WO2012052586A1 - Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales - Google Patents

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales Download PDF

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WO2012052586A1
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Oscar Landeta Elorz
Beatriz Velasco Michelena
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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention falls within the area of biotechnology and specifically in the diagnosis of gastrointestinal diseases.
  • the object of the invention is a quick and simple method of detecting fecal lactoferrin (hLf) and calprotectin (hCp) as markers for the diagnosis of inflammatory bowel disease (IBD), infectious diarrhea (ID) and colorectal cancer (CRC ).
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • IC non-specific or indeterminate type of colitis
  • IBD Inflammatory processes such as IBD are usually associated with the presence of leukocytes.
  • leukocytes For a reliable diagnosis, several possible markers of the disease have been identified.
  • US5455160 discloses an immunological method for screening IBD and CRC using an ELISA to determine calprotectin in stool samples.
  • the LEUKO EZ VUE TM from Techlab is an IC test for the qualitative detection of high levels of lactoferrin in stool samples.
  • the Prevent ID Caldetect of Preventis (Bensheim, Germany) is a semi-quantitative IC test for the detection of calprotectin in feces for IBD differentiation from IBS, as is the Quantum Blue Calprotectin Rapid Test of Bühlmann (Basel, Switzerland).
  • the immunoassays for calprotectin and lactoferrin are different, that is, an immunoassay for calprotectin and another for lactoferrin are performed, which means that different samples must be prepared, in different diluents, and different assays must be carried out. , which it involves: to. A greater expense of time. b. A greater number of manipulations with the inherent risk of error. C. That the results obtained for the two parameters are not directly correlated since they come from two different samples.
  • the object of the present invention is a rapid test of the IC type for the simultaneous and differentiated determination of calprotectin and lactoferrin in faecal samples that has the following advantages: to. A single sample is prepared. When both proteins are analyzed separately there are two different samples in different diluents. b. They are tested simultaneously which reduces the test time and the number of manipulations, thus reducing the risk of error. The simultaneous determination of two markers makes the test more sensitive. C. The determination is differentiated, that is, the presence of lactoferrin is visualized on one line and the presence of calprotectin on a different line. The differentiated determination of two markers makes the test more specific. d. A specific vial is used that allows quantitative sampling and dispersion in the diluent in an easy and hygienic way.
  • Another case of application of the present invention is the management of acute diarrhea.
  • the origin of diarrhea can be very diverse, it is important to discern whether it is a non-invasive process (self-limited, non-inflammatory) or an invasive process (aggressive, inflammatory).
  • the treatment of the former is limited to a rehydration therapy and electrolyte replacement while the latter requires specific treatment usually with antimicrobial agents.
  • Diarrhea with inflammatory processes is usually caused by Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni or Clostridium difficile .
  • the diagnosis of these is made by stool culture and identification of pathogens. Cultivation is a long and expensive technique.
  • Choi, SW et al. propose the use of a latex agglutination to detect the presence of lactoferrin in stool samples as a screening method to avoid culture in case of acute diarrhea.
  • US6727073 describes an IC test for the diagnosis of infectious diarrhea that simultaneously detects lactoferrin and one or more antigens of the bacteria that can cause it, namely Salmonella, E. coli O157, Listeria, Yersinia, Shigella, Campylobacter jejuni or Clostridium difficile .
  • the device of the present invention allows simultaneous and differentiated detection of fecal lactoferrin and calprotectin and is a tool in the diagnosis and management of cases of acute diarrhea.
  • US5552292 shows a diagnostic method of CRC consisting of an ELISA immunoassay for the detection of lactoferrin or myeloperoxidase in feces.
  • the method of the invention is useful for the diagnosis of IBD and its differentiation from IBS.
  • the latter is a benign disease whose symptoms are very similar to those of IBD.
  • the method of the invention is useful to quickly determine if it has an inflammatory and invasive character and therefore it is necessary to proceed with the culture and / or a treatment with antimicrobial agents.
  • the test of the invention is suitable for establishing early surveillance procedures for the appearance of the disease, especially in high-risk groups (age, family history, ).
  • Figure 1 Scheme of the stages of the diagnostic method.
  • the specific device or vial for the collection of faecal samples (Figure 1A) is a plastic vial of about 2 mL capacity, in which 1 mL of diluent has been previously dispensed, with a screw cap that has a stem whose extreme, designed for this purpose, allows quantitative collection of a stool sample (Figure 1B) solid or semi-solid and its introduction into the vial. After this, it is closed and vigorously stirred (Figure 1C) until complete dispersion of the sample. Finally, the opposite part of the device is broken ( Figure 1D) and a few drops are added on the place of application of the immunochromatographic device sample ( Figure 1E).
  • Figure 2B View of the section of the immunochromatographic device in strip format in which the plastic support (8) is distinguished in addition to the elements described in Figure 2A.
  • FIG. 2C Projected view of the immunochromatographic device, in which the elements described in Figures 2A and 2B are distinguished.
  • a single anti-calprotectin monoclonal antibody is used.
  • This monoclonal antibody (CA1) has been developed using highly purified calprotectin.
  • the monoclonal antibody obtained has a high affinity and specificity against the complex formed by the two subunits of the calprotectin while it barely binds to each of the subunits separately.
  • rabbit anti-human lactoferrin polyclonal antibodies are used. These antibodies have been obtained by immunizing rabbits with purified human lactoferrin and subsequently have been purified by affinity chromatography against the same antigen (purified human lactoferrin).
  • conjugates with colored nanoparticles are prepared separately. These nanoparticles are deposited in one of the materials of the immunochromatographic device and act as a mobile phase.
  • the same antibodies are immobilized separately on the porous membrane that acts as a fixed phase and in which the immune capture occurs separately from human lactoferrin and calprotectin.
  • the membrane and the material with the conjugate are mounted with the help of other materials on a plastic support that is cut in strip form.
  • the stool sample is resuspended in the dispersion diluent of the sample in an approximate 1/100 ratio. If the sample is liquid, 10 ⁇ L of the sample is mixed with 1 mL of the diluent. If the sample is solid, 10 mg of the sample is separated with the help of a spatula and dispersed in 1 mL of diluent. It is very convenient to use the sampling vial in which the sample is introduced with the help of a stem after which it is closed with the screw cap and vigorously shaken to subsequently break the top of the cap and add 4- 5 drops on the point of application of the immunochromatographic device sample. The design of the stem is such that when passing through the reducing hole of the vial allows the introduction of a predetermined amount of the stool sample, in this case 10 mg.
  • the monoclonal antibody CA1 was obtained from the hybridoma of the same name.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody CA1 was obtained using known protocols according to the method of cell fusion and selection of the obtained clones that was initially described by Kohler and Milstein in 1975 (Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature, 1975 Aug 7; 256 (5517): 495-7).
  • Human lactoferrin was purified from the commercial product Lactoferrin from human milk (L0520 Sigma-Aldrich) by ion exchange chromatography to a purity greater than 99% by SDS-PAGE.
  • Immunization is performed intradermally (day 1), inoculating 250 ⁇ g of purified lactoferrin in 0.5 mL of PBS to which 0.5 mL of Freund's Complete Adjuvant is added. After immunization, booster doses are administered every three weeks to complete a total of three. In each dose 250 ⁇ g of antigen is administered in a volume of 0.5 ml intramuscularly (to which 0.5 mL of Freund's Incomplete Adjuvant is added).
  • a 5 mL HiTrap NHS-activated HP column (GE Healthcare) with 5 mg of purified lactoferrin is prepared according to the manufacturer's instructions.
  • 10 mL of rabbit hyperimmune serum are passed through said column and washed with PBS until the absorbance at 280 nm is less than 0.050.
  • the antibodies are eluted in a 250 mM glycine buffer of pH 2.75 and fractions are collected that are immediately neutralized with phosphate buffer and subsequently dialyzed in PBS. The concentration is determined by its absorbance at 280 nm.
  • a CA1 antibody conjugate is prepared with polystyrene microparticles. Colored particles with carboxyl groups on their surface of 200 nm in nominal diameter are used (K1 020 of the brand Estapor, Merck, Darmstadt, Germany). 1 mL of 10% particles are washed by centrifugation and resuspension in 10 mM MES (2- ( N -morpholino) ethanesulfonic acid) pH 6 buffer and EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - is added - carbodiimide) to a concentration of 5 mM. Incubate 1h at 37 ° C and excess reagent is removed by centrifugation.
  • the particles thus activated are resuspended in 10 mM MES of pH 6 and the anti-calprotectin monoclonal antibody is added to a surface concentration of 2 mg / m 2 after which they are incubated 18h at 4 ° C and subsequently washed in Tween 20 at 0 ,one%.
  • an affinity purified anti-lactoferrin polyclonal antibody conjugate with polystyrene microparticles is prepared. Colored particles with carboxyl groups are used on their surface with a nominal diameter of 300 nm (K1 030 of the Estapor brand, Merck, Darmstadt, Germany). Likewise, 1 mL of 10% particles are washed by centrifugation and resuspension in 10 mM MES (2- ( N -morpholino) ethanesulfonic acid) pH 6 buffer and EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) is added ) -carbodiimide) to a concentration of 5 mM.
  • MES N -morpholino
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl
  • Conjugates with control line particles are obtained in the same way but using streptavidin (S4762, Sigma-Aldrich) at a final surface concentration of 1 mg / m 2 .
  • TRIS buffer tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • the anti-lactoferrin, anti-calprotectin and anti-streptavidin antibodies are dialyzed in PBS, brought to a concentration between 0.5 and 1 mg / mL and linearly deposited in parallel on a membrane of Laminated nitrocellulose (Millipore Hi-Flow Plus) 25 mm wide and with a pore size between 10 and 30 micrometers at a rate of 1 ⁇ L / cm after which it is dried in an air stream at 45 ° C after deposition (2 minutes) and immediately afterwards for 24 hours in a chamber at 30 ° C and 20% relative humidity.
  • Laminated nitrocellulose Millipore Hi-Flow Plus
  • the material with the conjugate, the membrane and the absorbent material are assembled as indicated in Figure 2 on a plastic support with an adhesive sheet and the strips are cut transversely to their assembly to a width of 4 mm.
  • a solution is prepared for the dispersion of stool samples consisting of an aqueous solution of 300 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 100 ⁇ g / mL nonspecific mouse IgG antibodies and 200 ⁇ g nonspecific rabbit IgG antibodies / mL in a 200 mM TRIS buffer at a pH of 9. This preparation is dispensed into vials for sampling at a rate of 1 mL / vial.
  • cut-off values that is, the analyte concentration above which the test is positive and below which the test is negative.
  • the cut-off value is 50 ⁇ g hCp / g of feces and for lactoferrin it is 10 ⁇ g hLf / g of feces.
  • Serial dilutions 1/2 of lactoferrin will be prepared in the sample dispersion diluent described in the previous section. 100 ⁇ L of these dilutions are applied to the immunochromatographic devices of the invention and the test is allowed to progress for 10 minutes at room temperature (25 ° C) after which the result is interpreted by visual assessment of the appearance of the test line. The same operation is performed but diluting the lactoferrin in a pool of stool samples resuspended approximately 1/100 in the same buffer. Results are shown in table 2.
  • the detection of calprotectin with the test of the present invention has> 94% correlation in sensitivity compared to the Calprest® test (Eurospital). And the detection of human fecal lactoferrin using the test of the present invention has> 99% sensitivity correlation compared to the IBD EZ VUE® rapid test (TechLab).

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Abstract

Método de diagnóstico rápido y dispositivo para llevarlo a cabo que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.

Description

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales Campo técnico de la invención
La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales. El objeto de la invención es un procedimiento rápido y sencillo de detección de lactoferrina (hLf) y calprotectina (hCp) fecales como marcadores para el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), la diarrea infecciosa (ID) y el cáncer colorrectal (CRC).
Estado de la técnica
Enfermedad inflamatoria intestinal.
Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es un término amplio para describir ciertas enfermedades que se caracterizan por una inflamación idiopática y crónica del tracto digestivo. La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) incluye la enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC) y un tipo no específico o indeterminado de colitis (IC).
En muchas ocasiones y debido a que presentan mucha similitud en sus síntomas, la IBD es muy difícil de distinguir del síndrome del intestino irritable (IBS). Éste último es una enfermedad benigna, en contraposición a la IBD pero cuyos síntomas son muy semejantes a las de la IBD.
Los procesos inflamatorios como la IBD suelen estar asociados a la presencia de leucocitos. Para un diagnóstico fiable se ha identificado diversos posibles marcadores de la enfermedad.
En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinación de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensayo con anticuerpos anti-lactoferrina. En la patente US7192724 ya se describe un método para diferenciar IBD de IBS midiendo la concentración de lactoferrina en heces utilizando un inmunoensayo tipo ELISA. Incluso se ha establecido que esa concentración puede ser útil para monitorizar el desarrollo de la enfermedad (Patente US7560240).
Por otra parte, la patente US5455160 revela un método inmunológico para el despistaje de la IBD y CRC usando un ensayo ELISA para determinar calprotectina en muestras de heces.
Se han descrito otros posibles marcadores para el diagnostico de la IBD entre los que destacan ANCA y ANSA aunque los mejores resultados se obtienen con lactoferrina y calprotectina fecales (Turkay, C. et Kasapoglu, B. CLINICS 2010; 65(2):221-31). Vieria, A. et al. (BMC Research Notes 2009, 2:221) indica que tanto la medida de la lactoferrina como de la calprotectina fecales por ELISA son marcadores altamente sensibles y específicos de la IBD y correlacionan con el grado de inflamación. Por último Gisbert, J. et al. (Inflamm Bowel Dis 2009; 15:1190-1198) determina que la medida por separado de ambos marcadores es útil en la predicción de una recaída en pacientes con CD o UC.
Acompañando a estas patentes y resultados experimentales existen en el mercado tanto pruebas ELISA como test inmunocromatograficos (IC) para la determinación por separado de lactoferina y calprotectina. El LEUKO EZ VUE™ de Techlab (Blacksburg, VA) es un test IC para la detección cualitativa de niveles elevados de lactoferrina en muestras de heces. El Prevent ID Caldetect de Preventis (Bensheim, Alemania) es un test IC semicuantitativo para la detección de calprotectina en heces para la diferenciación de IBD de IBS, al igual que el Quantum Blue Calprotectin Rapid Test de Bühlmann (Basilea, Suiza).
En todo lo descrito hasta ahora los inmunoensayos para calprotectina y lactoferrina son distintos, es decir, se hace por un lado un inmunoensayo para calprotectina y otro para lactoferrina, lo que significa que hay que preparar muestras distintas, en diluyentes distintos, y realizar ensayos distintos, lo que implica:
a. Un mayor gasto de tiempo.
b. Un mayor número de manipulaciones con el inherente riesgo de error.
c. Que los resultados obtenidos para los dos parámetros no se correlacionan directamente puesto que provienen de dos tomas de muestra diferentes.
El objeto de la presente invención es un test rápido del tipo IC para la determinación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:
a. Se prepara una única muestra. Cuando ambas proteínas se analizan por separado hay dos muestras diferentes en diluyentes diferentes.
b. Se ensayan simultáneamente con lo que se reduce el tiempo de ensayo y el número de manipulaciones, reduciéndose así el riesgo de error. La determinación simultánea de dos marcadores hace que la prueba sea más sensible.
c. La determinación es diferenciada, es decir, se visualiza en una línea la presencia de lactoferrina y en otra línea distinta la presencia de calprotectina. La determinación diferenciada de dos marcadores hace que la prueba pueda ser más específica.
d. Se utiliza un vial específico que permite la toma de la muestra de forma cuantitativa y su dispersión en el diluyente de manera fácil e higiénica.
Diarrea infecciosa (ID).
Otro de los casos de aplicación de la presente invención es la gestión de la diarrea aguda. Aunque el origen de la diarrea puede ser muy diverso, es importante discernir si se trata de un proceso no invasivo (autolimitado, no inflamatorio) o de un proceso invasivo (agresivo, inflamatorio). El tratamiento del primero se limita a una terapia de rehidratación y reposición de electrolitos mientras que el segundo requiere tratamiento específico usualmente con agentes antimicrobianos.
Las diarreas con procesos inflamatorios suelen estar causadas por Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile. El diagnóstico de éstas se hace por cultivo de las heces e identificación de los patógenos. El cultivo es una técnica larga y costosa. Choi, S.W. et al. (Journal of Clinical Microbiology, 1996:928-932) proponen el uso de un látex de aglutinación para detectar la presencia de lactoferrina en muestras de heces como método de despistaje para evitar el cultivo en caso de diarreas agudas.
Shastri, Y.M., et al. (Am J Med. 2008, 121(12):1099-106) describen que la determinación de calprotectina fecal muestra una alta correlación con infecciones bacterianas que producen diarrea y propone su determinación como método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa antes de proceder al cultivo.
En la patente US6727073 se describe un test IC para el diagnostico de la diarrea infecciosa que detecta simultáneamente lactoferrina y uno o varios antígenos de las bacterias que pueden causarla, a saber, Salmonella, E. coli O157, Listeria, Yersinia, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile.
El dispositivo de la presente invención permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales y constituye una herramienta en el diagnóstico y el manejo de los casos de diarrea aguda.
Cáncer colorrectal (CRC).
El cáncer colorrectal es una enfermedad en la que las células malignas se localizan en la porción intermedia y más larga del intestino grueso. Una de las herramientas diagnosticas más utilizadas para el despistaje del CRC es la detección de sangre oculta en heces (FOB). La forma más sensible y específica es un inmunoensayo para la detección de la hemoglobina ya sea en forma de ELISA o test rápido (IC).
La patente US5552292 muestra un método de diagnóstico del CRC consistente en un inmunoensayo tipo ELISA para la detección de lactoferrina o mieloperoxidasa en heces.
El documento WO 2009/065551 A1 revela un método de diagnóstico del CRC a partir de muestras de heces usando como marcadores calprotectina y el complejo hemoglobina-haptoglobina.
El dispositivo de la presente invención que permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales, constituye una herramienta útil en el diagnóstico y el despistaje del cáncer colorrectal (CRC).
Descripción de la invención
El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.
El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces.
El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos EIA (ELISA), mucho más complejos de llevar a cabo y necesitan de instrumentación de laboratorio.
Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente.
El método de la invención es útil para el diagnóstico de la IBD y su diferenciación de la IBS. Éste último es una enfermedad benigna cuyos síntomas son muy semejantes a las de la IBD.
Ante un caso de diarrea aguda, el método de la invención es útil para determinar de forma rápida si ésta tiene carácter inflamatorio e invasivo y por lo tanto hay que proceder al cultivo y/o a un tratamiento con agentes antimicrobianos.
En el caso del diagnóstico de CRC, la prueba de la invención es adecuada para establecer procedimientos de vigilancia precoz de aparición de la enfermedad especialmente en grupos de alto riesgo (edad, antecedentes familiares,…).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura 1A) es un vial de plástico de unos 2 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mL de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección cuantitativa de una muestra de heces (Figura 1B) sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 1D) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura 1E).
Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico.
Figura 2A: Vista superior del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1), una membrana porosa (2) con una línea de control (3), una línea para la detección de calprotectina (4) y otra línea para la detección de lactoferrina (5), un lugar de aplicación de la muestra (6) y un lugar para el conjugado anticuerpo-marcador (7).
Figura 2B: Vista de la sección del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira en la que se distinguen además de los elementos descritos en la Figura 2A, el soporte plástico (8).
Figura 2C: Vista proyectada del dispositivo inmunocromatográfico, en la que se distinguen los elementos descritos en la Figuras 2A y 2B.
Mejor modo de realización de la invención
Los dispositivos inmunocromatográficos para la detección tanto de antígenos como de anticuerpos han sido descritos anteriormente (por ejemplo, en la patente EP 1248112).
En la presente invención se trata de una prueba de tres líneas: una de control, otra para la detección de lactoferrina y otra para la detección de calprotectina.
En una realización preferente se utiliza un único anticuerpo monoclonal anti –calprotectina. Este anticuerpo monoclonal (CA1) se ha desarrollado utilizando calprotectina altamente purificada. El anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad y especificidad frente al complejo formado por las dos subunidades de la calprotectina mientras que apenas se une a cada una de las subunidades por separado.
También en una realización preferente, se utilizan anticuerpos policlonales de conejo anti-lactoferrina humana. Estos anticuerpos se han obtenido inmunizando conejos con lactoferrina humana purificada y posteriormente han sido purificados por cromatografía de afinidad frente al mismo antígeno (lactoferrina humana purificada).
Con los anticuerpos descritos, se preparan, por separado, conjugados con nanopartículas coloreadas. Estas nanopartículas son depositadas en uno de los materiales del dispositivo inmunocromatográfico y actúan como fase móvil. Los mismos anticuerpos son inmovilizados por separado sobre la membrana porosa que actúa como fase fija y en la que se produce la captura inmunológica por separado de la lactoferrina y calprotectina humanas. La membrana y el material con el conjugado son montados con la ayuda de otros materiales sobre un soporte plástico que se corta en forma tira.
Para la realización del ensayo se resuspende la muestra de heces en el diluyente de dispersión de la muestra en una proporción aproximada 1/100. Si la muestra es líquida 10 µL de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. Si la muestra es sólida se separan 10 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. Resulta muy conveniente la utilización del vial de toma de muestra en el que se introduce la muestra con la ayuda de un vástago tras lo que se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosoramente para posteriormente romper la parte superior del tapón y añadir 4-5 gotas sobre el punto de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. El diseño del vástago es tal que al pasar por el orificio reductor del vial permite la introducción de una cantidad predeterminada de la muestra de heces, en este caso 10 mg.
Tras la aplicación de la muestra se esperan 10 minutos para visualizar las líneas y se interpreta el resultado. El test se considera negativo si solo aparece una sola línea, la de control (por ejemplo, verde) en la ventana de resultados; positivo para calprotectina si además de la línea de control aparece una línea en la posición de la calprotectina (por ejemplo, azul); positivo para lactoferrina si además de la línea de control aparece una línea en la posición de la lactoferrina (por ejemplo, roja); y positivo para ambas (hLf y hCp) si aparecen tres líneas (por ejemplo, una verde, una roja y una azul).
Modos de llevar a cabo la invención
Ejemplo 1. Preparación y purificación de anticuerpos monoclonales anti-calprotectina.
El anticuerpo monoclonal CA1 se obtuvo a partir del hibridoma del mismo nombre. La obtención del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal CA1 se realizó mediante protocolos conocidos según el método de fusión celular y selección de los clones obtenidos que fue inicialmente descrito por Kohler y Milstein en 1975 (Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7;256 (5517):495-7).
Ratones del tipo BALB/c fueron inmunizados con calprotectina purificada (ProtEra S.r.l., Florencia, Italia). Los linfocitos de los ratones inmunizados fueron fusionados con células mielómicas de la linea SP20 y los hibridomas obtenidos fueron seleccionados mediante técnicas ELISA de la siguiente manera: los pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos fueron tapizados con anticuerpo policlonal de conejo anti-calprotectina en tampón carbonato 100 mM de pH 9 a 37ºC durante 2h. A estos pocillos se añadió la calprotectina purificada. Tras su lavado se añaden las distintas muestras de cultivo de hibridomas y la presencia del anticuerpo anti-calprotectina se revela utilizando un conjugado anti-mIgG con peroxidada y el sustrato correspondiente.
Se seleccionaron los hibridomas que mayor afinidad y mejor especificidad presentaron. Entre estos se seleccionaron los más productores y los que mejores prestaciones ofrecieron en los test de estrés térmico y velocidad de reacción frente al antígeno.
El hibridoma seleccionado CA1 fue cultivado en medio RPMI-HT durante varios días a 37ºC con 5% de CO2. A partir del medio de cultivo fue purificado el anticuerpo por cromatografía de afinidad a proteína A según las instrucciones del fabricante de la columna (GE Healthcare) tras lo que fue dializado en PBS de pH 7,4.
Ejemplo 2. Preparación y purificación de anticuerpos policlonales anti-lactoferrina.
La lactoferrina humana fue purificada a partir del producto comercial Lactoferrin from human milk (L0520 Sigma-Aldrich) por cromatografía de intercambio iónico hasta una pureza superior al 99% por SDS-PAGE.
Inmunización de conejos.
La inmunización se realiza por vía intradérmica (día 1), inoculando 250 µg de lactoferrina purificada en 0,5 mL de PBS al que se le añaden 0,5 mL de Adyuvante Completo de Freund. Después del la inmunización se administran dosis de recuerdo cada tres semanas hasta completar un total de tres. En cada dosis se administran 250 µg de antígeno en un volumen de 0,5 ml por vía intramuscular (al que se le añaden 0,5 mL de Adyuvante Incompleto de Freund).
Dos semanas después de la administración de cada dosis de recuerdo se procede a realizar la sangría para la obtención de los diferentes sueros. La sangre se extrae por punción de la arteria auricular. De cada sangrado se obtienen entre 15 y 30 mL de sangre completa (que equivalen a 7 y 15 mL de suero). Este suero se congela hasta su posterior purificación.
Purificación de los anticuerpos por afinidad.
Se prepara una columna HiTrap NHS-activated HP de 5 mL (GE Healthcare) con 5 mg de lactoferrina purificada según las instrucciones del fabricante. Por dicha columna se hacen pasar 10 mL de suero hiperinmune de conejo y se lava con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0.050. Los anticuerpos son eluídos en un tampón glicina 250 mM de pH 2,75 y se recogen fracciones que son inmediatamente neutralizadas con tampón fosfato y posteriormente dializadas en PBS. La concentración se determina por su absorbancia a 280 nm.
Ejemplo 3. Preparación de los conjugados.
Calprotectina
Se prepara un conjugado del anticuerpo CA1 con micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 200 nm de diámetro nominal (K1 020 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). 1 mL de partículas al 10 % se lavan por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 y se le añade EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba 1h a 37ºC y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 y se les añade el anticuerpo monoclonal anti-calprotectina hasta una concentración superficial de 2 mg/m2 tras lo que se incuban 18h a 4ºC y posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
Lactoferrina
De la misma manera, se prepara un conjugado del anticuerpo policlonal anti-lactoferrina purificado por afinidad con micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 300 nm de diámetro nominal (K1 030 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). Igualmente, 1 mL de partículas al 10 % se lavan por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 y se le añade EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba 1h a 37ºC y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 y se les añade el anticuerpo policlonal anti-lactoferrina purificado por afinidad hasta una concentración superficial de 1 mg/m2 tras lo que se incuban 4h a 37ºC y posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
Los conjugados con partículas para línea de control se obtienen de la misma manera pero utilizando streptavidina (S4762, Sigma-Aldrich) a una concentración superficial final de 1 mg/m2.
Una mezcla de los tres conjugados con partículas descritos en concentraciones de 0,02%, 0,04% y 0,05% respectivamente, se diluyen en una solución que contiene sacarosa 10%, caseína bovina 2%, PEG-6000 1% y Tween-20 2% en tampón TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8. Esta solución se deposita a razón de 15 µL/cm en un material bobinado de fibras de poliéster no entretejidas de 29 mm de ancho que se seca en corriente de aire a 45ºC tras la deposición (5 minutos) y durante 24h en una cámara a 30ºC y 20% de humedad relativa.
Ejemplo 4. Preparación de las líneas de test y control.
Los anticuerpos anti-lactoferrina, anti-calprotectina y anti-streptavidina (para la línea de control) se dializan en PBS, se llevan a una concentración entre 0,5 y 1 mg/mL y se depositan linealmente de forma paralela sobre una membrana de nitrocelulosa laminada (Millipore Hi-Flow Plus) de 25 mm de ancho y de tamaño de poro entre 10 y 30 micrómetros a razón de 1 µL/cm tras lo cual se seca en corriente de aire a 45ºC tras la deposición (2 minutos) e inmediatamente después durante 24h en una cámara a 30ºC y 20% de humedad relativa.
Ejemplo 5. Montaje del test inmunocromatografico.
El material con el conjugado, la membrana y el material absorbente se montan conforme indica la figura 2 sobre un soporte plástico con una lámina adhesiva y las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm.
Se prepara una solución para la dispersión de las muestras de heces consistente en una disolución acuosa de cloruro de sodio 300 mM, Triton X-100 al 1%, anticuerpos IgG inespecíficos de ratón 100 µg/mL y anticuerpos IgG inespecíficos de conejo a 200 µg/mL en un tampón TRIS 200 mM a un pH de 9. Esta preparación de dispensa en viales para la toma de muestra a razón de 1 mL/vial.
Ejemplo 6. Detección calprotectina y lactoferrina fecales.
Para que el dispositivo de la invención tenga una adecuada utilidad diagnóstica es necesario utilizar unos valores de corte, es decir, la concentración de analito por encima de la cual el test es positivo y por debajo de la cual el test es negativo. En el caso de la calprotectina el valor de corte es 50 µg hCp/g de heces y para la lactoferrina es 10 µg hLf/g de heces.
Debido a la existencia del valor de corte, es necesario tomar la muestra de heces de forma cuantificada. Para ello se utiliza un vial especifico para la toma de muestra fecales que contiene un vástago con hendiduras para la muestra y un reductor para eliminar la muestra sobrante de manera que el sistema ha sido calibrado para que se introduzcan en el vial exactamente 10 mg de muestra fecal. Por otro lado, y puesto que el vial contiene 1 mL de diluyente, se puede cuantificar la concentración de la muestra.
Calprotectina:
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de calprotectina en el diluyente de dispersión de muestras descrito en el apartado anterior. 100 µL de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la calprotectina en un pool de muestras de heces resuspendidas aproximadamente 1/100 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 1. Tabla 1
ng hCp/mL En diluyente En heces mg hCp/g heces
16000 + + 1600
8000 + + 800
4000 + + 400
2000 + + 200
1000 + + 100
500 + + 50
250 - - 25
125 - - 12,5
0 - - 0
Lactoferrina:
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de lactoferrina en el diluyente de dispersión de muestras descrito en el apartado anterior. 100 µL de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la lactoferrina en un pool de muestras de heces resuspendidas aproximadamente 1/100 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 2. Tabla 2
ng hLf/mL En diluyente En heces mg hLf/g heces
3200 + + 320
1600 + + 160
800 + + 80
400 + + 40
200 + + 20
100 + + 10
50 - - 5
25 - - 2,5
0 - - 0
Una muestra de heces que contenga una concentración de calprotectina fecal humana mayor o igual 50 µg/g heces y una concentración de lactoferrina igual o mayor que 10µg/g en heces, dan resultados positivos usando el test de la presente invención.
Ejemplo 7. Evaluación de las prestaciones de la prueba.
Las prestaciones del dispositivo de diagnóstico de la invención fueron comparadas con sendos inmunoensayos para lactoferrina y calprotectina. Se realizó un estudio con 64 muestras fecales procedentes del Servicio de Microbiología de un hospital local (Zaragoza, España). Con dichas muestras se realizaron tres tipos de ensayos:
  1. el método de la presente invención.
  2. el inmunoensayo tipo ELISA Calprest® (Eurospital Spa , Trieste, Italia), realizado según las instrucciones del fabricante.
  3. la prueba rápida tipo IC IBD EZ VUE® (TechLab, Blacksburg, VA, EEUU), realizado según las instrucciones del fabricante.
La detección de calprotectina con el test de la presente invención presenta >94% de correlación en sensibilidad comparada con la prueba Calprest® (Eurospital). Y la detección de lactoferrina fecal humana usando test de la presente invención presenta >99% de correlación en sensibilidad comparada con la prueba rápida IBD EZ VUE® (TechLab).

Claims (6)

  1. Dispositivo inmunocromatográfico para el análisis de muestras de heces caracterizado por que comprende:
    a. Una ventana de resultados de tres líneas, una de control, otra para la detección de calprotectina y otra para la detección de lactoferrina, de manera que permite la identificación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina fecales.
    b. Una membrana porosa en la que se han inmovilizado separadamente anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina.
    c. Un absorbente en el que se han depositado conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina unidos a moléculas o partículas marcadoras.
  2. Dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1 caracterizado por que los anticuerpos utilizados son policlonales o monoclonales tanto en la membrana como en los conjugados.
  3. Método de diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) caracterizado por que comprende:
    a. La obtención de una muestra de heces,
    b. la dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,
    c. la aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
    d. la interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
  4. Método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa (ID) caracterizado por que comprende el procedimiento de la reivindicación 3.
  5. Método de ayuda al diagnóstico del cáncer colorrectal (CRC) caracterizado por que comprende el procedimiento de la reivindicación 3.
  6. Kit para llevar a cabo los métodos de diagnóstico de las reivindicaciones 3, 4 y 5 caracterizado por que comprende:
    a. Un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1,
    b. un diluyente adecuado para suspensión y dispersión del material fecal,
    c. un vial para la toma de muestra y su manipulación.
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