CN105854024A - 以rgd为活性中心的多肽在制备抗抑郁靶向递药系统中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物药物技术领域，涉及以RGD为活性中心的多肽其在制备治疗抗抑郁靶向药物中的用途，特别是所述的RGD为活性中心的多肽可作为靶头构建抗抑郁脑靶向递药系统。本发明所述的RGD肽是由精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸构成的三肽序列(Arg-Gly-Asp)，以RGD三肽为活性中心的多肽包括五肽、七肽、环肽或拟肽化合物。经实验证实，本发明以RGD为活性中心的线性肽及环状肽修饰纳米给药系统，可显著提高该系统在脑内的药物蓄积，具有明显的脑靶向递药特征；应用该系统包载抗抑郁，可明显提三叶因子抗抑郁效果。

Description

以RGD为活性中心的多肽在制备抗抑郁靶向递药系统中的用途

技术领域

本发明属生物药物技术领域，涉及以RGD为活性中心的多肽其在制备治疗抗抑郁靶向药物中的用途，特别是所述的RGD为活性中心的多肽可作为靶头构建抗抑郁脑靶向递药系统。

背景技术

研究显示，抑郁症是一种严重危及人类身心健康的情感障碍性精神疾病，其发病率呈现逐年增加的趋势。抑郁症状多变、病因复杂，这给临床治疗带来了巨大困难。抑郁症严重性的另外一些表现是自杀危险性增加,以及对共病抑郁障碍的慢性躯体疾病病人愈后和转归产生消极影响。与其他严重疾病相比,抑郁症给社会造成的经济负担是惊人的。有效治疗抑郁症的历史已有四十余年，现在临床使用的抗抑郁药主要有六大类构成：单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药、五羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素(NA)再摄取抑制剂以及抗氧化剂。然而，由于血脑屏障(BBB)的存在，这些药物大多数难以跨过BBB而到达中枢发挥作用，导致药物在临床难以获得理想的疗效。因此，如何为精神疾病治疗药物在临床的应用提供理想的递药系统，也是抗精神病药物突破瓶颈问题的关键。

研究证实，在抑郁症发病过程中，白细胞(主要为中性粒细胞及单核细胞)可在细胞因子调控的趋化性作用下被激活，跨越BBB达到脑内病变部位。在这一病理过程中，血循环中的白细胞是关键：其在细胞因子调节的趋化性作用下穿越BBB并到达缺血脑组织，那么，如果能利用白细胞，使其携带载药系统跨越BBB并到达脑内缺血组织，则有利于构建一种十分理想的具有多级脑靶向功能的递送系统应用于抑郁症的治疗。

RGD肽(Arg-Gly-Asp)是由精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸构成的三肽序列，为纤维连接蛋白与其受体的特异性结合位点。RGD肽与整合素受体αvβ3具有高度亲和力，而αvβ3受体在肿瘤血管新生过程中的内皮细胞上具有高度的表达，因此采用RGD修饰的载体或诊断试剂可应用于肿瘤的治疗及诊断。此外，以RGD三肽为活性中心，有研究合成了一系列五肽、七肽、环肽或拟肽化合物，结果显示环化肽在体内具有更稳定的结构和更强的活性。

事实上除αvβ3外，RGD肽与整合素受体家族中αvβ1同样具有高度的亲和力。迄今，尚未见有关RGD修饰的载体通过与αvβ1的高亲和力与白细胞结合后，进一步实现多级脑靶向目的报道。

与本发明相关的现有技术有：

[1]Nestler,E.J.and Carlezon,W.A.,Jr.The mesolimbic dopamine reward circuit in depression.BiolPsychiatry,2006；59(12):1151-1159.

[2]Cascade,E.,Kalali,A.H.and Kennedy,S.H.Real-World Data on SSRI Antidepressant Side Effects.Psychiatry(Edgmont),2009；6(2):16-18.

[3]Huang R,Ke W,Han L，et al.Targeted delivery of chlorotoxin-modified DNA-loaded nanoparticles toglioma via intravenous administration.Biomaterials.2011,32(9):2399-2406.

[4]Bailey,M.T.,Kinsey,S.G.,Padgett,D.A.,Sheridan,J.F.,Leblebicioglu,B.,2009.Social stressenhances IL-1beta and TNF-alpha production by Porphyromonas gingivalislipopolysaccharide-stimulated CD11b+cells.Physiol.Behav.98,351-358.。

发明内容

本发明的目的在于提供以RGD为活性中心的多肽在制药中的新用途，具体涉及以RGD为活性中心的多肽在制备抗抑郁靶向递药系统中的用途。

本发明基于αvβ1是在白细胞表面高度表达的整合素受体，因此RGD修饰的载体可通过与αvβ1的高亲和力与白细胞结合，然后在炎症反应过程中被白细胞携带通过BBB并到达脑内受损部位，实现多级脑靶向目的，本发明中，通过实验，证实了以RGD为活性中心的多肽可用于制备抗抑郁靶向递药系统中。

本发明中，公开了以RGD为活性中心的多肽作为靶头在构建抗抑郁靶向递药系统中的用途；

其中，所述的多肽其特征为：以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列为活性中心的线性多肽、环肽或拟肽化合物；本发明的实施例中，优选环状RGD多肽；

本发明中，所述的递药系统包括但不限定于：脂质体、纳米粒、磷脂复合物、微球、聚合物、纳米球、纳米乳、自微乳、包合物等任何一种常见于临床的剂型；

本发明中，所述的RGD肽应用于递药系统的方式包括但不限定为：与递药系统中的任何一种常见的功能性材料偶联；所述的功能性材料其特征为：一端含NHS活泼酯，一端含巯基等任何一种常见的可与多肽发生反应的基团；本发明的实施例中，优选的功能性材料包括但不限定为：功能性磷脂、功能性胆固醇、功能性PEG、功能性聚合物、功能性胆固醇等。

本发明经试验显示，以RGD为活性中心的线性肽及环状肽修饰纳米给药系统，可显著提高该系统在脑内的药物蓄积，具有明显的脑靶向递药特征；进一步采用该系统包载抗抑郁，可明显提三叶因子抗抑郁效果。

下列结合附图和具体的实施方案仅作为本发明的解释，但绝不是对本发明的限制。

附图说明

图1，DSPE-PEG-NHS(A)和DSPE-PEG-cRGD(B)modi-toff图谱。

图2，裸鼠分别给予RGDL-Dir，cRGDL-Dir或PL-Dir后小动物活体成像照片，其中，A:PL-Dir；B:cRGDL-Dir；C:RGDL-Dir

图3，四种不同制剂对大鼠强迫游泳及运动行为的影响。

图4，四种不同制剂对大鼠新环境进食抑制的影响。

图5，强迫游泳实验结果。

图6，大鼠嗅球损毁抑郁实验结果。

具体实施方式

实施例1

RGD与磷脂的偶联：

精密称取适量RGD三肽(RGD，Arg-Gly-Asps)或五环肽(cRGD，Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)和DSPE-PEG-NHS(肽:DSPE-PEG-NHS＝2:1，molar ratio)，分别溶解于少量无水无氨DMF中，搅拌至全部溶解。将肽溶液缓慢滴加至快速搅拌下的DSPE-PEG-NHS溶液中，加入少量三乙胺调节pH至碱性，通氮气保护，室温搅拌反应24小时。葡聚糖凝胶将DSPE-PEG-cRGD与未反应的小肽分离。然后将DSPE-PEG-cRGD和DSPE-PEG-NHS进行modi-toff检测，结果如图1所示，从图中可以看出，DSPE-PEG-NHS的平均分子量为4319，DSPE-PEG-RGD的平均分子量为4632，DSPE-PEG-cRGD的质子峰向右迁移，说明cRGD肽已成功和DSPE-PEG-NHS偶联；

脂质体的制备：

称取大豆磷脂100mg，A胆固醇20mg，依达拉奉(Edaravone,ER)8mg，DSPE-PEG-cRGD或DSPE-PEG-RGD 2mol％置于250mL茄形瓶中，加入10mL氯仿溶解，室温旋蒸成膜。加入3mL无水乙醚，将磷脂膜复溶，再加入1mL蒸馏水，水浴超声5min形成白色的w/o乳剂。40℃旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝胶后，补加9mL水，继续旋转洗膜，磁力搅拌1h，探头超声，得载药ER-cRGD-L或ER-RGD-L。处方中不加入DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-cRGD，按上述方法制备得到荧光标记的普通脂质体(plain liposome，ER-PL)；

处方中加入将碘化1,1'-双十八烷基3,3,3',3'-四甲基吲三羰花青(Dir，Dir/Cy5:磷脂1:100mol/mol)，然后同上制备得Dir标记的cRGDL-Dir，RGD-Dir，PL-Dir；

脂质体的评价：将制备的ER-cRGDL，ER-RGD-L及ER-PL适当稀释，以粒径仪测其粒度分布，透射电镜观察其形态，结果见表1。三种脂质体包封率约为72％，载药量约为5％，平均粒径120nm左右，Zeta电位约为-21mV，偶联RGD或cRGD对脂质体理化性质无显著影响；

表1三种脂质体理化性质

靶向性评价：将RGDL-Dir，cRGDL-Dir及PL-Dir给予IL-1β致炎症模型裸鼠，给药后分别于30,40,60,90min及2,3,4,12h进行活体荧光测定，结果如图2所示，结果表明与普通脂质体相比，cRGD及RGD修饰的脂质体均具有明显的脑靶向作用，其中cRGDL-Dir脑靶向作用明显优于RGDL-Dir；

药效学评价：

强迫游泳试验：正常大鼠12只，随机分成四组，分别为对照组、ER溶液组(ERS)、ER-PL组和ER-cRGD-L组。将大鼠单个放入于高65cm，直径25cm，水深30cm，水温23-25℃的圆筒中强迫游泳15min(适应性实验)。吹干后放回笼内，24h后，单次给予四种制剂。30min后进行强迫游泳实验，游泳行为(大鼠在“泳池”内水平面、四周游动)、攀爬行为(大鼠在“泳池”沿内壁使用前爪向上攀爬)和不动行为(大鼠除为避免没入水中而主动向上运动外无其他行为)。记录大鼠在5min内不动行为的时间，结果如图3所示；

运动分析实验:系统由8个一样(40*40*65cm)有灯光和声音控制的暗盒组成，每个暗盒顶部都有一个摄像头，所有的摄像头和电脑连接记录小鼠的运动情况，通过软件分析小鼠的运动距离。共四组大鼠分别给予PBS、药物溶液、ERLs、cRGD-ERLs，30min后，大鼠进行运动分析实验。数据用分析软件分析，测定这段时间的运动距离，如图3所示；

如图3a所示，ERS组和对照组比较，无显著性差异，不能有效的减少大鼠不动时间。ER-PL组ER-cRGD-L组与PBS组、ERS组比较，不动时间显著减少，且ER-cRGD-L组较ER-PL组效果更显著，说明ER-PL及ER-cRGD-L均可增强ER治疗作用，且靶向制剂效果最佳，通过运动分析实验如图3b，可知四组均无显著性差异，说明四种制剂对大鼠的自主运动无影响；

新环境进食抑制实验(Novelty suppressed feeding test,NSF):正常大鼠12只，随机分成四组，分别为PBS组、ER溶液组(ERS)、ER-PL组和ER-cRGD-L组。试验前动物禁食24h，实验当天，准备长、宽75cm、高40cm的试验箱，箱底中央放置糖丸或小块食物于10cm*10cm的白纸上。分别给予大鼠PBS、ERS、ER-PL和ER-cRGD-L给药30min后，从任意的箱角放大鼠入箱内，通过摄像系统观察10min，记录大鼠的活动量，同时计算由放入大鼠到大鼠前肢抱起糖丸进食的时间(latency)。大鼠的活动量和进食时间的长短反应了大鼠的焦虑/抑郁程度，随后将动物放回笼中，同时记录放回笼中前5min内食物消耗量，以排除cRGD-ERL对食欲和进食时间的影响。结果如图4所示；

如图4a所示，ERS组和对照组比较，无显著性差异，不能有效的缩短latency时间，ER-PL组ER-cRGD-L组与对照组、ERS组比较，不动时间显著减少，且ER-cRGD-L组较ER-PL组效果更显著，说明ER-PL及ER-cRGD-L均能缓解大鼠的抑郁程度，且靶向制剂效果最佳。通过考察大鼠放回笼内前5min的进食情况，如图b所示；可以看出四组无显著性差异，说明四种制剂对大鼠的进食量无影响，排除了ER-cRGD-L对食欲和进食时间的影响。

实施例2

按处方比例磷脂：胆固醇：cRGD-PEG-DSPE比为85:10:5(mol/mol/mol)称取三种样品，其中磷脂浓度为5mg/mL，三叶因子(TFF3)脂药比为20:1(w/w)，置于50mL茄形瓶中，加入3mL无水乙醚，室温减压旋转蒸干成膜，加入3mL无水乙醚将磷脂膜复溶，再加入1mL TFF3的PBS(pH7.40)水溶液，水浴超声5min形成白色的w/o乳剂。40℃旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝胶直至凝胶崩塌，补加2mL蒸馏水，继续旋转洗膜，磁力搅拌30min，探头超声分散，得载有TFF3药物的cRGD脂质体(TFF3-cRGD-L)并以超滤法对其包封率进行测定。其中如不加入cRGD-PEG-DSPE，则制备普通脂质体(TFF3-L)，两种脂质体理化性质如表2所示，包封率约为45％，平均粒径约为130nm，Zeta电位-36mV左右。偶联cRGD不影响脂质体理化性质；

表2两种脂质体理化性质

药效学评价

强迫游泳试验：正常大鼠12只，随机分成四组，分别为PBS组、TFF3溶液组(TFF3)、载TFF3普通脂质体组(TFF3-L)组和载TFF3的cRGD脂质体组(TFF3-cRGD-L)，进行强迫游泳试验。结果见图5。单次给予TFF3溶液，能有效减少大鼠不动时间，增加游泳和攀爬时间，而不影响大鼠的自主运动。TFF3-L组及TFF3-cRGD-L组与PBS组、TFF3组比较，不动时间显著减少，游泳和攀爬时间显著增加，且TFF3-cRGD-L组较TFF3-L组效果更显著，说明TFF3-PL及TFF3-cRGD-L均可增强对抑郁症的治疗效果，且TFF3-cRGD-L效果最佳；

大鼠嗅球损毁抑郁模型试验：正常大鼠12只，随机分成四组，分别为PBS组、TFF3溶液组(TFF3)、载TFF3普通脂质体组(TFF3-L)组和载TFF3的cRGD脂质体组(TFF3-cRGD-L)，进行大鼠嗅球损毁抑郁模型及运动行为分析实验，结果见如图6所示，模型组与假手术组比较，大鼠的运动量明显增加，TFF3组与模型组比较，无显著性差异，TFF3-L组及TFF3-cRGD-L组与模型组比较，能显著性的减少大鼠的运动量，且TFF3-cRGD-L组较TFF3-L组效果更显著，说明TFF3-L及TFF3-cRGD-L均可增强TFF3的治疗作用，且TFF3-cRGD-L效果最佳。

Claims (7)

1.以RGD为活性中心的多肽在制备抗抑郁靶向递药系统中的用途；所述的以RGD为活性中心的多肽作为靶头。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多肽为：以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列为活性中心的线性多肽、环肽或拟肽化合物。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多肽为环状RGD多肽。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的递药系统选自：脂质体、纳米粒、磷脂复合物、微球、聚合物、纳米球、纳米乳、自微乳或包合物。

5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制备抗抑郁靶向递药系统中所述的RGD肽以与递药系统中的功能性材料偶联的方式用于制备抗抑郁靶向递药系统。

6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料为：一端含NHS活泼酯，一端含巯基的可与多肽发生反应的基团。

7.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料为功能性磷脂、功能性胆固醇、功能性PEG、功能性聚合物或功能性胆固醇。