JP2014502633A

JP2014502633A - 抗ウイルス剤

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Publication number: JP2014502633A
Application number: JP2013549383A
Authority: JP
Inventors: マルクボリソビッチバラゾフスキー; ビクトルゲオルギエビッチアントノフ; アレクサンドルニコラエビッチベリアエフ; アレクセイブラジミロビッチエレミン
Original assignee: アイビーファームエルエルシー
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2014-02-03
Also published as: AU2011354771A1; RU2451010C1; WO2012096596A1; JP2014510618A; CN103582646A; US20130281362A1; AU2011354772A1; EP2664621A1; WO2012096595A1; EP2664614A1; US20130289108A1; EP2664621A4; EP2664614A4; KR20140047576A; BR112013017709A2; CN103380108A; KR20140016251A

Abstract

本発明は、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンまたはそれの塩と、イノシンと、パラジウム、銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンにより形成される配位化合物との組合せ、前記組合せをベースとする医薬組成物および抗ウイルス剤、ならびにさらにウイルス性疾患の治療のための方法を提示している。

Description

本発明は、生物無機化学および医学に、特に抗ウイルス性医薬製剤の製法に関し、医学および獣医学においてウイルス性疾患の治療のために使用することができる。

インターフェロン、インターロイキンおよびヌクレオシドは、ウイルス性疾患の治療のために通常は使用される。そのような治療は疾患の急性期には効果的であるが、疾患の慢性過程においてしばしば不適切である。

インターフェロン治療には、副作用の発生が付きものである。最も普通に見られるこの治療の有害作用としては、インフルエンザ様の症候群、胃腸障害および心因性障害の症状、骨髄機能抑制の兆候、ならびに甲状腺および副甲状腺機能の障害が挙げられる。インターフェロンの多くの有害反応は、ウイルス性疾患の治療で幅広く使用されるヌクレオシドの合成修飾類似体（リバビリン、ビダラビン、リボミジル（ｒｉｂｏｍｉｄｉｌ）など）によって増強される。

前記治療の合併症は、慢性肝炎の臨床例の１０〜４２％で見られ、したがって、そのような治療は専門病院にあっても、合併症のリスクに関してかなり危険であるとみなされる可能性があり、現在のところ、特に慢性ウイルス性肝炎の治療のための低毒性の効果的な方法がなく、したがってこれらの創出は、現代の薬理学および医学の緊急課題の１つである。

ロシア国特許第２１５３３５０号およびロシア国特許第２１５３３５１号は、好ましくはシスプラチンおよび酸化型グルタチオンの配位化合物を使用することによるイノシンの抗ウイルス活性を増強するための薬理学的溶液について記載している。しかしながら、シスプラチンは、白金（Ｐｔ）の錯化合物であり、その使用には有毒作用および変異原性作用の危険が付随し、そのため、それを含有する薬物の使用は制限される。

ロシア国特許第２１５３３５０号明細書ロシア国特許第２１５３３５１号明細書

本発明の目的は、疾患の慢性過程において効果的であり、最小の副作用を有する広スペクトルの抗ウイルス剤を開発することである。

前記目的は、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンまたはそれの塩と、イノシンと、パラジウム、銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンにより形成される配位化合物とからなることを特徴とする組合せを提示することで達成される。前記組合せは、さらに「本発明による作用物質」とみなされる。

この組合せにおけるビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンは、二ナトリウム塩の形で好ましくは提供される。

このビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比は、１００〜１００００：１００〜１００００：１〜１０：１〜１０の範囲内、例えば１０００：１０００：１：１であることが望ましい。

シス−ジアミノジクロロパラジウムがパラジウム供給源として、二塩化銅が銅供給源として選択されることが望ましい。

本発明の１実施形態において、該組合せは、その場で調製されたパラジウムシス−ジアミノジクロリド、二塩化銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンに基づく触媒を含むことができる。

別の実施形態において、そのような触媒は、あらかじめ調製されてもよい。

提示された組合せは、抗ウイルス活性を示し、感染性疾患、特にウイルス性疾患の治療において使用することができる。

前記組合せと薬剤的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提示されている。

上記医薬組成物は、抗ウイルス活性を示し、感染性疾患、特にウイルス性疾患の治療において使用することができる。

前記組合せの酢酸緩衝液中の溶液を含む抗ウイルス剤も提示されている。

前記薬剤中のビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比は、１００〜１００００：１００〜１００００：１〜１０：１〜１０の範囲内、例えば１０００：１０００：１：１であることが望ましい。

この薬剤は、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む群から選択されるウイルスの治療のために使用することができる。

ウイルス性疾患の治療を必要としている患者における、ウイルス性疾患の治療のための方法であって、前記の組合せ、組成物または薬剤の有効量が前記患者に投与される上記方法も提示されている。このウイルス性疾患は、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ダニ媒介性脳炎、リフトバレー熱およびベネズエラウマ脳炎を含む群から選択され得る。

実験動物の本発明による作用物質の単回投与後の血清中のＩＦＮ−αの動態における変化の典型的なプロファイルを示す図である。血清ＩＦＮ−αレベル（Ｕ／ｍｌ）はＹ軸上に示されている。星印は、対照と比較したときのｐ＜０．０５で統計的に信頼できる差を示している。

本発明による作用物質は、抗ウイルス効果、さらにまた、インターフェロン産生効果（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔ）を示す。

イノシンは、１，９−ジヒドロ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−６Ｈ−プリン−６−オン（リボフラノシル−ヒポキサンチン）である。

イノシンは、タンパク質同化剤、代謝過程の刺激物質およびアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の前駆物質である。それはエネルギ収支を増大させ、冠状動脈の血液循環および心筋内の代謝過程を改善する。それは抗低酸素作用を示す。それは、虚血性心疾患（ＩＨＤ）（心筋梗塞、狭心症）、心筋症、心調律障害、心筋炎、心筋ジストロフィ、肝臓の疾患（肝炎、肝硬変、肝臓の脂肪ジストロフィ）、胃十二指腸潰瘍および開放隅角緑内障において使用される。

グルタチオン、γ−グルタミニル−システイニル−グリシンは、３つのアミノ酸、すなわち、グルタミン酸、システインおよびグリシンの残基によって形成されたトリペプチドである。

グルタチオンは、全ての生物の細胞内に存在し、システインのスルフヒドリル基（ＳＨ−）が可逆反応、すなわち
に参加できる能力のために酸化還元反応に対して非常に重要である。

この記述において、還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）は、（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンを意味する。酸化された形のグルタチオン（ＧＳＳＧ）は、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンを意味する。

別段の指摘がない場合、グルタチオンはこの記述においては還元されたグルタチオンとして理解するべきである。

グルタチオンは、陽イオン、特にＮａと塩を形成することができる。

本発明による組合せは、ｄ金属を含有する。ｄ金属、パラジウムおよび銅の供給源は、水に溶解する際に錯化合物の形成を引き起こすそれらのさまざまな塩であり得る。特に銅（ＩＩ）の単塩例えばＣｕＣｌ_２またはＣｕＢｒ_２などが、水溶液に加えられるとき、それのアクア化が起り、その後、その溶液中で加水分解および銅（ＩＩ）のオリゴ核アクアヒドロキシ錯体（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅａｒａｑｕａｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成が伴う。パラジウムは、それの適切な塩、特にシス−ジアミノジクロロパラジウムの形で加えることもできる。

本発明による作用物質ＧＳＳＧＮａ_２／イノシン／Ｐｄ／Ｃｕ＝１０００／１０００／１／１の調製のための反応は、次の化学反応式、すなわち
に相当する。

本発明による作用物質の調製は、いくつかの方法によって実施できる。

本発明による作用物質の調製のためのプロセスの１つの実施形態は、パラジウム−銅触媒（パラジウムと銅とγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシンとの配位化合物）の予備調製（段階１、実施例１）を含み、その後、その得られた触媒溶液を反応塊に加え、酸化を行い、その得られた溶液をイノシンの溶液と混合し、濾過し、凍結乾燥する。

別の実施形態においては、パラジウム−銅触媒のその場での調製のための変形形態が提示されており（実施例２）、酸化、得られた溶液のイノシンの溶液との混合、濾過および凍結乾燥が後に続く。

第３の実施形態（実施例３）においては、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンの二ナトリウム塩の溶液（パラジウムと銅の配位化合物を含有する）の真空昇華乾燥（凍結乾燥）のさらなる段階の導入を含み、その後凍結乾燥した材料の溶解、イノシンの溶液との混合、濾過および本発明による作用物質の溶液の凍結乾燥が続く別の調製の変形形態が提示されている。

最後の実施形態は、エネルギおよび材料に関してはより費用がかかるものの、第二のプロセス、すなわちイノシン酸化プロセスのないことと関連する利点を有する。

チオールＲＳＨの触媒酸化の間のパラジウムの最も重要な機能の１つは、配位化合物−チオレートイオンＲＳ⁻のパラジウムイオンへの付加生成物の形成であり、その後それの酸化およびその配位多面体の破壊が続く。

銅−パラジウム触媒を採用する触媒系の実験的研究は、パラジウム（ＩＩ）の二核チオレート架橋化合物と比較して著しく大きいこれらの触媒効率を明らかにしている。銅のチオレート錯体Ｃｕ^Ｉ _ｋ（ＳＲ）_ｍを含有する酸化型グルタチオンＧＳＳＧの水溶液とは対照的に、Ｐｄ−Ｃｕを含有する水溶液は、^１ＨＮＭＲ、ＩＲ分光法およびＨＰＬＣデータによれば、分解過程に耐性を示す。

研究は、Ｐｄ−Ｃｕ触媒中のＰｄ：Ｃｕ比が１：０．２から１：２までの範囲にあるのが最も有利であることを示している。

ＧＳＨのＧＳＳＧへの穏やかな選択的酸化の過程に対して、パラジウム（ＩＩ）の二核チオレート架橋錯体は、酸化触媒の基本機能を満たし、ところが一方、銅（Ｉ）のチオレート錯体は、それの触媒活性を加減するまたは、言い換えれば、それの触媒活性を制御する化学部位とみなされるべきものであるという結論を引き出すことができる。

例えば式［Ｐｄ_２ ^ＩＩ（μ−ＳＲ）_２（ＮＨ_３）_４］を有する官能性二核パラジウム配位化合物の｛Ｃｕ^Ｉ _ｋ（ＳＲ）_ｍ｝タイプの対照部位を有する銅塩ＣｕＸ_２（ただし、Ｘ＝Ｃｌ⁻またはＢｒ⁻である）から形成され、チオールの媒体中で対応する銅（Ｉ）化合物のチオレート誘導体に転化された二座架橋配位のグルタチオンとの組合せは、したがって、Ｐｄ_２ ^ＩＩおよびＣｕ^Ｉの錯体をベースとする触媒系の活性を制御するための最も効果的なアプローチの１つを開示するものである。

同程度の量でＣｕ、ＰｄおよびＧＳＨを含む錯化合物の形成は、提示されている組合せの生物学的効果を提供する。

薬剤的に許容される賦形剤が本発明による医薬組成物を調製するために使用される。特に、これらは無機または有機媒体である。ラクトース、コーンスターチまたはそれの誘導体、タルク、ステアリン酸またはそれの塩などが、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤およびゼラチンカプセルのための媒体として使用され得る。軟ゼラチンカプセルのための適切な媒体は、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体および液体のポリオールなどである。液剤およびシロップ剤の調製のための適切な媒体は、例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコースなどである。座薬のための適切な媒体は、例えば、天然油または硬化油、ワックス、脂肪、半固体または液体のポリオールなどである。

その上、医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、矯正薬、浸透圧を調節するための塩、緩衝剤、マスキング剤または酸化防止剤およびその他の必要な成分を含有できる。

一般に、本発明による全ての生成物および方法は、この記述の中に開示されているまたは先行技術から当業者には知られている任意の適切な成分および段階を代わりになるべきものとして含むか、それらから成るあるいは基本的にそれらから成ることができ、また、本発明による生成物および方法は、さらにまたは代わりに、先行技術から知られている生成物または方法において使用される、あるいは本発明の技術的結果を達成するためには不必要である任意の特定の成分、または段階、または目的物を排除することもできる。

本発明は、特定の実施例によってさらに説明される。

＜実施例１＞
［本発明による作用物質の調製］
段階１．２０ｍｇ（９４．６μｍｏｌ）のシス−［Ｐｄ（ＮＨ_３）_２Ｃｌ_２］を冷たい２０ｍｌの蒸留水中に分散させ、次いで３０ｍｇのＧＳＨ（９７．６μｍｏｌ）をその得られた懸濁液に加え、均一な淡黄色の溶液が得られるまで撹拌する。

段階２．１４．５２ｍｇ（８５．２μｍｏｌ）の塩化銅（ＩＩ）二水和物を含有する５ｍｌの溶液を、先に準備した反応混合物に加える。この得られた黄緑色の触媒の溶液のｐＨは、０．０１Ｍの水酸化ナトリウム溶液により５．５〜６．０に調整する。

段階３．５８．１９ｇ（０．１８９ｍｏｌ）のＧＳＨをガラスビーカ中で秤量し、次に２００ｍｌの蒸留水を撹拌しながら加え、１０〜１５℃に冷却する。７．５７ｇのＮａＯＨ（０．１８９ｍｏｌ）を５０〜６０ｍｌの蒸留水中に別に溶解し、その得られた溶液を、ＧＳＨの懸濁液に、激しく撹拌しながらかつ反応塊が１５〜２０℃より上まで温まらないようにしながら加え、その撹拌を均一な半透明の溶液が形成されるまで続ける。その反応混合物のｐＨは、必要に応じて０．０１Ｍの水酸化ナトリウム溶液により５．５〜６．０に調整する。あらかじめ準備された触媒溶液を、その得られた反応系に加え、そのビーカは、氷浴（５〜１０℃）に移動し、１００〜１０２ｍｌ（約０．１ｍｏｌ）の新たに準備した１Ｍの過酸化水素溶液を、激しく撹拌しながら４５〜６０分かけてごく一部ずつ加える。ＨＰＬＣを使用して反応の完了までの進行をチェックする。

２５．３８ｇ（０．０９５ｍｏｌ）のリボフラノシルヒポキサンチン（イノシン）を、別に１５０ｍｌの高温の（６０〜７０℃）蒸留水中に溶解する。完全に溶解した後、その溶液を室温まで冷却し、該反応混合物に加える。殺菌消毒濾過の後、その溶液は凍結させ、真空昇華（凍結）乾燥にかける。

得られた調製品中のＧＳＳＧ：イノシン：パラジウム：銅のモル比は、１０００：１０００：１：０．９である。

＜実施例２＞
［本発明による作用物質の調製］
３３０ｇ（１．０７４ｍｏｌ）の還元されたグルタチオンを３１００ｍｌの水中に懸濁させる。４２．９６ｇ（１．０７４ｍｏｌ）の１６％水溶液の形の水酸化ナトリウムを、その得られた懸濁液に、連続的に撹拌しながら、そして冷却しながら加える。０．１１３５ｇ（０．５３７ｍｍｏｌ）のシス−ジアミノジクロロパラジウムおよび０．０９１５ｇ（０．５３７ｍｍｏｌ）の塩化銅二水和物を得られた溶液に加え、３０４．５ｇの６％過酸化水素溶液（０．５３７ｍｏｌ）を十分に撹拌しながら、そして温度を監視しながら（１５℃を超えないように）加える。過酸化物を加えた後、得られた溶液は室温で１．５時間そのまま放置する。最小量の水に溶解した１４４ｇ（０．５３７ｍｏｌ）のイノシンを、酸化したグルタチオンの得られた溶液に加え、０．２２μのフィルタを通して濾過し、凍結乾燥させる。ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンリボフラノシル−ヒポキサンチン−二ナトリウム：シス−ジアミノジクロロパラジウム：二塩化銅（１０００：１：１の状態）の収率は、９９％である。

＜実施例３＞
［本発明による作用物質の調製］
段階１
３３０ｇ（１．０７４ｍｏｌ）の還元されたグルタチオンを３１００ｍｌの水中に懸濁させる。１６％の水溶液の形の４２．９６ｇ（１．０７４ｍｏｌ）の水酸化ナトリウムを得られた懸濁液に加える。この反応塊を、次に冷却し、０．１１３５ｇ（０．５３７ｍｍｏｌ）のシス−ジアミノジクロロパラジウムおよび０．０９１５ｇ（０．５３７ｍｍｏｌ）の塩化銅二水和物を加える。３０４．５ｇの６％過酸化水素溶液（０．５３７ｍｏｌ）を得られた溶液に温度をチェックしながら（１５℃を超えないように）加える。得られた溶液は、そのまま室温で１．５時間放置する。それを次に０．２２μのフィルタを通して濾過し、凍結乾燥させる。３６５ｇのビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンの二ナトリウム塩が得られる（水の含量４％、Ｐｄ−５７ｍｇ、Ｃｕ−３４ｍｇ）。

段階２
前の段階からのビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンの凍結乾燥させた二ナトリウム塩を最小量の水に溶解し、イノシン（１４４ｇ、０．５３７ｍｏｌ）の水中の溶液に加える。その得られた溶液を、０．２２μのフィルタにより濾過し、凍結乾燥させる。この２つの段階に対しての収率は９８％である。

＜実施例４＞
［本発明による作用物質の医薬品の形態の調製］
１３．６ｇの酢酸ナトリウム三水和物および６０ｇの本発明による作用物質の内容を、１Ｌの限度容量を有する溶液調製容器中の注射用の０．８Ｌの水に加え、溶解するまで撹拌し、その後全容積を１．０Ｌに調整する。そのｐＨを、ｐＨメータを用いて測定し、２０％の酢酸をｐＨ６．０±０．２まで加える。殺菌消毒濾過を０．２２μの細孔の大きさを有する消毒殺菌フィルタを用いて実施し、ガラス製アンプル（１アンプル当り１ｍｌ）中に充填する。その結果、９７０個のアンプルが得られ（ロスを斟酌して）、それらは静脈内または筋肉内注射用の組成物を含有し、３年間の規範ドキュメンテーションの要件に適合し、次の組成を有する：
本発明による作用物質６０ｇ
酢酸ナトリウム三水和物１３．６ｇ
酢酸ｐＨ６．０まで
水１０００ｍｌまで

＜実施例５＞
［病原性ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスにより引き起こされる疾患の治療における本発明による作用物質のインビボでの治療効果］
イノシンは、それを他の生物学的に活性な分子と組み合わせることによって高められ得る抗ウイルス効果を含めた広範な薬理学的活性を特徴とする。ロシア国特許第２１５３３５０号およびロシア国特許第２１５３３５１号は、好ましくはシスプラチンの配位化合物および酸化型グルタチオンを使用するイノシンの抗ウイルス効果の増強に関する薬理学的溶液を開示している。この増強効果は、シスプラチンおよび酸化されたグルタチオンの配位化合物が、標的の酸化修飾の反応物の錯体に触媒作用を及ぼしてイノシンの作用に対するそれらの感度を高める能力によって達成される。もしイノシンの抗ウイルス効果を増強するメカニズムが配位化合物の触媒活性と関係しているならば、そのとき、本発明による作用物質は、その組成物がシスプラチンと酸化型グルタチオンとの配位化合物と比較してより高い触媒活性を有する配位化合物を含むので、同様のより際立った効果を発揮するはずである。

本発明の目的は、さまざまなウイルス感染の治療における本発明による作用物質の治療有効性を確定することである。

（試験される化合物）
ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンリボフラノシルヒポキサンチン−二ナトリウム：シス−ジアミノジクロロパラジウム：二塩化銅（１０００：１：１の状態）（本発明による作用物質）
ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンリボフラノシルヒポキサンチン−二ナトリウム：シス−ジアミノジクロロ白金（対照１）
アルビドール医薬品形態、シリーズ９７０６０９（対照２）

（実験モデル）
・ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス−病原性菌株トリニダード。実験動物のその後の感染のためのウイルス含有材料は９〜１１日齢の発育ニワトリ胚（３０〜５０個）を用いて蓄積した。ウイルスを含有する懸濁液の５つの連続１０倍希釈物を最初に用意した。ウイルスを含有する懸濁液の０．２ｍｌの各希釈物を発育ニワトリ胚（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃｈｉｃｋｅｍｂｒｙｏｓ）の尿膜腔中に導入した。このウイルスを含有する懸濁液の注射部位を溶融パラフィンでシールした。この発育ニワトリ胚を次に（３７±０．５）℃の温度のサーモスタット中に１８時間入れ、それらの生存能力を、検卵器（ｏｖｏｓｃｏｐｅ）を用いて周期的に評価した。培養時間の終わりに、サーモスタット中の発育ニワトリ胚の生存能力を評価し、ウイルス含有材料の１０％懸濁液を抗生物質（１ｍｌ当り１００ユニットの割合のペニシリン、１ｍｌ当り２００ユニットのストレプトマイシン）が添加されている生理食塩水を用いて生きている胚の「死骸」から調製した。得られた懸濁液を、１５００〜２０００回転／分およびプラス（３±０．５）℃の温度で１０分間遠心分離した。その上澄みを１．０ｍｌの小瓶に分注し、その後の実験動物（マウス）の感染のために使用した。初期ウイルス力価は、１０^７〜１０^８ＬＤ_５０／ｍｌであった。

・リフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルス−病原性菌株８−８７。実験動物の感染のためのウイルス含有材料は３〜５日齢の授乳期のマウス（１０〜１５匹）を用いて蓄積した。ウイルス含有材料の５つの連続１０倍希釈物を最初に用意した。０．０２ｍｌのそれぞれの希釈物を授乳期のマウスの脳に注射し、これらを２４〜４８時間観察し、その終わりにその動物をエーテルで屠殺し、その脳を摘出し、それぞれにおける３つのサンプルをペニシリンの小瓶に入れ、それをマイナス（２０±０．５）℃の温度の冷凍室中で保存した。１０％脳懸濁液を、ウイルス含有材料としてその後使用した。初期ウイルス力価は、１０^５〜１０^６ＬＤ_５０／ｍｌであった。

・ダニ媒介脳炎（ＴＥ）ウイルス、病原性菌株アブセタロブ。実験動物の感染のためのウイルス含有材料は授乳期のマウスを用いて蓄積した。５つの連続１０倍希釈物を、あらかじめ感染させたマウスの脳または凍結乾燥状態から水分補給をしたウイルス含有材料の１０％懸濁液の遠心分離物であるウイルス含有材料から最初に用意した。０．０２ｍｌのそれぞれの希釈物を授乳期のマウスの脳に注射し、これらを２４〜４８時間観察し、その終わりにその動物をエーテルで屠殺し、その脳を摘出し、それぞれにおける３つのサンプルをペニシリンの小瓶に入れ、それをマイナス（２０±０．５）℃の温度の冷凍室中で保存した。１０％脳懸濁液を、ウイルス含有材料としてその後使用した。初期ウイルス力価は、１０^２〜１０^３ＬＤ_５０／ｍｌであった。

・インフルエンザＡウイルス菌株Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／６８（Ｈ_３Ｎ_２）。ウイルス含有材料を９〜１１日齢の発育ニワトリ胚を用いて得た。実験動物の感染のためのウイルス含有材料のその後の蓄積は、５匹のマウスを用いて行い、それらは病原性菌株Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／６８（Ｈ_３Ｎ_２）を含有しているウイルスを含有する尿膜腔液により感染させた。感染３日後にそれらの肺を分離し、１０倍容量の滅菌生理食塩水中でホモジナイズし、その後そのホモジネート中のウイルスの感染活性を動物における致死滴定による別々の実験で測定した。そのウイルス力価は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、１９３８年、２７：４９３〜４９７頁）を用いて計算した。

本発明による作用物質の有効性を評価する検討は、重量が１６〜１８ｇの非近交系雄白ネズミ（３６０匹）について行われた。

各原因物質のＬＤ_５０は、非近交系白ネズミにおいて、Ｉ．Ｐ．ＡｓｈｍａｒｉｎおよびＡ．Ａ．Ｖｏｒｏｂ’ｙｅｖにより修正されたＫｅｒｂｅｒ法を用いる判定基準を計算して測定した。

検討した製剤の有効性は、実験群（これらは対応する製剤を与えられる）および対照群における動物の生存率の値を比較することによって測定した。実験群および対照群において生き残っている動物の割合は、Ｖ．Ｓ．Ｇｅｎｅｓの表を使用して確定した。感染した動物は、２１日間観察し、実験群および対照群の中の生きている動物および死んだ動物の数を毎日記録した。

（結果の統計的処理のための方法）
実験結果の統計的処理は、従来の統計的方法を実装する特別のプログラムを用いるパソコンによって行われた。

（本発明による作用物質の抗ウイルス活性の研究結果）
特に危険なウイルス感染（ＥＤＶＩ）およびインフルエンザの全ての実験モデルにおいて、本発明による作用物質および比較製剤の有効性が評価されるのは、それらが２つのスキーム、すなわち
・感染の２４時間前、感染と同時ならびに感染後２４時間、４８時間および７２時間後（スキームＮｏ．１−緊急予防）
・感染と同時ならびに感染後２４時間、４８時間および７２時間後（スキームＮｏ．２−早期抗病因治療）
を使用して採用されるときである。

本発明による作用物質および対照１は、体重１ｋｇ当り３０ｍｇ（１０μｇ／マウス）の単回投与において０．５ｍｌの量で皮下に注射した。

インフルエンザ感染を治療するときに使用した対照製剤は、アルビドール医薬品形態、シリーズ９７０６０９（対照２）であり、それは感染１時間後に投与し、その後は５日間にわたって６０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口的に１日１回投与した。

（ベネズエラ脳脊髄炎に対する実験ウイルス感染における本発明による作用物質の有効性）
調査の結果を表１に示す。

表１に示されている結果は、評価された製剤が実験のＶＥＥに関して保護作用を見せたことを示している。本発明による作用物質は、これらの条件において最も効果的であることを証明した。ここで製剤がスキーム１（感染の２４時間前、感染と同時ならびに感染後２４時間、４８時間および７２時間後）に従って使用された場合、そのとき、ＶＥＥウイルスの感染用量とは関係なく感染したマウスの生存率は１００％のレベルであり、対照における１００％の死亡率とは対照的であった。また一方、製剤がスキーム２（感染と同時ならびに感染後２４時間、４８時間および７２時間後）に従って使用された場合、そのとき、これらの条件においては、原因細菌の感染用量によって、その保護作用は１００％のレベル（１２ＬＤ_５０の用量の原因細菌による感染で）および１００％（２ＬＤ_５０の用量の原因細菌による感染で）であった。対照１を使用したとき、保護の指標は、本発明による作用物質を使用するときより、原因細菌の感染用量によって、４０〜６０％低かった。

したがって、実施された調査に基づいて、実験のＶＥＥ感染に関して評価された製剤のうちで本発明による作用物質が最も効果的であると結論付けることができる。緊急予防スキームに従って採用されるときは、本発明による作用物質は、対照における１００％死亡率と比較して感染した動物に対して１００％の保護を提供した。

（リフトバレー熱での実験ウイルス感染における本発明による作用物質の有効性）
調査の結果を表２に示す。

表２に示されている結果は、ＲＶＦに関するベストの保護および治療効果は本発明による作用物質を使用したときに得られたことを示している。投与スキームとは無関係に、該製剤は、対照における１００％の死亡率と比較して感染したマウスに対して１００％の保護を提供した。これらの条件において対照１の有効性は低かった。

（実験的ダニ媒介脳炎での実験ウイルス感染における本発明による作用物質の有効性）
調査の結果を表３に示す。

示された結果からわかるように、２ＬＤ_５０の用量の原因細菌に感染した動物で使用されたとき、評価された全ての製剤が実質的に同じ保護の有効性を示し、対照における１００％の死亡率と比較して感染したマウスの８０〜１００％の生存率を提供した。同時に、その製剤が、１２ＬＤ_５０の用量の原因細菌に感染した動物で使用された場合、そのときこれらの条件において本発明による作用物質は、より顕著な効果を示した。

（インフルエンザ（病原性菌株Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／６８）での実験ウイルス感染における本発明による作用物質の有効性）
調査の結果を表４に示す。

得られた結果は、本発明による化合物が、インフルエンザウイルス菌株Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／６８（Ｈ_３Ｎ_２）に経鼻感染した白ネズミにおけるインフルエンザ感染に関してアルビドールより高い比活性度を有することを示している。

（結論）
実施された調査の全般的な結果は、本発明による作用物質が、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの両方により引き起こされるさまざまなウイルス性疾患に関して予防効果および治療効果があると特徴付けられる結論を可能にする。

＜実施例６＞
［本発明による作用物質のインターフェロン産生を誘導する能力の測定］
ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスの両方によって引き起こされるさまざまなウイルス疾患に関する本発明による作用物質の治療効果は、とりわけ、際立った抗ウイルス活性を有する生物学的に活性な物質であるインターフェロンの内因性産生を増大するその能力によるものであり得る。

本調査の目的：本発明による作用物質のインターフェロン産生を刺激する能力を測定すること。

試験化合物：ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンリボフラノシルヒポキサンチン−二ナトリウム：シス−ジアミノジクロロパラジウム：二塩化銅（１０００：１：１の状態）（本発明による作用物質）

（実験方法）
本発明による作用物質のインターフェロン産生特性は、実験の結果が効果的であることを示す（実施例３参照）本発明による作用物質を３０ｍｇ／ｋｇの投与量で受けている実験動物の血清中でインターフェロンα（ＩＦＮ−α）の滴定によって評価された。その製剤は、単回投与で皮下に投与された。マウスの対照群においてはプラセボ（０．８５％塩化ナトリウム溶液）の皮下投与が採用された。血液が、無菌状態の実験群（試験製剤の１つを受けている）および対照群のマウスから製剤注射の２、４、８、１６、２４、３２、３６、４０および４８時間後に後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓ）から収集された。５匹のマウスからの血液を一体化して１つのサンプルとした。インターフェロン蓄積の動態は、標準方法により調製された血清中で調査された。ロシア科学アカデミーの細胞学協会（ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｙｔｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＲｕｓｓｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）（セントピーターズバーグ）から得たＬ−９２９細胞（ネズミ科動物線維芽細胞の継代培養液）、１５３代の継代、の培養液を使用して実験動物の血清中のＩＦＮ−α活性を滴定した。用意したサンプル中のＩＦＮ−αは、微量法を用いて滴定した。培地により所要の濃度（３〜４×１０^５細胞／ｍｌ）まで希釈したＬ−９２９細胞の培養液は、９６ウェルのプレートのウェル中にセットし、サーモスタット中で２４時間培養した。細胞培養は、全体の滴定過程の間ずっと全く同じ条件、すなわち、５％ＣＯ_２および９８％湿度を有する雰囲気中プラス３７℃の温度、の中で培養した。ウェルのベース上に細胞単層が形成された後、その培地は、そのプレートから取り除き、維持培地を導入し、その中で試験サンプルの連続的な２倍の希釈を行った（対を成すウェルにおいて）。２４時間の培養が終了した時点で、試験サンプルを取り除き、実行希釈状態（１００ＣＰＤ_５０）のＥＭＣ試験ウイルスを導入した。その結果は、２４時間後に倒立顕微鏡を用いて測定した。ＩＮＦ力価は、試験ウイルスＣＰＤに対して５０％の保護が観察される最後の血清希釈に対する逆数の値である。

（調査の結果）
本発明による作用物質の単回投与後の試験動物の血清中のＩＮＦ−αにおける変化の動態は、図１に示されている。

その得られた結果は、ＩＮＦ−α濃度が、本発明による作用物質の投与２時間後には５〜６倍に増加し始め、１６〜２４時間後にはバックグラウンド値を４５〜５０倍超え、そして本発明による作用物質の投与後４８時間で正常値に戻ったことを示している。このＩＮＦ−α濃度における変化の動態は、本発明による作用物質がインターフェロン産生活性を有することを明らかにしている。内因性のＩＦＮ−αは、外因性のインターフェロンの製剤を超える明らかな優位性を有しており、すなわち、インターフェロノージェンは、体内に導入されるとき、抗原性を示さないインターフェロンを産生し；外因性のＩＦＮ−αの製剤に特有の有害作用は起らず；体内での誘導ＩＦＮ−αの合成は、均衡が保たれて、インターフェロンの過負荷に対する身体の保護を確保する制御および調節メカニズム（リプレッサーの翻訳）に従い；インターフェロノージェンの単回投与は、内因性のＩＮＦ−αの比較的長期にわたる循環を提供する。本発明による作用物質の作用は、インターフェロノージェンの上述の効果に相当する。

本発明による作用物質は、したがって、インターフェロン−αの産生を高める能力を特徴とする。

＜実施例７＞
（慢性ウイルス性Ｃ型肝炎（ＣＶＨＣ）における本発明による作用物質−ＧＳＳＧＮａ_２／イノシン／Ｐｄ／Ｃｕの治療有効性）
女性患者Ｎｏ．１：４８歳

診断：ＣＶＨＣ、複製相（ＰＣＲＨСＶ＋ −３．６０×１０^７コピー／ｍｌ＝９．００×１０^６ＩＵ／ｍｌ）、中程度の活性レベル。慢性自己免疫性甲状腺炎。甲状腺機能低下症。
病気の期間２０年

病歴は、ペグインターフェロン、リバビリンおよびその他の抗ウイルス製剤、ならびにインターフェロン誘導剤を含めた特異的抗ウイルス療法に不耐性を示す。Ｌ−チロキシンを、定常的に毎日朝１回１５０ｍｇを服用している。

脱力感、右季肋部の重苦しい感覚、残味覚、食欲不振、睡眠不足および被刺激性の訴え。

ここ５年の間に、右季肋部のうずく痛み、脱力感および尿の色の周期的な変化の出現を頻繁に感じている。

検査の後（結果については表５、縦列３参照）、外来患者部門において、２日（土曜、日曜）は休みの週当たり３回の６０ｍｇの筋肉注射で与えられる本発明による作用物質の医薬品形態による治療が行われた。

本発明による作用物質の医薬品形態は、耐用性がよい。注射後、患者は、エネルギの急増および気分の改善に気付いた。治療に対する反応の客観的基準は、ウイルス量の変化の動態であり、それは治療の１ヵ月後に１／３に低下し、３ヵ月後には１／６０に低下し、６ヵ月後には対数で４を超えた低下が見られた。ウイルス量の減少は、細胞溶解反応の激しさの減少（治療の終了によるアミノ基転移酵素の正常化）、および肝細胞の生理学的に最適な機能活性の復元（血液タンパク質ならびに色素およびその他の型の代謝の指標の値の正常化）が同時に起った。その製剤の治療効果は、血液の細胞構成および凝固系活性の正常化をもたらした。

調査してみると、肝臓は肋骨弓の下から０．５ｃｍ伸びた。肝臓の縁は柔らかく圧痛はなかった。

この治療の特別な特徴のうちで、Ｌ−チロキシンの用量は、３週間毎に減少される必要があることに注意しなければならない。治療の終わりまでに、Ｌ−チロキシンの用量は、半分にされた。

本発明による作用物質の医薬品形態の使用は、かくして、特異的な抗ウイルス治療薬が効かない慢性ウイルス性Ｃ型肝炎を治療することを可能にし、そのことは本発明による作用物質の抗ウイルス活性の証明である。

Claims

ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンまたはそれの塩と、イノシンと、パラジウム、銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンにより形成される配位化合物を含むことを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンが、二ナトリウム塩の形であることを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比が、１００〜１００００：１００〜１００００：１〜１０：１〜１０の範囲内であることを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比が、１０００：１０００：１：１であることを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、シス−ジアミノジクロロパラジウムがパラジウム供給源として選択されることを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、二塩化銅が銅供給源として選択されることを特徴とする組合せ。
請求項１から６のいずれか１項に記載の組合せであって、その場で調製されたパラジウムシス−ジアミノジクロリド、二塩化銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンをベースとする触媒を含むことを特徴とする組合せ。
請求項１から６のいずれか１項に記載の組合せであって、あらかじめ調製されたパラジウムシス−ジアミノジクロリド、二塩化銅および（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシンをベースとする触媒を含むことを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、抗ウイルス活性を示すことを特徴とする組合せ。
請求項１に記載の組合せであって、感染性疾患、およびウイルス性疾患の治療において使用されることを特徴とする組合せ。
医薬組成物であって、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組合せと薬剤的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
請求項１１に記載の医薬組成物であって、抗ウイルス活性を示すことを特徴とする医薬組成物。
請求項１２に記載の医薬組成物であって、感染性疾患、およびウイルス性疾患の治療に使用されることを特徴とする医薬組成物。
抗ウイルス剤であって、請求項１に記載の組合せの酢酸緩衝液中溶液であることを特徴とする抗ウイルス剤。
請求項１４に記載の抗ウイルス剤であって、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比が、１００〜１００００：１００〜１００００：１〜１０：１〜１０の範囲内であることを特徴とする抗ウイルス剤。
請求項１５に記載の抗ウイルス剤であって、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−グリシン二ナトリウム塩：イノシン：パラジウム：銅のモル比が、１０００：１０００：１：１であることを特徴とする抗ウイルス剤。
請求項１４に記載の抗ウイルス剤であって、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む群から選択されるウイルスの治療を目的とすることを特徴とする抗ウイルス剤。
ウイルス性疾患の治療を必要としている患者における、ウイルス性疾患の治療のための方法であって、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組合せ、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項１４から１７のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤の有効量を前記患者に投与することを特徴とする方法。
請求項１８に記載の方法であって、ウイルス性疾患が、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ダニ媒介性脳炎、リフトバレー熱およびベネズエラウマ脳炎を含む群から選択されることを特徴とする方法。