swelling was suppressed by 85% or more (shown as SCALE-A2 + 20% Ficoll in the figure).
  • cerebrum that is not swollen or retracted is particularly preferable, but a cerebrum that is swollen or retracted can also be used as a sample for observation with an optical microscope.
  • FIG. 5 by performing the clearing treatment using the biological material clearing reagent according to this reference example, the cerebral cortex and V-VI layer as well as the white matter region (corpus callosum) below the cerebral cortex are exceeded. Furthermore, clear observation over a depth of about 2.16 mm (operational limit of the objective lens) covering the cell group constituting CA1 etc. beyond the fiber tract of the hippocampus was possible.
  • the light transmittance was measured using a multi-channel detection PMA-2 (Hamamatsu Photonics). The measurement results are shown in FIG. As shown in the figure, 8M concentration urea aqueous solution, 4M concentration urea aqueous solution, clearing reagent SCALE-A2, and clearing reagent SCALE-D2 all have light transmittance of 80% or more, and water or PBS Unlike the treatment using, the effect of remarkable transparency treatment was achieved.
  • the fetus was encapsulated in an agarose gel (concentration 0.5% (w / v) or less) and observed with a fluorescent stereomicroscope (trade name: MZ10F: manufactured by Leica).
  • the working distance of the objective lens used for observation was 70 mm.
  • the mouse skull was then removed and the dentate gyrus of the hippocampus was carefully removed.
  • the extracted dentate gyrus of the hippocampus was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde-PBS, pH 7.4) overnight at 4 ° C. Thereafter, the dentate gyrus of the hippocampus was transferred into a 20% sucrose-PBS solution and gently shaken in an environment of 4 ° C. for 24 hours.
  • the dentate gyrus of the hippocampus was completely replaced with 20% sucrose-PBS solution, embedded in OCT-compound, and frozen using liquid nitrogen.
  • the frozen dentate gyrus of the hippocampus was transferred into PBS and thawed at room temperature.
  • the dentate gyrus of the hippocampus after thawing was again fixed in 4% paraformaldehyde-PBS for 1 hour.
  • the blood vessels of the dentate gyrus of the hippocampus used in this reference example are stained with a lectin-Texas Red conjugate.
  • the dentate gyrus of the hippocampus re-fixed was immersed in the biomaterial clearing reagent according to the present Reference Example for 3 days and shaken at room temperature.
  • the clearing reagent for biological material is an aqueous solution in which 4M urea, 0.1% (w / v) concentration Triton X-100, 10% (w / v) glycerol is dissolved in pure water.
  • the dentate gyrus of the hippocampus was enclosed in a thin film of agarose gel (concentration 0.5% (w / v) or less), and a laser with a wavelength of 920 nm was provided.
  • observation was performed with an upright two-photon microscope (trade name FV1000MPE: manufactured by Olympus).
  • the working distance of the objective lens used for observation was 2 mm.
  • observation was performed about 18 continuous visual fields from the hippocampal ventral surface to a depth of 1.7 mm, and the result of the observation was reconstructed as an integrated image.
  • FIG. 8 As shown in FIG. 8, by performing a clarification treatment using the biomaterial clarification reagent according to the present reference example, Fucci-S-Green (Fucci-S / G 2 / M) -positive neural stem cells are surrounded around the blood vessel. It was confirmed to be seen.
  • Rat strain Fisher (F344) 3 days after the transplantation of neural stem cells, was fixed according to the method described in Reference Example 8 (Whole body fixing step). Subsequently, the cerebral cortex of rat strain Fisher (F344) was fixed according to the method described in Reference Example 8 (Extraction and fixation of biological material). The rat cerebral cortex used in this reference example has its blood vessels stained with a lectin-Texas Red conjugate.
  • the cerebral cortex was observed according to the method described in the above Reference Example 8 (biological material clearing treatment and observation step).
  • the result of observation is shown in FIG.
  • neural stem cells expressing fluorescent protein Venus are stained in the vicinity of blood vessels (LectinLeTexas-Red conjugate) by clearing with the biological material clearing reagent according to this reference example. It was observed that they were gathering in This method is also suitable for observing cell migration and morphological changes after transplantation.
  • the clearing treatment was performed by immersing the cerebrum in the clearing treatment solution for 2 days.
  • the composition of the clearing treatment solution used in the BABB method was benzylalchol and benzylbenzoate (composition ratio of both: 1: 2).
  • the relative value of the fluorescence intensity derived from the fluorescent protein after each clearing treatment is shown with the fluorescence intensity derived from the fluorescent protein before the clearing treatment as 100.
  • the fluorescence intensity derived from the fluorescent protein was maintained at 80% or more in the clearing treatment with the SCALE-A2 reagent in all cases, but the fluorescence intensity derived from the fluorescent protein was not changed in the clearing treatment by the BABB method. In the case of, it was significantly attenuated.
  • Rabbit-derived anti-GFAP polyclonal antibody (Sigma) that recognizes intermediate filament GFAP (glial fibrillary acidic protein) was used as a primary antibody, reacted at 24C for 24 hours, and then rinsed with PBS.
  • anti-PSA-NCAM monoclonal antibody is an anti-mouse IgM antibody (Invitrogen, Molecular Probes) labeled with Alexa Fluor 546
  • GFAP polyclonal antibody is an anti-rabbit IgG antibody labeled with Alexa Fluor 633.
  • Immunohistochemical staining was performed by reacting at room temperature for 3 hours as Invitrogen (Molecular Probes). Since the fluorescence of these slices was not attenuated during this period, a triple fluorescence image including the fluorescence of GFP or YFP was obtained. The observation was performed with an 20 ⁇ objective lens (UplanApo20, Olympus) using an inverted confocal laser microscope (FV500, Olympus).
  • both pre-SCALE-A2 treatment Before SCALE in the figure
  • post-treatment After Recovery in the figure
  • nerve cells and mossy fibers extending from the cells to the CA3 region were stained without substantial problems.
  • astroglia was stained without any problem with the anti-GFAP polyclonal antibody.
  • Example 1 Observation of cerebrum
  • extraction and fixation of biological materials After thoracotomy was performed on a mouse that had been put to sleep by general anesthesia, a 4% paraformaldehyde-PBS solution was injected from the left ventricle to fix the whole body, and then the cerebrum was removed. The excised cerebrum was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde-PBS solution) and fixed for 8-12 hours. Thereafter, the cerebrum was immersed in a 20% sucrose-PBS solution for 2 days for complete replacement.
  • this cerebrum was embedded in OCT compound and frozen using liquid nitrogen. Then, the frozen cerebrum was thawed together with OCT compound in PBS. After changing the PBS and rinsing, the cerebrum was refixed with 4% paraformaldehyde-PBS for about 30 minutes.
  • the cerebrum after re-fixation was transferred into the biomaterial clarification reagent (SCALE-A2) shown in Reference Example 2 and shaken at room temperature for 2 days (first infiltration step).
  • SCALE-A2 biomaterial clarification reagent
  • Reagent B a biological material clearing reagent containing urea at a higher concentration and shaken at room temperature for 2 days (second infiltration step).
  • Reagent B is an aqueous solution in which 8 M concentration of urea and 0.1% (w / v) concentration of Triton X-100 are dissolved in pure water.
  • the cerebrum was then transferred into fresh SCALE-A2 solution and clarified by shaking at room temperature for 2-3 days (third infiltration step).
  • the amount of SCALE-A2 used and the amount of reagent B used per 1 g of cerebral wet weight was about 30 ml.
  • the processing time (approximately half of the time) compared with the case where the clearing treatment is performed using SCALE-A2 alone. Degree), the same degree of transparency could be achieved.
  • Example 2 Observation of hippocampus
  • the hippocampus of mice was observed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the clearing treatment was performed as follows. First, the re-fixed hippocampus was immersed in SCALE-A2 reagent (Reference Example 2) for 48 hours, shaken at room temperature (first infiltration step), and then immersed in Reagent B (Example 1) for 48 hours. And shaken at room temperature.
  • the hippocampus was placed on a substrate with a pattern, and the degree of transparency was determined by whether or not the pattern was seen through the hippocampus.
  • a re-fixed hippocampus was soaked in PBS for 96 hours and shaken at room temperature, and a hippocampus was soaked in SCALE-A2 reagent for 96 hours and shaken at room temperature.
  • FIG. 1 A shows the hippocampus treated with PBS (reference example), B shows the hippocampus treated with SCALE-A2 reagent (reference example), and C shows the hippocampus with SCALE-A2 reagent and reagent B. Is equivalent to the one processed (Example).
  • the degree of transparency was clearly higher in the example than in any reference example.
  • the hippocampus shown in C did not expand more than the hippocampus shown in B in the figure.
  • Example 3 Observation of brain slice
  • brain sections of mice were observed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the entire mouse brain was extracted and fixed and re-fixed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the clearing treatment was performed as follows. First, coronal slices (thickness 3 mm) including the hippocampus were prepared from the refixed brain. Next, the coronal slice was cut into a right hemisphere slice and a left hemisphere slice at the center line.
  • the coronal slice obtained in this way was subjected to a second observation step (see next paragraph). 3)
  • a transmission spectrum of light in a wavelength region of 300 nm to 920 nm of the above-mentioned coronal slice having a thickness of 1.5 mm was measured using a spectrophotometer (manufactured by Hitachi, product name: U-3310 Spectrophotometer).
  • a coronal slice (thickness 3 mm) containing the hippocampus was prepared from the refixed brain. Next, the coronal slice was cut into a right hemisphere slice and a left hemisphere slice at the center line. One hemispherical slice was immersed in SCALE-A2 reagent for 72 hours and shaken at room temperature to prepare a coronal slice having a thickness of 1.5 mm including the hippocampus.
  • FIG. “B” in the figure is the result of the first observation of this example
  • “B-A2 replaced” is the result of the second observation
  • “SCALE-A2” is the result of the reference example.
  • the degree of transparency was clearly increased (about twice) in the same or shorter processing time in the example than in the reference example.
  • SCALE-A2 reagent, reagent B, and water have almost the same transmission spectrum of light in the wavelength range of 300 nm to 920 nm.
  • the present invention can provide a more efficient biological material clarification method using components having excellent biocompatibility, and use thereof.

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Abstract

　本発明に係る生物材料の透明化方法は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む溶液を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、次いで、第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程を含んでなる。

Description

生物材料を透明化する方法、及びその利用
　本発明は、生物材料を透明化する方法、及びその利用に関する。
　光学顕微鏡を用いて不透明な組織内部を観察する際には、透明化試薬を用いた前処理（透明化処理）が行われる。
　透明化試薬及び前処理方法としては、例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載のAnn-Shyn ChiangによるFocus Clear（商品名）溶液、或いは非特許文献２に記載のHans-Ulrich Dodtらのtissue clearing methodが代表的なものとして知られている。これらは何れも、組織を透明化することで、組織中に存在する蛍光物質を観察する目的で使用される。
米国特許第６４７２２１６号公報（特許日２００２年１０月２９日）
Ann-Shyn Chiang et al.: Insect NMDA receptors mediate juvenile hormone biosynthesis. PNAS 99(1), 37-42 (2002). Hans-Ulrich Dodt et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4 (4), 331-336 (2007).
　上記の方法は何れも、透明化処理の有効成分等として有機溶剤が必須であるため、生組織に用いることは難しく、適用対象が専ら固定化サンプルに限定されるという問題がある。また、透明化処理の対象となる生物材料の収縮を引き起こしうるという問題がある。
　本発明に先立ち、本願発明者らは、尿素を用いれば、生物材料を透明化することが出来ることを見出している。尿素は、生物親和性に優れた成分であるため、透明化処理の有効成分として尿素又は尿素誘導体を用いれば、上記の問題を解決しうる。
　本願発明者らは、さらに、尿素又は尿素誘導体を用いた、より一層効率的な生物材料の透明化処理方法の開発という課題に着手した。
　本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、生物親和性に優れた成分を用いた、生物材料を透明化するより効率的な方法、及びその利用を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、有効成分たる尿素等の濃度が異なる溶液の組み合わせを用いることで、不所望な体積変化を抑制しつつ透明化処理をより効率的に行いうることを新たに見出し、本願発明を想到するに至った。
　すなわち、本発明に係る生物材料の透明化方法は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む溶液を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、次いで、第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程を含んでなる、ことを特徴としている。
　本発明に係る透明化方法は、さらに、第二浸潤工程に次いで、当該第二浸潤工程で用いた上記溶液より低濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第三浸潤工程を含んでいてもよい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが実質的に同濃度で上記化合物を含むことが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが同じ溶液であることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程、第二浸潤工程、及び、必要に応じて行なわれる第三浸潤工程で用いる溶液が何れも上記化合物として尿素を含むことが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程、第二浸潤工程、及び、必要に応じて行なわれる第三浸潤工程で用いる溶液の少なくとも一つが水溶液であることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程、第二浸潤工程、及び、必要に応じて行なわれる第三浸潤工程で用いる溶液の少なくとも一つが界面活性剤を含むことが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記水溶液が水溶性の高分子化合物をさらに含むことが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程、第二浸潤工程、及び、必要に応じて行なわれる第三浸潤工程で用いる溶液の少なくとも一つが、さらに、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記生物材料として、多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることが好ましい。
　本発明に係る透明化方法は、上記の方法において、上記第一浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であり、かつ、上記第二浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が６Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であることが好ましい。
　本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む第一溶液と、上記第一溶液より高濃度で、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む第二溶液と、からなることを特徴としている。
　本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、上記第一溶液が、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことが好ましい。
　本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、上記第二溶液が、尿素を５．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことが好ましい。
　本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、上記第一溶液が、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。
　本発明は、生物親和性に優れた成分を用いた、より効率的な生物材料透明化法、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
本発明の一参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理した結果を示す図である。 本発明の他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの大脳全体を処理した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬と、処理される生物材料の膨潤との関係性を示すグラフである。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの大脳全体を処理した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの脳切片を処理した後に、当該脳切片の光の透過率を測定した結果を示すグラフである。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの胎仔を処理した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理して神経幹細胞を観察した結果を示す図である。 尿素を有効成分とする生物材料用透明化試薬と従来技術（ＢＡＢＢ法）とでマウスの大脳を処理した結果を比較する図である。 尿素を有効成分とする生物材料用透明化試薬と従来技術（ＢＡＢＢ法）とで、各種蛍光タンパク質を発現したHeLa細胞を処理した結果を比較する図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬で、神経幹細胞が移植された大脳皮質を処理して観察した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、生物材料用透明化試薬で透明化処理をする前の生物材料と、透明化処理後に処理前の状態に回復させた生物材料とに対して行った免疫染色の結果を示す図である。 本発明の一実施例に関し、マウスの海馬を透明化処理した後に、当該海馬の光の透過を観察した結果を示す図である。 本発明の他の実施例に関し、マウスの脳切片を透明化処理した後に、当該脳切片の光の透過率を測定した結果を示す図である。 本発明のさらに他の参考例に関し、透明化処理の尿素濃度依存性を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　〔１．生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理方法〕
　（透明化処理方法の概要）
　本発明に係る透明化処理法は、生物材料を透明化する方法であって、以下に示す第一浸潤工程と第二浸潤工程とをこの順に含む方法である。本発明に係る透明化処理法は、さらに、第二浸潤工程の後に第三浸潤工程を含むことが好ましい。
１）尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物（尿素系化合物と総称する場合がある）を所定の濃度で含む溶液（「第一生物材料用透明化試薬」）を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、
２）第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液（「第二生物材料用透明化試薬」）を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程、
３）第二浸潤工程で用いた上記溶液より低濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液（「第三生物材料用透明化試薬」）を、上記生物材料中に浸潤する第三浸潤工程。
　なお、以下の説明では、第一生物材料用透明化試薬、第二生物材料用透明化試薬、及び第三生物材料透明化試薬を総称する場合は、単に「生物材料用透明化試薬」と称する。従って、単に「生物材料用透明化試薬」の説明としてなされる記載は、第一～第三生物材料透明化試薬に共通の説明に相当する。
　本発明にかかる生物材料の透明化処理方法は、透明化処理の有効成分たる尿素系化合物の濃度が異なる「生物材料用透明化試薬」を、「生物材料」に対して所定の順序で浸潤させる。このプロセスにより、生物材料の不所望な体積変化を抑制しつつ透明化処理に要する時間を大幅に短縮可能とすることを利点の一つとする。
　すなわち、上記第一浸潤工程及び第二浸潤工程をこの順序で行なうことで、生物材料の不所望な体積変化の抑制と、透明化処理に要する時間の大幅な短縮とを両立可能とする。必要に応じて、さらに上記第三浸潤工程を行なうことで、生物材料の不所望な体積変化をより一層確実に抑制可能となり、かつ周辺温度の低下時（寒冷時）であっても尿素系化合物の結晶析出等の発生によって生物材料が損傷する虞をより一層確実に抑制可能となる。
　（第一浸潤工程）
　第一浸潤工程は、上記第一生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第一生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
　上記の第一浸潤工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、第一浸潤工程を行う処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で１ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上で３日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
　上記第一生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度は、上記第二生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度より低ければ特に限定されない。ただし、当該尿素系化合物の濃度は、１Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であることが好ましく、２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であることがより好ましく、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であることがさらに好ましく、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内であることが特に好ましい。なお、本発明において、「尿素系化合物の濃度」とは、透明化する必須の有効成分としての尿素系化合物が、生物材料用透明化試薬中に複数種含まれる場合にはその合計濃度を指す。
　（第二浸潤工程）
　第二浸潤工程は、上記第二生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第二生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。第二生物材料透明化試薬は、第一生物材料透明化試薬、及び、必要に応じて用いる第三生物材料透明化試薬より高濃度で上記尿素系化合物を含むことによって、生物材料に対する尿素系化合物の浸透を促進すると推定される。
　上記の第二浸潤工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、第二浸潤工程を行う処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で１ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上で３日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
　上記第二生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度は、上記第一生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度より高いという前提を満たせば特に限定されない。ただし、当該前提を満たし、かつ、５．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であることが好ましく、６Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であることがより好ましく、６．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であることがさらに好ましく、７．７Ｍ以上で８．２Ｍ以下の範囲内であることが特に好ましい。また、第一生物材料用透明化試薬との濃度差という観点では、第二生物材料用透明化試薬の方が、２Ｍ以上高い濃度で上記尿素系化合物を含むことが好ましく、３Ｍ以上高い濃度で上記尿素系化合物を含むことがより好ましく、３．５Ｍ以上高い濃度で上記尿素系化合物を含むことがさらに好ましい。
　（第三浸潤工程）
　必要に応じて行われる第三浸潤工程は、上記第三生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第三生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
　上記の第三浸潤工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、第三浸潤工程を行う処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で１ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上で３日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
　上記第三生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度は、上記第二生物材料用透明化試薬に含まれる上記尿素系化合物の濃度より低ければ特に限定されない。ただし、当該尿素系化合物の濃度は、１Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であることが好ましく、２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であることがより好ましく、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であることがさらに好ましく、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内であることが特に好ましい。
　また、特に好ましい態様は、第一生物材料用透明化試薬と第三生物材料用透明化試薬とで、上記尿素系化合物を実質的に同濃度で含むことがより好ましい。ここで、実質的に同濃度とは、好ましくは濃度差が０．５Ｍ以内であることを指し、より好ましくは０．３Ｍ以内であることを指し、さらに好ましくは０．１Ｍ以内であることを指す。さらに他の態様では、第一生物材料用透明化試薬と第三生物材料用透明化試薬とが同一の溶液である。
　上記の第一浸潤工程～第三浸潤工程において、透明化処理用の容器内に「生物材料用透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されない。第一浸潤工程～第三浸潤工程を同一の容器内で連続的に行う場合の一例では、まず「第一生物材料用透明化試薬」を容器内に格納し、次いで「生物材料」を格納する。次いで、第一生物材料用透明化試薬の廃液、第二生物材料用透明化試薬の容器への格納、第二生物材料用透明化試薬の廃液、第三生物材料用透明化試薬の容器への格納、の順に処理を行う。また、必要に応じて、各浸潤工程の間で、容器及び生物材料を洗浄処理等する工程を設けてもよい。
　上記の各浸潤工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温又は低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。
　（生物材料用透明化試薬の有効成分）
　本発明では、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素」を含む溶液を用いる。本発明にかかる他の態様では、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素誘導体」を含む溶液を用いる。これら溶液は、上記「生物材料用透明化試薬」に相当する。
　上記尿素誘導体の種類は特に限定されないが具体的には例えば、各種のウレイン、又は、下記の一般式（１）に示す化合物である。なお、一般式（１）に示す化合物には一部のウレインが含まれる。本発明に用いる生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含んでいればよいが、これらの中で尿素を含むことがより好ましい。
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　一般式（１）に示す尿素誘導体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立に水素原子（但し、Ｒ１～Ｒ４の全てが水素原子の場合は尿素自体に相当するので除かれる）、ハロゲン原子、又は炭化水素基であり、炭化水素基を構成する炭素原子が複数個ある場合には当該炭素原子の一部が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子により置換されていてもよい。炭化水素基としては、鎖状炭化水素基、及び環状炭化水素基が含まれる。
　上記鎖状炭化水素基として、例えば、鎖状アルキル基、鎖状アルケニル基、及び鎖状アルキニル基等が例示される。鎖状炭化水素基を構成する炭素数は特に限定されないが、例えば、６以下の直鎖状又は分岐状のものが挙げられ、好ましくは炭素数が１～３のアルキル基である。鎖状炭化水素基は、例えば、ハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。鎖状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。
　上記環状炭化水素基として、例えば、シクロアルキル基、及びシクロアルケニル基等が例示される。環状炭化水素基は、例えばハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロヘキセニル基等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。
　上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　また、一般式（１）に示す尿素誘導体のより好ましい具体例は、以下の１）～２）に示す通りである。
１）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の３つの基が水素原子であり、残りの１つの基がハロゲン原子、又は炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの１つの基が、炭素数１～３、又は炭素数が１～２のアルキル基である。
２）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の２つの基が水素原子であり、残りの２つの基が互いに独立にハロゲン原子、又は炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの２つの基が何れも、炭素数１～３、又は炭素数が１～２のアルキル基である。なお、水素原子となる２つの基の一方はＲ１、Ｒ２の何れかから選ばれ、他方はＲ３、Ｒ４の何れかから選ばれることがより好ましい。
　（有効成分として尿素等を用いる利点）
　尿素は、毒性が極めて低い生体由来の成分である。そのため、本発明に用いる「生物材料用透明化試薬」は、１）固定化された生物材料はもとより、固定化されていない（生きた）生物材料の透明化にも用いうるものとなる。２）また、尿素は、蛍光タンパク質へのダメージ、及びその蛍光の消失が比較的少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用しうるものとなる。３）尿素は、極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順で透明化処理を行いうるものとなる。
　また、上記の利点に加えて、４）従来の生物材料用透明化試薬と比較して、光散乱性が高い不透明な生物材料の透明性を格段に向上させることができ、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。５）特に脳組織では、これまで深部観察のバリアーであった白質層を透明化することが可能となり、白質層より深部に位置する領域（例えば脳梁）の観察が可能となる。６）本発明にかかる透明化処理は可逆的である。具体的には、透明化処理後の生物材料を平衡塩類溶液に浸漬するのみで、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。透明化処理の前後においてタンパク質等の抗原性も変化せずに保存されるため、通常の組織染色、及び免疫染色の手法を用いた分析が可能である。
　なお、尿素に代えて上記した尿素誘導体を用いることによっても、同様の利点が得られうる。
　（界面活性剤）
　本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系；ポリビニルアルコール等の高級アルコール系；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、TritonX－100、及びTritonX-140等のTritonX（登録商標）シリーズ；Ｔween－20、Tween-40、Tween-60、及びTween-80等のＴween（登録商標）シリーズ；NP-40（商品名）；からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。界面活性剤は、必要に応じて、二種以上を混合して使用することもできる。
　これら界面活性剤は、尿素の、生物材料に対する浸透性を高め、透明化処理の効率を向上させうる。特に、脳組織の白質層等、のように、透明化処理が比較的困難な生物材料の透明化を行う場合には、「生物材料用透明化試薬」は界面活性剤を含むことが好ましい。
　なお、上記界面活性剤は、尿素に対するのと同様に、生物材料に対する尿素誘導体の浸透性を高めうる。
　「生物材料用透明化試薬」が界面活性剤を含む場合は、第一生物材料用透明化試薬、第二生物材料用透明化試薬、及び、必要に応じて用いる第三生物材料用透明化試薬の少なくとも一つが界面活性剤を含んでいればよい。ただし、第一～第二生物材料用透明化試薬（又は、第一～第三生物材料用透明化試薬）が何れも同じ界面活性剤を含むことが好ましく、同じ界面活性剤を実質的に同濃度で含むことがより好ましい。ここで、実質的に同濃度とは、濃度差が０．０１（ｗ／ｖ）％以内であることを指す。
　（水溶性の高分子化合物）
　本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて水溶性の高分子化合物をさらに含んでいてもよい。ここで、高分子化合物とは、分子量が例えば５万～６万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないものである。また、高分子化合物は、生物材料の変性等を引き起こさないものが好ましい。水溶性の高分子化合物として、具体的には、例えば、架橋型シュークロース高分子物質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はパーコール（商品名。コロイド状シリカをポリビニルピロリドン皮膜で被覆した高分子物質）等が挙げられる。架橋型シュークロース高分子物質として、具体的には例えば、フィコール（Ficoll）ＰＭ７０（商品名））のような、シュークロースをエピクロルヒドリンで架橋（共重合）した重量平均分子量約７万の高分子物質等が挙げられる。
　これら水溶性の高分子化合物は、尿素及び尿素誘導体とは異なり細胞内に浸入することが実質的になく、また水溶性であるから、細胞内外の浸透圧差の調整に寄与すると考えられる。そのため、透明化処理の対象となる生物材料の原型維持に寄与し、とりわけ、生物材料の膨張の防止に寄与する。特に限定されないが、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の浸透圧が比較的高い場合には、当該試薬はこれら水溶性の高分子化合物を含むことが好ましい。
　「生物材料用透明化試薬」が上記水溶性の高分子を含む場合は、第一生物材料用透明化試薬、第二生物材料用透明化試薬、及び、必要に応じて用いる第三生物材料用透明化試薬の少なくとも一つが当該高分子を含んでいればよい。ただし、第二生物材料用透明化試薬は、第一及び第三生物材料用透明化試薬より高濃度で上記尿素系化合物を含むため、生物材料の膨潤をより確実に抑制する観点では、少なくとも第二生物材料用透明化試薬が上記水溶性の高分子化合物を含むことが好ましい場合がある。なお、第一～第二生物材料用透明化試薬（又は、第一～第三生物材料用透明化試薬）が何れも上記高分子を含む場合は何れも同じ高分子を含むことが好ましく、同じ高分子を実質的に同濃度で含むことがより好ましい。ここで、実質的に同濃度とは、濃度差が０．０１Ｍ以内であることを指す。
　（その他の成分）
　本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、或いは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明の試薬は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。また、上記列挙した乾燥抑制成分は、生物材料透明化試薬の浸透圧を調節し、生物材料の膨潤をある程度抑制する効果も示す。
　「生物材料用透明化試薬」が上記列挙した乾燥抑制成分を含む場合は、第一生物材料用透明化試薬、第二生物材料用透明化試薬、及び、必要に応じて用いる第三生物材料用透明化試薬の少なくとも一つが当該乾燥抑制成分を含んでいればよい。また、乾燥抑制効果に加えて、生物材料の軽微な膨潤を抑制するという観点で、第一生物材料用透明化試薬、及び必要に応じて用いる第三生物材料用透明化試薬のみに上記乾燥抑制成分を添加する場合もある。なお、第一～第二生物材料用透明化試薬（又は、第一～第三生物材料用透明化試薬）が何れも上記乾燥抑制成分を含む場合は、何れも同じ乾燥抑制成分を含むことが好ましく、同じ乾燥抑制成分を実質的に同濃度で含むことがより好ましい。
　また、本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、上述した「尿素及び／又は尿素誘導体」、「界面活性剤」及び「水溶性の高分子化合物」以外に、例えば、ｐＨ調整剤、及び浸透圧調整剤等の添加剤を必要に応じて含んでいてもよい。
　（溶媒）
　本発明で用いる「生物材料用透明化試薬」は、尿素が可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、尿素が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された「生物材料用透明化試薬」を、水溶液としての「生物材料用透明化試薬」と称する。
　なお、水を主溶媒として用いた場合には、例えば、固定化した標本にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水と混合し用いてもよい。例えば固定化した標本にＤＭＳＯを混合して用いれば、生物材料に対する試薬の浸透性の向上、及び角質表面を有する組織の透明化処理促進等の効果が期待される。
　溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである。１）本発明に用いる上記「生物材料用透明化試薬」の有効成分である尿素は水への溶解性に優れているため、生物材料用透明化試薬の調製が容易かつ低コストとなる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。３）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。４）固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる。５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。６）有機溶剤を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
　また、本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液であってもよい。さらに、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料の変形を招来せず、かつ生物材料内に尿素が充分に浸透する程度に、その浸透圧が調整されていてもよい。
　なお、尿素誘導体に関しても、尿素と同様の上記溶媒を用いることができる。
　「生物材料用透明化試薬」が水溶液である場合は、第一生物材料用透明化試薬、第二生物材料用透明化試薬、及び第三生物材料用透明化試薬の少なくとも一つが水溶液であればよい。ただし、第一～第二生物材料用透明化試薬（又は、第一～第三生物材料用透明化試薬）が何れも水溶液であることが好ましい。
　（組成物の量的関係）
　本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」における「尿素」の含有量は、生物材料の透明化処理が進展する限りにおいて特に限定されない。なお、「尿素」の含有量の上限、すなわち第二生物材料用透明化試薬における尿素の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、「生物材料用透明化試薬」における尿素の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。
　また、「界面活性剤」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する界面活性剤の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　また、「水溶性の高分子化合物」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５(ｗ／ｖ)％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。また、生物材料の膨張抑制効果と透明化処理後の屈折率とのバランスという観点では、上記含有量は、５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で２０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で１５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「水溶性の高分子化合物」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　また、グリセロール等の「乾燥抑制成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５（ｗ／ｖ）％以上で２０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、５（ｗ／ｖ）％以上で１５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「乾燥抑制成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　（対象となる生物材料）
　上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
　また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、或いは細胞であってもよい。本発明で用いる「生物材料用透明化試薬」は優れた透明化処理能力を有するので、生物材料が、多細胞動物由来の組織又は器官（例えば、脳全体又はその一部）、或いはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても透明化処理を適用可能である。
　また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用に固定化（fixed）処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。なお、固定化された材料を用いる場合には、固定化処理後に、例えば２０（ｖ／ｗ）％ショ糖－ＰＢＳ溶液に、充分に（例えば、２４時間以上）浸漬する処理を行うことが好ましい。さらに、当該材料をOCT　compundに包埋して液体窒素で凍結後、ＰＢＳ中で解凍し、４（ｖ／ｗ）％ＰＦＡ－ＰＢＳ液で再度固定する処理を行うことが好ましい。
　上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
　（生物材料用透明化試薬の調製）
　本発明で用いる「生物材料用透明化試薬」の調製方法は、「尿素及び／又は尿素誘導体」、並びに、必要に応じて用いる「界面活性剤」、「水溶性の高分子化合物」、及び「乾燥抑制成分」等を、溶媒中に溶解することで調製される。溶媒中に溶解、又は混合する手順は特に限定されない。
　（透明化処理された生物材料の観察工程）
　透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、又は透明化処理工程後で観察工程前に、染色或いはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
　例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の事前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
　また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、又は蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、上記透明化処理工程の事前に行うことが好ましいが、上記透明化処理工程後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
　観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、３次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ　ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ　ＳＴＯＲＭ、及びＳＩＭ）を適用して行うこともできる。また、観察工程は、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行うことが好ましい。
　（その他の応用）
　上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、生物材料透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。ここで、平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液(TBS)；人工脳脊髄液(ACSF)；MEM, DMEM, 及びHam’s F-12などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
　上記「生物材料用透明化試薬」を用いた場合、透明化処理の前後において、或いは、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して光学顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して汎用の組織染色、又は免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことなども可能となる。
　〔２．生物材料用透明化処理キット、及び処理システム〕
　（生物材料用透明化処理キット）
　本発明にかかる「生物材料用透明化処理キット」は、上記尿素系化合物を所定の濃度で含む第一溶液と、当該第一溶液より高濃度で上記尿素系化合物を含む第二溶液とを備える。ここで、第一溶液は上記第一及び第三生物材料用透明化試薬に相当し、第二溶液は上記第二生物材料用透明化試薬に相当する。また、第一・第三生物材料用透明化試薬として異なるものを用いる場合、「生物材料用透明化処理キット」は、上記尿素系化合物を第二溶液より低濃度で含み、第一溶液とは組成が異なる第三溶液を備えていてもよい。
　「生物材料用透明化処理キット」は、さらに、上記の透明化処理工程で用いる「処理容器」、「生物材料把持器具（ピンセット等）」、透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す「平衡塩類溶液」、及び「キットの取扱説明書」から選択される少なくとも一つを備えていてもよい。なお、キットの取扱説明書には、例えは、上記（透明化処理方法の概要）欄に記載したような、第一～第二生物材料用透明化試薬、より好ましくは第一～第三生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理方法の手順等が記載されている。
　以下、第一溶液～第三溶液のより具体的な組成の一例を示す。これらの透明化試薬は、特に、マウス等の哺乳動物の脳全体、脳の一部（例えば、海馬、大脳全体又は大脳の一部）、及び胚を透明化処理する目的で、極めて好適である。
・第一溶液（１）、又は第三溶液（１）：
　水に、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で溶解した水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
・第一溶液（２）、又は第三溶液（２）：
　水に、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらに「乾燥抑制成分（例えば、グリセロール）」を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
・第一溶液（３）、又は第三溶液（３）：
　水に、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、「乾燥抑制成分（例えば、グリセロール）」を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらに「水溶性の高分子化合物（例えば、Ficoll）」を５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
・第一溶液（４）、又は第三溶液（４）：
　水に、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、ＴritonＸ－１００）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
・第二溶液（１）：
　水に、尿素を５．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で溶解した水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、６Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、７．７Ｍ以上で８．２Ｍ以下の範囲内である。
・第二溶液（２）：
　水に、尿素を５．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、６Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、７．７Ｍ以上で８．２Ｍ以下の範囲内である。
　なお、尿素に代えて尿素誘導体（又は尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合には、上記した尿素と同じ濃度で尿素誘導体等を用いて、上記第一・第三溶液（１）～（４）、及び第二溶液（１）～（２）を調製すればよい。
　（生物材料透明化処理システム）
　本発明に係る生物材料透明化処理システムは、本発明に用いる「生物材料用透明化試薬」と、単離された上記「生物材料」とを含んでなり、この「生物材料」を透明化するために当該「生物材料」の内部に「生物材料用透明化試薬」が浸潤したものである。すなわち、当該処理システムとは、例えば、透明化処理の途中段階にある生物材料を含む処理システム、又は、透明化処理が完了した生物材料を含む処理システムを包含する概念である。
　本発明について、以下の、参考例、実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。なお、各参考例に示す、尿素を有効成分として含む生物材料用透明化試薬は、本発明における第一～第三生物材料用透明化試薬として好適に使用できる。
　〔参考例１：海馬の観察〕
　（全身固定工程）
　神経系のニューロンに蛍光タンパク質ＹＦＰを発現したトランスジェニックマウス（ＹＦＰ－Ｈ　ｌｉｎｅ：米国Harvard大学　Josh Sanes教授より供与されたもの。[参考文献] Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000）の生後７－８週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷ＰＢＳを灌流した後、氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
　（生物材料の摘出及び固定工程）
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬を氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）に一晩、４℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬を、２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液中に移し２４時間、４℃の環境下で緩やかに振盪した。
　次いで、海馬の組織を２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液で完全に置換した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結後の海馬を、ＰＢＳ中に移し室温で解凍した。解凍後の海馬は、再び、４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ中で１時間再固定した。
　（生物材料の透明化処理及び観察工程）
　最後に、再固定した海馬を、本参考例に係る生物材料用透明化試薬に３日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、４Ｍ濃度の尿素を純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点（処理開始から３日後）で、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）中に海馬を封入し、９２０ｎｍの波長のレーザーを備えた正立型２光子顕微鏡（商品名FV1000MPE：オリンパス社製）で、海馬の基底側から表面側まで観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は２ｍｍであった。
　観察の結果は、図１に示す。図１に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ　Ｇｙｒｕｓ：ＤＧ）、ＣＡ１、及び海馬表面までをカバーした約１．９ｍｍの深度（生物材料の厚みに相当）にわたるクリアな観察が可能であった。
　〔参考例２：海馬の観察、及び試薬の検討〕
　上記（生物材料の透明化処理工程）で用いる生物材料用透明化試薬として、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液（ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬と呼称）を用いた点、及び、海馬の表面側から基底側へ観察を行った点以外は、上記参考例１と同じ方法に従い、マウスの海馬の観察を行った。
　観察の結果は、図２に示す。図２に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、海馬表面、ＣＡ１、歯状回（ＤＧ）、及び海馬基底までをカバーした約２ｍｍの深度（生物材料の厚みに相当）にわたるクリアな観察が可能であった。
　〔参考例３：大脳の観察〕
　以下の点１）～３）以外は、参考例１と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
１）　上記（生物材料の摘出及び固定工程）において大脳全体を摘出し、この大脳を固定したものを生物材料として用いた点。
２）　上記（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、参考例２と同一のＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬を生物材料用透明化試薬として用いた点。
３）　上記（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、作動距離が３ｍｍの対物レンズを用いて大脳の表面（大脳皮質）側から海馬側に向けて観察を行った点。
　観察の結果は、図３に示す。図３に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、大脳皮質、Ｖ－ＶＩ層はもちろん、大脳皮質下部の白質領域（corpus callosum）を越え、さらに海馬の繊維叢（fiber tract）を越えて、ＣＡ１及び歯状回（ＤＧ）等を構成する細胞群までをカバーした約３ｍｍの深度（対物レンズの作動限界）にわたるクリアな観察が可能であった。
　なお、従来の透明化試薬では、大脳皮質下部の白質領域を透明化することが出来なかったため、白質領域より深部の領域を観察することは不可能であった。
　〔参考例４：試薬の検討〕
　以下の条件に従い、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬が生物材料を膨潤させる程度の評価、及びＦｉｃｏｌｌを併用した膨潤抑制の効果について評価をした。
１）まず、透明化処理の期間を２日間とした以外は、参考例３に記載の方法に従い、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬を用いてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして、透明化処理後の大脳の体積を測定した。なお、透明化処理の期間を２日間確保すれば、マウスの大脳は、観察可能な程度に透明化されていた。
２）また、透明化試薬として、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬にＦｉｃｏｌｌを５％（ｗ／ｖ）濃度、或いは２０％（ｗ／ｖ）濃度、添加したものを用いた以外は、上記１）と同様にしてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして透明化処理後の大脳の体積をそれぞれ測定した。
３）コントロールとして、ＰＢＳ中に浸漬した直後（０日間）のマウスの大脳の体積を測定した。
　観察の結果は、図４に示す。図４に示すように、コントロール（図中でＰＢＳと示す）と比較して、上記１）の処理を行ったもの（図中でＳＣＡＬＥ－Ａ２と示す）は膨潤し、上記２）の処理を行ったものはＦｉｃｏｌｌの添加量に応じて膨潤が抑制された。特に、２０％（ｗ／ｖ）濃度のＦｉｃｏｌｌを添加した透明化試薬を用いることで、膨潤が８５％以上抑制された（図中でＳＣＡＬＥ－Ａ２＋２０％Ｆｉｃｏｌｌと示す）。
　なお、膨潤又は退縮が見られないものが特に好ましいが、膨潤又は退縮が見られた大脳も、光学顕微鏡観察用の試料として用いることは可能である。
　〔参考例５〕
　以下の点１）・２）以外は、参考例１と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
１）　（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロール、及び１０％（ｗ／ｖ）濃度のＦｉｃｏｌｌを純水に溶解した水溶液を生物材料用透明化試薬として用い、３日間の透明化処理を行った点。
２）　（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、作動距離が２ｍｍの対物レンズを用いて大脳の表面（大脳皮質）側から海馬側に向けて観察を行った点。
　観察の結果は、図５に示す。図５に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、大脳皮質、Ｖ－ＶＩ層はもちろん、大脳皮質下部の白質領域（corpus callosum）を越え、さらに海馬の繊維叢（fiber tract）を越えて、ＣＡ１等を構成する細胞群までをカバーした約２．１６ｍｍの深度（対物レンズの作動限界）にわたるクリアな観察が可能であった。
　なお、従来の透明化試薬では、大脳皮質下部の白質領域を透明化することが出来なかったため、白質領域より深部の領域を観察することは不可能であった。
　〔参考例６：光透過率の評価〕
　水、ＰＢＳ、８Ｍ濃度の尿素水溶液（透明化試薬）、４Ｍ濃度の尿素水溶液（透明化試薬）、透明化試薬ＳＣＡＬＥ－Ａ２（４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを含む水溶液）、及び透明化試薬ＳＣＡＬＥ－Ｄ２（４Ｍ濃度の尿素＋０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のＤＭＳＯを含む水溶液）、の各々で１日間処理を行ったマウス脳切片（厚さ６０μｍ）の大脳皮質部分を用いて、波長２００ｎｍ～１０００ｎｍの光の透過率を測定した。なお、光の波長帯２００ｎｍ～１０００ｎｍは、２光子顕微鏡観察で常用する励起波長領域と、観察対象となる蛍光タンパク質の主たる蛍光波長の波長領域との双方をカバーする。
　なお、光の透過率測定は、マルチチャンネル検出PMA-2（浜松ホトニクス社）を用いて行った。測定の結果は、図６に示す。同図に示すように、８Ｍ濃度の尿素水溶液、４Ｍ濃度の尿素水溶液、透明化試薬ＳＣＡＬＥ－Ａ２、及び透明化試薬ＳＣＡＬＥ－Ｄ２は何れも光の透過率が８０％以上であり、水又はＰＢＳを用いた処理とは異なり顕著な透明化処理の効果を奏した。
　〔参考例７：マウス胎仔の透明化処理〕
　Ｆｕｃｃｉ－Ｓ－Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ－Ｓ／Ｇ２／Ｍ）を発現するトランスジェニックマウス（理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。参考文献Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.）の胎生１３．５日目の胎仔を、４（ｖ／ｗ）％ PFA-PBSで２日固定後に２０（ｖ／ｗ）％ショ糖-PBS溶液に浸漬し、一旦凍結後に解凍を行った。この後、再び４（ｖ／ｗ）％PFA-PBSで1時間固定を行った。その後、参考例２に記載のＳＣＡＬＥ－Ａ２に７日間浸漬することで透明化処理を行った。
　次いで、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）中に上記胎仔を封入し、蛍光実体顕微鏡（商品名MZ10F：Leica社製）で観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離は70ｍｍであった。
　観察の結果は、図７に示す。同図に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、肝臓だけはやや黄色が残ったもののマウス胎仔の全身が顕著に透明になった。なお、同図中に示すｍｒ（Mounting rubber）は、マウス胎仔の頭部を支えるために用いたものである。
　〔参考例８：マウス海馬における神経幹細胞の観察〕
　（全身固定工程）
　Ｆｕｃｃｉ－Ｓ－Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ－Ｓ／Ｇ２／Ｍ）を発現するトランスジェニックマウス（理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。[参考文献] Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.）の生後６週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷ＰＢＳを灌流した後、氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
　（生物材料の摘出及び固定工程）
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬の歯状回を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬の歯状回を氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）に一晩、４℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬の歯状回を、２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液中に移し２４時間、４℃の環境下で緩やかに振盪した。
　次いで、海馬の歯状回を２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液で完全に置換した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結後の海馬の歯状回を、ＰＢＳ中に移し室温で解凍した。解凍後の海馬の歯状回は、再び、４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ中で１時間再固定した。
　なお、本参考例で用いた海馬の歯状回は、レクチン－テキサスレッド（Ｌｅｃｔｉｎ－Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）コンジュゲートによりその血管が染色されている。
　（生物材料の透明化処理及び観察工程）
　最後に、再固定した海馬の歯状回を、本参考例に係る生物材料用透明化試薬に３日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点（処理開始から３日後）で、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）の薄膜中に海馬の歯状回を封入し、９２０ｎｍの波長のレーザーを備えた正立型２光子顕微鏡（商品名FV1000MPE：Olympus社製）で観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は２ｍｍであった。また、観察は、海馬腹側表面から１．７ ｍｍの深さまで１８個の連続視野について行い、当該観察の結果を統合画像として再構成した。
　観察の結果は、図８に示す。図８に示すように、本参考例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、Ｆｕｃｃｉ－Ｓ－Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ－Ｓ／Ｇ２／Ｍ）陽性の神経幹細胞が血管周囲に見られることが確認された。
　〔参考例９：神経幹細胞移植の観察〕
　蛍光タンパクＶｅｎｕｓを発現させた大人のラット海馬由来の神経幹細胞を取得し、この神経幹細胞をラット系統Fisher（F344）（日本SLCより購入）の大脳皮質部分(第V層付近、深さ約1.7 mmの部位)に移植した。
　神経幹細胞の移植後、３日が経過したラット系統Fisher（F344）を、上記参考例８の（全身固定工程）に記載の方法に従い、固定をした。次いで、上記参考例８の（生物材料の摘出及び固定工程）に記載の方法に従い、ラット系統Fisher（F344）の大脳皮質を固定した。なお、本参考例で用いたラットの大脳皮質は、レクチン－テキサスレッド（Ｌｅｃｔｉｎ－Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）コンジュゲートによりその血管が染色されている。
　次いで、上記参考例８の（生物材料の透明化処理及び観察工程）に記載の方法に従い、大脳皮質の観察を行った。観察の結果は、図１１に示す。同図に示すように、本参考例に係る生物材料透明化試薬で透明化処理を行うことで、蛍光タンパクＶｅｎｕｓを発現した神経幹細胞が血管(Lectin Texas-Redコンジュゲートで染色されている)付近に集まっている様子が観察された。本方法は移植後の細胞の移動及び形態変化などを観察することにも適している。
　〔参考例１０：BABB法との比較（１）〕
　神経系に蛍光タンパク質ＹＦＰを発現したトランスジェニックマウス（ＹＦＰ－Ｈ　ｌｉｎｅ：米国Harvard大学　Josh Sanes教授より供与されたもの。参考文献： Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000）の生後１２週齢のものから大脳を摘出して、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬（参考例２参照）を用いた透明化処理と、非特許文献２に記載のＤｏｄｔらによるベンジルベンゾエート／ベンジルアルコール（benzylbenzoate / benzylalchol (BABB)）法による透明化処理との比較を行った。
　なお、透明化処理は、何れも２日間、大脳を透明化処理液に浸漬することにより行った。また、上記ＢＡＢＢ法で用いた透明化処理液の組成は、benzylalchol、およびbenzylbenzoate（両者の組成比＝1：2）であった。
　結果を図９に示す。同図中で、Transmissionと示す列及びＹＦＰと示す列の上段はＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬による処理結果であり、下段はＢＡＢＢ法による処理である。なお、「Transmission」は透過型顕微鏡による観察結果を、「ＹＦＰ」は蛍光顕微鏡を用いたＹＦＰからの蛍光を観察した結果を示す。
　図９に示すように、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬による透明化処理では、ＹＦＰが発する蛍光を明確に観察することが可能であった。一方、ＢＡＢＢ法による透明化処理を行った大脳は著しく縮小し、かつＹＦＰからの蛍光が著しく減弱した。
　〔参考例１１：BABB法との比較（２）〕
　各種の蛍光タンパク質をコードする遺伝子をHeLa細胞（東京大学医科学研究所より分与されたもの。Scherer et al., J. Exp. Med. 97(5):695-710, 1953）に導入して対応する蛍光タンパク質を発現させた。ここで、発現させた蛍光タンパク質は、ＳＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＡＧ１、Ｖｅｎｕｓ、及びＤｓＲｅｄである。ＥＧＦＰおよび ＤｓＲｅｄはClontech社より購入。ｍＡＧ１はMBL社より購入。ＶｅｎｕｓおよびＳＥＣＦＰは理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームがGFPをもとに遺伝子的に変異を導入し作製した。参考文献：SECFP, Hadjantonakis et al., BMC Biotechnol., 2:11, 2002.: EGFP, Zhang et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 227: 707-711, 1996.: Venus, Nagai et al., Nat. Botech., 20: 87-90, 2002.: mAG1, Karasawa et al., J. Biol. Chem., 278(36): 34167-34171, 2003.: Baird et al., PNAS., 97(22): 11984-11989, 2000.。
　次いで、参考例１０と同様にして、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬（参考例２参照）を用いた透明化処理と、非特許文献２に記載のＤｏｄｔらによるベンジルベンゾエート／ベンジルアルコール（benzylbenzoate / benzylalchol (BABB)）法による透明化処理とを行い、両者を比較した。
　観察の結果は、図１０に示す。同図では、透明化処理前の蛍光タンパク質由来の蛍光強度を１００とした、各透明化処理後の蛍光タンパク質由来の蛍光強度の相対値を示している。図１０より明らかな通り、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬による透明化処理では蛍光タンパク質由来の蛍光強度は何れの場合も８０％以上維持されたが、ＢＡＢＢ法による透明化処理では蛍光タンパク質由来の蛍光強度は何れの場合も顕著に減弱させた。
　〔参考例１２：透明化処理後の組織の回復〕
　ＧＦＰトランスジェニックマウスおよびＹＦＰトランスジェニックマウス(GFP-M lineおよびYFP-H line, 米国ハーバード大学Josh Sanes教授より供与されたもの)の海馬より2.5 ｍｍ厚のスライスを作製し、一旦ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬（参考例２参照）による透明化処理を５日間行って透明化した後、ＰＢＳで３回リンスして不透明状態の組織に戻した際の免疫染色性を、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬による透明化処理前のものと比較した。
　免疫染色には幼若な神経細胞の表面に存在するPSA-NCAMのポリシアル酸を認識するマウス由来抗PSA-NCAM（polysialilated neural cell adhesion molecule）モノクローナル抗体(Millipore社)と、アストログリアに特異的な中間径フィラメントGFAP（glial fibrillary acidic protein）を認識するウサギ由来抗GFAPポリクローナル抗体(Sigma社)とを１次抗体として用い、２４時間４℃で反応させた後にＰＢＳでリンスした。その後、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体は、Alexa Fluor 546で標識された抗マウスIgM抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）を、GFAPポリクローナル抗体はAlexa Fluor 633で標識された抗ウサギIgG抗体を２次抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）として室温で３時間反応させることで免疫組織染色を行った。これらのスライスの蛍光はこの間減衰することはなかったため、ＧＦＰあるいはＹＦＰの蛍光を含めた３重蛍光像が得られた。観察は倒立型共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus社)を用いて２０倍の対物レンズ(UplanApo20, Olympus社)により行った。
　図１２に示すように、ＳＣＡＬＥ－Ａ２の処理前（図中でBefore SCALE）、処理後（図中でAfter Recovery）ともに、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体によって、海馬歯状回に存在する幼若な神経細胞とその細胞からCA3領域へと伸長した苔状線維とが実質的な問題なく染色された。また同様に、抗GFAPポリクローナル抗体によって、アストログリアも問題なく染色された。
　〔実施例１：大脳の観察〕
　（生物材料の摘出及び固定工程）
　全身麻酔によって眠らせたマウスを開腹開胸し、左心室より４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液を注入して全身を灌流固定した後、大脳を摘出した。摘出した大脳を氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液）に浸漬して８～１２時間固定を行った。その後、この大脳を２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液に２日間浸漬して完全に置換をした。
　次いで、この大脳をＯＣＴ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結した大脳をＯＣＴ　ｃｏｍｐｏｕｎｄごとＰＢＳ中で振盪しながら解凍した。ＰＢＳを交換しリンスを行った後、約３０分、４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳを用いて大脳の再固定を行った。
　（透明化処理工程）
　次いで、再固定後の大脳を、参考例２で示す生物材料用透明化試薬（ＳＣＡＬＥ－Ａ２）中に移し２日間、室温で振盪した（第一浸潤工程）。次いで、より高濃度で尿素を含む生物材料用透明化試薬（試薬Ｂとする）中に大脳を移し、２日間、室温で振盪した（第二浸潤工程）。試薬Ｂは、８Ｍ濃度の尿素、及び０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を純水に溶解した水溶液である。次いで、新鮮なＳＣＡＬＥ－Ａ２液中に大脳を移し、２～３日間、室温で振盪して透明化した（第三浸潤工程）。なお、大脳の湿重量１ｇに対して用いるＳＣＡＬＥ－Ａ２の液量ならびに試薬Ｂの液量はそれぞれ約３０ｍｌであった。
　上記のように、尿素の濃度が高い試薬Ｂでの透明化処理を中間に挟む方法により、ＳＣＡＬＥ－Ａ２を単独で用いて透明化処理を行う場合と比較して、極めて短い処理時間（凡そ半分程度）で同等の透明化度を達成することができた。
　〔実施例２：海馬の観察〕
　以下の点１）～３）以外は、参考例１と同じ方法に従い、マウスの海馬の観察を行なった。
１）　生後６週齢の野生型（非遺伝子改変）の正常C57BL6系統雄マウスを用いた点。
２）　（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、透明化処理を次のように行なった点。まず、再固定した海馬を、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬（参考例２）で４８時間、浸漬し、室温で振盪した後に（第一浸潤工程）、次いで、試薬Ｂ（実施例１）で４８時間、浸漬し、室温で振盪した。
３）　観察工程は、模様つきの基板上に海馬を配置して、模様が海馬を介して透けて見えるか否かで透明化度を判定した。
　なお、参考例として、再固定した海馬を、ＰＢＳで９６時間、浸漬し、室温で振盪したものと、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で９６時間、浸漬し、室温で振盪したものも準備した。
　観察の結果は、図１３に示す。同図中のＡは、ＰＢＳで海馬を処理したもの（参考例）、Ｂは、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で海馬を処理したもの（参考例）、Ｃは、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬と試薬Ｂとで海馬を処理したもの（実施例）に相当する。同図に示すように、同じ処理時間で比較した場合、実施例は何れの参考例と比較しても透明化度が明らかに高くなっていることが確認された。また、処理前の海馬の大きさは何れもほぼ同じであったので、同図中のＢに示す海馬と比較してＣに示す海馬がより体積膨張をしたということもなかった。
　〔実施例３：脳切片の観察〕
　以下の点１）～３）以外は、参考例１と同じ方法に従い、マウスの脳切片の観察を行なった。
１）　生後６週齢の野生型（非遺伝子改変）の正常C57BL6系統雄マウスを用いた点。
２）　（生物材料の摘出及び固定工程）において、マウスの脳全体を摘出して、参考例１と同様に固定及び再固定した点。
３）　（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、透明化処理を次のように行なった点。まず、再固定した脳から海馬を含む冠状断スライス（厚さ３ｍｍ）を作成した。次いで、この冠状断スライスを、中央線で右半球側スライスと左半球側スライスとに切断した。そして一方の半球側スライスをＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で（参考例２）で２４時間、浸漬し、室温で振盪した後に（第一浸潤工程）、次いで、試薬Ｂ（実施例１）で２４時間、浸漬し、室温で振盪した（第二浸潤工程）。次いで、この冠状断スライスから、海馬を含む厚さ１．５ｍｍの冠状断スライスを切り出した。このようにして得た冠状断スライスを一度目の観察工程（次の段落参照）に供した。
次いで、一度目の観察工程を終えた冠状断スライスをＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で二度リンスした後、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で２４時間、浸漬し、室温で振盪した（第三浸潤工程）。このようにして得た冠状断スライスを二度目の観察工程（次の段落参照）に供した。
３）　観察工程は、分光光度計（日立製：製品名U-3310 Spectrophotometer）を用いて、１．５ｍｍ厚の上記冠状断スライスの、３００ｎｍ～９２０ｎｍの波長域の光の透過スペクトルを測定した。
　なお、参考例として、再固定した脳から海馬を含む冠状断スライス（厚さ３ｍｍ）を作成した。次いで、この冠状断スライスを、中央線で右半球側スライスと左半球側スライスとに切断した。そして一方の半球側スライスをＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で７２時間、浸漬し、室温で振盪した後に得た、海馬を含む厚さ１．５ｍｍの冠状断スライスを準備した。
　観察の結果は、図１４に示す。同図中の「Ｂ」は、本実施例の一度目の観察の結果であり、「Ｂ－Ａ２　replaced」は二度目の観察の結果であり、「ＳＣＡＬＥ－Ａ２」は参考例の結果である。同図に示すように、実施例は、参考例と比較して、同一又はより短い処理時間で、透明化度が明らかに高くなっている（約２倍）ことが確認された。
　なお、データは示さないが、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬、試薬Ｂ、及び水は、３００ｎｍ～９２０ｎｍの波長域の光の透過スペクトルがほぼ等しい。
　〔参考例１３：尿素濃度が脳組織の透明化に及ぼす影響〕
　８週齢の野生型C57BL6/J系統マウス（日本エスエルシーより購入）の大脳のスライスを、ＰＢＳ、４Ｍ、６Ｍ、又は８Ｍの尿素を含む水溶液中に浸漬し、室温で１２時間振盪することでインキュベーションした。
　大脳スライスは、まず、アクリル製のbrain slicer（室町機械製）を用いて、厚さ１ｍｍで、大脳の前後方向に連続したものを２枚調製した。次いで、２枚のスライスを左右にほぼ均等に分断して４つのスライスとした。そして、４つのスライスそれぞれを上記した各種水溶液に浸漬してインキュベーションした。結果を図１５に示す。ＰＢＳの場合は組織の透明化が生じていないことが認められた。これに対して８Ｍ尿素を含む溶液の場合は組織に膨潤があるものの、背景のパターンが最もよく組織を透過して確認することができた。４Ｍから８Ｍの濃度範囲では尿素濃度に依存的に透明化が生じることが認められた。
　本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明は、生物親和性に優れた成分を用いた、より効率的な生物材料透明化法、及びその利用を提供することが出来る。

Claims (18)

  1. 　生物材料を透明化する方法であって、
    　尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む溶液を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、
    　次いで、第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程を含んでなる、ことを特徴とする生物材料の透明化方法。
  2. 　上記第二浸潤工程に次いで、当該第二浸潤工程で用いた上記溶液より低濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第三浸潤工程を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の生物材料の透明化方法。
  3. 　上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが実質的に同濃度で上記化合物を含むことを特徴とする請求項２に記載の生物材料の透明化方法。
  4. 　上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが同じ溶液であることを特徴とする請求項３に記載の生物材料の透明化方法。
  5. 　上記溶液が何れも上記化合物として尿素を含むことを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載の透明化方法。
  6. 　上記溶液の少なくとも一つが水溶液であることを特徴とする請求項１から５の何れか一項に記載の透明化方法。
  7. 　上記溶液の少なくとも一つが界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の透明化方法。
  8. 　上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることを特徴とする請求項７に記載の透明化方法。
  9. 　上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項８に記載の透明化方法。
  10. 　上記水溶液が水溶性の高分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項６から９の何れか一項に記載の透明化方法。
  11. 　水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１０に記載の透明化方法。
  12. 　上記溶液の少なくとも一つが、さらに、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１から１１の何れか一項に記載の透明化方法。
  13. 　上記生物材料として、多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることを特徴とする請求項１から１２の何れか一項に記載の透明化方法。
  14. 　上記第一浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内であり、かつ、上記第二浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が６Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であることを特徴とする請求項１から１３の何れか一項に記載の透明化方法。
  15. 　生物材料用透明化処理キットであって、
    　尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む第一溶液と、
    　上記第一溶液より高濃度で、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む第二溶液と、からなることを特徴とする生物材料用透明化処理キット。
  16. 　上記第一溶液が、尿素を２．５Ｍ以上で５．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項１５に記載の生物材料用透明化処理キット。
  17. 　上記第二溶液が、尿素を５．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の生物材料用透明化処理キット。
  18. 　上記第一溶液が、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１５から１７の何れか一項に記載の生物材料用透明化処理キット。
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