WO2012062200A1 - 荧光定量pcr反应液及其用途 - Google Patents

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pcr reaction
fluorescent quantitative
reaction solution
dna polymerase
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张庆辉
陈敏峰
黄业博
陈城超
孙勇
张秀清
杨焕明
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology, and in particular to the field of molecular biology techniques and experimental methods.
  • the present invention relates to a fluorescent quantitative PCR reaction solution and uses thereof. More specifically, the present invention provides a fluorescent quantitative PCR reaction solution, a kit, a fluorescent quantitative PCR method, and a method for quantifying nucleic acid.
  • Real-time quantitative PCR also known as quantitative PCR, abbreviated as QPCR
  • QPCR quantitative PCR
  • Fluorescence quantitative PCR plays an important role in clinical disease diagnosis, animal disease detection, food safety, scientific research, and various application industries.
  • real-time PCR can be divided into a probe method and a dye method.
  • a probe method such as a quantitative PCR Taqman hydrolysis probe method is a commonly used real-time PCR technique.
  • Quantitative PCR The Taqman hydrolysis probe method is based on a Taqman fluorescent probe (also known as a hydrolysis probe), which is an oligonucleotide labeled with one at each end of the oligonucleotide. A fluorescent emitting group and a fluorescent quenching group.
  • the probe when the probe is paired with the target sequence, the probe is intact, and the fluorescent signal emitted by the fluorescent emitting group is absorbed and quenched by the proximity of the fluorescence quenching group at the 3' end, and fluorescence monitoring is performed.
  • the system cannot receive the detected fluorescent signal; in the extension reaction, the 5 ' _ 3 ' exonuclease activity of Taq polymerase degrades the probe, so that the fluorescent emitting group is separated from the fluorescent quenching group, and the fluorescent group The emitted fluorescent signal is not quenched by the fluorescence quenching group, so that the fluorescence monitoring system can receive the fluorescent signal, and the generation of one molecule of the PCR product is accompanied by the generation of a fluorescent signal, along with the amplification product.
  • Increased, detectable fluorescence enhancement see Heid, CA, J. Stevens, KJ Livak, et al. Real time quantitative PCR [J].
  • the present invention aims to solve at least one of the technical problems existing in the prior art.
  • the inventors conducted a large number of experiments, optimized the fluorescent quantitative reaction solution for possible influencing factors, and completed the present invention.
  • the present invention provides a fluorescent quantitative PCR reaction solution and use thereof for improving the amplification efficiency of current fluorescent quantitative PCR reaction techniques, particularly for long fragments.
  • the invention provides a fluorescent quantitative PCR reaction solution.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution comprises a PCR reaction enhancer, wherein the PCR reaction enhancer is selected from the group consisting of disulfoxide, glycerin, bovine serum albumin, guanamide, nonionic detergent. At least one of polyethylene glycol, spermidine, ammonium sulfate, and betaine.
  • the present invention further provides a kit comprising the fluorescent quantitative PCR reaction solution according to an embodiment of the present invention based on the above-described fluorescent quantitative PCR reaction solution.
  • the kit can be used to perform fluorescence quantitative PCR conveniently and efficiently, and the quantitative results are accurate and reproducible.
  • the present invention also provides a fluorescence quantitative PCR method comprising using a fluorescent quantitative PCR reaction solution according to an embodiment of the present invention.
  • the inventors have surprisingly found that when performing fluorescence quantitative PCR reaction on a sample to be tested by a real-time quantitative PCR method according to an embodiment of the present invention, the amplification efficiency is remarkably improved and the accuracy of quantification is remarkably enhanced as compared with the conventional real-time quantitative PCR method. Moreover, the result is very reproducible, and thus, the obtained quantitative amplification product can be conveniently and effectively applied to various subsequent studies.
  • a method of quantifying nucleic acid comprising quantifying said nucleic acid using a real-time PCR method according to an embodiment of the present invention.
  • the nucleic acid is quantified by the method, and the initial amount of the nucleic acid sample to be tested is required to be low, so that a smaller amount of the nucleic acid sample can be efficiently amplified, and the amplification efficiency is high. It is also convenient and accurate for fluorescence quantification of nucleic acids, and the quantitative results are accurate and reproducible.
  • Figure 1 A graph showing the amplification of a fluorescent quantitative PCR reaction according to one embodiment of the present invention.
  • Amplification curve of the fluorescent quantitative PCR reaction using a commercial fluorescent quantitative PCR reaction system (Comparative Example 1);
  • Figure 2 shows a standard curve of a fluorescent quantitative PCR reaction according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the relationship between standard deviation and CT.
  • concentration expression method used herein refers to a concentration expression method commonly used in the field of molecular biology.
  • the invention provides a fluorescent quantitative PCR reaction solution.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution comprises a PCR reaction enhancer, wherein the PCR reaction enhancer is selected from the group consisting of disulfoxide, At least one of glycerin, bovine serum albumin, guanidinamide, nonionic detergent, polyethylene glycol, spermidine, ammonium sulfate, and betaine.
  • PCR reaction enhancers include, but are not limited to, disulfoxide (DMSO), glycerin, bovine serum albumin (BSA), guanidinamide, nonionic detergent, polyethylene glycol, sub-fine One or more of an amine, ammonium sulfate, and betaine may, for example, include one or more of disulfoxide, bovine serum albumin, or betaine.
  • the type of polyethylene glycol is not particularly limited, and according to a specific example of the present invention, polyethylene glycol 6000 may be used.
  • the PCR reaction enhancer comprises disulfoxide, bovine serum albumin and betaine, and the PCR amplification reaction using the PCR reaction enhancer has a high amplification efficiency.
  • the inventors have surprisingly found that disulfoxide, glycerol, bovine serum albumin, guanidinamide, nonionic detergent, polyethylene glycol, spermidine, ammonium sulfate or betaine are in the fluorescent quantitative PCR reaction.
  • a PCR reaction enhancer it can promote the efficient amplification of many complex structure DNA templates (such as high GC content) by various heat-resistant DNA polymerases, increasing the sensitivity and specificity of PCR reactions.
  • the principle includes increasing the yield of the target fragment by increasing the thermal stability of the DNA polymerase and reducing the secondary structure of the template DNA.
  • the inventors further found that: 1% by mass to 10% by mass of disulfoxide can change the melting temperature of the primer template pairing reaction, thereby improving the denaturation of DNA having a high GC content, making the polymerase easier in the secondary structure. Extension; 5% by mass to 20% by mass of glycerol can increase yield and increase enzyme stability; 0.1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 - 1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 of bovine serum albumin can improve the efficiency of PCR reaction, while reducing PCR in the system The effect of the inhibitor on the reaction; 1.25 mass% - 10 mass% of the phthalamide promotes some "primer-template" annealing, reducing the denaturation temperature of the DNA with the secondary structure; ammonium sulfate can increase the ionic strength of the reaction system, Change the denaturation and annealing temperature of DNA to regulate the enzyme activity; 0.5-2 ⁇ betaine contributes to the PCR reaction of high GC content and long DNA fragments.
  • the PCR reaction enhancer is: 5% by mass of disulfoxide, 0.1 ⁇ / ⁇ 1 of BSA, 1 M of betaine, and thus, fluorescent quantitative PCR using the PCR reaction enhancer , the amplification efficiency is significantly enhanced.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution further comprises a thermostable DNA polymerase having 5'-3' polymerase activity and 5'-3' exonuclease activity.
  • the thermostable DNA polymerase may further have 3'-5' exonuclease activity to increase the sensitivity and specificity of the reaction and the like.
  • the thermostable DNA polymerase may be Ex TaqTM DNA polymerase or LA TaqTM DNA polymerase, of which Ex TaqTM DNA polymerase is preferred.
  • the thermostable DNA polymerase may be a hot start DNA polymerase.
  • hot-start DNA polymerase refers to a polymerase that is activated under high heat conditions, which may be initiated by a chemically modified polymerase, with a structural change under high heat; or with a polymerase
  • the immune antibody is activated by separation of the antibody under high heat; or modified from the antibody type, the small molecule compound is used to block the position of the polymerase, and the separation is initiated at a high temperature, whereby the hot-start DNA polymerase can prevent the DNA template from being The polymerization reaction is started before the set temperature is reached.
  • the hot-start DNA polymerase performs a quantitative PCR reaction to prevent non-specific amplification due to primer mismatch or primer dimer formation in the first step of the PCR reaction, thereby improving the amplification efficiency of the DNA fragment of interest.
  • the hot-start DNA polymerase is Ex TaqTM DNA Polymerase Hot Start Version.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution may comprise 10-67 mM pH 8.2-9.0 Tris-HCK
  • the photoquantitative PCR reaction using the above-described fluorescent quantitative PCR reaction solution can effectively shorten the reaction time, increase the amplification efficiency, and enable accurate quantification of the DNA template.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution may comprise 2.5-3 mM Mg 2+ , 1.2% by mass to 5% by mass of disulfoxide, 0.1-0.8 ⁇ / ⁇ 1 bovine serum albumin, 1-1.2. M-betaine and 0.05-0.07 ⁇ / ⁇ 1 hot-start DNA polymerase. Therefore, the quantitative PCR reaction using the fluorescent quantitative PCR reaction solution can effectively improve the amplification efficiency, and can accurately quantify the DNA template, and the time required for the entire reaction process is greatly shortened, that is, the experiment is improved. effectiveness.
  • the fluorescence quantitative PCR reaction solution of the present invention when performing fluorescence quantitative PCR on a long fragment, the fluorescence quantitative PCR reaction solution of the present invention is used, and the amplification efficiency is remarkable compared to the use of the current commercial fluorescent quantitative PCR reaction system. Increased, the amplification efficiency can be increased from 85% to over 95%. The problem of low efficiency of long-length quantitative PCR amplification is solved. Moreover, the fluorescent quantitative PCR reaction solution according to an embodiment of the present invention can be applied to both the quantification of long nucleotide fragments and the quantification of long fragment libraries.
  • the present invention also provides a kit comprising a fluorescent quantitative PCR reaction solution according to an embodiment of the present invention. Therefore, the kit can be used to conveniently and efficiently perform a fluorescence quantitative PCR reaction on a sample to be tested, and the reaction takes less time, the amplification efficiency is high, and the quantification is accurate.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution has been described in detail above and will not be described herein. Those skilled in the art will appreciate that other components required for performing fluorescent quantitative PCR may also be included in the kit and will not be described again.
  • the present invention also provides a fluorescence quantitative PCR method comprising using a fluorescent quantitative PCR reaction solution according to an embodiment of the present invention.
  • the sample can be quantitatively and quantitatively quantified by the fluorescence quantitative PCR method according to the embodiment of the present invention, and the sample can be efficiently amplified and quantified, and the amplification efficiency is high, the use time is short, the quantitative result is accurate, and the repeatability is good.
  • the fluorescent quantitative PCR reaction solution has been described in detail above and will not be described herein. Those skilled in the art can adjust the specific conditions of the fluorescent quantitative PCR method and other reagents used as needed, and will not be described herein.
  • nucleic acid can Any polymer comprising nucleic acids such as deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid, including but not limited to modified or unmodified DNA and/or RA. It will be understood by those skilled in the art that when the method is used to quantify RA, the RNA may be directly subjected to a fluorescent quantitative PCR reaction, or the RA may be reverse-transcribed into a corresponding DNA and then subjected to real-time quantitative PCR.
  • the method for quantifying nucleic acid according to an embodiment of the present invention can conveniently and accurately quantify nucleic acid samples, has short PCR time, high amplification efficiency, high precision of quantitative results and good repeatability.
  • Those skilled in the art can adjust the specific conditions of the nucleic acid quantification method and other reagents used as needed, and will not be described herein.
  • Example 1 Comparison of the effects of the present invention and existing commercial fluorescent quantitative PCR reaction systems
  • Genomic DNA was extracted from the blood of a male yellow racer to construct a DNA library (see "Preparing 2-5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing Part # 1005363 Rev. B" (Part # 1005363 Rev. B, by reference In its entirety, the DNA library contains DNA fragments of different lengths, and the library concentration of 18.7 nM was determined by Agilent 2100 Bioanalyzer, and the DNA fragments contained therein ranged in length from 391 bp to 637 bp, and the average length was 557 bp. Five concentrations of standards were prepared using the constructed DNA library.
  • the InM DNA library was diluted with deionized water to five concentrations: 0.1 ⁇ , 1 ⁇ , 10 ⁇ , ⁇ , and ⁇ as standards.
  • Primer 1.1 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATC 3 ' ( SEQ ID NO: 2 )
  • Primer 2.1 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3' (SEQ ID NO: 3)
  • 10x PCR buffer ( Takara Co., Ltd.) contained 100 mM Tris-HCK 500 mM KC1 and 15 mM MgCl 2 , Ex Taq hot start version DNA polymerase was 5 U L, purchased from Takara, dNTP was purchased from Takara, MgS0 4 and bovine serum albumin ( BSA was purchased from New England Biolabs, disulfoxide (DMSO) was purchased from Shanghai Biotech, betaine was purchased from Sigma, 50xROX reference dye (6-carboxy-X-rhodamine, 6-carboxyl-X- Rhodamine was purchased from Invitrogen, and primers and probes were synthesized by Shanghai Biotech.
  • reaction premix of the commercial reagent as a comparative example was purchased from Applied Biosystems under the product number 4304473, and the components were AmpliTaq Gold DNA polymerase, AmpErase UNG, dNTPs, Rox reference fluorescence and optimized buffer components (see Product Manual).
  • Quantitative PCR reaction system 1 5 quantitative standards were subjected to real-time PCR, and the standard of each concentration was repeated twice.
  • fluorescence quantitative PCR reactions were performed on five concentrations of standards, and the standards of each concentration were repeated twice.
  • PCR conditions were: 95 °C pre-denaturation lO min; 95 °C denaturation 30 S Annealing at 30 °C at 60 °C, 45 S at 72 °C for 40 cycles.
  • Figure 3 shows the relationship between standard deviation and CT.
  • ⁇ is the standard deviation
  • X is a certain concentration of the sample
  • ⁇ is 1/10 of X.
  • the smaller the standard deviation the smaller the difference between the two, the higher the accuracy of the measurement.
  • the 10-fold dilution point (X) Between ⁇ concentration)
  • the average CT interval should be exactly 3.32 CT values.
  • the Ct value (or expressed as a CT value) of the fluorescent quantitative PCR is performed using the commercial fluorescent quantitative PCR reaction solution and the fluorescent quantitative PCR reaction solution of the present invention.
  • the meaning of the Ct value is: the number of cycles experienced when the fluorescent signal in each reaction tube reaches the set domain value), and the standard deviation is small, reflecting the high accuracy of the measurement.
  • the standard deviations in Tables 1 to 4 are all less than 0.5, indicating that the ability to resolve 10-fold dilutions is strong, reflecting the better effect of quantitative PCR reactions.
  • FIG. 1 shows an amplification curve of a real-time PCR reaction according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 1A shows an amplification curve of a real-time PCR reaction using a commercial fluorescent quantitative PCR reaction system (Comparative Example 1).
  • 1B shows an amplification curve of a fluorescent quantitative PCR reaction using a fluorescent quantitative PCR reaction system 1 (Experimental Example 1) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 1C shows the use of a fluorescent quantitative PCR reaction system according to an embodiment of the present invention.
  • Example 2 Amplification curve of the fluorescent quantitative PCR reaction
  • Fig. 1D shows an amplification curve of the fluorescent quantitative PCR reaction using the fluorescent quantitative PCR reaction system 3 (Experimental Example 3) according to one embodiment of the present invention.
  • the abscissa is the number of cycles, and the ordinate is the fluorescence intensity. It can be seen from Fig. 1 that the inflection point of the amplification curve is clear, the exponential phase is obvious, the overall parallelism of the amplification curve is good, and the baseline is stable. However, the slope of the exponential phase of the expansion curves of Figures 1B, C, and D is greater than the slope of the exponential phase of the amplification curve of Figure 1A. The slope of the exponential phase of the curve reflects the amplification efficiency. The larger the amplification, the higher the amplification efficiency. The amplification curve reflects the beneficial effects of the fluorescent quantitative PCR reaction solution of the present invention from the side.
  • FIG. 2 shows a standard curve of a fluorescence quantitative PCR reaction according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2A shows a standard curve of a fluorescent quantitative PCR reaction using a commercial fluorescent quantitative PCR reaction system (Comparative Example 1)
  • FIG. 2B A standard curve of a fluorescent quantitative PCR reaction using a fluorescent quantitative PCR reaction system 1 (Experimental Example 1) according to an embodiment of the present invention is shown
  • FIG. 2C shows the use of a fluorescent quantitative PCR reaction system 2 according to an embodiment of the present invention (Experiment A standard curve of the fluorescent quantitative PCR reaction of Example 2)
  • Fig. 2D shows a standard curve of the fluorescent quantitative PCR reaction using the fluorescent quantitative PCR reaction system 3 (Experimental Example 3) according to one embodiment of the present invention.
  • the abscissa is the initial concentration of the sample (in pM), and the ordinate is CT.
  • Fig. 2 is the result calculated by the software StepOne Plus (ABI). It can be seen from Fig. 2 that the real-time quantitative PCR amplification system of the commercially available fluorescent quantitative PCR reaction system has an amplification efficiency of 86.73%, and the fluorescent quantitative PCR reaction solution containing the present invention is used.
  • the fluorescence amplification PCR amplification efficiencies of the three reaction systems 1, 2, 3 ie, experimental examples 1, 2, and 3) were 99.31%, 97.96%, and 99.49%, respectively, which were close to 100%. It is explained that the fluorescent quantitative PCR reaction solution of the present invention can effectively increase the amplification efficiency.
  • Fluorescent quantitative PCR reaction solution, kit, fluorescent quantitative PCR method and the same A method for quantifying nucleic acids can be effectively applied to a real-time PCR reaction and can accurately quantify nucleic acids.

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Description

荧光定量 PCR反应液及其用途 优先权信息
本申请请求 2010 年 1 1 月 10 日向中国国家知识产权局提交的、 专利申请号为 201010538264.4的专利申请的优先权和权益， 并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及分子生物学技术及实验方法领域，具体地， 本发明涉及荧光定量 PCR反应液及其用途。更具体地，本发明提供了一种荧光定量 PCR 反应液、 一种试剂盒、 一种荧光定量 PCR方法以及一种对核酸进行定量的方法。
背景技术
荧光定量 PCR ( Real-time quantitative PCR, 也称为定量 PCR, 简称为 QPCR )技 术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程， 最后通过标准曲线对待测样品模板进行定量分析的方法。
荧光定量 PCR在临床疾病诊断、 动物疾病检测、 食品安全、 科学研究以及各种应 用行业中都发挥着重要作用。
然而， 目前的荧光定量 PCR方法仍有待改进。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现完成的：
根据化学原理的不同， 荧光定量 PCR可分为探针法和染料法， 其中， 探针法例如 荧光定量 PCR Taqman水解探针法，是常用的荧光定量 PCR技术。荧光定量 PCR Taqman 水解探针法以 Taqman荧光探针（也称为水解探针）为基础， 该探针是这样的一种寡核 苷酸，在该寡核苷酸的两端分别标记了一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。在进行 荧光定量 PCR反应的过程中， 当探针与靶序列配对时， 探针完整， 荧光发射基团发射 的荧光信号因与 3 '端的荧光淬灭基团接近而被吸收淬灭， 荧光监测系统无法接收检测 到荧光信号； 在进行延伸反应时， Taq聚合酶的 5 ' _ 3 '外切酶活性将探针酶切降解， 使 得荧光发射基团与荧光淬灭基团分离，荧光基团发射的荧光信号不会被荧光淬灭基团吸 收淬灭， 从而荧光监测系统就可以接收到荧光信号， 而且一分子 PCR扩增产物的生成 伴随一分子荧光信号的产生， 随着扩增产物的增加， 可检测到的荧光增强 （可以参见 Heid， C.A., J. Stevens, K. J. Livak， et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res, 1996, 6 : 986 - 994. , 通过参照将其全文并入本文） 。 但是， 目前的荧光定量 PCR方法对模板 的长度要求较高， 模板的长度在 50- 150bp 内时扩增效率最好， 超过 400bp就无法达到 理想的扩增效率 (90% ~ 1 10%), 因此长片段的模板釆用荧光定量 PCR方法进行定量就 受到了很大的限制， 无法保证扩增效率， 从而可能会严重影响后续实验的精确性、 重复 性和灵敏度。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。 为了提高荧光定量 PCR反 应扩增长核苷酸片段的效率，发明人进行了大量的实验，针对可能的影响因素对荧光定 量反应液进行了优化， 并完成了本发明。
根据本发明的实施例， 本发明提供了一种荧光定量 PCR反应液及其用途， 用以提高 目前的荧光定量 PCR反应技术的扩增效率， 尤其是针对长片段的模板。
根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种荧光定量 PCR反应液。 根据本发明的实施 例， 该荧光定量 PCR反应液包含 PCR反应增强剂， 其中， 所述 PCR反应增强剂为选自二 曱亚砜、 甘油、 牛血清白蛋白、 曱酰胺、 非离子去污剂、 聚乙二醇、 亚精胺、 硫酸铵和甜 菜碱的至少一种。 发明人发现， 釆用根据本发明实施例的荧光定量 PCR反应液对待测样本 进行荧光定量 PCR反应时， 能够有效地增强 PCR扩增效率， 且实验的重复性非常好、 定量 结果准确、 灵敏度高。
由此， 根据本发明的又一方面， 基于上述荧光定量 PCR反应液， 本发明还提供了一种 试剂盒， 其包含根据本发明实施例的荧光定量 PCR反应液。 利用该试剂盒， 能够方便有效 地对待测样本进行荧光定量 PCR, 且定量结果准确、 可重复性好。
根据本发明的再一方面， 本发明还提供了一种荧光定量 PCR方法， 该方法包括使用根 据本发明实施例的荧光定量 PCR反应液。 发明人惊奇地发现， 利用根据本发明实施例的荧 光定量 PCR方法对待测样本进行荧光定量 PCR反应时，相对于传统的荧光定量 PCR方法， 其扩增效率显著提高， 定量的精度也明显增强， 而且结果可重复性非常好， 从而， 所得的 定量的扩增产物能够方便有效地应用于后续的多种研究中。
根据本发明的另一方面， 本发明还提供了一种对核酸进行定量的方法， 其包括利用根 据本发明实施例的荧光定量 PCR方法对所述核酸进行定量。 根据本发明的一些具体示例， 利用该方法对核酸进行定量， 由于对待测核酸样本的起始量要求低， 使得较少量的核酸样 本也能得到有效地扩增， 扩增效率高， 由此， 也能方便准确地对核酸进行荧光定量， 且定 量结果精确、 可重复性好。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得 明显， 或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明 显和容易理解， 其中：
图 1 : 显示了根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应的扩增曲线图。
A: 使用商品化荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 )进行荧光定量 PCR反应 的扩增曲线；
B: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) 的荧 光定量 PCR反应的扩增曲线；
C: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ) 的荧 光定量 PCR反应的扩增曲线；
D: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ) 的荧 光定量 PCR反应的扩增曲线。
图 2: 显示了根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应的标准曲线图。
A: 使用商品化荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 )进行荧光定量 PCR反应 的标准曲线；
B: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) 的荧 光定量 PCR反应的标准曲线；
C: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ) 的荧 光定量 PCR反应的标准曲线；
D: 使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ) 的荧 光定量 PCR反应的标准曲线， 以及
图 3 : 显示了标准差与 CT的关系图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终相 图描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。 在本 文所使用的浓度表示方法， 如果没有特别指出，是指分子生物学领域中常用的浓度表示 方法。
为了提高荧光定量 PCR Taqman水解探针法扩增长核苷酸片段的效率，发明人进行了大 量的实验，针对可能的影响因素釆取相应的措施对目前的荧光定量 PCR反应液进行了优化， 由此完成了本发明。
根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种荧光定量 PCR反应液。 根据本发明的实施 例， 荧光定量 PCR反应液包含 PCR反应增强剂， 其中， PCR反应增强剂为选自二曱亚砜、 甘油、 牛血清白蛋白、 曱酰胺、 非离子去污剂、 聚乙二醇、 亚精胺、 硫酸铵和甜菜碱的至 少一种。 根据本发明的一些具体示例， PCR反应增强剂包括但不限于二曱亚砜（ DMSO )、 甘油、 牛血清白蛋白 （BSA )、 曱酰胺、 非离子去污剂、 聚乙二醇、 亚精胺、 硫酸铵和甜菜 碱（Betaine ) 中的一种或多种， 例如可以包括二曱亚砜、 牛血清白蛋白或甜菜碱中的一种 或多种。 根据本发明的实施例， 聚乙二醇的类型并不受特别限制， 根据本发明的具体示例， 可以釆用聚乙二醇 6000。 根据本发明的一个实施例， PCR反应增强剂包含二曱亚砜、 牛血 清白蛋白和甜菜碱， 利用该 PCR反应增强剂的荧光定量 PCR反应扩增效率较高。
另外， 发明人惊奇地发现， 二曱亚砜、 甘油、 牛血清白蛋白、 曱酰胺、 非离子去污剂、 聚乙二醇、 亚精胺、 硫酸铵或甜菜碱等在荧光定量 PCR反应中， 作为 PCR反应增强剂能够 促进各种耐热 DNA聚合酶对许多复杂结构 DNA模板（如高 GC含量） 的有效扩增， 增加 PCR反应的灵敏度和特异性。其原理包括通过提高 DNA聚合酶的热稳定性，降低模板 DNA 的二级结构等机制提高目的片段的产量。 具体地， 发明人进一步发现： 1 质量％-10质量％ 的二曱亚砜能够改变引物模板配对反应的熔解温度， 从而改善 GC含量高的 DNA的变性情 况， 使聚合酶更容易在二级结构处延伸； 5 质量％-20质量％的甘油能够提高产量， 增加酶 的稳定性； 0.1 μ§/μ1 - 1 μ§/μ1的牛血清白蛋白能提高 PCR反应的效率，同时减少体系中 PCR 抑制物对反应的影响； 1.25质量％ - 10质量％的曱酰胺可促进某些 "引物 -模板"退火， 降低 带有二级结构的 DNA的变性温度； 硫酸铵能增加反应体系的离子强度， 改变 DNA的变性 及退火温度， 调节酶活； 0.5-2Μ的甜菜碱有助于高 GC含量和长 DNA片段的 PCR反应。 可以根据实际需要， 选择其中的一种或多种作为荧光定量 PCR反应液的 PCR反应增强剂。 根据本发明的一个实施例， PCR反应增强剂为： 5质量％的二曱亚砜， 0.1μ§/μ1 的 BSA, 1M 的甜菜碱， 由此， 釆用该 PCR反应增强剂的荧光定量 PCR, 扩增效率显著增强。
根据本发明的一些具体示例， 荧光定量 PCR反应液， 进一步包含耐热 DNA聚合酶， 该耐热 DNA聚合酶具有 5'-3'聚合酶活性和 5'-3'外切酶活性。 根据本发明的实施例， 该耐热 DNA聚合酶可以进一步具有 3'-5'外切酶活性， 以增加反应的灵敏度和特异性等。 根据本发 明的一个实施例， 该耐热 DNA聚合酶可以为 Ex Taq™ DNA聚合酶或 LA Taq™ DNA聚合 酶， 其中优选 Ex Taq™ DNA聚合酶。 根据本发明的实施例， 该耐热 DNA聚合酶可以为热 启动 （hot start ) DNA聚合酶。 在本说明书中， 表达方式 "热启动 DNA聚合酶" 是指在高 热状况下会活化的聚合酶， 其可以为经过化学分子修饰的聚合酶， 高热下结构改变而启动； 或者带有针对聚合酶的免疫抗体， 高热下使抗体分离而启动； 或者改良自抗体型， 使用小 分子的化合物封闭聚合酶的作用位置， 高温下分离而启动， 由此， 热启动 DNA聚合酶可以 避免 DNA模板在未达到设定温度前就开始进行聚合反应。 发明人发现， 利用热启动 DNA 聚合酶进行荧光定量 PCR反应，可以防止在 PCR反应的第一步因引物错配或引物二聚体的 形成而导致的非特异性扩增， 从而能够提高目的 DNA片段的扩增效率。 根据本发明的一个 实施例，热启动 DNA聚合酶为 Ex Taq™热启动 DNA聚合酶 (Ex Taq™ DNA Polymerase Hot Start Version)„
根据本发明的实施例， 荧光定量 PCR反应液可以包含 10-67 mM pH 8.2-9.0 Tris-HCK
25-50 mM KCl、 1.5-5.0 mM Mg2+、 0.2-0.4mM dNTP、 0.05质量0 /。-0.1质量0 /。 Tween 20、 1质 量％-10质量％二曱亚砜、 0.1 μ§/μ1 - 1 μ§/μ1牛血清白蛋白、 0.5-2Μ甜菜碱和 0.04-0.2υ/μ1热 启动 DNA聚合酶。 由此， 利用上述荧光定量 PCR反应液进行光定量 PCR反应， 可以有效 地缩短反应时间， 提高扩增效率， 并能够实现对 DNA模板的精确定量。 根据本发明的一些 具体示例， 荧光定量 PCR反应液可以包含 2.5-3 mM Mg2+、 1.2质量％-5质量％二曱亚砜、 0.1-0.8μ§/μ1牛血清白蛋白、 1-1.2M甜菜碱和 0.05-0.07υ/μ1热启动 DNA聚合酶。 由此， 利 用该荧光定量 PCR反应液进行光定量 PCR反应， 可以有效地提高扩增效率， 并能够准确地 对 DNA模板进行定量， 且整个反应过程所需的时间大大缩短， 即提高了实验的效率。 具体 地， 根据本发明的一个实施例， 在对长片段进行荧光定量 PCR时， 釆用本发明的荧光定量 PCR反应液， 相对于使用目前的商业化荧光定量 PCR反应体系， 其扩增效率显著提高， 可 以将扩增效率从 85%提高到 95%以上。 解决了目前长片段定量 PCR扩增效率偏低的问题。 并且， 根据本发明实施例的荧光定量 PCR反应液既可以应用于长核苷酸片段的定量， 也可 以应用于长片段文库的定量。
根据本发明的又一方面， 本发明还提供了一种试剂盒， 其包含根据本发明实施例的荧 光定量 PCR反应液。 由此， 利用该试剂盒， 能够方便有效地对待测样本进行荧光定量 PCR 反应， 并且反应需时少， 扩增效率高， 定量精确。 关于荧光定量 PCR反应液， 前面已经进 行了详细描述， 此处不再赘述。 本领域技术人员可以理解， 试剂盒中还可以包含进行荧光 定量 PCR所需要的其他组分， 在此也不再赘述。
根据本发明的再一方面， 本发明还提供了一种荧光定量 PCR方法， 其包括使用根据本 发明实施例的荧光定量 PCR反应液。利用根据本发明实施例的荧光定量 PCR方法对样本进 行荧光定量 PCR反应， 样本能够有效地进行扩增和被定量， 且扩增效率高， 用时短， 定量 结果精确， 可重复性好。 关于荧光定量 PCR反应液， 前面已经进行了详细描述， 此处不再 赘述。 本领域技术人员可以根据需要， 调整荧光定量 PCR方法的具体条件和所使用的其他 试剂， 在此不再赘述。
根据本发明的另一方面， 本发明还提供了一种对核酸进行定量的方法， 其包括利用根 据本发明实施例的荧光定量 PCR方法对核酸进行定量。 在本说明书中， 术语 "核酸" 可以 是任何包含核酸如脱氧核糖核酸和 /或核糖核酸的聚合物， 包括但不限于经过修饰或未经修 饰的 DNA和 /或 R A。 本领域的技术人员可以理解， 利用该方法对 R A进行定量时， 可以 是直接将 RNA进行荧光定量 PCR反应， 也可以将 R A反转录为相应的 DNA后再进行荧 光定量 PCR。 釆用根据本发明实施例的对核酸进行定量的方法， 能够方便准确地对核酸样 本进行定量， PCR定量用时短， 扩增效率高， 定量结果精确度高且重复性好。 本领域技术 人员可以根据需要， 调整核酸定量方法的具体条件和所使用的其他试剂， 在此不再赘述。
需要说明的是， 根据本发明实施例的荧光定量 PCR反应液及其用途是本申请的发明人 经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 本领域技术人员将会理解， 下 面的实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术 或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂 等译的 《分子克隆实验指南》， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说明书进行。 所用试剂 或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1: 本发明和现有商品化荧光定量 PCR反应体系的效果比较
实施例中涉及的各实验材料：
1 )模板、 探针和引物
模板的制备： 从一名男性黄种人的血液中提取基因组 DNA, 构建 DNA 文库 （参见 《Preparing 2-5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing Part # 1005363 Rev. B》 ( Part # 1005363 Rev. B, 通过参照将其全文并入本文）， 其中， 该 DNA文库含有长度不同的 DNA 片段， 经 Agilent 2100 Bioanalyzer测定文库浓度为 18.7 nM, 其所含 DNA片段的长度范围 为 391bp-637bp, 平均长度为 557 bp。 利用构建好的 DNA文库制备 5种浓度的标准品， 具 体地， 分别取 InM的 DNA文库用去离子水稀释为 5种浓度： 0.1ρΜ、 1ρΜ、 10ρΜ、 ΙΟΟρΜ 和 ΙΟΟΟρΜ, 作为标准品， 用作荧光定量 PCR反应的反应模板。 其中 lnM=10—9mol/L, 1ρΜ=10— 12mol/L。
水解探针序歹 'J : 5'CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3' ( SEQ ID NO: 1 ), 在其 5' 端带有荧光基团 5-FAM ( 5-羧基荧光素）， 3'端带有淬灭基团 6-TAMRA ( 6-羧基四曱基罗丹 明）。
引物 1.1： 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATC 3 ' ( SEQ ID NO: 2 )
引物 2.1 : 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3' ( SEQ ID NO: 3 )
2 )试剂 其中 10x PCR緩冲液（ Takara公司）含 lOOmM Tris-HCK 500mM KC1和 15mM MgCl2, Ex Taq hot start version DNA聚合酶为 5U^L, 购自 Takara, dNTP购自 Takara, MgS04 和 牛血清蛋白 （BSA )购自 New England Biolabs, 二曱亚砜（DMSO )购自上海生工， 甜菜碱 ( Betaine ) 购自 Sigma, 50xROX参比染料（6-羧基 -X-罗丹明， 6-carboxyl-X-rhodamine ) 购自 Invitrogen, 引物和探针由上海生工合成。 作为对比例的商品化试剂的反应预混液， 购 自 Applied Biosystems,货号为 4304473 ,成分为 AmpliTaq Gold DNA聚合酶、 AmpErase UNG、 dNTPs、 Rox参比荧光及优化的緩冲液组分（具体可参见产品说明书）。
1、 含有本发明荧光定量 PCR反应液的反应体系
1) 荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) ：
10XPCR緩冲液 2.5μί
Figure imgf000008_0001
100 mM MgSO4
lO mg/mL BSA
10质量％Tween-20
100% DMSO \ 25 \,
5M Betaine (甜菜碱）
Figure imgf000008_0002
10μΜ引物 1.1
10μΜ引物 2.1
10μΜ水解探针 0.625μ£
50x ROX参比染料 0.5 μΐ,
DNA聚合酶
模板
Figure imgf000008_0003
去离子水 9.625μ
合计 25
釆用荧光定量 PCR反应体系 1 , 对 5种浓度的标准品进行荧光定量 PCR反应， 每种浓 度的标准品重复 2次。
2 ) 荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ):
lOxPCR緩冲液 2.5μ
2.5 mM dNTP 2μ\,
100 mM MgSO4 0)25 \,
Figure imgf000009_0001
10质量％Tween-20
100% DMSO 0.3μΙ^
5M Betaine (甜菜碱） 6μL
ΙΟμΜ引物 1.1 0.^5μL
ΙΟμΜ引物 2.1 0.^5μL
ΙΟμΜ水解探针 0.625μ£
50x ROX参比染料 0.5 μL
DNA聚合酶 0.25μί
模板 \μ
去离子水
合计 25μ
釆用荧光定量 PCR反应体系 2 , 对 5种浓度的标准品进行荧光定量 PCR反应， 每种浓 度的标准品重复 2次。
3 ) 荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ):
lOxPCR緩冲液 2.5μ
Figure imgf000009_0002
100 mM MgS04 0.375μί
lO mg/mL BSA 0.25μί
10质量％Tween-20
100% DMSO \ 25 \.
5M Betaine (甜菜碱）
ΙΟμΜ引物 1.1 0.75μί
ΙΟμΜ引物 2.1 Ο.Ί5μΙ,
ΙΟμΜ水解探针 0.625μ£
50x ROX参比染料 0.5 μΐ,
DNA聚合酶 0.35μί
模板
去离子水
合计
釆用荧光定量 PCR反应体系 3 , 对 5种浓度的标准品进行荧光定量 PCR反应， 每种浓 度的标准品重复 2次。
2. 商品化的荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 ) 为:
反应预混液 12
ΙΟμΜ引物 1.1 0.^5μL
ΙΟμΜ引物 2.1 0.^5μL
ΙΟμΜ水解探针 0.625μ£
模板 \ μ
去离子水 9.3Ί5μΙ
合计 25μ
釆用商品化的荧光定量 PCR反应体系， 对 5种浓度的标准品进行荧光定量 PCR反应， 每种浓度的标准品重复 2次。
3. 反应条件
上述荧光定量 PCR反应均在荧光定量 PCR仪 StepOne Plus ( ABI公司） 中进行。
釆用含有本发明荧光定量 PCR反应液的 3种反应体系 （即实验例 1、 2、 3 ), 分别对 5 种浓度的标准品进行荧光定量 PCR反应， 其 PCR条件为： 95 °C 预变性 10 S; 95 °C变性 30 S、 60°C退火 30 S、 72 °C 延伸 45 S , 共 40个循环。
釆用商品化的荧光定量 PCR反应体系 （即对比例 1 ), 分别对 5种浓度的标准品进行荧 光定量 PCR反应时， PCR条件为： 95 °C 预变性 lO min; 95 °C变性 30 S、 60°C退火 30 S、 72 °C 延伸 45 S , 共 40个循环。
4. 实验结果
反应结束后， 利用 StepOne v2.0软件进行分析， 结果表明， 釆用荧光定量 PCR反应体 系 1 (实验例 1 )进行的荧光定量 PCR反应， 其扩增效率为 99.31%, 釆用荧光定量 PCR反 应体系 2 (实验例 2 )进行的荧光定量 PCR反应，其扩增效率为 97.96%,釆用荧光定量 PCR 反应体系 3 (实验例 3 )进行的荧光定量 PCR反应， 其扩增效率为 99.49%, 而釆用商品化 的荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 )进行的荧光定量 PCR反应， 其扩增效率为 86.73%。
具体实验结果见表 1-表 4, 以及图 1和图 2。 图 3显示了标准差与 CT的关系图。
表 1 釆用商品化荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 ) 的荧光定量 PCR结果 浓度 ( M ) Ct 1 Ct 2 平均 Ct 标准偏差 变异系数(％)
1000 13.2534 13.2442 13.2488 0.0065 0.0492
100 17.1752 17.2782 17.2267 0.0729 0.4231
10 20.8095 20.8827 20.8461 0.0518 0.2483 1 24.4600 24.3748 24.4174 0.0602 0.2466
0.1 28.0799 28.0995 28.0897 0.0138 0.0493 表 2 釆用荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) 的荧光定量 PCR结果 浓度 ( M ) Ct 1 Ct 2 平均 Ct 标准偏差 变异系数(％)
1000 12.9046 12.9299 12.9172 0.0178 0.1381
100 16.1706 16.1793 16.1750 0.0061 0.0378
10 19.4299 19.4734 19.4516 0.0308 0.1581
1 22.6603 22.8567 22.7585 0.1389 0.6101
0.1 26.3319 26.3066 26.3192 0.0179 0.0679 表 3 釆用荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ) 的荧光定量 PCR结果 浓度 ( M ) Ct 1 Ct 2 平均 Ct 标准差 变异系数(％)
1000 12.6027 12.6569 12.6298 0.0383 0.3036
100 15.8991 15.9597 15.9294 0.0429 0.2691
10 19.5051 19.5223 19.5137 0.0121 0.0621
1 22.9249 23.0240 22.9744 0.0701 0.3050
0.1 25.9567 25.9777 25.9672 0.0148 0.0571 表 4 釆用荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ) 的荧光定量 PCR结果 浓度 ( M ) Ct 1 Q 2 平均 Ct 标准差 变异系数(％)
1000 13.3488 13.3876 13.3682 0.0274 0.2049
100 16.6618 16.7310 16.6964 0.0490 0.2932
10 19.9321 20.0173 19.9747 0.0602 0.3015
1 23.3494 23.3351 23.3423 0.0101 0.0434
0.1 26.6832 26.7498 26.7165 0.0471 0.1763
5. 结果分析
图 3显示了标准差与 CT的关系。 在图 3中， σ为标准差， X为样品的某浓度， Υ为 X的 1/10。 由图 3可知， 标准差越小，表明两者之间的差异越小， 则测量的准确度越高， 具体来说， 如果定量 PCR的扩增效率是 100% , 那么 10倍稀释点 （ X与 Υ浓度）之间 的平均 CT间隔应该恰为 3.32个 CT值。 要以 99.7%的几率分辨 10倍稀释的浓度， 标 准差就必须小于等于 3.32/6=0.553。 标准差越大， 分辨 10倍稀释的能力就越低。 由此， 根 据表 1 -表 4并结合图 3的结果可以看出， 使用商品化荧光定量 PCR反应液和本发明的荧光 定量 PCR反应液进行荧光定量 PCR的 Ct值（或表示为 CT值， Ct值的含义是： 每个反应 管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）、 标准差均较小， 反映出测量的准确度 较高。 表 1-表 4中的标准差均小于 0.5 , 说明分辨 10倍稀释浓度的能力很强， 反映出定量 PCR反应的效果较好。
图 1显示了根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应的扩增曲线图，其中图 1A 显示了使用商品化荧光定量 PCR反应体系 （对比例 1 ) 进行荧光定量 PCR反应的扩增 曲线， 图 1B显示了使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) 的荧光定量 PCR反应的扩增曲线， 图 1C显示了使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ) 的荧光定量 PCR反应的扩增曲线， 图 1D显示了使用根据 本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ) 的荧光定量 PCR反应的扩增 曲线。 在图 1 中， 横坐标均为循环数， 纵坐标均为荧光强度。 从图 1可以看出， 扩增曲 线拐点清楚， 指数期明显， 扩增曲线整体平行性很好， 基线平稳。 但是， 图 1B、 C、 D扩 增曲线指数期的斜率比图 1A扩增曲线指数期的斜率要大。 曲线指数期斜率， 反应了扩增效 率， 越大说明扩增效率越高， 扩增曲线从侧面反映了本发明的荧光定量 PCR反应液的有益 效果。
图 2显示了根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应的标准曲线图， 其中， 图 2A显示了使用商品化荧光定量 PCR反应体系（对比例 1 )进行荧光定量 PCR反应的标 准曲线，图 2B显示了使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 1 (实验例 1 ) 的荧光定量 PCR反应的标准曲线， 图 2C显示了使用根据本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 2 (实验例 2 ) 的荧光定量 PCR反应的标准曲线， 图 2D显示了使用根据 本发明一个实施例的荧光定量 PCR反应体系 3 (实验例 3 ) 的荧光定量 PCR反应的标准 曲线。 在图 2中， 横坐标均为样品起始浓度 (单位是 pM), 纵坐标均为 CT值。 图 2是 经过软件 StepOne Plus ( ABI公司）计算得到的结果， 由图 2可知釆用商品化荧光定量 PCR 反应体系的荧光定量 PCR扩增效率为 86.73%, 釆用含有本发明荧光定量 PCR反应液的 3 种反应体系 1、 2、 3 (即实验例 1、 2、 3 )的荧光定量 PCR扩增效率分别为 99.31%、 97.96% 和 99.49%, 接近 100%。 说明本发明的荧光定量 PCR反应液能够有效地提高扩增效率。 工业实用性
本发明的一种荧光定量 PCR反应液、 一种试剂盒、 一种荧光定量 PCR方法以及一 种对核酸进行定量的方法， 能够有效地应用于荧光定量 PCR反应，并能够对核酸进行精确 定量。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中， 参考术语 "一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或 者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书
1、 一种荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 包含 PCR反应增强剂，
其巾，
所述 PCR反应增强剂为选自二曱亚砜、 甘油、 牛血清白蛋白、 曱酰胺、 非离子去污剂、 聚乙二醇、 亚精胺、 硫酸铵和甜菜碱的至少一种。
2、根据权利要求 1所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 所述聚乙二醇为聚乙二 醇 6000。
3、根据权利要求 1所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 其包含二曱亚砜、 牛血 清白蛋白和甜菜碱。
4、 根据权利要求 1所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 进一步包含耐热 DNA 聚合酶， 所述耐热 DNA聚合酶具有 5'-3'聚合酶活性和 5'-3'外切酶活性。
5、 根据权利要求 4所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 所述耐热 DNA聚合酶 进一步具有 3'-5'外切酶活性。
6、 根据权利要求 4所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 所述耐热 DNA聚合酶 为 Ex Taq™ DNA聚合酶。
7、 根据权利要求 4所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 所述耐热 DNA聚合酶 为热启动 DNA聚合酶。
8、 根据权利要求 7所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 所述热启动 DNA聚合 酶为 Ex Taq™热启动 DNA聚合酶。
9、 根据权利要求 1所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 包含：
10-67 mM H 8.2-9.0 Tris-HCl;
25-50 mM KC1;
1.5-5.0 mM Mg2+;
0.2-0.4mM dNTP;
0.05质量％-0.1质量％ Tween 20;
1质量％-10质量％二曱亚砜；
0.1 μ§/μ1 - 1 μ§/μ1牛血清白蛋白；
0.5-2Μ甜菜碱； 和
0.04-0.2υ/μ1热启动 DNA聚合酶。
10、 根据权利要求 9所述的荧光定量 PCR反应液， 其特征在于， 包含：
2.5-3 mM Mg ;
I.2质量％-5质量％二曱亚砜；
0.1-0.8μ§/μ1牛血清白蛋白；
1-1.2Μ甜菜碱; 和
0.05-0.07υ/μ1热启动 DNA聚合酶。
II、一种试剂盒，其特征在于， 包含权利要求 1-10任一项所述的荧光定量 PCR反应液。
12、 一种荧光定量 PCR方法， 其特征在于， 所述方法包括使用权利要求 1-10任一项所 述的荧光定量 PCR反应液。
13、 一种对核酸进行定量的方法， 其特征在于， 包括：
利用权利要求 12所述的荧光定量 PCR方法对所述核酸进行定量。
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