WO2012096595A1 - Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп - Google Patents

Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп Download PDF

Info

Publication number
WO2012096595A1
WO2012096595A1 PCT/RU2011/001055 RU2011001055W WO2012096595A1 WO 2012096595 A1 WO2012096595 A1 WO 2012096595A1 RU 2011001055 W RU2011001055 W RU 2011001055W WO 2012096595 A1 WO2012096595 A1 WO 2012096595A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
catalyst
palladium
combination
copper
solution
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/001055
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Марк Борисович БАЛАЗОВСКИЙ
Виктор Георгиевич АНТОНОВ
Александр Николаевич БЕЛЯЕВ
Алексей Владимирович ЕРЕМИН
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм"
Priority to JP2013548382A priority Critical patent/JP2014510618A/ja
Priority to EP11855523.4A priority patent/EP2664614A4/en
Priority to KR1020137017892A priority patent/KR20140016251A/ko
Priority to CN2011800644959A priority patent/CN103380108A/zh
Priority to AU2011354771A priority patent/AU2011354771A1/en
Priority to US13/978,936 priority patent/US20130289108A1/en
Publication of WO2012096595A1 publication Critical patent/WO2012096595A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F1/00—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic System
    • C07F1/08—Copper compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid, pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-aminoacids, e.g. alanine, edetic acids [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/34—Copper; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • B01J31/22—Organic complexes
    • B01J31/2204—Organic complexes the ligands containing oxygen or sulfur as complexing atoms
    • B01J31/226—Sulfur, e.g. thiocarbamates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/22—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/24—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of hydropolysulfides or polysulfides by reactions involving the formation of sulfur-to-sulfur bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2231/00—Catalytic reactions performed with catalysts classified in B01J31/00
    • B01J2231/70—Oxidation reactions, e.g. epoxidation, (di)hydroxylation, dehydrogenation and analogues
    • B01J2231/76—Dehydrogenation
    • B01J2231/763—Dehydrogenation of -CH-XH (X= O, NH/N, S) to -C=X or -CX triple bond species
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/02—Compositional aspects of complexes used, e.g. polynuclearity
    • B01J2531/0213—Complexes without C-metal linkages
    • B01J2531/0216—Bi- or polynuclear complexes, i.e. comprising two or more metal coordination centres, without metal-metal bonds, e.g. Cp(Lx)Zr-imidazole-Zr(Lx)Cp
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/10—Complexes comprising metals of Group I (IA or IB) as the central metal
    • B01J2531/16—Copper
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/80—Complexes comprising metals of Group VIII as the central metal
    • B01J2531/82—Metals of the platinum group
    • B01J2531/824—Palladium

Definitions

  • This invention relates to bio-inorganic chemistry, medical chemistry and medicine, and in particular to the field of obtaining drugs, and can be used in bio-inorganic chemistry, pharmacology, medicine and veterinary medicine.
  • Improving the therapeutic efficacy of pharmacological molecules by optimizing their pharmacokinetics and / or pharmacodynamics and / or reducing toxicity due to chemical modification of the drug molecule and / or its combined use with another chemical compound or compounds is one of the directions in the creation of new generation drugs that are active in physiologically more optimal doses.
  • combination agents including Amoxiclav, containing amoxicillin and clavulanic acid, Tienam containing imipenem in combination with a specific inhibitor of the enzyme of the kidney dihydropeptidase cilastatin.
  • Clavulanic acid prevents the decomposition of amoxicillin by bacterial enzymes, and cilastatin inhibits the metabolism of imipenem in the kidneys, which significantly increases the concentration of unchanged antibiotic in the kidneys and urinary tract.
  • GSSG disulfide M-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine - oxidized glutathione
  • GSSG disulfide M-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine - oxidized glutathione
  • a pharmacological solution has been proposed to enhance the antiviral activity of inosine used in the form of an organic salt with oxidized glutathione (RU 2153350, RU2153351).
  • composition of the oxidized glutathione preparation disclosed in RU 2153350 includes cisplatin, which is a complex compound of platinum (Pt), the use of which is associated with the danger of toxic and mutagenic effects. Moreover, it is platinum that exhibits a catalytic effect when used in a minimal amount.
  • SR is a thiolate ligand residue selected from the group consisting of glutathione and acetylcysteine,
  • the oxidation is a homogeneous selective oxidation of thiols with the formation of disulfide bonds between thiol residues, the thiol having a catalytic function in relation to its oxidation is ⁇ -acetyl-cysteine or Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine.
  • the catalyst is prepared by reacting the mononuclear aminate complexes of palladium (M) and the corresponding thiols with complexes formed from copper salts (I) and the corresponding thiols.
  • the molar ratio of Pd: Cu lies in the range from 1: 0.1 to 1: 2, more preferably in the range from 1: 0.2 to 1: 1.
  • the catalyst of the invention can be used in therapy.
  • a catalytic combination formed by a thiol selected from acetylcysteine, glutathione, their solvates and salts, and a catalyst according to the invention.
  • the catalyst is present in an amount of from 1 -10 "2 to 1 -10 " 7 g per mole of thiol.
  • the proposed combination may essentially consist only of acetylcysteine disulfide and / or glutathione, their solvates and salts and a catalyst according to the invention.
  • the combination of the invention can be used in therapy.
  • a pharmacological combination including said catalytic combination and a pharmacologically active compound capable of reacting with the components of the combination.
  • This combination is expediently used to increase the therapeutic activity of the pharmacologically active compound.
  • the specified pharmacologically active compound may be a drug or biologically active molecule selected from purine or pyrimidine bases or their derivatives.
  • the pharmacologically active compound may be, for example, ribavirin.
  • a pharmaceutical composition comprising the described catalyst or combination and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Such a pharmaceutical composition enhances the therapeutic activity of pharmacologically active compounds.
  • a method of therapeutic treatment of a patient’s body is also proposed to increase the therapeutic activity of a pharmacologically active compound in which an effective amount of the catalyst, combination or composition of the invention is administered to a patient in need thereof.
  • the inventors of the present invention have found that many manifestations of the pharmacological activity of Y-glutamyl-disteinyl-disulfide glycine obtained by the method of RU 2153350, is associated with the ability of the drug to carry out catalytic oxidation of sulfhydryl groups to disulfides in the composition of peptide molecules.
  • the inventors have identified the need for controlled catalysis, which was achieved using the proposed catalyst according to the invention.
  • Copper thiolate complexes (1) being added to the binuclear thiolath bridging coordination compounds of palladium (I), are able to significantly change the rate, but not the depth of thiol oxidation.
  • Figure 1 presents the dependence of the accumulation of N-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine disulfide (GSSG) as a function of the ratio of Pd: Cu in the system "GSH - H 2 0 2 - [Pd M-SG) 2 (NH 3 ) 4 KCu ' k (SR) m ⁇ >>.
  • GSSG N-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine disulfide
  • the catalytic efficiency of the palladium catalyst modified with copper ions (1) increases with a change in the Pd: Cu ratio from 1: 0 to 1: 2.
  • Spatial proximity thiolate ions contained as ligands in the coordination sphere of the metal can easily be achieved in binuclear compounds of palladium (II) in which RS thiolate ions "occupy bidentatnomostikovuyu coordination leading to the formation of the core Pd 2 'V- SR) 2
  • Equations (5) and (7) represent the stages during which the catalyst consumed and regenerated again.
  • Reaction (6) is the main step by which the formation of an intermediate unstable palladium complex ⁇ [Pd 2 ⁇ -SR) 2 (NH 3 ) 4 (OH) 2 ] 2+ ⁇ is possible.
  • Cu ' k (SR) m significantly more efficiently act as catalysts for the oxidation process.
  • aqueous solutions of glutathione disulfide containing Cu ' k (SR) m are unstable, and under aerobic conditions after 30-60 minutes. processes of deeper oxidation of the resulting disulfides begin. This makes it practically impossible to use coordination compounds Cu ' k (SR) m as selective catalysts for the oxidation of thiols to their disulfide forms.
  • aqueous solutions containing Pd-Cu catalysts are resistant to decomposition processes in the case when the concentration of copper atoms does not exceed the concentration of palladium atoms.
  • Exceeding the Pd: Cu ratio greater than 1: 1 under aerobic conditions is accompanied by a slow decomposition of GSSG. So, with a Pd: Cu ratio already equal to only 1: 2, a decrease in the GSSG concentration reaches 96% after about 1 week.
  • d-AO atomic d-orbitals
  • MO molecular orbitals
  • the catalytic system for the selective oxidation of thiols based on mixed intermediate-formed Cu 'and Pd should have greater activity than the system based on similar Pd complexes.
  • the reason for this lies in the energy level of copper d-orbitals.
  • the proposed catalysts of the invention can be combined with disulfides of Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine and / or L-acetyl-L-cysteine to form a combination with both natural biological and catalytic activity.
  • An excess of thiol makes it possible to manufacture and use small and ultralow doses of the catalyst directly, providing it with the substrate necessary for the catalytic cycle.
  • Free disulfide molecules of ⁇ -acetyl-cysteine and / or Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine in the composition of the preparation can be either in cationic or anionic form, or in the form of neutral particles.
  • Inorganic ions for example, sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium, selenium, manganese zinc, vanadium and other chemical elements, or organic compounds, such as amino acids, aliphatic and aromatic ions of organic molecules from various chemical groups, can be used as a counterion possessing biological activity (example N ° 12).
  • the combinations according to the invention may also contain other pharmacologically active compounds, in particular purine and / or pyrimidine bases, their derivatives or compounds based on them (examples N ° 10 and N ° 1 1).
  • pharmacologically active compound any substance that is used for therapeutic purposes, which is a molecule of drug or biologically active substances, in particular purine and / or pyrimidine bases and compounds based on them, for example: Adenosine (9--0-ribofuranosyladenine), Guanosine ( ⁇ - ⁇ -D-ribofuranosylguanidine), Deoxyadenosine (9-0-deoxyribofuranosyladenine), Deoxyguanosine -0-deoxyribofuranosylguanidine), 9- ⁇ -ribofuranosyladenine mono, di, triphosphate, E- -O-ribofuranosylguanidine mono, di, triphosphate, 9-E-0-deoxyribofuranosyladenine mono, di, triphosphate (cordycepin), deoxyribofuranosylguanidine mono, di, triphosphate, cytidine (4-amino-1- [3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) tetrahydrofur
  • Thymidine or deoxythymidine 1 - [(2R, 4S, 5R) -4-n iflpoKcn - 5- (hydroxy) tetrahydrofuran-2-yl] - 5-methylpyridine -2,4-dione, Inosine 9 - [(2R, 3R, 4S, 5R) -3,4-flnrnflpoKCH-5- (hydroxymethyl) oxolan-2-yl] -6,9-dihydro-3 ⁇ -purine-6 -one, Ribaverine: 1 - (3,4-dihydroxy-5-hydroxymethyl-tetrahydrofuran-2-yl) -1 H- [1, 2,4] triazole-3-carboxylic acid amide, Zanamivir (2R, 3R4S) - 4 - [(diaminomethylidene) amino] -
  • a pharmacologically active compound may be associated with an excess of ⁇ -acetyl-cysteine disulfides and / or Li-glutamyl- ⁇ -cysteinyl-glycine van der Waals forces (ionic, hydrogen and other non-covalent bonds).
  • Combinations of the invention can be made according to methods known in the art, taking into account the chemical properties of the palladium-copper catalysts of the invention, disulfides ( ⁇ -acetyl-cysteine and / or N-glutamyl- ⁇ -cysteinyl-glycine) and pharmacologically active substances.
  • the proportion of the catalyst of the invention in the preparation is from 1 "2" to 1-10 "7 g per mole of aliphatic thiol disulfide - N-acetyl-cysteine and / or Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine.
  • the proposed palladium-copper catalyst or catalytic combination according to the invention can be used to enhance the therapeutic activity of purine and / or pyrimidine base or a derivative based on them.
  • an increase in the therapeutic efficacy of a pharmacologically active compound is a reduction in a single or course dose, or a decrease in general toxicity and a more pronounced therapeutic effect with a therapeutic dose of or less than a pharmacologically active compound.
  • the palladium-copper catalyst of the invention, the catalytic combination and the pharmacological combination of the invention can be used in the form of pharmaceutical compositions.
  • pharmaceutically acceptable excipients are used.
  • these are inorganic or organic carriers. Lactose, corn starch or its derivatives, talc, stearic acid or its salts and the like. can be used, for example, as such carriers for tablets, coated tablets, dragees and hard gelatine capsules.
  • Suitable carriers for soft gelatine capsules are, for example, vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and • liquid polyols, etc.
  • Suitable carriers for solutions and syrups are, for example, water, polyols, sucrose, invert sugar, glucose and the like.
  • Suitable carriers for suppositories are, for example, natural or hardened oils, waxes, fats, semi-liquid or liquid polyols and the like.
  • pharmaceutical compositions may contain preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, sweeteners, colorants, flavoring agents, salts for regulating the osmotic pressure, buffers, masking agents or antioxidants and other necessary components.
  • a palladium-copper catalyst or a catalytic combination according to the invention and pharmacologically active substances, the effectiveness of which they enhance, can be in the same dosage form or in separate dosage forms.
  • Administration in separate dosage forms can be carried out simultaneously (simultaneous administration of two solid dosage forms, for example, tablets, simultaneous injection, in particular in one syringe), or sequentially when the patient is given or administered the first dosage form and then the second dosage form.
  • the interval between administration is preferably not more than 1 hour, but can be increased until a synergistic effect is observed.
  • the optimal order of administration depends on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the pharmacologically active substance, the effectiveness of which should be enhanced (absorption rate, distribution, excretion rate, especially cellular, organ tropism or systemic tropism) and can be selected individually for each specific substance.
  • the amount of introduced palladium-copper catalyst is determined by the mass fraction of Pd and Cu in the composition of the catalyst, which may correspond to or be lower than the daily requirement for each metal. Otherwise, the amount of d-metal introduced as part of the coordination compound is determined by the need to achieve a treatment result.
  • the therapeutic result can be achieved by introducing the catalyst in an amount of from 1 ⁇ 10 "3 to 1 -10 " 8 g per kg of patient body weight, which, in terms of the amount of disulfide in combination, will be from 1 * 10 ⁇ 2 to 1 x10 "5 mol disulfide per kg body weight.
  • Example ⁇ 1 Preparation of the Pd-Cu catalyst based on the ammonium complex of palladium (M) with L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine (GSH)
  • the resulting catalyst solution can be used to oxidize water-soluble thiols (for example: GSH or acetylcysteine).
  • water-soluble thiols for example: GSH or acetylcysteine
  • the molar ratio of palladium to copper is 2: 1.
  • Example Ns Preparation of a Pd-Cu catalyst based on an ammonia complex of palladium (I) with glutathione and its use for the synthesis of Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine disulfide (GSSG).
  • the previously prepared catalyst solution is poured into the obtained reaction system, and 50 ml of a 1 M freshly prepared hydrogen peroxide solution are poured in small portions with vigorous stirring, preventing the reaction mixture from heating above 15 ° C. The completeness of the reaction is monitored by HPLC.
  • the solution After completion of the reaction and sterilizing filtration, the solution is frozen and subjected to vacuum freeze-drying (lyophilic) drying.
  • the molar ratio "sodium salt of 1 ⁇ 1-glutamyl -...-cysteinyl-glycine-palladium-copper disulfide" is 1000 - 1 - 1.
  • Example N9 Preparation of a Pd-Cu catalyst based on the ammonium complex of palladium (P) with M-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine (GSH) and its use for the preparation of glycylcysteinylglutamate ribofuranosylhypoxanthine disodium
  • the previously prepared catalyst solution is poured into the obtained reaction system, the beaker is transferred to an ice bath (5-10 ° C) and in small portions, 100-102 ml ( ⁇ 0.1 mol) of a 1M freshly prepared hydrogen peroxide solution are poured over 45-60 minutes with vigorous stirring . The completeness of the reaction is monitored by HPLC.
  • ribofuranosylhypoxanthine inosine
  • 150 ml of hot distilled water 60-70 ° C.
  • the solution is cooled to room temperature and poured into the reaction mixture.
  • the solution is frozen and subjected to vacuum freeze-drying (lyophilic) drying.
  • the molar ratio of GSSG - inosine - palladium - copper is 1000-1000-1-0.9.
  • Example N2 Preparation of a Pd-Cu catalyst based on an ammonia derivative of the binuclear coordination compound Pd (ll) with L-acetyl-L cysteine
  • the resulting yellow-green catalyst solution can be used to oxidize water-soluble thiols (for example: reduced glutathione or acetylcysteine) or lyophilized for further use.
  • water-soluble thiols for example: reduced glutathione or acetylcysteine
  • the molar ratio of palladium to copper is 2: 1.
  • Example N2 Preparation of a Pd-Cu catalyst based on the ammonia derivative of the binuclear coordination compound Pd (ll) with 1 ⁇ 1-acetylcysteine and its use for the synthesis of the sodium salt of ⁇ -acetyl-L-cysteine disulfide. Stage 1. Obtaining an ammonia complex of palladium (M) with L-acetyl-L-cysteine
  • the molar ratio "sodium salt of Y-acetyl-L-cysteine disulfide - palladium - copper" is 1000 - 1 - 0.5.
  • Example N2 Preparation of a Pd-Cu catalyst based on an ammonia derivative of the binuclear coordination compound Pd (ll) with L-acetyl-L-cysteine and its use for the synthesis of the lithium salt of L-acetyl-L-cysteine disulfide.
  • Stage 2 Obtaining Pd-Cu catalyst 5 ml of a solution containing 6.5 mg (37.8 ⁇ mol) of CuCI 2 2H 2 0 is added to the resulting solution.
  • the resulting catalyst solution is made alkaline to pH 4.5-5.0 with a saturated solution of lithium hydroxide.
  • the solution After completion of the reaction and sterilizing filtration, the solution is frozen and subjected to vacuum freeze-drying (lyophilic) drying.
  • the molar ratio of lithium salt of 1 ⁇ 1-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine disulfide - palladium - copper is 1000 - 1 - 2.
  • Example 8.2 Preparation of a catalyst based on the ammonia derivative of the binuclear coordination compound Pd (ll) with r>] - glutamyl-1_-cysteinyl-glycine (GSH) and its use for the synthesis of glycylcysteinyl-glutamate disulfide 1 - [(2 ⁇ ?, ⁇ ?, 4 $, 5 /?) - 3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) oxolan-2-yl] -1 H-1, 2,4-triazole-3-carboxamide (GSSG - ribavirin)
  • the solution is frozen and subjected to vacuum freeze-drying (lyophilic) drying.
  • - palladium - copper is 1000 - 1000 - 1 - 1.5.
  • Example Ns 9. Comparative evaluation of the biological activity and toxicity of the coordination compounds of platinum and a paladium-copper catalyst when exposed to cell growth.
  • Platinum compounds have pharmacological activity due to the catalytic effect in the reactions of oxidative modification of sulfhydryl groups of peptide molecules, which underlies the stimulating effect on the production of cytokines by cellular effectors of the immune system, the selective inhibition of reactions of multiple drug resistance to antibiotics, the ability to suppress the development of autoimmune reactions that lie in the basis of many chronic socially significant diseases - psoriasis, neurodegenerative e and viral diseases.
  • platinum compounds have a number of properties that are in demand in pharmacological solutions and are due to the catalytic effect in the reactions of oxidative modification of sulfhydryl groups of peptide molecules.
  • platinum compounds are distinguished by high toxicity, the mechanism of which is not associated with catalytic activity.
  • the toxicity of platinum chemical compounds is acute, i.e. It appears relatively quickly after the introduction or ingestion of a substance containing platinum into the body, if the maximum permissible concentration of platinum is exceeded.
  • platinum is introduced into the body as a part of substances below the maximum permissible concentration, a gradual accumulation of platinum in the tissues of various organs can occur. In this case, the toxic effect of platinum compounds appears later or with a characteristic pattern of poisoning does not appear at all, however, the mutagenic effect of platinum can cause the development of malignant neoplasms.
  • Synthesized catalysts based on coordination compounds of aliphatic thiols (L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine - GSH, L-acetyl-L- cysteine) and d-metals of palladium and copper (examples Ns1, ⁇ ° 4) also characterize the catalytic activity in the chemical reaction of the oxidation of thiols as a part of peptide molecules and pharmacologically demanded thiol-containing molecules, characteristic of coordination compounds of platinum.
  • Compounds of palladium and copper are not toxic in comparison with compounds of platinum, they are not inherent mutagenic and teratogenic effects.
  • the nature of the cellular response allowed us to evaluate the similarity and / or differences in the effect on the cells of the catalyst based on the coordination compounds of GSH and d-metals of palladium and copper, M-acetyl-1_-cysteine and d-metals of palladium and copper, oxidized glutathione and platinum.
  • test compounds were stored at +4 ° C; immediately before the start of the experiment, the substances were dissolved in deionized water (super Q).
  • concentration of the initial solution is 1000 times or more higher than the concentration used in the experiment.
  • the prepared concentrated solution is stored for no more than 5 hours at +4 ° C.
  • Compounds were added to the cell culture medium to the test final concentration.
  • drugs were added to the cells once and the cells were incubated for 48 hours.
  • the experiments are added to the cells once a day after 24 hours five times the cells were incubated for 120 hours.
  • the corresponding volume of saline was added.
  • the number of living and dead cells in the culture was determined after 24 and 48 hours in the first series of experiments and after 24, 48, 72, 96, 120 hours in the second series of experiments.
  • A431 human epidermoid carcinoma cells obtained from the All-Russian collection of cell cultures (Institute of Cytology RAS, St. Russia).
  • Cells are cultured in a C0 2 incubator (New Brunswick Scientific) at +37 ° C and with a C0 2 content of 5%. Under these conditions, cells are grown to a monolayer culture and are exposed to the studied compounds.
  • DMEM medium is used (PanEco LLC,
  • A431 cells were seeded on plastic Petri dishes (Nunc) at a concentration of 10,0007 cm 2 , after 24 hours, when they reached 10-15% of the monolayer, they were exposed to the studied drugs.
  • the A431 cell culture medium was collected in test tubes (Falkon) for complete analysis of detached dead cells, and the cells on Petri dishes were washed with PBS (which was combined with the collected medium) and treated with a 0.25% trypsin solution in Versene (Paneko) for about 10 min at room temperature before cell detachment. Next, the cells were suspended by pipetting with an automatic pipette and combined with previously collected medium. Samples were centrifuged for 5 min 400 g at room temperature, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended in PBS phosphate buffered saline pH 7.4.
  • Propidium iodide was added to the cell suspension to a concentration of 50 ⁇ g / ml per
  • Test compound cultures H b (hour) (x 1 0 s / 2 .5 ⁇ l) cells (%)
  • the data obtained indicate that with a single exposure of the studied compounds to the cell culture, proliferative activity is stimulated in comparison with the control series.
  • the revealed effect is comparable for all the investigated substances.
  • the similarity of the results of the cell culture response when exposed to various coordination compounds is one of the evidence of the common mechanism of action and the cellular response to it.
  • the amount of metal introduced once is relatively small.
  • the experimental results show almost the same proliferative activity of cells every other day both in control and when exposed to all the studied compounds.
  • the previously revealed regularity of lesser cell death after a day under the influence of the studied compounds is preserved in comparison with the control.
  • the action on the cells with the coordination compound of glutathione disulfide with cisplatin on the second and next days leads to a decrease in the proliferative activity of the culture and increased cell death almost twice exceeding the values of similar indicators in the control.
  • the effect on the cell culture of compound Ns> 1 and compound N ° 2 predetermined an almost linear daily increase in the number of cells and a relatively constant value of their death.
  • the totality of the results obtained indicates certain patterns that, on the one hand, are determined by the activity of the test compound as a whole, and on the other, reflect the peculiarities of the action of metals forming coordination compounds on a biological object.
  • a similar dynamics of cell growth and death after 24 hours under the action of all the studied coordination compounds indicates a similar mechanism of their effect, regardless of metal and aliphatic thiol.
  • coordination compounds are not removed from the culture medium, which means that any subsequent administration increases their concentration. If we consider that the ligand is an actively metabolizable structure, then it is logical assumption of the release of the metal complex. Cisplatin is a stable molecule.
  • cisplatin Being non-toxic in the complex compound, cisplatin, during ligand degradation, exhibits its biological cytotoxic effect. In this regard, we observe an active increase in dead cells and low proliferative activity. It is possible that in addition to cisplatin in a closed system, nucleotides modified with cisplatin have a cytotoxic effect when they participate in nucleic acid synthesis reactions.
  • the biological activity of d-metals palladium and copper is different from cisplatin.
  • Palladium and its compounds are a biologically relatively neutral molecule.
  • Copper is a bioelement and is actively used by cells as part of various enzymes involved in the reactions of energy release, detoxification, physiologically ordered synthesis and breakdown of biomolecules.
  • biologically positive effects of a catalyst based on coordination compounds of aliphatic thiols of p-palladium and copper d-metals are revealed under experimental conditions.
  • catalysts based on the coordination compounds of the aliphatic thiols Y-glutamyl-L-cysteinyl-glycine and Y-acetyl-cysteine with d-metals palladium and copper characterize a similar mechanism of action on cells inherent in the coordination compound of oxidized glutathione and cisplatin, but they have no toxicity inherent in platinum compounds.
  • catalysts based on complex compounds of aliphatic thiols of coordination compounds of aliphatic thiols M-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine and M-acetyl-1_-cysteine with d-metals palladium and copper can be used in pharmacological solutions with drugs for the treatment of various the duration at which catalytic activity is required in the reactions of the oxidative modification of thiols to disulfides in the composition of peptide molecules.
  • Example I Comparative assessment of the ability of the coordination compound of oxidized glutathione and cisplatin and the ability of a catalyst based on the coordination compound M-glutamyl-1_-cysteinyl-glycine palladium and copper to potentiate the antiviral activity of inosine
  • Patents RU2153350, RU2153351 discusses a pharmacological solution for potentiating the antiviral activity of inosine, preferably using a coordination compound of cisplatin and oxidized glutathione.
  • the potentiation effect is presumably achieved due to the ability of the compound of cisplatin and oxidized glutathione to catalyze the complex of reactions of oxidative modification of the target, increasing its affinity for inosine. If the mechanism of potentiation of the antiviral effect of inosine is associated with the catalytic activity of coordination compounds, the agent according to the invention should have a similar more pronounced effect, since they are distinguished by a higher catalytic activity in comparison with the coordination compound of cisplatin and oxidized glutathione.
  • LDR Rift Valley fever virus
  • the accumulation of virus-containing material for infection of laboratory animals is carried out using 3-5-day-old sucker mice - 10-15 goals. Initially, five consecutive tenfold dilutions of virus-containing material were prepared. 0.02 ml of each dilution was injected into the brain of sucker mice, which was monitored for 24-48 hours, after which the animals were killed with ether, the brain was removed and three samples were deposited in penicillin vials, which were stored in a freezer at a temperature of minus (20 ⁇ 0.5) ° ⁇ . Subsequently, a 10% suspension of the brain was used as a virus-containing material. The initial titer of the virus 10 5 -10 6 LD 50 / ml;
  • TBE tick-borne encephalitis virus
  • the accumulation of virus-containing material for infection of laboratory animals was carried out on sucker mice. Initially, five consecutive ten-fold dilutions of virus-containing material were prepared, which were a centrifugate of a 10% suspension of the brain of previously infected mice or virus-containing material rehydrated from the lyophilic state. 0.02 ml of each dilution was injected into the brain of sucker mice, which was monitored for 24-48 hours, after which the animals were killed with ether, the brain was removed and three samples were deposited in penicillin vials, which were stored in a freezer at a temperature of minus (20 ⁇ 0.5) ° ⁇ .
  • a 10% suspension of the brain was used as a virus-containing material.
  • the initial titer of the virus is 10 2 - 10 3 LD 50 / ml.
  • Studies evaluating the effectiveness of pharmacological compositions NQ1 and NS2 were performed on white non-inbred male mice weighing 16-18 g (360 animals).
  • the effectiveness of the studied drugs was determined by comparing the values of the survival rates of animals in the experimental (treated with the appropriate drugs) and control groups. The percentage of surviving animals in the experimental and control groups was determined according to Genes B.C. tables. . Moreover, the monitoring of infected animals was carried out for 21 days, daily recording the number of living and dead in the experimental and control groups.
  • Pharmacological compositions N ° 1 and Ns2 were administered subcutaneously in a volume of 0.5 ml in a single dose of 30 mg / kg body weight (10 ⁇ g / mouse).
  • the protective effect was at the level of 100% (for infection with the pathogen at a dose of 12 LD 50 ) and 100% (when infected with a pathogen in a dose of 2 LD 50 ).
  • the protection indicators depending on the infecting dose of the pathogen, were 40-60% lower than when using FC N ° 1.
  • FC N ° 1 turned out to be the most effective in relation to experimental VEL infection, including invention.
  • ⁇ N ° 1 applied according to the emergency prevention scheme, provided protection for 100% of infected animals against 100% mortality in the control.
  • Ns1 FC including the agent of the invention, had a more pronounced antiviral activity in Compared with the pharmacological composition N ° 2 comprising a coordination compound of oxidized glutathione and cisplatin.
  • Example 11 The determination of the ability of the funds according to the invention to potentiate the antiviral activity of ribavirin
  • Ribavirin is a specific antiviral drug. Its effects on the virus are infected cells like inosine.
  • the tool according to the invention capable of stimulating the processes of oxidative modification of proteins, potentiated the antiviral effect of inosine.
  • the similarity of the antiviral effect of inosine and ribavirin suggests the possibility of potentiation of the antiviral effect of 1 - [(2R3R, 4S, 5R) -3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) oxolan-2-yl] -1 H-1, 2,4- triazole-3-carboxamide (the active principle of the pharmacopoeial preparation Ribavirin ® ) by the agent of the invention.
  • Example Ns10 The studies were performed on the experimental models described in Example Ns10.
  • the infectious dose of the pathogen in each model corresponded to Yu LD 50 .
  • the drug N ° 1 In a single dose of 30 mg / kg body weight (10 ⁇ g / mouse).
  • the drug N ° 2 In a single dose of 30 mg / kg body weight (10 ⁇ g / mouse)
  • N ° 1 represents the active principle of pharmaceutical drug Ribavirin ® in combination with an agent of the invention for therapeutic and protective efficacy against experimental infections VEE 1.5-2.0 times superior effect of pharmaceutical drug Ribavirin ® .
  • the preparation N21 which is the active principle of the pharmacopoeial preparation Ribavirin ® in combination with the remedy according to the invention, is protective and therapeutic efficacy in relation to experimental viral infection was more than 2 times greater than the effect of the pharmacopeia drug Ribavirin ® .
  • the drug N ° 1 when used in animals infected with a pathogen at a dose of 10 LD 50 , regardless of the scheme used, showed almost the same protective effectiveness, ensuring the survival rate of 70-80% of infected mice against the background of their 100% mortality in control. At the same time, if the drug N22 was used in infected animals, its effectiveness was less pronounced. The drug provided a protection level of 50% regardless of the administration scheme used, which was 10-30% lower than that of Ns1.
  • the preparation No. 1 which is the active principle of the pharmacopoeial preparation Ribavirin ® in combination with the agent according to the invention, has protective and therapeutic efficacy against experimental viral infections were 1.5-1.8 times greater than the effect of the pharmacopeia drug Ribavirin ® .
  • Example 12 The effect of the agent according to the invention on the hemostimulating activity of lithium ions introduced in the form of the lithium salt of 1CH-acetyl-1_-cysteine disulfide.
  • hemostatic activity of lithium is known in concentrations that are associated with a negative effect of lithium on the functions of the central nervous system.
  • Crystalline substances were stored at 4 ° C; immediately before the start of the experiment, the substance was dissolved in physiological saline. The solution was sterilized by passing through 0.22 ⁇ m Millex-GS filters (Millipore) in a sterile laminar box.
  • NQ3 - animals that received an injection of cyclophosphamide, which, in the future, were injected with the pharmacological composition N21 (FC N ° 1 synthesized as described in Example N26) as a therapeutic agent, containing lithium ions, 1 ⁇ 1-acetyl-1_-cysteine disulfide and the agent according to the invention in physiological saline at a dose of 10 mg / kg (amount of coordination compound 7.8> ⁇ 10 "8 M / kg);
  • N ° 4 - animals that received an injection of cyclophosphamide, which, in the future, were injected with aC-Li (preparation N Q 2) as a therapeutic agent in physiological saline at a dose of 10 mg / kg;
  • Ns5 - animals that received an injection of cyclophosphamide, which, in the future, was injected with lithium carbonate (preparation N ° 3) in physiological saline at a dose of 3 mg / kg (amount of lithium carbonate, calculated on the basis of the mass fraction of lithium ion (0.55) in 10 mg of lithium salt of cysteine, a similar amount of lithium is contained in 3 mg of lithium carbonate);
  • N ° 6 - animals that received an injection of cyclophosphamide, which, in the future, were injected with acetylcysteine disulfide (preparation N ° 4) in physiological saline at a dose of 9.5 mg / kg as a therapeutic agent;
  • the studied drugs were administered on the third day after the introduction of cyclophosphamide.
  • Lymphocytes % 75.4 + 1.4 56.7 + 1 .1 * 52.5 + 1 .3 * 49.7 + 1.6 * 21 +0.9 * 62 + 0.9) *
  • hemostatic stimulator Li 2 HC0 3 - preparation N ° 3
  • lithium salt of N-acetyl-1_-cysteine disulfide preparation N ° 2
  • lithium salt of disul Cffooosikln-feed-acetyl-cysteine in combination with the agent according to the invention FC N ° 1
  • FC N ° 1 when p p ea s ppter Ns6
  • Lymphocytes % 75.4 + 1.4 56.7 + 1.1 * 52.5 + 1 .3 * 49.7 + 1 .6 * 21 +0.9 * 62 + 0.9) *
  • hemostatic stimulator Li 2 HC0 3 - preparation N ° 3) N4 , s with lithium salt of N-acetyl-1_-cysteine disulfide (preparation N ° 2) and lithium salt of Y-acetyl-cysteine disulfide in combination with the agent according to the invention (FC N ° 1), example ⁇ ° 6)
  • Lymphocytes % 74.5 ⁇ 1.4 72.9 ⁇ 1.8 71.011.6 70.3 + 0.9 71.3 + 1.4 72.9 + 1.1
  • Cyclophosphamide at a dose of 120 mg / kg causes a fairly pronounced cytopenia in all blood cells with absolute and relative lymphopenia, most pronounced on the 14th day (1-3).
  • Lithium introduced in the lithium salt of 1 ⁇ 1-acetyl-1_-cysteine disulfide in combination with the agent of the invention, has a pronounced hemostimulating effect, which manifests itself in the almost complete restoration of blood cellularity.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Предложен палладиево-медный катализатор гомогенного селективного окисления тиолов, сочетающий в себе функциональное биядерное тиолатмостиковое координационное соединение палладия(II) и модифицирующий тиолатный комплекс меди(I), имеющий общую формулу [Pd2 II(µ -SR)2(NH3)4] ⋅ {CuI k(SR)m} (I), где SR представляет собой остаток тиолатного лиганда, выбранный из группы, включающей в себя остаток глутатиона и ацетилцистеина, k = 2 - 14, m ≥ 3k. Также предложены каталитическая комбинация, фармакологическая комбинация, фармацевтическая композиция, и способ терапевтического воздействия на организм пациента на основе указанного катализатора.

Description

Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к бионеорганической химии, медицинской химии и медицине, а именно к области получения лекарственных препаратов, и может быть использовано в бионеорганической химии, фармакологии, медицине и ветеринарии.
Предшествующий уровень техники
Повышение терапевтической эффективности фармакологических молекул посредством оптимизации их фармакокинетики и/или фармакодинамики и/или снижения токсичности за счет химической модификации молекулы лекарственного средства и/или ее сочетанным использованием с другим химическим соединением или соединениями является одним из направлений создания лекарственных препаратов нового поколения, проявляющих свою активность в физиологически более оптимальных дозах.
Так известен ряд комбинированных средств, в том числе Амоксиклав, содержащий в своем составе амоксициллин и клавулановую кислоту, Тиенам, содержащий имипенем в сочетании со специфическим ингибитором фермента дигидропептидазы почек циластатином. Клавулановая кислота препятствует разложению бактериальными ферментами амоксициллина, а циластатин тормозит метаболизм имипенема в почках, что значительно повышает концентрацию неизмененного антибиотика в почках и мочевыводящих путях.
Существует, однако, масса других лекарственных средств, потенциально полезных для лечения заболеваний, однако не обеспечивающих желаемого эффекта в силу развития к ним того или иного вида устойчивости.
В настоящее время известно вещество дисульфид М-глутамил-1_-цистеинил- глицина - окисленный глутатион (GSSG), которое само по себе обладает разнообразной фармакологической активностью. В частности, выявлена способность окисленного глутатиона инициировать процессы, осуществляющие различные виды химической модификации: фосфорилирование, глутатионелирование, окисление и др., - которые предшествуют формированию определенной структурной конформации с высоким сродством к лиганду и способностью к выполнению физиологической функции. Показана способность окисленного глутатиона усиливать продукцию широкого спектра цитокинов, контролирующих комплекс защитных реакций организма, включая противовирусное, антибактериальное, противоопухолевое, антифибротическое действие. Предложен спектр фармакологических решений по созданию композитов с включающих комплексное соединение окисленного глутатиона и цисплатина в сочетании с фармакологически активными молекулами для лечения различных заболеваний, включая сахарный диабет, ишемическую болезнь сердца, вирусные гепатиты, злокачественные опухоли, гнойные инфекции и ряд других. В частности, для лечения лекарственно резистентных форм вирусных гепатитов В и С предложено фармакологическое решение по усилению противовирусной активности инозина, применяемого в форме органической соли с окисленным глутатионом (RU 2153350, RU2153351 ).
Однако в состав препарата окисленного глутатиона, раскрытого в RU 2153350, входит цисплатин, представляющий собой комплексное соединение платины (Pt), применение которой сопряжено с опасностью токсического и мутагенного действия. При этом именно платина проявляет каталитический эффект при использовании её в минимальном количестве.
Опасность токсического действия платины в составе препарата окисленного глутатиона при многократном введении доказана в эксперименте на клетках, где ежедневное введение комплексного соединения платины на протяжении пяти дней привело к подавлению пролиферативной активности культуры и ее гибели. Использование окисленного глутатиона также накладывает определенные ограничения на возможные фармакологические решения, так как позволяет создавать лекарственные формы преимущественно парентерального введения.
Поэтому существует необходимость в разработке новых препаратов, обладающих способностью повышать терапевтическую эффективность фармакологических молекул посредством оптимизации их фармакокинетики и/или фармакодинамики, пригодных для создания лекарственные формы энтерального, парентерального и иных возможных способов введения.
Сущность изобретения
Данная задача решена тем, что предложен палладиево-медный катализатор гомогенного селективного окисления тиолов, сочетающий в себе функциональное биядерное тиолатмостиковое координационное соединение палладия(И) и модифицирующий тиолатный комплекс меди(1), имеющий общую формулу
[Pd2VSR)2(NH3)4] - {Cu'k(SR)m} (I), где
SR представляет собой остаток тиолатного лиганда, выбранный из группы, включающей в себя остаток глутатиона и ацетилцистеина,
к = 2 + 14,
m > Зк.
Предпочтительно окисление представляет собой гомогенное селективное окисление тиолов с образованием дисульфидных связей между тиольными остатками, причем тиол, в отношении окисления которого осуществляется каталитическая функция, представляет собой Ν-ацетил-цистеин или Ы-глутамил-L- цистеинил-глицин.
Предпочтительно катализатор получают путем взаимодействия моноядерных аминатных комплексов палладия(М) и соответствующих тиолов с комплексами, образующимися из солей меди(И) и соответствующих тиолов.
Целесообразно в катализаторе по изобретению мольное соотношение Pd:Cu, лежит в интервале от 1 :0,1 до 1 :2, более предпочтительно в интервале от 1 :0,2 до 1 :1.
Катализатор по изобретению можно применять в терапии.
Предложена также каталитическая комбинация, образованная тиолом, выбранным из ацетилцистеина, глутатиона, их сольватов и солей, и катализатором по изобретению.
Предпочтительно в комбинации катализатор присутствует в количестве от 1 -10"2 до 1 -10"7 г на моль тиола. Причем предложенная комбинация может по существу состоять только из дисульфида ацетилцистеина и/или глутатиона, их сольватов и солей и катализатора по изобретению.
Комбинацию по изобретению можно применять в терапии.
Предложена также фармакологическая комбинация, включающая в себя указанную каталитическую комбинацию и фармакологически активное соединение, способное к вступлению в реакцию присоединения с компонентами комбинации.
Эту комбинацию целесообразно применять для повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения.
Указанное фармакологически активное соединение может представлять собой лекарственную или биологически активную молекулу, выбранную из пуриновых или пиримидиновых оснований или их производных.
Эту комбинацию можно применять в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний. Фармакологически активное соединение может представлять собой, например, рибавирин.
Предложена также фармацевтическая композиция, включающая в себя описанные катализатор или комбинацию и фармацевтически приемлемый эксципиент. Такая фармацевтическая композиция повышает терапевтическую активность фармакологически активных соединений.
Предложен также способ терапевтического воздействия на организм пациента для повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят эффективное количество катализатора, комбинации или композиции по изобретению.
Описание графических материалов
На Фиг.1 представлена зависимость накопления дисульфида Ы-глутамил-Ь- цистеинил-глицина как функция соотношения числа молей Pd:Cu в системе: «GSH - Н202 - [Pd"2(M-SG)2(NH3)4] {Culn(SR)m}» (tg(a) - тангенс угла наклона для реакции окисления глутатиона пероксидом водорода в присутствии катализатора Pd-Cu, L=n(Cu)/n(Pd), 25±0.1 °С, CGSH 2 мг/мл, рН 6.0, Cpd 3.4е-6 моль/литр). Фиг.2. демонстрирует относительную каталитическую эффективность комплексов {Cu'k(SR)m} в реакции окисления 1Ч-глутамил-1_-цистеинил-глицина пероксидом водорода по сравнению с биядерным комплексом палладия [Pd2( - SG)2(NH3)4]2+ (25±0.1 °С, CQSH = 2 мг/мл, рН = 5.3, См = 6,5е-6 моль/литр). На Фиг 3. Представлены кривые окисления М-глутамил-1_-цистеинил-глицина комплексами палладия, меди и бинарным катализатором Pd-Cu (25±0.1 °С, CGSH 2 мг/мл, рН 6.0, См 6.3е-6 моль/литр).
Подробное описание изобретения
Попытки авторов изобретения использовать препарат дисульфида N- глутамил-1_-цистеинил-глицина получаемый без использования цисплатина или с использованием другого металла, привели к снижению терапевтических результатов.
Авторами данного изобретения было обнаружено, что множество проявлений фармакологической активности дисульфида Ы-глутамил- дистеинил- глицина, получаемого по способу из RU 2153350, сопряжено со способностью препарата осуществлять каталитическое окисление сульфгидрильных групп до дисульфидов в составе молекул пептидной природы.
Авторы изобретения выявили необходимость осуществления управляемого катализа, что было достигнуто с помощью предложенного катализатора по изобретению.
Тиолатные комплексы меди(1), будучи добавленными к биядерным тиолатмостиковым координационным соединениям палладия(И), способны значительно изменять скорость, но не глубину окисления тиола. На Фиг.1 , в качестве примера, представлены зависимости накопления дисульфида N- глутамил-1_-цистеинил-глицина (GSSG) как функции соотношения Pd:Cu в системе «GSH - Н202 - [Pd M-SG)2(NH3)4KCu'k(SR)m}>>.
Как можно видеть из результатов, приведенных на Фиг.1 , каталитическая эффективность палладиевого катализатора, модифицированного ионами меди(1), возрастает при изменении соотношения Pd:Cu от 1 :0 до 1 :2.
Хорошо известно, что ионы Си2+ сами способны эффективно катализировать окисление тиоаминокислот до образования в них связей -S-S-. Поэтому для установления области изменения соотношения Pd:Cu в предлагаемых бинарных каталитических системах Pd-Cu, авторами были отдельно рассмотрены каталитические эффективности биядерных тиолатмостиковых комплексов палладия(И), тиолатных комплексов меди(1) и их совместная работа.
Окисление тиолов биядерными комплексами палладия При каталитическом окислении тиолов RSH одной из наиболее важных функций палладия является образование координационных соединений - продуктов присоединения к иону палладия тиолат-ионов RS-, с последующим их окислением и разрушением координационного полиэдра.
Пространственная близость тиолатных ионов, входящих как лиганды в координационную сферу металла, легко может быть достигнута в биядерных соединениях палладия(И), в которых тиолатные ионы RS" занимают бидентатномостиковую координацию, приводящую к формированию остова Pd2'V- SR)2
Для окисления тиолат-ионов был рассмотрен каталитический цикл с участием биядерного гидроксомостикового аммиачного комплекса палладия(И) - ^2(μ-ΟΗ)2(ΝΗ3)4]2+, для которого в качестве доминирующих были рассмотрены следующие реакции:
[Pd2^-OH)2(NH3)4]2++2RSH . [Pd2^-SR)2(NH3)4]2++2H20 (5)
[Pd2( -SR)2(NH3)4]2++H202 . {[Ρά2(μ-8 )2(ΝΗ3)4(ΟΗ)2]2+}# (6)
{[Pd2^-SR)2(NH3)4(OH)2]2+} . [Pd2^-OH)2(NH3)4]2++RSSR (7)
Уравнения (5) и (7) представляют ступени, в ходе которых катализатор
Figure imgf000007_0001
расходуется и вновь регенерируется. Реакция (6) является основной ступенью, по которой возможно образование промежуточного неустойчивого комплекса палладия {[Pd2^-SR)2(NH3)4(OH)2]2+}.
Квантово-химические расчеты показали, что при окислении биядерного металлического остова Pd2'^-SR)2 пероксидом водорода в промежуточном биметаллическом соединении наиболее энергетически выгодным является присоединение обеих ОН-групп к одному атому палладия, что позволило рассматривать интермедиат как биядерный смешанновалентный комплекс с остовом Pd"Pd'v^-SR)2. Такой остов, в свою очередь, восстанавливаясь, окисляет мостиковые тиолатные группы.
Квантово-химические расчеты координационных соединений проводилась методом DFT B3LYP в 6-31 G" базисе по программе Jaguar 7.5. Для атомов Pd использовался эффективный псевдопотенциал остова HW с соответствующим валентным базисом. Анализ частот нормальных колебаний показал, что все полученные в результате оптимизации геометрии структуры соединений в газовой фазе соответствуют минимумам на поверхности потенциальной энергии. Энергии сольватации соединений рассчитывались в модели поляризуемого континуума. Для сокращения числа базисных функций молекулы глутатиона, ацетилцистеина или тиогликолевой кислоты RSH были моделированы простейшим тиолом CH3SH.
Причина нестабильности промежуточного координационного соединения Pd"Pdlv связана с наличием в его внутренней сфере окислителя (иона Pdlv) и восстановителей (лигандов μ-SR), что приводит к внутрисферному окислительно- восстановительному процессу. Этот процесс включает синхронный перенос двух электронов с пары координированных тиольных мостиков на ион Pdlv, приводящий к разрыву мостиковых связей Pd-SR и объединению двух тиольных радикалов RS- в дисульфид R2S2. Далее в координационной сфере восстановленного палладиевого димера происходит внутримолекулярная перегруппировка лигандов ОН", координированных ранее к Pdlv, в мостиковое положение. В результате образуется соединение [Pd(NH3)2^-OH)]2 2+, исходное для рассматриваемого каталитического цикла (схема 1).
Figure imgf000008_0001
Схема 1
Следует отметить, что в отсутствие пероксида водорода (02 или каких-либо других окислителей) водные растворы биядерных тиолатмостиковых комплексов палладия(П) не катализируют окисление тиоаминокислоты.
Оценка эффективности каталитического действия соединения [Ρά2(μ- SG)2(NH3)4]2+ на процесс окисления глутатиона (GSH) пероксидом водорода, проводимая с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), показала их большую (~ 30%) каталитическую эффективность, чем используемый в настоящее время 4uc-[Pt(NH3)2CI2].
Окисление тиолов комплексами меди(1)
При внесении в водный раствор простых солей меди(И), таких как CuCI2 или CuBr2 происходит их аквотация, сопровождающаяся последующим гидролизом и образованием в растворе олигоядерных аквагидроксокомплексов меди(И).
Эти аквагидроксокомплексы меди(И) в водных растворах, содержащих тиолы, почти мгновенно восстанавливаются, образуя тиолатные комплексы меди(1) - Cu'k(SR)m, где к = 2 -И 4, m > Зк. Состав и строение Cu'k(SR)m может иметь самый разнообразный характер, начиная от биядерных (к = 2) до четырнадцатиядерных (к =14) координационных соединений; причем нередко происходит формирование смесей комплексов разного строения. Однако какими бы не были эти комплексы по составу и строению, все они эффективно катализируют процессы окисления -S-H групп до дисульфидных сшивок -S-S- под действием любых, даже очень слабых окислителей.
На Фиг. 2, в качестве примера приведены результаты исследования относительной каталитической эффективности комплексов Cu'k(SR)m в реакции окисления глутатиона пероксидом водорода, по сравнению с биядерным палладиевым комплексом [Pd2^-SG)2(NH3)4]2+.
Как можно видеть из результатов, приведенных на Фиг.2, комплексы
Cu'k(SR)m, заметно более эффективно действуют в качестве катализаторов процесса окисления. Однако водные растворы дисульфида глутатиона, содержащие Cu'k(SR)m, по данным 1Н ЯМР, ИК спектроскопии и ВЭЖХ, неустойчивы, и в аэробных условиях через 30-60 мин. начинаются процессы более глубокого окисления образовавшихся дисульфидов. Это делает практически невозможным использование координационных соединений Cu'k(SR)m в качестве селективных катализаторов окисления тиолов до их дисульфидных форм.
Окисление тиолов с использованием Cu-Pd катализаторов
Экспериментальные исследования каталитических систем с применением медно-палладиевых катализаторов [Pd2 l -SR)2(NH3)4]-{Cul k(SR)m} показывает их значительно большую каталитическую эффективность по сравнению с биядерными тиолатмостиковыми соединениями палладия(П) - [Pd2' -SR)2(NH3)4] (Фиг.З). Но, в отличие от водных растворов окисленного глутатиона GSSG, содержащих тиолатные комплексы меди Cu'k(SR)m, водные растворы, содержащие Pd-Cu катализаторы, по данным 1Н ЯМР, ИК спектроскопии и ВЭЖХ устойчивы к процессам разложения в том случае, когда концентрация атомов меди не превышает концентрацию атомов палладия. Превышение соотношения Pd:Cu большее, чем 1 :1 в аэробных условиях сопровождается медленным распадом GSSG. Так при соотношении Pd:Cu, равном уже только 1 :2, понижение концентрации GSSG достигает величины 96% примерно через 1 неделю.
Исследования показывают, что в Pd-Cu катализаторах соотношения Pd:Cu лежат в пределах от 1 :0.2 до 1 :2, в зависимости от необходимости варьирования активностью работы катализатора. Суммируя, для процессов мягкого селективного окисления тиолов GSH до GSSG, можно сделать вывод о том, что биядерные тиолатмостиковые комплексы палладия(И) выполняют основную функцию катализаторов окисления, а тиолатные комплексы меди(1) следует отнести к химическим сайтам, меняющим их каталитическую активность или, говоря иначе, управляющим их каталитической активностью.
Таким образом, сочетание функциональных биядерных палладиевых координационных соединений [Pd2' -SR)2(NH3)4] с бидентатномостиковой координацией глутатиона или ацетилцистеина с управляющим сайтом {Cu'k(SR)m}, образующимся из солей меди СиХ2 (где Х= СГ или Вг"), превращающихся в среде тиолов в соответствующие тиолатные производные комплексов меди(1), показывает один из наиболее эффективных подходов к управлению активностью каталитических систем на основе комплексов палладия Pd2" и Си1.
Повышение каталитической эффективности палладий-медных катализаторов общей формулы [Pd2l -SR)2(NH3)4]-{Culi<(SR)m} по сравнению с функциональным химическим сайтом [Pd2"^-SR)2(NH3)4] обусловлено тем, что пероксид водорода окисляет не ионы Pd", а ионы {Cu'k(SR)m}.
Управляющий химический сайт, образующийся {Cu"k(SR)m} за счет окислительно-восстановительной реакции
{CuV(SR)m} + 2 Н202 = {Cu"k(SR)m} + 2 ОН + 2 ОН"
выступает в роли окислителя функционального сайта [Pd2"^-SR)2(NH3)4] в соответствии со схемой 2.
Figure imgf000010_0001
RSSR
Схема 2 Для окислительно-восстановительных реакций координационных соединений d-элементов существуют два общих типа переходных состояний, так называемые внешнесферный и внутрисферный типы. Для внешнесферного типа внутренние координационные оболочки ионов обоих металлов не затрагиваются. Для внутрисферного типа ионы обоих металлов связываются мостиковым лигандом, общим для обеих координационных оболочек.
Результаты квантово-химических расчетов показали, что в каталитических системах на основе биядерного металлического остова Pd2" в водных растворах будет происходить формирование промежуточного смешанного Cu-Pd биметаллического центра - [Cu"^-SR)2Pd"]# (интермедиата), легко диспропорционирующего на {Cu'k(SR)m} и [Pd"( -SR)Pdlv(OH)2]
Анализ структуры граничных молекулярных орбиталей (МО) объясняет экспериментально выявленную более высокую реакционную способность каталитической системы на основе смешанных Cu-Pd координационных соединений, чем на основе биядерных комплексов, содержащих только ионы Pd".
Участие атомных d-орбиталей (d-AO) металлов в каталитических процессах приводит к снятию запретов на протекание стадии реакции по симметрии молекулярных орбиталей (МО), часто определяющих высокую энергию активации процессов. Основная идея для объяснения катализа ионами металлов для реакций, запрещенных по симметрии, состоит в том, что ионы переходных металлов имеют доступные и близколежащие по энергии d-AO. Это дает возможность Частицам, координирующимся к иону металла, отдавать пару своих электронов на одни d-орбитали металла, а получать их с других d-орбиталей металла.
Анализ характера граничных МО в координационном соединении с центром Cu"^-SR)2Pd" показал, что его высшая занятая молекулярная орбиталь (ВЗМО) состоит в большой степени из d-AO меди и не пригодна для образования окисленного продукта, содержащего ион Pdlv. Для осуществления процесса необходим перенос пары электронов на низшую свободную молекулярную орбиталь (НСМО) с большой долей 4d-opбиτaлeй Pd". Чем меньше разница в энергиях этих МО, тем меньшие затраты требуются для достижения переходного состояния. В рассматриваемом координационном соединении со смешанным биметаллическим центром Cu"( -SR)2Pd" энергетическая разность между этими орбиталями составляет 2.61 эВ. В координационном соединении с центром Pd"( - SR)2Pd разница в энергиях соответствующих занятых и свободных орбиталей значительно больше: 4.18 эВ. (для Pt"^-SR)2Pt" 4.79 эВ).
Таким образом, каталитическая система для селективного окисления тиолов на основе смешанных промежуточно образуемых комплексов Си' и Pd" должна обладать большей активностью, чем система на основе аналогичных комплексов Pd". Причина этого заложена на уровне энергетики d-орбиталей меди.
Образование промежуточного биметаллического центра [Cu"( -SR)2Pd"] в цикле объясняет причину повышения каталитической эффективности катализаторов общей формулы [Pd2 l -SR)2(NH3)4] {Cu'k(SR)m}, а целенаправленно заданное число активных биметаллических центров [Cu"^-SR)2Pd"] позволяет менять суммарную активность палладий-медных катализаторов.
Предложенные катализаторы по изобретению могут сочетаться с дисульфидами Ы-глутамил-Ьцистеинил-глицина и/или Ы-ацетил-Ьцистеина формируя комбинацию, обладающую как естественной биологической, так и каталитической активностью. Избыток тиола обеспечивает возможность изготовления и использования малых и ультрамалых доз непосредственно катализатора, обеспечивая его к тому же необходимым для каталитического цикла субстратом.
Свободные молекулы дисульфидов Ν-ацетил-цистеина и/или Ы-глутамил-Ь- цистеинил-глицина в составе препарата могут находиться как в катионной, так и в анионной форме, или же в форме нейтральных частиц.
В качестве противоиона могут быть использованы неорганические ионы, например катионы натрия, лития, калия, кальция, магния, селена, марганца цинка, ванадия и других химических элементов, или ионы органических соединений, например аминокислот, алифатические и ароматические ионы органических молекул из различных химических групп обладающие биологической активностью (пример N°12). Комбинации по изобретению могут содержать также другие фармакологически активные соединения, в частности пуриновые и/или пиримидиновые основания, их производные или соединения на их основе (примеры N° 10 и N°1 1 ).
Под фармакологически активным соединением подразумевается любое вещество, которое используется с терапевтическими целями, представляющее собой молекулы лекарственных или биологически активных веществ, в частности пуриновых и/или пиримидиновых оснований и соединений на их основе, например: :Аденозин (9- -0-рибофуранозиладенин), Гуанозин (θ-β-D- рибофуранозилгуанидин), Дезоксиаденозин (9- -0-дезоксирибофуранозиладенин), Дезоксигуанозин (9- -0-дезоксирибофуранозилгуанидин), 9-βΌ- рибофуранозиладенина моно, ди, трифосфат, Э- -О-рибофуранозилгуанидин моно, ди, трифосфат, 9-Э-0-дезоксирибофуранозиладенина моно, ди, трифосфат (кордицепин), Э- -Р-дезоксирибофуранозилгуанидин моно, ди, трифосфат, Цитидин (4-амино-1-[3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2- ил]пиримидин-2-он). 1-[(2R,4S,5R)-4-rnflpoKcn - 5-(гидрокси)тетрагидрофуран-2-ил]- 5-пиридин-2,4-дион, Дезоксицитидин (4-амино-1-[4-гидрокси-5-
(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2-ил]пиримидин-2-он), Тимидин или дезокситимидин 1-[(2R,4S,5R)-4-n iflpoKcn - 5-(гидрокси)тетрагидрофуран-2-ил]- 5- метилпиридин -2,4-дион, Инозин 9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-flnrnflpoKCH-5- (гидроксиметил)оксолан-2-ил]-6,9-дигидро-ЗН-пурин-6-он, Рибаверин: 1 -(3,4- дигидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидрофуран-2-ил)-1 Н-[1 ,2,4]триазол-3- карбоновой кислоты амид, Занамивир (2R,3R4S)- 4-[(диаминометилиден)амино]- 3-ацетамидо- 2-[(1R,2f?)- 1 ,2,3-тригидроксипропил]- 3,4-дигидро - 2Н-пиран- 6- карбоновая кислота, Фармцикловир: 2-[2-(2-Амино-9Н-пурин-9-ил)этил]-1 ,3- пропандиол диацетат(эфир), Ганцикловир. (2-амино-1 ,9-дигидро-9-2-гидрокси-1- (гидроксиметил)этоксиметил-бН-пурин-б-он), Зидовудин (З'-Азидо-З1- дезокситимидин), Ацикловир: 2-амино-9-((2-гидроксиэтокси)метил)-1 Н-пурин-б(ЭН)- он, Фторурацил: 5-фтор-1 Н-пиримидин-2,4-дион, 1-(2,3-Дидезокси-бета-0- глицеропент-2-енофуранозил)Тимин, Фтортиоурацил: 5-фтор-1 Н-пиримидин-2- тион-4-он, Тиоурацил: 1 Н-пиримидин-2-тион-4-он, S-аденозилгомоцистеин: 4[5-(6- амино-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокси-тетрагидро-фуран-2-илметилсульфанил]-2- меркапто-бутановая кислота, S-Аденозилметионин: (28)-2-амино -4- [[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-aMHHonypHH -9-ил)-3,4-дигидрокмиоксолан-2-ил]метил- метилсульфонио]бутаноат, циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) 6-(6-амино- пурин-9-ил)-2-оксо-тетрагидро-2А-5-фуро[3,2-с1][1 ,2,3]с1-изооксофосфинин-2,7диол, 8-хлор-цА Ф: 6-(6-амино-8 хлор-пурин-9-ил)-2-оксо-тетрагидро-2А-5-фуро[3,2- с1][1 ,2,3]с1-изооксофосфинин-2,7диол, М6,2'-0-дибутирил-8-8Н- цАМФ, N6,2'-0- дибутирил-8-8Н-цАМФ, циклический гуанозинмонофосфат, cGMP, N6- монобутирил-8-5-метил-цАМФ, Формицин: 2-(7-амино-1 Р-пиразоло[4,3-с1] пиримидин-3-ил)-5-гидроксиметил-тетрагидрофуран-3,4-диол, -метилизогуанозин: 6-амино-1 -метил-1 ,9-дигидро-пурин-2-он. Фармакологически активное соединение может быть связанно с избытком дисульфидов Ν-ацетил-цистеина и/или Ы-глутамил-Ьцистеинил-глицина ван-дер- ваальсовыми силами (ионными, водородными и иными нековалентными связями).
Комбинации по изобретению могут быть изготовлены согласно известным из уровня техники методами с учетом особенностей химических свойств палладиево- медных катализаторов по изобретению, дисульфидов (Ν-ацетил-цистеина и/или N- глутамил-Ь-цистеинил-глицина) и фармакологически активных веществ. Предпочтительно, когда доля катализатора по изобретению в препарате составляет от 1 -Ю"2 до 1 -10"7 г на моль дисульфида алифатического тиола - N- ацетил-цистеина и/или Ы-глутамил-Ь-цистеинил-глицина.
Согласно изобретению предложенный палладиево-медный катализатор или каталитическая комбинация по изобретению может быть использована для усиления терапевтической активности пуринового и/или пиримидинового основания или производного на их основе. В контексте данного описания повышение терапевтической эффективности фармакологически активного соединения представляет собой снижение разовой или курсовой дозы, или снижение общей токсичности и достижение более выраженного терапевтического эффекта при принятой терапевтической дозе или меньшей для этого фармакологически активного соединения.
Палладиево-медный катализатор по изобретению, каталитическая комбинация и фармакологическая комбинация по изобретению могут быть использованы в форме фармацевтических композиций.
Для получения фармацевтических композиций по изобретению используют фармацевтически приемлемые эксципиенты. В частности, это неорганические или органические носители. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и • жидкие полиолы и т.п. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.п. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие, необходимые компоненты.
Палладиево-медный катализатор или каталитическая комбинация по изобретению и фармакологически активные вещества, эффективность которых они усиливают, могут находиться как в одной лекарственной форме, так и в отдельных лекарственных формах. Введение в отдельных лекарственных формах может быть осуществлено одновременно (одновременный прием двух твердых дозированных лекарственных форм, например таблеток, одновременная инъекция, в частности в одном шприце), либо последовательно, когда пациенту дают или вводят сначала первую лекарственную форму, а затем вторую лекарственную форму. Интервал между введением предпочтительно составляет не более 1 часа, однако может быть увеличен до тех пор, пока наблюдается синергический эффект. Оптимальный порядок введения зависит от фармакокинетики и фармакодинамики фармакологически активного вещества, эффективность которого должна быть усилена (скорость всасывания, распределение, скорость выведения, особенности клеточной, органной тропности или системной тропности) и может быть подобрана для каждого конкретного вещества индивидуально.
Количество вводимого палладиево-медного катализатора определяется массовой долей Pd и Си в составе катализатора, которое может соответствовать или быть ниже суточной потребности в каждом металле. В противном случае количество вводимого d-металла в составе координационного соединения определяется необходимостью достижения результата лечения.
Терапевтический результат может быть достигнут при введении катализатора в количестве от 1 · 10"3 до 1 -10"8 г на кг массы тела пациента, что в пересчете на количество дисульфида в комбинации составит от 1 *10~2 до 1 x10"5 моль дисульфида на кг массы тела.
В общем, все продукты и способы по изобретению альтернативно могут включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компо- нентов и стадий, раскрытых в данном описании или известных специалисту из уровня техники, и такие продукты или способы по изобретению могут дополни- тельно или альтернативно исключать какой-либо компонент, или стадию, или объ- ект, который использован в продукте или способе, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения. ПРИМЕРЫ
Далее изобретение поясняется конкретными примерами.
Пример Νδ 1. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного комплекса палладия(М) с Ы-глутамил-Ьцистеинил-глицином (GSH)
50 мг (237 мкмоль) цис-[Рс1(1\1Нз)2С12] вносят в 10 мл раствора, содержащего 75 мг (244 мкмоль) GSH и гомогенизируют в ультразвуковой ванне до образования светло-желтого раствора. К полученной системе приливают 5 мл раствора, содержащего 20 мг (1 17 мкмоль) CuCI22H20 и корректируют рН полученного желто- зеленого раствора до 5.0-5.2 раствором гидроксида натрия (~ 0.01 М).
Полученный раствор катализатора может быть использован для проведения окисления водорастворимых тиолов (например: GSH или ацетилцистеина).
В полученном растворе катализатора мольное соотношение палладий - медь составляет 2: 1.
Пример Ns 2. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного комплекса палладия(И) с глутатионом и его использование для синтеза дисульфида Ы-глутамил-Ь-цистеинил-глицина (GSSG).
Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(И) с глицилцистеинилглутаматом
10 мг (47.3 мкмоль) цис-[Р (МН3)2С12] на холоду диспергируют в 10-15 мл дистиллированной воды, в полученную суспензию вносят 145 мг (0.473 ммоль) GSH и перемешивают на магнитной мешалке до образования светло-желтого гомогенного раствора.
Стадия 2. Получение Pd-Cu катализатора
В ранее полученную реакционную смесь приливают 5 мл раствора, содержащего 8.06 мг (47.3 мкмоль) дигидрата хлорида меди(И). рН полученного желто-зеленого раствора катализатора доводят до значения 5.5 - 5.8 0.01 М раствором гидроксида натрия.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для синтеза
GSSG
В стеклянный стакан отвешивают 29.09 г (0.946 ммоль) GSH, приливают при перемешивании 150-200 мл дистиллированной воды, охлаждают до 10-15 °С. Отдельно растворяют в 50-60 мл дистиллированной воды 3.78 г NaOH (0.946 ммоль) и полученный раствор приливают к суспензии GSH при интенсивном перемешивании и не позволяя реакционной массе разогреваться выше 15-20 °С, и перемешивают до образования прозрачного гомогенного раствора. рН реакционной смеси корректируют до 5.5-5.8 0.1 М раствором гидроксида натрия. В полученную реакционную систему приливают ранее приготовленный раствор катализатора, и небольшими порциями приливают 50 мл 1 М свежеприготовленного раствора пероксида водорода при интенсивном перемешивании не допуская нагревания реакционной смеси свыше 15 °С. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.
После окончания реакциии и стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение «натриевая соль дисульфида 1\1-глутамил-..-цистеинил-глицина - палладий - медь» составляет 1000 - 1 - 1.
Пример N9 3. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного комплекса палладия(П) с М-глутамил-1_-цистеинил-глицином (GSH) и его использование для получения глицилцистеинилглутамат рибофуранозилгипоксантина-динатрия
Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(И) с GSH
20 мг (94.6 мкмоль) цис-^(МН3)2С12] на холоду диспергируют в 20 мл дистиллированной воды, в полученную суспензию вносят 30 мг GSH (97.6 мкмоль) и перемешивают до образования светло-желтого гомогенного раствора.
Стадия 2, Получение Pd-Cu катализатора
В ранее полученную реакционную смесь приливают 5 мл раствора, содержащего 14.52 мг (85.2 мкмоль) дигидрата хлорида меди(Н). рН полученного желто-зеленого раствора катализатора доводят до значения 5.5 - 6.0 0.01 М раствором гидроксида натрия.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для получения N- глутамил-1_-цистеинил-глицина рибофуранозилгипоксантина-динатрия
В стеклянный стакан отвешивают 58.19 г (0.189 моль) GSH, приливают при перемешивании 200 мл дистиллированной воды, охлаждают до 10-15, °С. Отдельно растворяют в 50-60 мл дистиллированной воды 7.57 г NaOH (0.189 моль) и полученный раствор приливают к суспензии GSH при интенсивном перемешивании и не позволяя реакционной массе разогреваться выше 15-20 °С и перемешивают до образования прозрачного гомогенного раствора. Если необходимо рН реакционной смеси корректируют до 5.5-6.0 0.01 М раствором гидроксида натрия. В полученную реакционную систему приливают ранее приготовленный раствор катализатора, стакан переносят на ледяную баню (5-10 °С) и небольшими порциями, в течении 45-60 мин приливают 100-102 мл (~ 0.1 моля) 1М свежеприготовленного раствора пероксида водорода при интенсивном перемешивании. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.
Отдельно в 150 мл горячей дистиллированной воды (60-70 °С) растворяют 25.38 г (0.095 моль) рибофуранозилгипоксантина (инозин). После полного растворения раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают к реакционной смеси. После стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение GSSG - инозин - палладий - медь составляет 1000-1000-1-0.9.
Пример N2 4. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного производного биядерного координационного соединения Pd(ll) с Ы-ацетил-Ь цистеином
120 мг (568 мкмоль) ^c-[Pd(NH3)2CI2] диспергируют в ультразвуковой ванне в 20 мл водного раствора 1Ч-ацетил-1_-цистеина (648.5 мг, 3.97 ммоль) до образования желтого гомогенного раствора. В полученную систему приливают 5 мл раствора, содержащего 48.4 мг (284 мкмоль) CuCI22H20. Выпавший белый осадок растворяется при подщелачивании реакционной системы до рН 4.5-5.0 0.1 М раствором гидроксида натрия.
Полученный желто-зеленый раствор катализатора может быть использован для проведения окисления водорастворимых тиолов (например: восстановленного глутатиона или ацетилцистеина) или лиофилизирован для дальнейшего использования.
В полученном растворе катализатора мольное соотношение количеств палладий - медь составляет 2:1.
Пример N2 5. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного производного биядерного координационного соединения Pd(ll) с 1\1-ацетил- цистеина и его использование для синтеза натриевой соли дисульфида Ν-ацетил- L-цистеина. Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(М) с Ы-ацетил-Ь- цистеином
16 мг (75.7 мкмоль) 4HC-[Pd(NH3)2CI2] диспергируют в ультразвуковой ванне в 20 мл водного раствора Ы-ацетил-1_-цистеина (123.5 мг, 757 мкмоль) до образования желтого гомогенного раствора.
Стадия 2. Получение Pd-Cu катализатора
К полученному раствору приливают 5 мл раствора, содержащего 6,5 мг (37,8 мкмоля) CuCI22H20. Полученный раствор катализатора подщелачивают до рН 4.5- 5.0 насыщенным раствором гидроксида лития.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для получения натриевой соли 1М-ацетил-1_-цистеина
В 250 мл дистиллированной воды растворяют 24.7 гр (0.151 моль) Ν-ацетил- L-цистеина, приливают раствор катализатора, и в полученный раствор при интенсивном перемешивании вносят 6,35 гр (0.151 моль) гидроксида натрия. После полного растворения NaOH в-Н20 рН раствора корректируют до 5.5-6.0 насыщенным раствором гидроксида натрия, и охлаждают до 10-15 °С.
В полученный раствор на холоду, небольшими порциями и при интенсивном перемешивании вносят 1 М раствор пероксида водорода (-80 мл), не допуская повышения температуры реакционной смеси свыше 15-20 °С. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.
После окончания реакциии и стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение «натриевая соль дисульфида Ы-ацетил-Ь-цистеина - палладий - медь» составляет 1000 - 1 - 0.5.
Пример N2 6. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного производного биядерного координационного соединения Pd(ll) с Ы-ацетил-Ь- цистеина и его использование для синтеза литиевой соли дисульфида Ы-ацетил-Ь- цистеина.
Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(И) с Ы-ацетил-Ь цистеином
16 мг (75.7 мкмоль) 4HC-[Pd(NH3)2CI2] диспергируют в ультразвуковой ванне в 20 мл водного раствора 1Ч-ацетил-1_-цистеина (123.5 мг, 757 мкмоль) до образования желтого гомогенного раствора.
Стадия 2. Получение Pd-Cu катализатора К полученному раствору приливают 5 мл раствора, содержащего 6,5 мг (37,8 мкмоля) CuCI22Н20. Полученный раствор катализатора подщелачивают до рН 4.5- 5.0 насыщенным раствором гидроксида лития.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для получения литиевой соли 1М-ацетил-1_-цистеина
В 250 мл дистиллированной воды растворяют 24.7 гр (0.151 моль) Ν-ацетил- L-цистеина, приливают раствор катализатора, и в полученный раствор при интенсивном перемешивании вносят 6,35 гр (0.151 моль) моногидрата гидроксида лития. После полного растворения LiOH H20 рН раствора корректируют до 5.5-6.0 насыщенным раствором гидроксида лития, и охлаждают до 10-15 °С.
В полученный раствор на холоду, небольшими порциями и при интенсивном перемешивании вносят 1 раствор пероксида водорода (-80 мл), не допуская повышения температуры реакционной смеси свыше 15-20 °С. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.
После окончания реакциии и стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение «литиевая соль дисульфида 1\1-ацетил-1_-цистеина - палладий - медь» составляет 1000 - 1 - 0.5. Пример Ns 7. Получение катализатора Pd-Cu на основе аммиачного производного биядерного координационного соединения Pd(ll) с (Ч-глутамил-Ь- цистеинил-глицином (GSH) и его использование для синтеза литиевой соли дисульфида Ы-глутамил- цистеинил-глицина.
Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(И) с GSH
21.1 мг (100 мкмоль) ^c-[Pd(NH3)2CI2] диспергируют в ультразвуковой ванне в 20 мл водного раствора GSH (307.5 мг, 1 ммоль) до образования желтого гомогенного раствора.
Стадия 2. Получение Pd-Cu катализатора
К полученному раствору приливают 5 мл раствора, содержащего 34.1 мг (200 мкмоль) CuCI22Н20. Полученный раствор катализатора подщелачивают до рН 5.0-5.5 насыщенным раствором гидроксида лития.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для- получения литиевой соли дисульфида Ы-глутамил-Ь-цистеинил-глицина
В 400-500 мл дистиллированной воды растворяют 61.5 гр (0.2 моль) GSH, приливают раствор катализатора, и в полученный раствор при интенсивном перемешивании вносят 8.39 гр (0.2 моль) моногидрата гидроксида лития. После полного растворения ϋΟΗΉ20 рН раствора корректируют до 5.5-5.8 насыщенным раствором гидроксида лития, и охлаждают до 10-15 °С.
В полученный раствор на холоду, небольшими порциями и при интенсивном перемешивании вносят 1 М раствор пероксида водорода (-1 10 мл), не допуская повышения температуры реакционной смеси свыше 15 °С. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ.
После окончания реакциии и стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение литиевая соль дисульфида 1\1-глутамил-1_-цистеинил-глицина - палладий - медь составляет 1000 - 1 - 2.
Пример Ν2 8. Получение катализатора на основе аммиачного производного биядерного координационного соединения Pd(ll) с г>]-глутамил-1_-цистеинил- глицином (GSH) и его использование для синтеза дисульфида глицилцистеинилглутамата 1 -[(2Я?,ЗЯ?,4$,5/?)-3,4-дигидрокси-5- (гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1 Н-1 ,2,4-триазол-З-карбоксамида (GSSG - рибавирин)
Стадия 1. Получение аммиачного комплекса палладия(М) с GSH
20 мг (94.6 мкмоль) ^c-[Pd(NH3)2CI2] диспергируют в ультразвуковой ванне в 20 мл водного раствора GSH (291 мг, 947 мкмоль) до образования желтого гомогенного раствора.
Стадия 2. Получение Pd-Cu катализатора
К полученному раствору приливают 5 мл раствора, содержащего 24.2 мг (142 мкмоль) CuCI22H20. Полученный раствор катализатора подщелачивают до рН 5.5-5.8 0.01 М раствором гидроксида натрия.
Стадия 3. Использование каталитической системы Pd-Cu для получения GSSG - рибаверина
В 400-500 мл дистиллированной воды растворяют 87.3 гр (0.284 моль) GSH, при интенсивном перемешивании приливают раствор катализатора и раствор 1 1.35 гр (0.284 моль) гидроксида натрия в 50 мл воды. рН раствора корректируют до 5.5- 5.8 0.1 М раствором гидроксида натрия, и охлаждают до 10-15 °С.
В полученный раствор на холоду, небольшими порциями и при интенсивном перемешивании вносят 1 М раствор пероксида водорода (-150 мл), не допуская повышения температуры реакционной смеси свыше 15 °С. Полноту протекания реакции контролируют методом ВЭЖХ. Отдельно в 100-150 мл горячей (60-70 °С) дистиллированной воды растворяют 34.65 г (0.142 моль) рибавирина. После полного растворения раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают к реакционной смеси.
После окончания реакции и стерилизующей фильтрации раствор замораживают и подвергают вакуумно-сублимационной (лиофильной) сушке.
В полученном препарате мольное соотношение натриевая соль GSSG - рибавирина|- палладий - медь составляет 1000 - 1000 - 1 - 1.5.
Пример Ns 9. Сравнительная оценка биологической активности и токсичности координационного соединения платины и паладиево-медного катализатора при воздействии на рост клеток.
Соединения платины имеют фармакологическую активность, обусловленную каталитическим действием в реакциях окислительной модификации сульфгидрильных групп молекул пептидной природы, что лежит в основе стимулирующего действия на продукцию цитокинов клеточными эффекторами иммунной системы, избирательного ингибирования реакций множественной лекарственной устойчивости к антибиотикам, способности подавлять развитие аутоиммунных реакций, лежащих в основе многих хронических социально значимых заболеваний - псориаз, нейродегенеративные и вирусные заболевания.
Таким образом, соединениям платины присущ ряд свойств востребованных в фармакологических решениях и обусловленных каталитическим действием в реакциях окислительной модификации сульфгидрильных групп молекул пептидной природы. Однако соединения платины отличает высокая токсичность, механизм которой не связан с каталитической активностью. Токсичность химических соединений платины носит острый характер, т.е. проявляется относительно быстро после введения или попадания содержащего платину вещества в организм, если превышена предельно допустимая концентрация платины. При введении в организм платины в составе веществ ниже предельно допустимой концентрации, может происходить постепенное накопление платины в тканях различных органов. В этом случае токсическое действие соединений платины проявляется позже или с характерной картиной отравления не проявляется вообще, однако мутагенное действие платины может служить причиной развития злокачественных новообразований.
Синтезированные катализаторы на основе координационных соединений алифатических тиолов (Ы-глутамил-Ь-цистеинил-глицином - GSH, Ы-ацетил-L- цистеином) и d-металлов палладия и меди (примеры Ns1 , Ν°4) также характеризует каталитическая активность в химической реакции окисления тиолов в составе молекул пептидной природы и фармакологически востребованных тиолсодержащих молекул, свойственная координационным соединениям платины. Соединения палладия и меди не токсичны в сравнении с соединениями платины, им не присущи мутагенное и тератогенное действие. Учитывая, что каталитическая активность соединений платины связана с востребованными фармакологической эффектами (исключая химиотерапию онкологических заболеваний, где востребовано токсическое действие соединений платины), необходимо было сопоставить биологические эффекты координационных соединений алифатических тиолов GSH, 1Ч-ацетил-1_-цистеина и d-металлов палладия и меди с биологической активностью координационных соединений платины. В качестве объекта воздействия координационных соединений были выбраны клетки А431 , на которых относительно полно исследованы биохимические аспекты действия координационных соединений платины с алифатическими тиолами. Характер клеточного ответа позволил оценить схожесть и/или различия в действии на клетки катализатора на основе координационных соединений GSH и d-металлов палладия и меди, М-ацетил-1_-цистеина и d-металлов палладия и меди, окисленного глутатиона и платины.
Цель работы. Изучение влияния катализатора на основе координационных соединений алифатических тиолов GSH, Ы-ацетил- цистеина и d-металлов палладия и меди, координационного соединения окисленного глутатиона и платины на рост культуры клеток.
В качестве исследуемых соединений использовались катализатор на основе координационного соединения алифатического тиола Ы-глутамил-Ьцистеинил- глицином и d-металлов палладия и меди (соединение N°1 , синтезировано в соответствии с описанием в примере N°1 И N°2), катализатор на основе координационного соединения Ы-ацетил-Ь-цистеина и d-металлов палладия и меди (соединение N°2, синтезировано в соответствии с описанием в примере N°4. N°5), координационное соединение окисленного глутатиона и цисплатина (соединение N°3, синтезировано в соответствии с методикой описанной в тексте патента 2153350).
Приготовление препаратов для проведения исследования.
Исследуемые соединения хранили при +4°С; непосредственно перед началом эксперимента вещества растворяли в деионизированной воде (super Q). Концентрация исходного раствора в 1000 и более раз превышает концентрации, используемые в эксперименте. Приготовленный концентрированный раствор хранится не более 5 часов при +4°С.
Путь введения.
Соединения добавляли в среду культивирования клеток до исследуемой конечной концентрации.
Число доз.
В одной из серий экспериментов препараты добавляется к клеткам однократно и клетки инкубировали в течении 48 часов.
В другой серии на указанный период времени экспериментов препараты добавляется к клеткам раз в сутки через 24 часа пятикратно клетки инкубировали в течении 120 часов. В контрольных сериях вносили соответствующий объем физраствора.
Концентрации.
Все соединения вносили до конечной концентрации 0, 15 мкмоль/мл (концентрация рассчитана по содержанию избытка дисульфида алифатического тиола);
Критерии оценки действия
Определяли количество живых и погибших клеток в культуре через 24 и 48 Часов в первой серии экспериментов и через 24, 48, 72, 96, 120 часов во второй серии экспериментов.
Использованная линия клеток.
Клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 , полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, С. Петербург).
Условия культивирования клеток .
Клетки культивируются в С02-инкубаторе (New Brunswick Scientific) при +37°С и при содержании С02 5 %. В этих условиях клетки выращиваются до монослойной культуры и подвергаются действию исследуемых соединений.
Среда для культивирования клеток.
Для культивирования клеток используется среда DMEM (ООО "ПанЭко",
Москва) с добавлением гентамицина К (80 мг/л), L-глутамина (300 мг/л) и фетальной сыворотки (РАА, Австрия) до конечной концентрации 10 %. За сутки до начала эксперимента равные количества клеток (1000/2.5мкл— 400x10"3/мл переводят в среду с пониженным содержанием сыворотки - 0,5 %.
Динамика роста клеток. Клетки A431 высевали на пластиковые чашки Петри (Nunc) в концентрации 100007см2, через сутки при достижении ими 10-15% монослоя подвергали действию исследуемых препаратов.
Подготовка клеток для окраски.
Среду культивирования клеток А431 собирали в пробирки (Falkon) для полного анализа открепившихся мертвых клеток, а клетки на чашках Петри промывали PBS (который объединяли с собранной средой) и обрабатывали раствором трипсина 0,25% в Версене (Панэко) около 10 мин при комнатной температуре до открепления клеток. Далее клетки суспендировали пипетированием автоматической пипеткой и объединяли с собранной ранее средой. Пробы центрифугировали 5 мин 400 g при комнатной температуре, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере PBS рН 7,4.
Окраска клеток иодидом пропидия
Иодид пропидия добавляли к суспензии клеток до концентрации 50 мкг/мл за
5-10 мин до измерения на проточном цитофлуориметре Bruker ACR 1000. Этот краситель способен проникать через поврежденную клеточную мембрану, и окрашенные клетки являются мертвыми.
Методы статистической обработки результатов.
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6,0».
Результаты влияния исследуемых соединений на пролиферативную активность и гибель клеток
Согласно полученным данным все исследуемые соединения при однократно введении в среду культивирования клеток стимулируют пролиферативную активность (табл.1).
Таблица 1
Влияние исследуемых соединений на пролиферативную активность клеток
А431 при однократном воздействии.
. . Возраст Всего клеток Доля погибших
Исследуемое соединение культур Н Ь| (час) (х1 0з/2.5мкл ) клеток (%)
Контроль (без 0 1.0
добавления исследуемых 24 8.7 22 соединений) 48 15.1 29 0 I .0
Соединение N°1 24 I I .7 1 1
48 21.4 1 1 0 1.0
Соединение N°2 24 12.3 9
48 22.1 12
0 1.0
24 10.8 14
Соединение N°3 48 19.1 19
Полученные данные свидетельствуют о том, что при однократном воздействии исследуемых соединений на культуру клеток имеет место стимуляция пролиферативной активности в сравнении с контрольными сериями. Выявленный эффект сопоставим у всех исследуемых веществ. По критерию количества погибших клеток отмечено уменьшение их количества в два и более раза при воздействии соединений N°1 и Ne2 в сравнении с контролем и несколько меньшее при воздействии соединения N°3 (50-60%). Схожесть результатов ответа культуры клеток при воздействии различных координационных соединений является одним из свидетельств общности механизма воздействия и клеточного ответа на него. Вносимые однократно количества металла относительно малы. Если учесть, что цисплатин токсичен для клеток, то очевидно недостаточно однократного введения, чтобы заметить эффект комплекса алифатического тиола и цисплатина и собственно цисплатина, который может освобождаться при распаде координационного соединения. В этой связи был поставлен эксперимент 120 часовой инкубации клеток с пятикратным воздействием на клетки каждого исследуемого соединения раз в 24 часа. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние исследуемых соединений а на пролиферативную активность клеток А431 при пятикратном воздействии.
Возраст Всего клеток Доля погибших
Исследуемое соединение
культуры (час) (х103/2.5мкл ) клеток (%)
0 1.0
24 8.9 22
Контроль (без 48 17.3 29 добавления исследуемых 72 31.4 32 соединений) 96 49.1 32
120 58.6 35 0 1.0
24 10.1 1 1 48 19.6 9
Соединение N°1 72 39.4 9
96 78.7 12
120 94.2 14
0 I .0
24 I I .6 7
48 23.1 9
Соединение N°2 72 44.8 8
96 79.8 1 1 120 102.1 1 1
О 1.0
24 10.8 12
48 16.6 27 72 24.8 38
Соединение N°3
96 29.5 48
120 32.5 67
Результаты экспериментов показывают практически одинаковую пролиферативную активность клеток через сутки как в контроле так и при воздействии всех исследуемых соединений. Сохраняется и выявленная ранее закономерность меньшей гибели клеток через сутки при воздействии исследуемых соединений в сравнении с контролем. Однако воздействие на клетки координационным соединением дисульфида глутатиона с цисплатином на вторые и последующие сутки приводит к падению пролиферативной активности культуры и усилению гибели клеток практически двукратно превосходя значения аналогичных показателей в контроле. Напротив, воздействие на культуры клеток соединения Ns>1 и соединение N°2 предопределило практически линейный ежесуточный прирост количества клеток и относительно постоянную величину их гибели.
Совокупность полученных результатов указывает на определенные закономерности, которые с одной стороны определяются активностью исследуемого соединения в целом, с другой отражают особенности воздействия на биологический объект металлов, образующих координационные соединения. Так схожая динамика роста и гибели клеток через 24 часа при действии всех исследуемых координационных соединений указывает на схожесть механизма их воздействия независимо от металла и алифатического тиола. Однако из культуральной среды координационные соединения не удаляются, а это означает, что всякое последующее введение увеличивает их концентрацию. Если учесть, что лиганд является активно метаболизируемой структурой, то логичным является предположение об освобождении комплекса металла. Цисплатин представляет собой стойкую молекулу. Будучи нетоксичным в составе комплексного соединения, цисплатин, при деградации лиганда, проявляет свое биологическое цитотоксическое действие. В этой связи мы наблюдаем активный прирост погибших клеток и низкую пролиферативную активность. Не исключено, что помимо цисплатина в замкнутой системе цитотоксическое воздействие оказывают модифицированные цисплатином нуклеотиды при их участии в реакциях синтеза нуклеиновых кислот.
Биологическая активность d-металлов палладия и меди отлична от цисплатина. Палладий и его соединения представляют собой биологически относительно нейтральную молекулу. Медь является биоэлементом и активно используется клетками в составе различных ферментов, участвующих в реакциях освобождения энергии, детоксикации, физиологически упорядоченного синтеза и распада биомолекул. В этой связи в условиях эксперимента выявлены биологически позитивные эффекты катализатора на основе координационных соединений алифатических тиолов d-металлов палладия и меди.
Заключение. Таким образом, катализаторы на основе координационных соединений алифатических тиолов Ы-глутамил-Ьцистеинил-глицина и Ы-ацетил- цистеина с d-металлами палладием и медью характеризует схожий механизм воздействия на клетки, присущий координационному соединению окисленного глутатиона и цисплатина, однако у них отсутствует токсичность присущая соединениям платины. В этой связи катализаторы на основе комплексные соединения алифатических тиолов координационных соединений алифатических тиолов М-глутамил-1_-цистеинил-глицина и М-ацетил-1_-цистеина с d-металлами палладием и медью могут быть использованы в фармакологических решениях с лекарственными средствами для терапии различной длительности при которой востребована каталитическая активность в реакциях окислительной модификации тиолов до дисульфидов в составе молекул пептидной природы.
Пример.Ю Сравнительная оценка способности координационного соединения окисленного глутатиона и цисплатина и способности катализатора на основе координационного соединения М-глутамил-1_-цистеинил-глицина палладия и меди потенцировать противовирусную активность инозина В патентах RU2153350, RU2153351 рассматривается фармакологическое решение по потенцированию противовирусной активности инозина предпочтительно с использованием координационного соединения цисплатина и окисленного глутатиона . Эффект потенцирования достигается предположительно за счет способности соединения цисплатина и окисленного глутатиона катализировать комплекс реакций окислительной модификации мишени, повышая ее сродство к воздействию инозина. Если механизм потенцирования противовирусного эффекта инозина связан с каталитической активностью координационных соединений, то средство по изобретению должно оказывать подобное более выраженное действие, так как их отличает более высокая каталитическая активность в сравнении с координационным соединением цисплатина и окисленного глутатиона.
Цель исследования: сравнительная оценка противовирусной активности инозина в сочетании с координационным соединением окисленного глутатиона и цисплатина и катализатором основе координационного соединения М-глутамил-L- цистеинил-глицина палладия и меди.
Исследуемые соединения
Фармакологическая композиция (ФК) N°1 - 1\1-глутамил-1_-цистеинил-глицина рибофуранозилгипоксантина-динатрия, содержащий средство по изобретению (синтез приведен в примере N°3)
Фармакологическая композиция (ФК) N°2 - 1М-глутамил-1_-цистеинил-глицина рибофуранозилгипоксантина-динатрия содержащий координационное соединение цисплатина и окисленного глутатиона (синтез осуществлен в соответствии с методикой, приведенной в патентах 2153350, 2153351)
Экспериментальная модель
- вирус венесуэльского энцефалита лошадей (ВЭЛ) - патогенный штамм
Тринидад. Накопление вируссодержащего материала для последующего заражения лабораторных животных осуществляли с использованием 9-1 1 дневных развивающихся куриных эмбрионов - 30-50 шт. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащей суспензии. По 0,2 мл каждого разведения вируссодержащей суспензии вносили в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов. Место инъекции вируссодержащей суспензии покрывали расплавленным парафином. Затем развивающиеся куриные эмбрионы помещают в термостат при температуре (37±0,5) °С на 18 ч, периодически оценивая их жизнеспособность с помощью овоскопа. По истечении времени инкубации в термостате оценивали жизнеспособность развивающихся куриных эмбрионов и из «тушек» живых эмбрионов готовили 10 % суспензию вируссодержащего материала с использованием физиологического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин из расчета 100 ЕД на 1 мл, стрептомицин - 200 ЕД на 1 мл). Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1 ,5-2,0 тыс. об. /мин и температуре плюс (3±0,5) °С. Надосадочную жидкость разливали во флаконы объемом 1 ,0 мл и использовали для дальнейшего заражения экспериментальных животных мышей. Исходный титр вируса 107-108 ЛД50/мл
- вирус лихорадки долины Рифт (ЛДР) - патогенный штамм 8-87. Накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных осуществляют с использование 3-5-дневных мышей-сосунков - 10-15 гол. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам, за которыми устанавливали наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус (20±0,5)°С. В дальнейшем, 10 % суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса 105-106 ЛД50/мл;
- вирус клещевого энцефалита (КЭ), - патогенный штамм Абсетаров. Накопление вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных проводили на мышах-сосунках. Первоначально готовили пять последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала, которым служил центрифугат 10 % суспензии мозга зараженных ранее мышей или регидратированный из лиофильного состояния вируссодержащий материал. По 0,02 мл каждого разведения вводили в мозг мышам-сосункам, за которыми устанавливали наблюдение в течение 24-48 ч, по окончании которого животных забивали эфиром, извлекали головной мозг и депонировали его по три образца в пенициллиновые флаконы, которые хранили в морозильной камере при температуре минус (20±0,5)°С. В дальнейшем, 10 % суспензию головного мозга использовали в качестве вируссодержащего материала. Исходный титр вируса 102- 103 ЛД50/мл. Исследования по оценке эффективности фармакологических композиций NQ1 И NS2 выполнены на белых неинбредных мышах-самцах массой 16-18 г (360 голов).
В исследования брали животных, в обязательном порядке выдержавших карантин в течение 1 нед в клинике экспериментальных биологических моделей НИИЦ (МБЗ) ФГУ «ГосНИИИ ВМ Минобороны России».
Применительно к каждому возбудителю величину ЛД50 определяли на белых неинбредных мышах с расчетом этого критерия по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева.
Эффективность изучаемых препаратов определяли по сопоставлению величин показателей выживаемости животных в подопытных (получавших соответствующие препараты) и контрольных группах. Процент выживших животных в подопытных и контрольных группах определяли по таблицам Генеса B.C. . При этом наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 сут, ежедневно регистрируя число живых и павших в подопытных и контрольных группах.
Методы статистической обработки результатов
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на персональном компьютере, используя специальные программы, реализующие традиционные статистические методы.
Результаты изучения противовирусной активности фармакологических композиций N°1 и N°2
На всех экспериментальных моделях ООВИ эффективность фармакологических композиций Ne1 и N°2 оценивали при их применении по двум схемам:
- за 24 ч до заражения, одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения (схема 1 - экстренной профилактики);
- одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения (схема 2 - раннего этиотропного лечения).
Фармакологические композиции N°1 И Ns2 вводили подкожно в объеме 0,5 мл в разовой дозе 30 мг/кг массы тела (10 мкг/мышь).
Эффективность фармакологических композиций N°1 и N°2 при
экспериментальной инфекции ВЭЛ. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.
Таблица 3 Сравнительная оценка противовирусной эффективности фармакологических композиций N°1 и N°2 в качестве средств экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной инфекции ВЭЛ
Figure imgf000032_0001
Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что оцениваемые препараты оказывали протективное действие в отношении экспериментального ВЭЛ. Наиболее эффективным в данных условиях оказалась ФМ Ν°1. При этом, если препарат применяли по схеме 1 (за 24 ч до заражения, одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения), то вне зависимости от заражающей дозы вируса ВЭЛ выживаемость инфицированных мышей находилась на уровне 100 % на фоне 100 % летальности в контроле. Если же препарат применяли по схеме 2 (одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч_ после заражения), то в этих условиях в зависимости от заражающей дозы возбудителя протективный эффект находился на уровне 100 % (при заражении возбудителем в дозе 12 ЛД50) и 100 % (при заражении возбудителем в дозе 2 ЛД50). При применении ФК Ν°2 показатели защиты в зависимости от заражающей дозы возбудителя были на 40-60 % ниже, чем при применении ФК N°1.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что среди оцененных препаратов наиболее эффективной в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ оказалась ФК N°1 , включающая средство по изобретению. ΦΚ N°1 , примененная по схеме экстренной профилактики, обеспечивала защиту 100 % инфицированных животных на фоне 100 % летальности в контроле.
Эффективность армакологических композиций N°1 и N°2 при экспериментальной вирусной инфекции ЛДР.
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 4.
Таблица 4
Сравнительная оценка противовирусной эффективности фармакологических композиций N°1 и N°2 в качестве средств экстренной профилактики и этиотропного лечения экспериментальной инфекции ЛДР
Figure imgf000033_0001
Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о том, что наилучший протективный эффект в отношении ЛДР был получен при применении ФК N°1. Вне зависимости от схемы применения препарат обеспечивал 100 % защиту инфицированных мышей на фоне 100 % летальности в контроле. Фармакологическая композиция N°2 в данных условиях была практически неэффективна.
Эффективность фармакологических композиций NQ1 и Ν°2 при экспериментальной вирусной инфекции - экспериментальном клещевом энцефалите. Результаты исследований приведены в таблице 5.
Таблица 5
Сравнительная оценка противовирусной эффективности фармакологических композиций Ns1 и Ns2 в качестве средств экстренной профилактики - и этиотропного лечения экспериментальной инфекции экспериментального клещевого энцефалита
Figure imgf000034_0001
Как следует из представленных данных, все оцененные препараты при применении у животных, инфицированных возбудителем в дозе 2 ЛД50, проявляли практически одинаковую защитную эффективность, обеспечивая выживаемость 80-100 % инфицированных мышей на фоне их 100 % летальности в контроле. В то же время, если препараты применяли у животных, инфицированных возбудителем в дозе 12 ЛД50, то в этих условиях ФК N°1 оказалась более эффективной, чем ФК N22.
Заключение
Совокупность результатов проведенных исследований позволяет сделать заключение о том, что фармакологические композиции N°1 и N°2 обладают противовирусной активностью. Однако ФК Ns1 , включающая средство по изобретению, обладала более выраженной противовирусной активностью в сравнении с фармакологической композицией N°2 включающей координационное соединение окисленного глутатиона и цисплатины.
Пример 11. Определение способности средства по изобретению потенцировать противовирусную активность рибавирина
Рибавирин является специфическим противовирусным препаратом. Его воздействие на вирус инфицированные клетки подобно инозину. Средство по изобретению, способное стимулировать процессы окислительной модификации белков, потенцировало противовирусный эффект инозина. Подобие противовирусного действия инозина и рибавирина позволяет предполагать возможность потенциирования противовирусного эффекта 1-[(2R3R,4S,5R)-3,4- дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1 Н-1 ,2,4-триазол-3-карбоксамида (действующее начало фармакопейного препарата Рибавирин® ) средством по изобретению.
Цель исследования: Оценить способность средства по изобретению потенцировать противовирусную активность 1 -[(2Я,ЗЯ45,5Я?)-3,4-дигидрокси-5- (гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1 Н-1 ,2,4-триазол-З-карбоксамида.
Исследуемые соединения
Фармакологическая композиция 1 -[(2 ЗЯ45,5/?)-3,4-дигидрокси-5- (гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1 /-/-1 ,2,4-триазол-3-карбоксамид в сочетании со средством по изобретению (синтез приведен в примере Ns8) - препарат Ns1.
Фармакопейный противовирусный препарат Рибавирин® производства «Канонфарма Продакшн» (Россия) - препарат N°2. Экспериментальная модель
Исследования выполнены на экспериментальных моделях, описанных в примере Ns10. Заражающая доза возбудителя в каждой модели соответствовала Ю ЛД50.
Результаты изучения противовирусной активности препаратов N°1 и
NQ2. На всех экспериментальных моделях ООВИ эффективность препаратов N°1 и N°2 оценивали при их применении по двум схемам:
- за 24 ч до заражения, одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения (схема 1 - экстренной профилактики);
- одновременно с заражением, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения
(схема 2 - раннего этиотропного лечения).
Препараты N°1 и N°2 вводили подкожно в объеме 0,5 мл
Препарат N°1 В разовой дозе 30 мг/кг массы тела (10 мкг/мышь).
Препарат N°2 В разовой дозе 30 мг/кг массы тела (10 мкг/мышь)
Эффективность препаратов N21 и N°2 при экспериментальной вирусной инфекции - Венесуэльский энцефалит лошадей (ВЭЛ).
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 6.
Таблица 6
Эффективность препаратов N21 и N°2 при экспериментальной вирусной инфекции - Венесуэльский энцефалит лошадей (ВЭЛ)
Figure imgf000036_0001
* - различия с показателями в контроле достоверны при р<0,05.
Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что оцениваемые препараты по формируемому при их введении в организм животных* протективному эффекту в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ отличались друг от друга. Препарат N°1 обеспечивал выживаемость инфицированных мышей на уровне 80 % на фоне 100 % летальности в контроле (р<0,05) при обеих схемах введения, тогда как аналогичные эффекты препарата N°2 (рибавирина) не превышали 50%.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что препарат N°1 представляющий собой действующее начало фармакопейного препарата Рибавирин® в сочетании со средством по изобретению по протективной и терапевтической эффективности в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ в 1.5-2.0 раза превосходил действие фармакопейного препарата Рибавирин®.
Эффективность препаратов N°1 и N°2 при экспериментальной вирусной инфекции - Лихорадка долины Рифт (ЛДР)
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 7.
Таблица 7
Эффективность препаратов N°1 и Ns2 при экспериментальной вирусной инфекции - Лихорадка долины Рифт (ЛДР)
Figure imgf000037_0001
Представленные в таблице 7 данные свидетельствуют о том, что в отношении экспериментальной инфекции ЛДР протективное и терапевтическое действие препарата N°1 проявлялось в большей степени, чем препарата N22. В частности, защитный эффект препарата N°1 составил 70 % на фоне 30% у препарата N22 и 100 % летальности в контроле.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что препарат N21 представляющий собой действующее начало фармакопейного препарата Рибавирин® в сочетании со средством по изобретению по протективной и терапевтической эффективности в отношении экспериментальной вирусной инфекции более чем в 2 раза превосходил действие фармакопейного препарата Рибавирин®.
Эффективность препаратов Ns1 и N°2 при экспериментальной вирусной инфекции - Клещевой энцефалит (КЭ)
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 8.
Таблица 8
Эффективность препаратов N°1 и Ns2 при экспериментальной вирусной инфекции - Клещевой энцефалит (КЭ)
Figure imgf000038_0001
Как следует из представленных данных, препарат N°1 при применении у животных, инфицированных возбудителем в дозе 10 ЛД50, вне зависимости от использованной схемы проявлял и практически одинаковую защитную эффективность, обеспечивая выживаемость 70-80 % инфицированных мышей на фоне их 100 % летальности в контроле. В то же время, если у инфицированных животных применяли препарат N22, то его эффективность оказалась менее выраженной. Препарат обеспечивал уровень защиты 50 % вне зависимости от использованной схемы его введения, что было на 10-30 % ниже, чем у препарата Ns1.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что препарат N°1 представляющий собой действующее начало фармакопейного препарата Рибавирин® в сочетании со средством по изобретению по протективной и терапевтической эффективности в отношении экспериментальной вирусной инфекции в 1.5-1.8 раза превосходил действие фармакопейного препарата Рибавирин®.
Заключение
Совокупность результатов проведенных исследований позволяет сделать заключение о том, что средство по изобретению потенцировало противовирусное действие 1-[(2/:?,ЗЯ45,5Я)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1 /-/-1 ,2,4- триазол-3-карбоксамида, действующего начала . фармакопейного препарата Рибавирин®. В этой связи использование средства по изобретению может быть перспективным в фармакологических решения по созданию лекарственных препаратов нового поколения для лечения и профилактики вирусных заболевании человека и животных.
Пример 12. Влияние средства по изобретению на гемостимулирующую активность ионов лития вводимых в форме литиевой соли дисульфида 1Ч-ацетил-1_- цистеина.
В настоящее время отсутствует эффективное гемостимулирующие средство длительного хранения. В медицинской практике известна гемостимулирующая активность лития в концентрациях, которые сопряжены с негативным влиянием лития на функции центральной нервной системы.
Цель исследования. Определение способности средства по изобретению потенцировать гемостимулирующее действие ионов лития. Приготовление растворов исследуемых соединений для проведения исследования.
Кристаллические вещества хранили при 4°С; непосредственно перед началом эксперимента вещество растворяли в физиологическом растворе. Раствор стерилизовали пропусканием через фильтры 0,22 мкм Millex-GS (Millipore) в стерильном ламинарном боксе.
Модель исследования.
Исследование было проведено на белых рандомбредных крысах-самцах массой 140-160 г, которым однократно вводили циклофосфан в дозе 120 мг/кг подкожно в физиологическом растворе.
Было сформировано 4 группы экспериментальных животных. N°1 - интактные животные, получавшие инъекции растворителя изучаемых соединений (физиологический раствор)(контроль растворителя);
N°2 - животные, получившие инъекцию ЦФ, которым в дальнейшем в качестве лечебного средства вводили физиологический раствор (контроль);
Опытные группы:
NQ3 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили фармакологическую композицию N21 (ФК N°1 синтезирована в соответствии с описанием в примере N26), содержащую ионы лития, дисульфид 1\1-ацетил-1_-цистеина и средство по изобретению в физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг (количество координационного соединения 7,8><10"8М/кг);
N°4 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили aC-Li (препарат NQ2) В физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг ;
Ns5 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили карбонат лития (препарат N°3) в физиологическом растворе в дозе 3 мг/кг (количество карбоната лития, рассчитывали исходя из массовой доли иона лития (0.55) в 10 мг литиевой соли цистеина, аналогичное количество лития содержится в 3 мг карбоната лития);
N°6 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили дисульфид ацетилцистеина (препарат N°4) в физиологическом растворе в дозе 9.5 мг/кг;
Исследуемые препараты вводили на третий день после введения циклофосфана.
Исследуемый материал,
Забор крови для гематологических исследований проводили из хвостовой вены через 3, 7, 14 суток после введения ЦФ. В конце каждой серии (3, 7 и 14 сут) экспериментальных животных подвергали эвтаназии передозировкой эфира и получали кровь из хвостовой вены и костный мозг из бедренной кости.
Анализируемые показатели.
В данном исследовании оценивали клеточность крови (число эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, а также СОЭ) и костного мозга при 7-дневном введении исследуемых соединений гемодепрессированным животным.
Результаты исследования Результаты проведенных исследований клеточности крови представлены в таблицах 9-1 1 .
Таблица 9
5 Общий анали Изентактны крови самцов крыс с цитопенией на 3 сут после введения циклофосфана ( (ф)зраствори120 мг/кг); не получавших лечение (вводили физраствор), получавших лечение дисульфидом 1\1-ацетил-1_-цистеина (препарат1М->4). гемостимулятором (Li2HC03 - препарат Ns3), литиевой солью дисульфида N- ацетил-1_-цистеина (препарат N°2) и литиевой солью дисульфида Ы-ацетил- 10 цистеина в сочетании со сре Цффиклоосан-дством по изобретению (ФК N°1 ), пример Ne6)
Цффиклоосан- реара ппт
Исследуемые
показатели
Figure imgf000041_0001
Цффиклоосан- реара ппт
Гемоглобин 16.2+0.16 12.8+0.56 12.4+0.76 12.8+0.4 N3Q4 12.2+0.68 , 13.9+0.31
(г/л)
Эритроциты 6.8+0.16 3,6+0.25 3,2+0.33 3,4+0.29 3.4+0.18 5.9+0.08*
1012/л Цффиклоосан-
Тромбоциты, 374+8.5 116+10.0** 114+11 .0** 129+12.0** 174+1 препарат0.0** 322±13.8*
103/л
Ретикулоциты, 1.8+0.2 1.0+0.1 0.9.0+0.2 1 .1 +0.1 1 ,2+0.2 1 ,63+0.2*
% Цффоосаиклн-
Лейкоциты, 9.2+.35 3,41 +0,09* 3,47+0,08* 3,22+0,11 * 4,8+0.18** 5,77+0.18 препарат
109/л
Сегментоядер 17+2.5 33+1 .9 * 31 +1 .8 * 31 +1 .7 * 49.4+0.6 ** 64.3+1 .6 ные
нейтрофилы,
%
Лимфоциты, % 75.4+1.4 56.7+1 .1 * 52.5+1 .3 * 49.7+1.6 * 21 +0.9 * 62+0.9) *
* - р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем;
15 - ** - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем
Таблица 10
Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на 7 сут после введения 20 циклофосфана (120 мг/кг); не получавших лечение (вводили физраствор), получавших лечение дисульфидом 1\1-ацетил-1_-цистеина (препарат^). Исследуемые
показатели
Figure imgf000042_0001
Иентактны
Гемоглобин 16.2+ (ф)0израствор.16 12.8+0.56 12.4+0.76 12.8+0.44 12.2+0.68 13.9+0.31
(г/л)
Эритроциты 6.8+0.16 3,6+0.25 3,2+0.33 3,4+0.29 3.4+0.18 5.9+0.08**
1012/л Цффиклоосан-
Тромбоциты, 374+8.5 116+10.0* 114+11.0** 129+12.0** 174+10.0** 322±13.8**
103/л
Ретикулоциты, 1.8+0.2 1.0+0.1 0.9.0+0.2 1.1+0.1 1,2+0.2 1 ,63+0.2**
% Цффоосаиклн-
Лейкоциты, 9.2+.35 3,41+0,09* 3,47+ препарат0,08* 3,22+0,11* 4,8+0.18** 5,77+0.18**
109/л
Сегментоядер 17+2.5 33+1.9 * 31+1.8* 31+1.7* 49.4+0.6 ** 64.3+1.6 **
гемостимулятором (Li2HC03 - препарат N°3), литиевой солью дисульфида N- ацетил-1_-цистеина (препарат N°2) и литиевой солью дисуль Цффоосаиклн-фида -ацетил- цистеина в сочетании со средством по изобретению (ФК N°1), приреарам пптер Ns6)
Цффоаиклосн- реара ппт N1s
ные
нейтрофилы,
%
Лимфоциты, % 75.4+1.4 56.7+1.1 * 52.5+1 .3 * 49.7+1 .6 * 21 +0.9 * 62+0.9) *
- р 0,05 - по ср Иаатныентквнению с биологическим контролем;
(ф)расоризтв
* - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем ф Цфоосаникл-
Таблица 11.
Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на 14 сут после введения циклофосфана (120 мг/кг); не получа Цффвоосаиклн-ших лечение (вводили физраствор), получавших лечение дисульфидом Ы-ареара пптцетил- цистеина (npenapaTN°4). гемостимулятором (Li2HC03 - препарат N°3) N4,s литиевой солью дисульфида N- ацетил-1_-цистеина (препарат N°2) и литиевой солью дисульфида Ы-ацетил- цистеина в сочетании со средством по изобретению (ФК N°1), пример Ν°6)
Цффооаиклсн- реарат пп
Цффиклоосан-
Исследуемые реара ппт
показатели N2°
Figure imgf000043_0001
Цффоосаиклн-
Гемоглобин, (г/л) 16.2± 0.16 11.3± .68 12.6Ю.5 12.1+0. 7 12.6+0.63 14.7+ препарат0.64
Эритроциты, 6.9± 0.16 4,5± 0.17 4.1Ю.21 4,7+ 0.27 5.1+ 0.26 6.1+ 0.1 N1°2
1012/л
Тромбоциты, 387±21.5 363±56.9 377+54.9 41 1+59.9 387+38.3 598+72.9**
103/л
Ретикулоциты, % 1.9±0.2 1.1 ±0.2 1.2+0.4 1.3+0.3 1 ,210.3 2,010.2**
Лейкоциты, 109/л 9.4±0.35 4.4+0.19* 5.1+0.22** 5.2+0.26** 5.9+0.22** 10,1+0.19**
*
Сегментоядерные 15±2.5 ** 14.611.6* 13.6+1.9** 15.0+2.6** 19.3+2.4 2412.2** нейтрофилы, % * **
Лимфоциты, % 74.5±1.4 72.9±1.8 71.011.6 70.3+0.9 71.3+1.4 72.9+1.1
- * - р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем;
- ** - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем Циклофосфан в дозе 120 мг/кг вызывает достаточно выраженную цитопению по всем форменным элементам крови с абсолютной и относительной лимфопенией, максимально выраженную на 14-й день (1-3).
Литий, вводимый в составе литиевой соли дисульфида 1\1-ацетил-1_-цистеина в сочетании со средством по изобретению оказывает выраженный гемостимулирующий эффект, что проявилось в практически полном восстановлении клеточности крови. Действие дисульфида Ы-ацетил-Ь- цистеина, и литиевой соли дисульфида Ы-ацетил-Ь-цистеина, карбоната лития, в отличие от фармакологической композиции N°1 , проявляется в виде позитивных тенденций, которые в целом можно оценить как гемостимулирующий эффект (табл.1-3).
Заключение
Совокупность результатов проведенных исследований позволяет сделать заключение о том, что литий в составе фармакологической композиции N°1 , представляющей собой литиевую соль дисульфида 1\1-ацетил-1_-цистеина в сочетании со средством по изобретению обладает гемостимулирующим действием, тогда как без средства по изобретению литий вводимый составе карбоната или дисульфида Ы-ацетил- цистеина не оказывал гемостимулирующего действия.
Таким образом, средство по изобретению характеризует способность потенцировать специфическую гемостимулирующую активность ионов лития.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Палладиево-медный катализатор гомогенного селективного окисления тиолов, сочетающий в себе функциональное биядерное тиолатмостиковое координационное соединение палладия(И) и модифицирующий тиолатный комплекс меди(1), имеющий общую формулу
[Pd2'VSR)2(NH3)4] · {Cu'k(SR)m} (I),
где
SR представляет собой остаток тиолатного лиганда, выбранный из группы, включающей в себя остаток глутатиона и ацетил цистеина,
к = 2 - 14,
m > Зк.
2. Катализатор по п.1 , где тиол, в отношении окисления которого осуществляется каталитическая функция, представляет собой Ν-ацетил-цистеин.
3. Катализатор по п.1 , где тиол, в отношении окисления которого осуществляется каталитическая функция, представляет собой Ы-глутамил- цистеинил-глицин.
4. Катализатор по любому из п. п.1-3, где окисление представляет собой гомогенное селективное окисление тиолов с образованием дисульфидных связей между тиольными остатками.
5. Катализатор по п.1 , полученный путем взаимодействия моноядерных аминатных комплексов палладия(И) и соответствующих тиолов с комплексами, образующимися из солей меди(И) и соответствующих тиолов.
6. Катализатор по п.1 , где мольное соотношение Pd:Cu, лежит в интервале от 1 :0,1 до 1 :2.
7. Катализатор по п.6, где мольное соотношение Pd:Cu, лежит в интервале от 1 :0,2 до 1 :1.
8. Катализатор по п.1 , для применения в терапии.
9. Каталитическая комбинация, образованная тиолом, выбранным из ацетил цистеина, глутатиона, их сольватов и солей, и катализатором по п. 1.
10. Комбинация по п.9, где катализатор присутствует в количестве от 1 - 10"2 до 1 -10"7 г на моль тиола.
1 1. Комбинация по п.9, по существу состоящая из дисульфида ацетилцистеина и/или глутатиона, их сольватов и солей и катализатора по п. 1.
12. Комбинация по п.9 для применения в терапии.
13. Фармакологическая комбинация, включающая в себя каталитическую комбинацию по п. п.9-12 и фармакологически активное соединение, способное к вступлению в реакцию присоединения с компонентами комбинации по п. п.9-12.
14. Комбинация по п.13, для повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения.
15. Комбинация по п.14, где фармакологически активное соединение представляет собой лекарственную или биологически активную молекулу, выбранную из пуриновых или пиримидиновых оснований или их производных.
16. Комбинация по любому из п.п.13-15, для применения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний.
17. Комбинация по любому из п.п.13-15, где фармакологически активное соединение не представляет собой инозин.
18. Комбинация по п.15, где фармакологически активное соединение представляет собой рибавирин.
19. Фармацевтическая композиция, включающая в себя катализатор по любому из п.п.1-8 или комбинацию по любому из п. п.9-18 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, повышающая терапевтическую активность фармакологически активных соединений.
21. Способ терапевтического воздействия на организм пациента для повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят эффективное количество катализатора по любому из п.п.1 -8, комбинации по любому из п. п.9-12 или 13-18, или композиции по любому из п. п.19-20.
PCT/RU2011/001055 2011-01-11 2011-12-30 Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп WO2012096595A1 (ru)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013548382A JP2014510618A (ja) 2011-01-11 2011-12-30 チオール基の均一選択的酸化のためのパラジウム−銅触媒
EP11855523.4A EP2664614A4 (en) 2011-01-11 2011-12-30 PALLADIUM COPPER CATALYSTS FOR THE HOMOGENEOUS SELFACTIVE OXIDATION OF THIOL GROUPS
KR1020137017892A KR20140016251A (ko) 2011-01-11 2011-12-30 티올기의 균일한 선택적 산화를 위한 팔라듐-구리 촉매
CN2011800644959A CN103380108A (zh) 2011-01-11 2011-12-30 用于均质选择性氧化硫醇基团的钯-铜催化剂
AU2011354771A AU2011354771A1 (en) 2011-01-11 2011-12-30 Palladium-copper catalysts for the homogeneous selective oxidation of thiol groups
US13/978,936 US20130289108A1 (en) 2011-01-11 2011-12-30 Palladium-Copper Catalysts for the Homogeneous Selective Oxidation of Thiol Groups

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011101479 2011-01-11
RU2011101479/04A RU2451010C1 (ru) 2011-01-11 2011-01-11 Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012096595A1 true WO2012096595A1 (ru) 2012-07-19

Family

ID=46230722

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/001056 WO2012096596A1 (ru) 2011-01-11 2011-12-30 Противовирусное средство
PCT/RU2011/001055 WO2012096595A1 (ru) 2011-01-11 2011-12-30 Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/001056 WO2012096596A1 (ru) 2011-01-11 2011-12-30 Противовирусное средство

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20130281362A1 (ru)
EP (2) EP2664614A4 (ru)
JP (2) JP2014510618A (ru)
KR (2) KR20140047576A (ru)
CN (2) CN103380108A (ru)
AU (2) AU2011354771A1 (ru)
BR (1) BR112013017709A2 (ru)
RU (1) RU2451010C1 (ru)
WO (2) WO2012096596A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2659161C1 (ru) * 2017-11-17 2018-06-28 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид
CN111774096B (zh) * 2020-07-14 2021-12-03 厦门大学 一种用硫醇类配体修饰的催化剂及其制备方法与应用
EP4233857A1 (en) 2022-02-28 2023-08-30 CIIMAR - Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental Bioactive compounds obtained from cyanobactera leptothoe sp. lege 181152

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2153351C2 (ru) 1995-12-14 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Средство для регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов (варианты) и способ его использования
RU2153350C1 (ru) 1998-11-23 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Композит гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью с веществом металлом, фармацевтические композиции на его основе, способы их получения и применения для лечения заболеваний на основе регуляции метаболизма, пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза в нормальных и патологически измененных тканях
RU2245340C2 (ru) * 1999-04-13 2005-01-27 Анормед, Инк. Цисплатиновый комплекс и способ его получения

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3224981A (en) * 1961-12-29 1965-12-21 Ethyl Corp Supported copper oxide and palladium catalyst composition
FR1596449A (ru) * 1968-10-12 1970-06-15
US4226785A (en) * 1979-10-04 1980-10-07 Eastman Kodak Company Process for dehydrogenation of sterols to produce Δ4-3-ketosteroids
US4521530A (en) * 1983-06-15 1985-06-04 Teledyne Industries, Inc., Teledyne Water Pik Catalyst of palladium, copper and nickel on a substrate
DE3411385A1 (de) * 1984-03-28 1985-10-10 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur herstellung von o,o'-dithiobenzamiden
RU2089179C1 (ru) * 1995-12-14 1997-09-10 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования
US6544923B1 (en) * 1999-08-25 2003-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Surface-confined catalytic compositions
US6492118B1 (en) * 1999-08-27 2002-12-10 Matrix Technologies Corporation Methods of immobilizing ligands on solid supports
US20030073618A1 (en) * 2001-02-08 2003-04-17 Kozhemyakin Leonid A. Compounds comprising disulfide-containing peptides and nitrogenous bases, and medical uses thereof
US20030078232A1 (en) * 2001-08-08 2003-04-24 Elfatih Elzein Adenosine receptor A3 agonists
TWI228051B (en) * 2003-05-19 2005-02-21 Well Being Biochemical Corp Anti-bacterial, anti-viral, and anti-fungus composition, its preparation and use
EP3851126A1 (en) * 2003-05-20 2021-07-21 ImmunoGen, Inc. Maytansinoid-cell-binding agent conjugates
DE10323839B3 (de) * 2003-05-23 2004-10-21 Thioplast Chemicals Gmbh & Co.Kg Oxidation von Mercaptoethanol
US7381683B1 (en) * 2004-10-28 2008-06-03 Nanostellar, Inc. Method of producing multi-component catalysts
UY29198A1 (es) * 2004-11-09 2006-05-31 Cancer Rec Tech Ltd Derivados sustituidos de quinazolinona y derivados sustituidos de quinazolina-2, 4-diona, composiciones conteniéndolos, procedimientos de preparación y aplicaciones
RU2008106419A (ru) * 2008-02-21 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Ива фарм" (RU) Лекарственные средства на основе олигоядерных координационных соединений d-металлов, способ терапевтического воздействия на организм пациента и способ повышения терапевтической эффективности фармакологически активного вещества

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2153351C2 (ru) 1995-12-14 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Средство для регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов (варианты) и способ его использования
RU2153350C1 (ru) 1998-11-23 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Композит гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью с веществом металлом, фармацевтические композиции на его основе, способы их получения и применения для лечения заболеваний на основе регуляции метаболизма, пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза в нормальных и патологически измененных тканях
EP1131340B1 (en) * 1998-11-23 2004-10-13 Novelos Therapeutics, Inc. Hexapeptide with the stabilized disulfide bond and derivatives thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptosis
RU2245340C2 (ru) * 1999-04-13 2005-01-27 Анормед, Инк. Цисплатиновый комплекс и способ его получения

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2664614A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103582646A (zh) 2014-02-12
AU2011354771A1 (en) 2013-07-11
EP2664621A4 (en) 2014-11-26
AU2011354772A1 (en) 2013-08-29
EP2664621A1 (en) 2013-11-20
JP2014510618A (ja) 2014-05-01
BR112013017709A2 (pt) 2019-01-15
RU2451010C1 (ru) 2012-05-20
US20130281362A1 (en) 2013-10-24
EP2664614A4 (en) 2014-11-26
KR20140047576A (ko) 2014-04-22
WO2012096596A1 (ru) 2012-07-19
US20130289108A1 (en) 2013-10-31
CN103380108A (zh) 2013-10-30
JP2014502633A (ja) 2014-02-03
KR20140016251A (ko) 2014-02-07
EP2664614A1 (en) 2013-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mansuri et al. Comparison of in vitro biological properties and mouse toxicities of three thymidine analogs active against human immunodeficiency virus
KR100256144B1 (ko) 아실화된 피리미딘 누클레오사이드를 이용한 화학요법제 및 항비루스제의 독성의 치료
TW200844108A (en) Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of liver disorders
CN101115505A (zh) 治疗由过氧亚硝酸盐过度表达引起的哺乳动物疾病和创伤的方法和组合物
JP2006096772A (ja) 造血改善のためのオキシプリンヌクレオシド、およびそれらの同族体、ならびにそのアシル誘導体
WO2019217164A1 (en) Compositions and methods for treating cancer and other diseases
RU2451010C1 (ru) Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия
JPH10507441A (ja) オキシプリンヌクレオシドを用いる敗血症または炎症性疾患の処置方法
Schulman Cystinosis
KR100315890B1 (ko) 전신염증및염증성간염치료용피리미딘누클레오티드전구체
RU2738719C1 (ru) Средство для лечения коронавирусных, ретровирусных инфекций и гепатита с
JPH10502655A (ja) ジヌクレオシド−５’，５’−ピロリン酸
CN107698639A (zh) 一类吉西他滨磷酸酯的n‑甲酸酯乏氧活化前药及其应用
US10779529B2 (en) Compositions and methods for preserving red blood cells and platelets
CZ20012519A3 (cs) Nukleosid pro pouľití jako léčivo pro léčení odezvy imunitního systému v expozici
RU2354376C1 (ru) Средство, препятствующее развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения при введении цитостатика
CN1122534C (zh) 减少药物副作用的方法
KR20020031404A (ko) 혈장 대체 조성물
RU2414223C1 (ru) Средство, обладающее иммуностимулирующим и гемостимулирующим действием
CN107921134B (zh) 肿瘤基因甲基化调节剂的新用途及抗肿瘤药物
TR2022012697T2 (tr) Koronavi̇rüs, retrovi̇ral enfeksi̇yonlar ve hepati̇t c tedavi̇si̇ i̇çi̇n i̇laç/ajan
JPH01175938A (ja) ウイルス感染症治療剤
NYHAN JR EFFECTS OF CARCINOSTATIC AGENTS ON AMINO ACID METABOLISM IN THE WALKER CARCINOSARCOMA
Horsman et al. Enhancement of cyclophosphamide cytotoxicity in vivo by the benzamide analogue pyrazinamide
MXPA98005083A (en) Method of treatment of disorders characterizopopor the over-expression of citidina deaminasa or deoxicitidina deamin

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11855523

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011855523

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137017892

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013548382

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13978936

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011354771

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20111230

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013016654

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013016654

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130627