WO2012057567A2 - Klotho 유전자를 포함하는 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법 - Google Patents

Klotho 유전자를 포함하는 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법 Download PDF

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a kit for screening skin active materials and a method for searching for skin active materials using the same, and more specifically, to express klotho gene expression in skin cells by using a search kit including an ldotho gene known as a longevity gene.
  • the present invention relates to a skin active material search kit that searches for skin active substances such as anti-aging substances and whitening moles by separating and purifying candidate substances, and a method of searching for skin active substances using the same.
  • an object of the present invention is to provide a search kit for screening a skin active substance through the expression of klotho gene in skin cells and a method for searching for a skin active substance using the same.
  • the present invention comprises a Klotho protein gene, a primer for amplifying the Klotho protein gene of SEQ ID NO: 1.2, a probe of SEQ ID NO: 3, and skin cells.
  • a search kit for searching for skin active substances by screening for substances that increase the expression level of Klotho protein in the skin cells is provided.
  • the present invention provides a method for searching the skin active material using the search kit.
  • the dermal actives search kit according to the present invention is an anti-aging medulla through the expression of klotho gene in skin cells. Skin actives such as whitening substances and moisturizing moles could be screened quickly and easily.
  • La human embryonic kidney cells (lffiK293). Keratinocytes (NI1K) and Fibroblasts (NI1K).
  • HEK293 human non 1 st kidney cells. This graph shows the results of quantitative real-time PCR confirming Klotho protein expression levels in keratinocytes (NHK) and fibroblasts (NHF).
  • FIG. 3 is a graph showing quantitative real-time PCR results confirming Klotho protein expression levels on days 2 and 8 after treatment of retinoic acid (RA) and retinol (R0L: retinol) on keratinocytes.
  • RA retinoic acid
  • R0L retinol
  • Figure 4 is a graph showing the decrease in Klotho gene expression level in human neonatal epithelial keratinocytes (HFJ0) knocked down Klotho gene.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the change in the expression level of MMP-9 in human neonatal epithelial keratinocytes (HEK) knocked down Klotho gene.
  • Figure 6 shows the result of confirming the change in MMP-9 activity by treatment of recombinant Klotho protein to human neonatal epithelial keratinocytes (HEK).
  • Figure 7 lug / ml recombinant Klotho protein in human neoplastic keratinocytes (HEK). The result of confirming the change of HAS2 mRNA expression level after 8 days after 0-.5ug / ml treatment was 8 days.
  • Figure 8 is a graph showing the results of confirming the change in the expression level of 1) 21 in human neonatal dermal fibroblasts (HDF) knocked down the Klotho gene.
  • the present invention relates to a method that can detect the expression level of Klotho protein in skin cells, and through this screening a substance capable of inducing the expression of Klotho protein, a longevity gene in skin cells, can search for skin active substances .
  • the skin active substance is an anti-aging substance that improves skin wrinkles or elasticity or improves rough skin, brightens or blemishes skin tone. It may include both whitening and moisturizing substances that improve skin pigmentation such as freckles, skin blemishes and sunburn.
  • correction Sheet (Rule 91) ISA / KR Klotho protein gene.
  • An anti-aging substance can be searched for by screening a substance consisting of a probe of SEQ ID NO: 3 (Table 1 saliva-crude) and skin cells, which increase the expression level of Klotho protein in the skin cells.
  • the skin cells may be normal keratinocytes (NHK), fibroblasts (NHF: normal human fibroblasts) or melanocytes (N11M: norma 1 human melanocyte)- It is not limited to this.
  • NHK normal keratinocytes
  • NHL normal human fibroblasts
  • N11M norma 1 human melanocyte
  • the present invention relates to a method of searching for skin active substances through a step of confirming whether Klotho protein is expressed after treating candidate skin cells, and separating and purifying the material rate to increase Klotho protein expression.
  • Fibroblasts (NHF), NHM—promoblac Normal Human Epidermal Melanocytes (NHEM) juvenile foreskin, gall-derived delanocyte-forming cells, Promocell), NHHHDP ( ⁇ -dark pigment; hookin-derived melanocytes, Invitrogen) and NHM—MP (NHM) RT-PCR was used to detect the presence of Klotho mRNA in cDNA of moderate pigments (Asian-derived melanocytes, Invitrogen). At this time, PCR reaction conditions were performed by repeating the cycle of denaturation for 30 seconds at 94 ° C, annealing for 30 seconds at 551: and expansion for 60 seconds at 72 ° C.
  • HEK Human neonatal epithelial keratinocytes (HEK: Lonza. NHEK—Neo-Neonatal Normal Human Epidermal Kerat inocytes.Pooled) in 6-wel medium (KBM ⁇ gold, Lc za)
  • HEK Human neonatal epithelial keratinocytes
  • HEK Human neonatal epithelial keratinocytes
  • Human Epidermal Kerat inocytes Pooled were dispensed in 6—well with 5xl () 4 in medium (KBM-gold) and incubated at 37 ° C for 24 hours, followed by preparation of Klotho protein (R & D systems, Recombinant Human Klotho). lug / ml was incubated for 8 days. As a control, HEK without Klotho protein was used.
  • the cultured HEK culture was loaded on gelatin gel, and the results are shown in FIG. 6 through zymography.
  • hyaluronic acid synthase2 a hyaluronic acid synthase known as skin moisturizing factor
  • human neonatal epithelial keratinocytes Longza, NHEK-Neo-Neonatal Normal
  • Human Epidermal Kerat inocytes was treated with recombinant Klotho protein to observe HAS mRNA expression.
  • HEK Human neonatal keratinocytes
  • RM was extracted from the cultured HEK using RNeasy mini ki qiagen), and cDNA was synthesized by RT-PCR using Superscript III kit (invitrogen). Quantitative real-time PCR was performed using a probe for HAS2 (TaqMan® Gene Expression Assays) to observe the expression of HAS2 mRNA and the results are shown in FIG. 7.
  • HAS2 mRNA expression was decreased in the control group Reference Example 4, which was untreated on Day 8, than Reference Example 1, which was not treated on Day 2.
  • Reference Example 5 the recombinant Klotho protein treatment group on day 8, it can be seen that the expression of MS2 mRNA was significantly increased compared to Reference Example 1 on the second day untreated control group.
  • the decrease in the expression of MS2 mRNA in Reference Example 4 than in Reference Example 1 appears to occur during HEK differentiation and keratinization, and it can be seen that the recovery of reduced HAS2 at 8 days by recombinant klotho protein treatment, It can be seen that klotho protein plays a role in restoring the epidermis's moisturizing ability.
  • Test Example 7 Increased expression of p21 in human neonatal dermal islet cells (HDF) knocked down Klotho gene
  • RNAiMAX small interfering RNA
  • GIBC0 0PTI-MEM
  • RNAiMAX transfection reagent
  • SEQ ID NO: 1 and 2 is the DNA sequence of the primer for amplification of Klotho protein gene.

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Abstract

본 발명은 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장수유전자로 알려진 Klotho 유전자를 포함하는 탐색 키트를 이용하여 피부 세포에서 Klotho 유전자 발현을 유도하는 후보물질을 분리, 정제함으로써 보습, 항노화 물질 및 미백물질 등의 피부 활성물질을 탐색해 내는 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
Klotho 유전자를 포함하는 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피 부 활성물질을 탐색하는 방법
【기술분야】
본 발명은 피부 활성물질 탐색용 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐 색하는 방법에 관한 것으로， 보다 상세하게는 장수유전자로 알려진 ldotho 유전자 를 포함하는 탐색 기트를 이용하여 피부 세포에서 klotho 유전자 발현을 유도하는 후보물질올 분리， 정제함으로써 항노화 물질 및 미백몰질 등의 피부 활성물질을 탐 색해 내는 피부 활성물질 탐색용 기트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법에 관한 것이디-.
【배경기술】
피부는 나이가 들거나 태양광에 노출됨으로써 노화가 진행된디-. 노화가 진행 됨에 따라 표피의 각질층이 떨어져 교체되는데 더 많은 시간이 소요되어 각질충이 두꺼워지고， 진피는 탄력 섬유와 보습성분들의 함량이 떨어지거니- 배열이 바뀌게 되어 탄력과 수분 함유량이 떨어지면서 주름이 생기게 된다. 지금까지 피부 노화의 원인 중 하나인 광노화를 막기 위해서 자외선 조사에 의한 피부의 변화를 예방할 수 있는 방법들이 활발히 연구되어 왔다. 또한 나이가 들어감에 따른 노화. 즉 유 전적으로 조절되고 있는 노화를 막기 위한 방법들도 연구되어 왔으며. 이러한 노력 돌은 결국 노화를 총괄하여 조절하는 기전을 찾는 것에 집증되고 있다.
Klotho 유전자에 대한 연구는 그러한 노력 중에 하나이디-. Klotho 유전자가 넉아웃 (knock-out)된 마우스는 1,25(0H)2D3 농도 상승과 연관된 동맥경화, 혈관석회 화. 연조직 석희화. 폐기종. 활동저하. 생식선 형성이상, 불임. 피부위축. 운동실 조증. 저혈당증 및 고인산혈증을 나타낸다 (Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 1997； 390. 45-51). 반대로 klotho 단백질의 발현이 증가되면 수명증기-. 인슐린 저항성 증가 및 IGF-1 저항성 증가 등이 나타난다 (Kurosu et al.. 2005). 사람에서도 Klotho 단백질의 단일염기 다형성은 수명단축， 골다공증， 뇌졸중 및 관상등맥질환과 연관되어 있음이 보고되 었다 (Arking et al.. 2002. Kawano et al, , 2002; Mull in et al., 2005. Ogata et al., 2002; Yamada et al., 2005).
기존의 연구에 따르면 klotho는 사람의 신장에서 주로 발현되며 태반， 전립
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 선 및 소장에서도 발현된다고 한다-. 하지만 Klotho 에 대한 중요성이 증대되고 있 는 상황에서 현재까지 피부 세포, 즉 각질형성세포 (normal human kerat inocyte) , 섬유아세포 (fibroblast) 또는 델라닌형성세포 (melanocyte)에서 klotho가 발현된다 는 보고는 아직 없었으며 따라서 klotho 발현을 증가시킬 수 있는 물질에 대한 연 구도 이루어지지 않은 상황이디-.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 피부 세포에서 klotho 단백질의 발현을 증가시킬 수 있 는 기트를 제작하고 이를 이용하여 각질형성세포， 섬유아세포 및 멜라닌형성세포 등의 피부 세포에서 klotho 단백질의 발현을 확인함으로써 항노화 물질 및 미백 물 질 등의 피부 활성물질을 탐색할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 피부 세포에서 klotho 유전자 발현 여부를 통해 피부 활성물질을 스크리닝하기 위한 탐색 키트 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기한 목적올 달성히-기 위하여， 본 발명에서는 Klotho 단백질 유전자， 서열 번호 1.2의 Klotho 단백질 유전자 증폭용 프라이머， 서열번호 3의 프로브 및 피부 세포로 구성되고. 상기 피부세포에서 Klotho 단백질의 발현량을 중가시키는 물질을 스크리닝함으로써 피부 활성물질을 탐색하는 탐색 키트를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 탐색 기트를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법을 제공한다.
【유리한 효괴-】
본 발명에 의한 피부 활성물 탐색 키트는 피부 세포에서 klotho 유전자의 발 현 여부를 통해 항노화 몰질. 미백 물질 및 보습 몰질과 같은 피부 활성물질을 신 속하고 간편하게 스크리닝할 수 있었다.
【도면의 간단한 설명】
도 la 는 사람 배아 신장 세포 (lffiK293). 각질형성세포 (NI1K) 및 섬유아세포
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR (NHF)에서 Klotho 단백질 빌 -현을 확인한 RT-PCR 증폭 결과롤 보여주며， 도 lb는 사 람의 멜라닌형성세포에서 Klotho 단백질 발현을 확인한 RT-PCR 증폭 결과를 보여준 다. 이때 NHM-promoblack 및 NfflHF는 혹인 유래 멜라닌형성세포이고， NHM-MP는 동 양인 유래 멜라닌형성세포이다.
도 2는 사람 비 1아 신장 세포 (HEK293). 각질형성세포 (NHK) 및 섬유아세포 (NHF)에서 Klotho 단백질 발현량을 확인한 quantitative real-time PCR결과를 보여 주는 그래프이다.
도 3은 각질형성세포에 레티노산 (RA: retinoic acid) 및 레티놀 (R0L: retinol)을 처리한 후 이틀째 및 8일째 Klotho 단백질 발현량을 확인한 quantitative real-time PCR 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 Klotho 유전자를 넉다운시킨 사람 신생아 상피 각질형성세포 (HFJ0에 서 Klotho유전자 발현량 감소 ¾ 보여주는 그래프이디-.
도 5는 Klotho 유전자를 넉다운시킨 사람 신생아 상피 각질형성세포 (HEK)에 서 MMP-9의 발현량 변화를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 사람 신생아 상피 각질형성세포 (HEK)에 재조합 Klotho단백질을 처리 하여 MMP-9활성 변화를 확인한 결과이디-.
도 7은 사람 신생이ᅳ 각질형성세포 (HEK)에 재조합 Klotho 단백질을 lug/ml. 0-.5ug/ml 처리하고 이틀째， 8일 후의 HAS2 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과롤 보 여주는 그래프이다.
도 8는 Klotho 유전자를 넉다운시킨 사람 신생아 진피 섬유아세포 (HDF)에서 1)21의 발현량 변화를 확인한 결과를 보여주는 그래프이디-.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명은 피부 세포에서 Klotho 단백질의 발현량을 탐색할 수 있는 방법에 관한 것이며， 이를 통해 피부 세포에서 장수유전자인 Klotho 단백질의 발현을 유도 할 수 있는 물질을 스크리닝함으로써 피부 활성물질을 탐색할 수 있디. 상기 피부 활성물질은 피부 주름 또는 탄력을 개선시기거나 거친 피부를 개선시키는 항노화 물질, 피부톤을 밝게 해주거나 기미. 주근깨， 피부 잡티 및 태양 광선에 의한 피부 그을림 등의 피부 색소 침착 현상을 개선시켜 주는 미백 물질 및 보습물질을 모두 포함할 수 있다.
피부 세포에서 Klotho 단백질의 발현량율 탐색할 수 있는 본 발명의 탐색 키
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 트는 Klotho 단백질 유전자. 서열번호 1,2의 Klotho 단백질 증폭용 프라이머. 서열 번호 3의 프로브 (표 1 침 -조) 및 피부 세포로 구성되고， 상기 피부세포에서 Klotho 단백질의 발현량을 증가시키는 물질올 스크리닝함으로써 항노화 물질을 탐색할 수 있다.
【표 1]
Figure imgf000006_0001
본 발명의 일 실시예에서 상기 피부 세포는 인간 각질형성세포 (NHK: normal human kerat i oocytes) , 섬유아세포 (NHF: normal human fibroblasts) 또는 멜라닌형 성세포 (N11M: norma 1 human melanocyte)일 수 있으니-, 이에만 한정되는 것은 아니 다. 또한 본 발명은 상기 탐색 키트를 이용하여，
피부 세포에 후보물질을 처리한 후 Klotho 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계 및 Klotho 단백질의 발현을 증가시기는 물질율 분리 및 정제하는 단계를 거쳐 피부 활성물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 탐색 키트를 이용하여 항노화 물질로 알려 진 레티노산과 레티놀이 Klotho 단백질 발현을 증가시기는 것을 확인하고 본 발명 에 의한 탐색 방법이 아직 알려지지 않은 항노화 물질 및 피부 활성물질을 스크리 닝하는데 적합한 것임을 확인하였다. 이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한 다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는- 것일 뿐 본 발명의 권리범위기- 이들 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고， 당업계에서 통상적으 로 주지된 변형. 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며. 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다ᅳ
【발명의 실시를 위한 형태】
[시험예 1] 피부 세포에서 klotho의 발현 여부
피부 세포에서 Klotho 단백질이 발현되는지를 알아보기 위하여ᅳ klotho 유전
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 자 (NCBI 기탁번호: NM_004795)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1，2 프라이머를 제작 한 후 상기 프라이머 쌍과 서열번호 3의 프로브 (TaqMan' fluorogenic probe)를 이 용하여 각질형성세포 (NHK). 섬유아세포 (NHF), NHM—promoblac Normal Human Epidermal Melanocytes (NHEM) juvenile foreskin, 혹인 유래 델라닌형성세포， Promocell), NHHHDP (匪 -dark pigment; 훅인 유래 멜라닌형성세포, Invitrogen) 및 NHM—MP(NHM— moderate pigment; 동양인 유래 멜라닌형성세포， Invitrogen)의 cDNA에 서 Klotho mRNA를 검출할 수 있는지 RT-PCR로 관찰하였다. 이때， PCR 반웅조건은 94°C에서 30초간 변성， 551：에서 30초간 어닐링 및 72°C에서 60초간 확장하는 사이 클을 35회 반복하여 수행하였다. 양성대조군으로 기존에 Klotho 유전자가 발현된다 고 알려진 사람 비ᅵ아 신장 세포인 HEK293(human embryonic kidney) 세포의 cDNA를 이용하였고. 그 결과를 도 la 및 lb에 나타내었디ᅳ. 도 ]a 및 lb의 결과에서， 본 발 명에서 사용한 각질형성세포， 섬유아세포 및 멜라닌형성세포에서 모두 Klotho 유전 자가 발현되는 것을 확인하였다.
또한 Klotho mRNA가 각 세포에서 빌 -현된 양을 quantitative real-time PCR로 확인한 결과를 도 2에 나타내었디-.
[시험예 2] 레티노산 (RA) 및 레티놀 (R0L)이 처리된 각질형성세포에서 Klotho mRNA발현량 조사
항노화 물질로 잘 알려진 레티노산과 레티놀이 각질형성세포에서 Klotho 발 현에 미치는 영향을 알아보기 위하여， 상기 시험예 1과 동일한 조건에서 quantitative real time PCR을 수행하였으며, 상기 레티노산 0.1 및 1 μ M과 레티 놀 1 및 10 μΜ을 각각 처리한 후 이를째 및 8일째 Klotho 단백질 발현량을 조사하 였으며 , 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에서, 레티노산과 레티놀을 처리한 8일째에 Klotho 단백질 발현 량이 현격하게 증가하는 것을 확인하였다.
[시험예 3] 사람신생아 상피 각질형성세포 (HEK)에서 Klotho유전자 넉다운 (knock down)
*사람 신생아 상피 각질형성세포 (HEK: Lonza사. NHEK— Neo-Neonatal Normal Human Epidermal Kerat inocytes. Pooled)를 6-wel 배지 (KBM一 gold, Lc za사)에
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 1x10 씩 분주하여 37°C에서 24시간 동안 배양하여 배지를 버리고， 0ΡΉ-ΜΕΜ 배지 (GIBCO사)로 교환한 후. Klotho 유전자에 상보적 서열을 갖는 siRNA(small interfering RNA; Dharmacon사. ON-TARGET J/WS) ΙΟΟηΜ과 트랜스펙션 시약 (R iMAX, invitrogen사) lOul를 혼합하여 0PT1-MEM 배지 (GIBC0사)에서 20분간 37T:에서 배양 한 것을 첨가하여 37t에서 6시간 배양하고, DMEM 배지에서 37^로 4일간 유지시켰 다. 대조군으로는 아무것도 타겟팅하지 않는 siRNA를 처리한 HEK 세포 (도 4의 sc) 와 siRNA를 넣지 않고 트랜스펙션 시약 (RNAiMAX) 만을 처리한 HEK 세포 (도 4의 VC) 를 사용하였다.
ts> Klotho 유전자 넉다운 여부 확인을 위해 상기 시험예 1과 동일 조건에서 quantitative real time PCR를 수행하여 결과를 도 4에 나타내었다.
t6> 도 4의 결과에서 siRNA와 트랜스펙션 시약을 첨가한 경우에 Klotho 유전자 발현이 현저하게 감소함을 확인할 수 있다. is> [시험예 4] Klotho유전자를넉다운 (knock down)시킨사람신생아상피 각질 형성세포 (HEK)에서 MMP-9의 발현양증가
»> 콜라겐을 분해하여 노화를 일으키는- 인자로 알려진 MMP— 9에 klotho 단백질이 미치는 영향을 알아보기 위하여 kiotho 유전자— ¾ 넉다운시킨 사람 신생아 상피 각 질형성세포 (Human neonatal epidermal kerat inocyte, Hffi)에서 MMP-9의 발현양 변 화를 RT— PCR로 관찰하였다.
»> 사람 신생이 · 상피 각질형성세포 (HEK: Lonza사의 NHEK—Neo— Neonatal Normal
Human Epidermal Kerat inoc tes, Pooled)¾- 6_well에 배지 (匪一 gold, Lonza사)에 lxlO3 씩 분주하여 37°C에서 24시간 동안 배양하여 배지 — 버리고， 0ΡΉ-ΜΕΜ 배지 (GIBC0사)로 교환한 후, Klotho 유전자에 상보적 서열을 갖는 siRNA(small interfering RNA; Dharmacon사， ON-TARGETp/ws) ΙΟΟηΜ과 트랜스펙션 시약 (RNAiMAX, im'itrogen사) lOul를 혼합하여 0PT1-MEM 배지 (GIBC0사)에서 20분간 37"C에서 배양 한 것을 첨가하여 37°C에서 6시간 배양하고， DMEM 배지에서 371C로 4일간 유지시켰 다. 대조군으로는 아무것도 타겟팅하지 않는 siRNA를 처리한 HEK 세포 (도 5의 ΗΕΚη sc)와 siRNA를 넣지 않고 트랜스펙션 시약 (RNAiMAX) 만올 처리한 HEK 세포 (도 5의 IffiKn VC)를 사용하였디-.
;ι> 배양된 HEK 세포로부터 RNeasy mini kit(qiagen사)를 이용하여 RN/！를 추출하
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 여, Superscript III kit ( invitrogen사)로 RT—PCR 을 수행하여 cDNA를 합성하였 다. MMP— 9에 대한 프로브 (TaqMan® Gene Expression Assays)를 사용하여 quant itiative real-time PCR을 수행하여 MMP-9 niRNA 발현 양상올 관찰하였으며 결 과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과에서 Klotho의 발현양을 낮춘 Hffi에서 MMP-9 의 발현양이 증가 하는 것을 볼 수 있으며， 이를 통해 낮추어진 Klotho의 발현양이 MMP-9의 활성을 증가시켜 피부노화를 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.
[시험예 5] 재조합 Klotho 단백질을 처리한사람 신생아상피 각질형성세포 (HEK)에서 MMP-9활성 감소
사람 신생아 상피 각질형성세포 (HEK; Lonza, NHEK-Neo-Neonatal Normal
Human Epidermal Kerat inocytes, Pooled)를 6— well에 배지 (KBM-gold)에 5xl()4씩 분 주하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후， 재조함 Klotho 단백질 (R&D systems, Recombinant Human Klotho) lug/ml 을 처리하여 8일간 배양하였디-. 대조군은 Klotho 단백질을 처리하지 않은 HEK를 사용하였다.
배양된 HEK 배양액을 젤라틴 겔에 로딩하여 zymography를 통해 결과를 도 6 에 나타내었다.
도 6의 결과에서 재조합 Klotho 단백질을 공급한 HEK에서 대조군에 비해 MMP-9의 활성이 감소한 것을 확인할 수 있디-. 이를 통해 klotho 단백질이 공급되어 MMP-9 활성이 감소하는 것으로 인해 ¾라틴 분해가 감소되어 기저막 유지 효과를 가짐을 알 수 있다.
[시험예 6] 재조합 Klotho 단백질을 처리한사람 신생아상피 각질형성세포 (HEK)에서 HAS2 mRNA발현증가
피부 보습 인자로 알려진 히알루론산의 합성효소인 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase2, MS2)의 발현에 대한 Klotho 단백질의 영향을 알아보 기 위하여 사람 신생아 상피 각질형성세포 (Lonza, NHEK-Neo-Neonatal Normal Human Epidermal Kerat inocytes, Pooled)에 재조합 Klotho 단백질을 처리하여 HAS mRNA 발현양상을 관찰하였다.
사람 신생아 각질형성세포 (HEK) (Lonza, NHEK-Neo-Neonatal Normal Human
Epidermal Kerat inocytes, Poo led)를 ( vell 배지 (KBM-gold)에 2xK)a씩 3well,
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 5x10씩 3well로 분주하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후. 재조합 Klotho 단백질 을 표 2와 같이 각각 1， 0.5ug/ml 농도로 처리하여 2일， 8일간 37°C 에서 배양하였 다.
【표 2]
Figure imgf000010_0001
배양된 HEK로부터 RNeasy mini ki qiagen사)를 이용하여 RM를 추출하여, Superscript III kit (invitrogen 사)로 RT— PCR 을 수행하여 cDNA를 합성하였다. HAS2에 대한 프로브 (TaqMan® Gene Expression Assays)를 사용하여 quant i t iat ive real-time PCR을 수행하여 HAS2 mRNA 발현 양상을 관찰하였으며 결과를 도 7에 나 타내었디-.
도 7의 결과에서 2일째의 무처리 대조군인 참고예 1 보다 8일째 무처리 대조 군인 참고예 4의 경우에 HAS2 mRNA 발현이 감소되었으며. 8일째의 재조합 Klotho 단백질 처리군인 참고예 5에서 2일째 무처리 대조군 참고예 1 보다 MS2 mRNA 발현 이 현저히 증가한 것올 확인할 수 있다. 이를 통해 참고예 4가 참고예 1보다 MS2 mRNA 발현이 감소되는 것은 HEK가 분화되어 각질화 되는 과정에서 일어나는 현상으 로 보이며, 재조합 klotho 단백질 처리에 의해 8일째에 감소된 HAS2를 회복시키는 것으로 미루어보아, klotho 단백질은 표피층의 보습력을 회복시키는 역할을 하는 것을 알 수 있다.
[시험예 7] Klotho 유전자를 넉다운 (knock down)시킨 사람신생아 진피 섬 유아세포 (HDF)에서 p21의 발현양증가
노화가 진행될수록 발현양이 증가되는 것으로 알려진 p21에 klotho 단백질이 미치는 영향을 알아보기 위하여， klotho 유전자를 넉다운시킨 사람 신생아 진피 섶 유아세포 (Human neonatal derma 1 fibroblast, HDF)에서 p21의 빌 -현양 변화를 RT- PCR로 관찰하였디-.
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 사람 신생아 진피 성유아세포 (Lonza사, Nffl -Ne으 Neonatal Human Dermal Fibroblasts)!- 60翻 디쉬에 배지 (DMEM)를 이용하여 2x10°씩 분주하여 37°C에서 24 시간 동안 배양하여 배지를 버리고， 0PTI-MEM비ᅵ지 (GIBC0사)로 옮긴 후， Klotho유 전자에 상보적 서열올 갖는 siRNA(small interfering RNA; Dharmacon사， ON一 i GElpJus) ΙΟΟηΜ과 트랜스펙션 시약 (RNAiMAX, invitrogen사) 10ul을 혼합하여 0PT1-MEM 배지 (GIBC0사)에서 20분간 37T에서 배양한 것을 첨가하여 37¾에서 6시 간 배양하고, DMEM 배지에서 3Π:로 4일간 유지시켰다. 대조군으로는 아무것도 타 겟팅하지 않는 siRNA를 처리한 HDF 세포 (도 8의 llDFn sc)와 si RNA를 넣지 않고 트 랜스펙션 시약 (RNAiMAX) 만을 처리한 I1DF세포 (도 8의 HEKn VC)를 사용하였다. 배양된 HDF로부터 RNeasy mini kit (qiagen사)를 이용하여 RNA를 추출하여, Superscript 111 kit (invitrogen 사)로 RT-PCR 을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 노화 마커인 p21에 대한 프로브 (TaqMan® Gene Expression Assays)롤 사용하여 quant itiative real-time PCR을 수행하여 p21 rnRNA 발현 양상을 관찰하였으며 결과 를 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과에서 대조군에 비해 klotho유전자를 넉다운 시킨 경우 p21의 발 현양이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Klotho가 피부 진피 섬유아세포의 노 화를 억제하는 역할을 수행하는 것을 알 수 있다.
【서열목록 프리텍스트】
서열번호 1 및 2는 Klotho단백질 유전자 증폭용 프라이머의 DNA 염기서열이 며. 서열번호 3의 TacjMan fluorogenic프로브의 DNA염기서열이다.
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
Klotho단백질 유전자 서열번호 1，2의 Klotho 단백질 유전자 증폭용프라이 머， 서열번호 3의 프로브 및 피부 세포로 구성되고，
상기 피부세포에서 Klotho 단백질의 발현량올 증가시키는 물질을 스크리닝함 으로써 피부 활성물질올 탐색하는 탐색 키트. .
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 피부 활성물질은 보습， 항노화물질 또는 미백 물질 임을 특징으로 하는 탐색 키트.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 피부 세포는 인간각질형성세포， 섬유아세포 또는 멜 라닌형성세포인 것을 특징으로 하는 탐색 키트.
【청구항 4】
제 1항 내지 제 3항 증 어느 한 항에 의한 탐색 키트를 이용하여, 피부 세포에 후보물질을 처리한 후 Klotho 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계; 및
Klotho 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 분리 및 정제하는 단계를 거쳐 피부 활 성물질을 탐색하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2975410A4 (en) * 2013-03-13 2016-08-24 Amorepacific Corp PROCESS FOR SCREENING AFTER A SUBSTANCE WITH LIGHTENING EFFECT

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102012166B1 (ko) * 2012-11-20 2019-08-20 (주)아모레퍼시픽 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법
KR102045247B1 (ko) * 2013-01-08 2019-11-15 (주)아모레퍼시픽 피부 면역세포를 이용하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 키트
KR102053775B1 (ko) * 2013-07-23 2019-12-09 (주)아모레퍼시픽 미토콘드리아 역동성을 이용한 미백 물질 스크리닝 방법 및 이를 이용한 키트
CN106868089B (zh) * 2015-12-11 2020-02-28 上海家化联合股份有限公司 一种利用皮肤成纤维细胞钾离子通道评价抗衰老功效的方法
KR102692717B1 (ko) * 2016-09-23 2024-08-08 (주)아모레퍼시픽 Tnfrsf14 억제 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 tnfrsf14 억제 물질의 스크리닝 방법
CN114622024A (zh) * 2020-12-08 2022-06-14 复旦大学 用于皮肤分型的标志物组合及其应用

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07112966B2 (ja) * 1986-03-26 1995-12-06 鐘紡株式会社 皮膚化粧料
EP1210426A2 (en) * 1999-09-10 2002-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polymorphisms in a klotho gene
AU2003211453A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-09 Nihon Kefir Co., Ltd. External compositions for the skin
JP2003334088A (ja) * 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
JP2006508666A (ja) * 2002-12-10 2006-03-16 オタワ ヘルス リサーチ インスティテュート カスパーゼ３活性調節による幹細胞分化の調節
KR100485326B1 (ko) * 2002-12-26 2005-04-27 주식회사 태평양 진세노사이드 화합물 ｋ로 이루어진 히알루론산 생성촉진제
JP2005089427A (ja) * 2003-09-22 2005-04-07 Kose Corp 皮膚外用剤
JP4541728B2 (ja) * 2004-03-09 2010-09-08 株式会社コーセー 皮膚外用剤
JP4587755B2 (ja) * 2004-09-17 2010-11-24 丸善製薬株式会社 抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤、並びに皮膚化粧料
JP2006158339A (ja) * 2004-12-09 2006-06-22 Kyoto Univ βＫｌｏｔｈｏ遺伝子、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子、及びそれらの利用
JP2006290742A (ja) * 2005-04-05 2006-10-26 Kyoei Kagaku Kogyo Kk 老化防止化粧料
CN101248192B (zh) * 2005-08-23 2013-02-20 株式会社芳珂 皮肤老化标记物及其利用技术
JP5027528B2 (ja) * 2006-03-02 2012-09-19 株式会社ファンケル 皮膚老化の検査方法
CN1880480A (zh) * 2006-04-12 2006-12-20 重庆医科大学 检测等位基因特异引物－pcr方法及其在检测克老素基因多态性中的应用
JPWO2007132867A1 (ja) * 2006-05-15 2009-09-24 杉本　芳一 癌の予防及び治療剤
JP5219344B2 (ja) * 2006-06-16 2013-06-26 三省製薬株式会社 皮膚外用剤
KR100835747B1 (ko) * 2006-08-25 2008-06-09 고려대학교 산학협력단 노화 관련 Ｍｒｅ11 단백질 및 이를 이용한 노화조절 방법
FR2908654B1 (fr) * 2006-11-20 2014-04-04 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type chitinase
JP4819727B2 (ja) * 2007-03-19 2011-11-24 株式会社コーセー 美白成分のスクリーニング方法
JPWO2008143145A1 (ja) * 2007-05-15 2010-08-05 株式会社Ａｎｂａｓ 皮膚保湿作用の評価方法、およびこれを用いた保湿物質のスクリーニング方法
KR100840144B1 (ko) * 2007-05-17 2008-06-23 경상대학교산학협력단 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법
FR2924613B1 (fr) * 2007-12-10 2012-12-21 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type hsp27.
FR2924947B1 (fr) * 2007-12-18 2010-03-19 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type calmodulin-like skin protein clsp
TW200936156A (en) * 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US20090226901A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-10 Kao Corporation Method of evaluating or selecting agents for preventing or improving pigmented spots
JP2010115131A (ja) * 2008-11-12 2010-05-27 Kao Corp 肌評価方法及び皮膚老化改善剤・皮膚老化予防剤のスクリーニング方法
WO2010065567A2 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Lifespan Extension Llc Methods and compositions for altering health, wellbeing, and lifespan
FR2940976B1 (fr) * 2009-01-13 2017-11-03 Oreal Utilisation a des fins de criblage d'actifs anti-ages de formes solubles de la proteine de type desmogleine i
CN101845482A (zh) * 2009-03-23 2010-09-29 上海芯超生物科技有限公司 一种女性皮肤美容基因检测芯片及其检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE, vol. 390, 1997, pages 45 - 51

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2975410A4 (en) * 2013-03-13 2016-08-24 Amorepacific Corp PROCESS FOR SCREENING AFTER A SUBSTANCE WITH LIGHTENING EFFECT

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