CZ238898A3

CZ238898A3 - Léčebný přípravek s virucidním účinkem

Info

Publication number: CZ238898A3
Application number: CZ19982388A
Authority: CZ
Inventors: Aleksandr Ivanovič Iljin; Albert Artuševič Sarkesjan; Pavel Georgievič Borisov; Jevgenij Alexejevič Božkov; Norjan Garibalděvič Arakeljan; Anatolij Vasiljevič Verbkin; Petr Franc
Original assignee: Apa - Praha, S.R.O.
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2000-02-16
Also published as: EA003100B1; EP0978289A1; EA200100076A1; WO2000006202A1; AU4767499A; CZ295765B6

Description

Léčebný přípravek s virucidním účinkem

Oblast techniky

Vynález se týká léčebného přípravku s virucidním účinkem, zejména na viry obsahující DNA a RNA u savců, včetně člověka, obsahující jod, jodid draselný nebo sodný, syntetický polymer rozpustný ve vodě, přírodní polymery, například polysacharidy, monosacharidy a oligosacharidy, a vodu. Vynález se tedy týká oblasti medicíny, konkrétně léčebných přípravků se širokým spektrem účinku, včetně účinku na viry obsahující DNA a RNA u savců, včetně člověka. Léčebný přípravek se může použít pro léčení infekčních nemocí virové povahy, včetně viru vyvolávajícího onemocnění AIDS.

Dosavadní stav techniky

V průběhu posledních třiceti let bylo navrženo mnoho přípravků pro léčení virových onemocnění. V minulosti se však v důsledku nesprávného vyhodnocení skutečného rozvoje většiny virových infekcí a neznalosti působení virů na živé buňky organismu došlo k chybným závěrům terapeutických výzkumů. V poslední době však zásluhou detailnějšího studia a rozpracování metod specifické virové diagnostiky, rozšiřování biochemických znalostí o procesech replikace virů a také lepšího pochopení chování virů ve specifických populacích buněk hostitelů vznikla tendence rozpracování účinnějších přípravků, které se používají k potírání virových infekcí. Významnou událostí byl objev endogenního interferonu a zjištění jeho antivirové aktivity. V současné době je zjištěno, že účinek řady imunostimulačních a antivirových prostředků je spojen s jejich interferonové aktivitou, to jest schopností stimulovat tvorbu endogenního interferonu (M.D.Maškovskij, Lekarstvennye sredstva. Posobie dlja vračej. T 2 Charkov, Torsing, 1998, str. 349).

• · • 9

-2Pro profylaxi a léčení chřipky a jiných virových infekcí se dále používá přírodní (leukocytový lidský) interferon. Z moderních nejúčinnějších syntetických antivirových přípravků je třeba vyzdvihnout remantadin, který se používá k léčení onemocnění, vyvolávaných virem chřipky, adenoviry, pikornaviry a jinými (Kukajn R.A a kol. Antivirusnaja aktivnost’i mechanizm dějstvija različnych chimičeskich sojediněnij. Riga:; Znanie.-1979) Nebezpečnou vlastností virů je jejich schopnost mutace. Takové epidemie virových onemocnění, jako je španělská chřipka, hongkongská chřipka a nakonec i AIDS, mají za původce retroviry, které jsou viry živočichů, a neméně na ně onemocní i člověk.

Pro léčení AIDS se používá známá lipozomní farmaceutická kompozice, která obsahuje lipid a polyen, například nistatin a amfotericin B.

Lipozomní kompozicejsou však značně toxické pro infikované HIV-1 -buňky (WO 92/118415, Int.Cl. A61K9/127, 31/71, r. 1992). Pro léčení AIDS se používá také rapamicin nebo jeho analogy, které zpomalují rozvoj, popřípadě šíření HIV-1-infekce u savců (WO 94/05300, Int.CI. A61K31/71, r. 1994).

Je také znám farmaceutický přípravek, který jako aktivní složku obsahuje benanomicin A nebo B pro inhibici nákazy virem AIDS (EP 0356330A, Int.Cl.4 A61K31/71, zveřejnění 15.09.1990). Nedostatkem uvedených přípravků, které se používají pro léčbu nebo inhibici AIDS,je to, že vyvolávají řadu vedlejších reakcí organismu. Jedním z nejvíce používaných přípravků pro zpomalení rozvoje infekce AIDS je 3'-acido-2'didezoxotimidin (nazývaný též acidotimidin nebo ziovudin). Tento přípravek má pozitivní účinek při patogenní retrovirové infekci, nelze však bohužel hovořit o úplném potlačení viru AIDS pomocí tohoto přípravku. (V míre nauki, il. žurnál, No. 12, M., Mir, - 1988, str. 80-81). Nejbližším k dosaženému výsledku je svou technickou podstatou léčebný přípravek s bakteriocidním a virucidním účinkem, který obsahuje jod, jodid draselný nebo sodný, syntetický polymer rozpustný ve vodě, • · · ·

-3přírodní polymery, například polysacharidy a mono- a oligosacharidy, s následujícím složením:

jod	g/i 6-10
chlorid draselný nebo sodný	9-15
syntetický polymer rozpustný ve vodě	3-6
přírodní polymer (mono- nebo oligosacharidy)	8 -120
voda	zbytek

Tento léčebný přípravek je popsán v CZ-užitném vzoru č. 5435, A61K33/18, A61K31/715.

Nedostatkem tohoto přípravku je jeho poměrně vysoká toxicita.

Působení na viry, které již pronikly do buňky, je složité, protože buňka sama je účinně brání před jakýmkoliv působením. Naopak, uvnitř buňky provádí rozkladnou činnost přizpůsobený vir. Problém spočívá v tom, aby se na molekulární úrovni potlačily specifické procesy biologické syntézy virových částic, aniž by se pokud možno narušila životaschopnost buněk virem nepostižených.

S přihlédnutím k uvedenému spočívá úkol v nalezení přípravku schopného potlačovat vir jak vně, tak i uvnitř napadené buňky, aniž by se přitom tato buňka organismu zahubila.

Navíc, přípravek má mít široké spektrum účinku při nízké toxicitě. Uvedený úkol je vyřešen dále popsaným přípravkem.

-4• to

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky známých léčebných přípravků tohoto druhu do značné míry odstraňuje léčebný přípravek s virucidním účinkem, zejména na viry obsahující DNA a RNA u savců, včetně člověka, obsahující jod, jodid draselný nebo sodný, syntetický polymer rozpustný ve vodě, přírodní polymery, například polysacharidy, monosacharidy a oligosacharidy, a vodu, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že přídavně obsahuje chlorid litný, při následujícím složení g/i jod 0,8-25 jodid draselný nebo sodný 1,2 - 38 chlorid litný 0,1-20 syntetický polymer rozpustný ve vodě 0-6 přírodní polymery - polysacharidy, monosacharidy a oligosacharidy 8 - 400 voda zbytek do 1 I

Intervaly koncentrací složek nebyly vybrány náhodně. Všechny znaky složení navrženého přípravku s virucidním účinkem jsou nezbytné a dostatečné pro dosažení stanoveného cíle. Žádný z těchto znaků nemůže být vypuštěn nebo nahrazen jiným, v opačném případě se nedosáhne technického účinku. Volba jak druhu, tak i koncentrace složek navrženého léčebného přípravku je založena na početných experimentálních údajích. Složení léčebného přípravku, to jest jeho složky, je z hlediska jejich známosti z literatury, očividně známé, novým překvapivým zjištěním však je, že v součinnosti s ostatními složkami se jednotlivé složky tohoto léčebného přípravku projevují ne zcela očekávatelnými vlastnostmi. S přihlédnutím k tomu, že chemicky a biologicky aktivní složkou je jod, je podstatné, že při jeho koncentraci nižší než 0,8 g/l probíhá jeho následující hydrolýza:

J₂ + Η₂0 · ΗΙ + ΗΟΙ λ

Ο to jest léčebný přípravek nelze uchovávat.

Při koncentraci jodu vyšší než 25 g/l vznikají v důsledku strukturní tvorby komplexních sloučenin jodu se složkami léčebného přípravku systémy ve formě želé, které jsou nevhodné pro medicínskou aplikaci. V čase kromě toho probíhají procesy halogenizacee mono- oligo- a polysacharidů, čímž se zvyšuje toxicita léčebného přípravku. Intervaly koncentrací ostatních složek slouží pro zajištění průběhu komplexotvorných reakcí, asociace a agregace při výrobě léčebného přípravku za účelem dosažení jeho virucidních účinků.

Syntetické, ve vodě rozpustné polymery, například polyvinylalkohol, poly-Nvinylpyrolidon, plní při zavedení do krve funkci náhrady plazmy, sorbentů (například toxinů) nebo prolongátorů.

V případě léčebného přípravku podle vynálezu plní ve vodě rozpustný syntetický polymer funkci vytváření želé.

Je třeba také poznamenat, že jedním z důležitých kriterií při volbě složek léčebného přípravku je to, že úlohu matrice plní komplexní sloučeniny jodu s nízko- a vysokomolekulárními ligandy, které vytvářejí asociáty svého druhu. Jejich vodný roztok má některé vlastnosti gelu.

Je známo, že uhlovodany, ke kterým patří mono- a polysacharidy, spolu s bílkovinami a lipidy, jsou součástí biologických membrán, oddělujících prostory mezi buňkami nebo uvnitř buňky.

Projevem bílkoviny v membránách jsou obvykle fermenty (R.Coleman.

-6·· ► « • ·

Biochim.Biophys Acta, 1973, 300.1). Membrány svými vlastnostmi zajišťují nezbytnou prostorovou součinnost mezi fermenty, v důsledku čehož produkt reakce katalyzované jedním fermentem se stává substrátem pro jiný sousední ferment.

Na vnitrobuněčné úrovni hrají v regulaci procesů metabolismu důležitou úlohu hormony. Spojování hormonů s jejich receptory je podobné vzájemnému působení fermentu a jeho substrátu.

Vytváření komplexů ferment-substrát a hormon-receptor předpokládá vzájemné respektování molekul mezi sebou. Tuto schopnost mají na vysoké úrovni buňky. Například, leukocyty v krevním řečišti rozeznají a narušují cizorodé buňky, například bakterie, nenapadají však vlastní buňky krve. Rozeznávání se projevuje i kontaktní inhibici: některé buňky vyšších organismů se v živném prostředí dělí dále do doby, dokud nepřijdou do styku s jinými buňkami. Rakovinné buňky za stejných podmínek pokračují v dělení.

Procesy buněčného rozeznávání jsou závislé na pohyblivosti složek membrány (M.S.Bretscher, M.C.Raff, Nátuře, 1975,258,43).

Uhlovodany, ke kterým patří mono-, oligo- a polysacharidy, zvolené pro předmětný léčebný přípravek jako přírodní polymery, jsou mimořádně důležitým druhem přírodních sloučenin. V biologii a medicíně má význam uhlovodanů dominující roli, kterou tyto hrají v živých organismech a také ve složitosti jejich funkcí. Uhlovodany se účastní většiny biochemických procesů jako vysokomolekulární částice, ačkoliv v mnoha biologických kapalinách jsou obsaženy mono- a oligosacharidy (Compresive OrganicChemistry/Edited by E.Hasla.V5.Biological Compounds.Pergamon Press, 19).

Mono-, oligo- a polysacharidy, které jsou součástí léčebného přípravku, nejsou pro organismy savců, včetně člověka, cizorodé a hrají důležitou roli v procesu

-7···· ·· • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • * ·· ·· · · · • · · ·· ·· buněčného uznávání.

Jod, který je součástí léčebného přípravku jak v molekulární formě, tak ve formě solí (jodid draselný nebo jodid sodný), se v léčebném přípravku nachází v několika aktivních formách, a to zásluhou komplexotvorných reakcí l₂ + Kl Kl₃ K⁺ + l₃- (1)

L + x*l₂ L * xl₂ [L * l]⁺ + x-11₃- (2)

L + l₃- ' [L * l₃]- (3) kde L = ligand (mono-, oligo-, polysacharid a ve vodě rozpustný syntetický polymer).

Asociace komplexních sloučenin, vznikajících reakcí (1), vede k vytváření gelu v léčebném přípravku. Velmi důležitá je při vytváření gelu funkce ve vodě rozpustného syntetického polymeru.

V současné době je všeobecně přijímán kapalino-mosaikový model biologických membrán, který předpokládá, že membrána se ve fyziologických podmínkách chová jako tekoucí, tedy nikoliv statická (S.J.Singer, Ann. New York, Acad.Sci. 1972,195,16).

Dvouvrstvy, které tvoří strukturu membrány a sestávají z fosfolipidů a také glykolipidů a sulfolipidů, procházejí při charakteristické teplotě dobře vyjádřeným fázovým přechodem ze stavu poměrně pevného gelu ve stav tekutých krystalů. Složky membrány jsou v důsledku toho schopny v ploše membrány laterálně difundovat. Koeficient difúze pro bílkovinu s molekulovou hmotností 1 * 10¹⁰, obsaženou v membráně, činí3*10¹°cm²/s. (M.Edidian, Ann.Rev.Biophys.Bioeng. 1974,4,179). Laterální difúze v biologických membránách je do značné míry regulovaným procesem.

-8• A ·· ··

AA AA · · · · • · · · · · • A A ···· · • · · · · • •A ··· ·· *·

Příčné přemisťování složek membrán mezi vnitřní a vnější polovinou dvouvrstvy probíhá v čase, rychlost tohoto přemisťování však může být výrazně zvýšena přítomností jiných složek biologických membrán (do t_1/2 = 5 min.) (D.Marsh.Essays Biochem., 1975,11,139)

Jod a jeho různé formy, který je součástí léčebného přípravku, je schopen spolupůsobit prakticky se všemi třídami látek, které jsou součástmi organismu savce, včetně člověka, jakož i membrány a vlastní buňky, například bílkovinami, uhlovodany, lipidy, aminokyselinami, glyko- a fosfolipidy, hormony, fermenty, vitaminy a podobně. Probíhají přitom procesy vytváření komplexů a halogenizace, posloupnost biochemických procesů v živém organismu však vede k tomu, že po spolupůsobení jedné z aktivních forem jodu vzniká nová aktivní forma jodu, která se stává součástí jiných komplexů, například jod-ferment, jod-hormon a jod-biologická membrána, jodbílkovina a podobně.

Každý nově vznikající komplex je biologicky aktivní a vlastní pro živý organismus savce, včetně člověka.

Jod, který je součástí léčebného přípravku, a také komplexy jodu, které vznikají v organismu, zásluhou mechanismu uznávání a specifického chemického spolupůsobení halogenizují (jodují) viry obsahující DNA a RNA, nacházející se jak uvnitř, tak i vně buňky.

Halogenizace probíhá především cestou náhrady vodíkového atomu v peptidové vazbě molekuly viru:

OH Ol

II

-C-N

- +l₂-* - C-N - +HI (4) • ·

-9a náhrady SH-skupiny v síti molekuly viru:

R - SH + I, + H,0 - R -1 + H,S + HOI (5)

V důsledku halogenizace vznikají nové látky, které nemají vlastnosti výchozího viru. Na tomto je založen specifický virucidní účinek léčebného přípravku.

Posloupností biochemických reakcí, které při aplikaci léčebného přípravku probíhají v organismu savců, včetně člověka, se vysvětluje imunomodulační, imunostimulační účinek léčebného přípravku.

Chlorid litný, který je součástí léčebného přípravku, plní úlohu pro halogenidy alkalických kovů neobvyklou. Zlepšuje vodivost v buněčných membránách, vyvolává zlepšení laterální difúze v dvouvrstvě buněčných membrán, a to zásluhou malých rozměrů kationtu lithia a jeho pevnější koordinace s donorovými atomy mono-, oligoa polysacharidů.

Navržený léčebný přípravek s virucidním účinkem, zejména na viry obsahující DNA a RNA, je vodný roztok, tmavě modré barvy, molekulárních a iontových komplexů jodu s asocianty ve vodě rozpustných syntetických polymerů, vytvářejících gel, a přírodních mono-, oligo- a polysacharidů. Teplota tání léčebného přípravku je -1,40 °C, měrná hmotnost 1,048 g/cm³, hmotnostní podíl sušiny nejméně 25 %. Hodnota pH léčebného přípravku s virucidním účinkem činí 6-7. Všechny jeho složky jsou rozpuštěny v izotonickém roztoku chloridu sodného.

Léčebný přípraveek s virucidním účinkem má nízkou toxicitu. Letální dávka LD₁₀₀činí při perorálním podávání 75 g/kg živé hmotnosti (pro bílé myši).

-109 9 « » · · 4

Φ 9 -9 9

9 9 9 « • · 4 • 9 99

Lečebný příppravek s virucidním účinkem má široké spektrum tohoto účinku. Je účinný při infekcích vyvolaných viry poliomyelidy, slitavky a kulhavky, encefalomyokarditidy, chřipky, spalničky (viry obsahující RNA), herpes, neštovic ovcí, ectimy a dalších (viry obsahující DNA).

Léčebný přípravek je netoxický k buněčným kulturám rozředěným vodou v poměru 1:20 až 1:100.

Antivirový účinek léčebného přípravku se projevuje na všech úrovních při zavedení současně s viry, či při zavedení předcházejícím nebo následujícím zavedení virů.

Léčebný přípravek je účinným prostředkem pro chemoterapii virových infekcí.

Léčebný přípravek má schopnost stimulovat tvorbu protilátek v kulturách lymfocytů.

Léčebný přípravek s virucidním účinkem se u savců, včetně člověka, aplikuje vnitrožilně, vnitrosvalově, vnitrobřišně a podkožně. Je také možná perorální aplikace a podobně.

Způsob výroby předmětného léčebného přípravku je založen na reakcích vytvářejících komplexy jodu s polyfunkčními nízko- a vysokomolekulárními ligandy.

Vlastní způsob přípravy léčebného přípravku s antivirovým účinkem je následující. Ve 100 ml vody se rozpustí 9 g jodidu draselného, přidá se 6 g krystalického jodu a roztokem se míchá do úplného rozpuštění jodu. Odděleně se ve 100 ml vody rozpustí 2 g polyvinylalkoholu. Odděleně se ve 200 ml vody rozpustí 30 g směsi mono-, oligo- a polysacharidů. Získané roztoky se smíchají v následujícím • ·

-11 pořadí: k roztoku polyvinylalkoholu se přidá roztok směsi mono-, oligo- a polysacharidů a poté roztok jodu a jodidu draselného. Poté se doplní destilovaná voda do 1 litru, přičemž předem se přidá 9 g chloridu sodného a 2 g chloridu litného.

Uvedeným způsobem se se stejným pořadí kroků připravují roztoky léčebného přípravku s koncentracemi složek podle předmětu vynálezu.

Antivirová aktivita předmětného léčebného přípravku se zkoumala na viru chřipky A, kmen A/Aichi 2/68 (H₃N₂) - představitel orthomixovirů, viru prostého herpes u člověka druhého serotypu (rodina herpesvirů), viru encefalomyokarditidy (rodina pikornavirů), vakcinového atenuovaného polioviru typu III, kmen Sebin, v provozních podmínkách na kulhavce a slintavce ovcí.

Toxicita léčebného účinku přípravku s virucidním účinkem se studovala na buněčné kultuře, na myších a na kuřecích embryích a také na lymfocytech.

Pro posílení a shromáždění virů se za účelem studia antivirové aktivity použila transformovaná linie adenokarcinomu hrtanu člověka Hep-2 a primární kultura fibroplastů KE-FEK. Buňky se kultivovaly v prostředí podle Eagle s glutaminem a kravskou syrovátkou (Hep-2) a v prostředí 199 se syrovátkou (FEK).

Vliv předmětného léčebného přípravku na indukci humorální a buněčné imunní odezvy lymfocytú člověka v kultuře se studoval metodikou popsanou v Nejrochimia, 115, v 1, 1998, str. 45-50).

Při zkoumání antivirové aktivity se použily standardní metody.

- Titrování viru na buněčných kulturách podle cytopatického účinku.

- Určení titrátů podle Kerber.

• · · · · » ♦ · · Φ a · 9 · · * · » · · • a · · » 9 · ·

-12 - Titrování virů u myší metodou Reed a Mencha

- Titrování virů u kuřecích embryí.

- V reakci hemoglutanace.

Léčebný přípravek s virucidním účinkem se používal ve formě vodných roztoků v ředění 1:5 až 1:100, připravovaných ex tempore.

Pro kontrolu se u myší a kuřecích embryí použily oficiální antivirové přípravky remantadin a acyklovir.

Statistické zpracování výsledků fyzikálně-chemických pokusů a biologických výzkumů se provádělo metodikou popsanou v GF X1 SSSR, str. 199-251.

Výpočet dávky předmětného léčebného přípravku při pokusech na myších, kuřecích embryích, ovcích a člověku se prováděl způsobem popsaným v přihlášce vynálezu CZ-PV 1270-98 z 24.04.98, podle vzorce n-n'*k*1000

D =— --------------------- * Μ * P,

N_a k’ kde n je počet infekčních jednotek na 1 ml krve savce;

n' je počet molekul přípravku potřebných pro likvidaci jedné infekční jednotky;

k je obsah vody v orgasnismu savce (0,585 u člověka);

N_a je Avogadrovo číslo;

k' je obsah vody v krvi savce (0,72 u člověka);

M je molekulová váha aktivní látky přípravku;

P je hmotnost savce v kg.

• 9 99

9 9 9

999 999

9

9 9 9

- 13 Dosazením hodnot do vzorce dostaneme:

D = 0,187 *10'⁴ *M*P,g to jest jednu dávku přípravku.

Pro potvrzení rozsahu koncentrací složek léčebného přípravku se při provádění výzkumů použila následující složení:

g/i

I. jod krystalický 0,8 jodid draselný (sodný) 1,2 chlorid litný 0,1 přírodní mono-, oligo a polysacharidy 100 voda zbytek do 1 I

II. jod krystalický 8 jodid draselný (sodný) 12 chlorid litný 2 ve vodě rozpustný syntetický polymer 3 přírodní mono-, oligo a polysacharidy 100 voda zbytek do 1 I

III. jod krystalický 25 jodid draselný (sodný) 38 chlorid litný 20 ve vodě rozpustný syntetický polymer 6 přírodní mono-, oligo a polysacharidy 400 voda zbytek do 1 I • «

- 14Jako přírodní polysacharidy se používají všechny přírodní polysacharidy, včetně antibiotik, patřící k této třídě látek, a jejich deriváty, vytvářející s jodem ve vodě rozpustné komplexní sloučeniny, ve zde popsaném rozsahu koncentrací jodu a ostatních složek. Jako ve vodě rozpustné syntetické polymery se schopností vytvářet gely se použijí polymery povolené Mezinárodním seznamem povolených léčiv a o odpovídajícím SSSR seznamem XI vyd., vytvářející s jodem ve zde popsaném rozsahu koncentrací jodu a ostatních složek ve vodě rozpustné komplexy.

Profylaktický a terapeutický účinek předmětného léčebného přípravku se zkoumal na bílých myších s tělesnou hmotností 12 - 14 g, u kterých se po titrování virem a stanovení letální dávky LD50 vyvolala pokusná chřipková infekce, a to cestou intranazálního zavedení virové suspenze, obsahující 100 LD 50 v množství 0,05 ml.

2,5

Titr chřipkového viru, stanovený metodou Reed a Mechta, činil 10 /0,05 ml.

V tabulkách 1-3 jsou uvedeny údaje o profylaktickém účinku předmětného léčebného přípravku v různých ředěních při vnitrobřišní aplikaci 2 hodiny před infekcí chřipkovým virem.

Jako pozitivní kontrola se myším aplikoval remantadin, jeden z nejúčinnějších chemických preparátů proti viru chřipky typu A.

Jak je patrné z údajů v tabulkách 1 - 3, předmětný léčebný přípravek v rozředění 1/10 a 1/20 při aplikaci 2 hodiny před infekcí spolehlivě chrání zvířata před chřipkovou infekcí.

Nízká počáteční koncentrace jodu v léčebném přípravku podle příkladu 1 (Tab. 2) přirozeně nedává možnost dosažení positivního účinku při další aplikaci léčebného přípravku.

· • 4 · · 4 4 · 4 • 4 4 • 4 4 • 4 4 4

4 44

4 4 4 «4 4

4 4 4 • 4444 4

4 4

-15V tab. 4 jsou uvedeny údaje o zkoumání terapeutického účinku léčebného přípravku na chřipkovou infekci u myší. Dávky léčebného přípravku, vykazujícího virucidní účinek při profylaktické aplikaci, se myším aplikovaly vnitrobřišně počínaje 2 hodiny po infikování chřipkovým virem.

Analýza údajů tabulky 4 svědčí o hodnověrném snížení letality při aplikaci výchozího léčebného přípravku a léčebného přípravku v rozředění 1:10.

V tabulce 5 jsou uvedeny údaje o zkoumání způsobilosti předmětného léčebného přípravku v rozředění 1/20 a 1/40 neutralizovat 100 TCD50 viru encefalomyokardu při aplikaci 1 hodina před a po infekci tímto virem. Způsobilost léčebného přípravku neutralizovat účinky viru se posuzovala podle míry cytopatipkého účinku na pokusných a kontrolních vzorcích s monovrstvou buněk Ner-2, ze kterých byla odtitrována živná kapalina.

Jak je patrné z údajů v tabulce 5, dokonce při aplikaci léčebného přípravku v rozředění 1/40, aplikovaného po infikování virem v dávce 100 TCD50, rozdíl mezi pokusným a kontrolním souborem činil 3,5 - 4,0 log, což svědčí o značném potlačení viru.

Antivirový účinek předmětného léčebného přípravku na reprodukci prostého herpesviru (VPG) se zkoumal na vyvíjecích se kuřecích embryích, na jejichž vnějším zárodečném obalu se reprodukce VPG projevuje jako proliferace.

Výsledky pokusů, které jsou uvedeny v tabulce 6, svědčí o inhibici reprodukce viru působením léčebného přípravku v rozředění 1:10. Rozdíl mezi výsledky titrace viru u pokusného a kontrolního vzorku převyšuje 2 log, což svědčí o potlačení titru virů při pokusech 1 a 2 na 60 %, popřípadě 65 %.

* 4 ♦ 444

4 · • 4 4 • 44 4 • 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4

4444 I

4 4

4« 4«

-16 V tabulce 7 jsou uvedeny údaje o vlivu předmětného léčebného přípravku na indukci humorální imunní odpovědi tonzilárních lymfocytů člověka na Jersinia enterocotitica a Styphylococcus aureus.

Jak vyplývá z údajů v tabulce 7, předmětný léčebný přípravek má schopnost stimulovat tvorbu protilátek v kulturách lymfocytů v koncentracích od 1/10 do 1/100 proti Jersinia enterocolitica a Staphylococcus aureus.

Předmětný léčebný přípravek také stimuluje baktericidní aktivitu lymfocytů člověka proti Jersinia enterocolitica a Staphylococcus aureus

Byly zkoumány účinky předmětného léčebného .přípravku na slintavku a kulhavku ovcí v provozních podmínkách. Získané údaje jsou uvedeny v tabulkách 8 a 9.

Údaje v tabulkách 8 a 9 potvrzují výše uvedená zjištění o profylaktickém účinku léčebného přípravku, protože po dvou injekcích léčebného přípravku se již neobjevovalo onemocnění zvířat s klinickými příznaky slintavky a kulhavky.

Údaje v tabulkách 8 a 9 také svědčí o nadějném terapeutickém účinku léčebného přípravku s virucidním účinkem, protože po dvou injekcích léčebného přípravku hromadné hynutí ustalo a zbylá nemocná zvířata se během 7 - 10 dní uzdravila. Celkový úhyn zvířat v pokusné skupině činil 1,83 % , zatímco v kontrolní skupině, nehledě na karanténní opatření, činil 14 %.

V tabulce 10 jsou uvedeny údaje o terapeutickém účinku předmětného léčebného přípravku při onemocněních člověka, vyvolaných viry obsahujícími jak DNA, tak i RNA. Léčebný přípravek se aplikoval dobrovolníkům.

« · · * · e · φ · r · φ Φ · · · · · * · · • ♦ · · · · * ♦ · ·· · · φφφ *· · « * O

- 17 Jak je patrné z údajů v tabulce 10, léčebný přípravek je účinný ve všech případech, zejména pak při rychle probíhajících infekcích, například chřipce, diarrhoea, prudkém respiračním onemocnění, slintavce a kulhavce. V žádném z případů nebyly pozorovány nějaké komplikace.

Výše uvedené příklady jsou pouze ilustrací podstaty vynálezu, aniž by tento nějak omezovaly.

Takto při pokusech in vitro a in vivo získané údaje o antivirovém účinku předmětného léčebného přípravku, absenci toxicity, schopnosti ničit vir vně buňuky i uvnitř buňky, přítomnosti jak profylaktického, tak i terapeutického účinku a širokém spektru účinku dovolují přiřadit léčebný přípravek k účinným prostředkům pro chemoterapii virových infekcí.

-184 · 4 4 4 · · 4

4 4 · 4 «4 • 4 4 · 4

4 4 4 4 4 « • · · 4 4 V

44 4 4 4 4·4 ·· 44 • 4 · · 4

4 · 4 ♦ · · • ♦ 4 4

Tabulka 1

Vliv profylaktické aplikace léčebného přípravku s virucidním účinkem na výsledek experimentální chřipkové infekce u myší, Složení léčebného přípravku podle příkladu

1.

podmínky	dávka	počet	poměr	počet	absolutní	%
pokusu	přípravku	molekul	1 IE k	myší	počet	letality
	mg/kg	jodu	počtu		uhynulých
		v 1 f	molekul
			jodu
P¹ (1/10)+VG²	12,32	5*10¹⁹	10 1:5*10	100	12/100	12
P(1/20)+VG	6,16	2,5*ld⁹	10 1:2,5*10 '	100	28/100	28
P(1/40)+VG	3,08	19 1,25*10	10 1.1,25*10	100	50/100	50
remantadin+ VG	1,66	7.9*10^1θ	1:7,9*1(?	100	16/100	16
VG				100	70/100	70

Poznámky:

1. P - přípravek (léčebný přípravek s virucidním účinkem)

2. VG - vir chřipky

3. v přepočtu na jod

4. IE - infekční jednotka • 44 · 4 4

-19« 4 4 · ·

4 4 4 4 4 4 • ♦ 4 · 4 ·

4 · 444 444

Tabulka 2

Vliv profylaktické aplikace léčebného přípravku s virucidním účinkem na výsledek experimentální chřipkové infekce u myší, Složení léčebného přípravku podle příkladu 1.

podmínky pokusu	dávka přípravku mg/kg	počet molekul jodu v 1 I	poměr 1 IE k počtu molekul jodu	počet myší	absolutní počet uhynulých	% letality
P + VG	3,69	19 1,50*10	10 ' 1:1,5*10	100	38/100	38
P(1/10)+VG	0,369	18 1,50*10	19 1:1,50*10	100	60/100	60
remantadin	1,66	18 7.9*10	9 1:7,9*10	100	16/100	16
VG				100	70/100	70

Tabulka 3

Vliv profylaktické aplikace léčebného,,přípravku svirucjdním,,účinkem na výsledek experimentální chřipkové infekce u myší. Složeni lecebneho přípravku podle přikladu

podmínky pokusu	dávka , RW l	TToTeříul	wf m_ui odu	počet myši	absolutní GGynulých	letaíity
P (1/31)+VG	12,32	5 10¹⁹	10 1:5 10	100	11/100	11
P(1/62)+VG	6,16	19 2,5 10	10 1:2,5 10	100	27/100	27
P(1/124)+VG	3,08	19 1,25 10	10 1.1,25 10	100	51/100	51
remantadin+ VG	1,66	19 7.9 10	9 1:7,9 10	100	16/100	16
VG	•			100	70/100	70

-20V··· 4 4 • · · 4 • 4 · • 4 · · • · 4 4

4 «4 ·

Tabulka 4

2.

podmínky pokusu	dávka přípravku mg/kg	počet molekul jodu v 1 I	poměr 1 IE k počtu molekul jodu	počet myší	absolutní počet uhynulých	% letality
VG + P	123,2	20 5*10	11 · 1:5*10	100	3/100	3
VG + P(1/10)	12,32	19 2,5*10	10 1:5*10	100	21/100	21
VG + P(1/20)	6,16	19 2,5*10	10 1:2,5*10	100	42/100	42
VG + remantadin	1,66	18 7.9*10	9 1:7,9*10	100	20/100	20
VG				100	60/100	60

···· 9· ♦ · ·· ·· • · 9 · · · · · · 9 ·

9 9 9 9 9 9 ·9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 '9 9 99 9 99 9 9 9 9 9

-21 Tabulka 5

Vliv předchozí a následné aplikace léčebného přípravku s virucidním účinkem na reprodukci viru encefalomyokarditu (VEM) v buňkách kultury Ner-2. Složení přípravku podle příkladu 2.

Podmínky pokusu	vyjádření CPD	výsledky titrování vzorků	stupeň inhibce v log
	1. pokus	2. pokus	1. pokus	2. pokus	1. pokus	2. pokus
P(1/20) + VEM	0/4	1/4	1,0	2,0	' 5,5	4,5
P(1/40) + VEM	0/4	1/4	0,75	2,25	5,75	4,25
VEM + P(1/20)	1/4	1/4	1,5	1,75	5,0	4,75
VEM + P(1/40)	2/4	3/4	2,5	3,0	4,0	3,5
kontrolní VEM	4/4	4/4	6,5	6,5

• ·

-22• · · fl • · · • fl · · • · · · • fl fl · fl

Tabulka 6

Výsledky zkoumání inhibičního účinku léčebného přípravku a virucidním účinkem na reprodukci viru prostého herpesviru (VPG) v kuřecích embryích (KE)

ředění	počet	počet infikovaných KE
viru	objektů (KE)

titry VPG v log

kontrolní	pokus	kontrolní	pokus
1 2	1 2	1 2	1 2

-1
10	100	100/	75/	50/	50/	’ 3,75 3,5	1,5 1,25
		100	100	100	100
-2 10	100	100/	75/	50/	25/
		100	100	100	100
-3 10	100	75/	50/	0/100	0/100
		100	100
-4 10	100	50/	50/	0/100	0/100
-5 10	100	0/100	25/	0/100	0/100

-23• · · · φ φ φ φ ♦ • · · φ φ · φ φ φ φ φ · φ φ φφ φφφφ • φ φ φφ φ φ φφφφ φ φ φφφ φ φφφ φφ Φ·

Tabulka 7

Vliv různých koncentrací léčebného přípravku na tvorbu protilátek (AOK) v kultuře na antigeny. Složení přípravku podle příkladu 2.

podmínky počet antigenspecifických AOK (v přepočtu na 1*10 buněk) pokusu Jersenia entercolitica Staphylococcus aureus

kontrolní	54	39
PWM*	155	74
ředění přípravku
1:10	153	102
1:20	129	148
1:50	114	153
1:100	89	75

Poznámka:

PWM - mitogen amerického lakonosu • ·

-24··· · ·· • ♦ ♦ · • · · • · · ♦ • · · · ·» ·· ·

Tabulka 8

Výsledky působení léčebného přípravku s virucidním účinkem při slintavce a kulhavce ovcí. Složení přípravku podle příkladu 2. První aplikace přípravku.

počet ovcí, počet hlav onemocnělých zvířat dávka přípravku - 0,1 ml/kg živé hmotnosti vnitrosvalově hlav % počet uhynulých počet onemocnělých zvířat zvířat

	-hlav	%	. hlav	%
pokus	1200	52	4,3	20	1,7	5	0,42
kont-	500	25	5,0	15	3,0	20	4,1
rola

-25• · · · 99 · • » ♦ ·· • · · · • · · · ·

9 9 · · ·· ··· • · • 9 « • ··

Tabulka 9

Výsledky působení léčebného přípravku s virucidním účinkem při slintavce a kulhavce ovcí. Složení přípravku podle příkladu 2. Druhá aplikace přípravku za 24 hodin.

počet ovcí, počet dávka přípravku - 0,3 ml/kg živé hmotnosti hlav onemocnělých vnitrosvalově zvířat hlav % počet uhynulých počet onemocnělých zvířat zvířat

	hlav	%	hlav	%
pokus	1200	52	4,3	2	0,17	-	-
kont-	500	25	5,0	20	4,3	25	5,4*
rola

* Poté byla u kontrolní skupiny provedena vakcinace, celkový úhyn činil 14 %.

-269 99 99

9999

9 9 99 • 9 99 9 9 9

9 9 ·

999 ·· ··

Tabulka 10

Výsledky působení léčebného přípravku s virucidním účinkem při onemocnění virové povahy. Vnitrosvalová aplikace. Složení přípravku podle příkladu 2.

rodina, onemocnění počet dávka za doba léčení, počet dávek druh viru dobrovolníků 24 hod. dny

viry obsahující DNA:
Herpetoviridae Herpesvirus 2	herpes	22	0,2	3-5	3
Adeno- viridae Masta- denovirus	katar horních cest dýchacích	15	0,2	2 - 3	2 - 3
viry obsahující RNA:
Reoviridae Rotavirus	diarrhoea	18	0,2	1 -3	1 -3
Corona- viridae Corona- virus	prudké respirační onemocnění	50	0,2	1 - 3	1 - 3
Ortomyxoviridae Influenzavirus A	chřipka	35	0,2	1 - 3	1 -2
Picorna- viridae Aphtovirus	slintavka, kulhavka	3	0,2	2-3	2

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Léčebný přípravek s virucidním účinkem, zejména na viry obsahující DNA a RNA u savců, včetně člověka, obsahující jod, jodid draselný nebo sodný, syntetický polymer rozpustný ve vodě, přírodní polymery, například polysacharidy, monosacharidy a oligosacharidy, a vodu, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje chlorid litný, při následujícím složení g/i jod 0,8 - 25 jodid draselný nebo sodný 1,2 - 38 chlorid litný 0,1-20 syntetický polymer rozpustný ve vodě 0-6 přírodní polymery - polysacharidy, monosacharidy a oligosacharidy 8 - 400 voda zbytek do 1 I
2. Léčebný přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že má imunomodulační a imunostimulační účinek.