CN103347848B - 水合n-富勒烯氨基酸、其制备方法和以它为基础的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药工业和药物，具体涉及通式C₆₀(H)₃{NH(CH₂)_nCOOH}₃·xH₂O的新的水合富勒烯C₆₀氨基酸衍生物，其中C₆₀是富勒烯，n=5、6、7且x=8～10，本发明还涉及制备所述衍生物的方法和基于所述衍生物的药物组合物的生产。水合N‑富勒烯氨基酸是如下形成的：通过使富勒烯与15倍摩尔过量的氨基酸的无水钾盐在芳香族溶剂介质中反应，在搅拌下向得到的悬浮液中缓慢添加相间催化剂并加热到不超过60℃的温度，直到溶液完全脱色并形成固体残余物，然后将这个残余物分离并将富勒烯氨基酸衍生物的钾盐的0.8M水溶液用有机酸或无机酸的溶液处理，然后离心、漂洗并干燥所述残余物。还公开了包括有效量的水合N‑富勒烯氨基酸作为活性物质的药物组合物，所述药物组合物表现出抗疱疹病毒、各种来源的流感病毒和HIV的活性，以及抗肿瘤和抗牛皮癣的活性。

Description

水合N-富勒烯氨基酸、其制备方法和以它为基础的药物组 合物

技术领域

本发明涉及制药工业和药物，更具体地说，涉及新的式(I)的富勒烯C₆₀的水合氨基酸衍生物，以及涉及其制造方法和制备包含所述衍生物的药物组合物。

背景技术

富勒烯作为生物学活性化合物的应用促进了富勒烯官能化衍生物化学的密集发展，特别是在发现一些水溶性富勒烯具有高的抗病毒活性之后(参见Partha,R.和Conyers,J.L.，“Biomedical Applications of Functionalized Fullerene-BasedNanomaterials”，Int.J.Nanomedicine,2009(4),261-75；专利US6204391，2005,“WaterSoluble Fullerenes with Antiviral Activity”；R.Bakry等人，“MedicinalApplication of Fullerenes”，International Journal of Nanomedicine，2007(4),639-649；以及Z.Zhu、D.I.Schuster和M.Tuckermann，“Molecular Dynamics Study of theConnection between Flap Closing and Binding of Fullerene-Based Inhibitors ofthe HIV-1 Protease”，Biochemistry，2003,vol.42,1326-1333)。

富勒烯衍生物的医药用途基于使得富勒烯衍生物能够渗透细胞膜的富勒烯核心的亲脂性能，以及富勒烯以高量子产率生成使DNA裂解的单线态氧的能力。这些性能赋予官能化的富勒烯衍生物以细胞毒性、抗病毒性能以及其它性能(参见Bedrov,D.、Smith,G.D.、Davande,H.，“Passive transport of fullerenes through a lipid membrane,”J.Phys.Chem.,B,2008,Vol.l 12.,pp.2078-84；Qiao,R.和Roberts A.E.，“Translocationof Fullerene and Its Derivatives across a Lipid Bilayer”，Nano Lett.，2007,Vol.7,pp.614-9；Nelsen,G.D.等人，“In vivo Biology和Toxicology of Fullerenes和Their Derivatives”，Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology，2008,Vol.103,pp.197-208)。

水合富勒烯类化合物具有作为生物抗氧化剂的高的生物活性，是由于形成了与富勒烯球配位的水分子簇(水分子簇)的活性结构物质(参见Andrievsky,G.V.、Brushkov,V.L、Tykhonov,A.A.和Gudkov S.V.，“Peculiarities of the Antioxidant andRadioprotective Effects of Hydrated C₆₀Fullerene Nanostructures in vitro andin vivo”，Free Radical Biology and Medicine，2009,vol.47,pp.786-793)。

阻碍对富勒烯及其衍生物的生物学研究和基于这些研究创造药物的主要问题在于难以将富勒烯系统溶解在水溶液中。

制备水溶性富勒烯组合物的一个有前景的方法是通过结合亲水性增溶配位体对富勒烯球进行化学修饰。

现在，已经制备了各种各样的官能化富勒烯，其中亲水性部分存在于与富勒烯连接的配体的侧链中(洗涤剂类型的复合物)，以及其中极性基团分布在整个富勒烯球上的球状衍生物(这一类型包括富勒醇和氨基加合物)。

富勒烯的氨基酸衍生物具有最大的应用潜力。

包含六个或更多个亚甲基基团的脂肪族原料的非天然氨基酸在水合作用和生化活性方面具有一些特定的特征。氨基酸水溶液中的水结构的光谱研究表明，将氨基与羧基间隔开的亚甲基基团数目的增加增强水分子簇的破坏。对广泛系列的R-(CH)_nCOOH氨基酸的衍生物进行的药理学研究表明，其中n等于或大于六的系统具有较高的活性。

在俄罗斯联邦专利2196602、2124022和2236852中描述了通过氨基酸的氨基对富勒烯球的亲核加成反应制备的富勒烯C₆₀的球状氨基酸衍生物，所述专利可以作为与本发明最相关的现有技术。

在俄罗斯联邦专利2196602中，要求保护一种通过基于氨基酸和二肽富勒烯衍生物的化合物来抑制HIV和CMV感染的复制的方法。在所述专利中使用的氨基酸富勒烯衍生物是富勒烯氨基己酸和富勒烯氨基丁酸的钠盐。

在俄罗斯联邦专利2124022中，为了制备富勒烯氨基己酸，将氨基己酸钾盐和18-冠-6的水溶液加入到富勒烯在邻二氯苯中的溶液中。将反应物质在60℃搅拌6到8小时。然后，将溶剂蒸馏出去，并将残余物用饱和氯化钾溶液处理，然后用水洗涤富勒烯衍生物残余物。以定量的收率获得目标产物。得到的(一氢)N-富勒烯氨基己酸可以溶解于二甲亚砜、二甲基甲酰胺和吡啶。在该专利中所要求保护的合成方法中没有限定分离最终产物的条件。

如上所述制备的化合物(都是单加成产物)的主要缺点在于其水不溶性。上述发明的另一个缺点在于在合成中使用的相转移催化剂是冠醚，难以将其与反应产物分离。

俄罗斯联邦专利2236852保护用于抑制包膜病毒复制的药物，所述药物是以下通式的富勒烯多羧酸阴离子：C₆₀H_n[NH(CH₂)_mC(O)O^-]_n，其是通过是富勒烯与氨基酸盐在多(氧化烯)的存在下在有机溶剂介质中反应制备的。

为了制备那些化合物，向富勒烯在邻二氯苯(或甲苯或另一种有机溶剂)中的溶液加入作为盐(钾盐或钠盐)形式的氨基酸，然后加入增溶剂。氨基酸和增溶剂的添加顺序并不重要，可以将它们作为预混的复合物加入。有用的增溶剂是各种聚(氧化烯)(摩尔重量为150到400或比400更高的聚乙二醇(例如，PEG-1500)、以及具有游离末端基团的聚乙二醇，以及具有被取代的末端基团的那些(例如摩尔重量为500的聚乙二醇二甲酯)。为了提高反应速率，加入任何强的还原剂(碱金属)。富勒烯:氨基酸的比例被增加超过50倍。得到期望的可药用盐的转化，尤其是钠盐或钾盐，是通过用适当的碱处理所述酸进行的，或者通过添加适合的碱或添加挥发性弱酸的盐来进行。具体地，不溶于水的富勒烯-多羧酸被转化为更优选的可药用的水溶性盐，例如钠盐。添加挥发性弱酸的盐是通过用挥发性弱酸的碱金属盐来处理所述溶液进行的。通过蒸发或冷冻干燥将溶液浓缩，弱酸被除去且混合的富勒烯-多羧酸作为它们的碱金属盐的混合物形式被回收。该发明的目标产物具有恒定的组成，目标产物中的主要物质的含量低至87.8%。

通过所引用的专利中所示的方法制备的富勒烯氨基酸衍生物的主要缺点在于产生以盐和酸两种形式存在的富勒烯-羧酸根阴离子的混合物。通过所引用的专利所述的方法不能制备得到单独的化合物。另外，通过该现有技术制备的作为酸形式的富勒烯多(氨基酸)是几乎不溶于水的。使用多羧酸阴离子制备稳定药物组合物的尝试失败了，是因为化合物在储存期间发生沉淀。富勒烯多(氨基酸)影响白细胞生成：它们引起实验动物(大鼠和兔)中白细胞结构的改变并诱导嗜中性白细胞的幼年形式(嗜中性晚幼粒细胞)的出现。在安全性(无害性)方面，这表明这些物质具有引起上述改变的毒性。在合成过程中对使用大过量的氨基酸钾盐或钠盐以及大过量的溶剂的需要引起废物循环的环境问题，并且提高了生产过程的成本。由于工艺学的原因，在使用氯化的芳族溶剂时，不能使用碱金属来增加反应速率。

发明内容

本申请要求保护的技术方案所要解决的技术问题在于：生产带有氨基酸的个体的水合富勒烯C₆₀化合物，其具有对抗疱疹病毒、丙型肝炎病毒、多种流感病毒和HIV的抗病毒活性，并具有抗肿瘤以及抗牛皮癣活性，且不会对身体产生毒性作用；制备这些化合物的方法；以及包括这些化合物的药物组合物。

为了解决这一问题，我们提出了一组彼此关联以构成一个发明构思的发明，即：化合物、制备该化合物的方法和包含该化合物的药物组合物。

通式(II)的带有氨基羧酸的富勒烯C₆₀的个体水合化合物解决了这一问题，其中每个富勒烯分子带有三个共价结合的氨基酸部分，这些部分在其结构中包括活性水合作用位置(从而导致形成水溶性的水合物)和长的烃链，由此可以将水分子保持在富勒烯复合物的内部配位球中。

C₆₀(H)₃{NH(CH₂)_nCOO-}₃xH@2O,(II)

其中C₆₀是富勒烯；n=5、6或7；以及х=8～10。

所述问题是通过如下方式解决的：如下形成式（II）的水合氨基酸富勒烯衍生物：使富勒烯与15倍摩尔过量的氨基酸的无水钾盐在芳香族溶剂介质中反应，包括在搅拌并加热到不高于60～80℃的温度下向得到的悬浮液中缓慢添加相转移催化剂，直到溶液完全脱色并形成固体残余物，然后将该残余物分离并用有机酸或无机酸的0.1N溶液处理所述富勒烯氨基酸的钾盐的0.8M水溶液，然后离心、洗涤并干燥所述残余物。

另外，根据本发明，所述无水氨基酸钾盐是以细分散状态使用的，以增强所述工艺的反应性及其效率和收益性，并且富勒烯氨基酸的钾盐的固体残余物的分离是通过过滤、乙醇洗涤和干燥进行的。有用的相转移催化剂是分子量为200、400或500的聚(氧化乙烯)的甲基酯，它们是最容易得到和最安全的催化剂。

还通过创造其中活性剂是式(II)的水溶性水合富勒烯氨基酸的药物组合物解决了所述问题，所述水溶性水合富勒烯氨基酸具有对抗疱疹病毒、丙型肝炎病毒、多种流感病毒和HIV的抗病毒活性，且具有抗肿瘤和抗牛皮癣活性。

根据本申请要求保护的药物组合物包含有效获得期望结果的量的通式(II)的化合物，并可以作为标准剂型给药(例如，作为固体剂型、半固体剂型或液体剂型)，其包括与适合于通过肌内、静脉内、经口、舌下吸入、局部、经鼻、经直肠或经阴道的途径给药的载体或赋形剂一起配制的作为活性剂的所要求保护的技术方案的化合物。可以在组合物中将所述的活性剂与适合于制造溶液、片剂、丸剂、胶囊、小珠、栓剂、乳剂、悬浮液、软膏、凝胶剂和其它剂型的常规无毒的可药用载体一起配制。

对于特定患者的具体给药水平和周期取决于许多因素，包括特定的富勒烯衍生物的活性、其代谢稳定性和作用时长；排泄率；患者的年龄、体重、一般健康状况和性别；药物联合；以及所要治疗的受试者的疾病的严重程度。

对于以悬浮液形式的经口给药，根据制备药物制剂的领域中的公知方法制备组合物，且它们可以包含用于提供期望重量的微晶纤维素或其衍生物、作为助悬剂的海藻酸或海藻酸钠、作为粘度增强剂的甲基纤维素和本领域中已知的甜味剂和/或香料。在制造片剂时，这些组合物可以包含微晶纤维素、磷酸钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或其它赋形剂、以及本领域中已知的粘合剂、增充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。

在意欲通过经鼻气雾剂或通过吸入给药时，通过药物制剂领域中公知的方法制备组合物，且可以使用苯甲酸或其它适合的防腐剂、用于增强生物适用性的吸附促进剂和/或本领域中已知的增溶剂或分散剂将组合物制备为在生理盐水中的溶液。

可以根据已知的方法形成用于注射的溶液或悬浮液，使用无毒的、适合非肠道给药的稀释剂或溶剂，例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液；或适合的分散剂或润湿剂和助悬剂，例如无菌的、柔和的和稳定的油类，包括合成的单-或二-甘油酯或包括油酸在内的脂肪酸。

在意欲以栓剂形式通过经直肠给药时，可以通过将药物与在常温下为固体但是在体腔内液化和/或溶解以释放药物的非刺激性赋形剂混合来制备组合物，所述的非刺激性赋形剂例如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇。

在以软膏、凝胶剂、乳剂、搽剂等形式局部给药时，可以通过将活性成分与可接受的软膏基质混合来制备组合物。

有用的软膏基质是油脂、石油或亲水性基质，例如矿脂、矿物油、石蜡、蜂蜡、羊毛脂、聚乙二醇等等。

有用的用于凝胶剂的基质是甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐、羟丙基(oxypropyl)纤维素、聚乙二醇或聚氧化乙烯、聚羧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等等。

本发明涉及化合物、制备这些化合物的方法及其与极性试剂的可药用结合物。所述化合物不影响白细胞生成：它们既不引起实验动物(大鼠和兔)中白细胞结构的改变也不诱导嗜中性白细胞的幼年形式(嗜中性晚幼粒细胞)的出现。在安全性(无害性)方面，这表明这些物质没有引起上述改变的毒性。根据试剂比例和工艺参数，所要求保护的方法制备不同的包括富勒烯氨基酸的组合物，即，通式(II)的水溶性水合富勒烯氨基酸。

所述方法在合成步骤中使用了最佳的试剂比例和最小量的有机溶剂和相转移催化剂，随后用有机酸和无机酸的浓缩溶液回收所要求保护的化合物，从而提供具有定制的富勒烯氨基酸组成的定量生产，并使得所要求保护的方法适合于这些组合物的有效率的和环境安全的大规模合成。

所要求保护的技术方案的技术结果在于制备不会对身体引起毒性作用的稳定的带有氨基羧酸的个体水溶性水合富勒烯C₆₀化合物。已经开发了一种有效率的方法来制备具有抗病毒、抗肿瘤和抗牛皮癣活性的稳定的个体水合富勒烯衍生物。

下面将通过实施例来举例说明本申请要求保护的发明。

本发明的不同实施方案

实施例1.式N-C₆₀(H₃){NH(CH₂)₅COOH}₃10H₂O的N-富勒烯三(ε-氨基己酸)水合物(根据IUPAC命名规则：N-富勒烯三(6-氨基己酸)水合物)的制备。

向60g(0.08mol)富勒烯C₆₀在4.5L邻二氯苯中的溶液加入204g(1.2mol)的细粉碎的ε-氨基己酸的无水钾盐。在搅拌并加热到不高于60℃的温度下向得到的悬浮液中加入邻二氯苯和甲基聚乙二醇500醚的比例为5:1的混合物2小时。将反应混合物在不高于60℃的温度搅拌5小时，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物。在这之后，将混合物过滤；在过滤器上将沉淀物用乙醇分几次进行洗涤并在不高于60℃的温度真空干燥。将分离的富勒烯氨基己酸钾盐的混合物溶解于100mL蒸馏水中。在搅拌下向这个溶液中缓慢加入0.1N盐酸，直到pH变为5.1。让混合物静置，直到产物完全沉淀出来。然后将水层倾析掉。将作为该固态产物在水中的细悬浮液的残余物离心并用水洗涤到pH为6。将残余物在真空干燥器内在不高于60℃的温度干燥。

以定量的收率(115g)获得产物。

该化合物是暗褐色固体，可溶于水以及CН_зСN:Н₂O(1:10)和DMF-H₂O(1:100)中。

热重分析表明，该化合物包含10摩尔的H₂O。在350℃，发生复合物的剧烈破坏。分解残余物包含富勒烯及其氧化产物。

产物(I)的红外吸收光谱特征在于N-取代氨基酸的特征性吸收谱带：-COOH-基团，在1704cm^-1和1658cm^-1；N-H-伸缩振动，在3400cm^-1；N-H弯曲振动，在1552cm^-1；以及C₆₀-NH-R-，吸收谱带出现在1104cm^-1、930cm^-1,和830cm^-1。

在产物的电子吸收光谱中没有显示来自游离富勒烯的吸收谱带。

元素分析显示了以下的元素比例：%С=72.75；%Н=4.70；%N=2.32；对于分子式C₇₈H₃₉O₆N₃10H₂O计算值：%С=72.38、%Н=4.3、%N=3.24。

产物中羧基的数目来源于与金属盐和胺的反应。在与硝酸银的反应中，定量分离了组成为C₆₀(H)₃{NH(CH₂)₅COOAg}₃10H₂O的复合物：(实测值：%Ag=20.88、%С=57.80、%N=2.51、%H=3.32；对于C₇₈H₃₆O₆N₃Ag₃(10H₂O)，计算值：%Ag=20.00、%С=57.88、%N=2.60、%H=3.46)。

与三羟甲基氨基甲烷（trisamine）反应得到组成为C₆₀(H)₃{NH(CH₂)_nCOO^-NH₃ ⁺C(CH₂OH)₃}₃的水溶性复合物(实测值：%С=64.88、%Н=4.56、%N=5.08；对于C₉₀H₇₂O₁₅N₆10H₂O，计算值：%С=65.2、%Н=4.34、%N=5.10)。

实施例2.式N-C₆₀(H₃){NH(CH₂)₆COOH}₃8H₂O的N-富勒烯三(ω-氨基庚酸)水合物(根据IUPAC命名规则：N-富勒烯(三-7-氨基庚酸)水合物)的制备。

向72g(0.1mol)富勒烯C₆₀在4L邻二氯苯中的溶液加入182g(1.2mol)的细粉碎的ω-氨基庚酸的无水钾盐。在搅拌并加热到不高于80℃的温度下向得到的悬浮液中加入邻二氯苯和甲基聚乙二醇500醚的比例为5:1的混合物3小时。将反应混合物在不高于80℃的温度搅拌8小时，直到溶液完全脱色并形成固体沉淀物。在这之后，将混合物过滤。在过滤器上将沉淀物用乙醇分几次进行洗涤并在不高于60℃的温度真空干燥。将分离的富勒烯氨基庚酸钾盐和氨基庚酸的混合物溶解于120mL蒸馏水中。在搅拌下向这个溶液中缓慢加入0.1N盐酸，直到pH变为5.1。让混合物静置，直到产物完全沉淀出来。然后将水层倾析掉。将作为固态产物在水中的细悬浮液的残余物离心并用水洗涤到pH为6。将残余物在真空干燥器内在不高于60℃的温度干燥。

以定量的收率(130g)获得产物。

该化合物是暗褐色固体，可溶于水并可溶于CН_зСN:Н₂O(1:10)和DMF-H₂O(1:100)中。

热重分析表明，该化合物包含8摩尔的H₂O。复合物在450℃经历剧烈的破坏。分解残余物包含富勒烯及其氧化产物。

产物的红外吸收光谱特征在于N-取代氨基酸的特征性吸收谱带：-COOH-基团，在1707cm^-1和1650cm^-1；N-H伸缩振动，在3400cm^-1；N-H弯曲振动，在1552cm^-1；以及C₆₀-NH-R-，吸收谱带出现在1104cm^-1、930cm^-1和830cm^-1。

电子吸收光谱特征在于在260nm的吸收谱带。

元素分析显示了以下的元素比例：%С=72.75；%Н=4.70；%N=2.32；对于分子式：%С=73.55；%Н=4.60；%N=3.18；对于分子式C₈₁H₄₅O₆N₃(8H₂O)，计算值：%С=74.82、%H=4.69、%N=3.23。

与硝酸银的反应获得富勒烯氨基酸的银盐，其定量证明产物中存在有三个氨基酸部分。

实施例3.式N-C₆₀(H₃){NH(CH₂)₇COOH}₃10H₂O的N-富勒烯三(8-氨基辛酸水合物)的制备。

根据实施例1中所述的规程，不同之处仅在于使用氨基辛酸的钾盐代替细分散的ε-氨基己酸(ω-氨基庚酸)的无水钾盐。得到的化合物的分析证明了复合物的上述组成。

研究了这些化合物针对HIV、HSV和流感病毒的抗病毒活性，还研究它们的抗肿瘤活性。所述化合物具有高的抗肿瘤活性和针对所有上述病毒的抗病毒活性。本发明的优选实施例如下所述。在以下实施例中，通过实施例1所述方法制备的化合物在下文中被称为药物1(富勒烯三(氨基己酸)水合物)。

实施例4.富勒烯三(氨基己酸)的抗HIV活性

这些研究是在莫斯科的俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所进行的。任务是研究所述药物的抗HIV活性。

为细胞添加试验药物并以0.01TCD₅₀/细胞的病毒剂量进行感染。将细胞培养物在37℃在5%CO₂气氛和98%湿度下保温4到5天。通过用染料将细胞染色和光学显微术来确定试验结果：病毒的细胞致病作用(CPE)和病毒诱导的合胞体形成(合胞体是具有通过膜融合形成的完全密封的细胞膜的若干细胞的集聚体)的研究。

根据对应于一个试验参数的四个孔中每一孔中死亡细胞的数目，根据普遍接受的四加号系统在显微镜下使用符号”+”和”-”来评价细胞破坏的程度。

++++表示在单次稀释试验中四个孔中的细胞100%死亡；

+++表示四个孔中的细胞75%死亡；

++表示四个孔中每一孔中的细胞50%死亡；

+表示四个孔中每一孔中的细胞25%死亡；

+-表示变性开始；以及

-表示没有出现细胞破坏。

这些研究的结果显示在表1和2中。

这些结果（参见表1和2）表明，药物1在1～10mcg/mL的浓度具有针对1型人类免疫缺陷病毒的抗病毒活性。所述药物的EC₅₀(50%有效浓度)是5.0mcg/mL。

实施例5.富勒烯三(氨基己酸)针对流感病毒的抗病毒活性。

这些研究是在莫斯科的俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所进行的。任务是研究所述药物在MDCK细胞培养物中针对A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1流感病毒的抗病毒活性。

将药物用DMSO稀释(5mg物质+0.5mL DMSO)，随后加入4.5mL MEM细胞培养基以获得浓度为1.0mg/mL的储备溶液。随后，将储备溶液用MEM培养基稀释，以获得以下系列的工作浓度：6.5mcg/mL-12.5-25.0-50.0-100mcg/mL。

根据ELISA识别的在MDCK细胞培养物中的流感病毒复制的减少确定抗病毒活性。

为此，使MDCK细胞在96孔板上生长，以获得完整的单层，用生长培养基洗涤，并加入在100mcL MEM培养基中的两倍浓度的物质。根据两个规程进行用100～1000TCD₅₀的工作剂量的病毒进行感染：在注射物质后的2小时进行和同时进行。将板在充满CO₂的恒温箱中在37℃保温24小时。在培养之后，除去培养基并用含80%丙酮的PBS固定细胞15分钟，然后充分干燥，并通过特异性试剂(即，单克隆抗体、缀合物和底物(邻苯二胺))的连续吸附进行ELISA。通过用Biokom分光光度计在492nM测量光密度来监控反应程度。每个病毒稀释度一式三份进行研究，计算其平均光密度(OD)值。测定百分比抑制，其为实验OD和细胞对照的OD之差除以病毒对照的OD与细胞对照的OD之差的商乘以100%。使用如此获得的数据来测定引起50.0%病毒复制抑制的最小药物浓度(MIC₅₀)。

在使用不同感染复数的三个实验中确定对A(H1N1)流感病毒复制的抑制。结果显示在表3(三个实验的规程)和表4(三个实验的平均结果)中。

从表4可见，药物1的系列在MDCK细胞培养物中流感病毒复制的减少方面表现出最高的活性。在复制程度与药物浓度之间有明确的相关性：随着浓度增加，病毒复制减少。另外，无论感染规程如何(在注射药物后2小时进行或同时进行)，在数值之间没有显著的差异。引起病毒的复制50.0%抑制的药物的最小浓度(MIC₅₀)在其中在感染前2小时注射药物的规程中是9.5mcg/mL，而在同时注射的规程中为12.5mcg/mL。计算是通过图形数据处理进行的。

因此，得自不同系列的药物1针对A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1流感病毒的活性数值证明了在系列1中MDCK细胞培养物中具有高的复制抑制活性，而在系列2中为中等活性。药物给药规程(在感染前2小时进行或与感染同时进行)不影响药物在MDCK细胞培养物中的活性。

实施例6.富勒烯三(氨基己酸)对小鼠的诱发的流感肺炎的抗病毒活性研究。

这些研究是在莫斯科的药物化学中心(TsKhLS-VNIKhFI)进行的。

用于研究的药物1是暗褐色粉末。通过将经过称重的药物部分溶解在1%的用水煮过的淀粉溶液中来制备用于经口给药的药物剂量。对于腹膜内或肌内给药，将经过称重部分的药物1溶解于1.5%二甲亚砜溶液中。

使用的病毒是经过小鼠适应的A/Aichi/2/69(H3N2)流感病毒。这种病毒广泛用于测定抗病毒药对小鼠的诱发的流感肺炎的效能，购自俄罗斯医学科学院Ivanovsky病毒学研究所的病毒株和细胞培养物保藏中心。为了制备感染材料，给小鼠鼻内感染尿囊病毒。一旦发展出疾病的症状，将小鼠处死并在无菌条件下制备肺组织匀浆。然后，用这个匀浆感染10天龄的小鸡胚胎，由所述小鸡胚胎获得尿囊病毒，并在小鼠中进行滴定之后，用于感染动物。

体重为12～14g的白色非纯种(雌性)小鼠购自Andreevka动物养殖场(莫斯科oblast)并在经过调节的动物饲养条件下以标准配给维持。

在轻度乙醚麻醉下用A/Aichi/2/69(H3N2)流感病毒(在100mcL中的10LD₅₀)鼻内感染经过称重的小鼠(平均体重为12～14g的非谱系(nonlinear)雌性小鼠)。通过如主要实验那样在小鼠中滴定尿囊病毒的初步试验中测定LD₅₀。试验药物的治疗方案如下：感染前的24小时，感染前的1小时，感染后的24小时，然后一日一次，24小时，连续5天。对于经口给药，使用带有专用针头(洗胃)的胰岛素注射器；每个剂量都是以100mcL的量给药。对于腹膜内和肌内给药，每个剂量也是以100mcL的量进行注射给药。病毒对照组由用病毒感染单没有用药物处理的10只小鼠组成。在实验中，还有两个组每组10只未经感染的小鼠，每只小鼠接受经腹膜内和经肌肉内给药的100mcL的用作药物溶剂的1.5%MSO。其它组也都各自最初由10只动物组成。每天监控经过处理的动物和对照动物；在感染后的前五天，每天为小鼠进行称重，然后每隔一天进行。通过以下的三个标准确定药物1在诱发的流感肺炎中的化疗活性，即：与对照组相比，免于致死性病毒感染的指数、平均寿命的延长以及药物治疗组动物的体重损失的减少。

与病毒对照相比，用药物1的治疗有效降低小鼠的流感肺炎死亡率和减少体重损失并延长平均寿命。这种治疗的功效取决于药物的剂量和治疗方案。使用富勒烯三(氨基己酸)水合物的经口治疗效率随药物剂量的增加而提高。用药物1进行经口治疗是有效的，使平均寿命延长1.6到1.7倍。用富勒烯三(氨基己酸)进行的肌内给药治疗在所有三个参数(保护免于死亡的指数、平均寿命和体重损失)方面都是最有效的；在以100和200mg/kg/天的剂量给药时，这种治疗防止了70%到80%的受感染动物死亡和它们的体重损失，并且还延长它们的寿命将近两倍。

用富勒烯三(氨基己酸)进行的腹膜内给药治疗只在50和100mg/kg/天的剂量是有效的。由200mg/kg/天剂量的药物1进行的腹膜内给药治疗引起的小鼠死亡率、平均寿命的显著缩短和体重的显著降低，提示采用这种治疗方法这一剂量对于受感染的小鼠而言是毒性的。结果显示在表5和6中。

实施例7.富勒烯三(氨基己酸)在由多种来源的病毒引起的小鼠的实验性致命流感感染的保护活性研究。

这些研究是在圣彼得堡毒理学研究所进行的。

用于研究的药物1是黑色细碎粉末。将经过称重的药物样品溶解于Igla MEM细胞培养基(BioloT,圣彼得堡,cat.20 No.1.3.3)中。得到的溶液用于在MEM培养基中制备系列稀释度，以确定样品在动物试验中的抗病毒活性。

使用的参照药物是Remantadine(1-(1-金刚烷基)-氨基乙基盐酸盐，AldrichChem.Co.,25 Milw.,WI,cat.No.39.059-3)和达菲((3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯磷酸盐，Hoffmann LaRoche,瑞士)。

病毒：在研究中使用的病毒是以下株的经过小鼠适应的流感病毒：

-A/Swine/1976/31(H1N1)(猪源的)；

-A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(人源的且Remantadine耐药性的)；以及

-A/Vladivostok/2/09(H1N1)(人源的且达菲耐药性的)。

将病毒在10到12天龄的小鸡胚胎的尿囊腔中在36℃传代48小时。通过在动物中和在小鸡胚胎中的三次交替传代使A/Vladivostok/2/09(H1N1)株预先适应小鼠。

使用小鸡胚胎的包含病毒的尿囊液来感染动物。将其用于制备在生理盐水中的系列10倍稀释度，之后在单独的实验中通过滴定动物致死率测定感染材料中的病毒的感染力。通过Reed-Muench法计算病毒滴度(参见Am.J.Hyg.，1938,27:493-497)。

体重为14～16g的白色非纯种(雌性)小鼠购自Rappolovo动物养殖场(Leningradoblast)并在俄罗斯医学科学院流感研究所，在经过调节的动物饲养条件下以标准配给维持。通过随机取样进行实验组动物的选择。在试验前，观察动物2周。

经腹膜内对动物给予0.2mL量的以下剂量试验药物：药物1为300、100和30mg/kg，Remantadine为50mg/kg，达菲为20mg/kg动物体重。如下以治疗-预防性方案关于药物：在感染前24小时和1小时和感染后24、48、72小时。为安慰剂对照组注射盐水磷酸盐缓冲液。阴性对照是保持在与实验组相同条件下的原样的动物。

在轻度乙醚麻醉下以1和10 LD₅₀剂量对动物鼻内给予病毒。每个观察组为25只小鼠。在感染后的第5天，将每组的10只动物无痛处死并尸检，将肺分离。在10个肺中，五个用于分离病毒（将它们冻结并存储在-20℃，直到进行相应的实验)；另外的五个用甲醛固定，然后用于组织分析(参见以下)。

其它动物监控14天，在该时间段中检测诱导的流感引起的动物死亡率。每天记录对照组和实验组中的动物死亡率。用如此获得的死亡率计算百分死亡率(M：在14天中死亡的动物占该组占倍感染动物总数的比例)、保护指数(IP：对照组和实验组的百分死亡率与对照组百分死亡率的比值)和在14天观察过程中动物的平均寿命(DL)。

对在感染之后的第15天存活的动物进行尸检，并视觉评价肺中流感后肺炎损害的面积。损害大小表示为占肺的总表面积的百分比。

典型的流感感染，包括呼吸急促、共济失调、震颤、食物和水摄入量减少和由其引起的体重减轻。

对照组和实验组占动物的死亡率动态数据概括在表7－9中。

从这些结果可见，流感病毒的白色小鼠中引起致命性感染，从感染之后的3-4天动物开始死亡，取决于病毒剂量。动物的寿命与病毒剂量反向相关。在实验中作为参照药物Remantadine具有非常有限的针对这种感染的保护作用，表现为实验组比对照组的死亡率有一定的降低(保护指数是13～29%)和寿命的非显著性延长(取决于病毒剂量，延长1.1～1.6天)。因此，这些数据与较早的体外和体内实验的结果相符，证明了使用的病毒株对Remantadine不敏感。在这种情况中观察到的有限保护作用可以解释为源于该药物的解毒作用。

同时达菲(参照药物)表现出明确的保护作用，接受治疗的小鼠组的死亡率减少(与对照组相比，大约70%)，图示动物的平均寿命延长(2到6天)。因此，使用的病毒对Remantadine是抗药的，但是对达菲敏感。

在数据分析中发现，药物的试验样品在其保护性能方面接近参照药物达菲(表7)。

使用由另外两个流感病毒株引起的诱导的流感肺炎证实了这些结果。这些实验的数据概括在表8和9中。

从这些数据可以看出，化疗药物对所使用的病毒的活性是显著不同的。例如，针对病因的药物达菲对于A/Vladivostok/2/09流感病毒株无活性。由此在动物试验中确认了较早获得的数据，即，这种分离株对达菲耐受。同时，试验药物针对这一病毒株的活性非常高，这无疑可以看作是该药物的一个优点。

试验药物的活性指数(保护指数，即寿命延长)是21-72%和0.8-4.4天，取决于所使用的病毒株、病毒的感染剂量和药物的剂量。

为了研究药物1对受感染的动物的肺组织中的流感病毒复制活性的影响，在感染后的第3天从动物的肺制备组织匀浆，然后用于测定病毒在细胞培养物中的感染滴度。模型流感病毒在动物身体中的复制水平数值显示在表10中。

从这些结果可以推测，所使用的全部三种病毒都能够在小鼠肺中有效地复制，在第3天达到3.4-6.4log₁₀EID₅₀/20mg的滴度，取决于所述使用的病毒株和病毒的感染剂量。所使用的化疗药物，即试验药物和参照药物，以不同程度限制病毒的增殖。例如，Remantadine不显著地(以2-3个数量级)降低A/Swine/1976/31和A/Vladivostok/2/09敏感病毒的感染性，但是对Remantadine-耐受株A/Puerto Rico/8/34没有表现出可靠的抑制活性。达菲对于A/Swine/1976/31和A/Puerto Rico/8/34病毒是有活性的。同时，在模型耐受株A/Vladivostok/2/09中试验了达菲，发现感染性病毒滴度有些降低；然而，与对照的差异不显著。

试验的药物表现出对所研究的所有病毒都具有显著的抑制活性。该活性水平没有超过参照药物(Remantadine和达菲)的活性，而是与之相当。对于对耐受化疗药物的病毒的活性，试验药物具有比达菲高得多的针对奥塞米韦耐药株A/Vladivostok/2/09的活性和比Remantadine更高的针对Remantadine耐受株A/PR/8/34的活性。

在使用300mg/kg剂量的药物1的治疗-预防性给药研究实验性流感感染的形态发生特征时，需要指出的是接受药物的动物的肺中的感染过程的形态发生与对照动物的肺中的形态学变化有很大不同。在感染后第3天的主要区别在于炎性渗出物的性质，即，在相同的强度时，几乎没有观察到处于破坏阶段的细胞，这些是流感肺炎急性期所特有的。渗出液的细胞成分仅由完整的嗜中性白细胞、淋巴细胞和巨噬细胞组成。另外，渗出液的血浆组分和出血性组分也较不显著。支气管上皮细胞似乎是比对照动物中更完整。炎症位置本身的面积比对照动物中更小。

在流感后肺炎中观察到同样的趋势。肺中的损害位置在大小上相当有限形态学研究表明中度的上皮化生和完整嗜中性白细胞和圆形细胞成分的间质渗透。需要提及的是，在动物感染所研究的三种病毒中的任一种时都观察到药物的作用，无论这些病毒对参照药物是敏感的还是耐受的。

药物1的保护作用的另一个标准是动物中慢性肺损害位点的大小。这一试验的结果示出在表11中。

从该结果可见，所有的三种病毒都诱导肺中持久的慢性损害的形成，所述的慢性损害是在感染之后的第15天从存活动物视觉检测到的。参照药物(Remantadine和达菲)可靠地降低由对这些药物敏感的病毒引起的流感后肺炎损害的程度，但是对耐受株无活性。同时，药物1可靠地降低这一数值，无论所使用的病毒如何。

因此，在浓度研究(300到30mg/kg)中，药物1在所使用的模型中具有剂量依赖性的保护活性。这一活性表现在以下的数值：

-受感染动物的肺组织中感染性病毒滴度的6到200倍的减少；

-受感染动物寿命的延长(0.1～4.4天，取决于病毒株、病毒剂量、合成批次和药物剂量)；

-实验组的特定死亡率降低7～72%，取决于病毒株、病毒剂量、合成批次和药剂剂量；以及

-慢性的流感后肺炎损害的平均程度的2～4倍的降低。

在这些数值的组合中，一些剂量的药物1的保护活性与参照药物Remantadine的活性相当。

这些数据表明，药物1具有高的抗流感活性，特别是针对猪源的病毒株，以及针对在临床实践中使用的Remantadine和达菲抗流感药耐受的病毒。

实施例8.富勒烯三(氨基己酸)对白色小鼠中的诱导的实体和艾氏（Ehrlich）腹水癌的抗肿瘤活性研究。

这些研究的任务如下：

-研究药物1对腹膜内给予的癌细胞的腹水肿瘤生长动态的影响；

-研究药物1对实体瘤生长动态的研究和研究药物对实体艾氏腹水癌的形态学和形态测量特征的影响；以及

-研究药物1对欧利希氏腹水癌细胞的细胞凋亡活性的影响。

在研究中使用两个剂量的药物1水溶液：浓度为30和10mg/kg。在接种前24小时为动物各自皮下注射0.2mL的各浓度溶液，然后在整个试验过程中每天注射。药物的最终浓度是300和100mg/kg体重。

使用的参照药物是顺铂(用于治疗人的癌的抗肿瘤药)。由于其高的毒性，顺铂在肿瘤植入后的第二天一次性给予。最终的顺铂浓度是5mg/kg体重。

对平均体重为20±3g的非纯种白色小鼠(购自Rappolovo动物农场，Leningradoblast)进行实验。

艾氏腹水癌细胞购自肿瘤学研究所的细胞系保藏中心，并在白色小鼠的腹膜腔中进行培养。为此，经腹膜内对动物给予0.2mL细胞悬液。在接种后的7到10天，将动物处死；通过腹部穿刺回收腹水液，用盐水稀释10倍，并置于冰上。

为了诱导实体艾氏腹水癌，在收集腹水置于冰上后的40分钟内为每只动物在右侧臀部区域皮下注射0.2mL细胞悬液。在实验过程中，从接种后的第8天开始在28天过程中每周两次用千分尺测量肿瘤结节。通过用结节长度的一半乘以宽度的平方计算肿瘤大小并以立方毫米为单位表示。为对照组和实验组中的动物死亡率评分。在移植后的第29天将动物无痛处死。

为了研究药物对腹水肿瘤的影响，在收集最初的腹水之后的至多40分钟内为动物经腹膜注射0.2ml的细胞悬液。在实验过程中监控小鼠的体重，作为腹膜腔中腹水累积的指示。观察动物持续16天。在移植后的第17天，将动物无痛处死。

对照组和实验组中的带有腹水癌的动物的肿瘤生长动态和死亡率列出在表12中。

从该结果可见，将肿瘤细胞接种到动物的腹膜腔中引起腹水在腹膜腔内的快速累积。治疗剂的应用具有显著的治疗效果并导致腹水累积的抑制。

用本申请要求保护的药物和参照药物(顺铂)治疗动物导致动物体重增加的动力学的显著减速。在所述方法的较后阶段，这些差异达到统计显著性。

药物对白色小鼠中的中等大小和颗粒度的艾氏腹水癌细胞的细胞凋亡过程的影响示出在表13和14中。

从该结果可见，对照动物中两个肿瘤亚群的肿瘤细胞中的仅小部分处于可逆的或不可逆的细胞凋亡阶段。应用顺铂引起免疫细胞中处于早期细胞凋亡阶段(表13)和肿瘤细胞中处于晚期细胞凋亡和坏死阶段(表14)的细胞部份的显著增加。

药物1以顺铂的水平起作用：作为参照药物，它促进免疫细胞的早期细胞凋亡和肿瘤细胞亚群的晚期细胞凋亡。药物几乎没有留下活的(AnV^-7AAD^-)肿瘤细胞。对于肿瘤细胞的坏死诱导水平，该药物甚至胜过顺铂(30.2%对顺铂的26.6%)。药物1的抗肿瘤作用机制，与顺铂一样，在于诱导构成腹水的肿瘤和免疫细胞的凋亡过程。与腹水中的嗜中性白细胞和淋巴细胞的细胞凋亡过程相比，该细胞凋亡过程有选择性地和可靠地更迅速地在肿瘤细胞中进行。

细胞荧光分析的结果提示，与也存在于腹水中的正常白细胞相比，参照药剂(顺铂)对肿瘤细胞具有选择性的作用。在药物给药后的相同时间，构成中等大小和颗粒度的部份的正常细胞(嗜中性白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和其它细胞)处于早期细胞凋亡阶段，而肿瘤细胞处于晚期(不可逆的)细胞凋亡或坏死阶段。

与对照组动物相比较的在该药物与顺铂的作用实体瘤的发展动力学的数据示出在表15中。

从该结果可见，所有使用的药物在全部实验中都表现出一定程度的对肿瘤生长的抑制。总的来说，顺铂具有最显著的抗肿瘤活性。在将其给药时，直到移植之后的第17天仍可靠地抑制肿瘤生长。

同时，两个系列的药物也都表现出剂量依赖性的抗肿瘤作用。直到实验的第8天仍观察到可靠的肿瘤大小减小对其生长的抑制。随后，还考查了药物在所有研究阶段的对肿瘤生长的作用，但是与对照的差异没有到达统计显著性。总体上，观察到100mg/kg体重剂量的药物1几乎在实验的所有阶段最接近顺铂。

该结果不允许我们将药物1看作是靶向治疗癌疾病的先导药物。然而，基于这些数据，我们可以将其看作是有前途的工具，用于进一步开发与其它抗肿瘤药一起使用的联合治疗剂，特别是用于腹水肿瘤。

药物剂型可以经口给药、非肠道给药(包括皮下注射，静脉内、肌内或臀部注射和输注)、通过吸入喷雾给药或经直肠给药，用于治疗或预防病毒感染例如HIV、疱疹和各种流感，以及用于联合治疗的抗肿瘤药。

将化合物与常规的药物载体和赋形剂混合并以片剂、胶囊、栓剂、软膏、乳剂、溶液剂或喷雾剂的形式使用。需要指出的是，为了制备溶液剂、喷雾剂和软的剂型(软膏、栓剂)，将化合物在DMSO和水的混合物中进行预先稀释。

使用可药用剂量的式(II)的化合物进行治疗同时影响不止一种病毒(在混合感染的情况中)并应对病毒复制的不同阶段。所述治疗表现出伴随以对药物给药的应激响应的减少、保护身体免受感染的抗氧化作用的增强和毒素的去除。中毒是许多病毒感染的特征并引起疾病加重。

式(II)的化合物可以与其它抗病毒药、免疫调节药、抗感染药或疫苗组合，以多种组合，使用拟用于治疗的任何药物制剂。

表1.在人类类淋巴母细胞模型中进行的要求保护的药物的细胞毒性

表2.药物1对HIV-1感染的人细胞模型的抗病毒活性

表3.药物1针对流感病毒A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1的活性数值

表4.药物1针对流感病毒A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1的活性数值，平均值

表10.在给予化疗药物的情况下流感病毒在白色小鼠的肺组织中的感染力

^*相对于对照为显著性差异，<0.05

表11.在给予化疗药物的情况下流感病毒在白色小鼠的肺组织中的感染力

^*相对于对照为显著性差异，p<0.05

表12.用治疗剂治疗的患有欧利希氏腹水癌的动物的体重动力学

^*在相应时间与没有使用药物的差异是显著的，p<0.05

表15.在研究中用治疗剂治疗的白色小鼠中的艾氏腹水癌实体瘤大小动力学

^*与没有使用药物的差异是显著的，p<0.05。

实施例9.在30天过程中经肌内给药富勒烯三(氨基己酸)水合物对大鼠的慢性毒性。

该实验在Serpukhov镇的生物战剂的毒理学和卫生学管理研究中心(俄罗斯的FGUN NITs TBP FMBA)进行的。

这些研究的任务是对富勒烯三(氨基己酸)水合物在30天的肌内给药过程中对大鼠身体的可能的破坏作用的水平和性质进行实验评估。

该实验对Wistar大鼠进行，Wistar大鼠购自GU NTsBT,俄罗斯医学科学院(Stolbovaya分部)的养殖场。动物的保管满足由USSR的公共卫生部,7月6日,1973批准的关于组织、设备和实验临床和生物学临床的维护(动物饲养)的卫生规定。根据USSR的公共卫生部,8月12日,1977的命令755号采用的标准对动物喂予天然的和压块的食物。将动物隔离并在动物饲养栏中适应环境5天。

由根据体重作为先导指标进行随机取样形成实验动物组。

试验的物质作为在20%二甲亚砜(DMSO)溶液中的不同浓度的溶液以3、9或20mg/kg的剂量在30天过程中每天经肌肉内对大鼠给药。对照组动物接受20%DMSO溶液。每天在即将使用前来制备物质和DMSO的工作溶液。要给药的剂量在考虑经过称重后的个体体重后进行校正。在20只动物(10只雄性和10只雌性)中进行每个剂量的试验。

为了评价富勒烯三(氨基己酸)水合物的毒性作用，在物质的给药时间段结束后的24小时，每组取出一半的动物进行血液学、生物化学和病理实验研究。另一半的实验动物在物质的停药时间段之后取出并进行类似的研究。

从物质的给药到停药后的14天期间，每天评价动物的一半状况和中毒的临床症状。根据动物的身体活动性、食物和水的摄取量、毛和可见粘膜的状况和体重来评价动物的一般状况。

使用Hema-screen 13(Hospitex Diagnostics,意大利)半自动双通道热导测量的细胞计数器和使用光学显微法进行血液学分析。

使用Stat Fax 3300半自动分析仪测定血清的生物化学数值。

使用Urisys 1100半自动分析仪测定尿素的生物化学数值。

通过在尸检时的视觉上检查和样品(用苏木精和曙红染色的4到5微米的石蜡段)的显微组织学检查测定动物内脏的形态学状况。

通过Student检验通过变量统计方法进行结果的统计处理。

1.研究的结果。

1.1.临床观察的结果。

在为期一个月的时间每天为大鼠经肌肉内注射3、9或20mg/kg剂量的富勒烯三(氨基己酸)水合物。在所有的剂量，没有观察到中毒的临床迹象；实验组和对照组的动物的一般状况彼此相同。在整个实验过程中实验组的大鼠的体重增加并没有显著不同于对照组(表16)。

表16.在富勒烯三(氨基己酸)水合物的给药和停药过程中大鼠的体重

1.2.血清的生化分析的结果

在富勒烯三(氨基己酸)水合物的给药结束时，观察到最大试验剂量的雄性大鼠表现出尿素水平的明显降低(表17)。在最小剂量和中等剂量表现出的胆固醇浓度变化与所研究的物质的作用无关，且没有超过生理学极限。在雌性大鼠中，在最大试验剂量表现出丙氨酸氨基转移酶活性的轻微、但是可靠的增加。在物质的最小剂量观察到的葡萄糖水平变化以及在中等剂量观察到的总蛋白和胆固醇浓度的变化没有剂量反应且没有超出生理学极限。

表17.在给予富勒烯三(氨基己酸)水合物之后大鼠的血清生物化学数值

^*根据Student检验为统计学显著的。

在雄性和雌性大鼠中在富勒烯三(氨基己酸)水合物停药周期后在最大试验剂量表现出肌酐浓度的可靠降低。在相同的剂量，在雄性和雌性大鼠中都表现出天冬氨酸氨基转移酶活性的变化。然而，在雄性大鼠中活性是降低的，而在雌性大鼠中活性是升高的(表18)。

表18.在富勒烯三(氨基己酸)水合物停药后大鼠血清的生物化学数值

表18(续)

^*根据Student t检验为统计显著的。

评价了在物质的给药期间以及在停药期间大鼠血清的生化分析结果，需要指出的是，雄性和雌性大鼠的血清中上述数值的变化在该物种的生理学范围极限范围内。

1.3.血液的血液学分析结果

在富勒烯三(氨基己酸)水合物的给药结束时，发现没有血液学数值变化与试验物质有关。在雌性大鼠中，在中等剂量观察到平均红细胞体积有不显著的减小，以及在最小剂量观察到网状细胞级分有一定程度的增加(表19)。这些变化没有超过生理学范围且没有剂量响应。表19.在三(氨基己酸)水合物给药结束后大鼠血液中的血液学数值

^*根据Student t检验为统计显著的。

在富勒烯三(氨基己酸)水合物停药结束后大鼠的血液学数值研究在对照动物和实验动物之间没有表现出显著性差异(表20)。

表20.在三(氨基己酸)水合物给药结束后大鼠血液中的血液学数值

表20(续)

1	2	3	4	5
					白细胞，ths/mm，包括：	21.6±2.6	17.8±4.0	20.1±3.5	8.1±2.5
嗜碱性白细胞，%	0	0	0	0
					嗜酸性粒细胞，%	2.0±1.4	1.8±1.8	1.8±1.8	2.0±1.4
Young，%	0	0	0	0
					Stabnuclear，%	1.4±1.3	1.6±1.7	1.2±1.1	1.4±1.3
Segmentonuclear，%	20.8±3.3	22.0±2.4	22.0±3.2	22.8±3.8
					淋巴细胞，%	70.6±3.7	69.2±3.	69.4±4.4	68.4±4.1
单核细胞，%	5.2±1.3	5.4±0.9	5.6±1.1	5.4±0.9

1.4.尿的分析

在富勒烯三(氨基己酸)水合物给药结束后，发现9mg/kg剂量的雄性组的尿pH增高(表21)。新的数值水平在生理学范围内。没有观察到剂量依赖性。

在富勒烯三(氨基己酸)水合物停药后，发现20.0mg/kg剂量的雌性组的相对尿密度与对照组动物相比有所降低。在雄性组，在相同的时间段观察到与对照组相比统计学显著变化，即：在3.0mg/kg剂量观察到pH升高，以及在9.0mg/kg剂量观察到相对尿密度增加。二者的数值都在生理学范围的极限范围内且没有剂量响应(表22)。

1.5.病理形态学研究的发现

在富勒烯三(氨基己酸)水合物的肌内给药结束后进行的尸检中，实验组和对照组大鼠之间在外观检查和研究方面没有表现出差异：皮毛光滑闪亮，皮肤有弹性且可移动，皮下组织适度，可见粘膜是淡色的、纯净的、没有溃疡和覆盖物，身体各个开口没有异常排放。在打开胸腔和腹腔时，观察到内脏都处于正确的解剖学位置。没有检测到内脏的大解剖明显的病理学迹象。在接受任何试验剂量的富勒烯三(氨基己酸)水合物的动物中，在解剖后股骨部位(注射部位)的骨骼肌时，观察到带褐色的肌肉组织、筋膜和脂膜。在对照组动物中，上述组织没有呈现这种颜色。

在分析富勒烯三(氨基己酸)水合物肌肉内给药周期之后的动物内脏的重量系数时，在实验组和对照组大鼠之间没有差异(表23)。

表23.富勒烯三(氨基己酸)水合物肌肉内给药周期之后大鼠内脏的重量系数

显微镜检验包括接受最大剂量的富勒烯三(氨基己酸)水合物的动物与对照组大鼠的器官和组织的组织病理学图片的对比评价。在检验中，主要地在肺、肝和肾中发现单独的病变(表24)。在各组中检测到的变化程度略有不同，但是一般是弱的或中等程度的。由于在器官中检测到变化的区域没有任何可选的响应或增殖响应，且在它们的血管中有许多急性多血的情况，它们的外观的最可能的原因是动物对全身麻醉和无痛处死时吸入二氧化碳的个体响应。基于在实验组和对照组中确定的损害的大体相等的出现频率，我们可以断定它们不是由试验物质诱导的。因此，这些变化被认为是背景。

在富勒烯三(氨基己酸)水合物的注射位置(骨骼肌)，同时发现了炎性变化(小的出血位置、包裹的和膨胀的肌纤维位置、淋巴样细胞渗透个体肌纤维和纤维束之间的空间)和再生性变化(带有新生血管的疏松或致密的结缔组织区域)。这些变化在对照组大鼠中也是固有的。上述图片是由于这项研究中重复的肌肉注射引起的多发性损伤所特有的，与给予的物质无关。

在富勒烯三(氨基己酸)水合物停药期间结束后的尸检中，外观检验和研究没有发现实验组大鼠与对照组大鼠之间有差异。在预先注射富勒烯三(氨基己酸)水合物的位置没有发现组织的褐色变色。在器官重量系数的统计分析中，在实验动物与对照动物之间没有发现显著性差异(表25)。

表25.富勒烯三(氨基己酸)水合物停药周期之后大鼠器官的重量系数

器官的组织样品的显微镜检验表明，变化在性质和严重程度方面大体上与富勒烯三(氨基己酸)水合物给药过程之后所描述的相同并且对于实验组动物和对照组动物而言都是固有的并且程度近似相同(表26)。为此，在这种情况下，可以推断，所发现的变化不是由所研究的物质诱导的。

在试验物质和对照物质的注射部位(骨骼肌)，在实验动物和对照动物中都观察到类似的变化：沿着肌纤维或与它们成锐角的完全成形的密集纤维性结缔组织的一些薄细长区域。这一形态学图片表明，溶剂和富勒烯三(氨基己酸)水合物的注射部位的愈合过程在速度和性质方面没有差异。

因此，作为死后研究的结果，没有发现与暴露于富勒烯三(氨基己酸)水合物或其停药有关的形态特征。

结论.在对大鼠给予富勒烯三(氨基己酸)水合物的周期和物质给药的停药周期，动物的临床状况没有发生改变的迹象。富勒烯三(氨基己酸)水合物的给药没有对实验动物的行为、皮毛状况、可见的粘膜和体重增加产生影响。

富勒烯三(氨基己酸)水合物对大鼠的长期(一个月)给药没有影响外周血液数值。试验物质的停药同样没有引起血液数值的变化。

在富勒烯三(氨基己酸)水合物给药结束后，发现给予最大试验剂量(20mg/kg)的雄性大鼠的尿素水平在生理学范围内的可靠降低，而在雌性大鼠中发现丙氨酸氨基转移酶发生了不显著的但是可靠的升高。在雄性和雌性大鼠中在试验物质结束后在最大试验剂量表现出肌酐浓度的降低。

在对富勒烯三(氨基己酸)水合物停药后的大鼠尿研究结果进行分析时，发现20mg/kg剂量的雌性组的尿相对密度与对照组动物相比有所降低。

作为事后研究的结果，在以20mg/kg体重的剂量肌肉内给药一个月后，没有发现表明富勒烯三(氨基己酸)水合物对大鼠的身体具有破坏作用的迹象。

因此，该研究表明，在以最大20mg/kg体重的剂量肌肉内给药30天后和在停药周期结束后都没有迹象表明富勒烯三(氨基己酸)水合物对大鼠的身体具有破坏作用。

实施例10.富勒烯三(氨基己酸)水合物在对实验动物单次肌肉注射的急性毒性研究。

该实验在Serpukhov镇的生物战剂毒理学和卫生学管理中心(俄罗斯的FGUN NITsTBP FMBA)进行。

这些研究的任务是确定可耐受剂量和毒性剂量和研究该物质在肌肉内给药后对实验动物的可能的破坏作用。

该实验对购自GU NTsBMT，俄罗斯医学科学院养殖场的Wistar非纯种白色小鼠和大鼠进行。动物的保管满足由USSR的公共卫生部,July6,1973批准的关于组织、设备和实验临床和生物学临床的维护(动物饲养)的卫生规定。动物随意进食根据GOST 50258-92制备的挤出拌饲料PK-120-1。将动物隔离并在动物饲养栏中适应环境至少10天。

由根据体重作为先导指标进行随机取样形成实验动物组。

在无菌条件下即时制备用于对动物注射的试验物质在20%DMSO水溶液中的溶液。将溶液包装在适当标记的瓶子中并在给药前在2-6℃的温度下存储不超过2小时。

将物质以5、50和500mg/kg的剂量经肌肉内对大鼠和小鼠给药。最大试验剂量是对小鼠和大鼠肌肉注射的最大可允许体积。为对照组的动物注射与物质最大剂量相同量的20%水溶液。

要给药的剂量在考虑个体体重后进行校正。

在观察期(给药后持续14天)期间，根据动物的身体活动型、食物和水的摄取量、毛和可见粘膜的状况和体重来评价动物的一般状况。

在观察期结束后，将接受500mg/kg的物质和对照物质(溶剂)的小鼠和大鼠进行尸检。通过吸入二氧化碳将动物无痛处死。在无痛处死后的1小时内进行尸检。在尸检时视觉确定内脏的形态学状况。

通过Student检验通过变量统计方法进行结果的统计处理。

研究结果。在所有试验的剂量，没有观察到动物中毒的临床症状。在观察期期间没有发生死亡；实验组和对照组的动物之间的一般状况没有差异。动物容易地进食且体重增加均匀；在实验组和对照组之间没有发现组间体重数值的统计学可靠的差异(表27、28)。

表27.小鼠的体重

对两种性别的小鼠和大鼠肌肉内给予该物质的LD₅₀都大于最大试验剂量(500mg/kg)。

表28.大鼠体重

在该物质的单次肌肉注射的14天之后对大鼠和小鼠进行尸检。由于在观察期的过程中给予所有剂量的动物组中都没有动物死亡，只对接受最大剂量(500mg/kg)物质的小鼠和大鼠以及对照组的动物进行尸检。通过吸入二氧化碳将动物无痛处死。

在实验组和对照组的小鼠和大鼠的外观检查中，记录到如下图片：皮毛光滑闪亮，皮肤有弹性且可移动，皮下组织适度，可见粘膜是淡色的、没有溃疡和覆盖物，身体各个开口没有异常排放。

尸检同样没有显示在所有实验组和对照组之间有差异。胸腔和腹腔的器官处于正确的解剖学位置且具有正常的宏观结构；没有发现病理学改变。在物质的注射位置(股)，没有检测到损害的迹象。

因此，尸剖没有检测到以最大500mg/kg的剂量对小鼠和大鼠单次肌肉内给药物质之后产生破坏作用的迹象。

结论.发现该物质的所有试验剂量都没有引起实验动物的中毒和死亡。富勒烯三(氨基己酸)水合物对小鼠和大鼠的LD50值都大于最大试验剂量(500mg/kg)，并从而超过人用最大一次性治疗剂量(2.9mg/kg)大于170倍。

对最大170倍同等治疗剂量的物质的敏感度没有发现物种和性别方面的差异。该物质在单次肌肉注射之后没有引起局部刺激性。

因此，富勒烯三(氨基己酸)水合物具有高的治疗指数且可以由偶然的药物过量引起中毒。

Claims (5)

1.通式C₆₀(H)₃{NH(CH₂)_nCOOH}₃xH₂O的水合N-富勒烯氨基酸，其中С₆₀是富勒烯；n=5、6和7；以及х=8～10。

2.制备根据权利要求1的化合物的方法，其特征在于使富勒烯与15倍摩尔过量的通式NH₂(CH₂)_nCOOH的氨基酸的无水钾盐在芳香族溶剂介质中反应，其中n=5、6或7，包括在搅拌并加热到不高于60～80℃的温度下向得到的悬浮液中缓慢添加相转移催化剂，直到溶液完全脱色并形成固体残余物，其中所述残余物代表得到的富勒烯氨基酸衍生物的钾盐，然后将所述残余物分离并溶解在水中以得到0.8M水溶液，然后用有机酸或无机酸的0.1N溶液处理所述水溶液，然后接着离心、洗涤并干燥所述残余物。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于使用细分散状态的氨基酸的无水钾盐，且通过过滤、乙醇洗涤和干燥进行富勒烯氨基酸衍生物的钾盐的固体残余物的分离。

4.根据权利要求2和3任一项的方法，其特征在于所述的相转移催化剂是分子量为400或500的甲基聚乙二醇酯。

5.药物组合物，其具有对抗疱疹病毒、多种流感病毒和HIV的抗病毒活性并具有抗肿瘤活性和抗牛皮癣活性，包含有效量的根据权利要求1的化合物作为活性剂。