WO2012118193A1 - ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 - Google Patents

ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof containing a zinc compound with a low content of divalent soluble iron.
  • Hyaluronic acid is known as a polysaccharide composed of linked disaccharide units of N-acetylglucosamine and glucuronic acid.
  • Hyaluronic acid is generally used as a raw material for pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like.
  • As a production method of hyaluronic acid there are a method of producing with an extract from a chicken crown or the like, and a method of producing by a fermentation method using a microorganism.
  • Patent Document 1 describes that hyaluronic acid was produced by fermentation using Streptococcus tin-epidemicus.
  • the yield and molecular weight of hyaluronic acid are higher when ferrous sulfate is added to a concentration of 3 times during the culture (Example 3) than when not added (Example 1). It is described that it has increased.
  • Patent Document 2 describes that hyaluronic acid powder was produced by fermentation using Streptococcus equi (ATCC9527).
  • Patent Document 3 describes experimental data indicating that sodium hyaluronate crystals produced based on the method of Patent Document 2 contain a large amount of calcium, magnesium, and iron.
  • Patent Document 3 discloses a sodium hyaluronate crystal in which the content of calcium, magnesium, and iron is reduced to less than 10 ppm by further contacting a chelate resin with the hyaluronic acid-containing liquid obtained based on the method of Patent Document 2. It is described that obtained.
  • the hyaluronic acid powder contained a lot of calcium, magnesium, and iron, and the purity of sodium hyaluronate was low.
  • Patent Document 3 Thirdly, in the production method of Patent Document 3, it is described that the content of calcium, magnesium, and iron in the sodium hyaluronate crystal is reduced to less than 10 ppm, but what was the specific content? Is unknown. The analysis results are in the order of ppm and lack precision. Furthermore, it is not described what specific effects can be obtained by reducing the contents of calcium, magnesium, and iron.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having high stability because the content of divalent soluble iron is 5 ppb or less and contains a zinc compound.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have found that the higher the content of divalent soluble iron mixed in the hyaluronate aqueous solution, the higher the hyaluronic acid molecule It was found for the first time that the stability of was reduced. In addition, the inventors surprisingly found that the stability of hyaluronic acid molecules does not decrease even when the content of trivalent soluble iron is large, and the content of divalent soluble iron is large. We have also found that the stability of hyaluronic acid molecules is reduced.
  • the present inventors reduced the content of divalent soluble iron mixed in an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof, and improved the stability of hyaluronic acid molecules by divalent soluble iron.
  • a decrease in the stability of hyaluronic acid molecules due to divalent soluble iron can be suppressed by adding a zinc compound.
  • the inventors have also surprisingly added glycine, L-aspartate Na, Na bromide, Na hydrogen sulfite, Na sulfide, Na thioglycolate, glucose, purified white sugar, or ascorbic acid. Found that the decrease in the stability of hyaluronic acid molecules due to divalent soluble iron was not suppressed, and that the addition of the divalent soluble iron often resulted in a decrease in stability, and thus completed the present invention.
  • an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof containing a zinc compound having a divalent soluble iron content of 5 ppb or less is provided.
  • the aqueous solution containing this hyaluronic acid or a salt thereof has been demonstrated in Examples to be described later that the intrinsic viscosity remaining rate after storage is good. Therefore, it is suitable for raw materials such as pharmaceuticals, cosmetics and foods.
  • a pharmaceutical composition comprising an aqueous solution containing the above hyaluronic acid or a salt thereof.
  • This pharmaceutical composition contains an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having a good residual intrinsic viscosity after storage. For this reason, it is difficult for a decrease in viscosity or a decrease in quality to occur over time.
  • an injection for treating arthritis comprising an aqueous solution containing the above hyaluronic acid or a salt thereof.
  • This injection for treatment of arthropathy includes an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having a good residual intrinsic viscosity after storage. Therefore, good retention is obtained when administered in or around the joint.
  • a cosmetic composition comprising an aqueous solution containing the hyaluronic acid or a salt thereof.
  • This cosmetic composition contains an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having an excellent residual viscosity after storage. For this reason, it is difficult for a decrease in viscosity or a decrease in quality to occur over time.
  • the method further comprises a step of dissolving a composition containing hyaluronic acid or a salt thereof and divalent soluble iron and a zinc compound in an aqueous solution, wherein the composition comprises hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the According to this production method it is possible to produce hyaluronic acid or a salt thereof having an excellent residual residual viscosity after storage.
  • the method further comprises a step of dissolving a composition containing hyaluronic acid or a salt thereof and divalent soluble iron and a zinc compound in an aqueous solution, wherein the composition comprises hyaluronic acid or a salt thereof.
  • a method for promoting stabilization of an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof, wherein the content of divalent soluble iron in the aqueous solution is 5 ppb or less when dissolved in an aqueous solution so that the salt concentration is 10 mg / mL Provided.
  • a stabilizer for stabilizing an aqueous solution containing a hyaluronic acid or a salt thereof containing a zinc compound and having a divalent soluble iron content of 5 ppb or less examples in which the zinc compound is contained in an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having a content of divalent soluble iron of 5 ppb or less remarkably increases after storage. Has been proven. Therefore, if this stabilizer is added to an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having a divalent soluble iron content of 5 ppb or less, the stabilizer can be remarkably stabilized.
  • the content of divalent soluble iron is 5 ppb or less and contains a zinc compound, an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having high stability can be obtained.
  • FIG. 1 is a graph showing a change in intrinsic viscosity residual rate when sodium hyaluronate powder is added to an aqueous solution containing divalent soluble iron and zinc chloride.
  • One embodiment of the present invention is an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof containing a zinc compound having a divalent soluble iron content of 5 ppb or less.
  • An aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having such a composition has a high residual residual viscosity after storage and is excellent in physical stability, as demonstrated in Examples described later. In addition, the viscosity and quality are hardly lowered even after long-term storage or after a long period of time, and it is suitable for raw materials such as pharmaceuticals, cosmetics and foods.
  • Examples of the zinc compound include zinc salicylate, zinc phosphate, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc iodide, zinc fluoride, zinc chloride, zinc bromide, zinc carbonate, zinc pt-butylbenzoate, and zinc thiocyanate.
  • Zinc lactate, zinc acetate, or zinc oxide may be used. It can also be used as a complex such as a salt of zincate ion.
  • zinc acetate, zinc sulfate, zinc chloride, or zinc oxide is preferred.
  • zinc acetate or zinc chloride is preferred.
  • one having a reduced endotoxin concentration is used.
  • the above 5 ppb or less may be, for example, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, or 5 ppb.
  • the content may be equal to or less than the value exemplified here, or may be in the range of any two values. This content is preferably smaller from the viewpoint of improving the stability of an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the content of the zinc compound contained in the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof of the present embodiment is, for example, 0.005, 0.01, 0.1, 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2, 5, 10, 50, or 100 ⁇ g. May be / mL. Moreover, this content rate may be in the range of any two values exemplified here.
  • the content is preferably 0.01 ⁇ g / mL or more, more preferably 0.5 ⁇ g / mL or more from the viewpoint of further improving the stability of the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the content is preferably 10 ⁇ g / mL or less, more preferably 2 ⁇ g / mL or less from the viewpoint of reducing production costs or improving operability.
  • the average molecular weight of sodium hyaluronate or a salt thereof contained in the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof of the present embodiment is, for example, 500,000, 800,000, 1,000,000, 1.5 million, 1.8 million, 2 million, 2.5 million, 300 May be 5 million, 5 million, or 8 million. This average molecular weight may be within the range of any two values exemplified here. From the viewpoint of further improving the viscosity of an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof, it is preferably 1 million or more, more preferably 1.5 million or more.
  • An aqueous solution containing high-viscosity hyaluronic acid or a salt thereof is excellent in retention in the affected area when used as an injection for the treatment of arthropathy.
  • the average molecular weight of hyaluronic acid or a salt thereof contained in an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof is calculated by measuring Laurent's formula (LAURENT et al., Biochim Biophys Acta. 1960 Aug 26; 42: 476-485 .).
  • the content of hyaluronic acid or a salt thereof contained in the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof according to the present embodiment is, for example, 0.1, 1, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 15, or 20 mg / mL. It may be. This content may be within the range of any two values exemplified here. From the viewpoint of therapeutic effect or operability when used for injections and the like, it is preferably in the range of 5 and 15 mg / mL, more preferably in the range of 8 and 12 mg / mL.
  • the pH of the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof according to this embodiment may be, for example, 5.5, 6, 6.5, 6.8, 7, 7.8, 8, 8.5, or 9. This pH may be within the range of any two values exemplified herein.
  • the pH is preferably in the range of 6.5 and 8 from the viewpoint of stability, and more preferably in the range of 6.8 and 7.8.
  • the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof includes, for example, a step of dissolving a composition containing hyaluronic acid or a salt thereof and divalent soluble iron and a zinc compound in the aqueous solution.
  • the composition comprises hyaluronic acid or a salt thereof, in which the content of divalent soluble iron in the aqueous solution is 5 ppb or less when dissolved in the aqueous solution so that the concentration of hyaluronic acid or a salt thereof is 10 mg / mL. It can obtain by the production method of the aqueous solution containing. This production method does not necessarily require complicated steps, and is excellent in productivity or cost.
  • hyaluronic acid salt may be, for example, sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, zinc hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, or ammonium hyaluronate.
  • sodium hyaluronate is preferable from the viewpoint that a desired viscosity or a therapeutic effect on arthropathy can be expected.
  • the chemical name of sodium hyaluronate is, for example, [ ⁇ 3) -2-acetamido-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-sodium glucopyranosyluronate- (1 ⁇ ] n (IUPAC) Can be represented.
  • divalent soluble iron is iron in a soluble state and is divalent. It can also be expressed as Fe 2+ or divalent iron.
  • the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof according to this embodiment can be used as a raw material of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition contains an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof excellent in stability, the viscosity and quality are hardly lowered even after long-term storage. Further, for example, when it is administered in or around the joint, it can stay in the affected area for a long time or a desired time.
  • the dosage form of this pharmaceutical composition is not particularly limited, but an injection is preferable from the viewpoint that it can be directly administered to an affected area such as a joint.
  • a syringe, a vial, or an ampoule can be used as the container for the injection.
  • it can be administered alone, but can be mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers or excipients and any well known in the pharmaceutical arts. It is preferably provided as a pharmaceutical preparation produced by the method.
  • This pharmaceutical composition is prepared according to the dosage form by using a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, lidocaine hydrochloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin).
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, lidocaine hydrochloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin
  • the pharmaceutical composition may also contain sodium hydrogen phosphate, crystalline sodium dihydrogen phosphate, and sodium chloride as additives.
  • the adjusted pharmaceutical composition can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, dogs, monkeys, sheep, pigs, cows, cats, etc.).
  • the pharmaceutical composition includes a composition used for the purpose of prevention.
  • the administration method of this pharmaceutical composition can be appropriately selected depending on the age, symptoms, affected area, etc. of the subject.
  • 2.5 mL of an adult can be administered into the knee joint cavity 5 times continuously every week.
  • it can be administered at intervals of 2 to 4 weeks.
  • 2.5 mL of an adult once a week for 5 consecutive shoulder joints (shoulder joint cavity, subacromial bursa, or biceps long head tendon) can be administered within the tendon sheath).
  • 2.5 mL of an adult can be administered into the knee joint cavity 5 times continuously every week. It may also be administered in combination with an appropriate chemotherapeutic agent.
  • Examples of the pharmacological action of this pharmaceutical composition include: a) viscoelasticity or lubrication action by hyaluronate binding to the cartilage tissue and covering the surface, b) cartilage matrix stabilization action (degeneration suppression) C) analgesic action by covering the surface of inflammatory cells and synovial cells, or by suppressing the production of analgesic substances, or d) close to arthritis with synovial and cartilage degeneration Examples thereof include inflammatory effects expressed by affecting synovial cells, chondrocytes, or inflammatory cells such as neutrophils and macrophages. By these actions, for example, reduction of pain, improvement of daily life activities and joint range of motion are expected.
  • the aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof according to this embodiment can be used as a raw material for a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition includes an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof excellent in stability, the viscosity and quality are not easily lowered even after long-term storage.
  • the moisturizing effect tends to be sustained.
  • Another embodiment includes dissolving a composition containing hyaluronic acid or a salt thereof and divalent soluble iron and a zinc compound in an aqueous solution, wherein the composition comprises hyaluronic acid or a salt thereof.
  • This is a method for promoting the stabilization of an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof, in which the content of divalent soluble iron in the aqueous solution is 5 ppb or less when dissolved in the aqueous solution so as to have a concentration of 10 mg / mL.
  • this method an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having high physical stability can be obtained. Further, this method does not necessarily require a complicated process and is excellent in convenience.
  • the zinc compound can be used as a raw material for an aqueous solution stabilizer containing hyaluronic acid or a salt thereof. If this stabilizer is used, the physical stability of an aqueous solution containing hyaluronic acid or a salt thereof having a divalent soluble iron content of 5 ppb or less can be improved.
  • This stabilizer may be in powder or liquid form. In the case of liquid, a buffer may be included.
  • a sodium hyaluronate aqueous solution was prepared by the following procedure. First, 1 liter of a medium consisting of 5% glucose, 0.2% monopotassium phosphate, 1.0% polypeptone, and 0.5% yeast extract was heat sterilized and then Streptococcus equi FM-100 No. 9027). The culture was carried out for 20 hours at 200 rpm with stirring, at a temperature of 33 ° C., and at pH 8.5 (control by automatic dropping of 20% sodium hydroxide) while aeration of air at 1 vvm. This solution was filtered with a cell filtration device and dialyzed against water for 12 hours to recover the hyaluronic acid solution in the dialysis membrane.
  • the collection container used was an inner surface made of glass in order to prevent iron contamination.
  • Sodium chloride was added to 2.5% here, and ethanol was added twice as much as the hyaluronic acid solution to precipitate sodium hyaluronate.
  • the precipitate was washed 5 times with ethanol, and the impurities were thoroughly washed out and then air-dried at 40 ° C. for 10 hours to obtain Na hyaluronic acid powder.
  • the obtained sodium hyaluronate powder was dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride, and sodium hyaluronate containing 5, 8, 10, 12, 15 mg / mL of hyaluronic acid Na, respectively.
  • An aqueous solution was obtained.
  • the intrinsic viscosity was measured, and the molecular weight of Na hyaluronate was calculated using Laurent's formula.
  • Streptococcus equi FM-100 was cultured according to the procedure described in Example 1, and an aqueous sodium hyaluronate solution was purified by the same procedure as that described in Example 1 of Patent Document 3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-280430). Specifically, first, 1 liter of a medium consisting of 5% glucose, 0.2% potassium phosphate, 1.0% polypeptone, and 0.5% yeast extract is heat-sterilized, and then Streptococcus ex FM-100 is added. Vaccinated.
  • the culture was carried out for 20 hours at 200 rpm with stirring, at a temperature of 33 ° C., and at pH 8.5 (control by automatic dropping of 20% sodium hydroxide) while aeration of air at 1 vvm.
  • the culture solution is diluted 10 times with ion-exchanged water, and 5 g of activated carbon (Shirakaba RW50-T manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.) and pearlite (LocaHelp # 409, Mitsui Mining & Smelting Co., Ltd.) are added to the 2.5 L aqueous solution. 30 g was added, treated for 1 hour, and filtered using Nutsche.
  • the obtained sodium hyaluronate powder was dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride, and sodium hyaluronate containing 5, 8, 10, 12, 15 mg / mL of hyaluronic acid Na, respectively.
  • An aqueous solution was obtained.
  • the intrinsic viscosity was measured, and the molecular weight of Na hyaluronate was determined using the Laurent equation.
  • Example 1 (1) Analysis of soluble iron
  • the hyaluronic acid Na powder prepared in Example 1 and Comparative Example 1 was dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride, and the hyaluronic acid Na was dissolved in 5, 8
  • An aqueous sodium hyaluronate solution containing 10, 12, or 15 mg / mL was prepared (No. 1 to 10), respectively.
  • the amount of divalent soluble iron, the amount of divalent and trivalent soluble iron, and the total amount of iron were measured by the following procedures (1-1) to (1-3). did.
  • the total iron amount includes soluble and insoluble iron amounts.
  • the detection limit of the bivalent soluble iron amount, the bivalent and trivalent soluble iron amount, and the total iron amount was 5 ppb.
  • Example 1 From the above results, 1) that the method described in Example 1 can be used, it is possible to prepare an aqueous solution of sodium hyaluronate having a mixed amount of divalent soluble iron of 5 ppb or less. It was found that the intrinsic viscosity after storage of the aqueous acid Na solution was lowered, and 3) trivalent soluble iron did not affect the intrinsic viscosity after storage of the aqueous hyaluronate solution.
  • Example 2 Various additives were dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride as shown in Table 5 (Nos. 23 to 36). Next, the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved in each aqueous solution so as to have a concentration of 10 mg / mL. Furthermore, after storing at 80 ° C. for 24 hours, the intrinsic viscosity and the intrinsic viscosity residual ratio (%) were measured.
  • Additives include zinc chloride, zinc salicylate, zinc iodide, zinc acetate, glycine, sodium L-aspartate, sodium bromide, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfide, sodium thioglycolate, glucose, purified white sugar, and ascorbic acid It was used.
  • the stability of the aqueous sodium hyaluronate solution is improved. I understood it. Further, when Na bromide, Na hydrogen sulfite, Na sulfide, Na thioglycolate, glucose, or ascorbic acid was added, the stability was rather lowered.
  • Example 3 Various additives were dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride as shown in Table 6 (Nos. 37 to 43). Further, 11.3 ppb (5 ppb as divalent soluble iron) was added to each aqueous solution. Next, the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved in each aqueous solution so as to have a concentration of 10 mg / mL. Then, after storing for 24 hours at 80 ° C., the intrinsic viscosity and the intrinsic viscosity residual ratio (%) were measured.
  • the aqueous solution in which the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved contained 5 ppb of divalent soluble iron, and the stability of the aqueous hyaluronate solution was lowered. Furthermore, it was found that the decrease in stability was significantly suppressed by zinc chloride or zinc acetate.
  • Example 3 Zinc chloride was dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride at concentrations shown in Table 7 (No. 44 to 50). Next, the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved in each aqueous solution so as to have a concentration of 10 mg / mL. Furthermore, after storing at 80 ° C. for 24 hours, the intrinsic viscosity and the intrinsic viscosity residual ratio (%) were measured.
  • the aqueous solution in which the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved contained 0.01 ⁇ g / mL or more of zinc chloride, so that the stability of the aqueous hyaluronate solution was improved. . Moreover, the improvement of the stability became moderate when 1 ⁇ g / mL of zinc chloride was contained.
  • Zinc chloride was dissolved in an aqueous solution containing 2 mM phosphate buffer and 0.9% sodium chloride so as to have a concentration of 1 ⁇ g / mL. Furthermore, iron chloride (II) having a concentration shown in Table 8 was added to each aqueous solution (No. 51 to 56). Next, the sodium hyaluronate powder prepared in Example 1 was dissolved in each aqueous solution so as to have a concentration of 10 mg / mL. Then, after storing for 24 hours at 80 ° C., the intrinsic viscosity and the intrinsic viscosity residual ratio (%) were measured.
  • Fig. 1 shows the results of Table 8 and Table 3 as a graph. From FIG. 1, it can be seen that when 1 ⁇ g / mL of zinc chloride is contained in a hyaluronic solution containing a low concentration of divalent soluble iron, the stability of the aqueous sodium hyaluronate solution is improved. This stabilizing effect was particularly remarkable when the divalent soluble iron concentration was 5 ppb or less.
  • the aqueous solution of sodium hyaluronate having a low content of divalent soluble iron had an improved residual intrinsic viscosity after storage. Furthermore, when zinc chloride was contained in the aqueous hyaluronate solution, the intrinsic viscosity remaining rate was further improved.
  • This aqueous sodium hyaluronate solution has high stability and is less likely to cause a decrease in viscosity or quality even after long-term storage. Moreover, since it is suitable for long-term storage, the cost can be reduced.

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Abstract

　安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を明らかにする。　２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を提供する。または、上記ヒアルロン酸またはその塩の濃度が、５～１５ｍｇ／ｍＬである、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を提供する。

Description

ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液
　本発明は、２価の溶解性鉄の含有率が低く、亜鉛化合物を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に関する。
　ヒアルロン酸とは、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖単位が連結して構成されている多糖として知られている。ヒアルロン酸は、一般的に医薬品・化粧品・食品等の原材料として使用されている。ヒアルロン酸の生産方法としては、鶏の鶏冠等からの抽出物により製造する方法や、微生物を用いた発酵法により生産する方法がある。
　例えば、特許文献１にはストレプトコッカスズーエピデミカスを用いて、発酵法によりヒアルロン酸を生産したことが記載されている。この特許文献１には、培養中に硫酸第一鉄を３倍の濃度になるように添加した場合（実施例３）、添加しない場合（実施例１）よりもヒアルロン酸の収率および分子量が増加したことが記載されている。
　また、特許文献２にはストレプトコッカス・エクイ（ATCC9527）を用いて、発酵法によりヒアルロン酸粉末を生産したことが記載されている。特許文献３には、特許文献２の方法に基づいて生産したヒアルロン酸ナトリウム結晶には、カルシウム、マグネシウム、および鉄が多く含有されていることを表す実験データが記載されている。また特許文献３には、特許文献２の方法に基づいて得たヒアルロン酸含有液にさらにキレート樹脂を接触させることで、カルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率が１０ｐｐｍ未満に減少したヒアルロン酸ナトリウム結晶を得たことが記載されている。
特開平9-56394 特公平7-2117 特開2008-280430
　しかしながら、上記文献記載の従来技術は以下の点で改善の余地を有していた。
　第一に特許文献１の生産方法では、硫酸第一鉄（硫酸鉄（II）、ＦｅＳＯ４）を大量に培地に添加しているため、精製後のヒアルロン酸含有溶液に鉄が混入しやすいと考えられる。また、硫酸第一鉄を大量に含む培地から鉄を取り除くには、通常よりも多くのコストが必要になる。
　第二に特許文献２の生産方法では、ヒアルロン酸粉末にカルシウム、マグネシウム、および鉄が多く含まれており、ヒアルロン酸ナトリウムの純度が低かった。
　第三に特許文献３の生産方法では、ヒアルロン酸ナトリウム結晶中のカルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率を１０ｐｐｍ未満に減少させたことが記載されているが、具体的に含有率がいくつであったかは不明である。またその分析結果はｐｐｍオーダーであり、精密性に欠けている。さらに、カルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率を減少させたことによって、具体的にどのような効果が得られるのかは記載されていない。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含むために、安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる不純物に関する研究を行った結果、ヒアルロン酸塩水溶液中に混入している２価の溶解性鉄の含有率が高いほどヒアルロン酸分子の安定性が減少することを初めて見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、３価の溶解性鉄の含有率が大きくてもヒアルロン酸分子の安定性は減少せず、２価の溶解性鉄の含有率が大きい場合に限ってヒアルロン酸分子の安定性の減少が起こっていることも見出した。
　そこで、本発明者らは、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液中に混入している２価の溶解性鉄の含有率を低減させるとともに、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少を抑制する添加物を探し求めたところ、亜鉛化合物を添加することによって、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少を抑制することができることを初めて見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、グリシン、L-アスパラギン酸Na、臭化Ｎａ、亜硫酸水素Ｎａ、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Ｎａ、ブドウ糖、精製白糖、またはアスコルビン酸を添加した場合には、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少が抑制されず、かえって添加したことによって安定性が減少することも多いことを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明によれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液が提供される。このヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、保存後の極限粘度残存率が良好であることが、後述する実施例で実証されている。そのため、医薬品・化粧品・食品等の原材料に好適である。
　また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、時間経過とともに生じる粘度の低下、または品質の低下が生じにくい。
　また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、関節症治療用注射剤が提供される。この関節症治療用注射剤は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、関節内またはその周辺に投与した場合に、良好な滞留性が得られる。
　また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、化粧料組成物が提供される。この化粧料組成物は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、時間経過とともに生じる粘度の低下、または品質の低下が生じにくい。
　また、本発明によれば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、亜鉛化合物と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法が提供される。この生産方法によれば、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を生産できる。
　また、本発明によれば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、亜鉛化合物と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法が提供される。亜鉛化合物を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含有させれば、保存後の極限粘度残存率が顕著に向上することが、後述する実施例で実証されている。そのため、この安定化促進方法によれば、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化を顕著に促進することができる。
　また、本発明によれば、亜鉛化合物を含む、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を安定化するための、安定化剤が提供される。亜鉛化合物を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含有させれば、保存後の極限粘度残存率が顕著に向上することが、後述する実施例で実証されている。そのため、この安定化剤を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に添加すれば、顕著に安定化させることができる。
　本発明によれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含むために、安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液が得られる。
図１は、２価の溶解性鉄および塩化亜鉛を含有する水溶液に、ヒアルロン酸ナトリウム粉末を添加したときの、極限粘度残存率の変化を表したグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
　＜ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液＞
　本発明の一実施形態は、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含む、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液である。このような組成からなるヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、後述する実施例で実証されているように、保存後の極限粘度残存率が高く、物理的な安定性に優れている。また、長期保存後または長期時間経過後にも粘度や品質の低下が生じにくく、例えば医薬品・化粧品・食品等の原材料に好適である。
　上記の亜鉛化合物は、例えばサリチル酸亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、炭酸亜鉛、ｐ-ｔ-ブチル安息香酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛、乳酸亜鉛、酢酸亜鉛、または酸化亜鉛等であってもよい。また、亜鉛酸イオンの塩等のように錯体としても用いることができる。医薬組成物の原材料として使用する場合には、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、または酸化亜鉛が好ましい。注射剤の原材料として用いる場合には、酢酸亜鉛または塩化亜鉛が好ましい。また、好ましくは、エンドトキシン濃度を低減したものを用いる。
　上記の５ｐｐｂ以下は、例えば0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4、または５ｐｐｂであってもよい。またこの含有率は、ここで例示した値以下、またはいずれか２つの値の範囲内であってもよい。この含有率は、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定性を向上させるという観点からは、より少ない方が好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、上記の亜鉛化合物の含有率は、例えば0.005、0.01、0.1、0.5、0.8、1、1.5、2、5、10、50、または100μｇ/ｍＬであってもよい。またこの含有率は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。またこの含有率は、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定性をより向上させるという観点からは、0.01μｇ/ｍＬ以上が好ましく、0.5μｇ/ｍＬ以上がより好ましい。またこの含有率は、生産コスト低減、または操作性向上の観点からは10μｇ/ｍＬ以下が好ましく、2μｇ/ｍＬ以下がより好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、ヒアルロン酸ナトリウムまたはその塩の平均分子量は、例えば50万、80万、100万、150万、180万、200万、250万、300万、500万、または800万であってもよい。この平均分子量は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の粘性をより向上させるという観点からは、100万以上が好ましく、150万以上がより好ましい。粘性の高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、関節症治療用の注射剤として使用した場合、患部での滞留性に優れている。ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれるヒアルロン酸またはその塩の平均分子量は、極限粘度を測定した後、Ｌａｕｒｅｎｔの式（LAURENT et al., Biochim Biophys Acta. 1960 Aug 26;42:476-485.）を用いて算出することができる。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、ヒアルロン酸またはその塩の含有量は、例えば、0.1、1、5、8、9、10、11、12、15、または20ｍｇ／ｍＬであってもよい。この含有率は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。治療効果、または注射剤等に使用する際の操作性の観点からは、5と15ｍｇ／ｍＬの値の範囲内が好ましく、8と12ｍｇ／ｍＬの値の範囲内がより好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液のｐＨは、例えば5.5、6、6.5、6.8、7、7.8、8、8.5、または9であってもよい。このｐＨは、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。またこのｐＨは、安定性の観点からは、6.5と8の値の範囲内が好ましく、6.8と7.8の値の範囲内がより好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、例えば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、亜鉛化合物と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法によって得ることができる。この生産方法は複雑な工程を必ずしも必要とせず、生産性またはコスト面で優れている。
　本明細書において「ヒアルロン酸の塩」とは、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、またはヒアルロン酸アンモニウムであってもよい。この中でも、所望の粘性、または関節症への治療効果が期待できるという観点からは、ヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。ヒアルロン酸ナトリウムの化学名は、例えば[→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-sodium glucopyranosyluronate-(1→]n(IUPAC)で表すことができる。
　本明細書において「２価の溶解性鉄」とは、溶解性の状態にある鉄で２価のものである。Ｆｅ２＋や２価鉄と表記することもできる。
　＜医薬組成物等＞
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、医薬組成物の原材料として使用できる。この場合、上記医薬組成物は安定性に優れたヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含むため、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくい。また、例えば関節内またはその周辺に投与した場合に、患部に長時間または所望の時間滞留することができる。この医薬組成物の剤形は特に限定されないが、関節等の患部へ直接投与することができるという観点からは注射剤が好ましい。注射剤の容器としては、例えばシリンジ、バイアル、またはアンプルを使用できる。投与に際しては、単独で投与することも可能ではあるが、薬理学的に許容される１つまたはそれ以上の担体もしくは賦形剤と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが好ましい。この医薬組成物は投与形態に合わせて、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。またこの医薬組成物は、添加剤としてリン酸水素ナトリウム、結晶リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。調整された医薬組成物は、例えばヒトや哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコなど）に対して投与することができる。なお医薬組成物には、予防を目的として使用される組成物を含む。
　この医薬組成物の投与方法は被験者の年齢、症状、患部等により適宜選択することができる。変形性膝関節症の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回膝関節腔内に投与することができる。または、症状の維持を目的とする場合は、2～4週間隔で投与することができる。また肩関節周囲炎の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回肩関節（肩関節腔、肩峰下滑液包、または上腕二頭筋長頭腱腱鞘）内に投与することができる。また関節リウマチにおける膝関節痛の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回膝関節腔内に投与することができる。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。
　この医薬組成物の薬理作用としては、例えば、a)ヒアルロン酸塩が軟骨組織に結合し表面を被覆することによる粘弾性もしくは潤滑作用、b)軟骨基質の安定化による関節軟骨保護作用(変性抑制作用、修復作用等)、c)炎症性細胞及び滑膜細胞の表面を被覆することによる、もしくは発痛増強物質の産生抑制等による鎮痛作用、またはd)滑膜及び軟骨変性を伴う関節炎と密接な関わりをもつ滑膜細胞、軟骨細胞、もしくは好中球やマクロファージといった炎症性細胞に影響を及ぼして発現される炎症作用、を挙げることができる。これら作用により、例えば疼痛の軽減、または日常生活活動や関節可動域の改善が期待される。
　本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、化粧料組成物の原材料として使用できる。この場合、上記化粧料組成物は、安定性に優れたヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含むため、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくい。また、保湿用の化粧料組成物として使用する場合、保湿効果が持続しやすい。
　＜安定化方法等＞
　他の実施形態は、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、亜鉛化合物と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法である。この方法によれば、物理的な安定性が高い、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を得ることができる。またこの方法は、複雑な工程を必ずしも必要とせず、利便性に優れている。
　また、亜鉛化合物はヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化剤の原材料として使用できる。この安定化剤を用いれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下の、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の、物理的な安定性を向上させることができる。この安定化剤は、粉末状または液状であってもよい。また液状の場合には緩衝剤を含んでいてもよい。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
　以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　以下の手順で、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液を調整した。まず、グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・エキＦＭ－１００（微工研条寄第９０２７号）を接種した。空気を１ｖｖｍで通気しながら、撹拌２００回転／分、温度３３℃、ｐＨ８．５（２０％水酸化ナトリウムの自動滴下によるコントロール）で２０時間培養した。この液を菌体ろ過装置によりろ過し、水に対して１２時間透析して透析膜内のヒアルロン酸溶液を回収した。回収容器は、鉄の混入を防ぐため、内表面がガラス製のものを用いた。ここに塩化ナトリウムを２．５％となるように添加し、エタノールをヒアルロン酸溶液の２倍量加えてヒアルロン酸Ｎａを沈殿させた。沈殿をエタノールで５回洗浄し、不純物を十分に洗い流してから４０℃で１０時間風乾し、ヒアルロン酸Ｎａの粉末を得た。
　次に、得られたヒアルロン酸Ｎａ粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａをそれぞれ５、８、１０、１２、１５ｍｇ／ｍＬ含むヒアルロン酸Ｎａ水溶液を得た。さらに、極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔの式を用いてヒアルロン酸Ｎａの分子量を求めた結果、２５３万であった。
　＜比較例１＞
　実施例１に記載の手順でストレプトコッカス・エキＦＭ－１００を培養し、特許文献３（特開2008-280430）の実施例１に記載の手順と同様の手順で、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液を精製した。具体的には、まず、グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・エキＦＭ－１００を接種した。空気を１ｖｖｍで通気しながら、撹拌２００回転／分、温度３３℃、ｐＨ８．５（２０％水酸化ナトリウムの自動滴下によるコントロール）で２０時間培養した。培養液を、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液に活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０－Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。この操作を２回繰り返して培地中の有機成分を除去し、ヒアルロン酸Ｎａ含有液を調整した。次に、内径１５ｍｍ、高さ３００ｍｍのクロマトカラムに三菱化学社製ダイヤイオンＣＲ１１を６８ｍｌ充填し、樹脂を再生した。このクロマトカラムに上記ヒアルロン酸Ｎａ含有液２．５Ｌを、ＳＶ＝１８（１２００ｍｌ／ｈｒ）で通液した。クロマトカラム通過液１Ｌに食塩２ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、２－プロパノールで析出を行い、４０℃で真空乾燥し、ヒアルロン酸Ｎａの粉末を得た。
　次に、得られたヒアルロン酸Ｎａ粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａをそれぞれ５、８、１０、１２、１５ｍｇ／ｍＬ含むヒアルロン酸Ｎａ水溶液を得た。さらに、極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔの式を用いてヒアルロン酸Ｎａの分子量を求めた結果、２４０万であった。
　＜評価例１＞
　（１）溶解性鉄の分析
　実施例１および比較例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａを５、８、１０、１２、または１５ｍｇ／ｍＬ含有するヒアルロン酸Ｎａ水溶液をそれぞれ調製した（No.1～10）。次に、それぞれの水溶液について、鉄量２価の溶解性鉄量、２価および３価の溶解性鉄量、および全鉄量を下記（１－１）～（１－３）の手順で測定した。全鉄量には溶解性および不溶解性の鉄量を含む。鉄量２価の溶解性鉄量、２価および３価の溶解性鉄量、および全鉄量の検出限界は、５ｐｐｂであった。
　（１－１）２価の溶解性鉄の分析方法
　ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
　ｂ）チオシアン酸カリウム溶液０．１ｍＬ、１，１０－フェナントロリン溶液０．０５ｍＬを添加して混合する。
　ｃ）約１０ｍＬに希釈した後、約１０分間放置する。
　ｄ）クロロホルム５ｍＬを加えた後、密栓する。５分間振り混ぜ、抽出する。
　ｅ）静置後、クロロホルム相を４ｍＬ分取し、別のサンプル瓶に移す。
　ｆ）ホットプレート上で蒸発乾固した後、濃硝酸０．５ｍＬを加え酸分解する。
　ｇ）希硝酸（１＋１００）２ｍＬを加え、残分を溶解する。
　ｈ）ＩＣＰ発光分析でＦｅを定量する。
　（１－２）２価および３価の溶解性鉄の分析方法
　ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
　ｂ）塩酸ヒドロキシルアミン溶液０．２ｍＬを添加する。
　ｃ）１，１０－フェナントロリン溶液０．２ｍＬ、チオシアン酸カリウム溶液０．５ｍＬを添加する。
　ｄ）約１０ｍＬに希釈した後、約１０分間放置する。
　ｅ）４－メチル－２－ペンタノン５ｍＬを加えた後、密栓する。１分間振り混ぜ、抽出する。
　ｆ）静置後、４－メチル－２－ペンタノン相を４ｍＬ分取し、別のサンプル瓶に移す。
　ｇ）ホットプレート上で蒸発乾固した後、濃硝酸０．５ｍＬを加え酸分解する。
　ｈ）希硝酸（１＋１００）２ｍＬを加え、残分を溶解する。
　ｉ）ＩＣＰ発光分析でＦｅを定量する。
　（１－３）全鉄の分析方法
　ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
　ｂ）ＨＣｌ（１＋１）０．１ｍＬを加えホットプレートで加熱する。
　ｃ）上記（１－２）２価および３価の溶解性鉄の分析方法溶解性鉄の分析のｂ）以降の操作を行う。
　（１－４）鉄量の分析結果
　上記（１－１）～（１－３）の分析結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）極限粘度測定
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、実施例１または比較例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ溶解した（No. 11～12）。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した結果を表２に示す。なお極限粘度は第十五改正日本薬局方第二追補「精製ヒアルロン酸ナトリウム」の粘度の項の記載に従い測定した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表３に示すように塩化鉄（II）（FeCl2）を溶解した（No.13～19）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表４に示すように塩化鉄（III）（FeCl3）を溶解した（No.20～22）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の結果から、１）実施例１に記載の方法を用いれば、２価の溶解性鉄の混入量が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸Ｎａ水溶液を調整できること、２）２価の溶解性鉄によって、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の保存後の極限粘度が低下すること、３）３価の溶解性鉄は、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の保存後の極限粘度に影響を与えないこと、がわかった。
　＜評価例２＞
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表５に示すように各種添加物を溶解した（No.23～36）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。添加物としては、塩化亜鉛、サリチル酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、酢酸亜鉛、グリシン、L-アスパラギン酸Ｎａ、臭化Ｎａ、亜硫酸水素Ｎａ、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Na、ブドウ糖、精製白糖、およびアスコルビン酸を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　・添加剤
　塩化亜鉛：和光純薬社、263-00271
　サリチル酸亜鉛：和光純薬社、269-00692
　ヨウ化亜鉛：和光純薬社、268-01061
　酢酸亜鉛：和光純薬社、263-00232
　グリシン：和光純薬社、036435
　L-アスパラギン酸Na：和光純薬社、193-01262
　臭化Na：和光純薬社、193-01505
　亜硫酸水素Na：和光純薬社、190-01375
　硫化Na：和光純薬社、197-03362
　チオグリコール酸Na：和光純薬社、590-11762
　ブドウ糖：和光純薬社、076-05705
　精製白糖（ショ糖）：和光純薬社、196-13705
　アスコルビン酸Na：和光純薬社、196-01252
　以上の結果、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、塩化亜鉛、サリチル酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、または酢酸亜鉛を含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかった。また、臭化Ｎａ、亜硫酸水素Ｎａ、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Ｎａ、ブドウ糖、またはアスコルビン酸を添加した場合には、かえって安定性が低下していた。
　＜評価例３＞
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表６に示すように各種添加物を溶解した（No.37～43）。さらに、それぞれの水溶液に塩化鉄（II）を１１．３ｐｐｂ（２価の溶解性鉄として５ｐｐｂ）添加した。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その後、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、２価の溶解性鉄を５ｐｐｂ含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が低下することが示された。さらには、その安定性の低下は、塩化亜鉛または酢酸亜鉛によって顕著に抑制されることがわかった。
　＜評価例３＞
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表７に示す濃度で塩化亜鉛を溶解した（No.44～50）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以上の結果から、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、塩化亜鉛を０．０１μg／ｍＬ以上含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかった。また、その安定性の向上は、塩化亜鉛を１μg／ｍＬ含有したあたりで緩やかになった。
　＜評価例４＞
　２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、塩化亜鉛を、濃度が１μg／ｍＬとなるように溶解した。さらに、それぞれの水溶液に表８に示す濃度の塩化鉄（II）を添加した（No.51～56）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その後、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８の結果と、表３の結果をグラフにすると、図１の通りである。この図１から、２価の溶解性鉄濃度が低濃度含まれているヒアルロン溶液に、塩化亜鉛を１μg／ｍＬ含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかる。この安定化効果は、特に２価の溶解性鉄濃度が５ｐｐｂ以下のときに顕著であった。
　以上のように、２価の溶解性鉄の含有率が低いヒアルロン酸Ｎａ水溶液は、保存後の極限粘度残存率が向上していた。さらには、そのヒアルロン酸Ｎａ水溶液に塩化亜鉛を含有させると、より一層極限粘度残存率が向上した。このヒアルロン酸Ｎａ水溶液は安定性が高く、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくいため、例えば医薬組成物等の原材料として優れている。また、長期保存に適しているためコストも抑えられる。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (12)

  1. 　２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、亜鉛化合物を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  2. 　前記ヒアルロン酸またはその塩の濃度が、５～１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  3. 　前記亜鉛化合物が、サリチル酸亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、炭酸亜鉛、ｐ-ｔ-ブチル安息香酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛、乳酸亜鉛、酢酸亜鉛、および酸化亜鉛からなる群から選ばれる１種以上の亜鉛化合物である、請求項１または２に記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  4. 　前記亜鉛化合物の含有量が０．０１～１００μｇ／ｍＬである、請求項１～３いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  5. 　前記ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が１００万以上である、請求項１～４いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  6. 　前記ヒアルロン酸の前記塩が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１～５いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
  7. 　請求項１～６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、医薬組成物。
  8. 　請求項１～６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、関節症治療用注射剤。
  9. 　請求項１～６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、化粧料組成物。
  10. 　ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、
    　亜鉛化合物と、
    　を水溶液に溶解させる工程を含み、
    　前記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、
    　ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法。
  11. 　ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、
    　亜鉛化合物と、
    　を水溶液に溶解させる工程を含み、
    　前記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、
    　ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法。
  12. 　亜鉛化合物を含む、
    　２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を安定化するための、安定化剤。
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