ES2875420T3 - Anticuerpo antipresepsina específicamente purificado - Google Patents

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Abstract

Anticuerpos policlonales antipresepsina, en donde los anticuerpos se unen específicamente a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo antipresepsina específicamente purificado
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos policlonales antipresepsina útiles para la medición de la presepsina en muestras.
Técnica anterior
La CD 14 es una glicoproteína conocida que se expresa en la superficie de la membrana de las células monocíticas y funciona como receptor de LPS (lipopolisacárido). Existen dos formas de moléculas de CD14. Una de ellas es la forma de CD14 unida a la membrana (mCD14) que se expresa en la superficie celular. Otra forma es la CD14 soluble (sCD14). Las sCD14, que tienen un peso molecular de aproximadamente 55 kDa y aproximadamente 49 kDa (en adelante, denominadas "sCD14 de alto peso molecular"), son conocidas en la técnica y se ha informado de que estas sCD14 muestran un nivel elevado en la sangre de un paciente con muchas enfermedades tales como la sepsis, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y el lupus eritematoso sistémico (LES). Por esa razón, estas sCD14 de alto peso molecular no se consideran marcadores específicos de una enfermedad (véanse los documentos no de patente 1 y 2).
Mientras tanto, se ha informado de que existe una nueva especie molecular de sCD14, la sCD14-ST (subtipo de antígeno CD14 soluble, también denominado presepsina), cuya concentración en sangre está aumentada de manera característica en los pacientes con sepsis.
La sCD14-ST (presepsina) se caracteriza por migrar a 13 ± 2 kDa del peso molecular en SDS-PAGE en condiciones no reductoras de todas las sCD14, y comprende la región N-terminal de CD14. La sCD14-ST (presepsina) tiene una secuencia de aminoácidos en la que la región C-terminal está suprimida en gran medida en comparación con las secuencias de aminoácidos de la sCD14 de alto peso molecular, y a diferencia de la sCD14 de alto peso molecular, la sCD14-ST (presepsina) no tiene capacidad de unión al LPS. Además, la presepsina presenta una inmunogenicidad diferente a la de la sCD14 de alto peso molecular y, por consiguiente, las moléculas se pueden distinguir usando el anticuerpo. La concentración sanguínea de presepsina aumenta específicamente en los pacientes con sepsis (véase el Documento de Patente 1). Además, se ha informado de que la concentración sanguínea de presepsina muestra un nivel más alto en la sangre de los pacientes con sepsis en comparación con los pacientes con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), que es difícil de discriminar de la sepsis. Así, la presepsina se considera un marcador de diagnóstico específico de la sepsis (véase el documento no de patente 3).
Se han desvelado (véanse los documentos de patente 1 y 2) un anticuerpo policlonal procedente de conejo (anticuerpo S68) y un anticuerpo monoclonal procedente de rata (F1146-17-2), que reconocen específicamente la presepsina. En la actualidad, en la medición de la presepsina se usa prácticamente un sistema de medición que usa anticuerpos policlonales procedentes de conejo como anticuerpo específico de la presepsina, y en Europa y en Japón se comercializan kits de medición (PATHFAST™ Presepsin, Mitsubishi Chemical Medience Corporation).
Los anticuerpos policlonales procedentes del conejo reconocen varios antígenos y tienen una fuerte afinidad por el antígeno en comparación con los anticuerpos procedentes de roedores tales como el ratón. Por otra parte, la considerable variabilidad individual de los conejos dificulta la producción de anticuerpos estables y se cree que presentan una mayor variación entre distintos lotes.
Documentos de la técnica anterior
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO2005/108429
Documento de patente 2: WO 2004/044005
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Hayashi et al., Infection and Immunity, 67: 417-420, 1999
Documento no de patente 2: Lawn et al., Clinical & Experimental Immunology, 120: 483-487, 2000 Documento no de patente 3: Yaegashi et al., Journal of Infection and Chemotherapy, 11: 234-238, 2005 Resumen de la invención
Problema a resolver por la invención
La presepsina se ha medido convencionalmente usando los anticuerpos policlonales antipresepsina (anticuerpos S68) procedentes de conejos. Sin embargo, se ha descubierto que cuando las muestras se miden mediante la construcción de ELISA con anticuerpos S68, existe una variación relativamente grande en los valores medidos entre los diferentes lotes de anticuerpos.
Un problema de la presente invención es proporcionar anticuerpos policlonales antipresepsina que tengan menos variación en los valores medidos entre los lotes de anticuerpos en comparación con los anticuerpos S68 y, por lo tanto, que sean adecuados para la medición de la presepsina.
Otro problema de la presente invención es proporcionar un anticuerpo altamente específico que se una específicamente a la presepsina y que cause menos reacción cruzada con la sCD14 de alto peso molecular en la sangre humana.
Otro problema de la presente invención es proporcionar anticuerpos policlonales antipresepsina que tengan mayor reactividad con la presepsina que los anticuerpos S68.
El objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos policlonales antipresepsina que puedan resolver al menos uno de los problemas anteriores.
Medios para resolver el problema
Los anticuerpos policlonales convencionales antipresepsina procedentes de conejo (anticuerpos S68) se preparan purificando mediante el uso de una columna de afinidad inmovilizada por el péptido S68 para dar los anticuerpos policlonales obtenidos mediante la inmunización de conejos con el péptido s 68 (SEQ ID NO: 2) . El inventor de la presente invención ha encontrado que se ha obtenido un policlonal de alta reactividad cambiando la columna de afinidad para purificar de la columna de afinidad inmovilizada por el péptido S68 a la columna de afinidad inmovilizada por el péptido P03 (SEQ ID NO: 1). El péptido P03 tiene una secuencia que contiene una parte del péptido S68.
El inventor de la presente invención confirmó que la especificidad de los anticuerpos policlonales obtenidos por medio de purificación usando el péptido P03 mediante un ensayo de inhibición competitiva de péptidos. El inventor ha encontrado que los anticuerpos policlonales antipresepsina que se unen específicamente al péptido P03 (en adelante también denominados "anticuerpos policlonales específicos de P03") tienen propiedades para presentar menos variación entre distintos lotes de anticuerpos en los valores medidos que los anticuerpos S68 y causan menos reacción cruzada con el CD14 soluble de alto peso molecular (en adelante también denominado "sCD14 de alto peso molecular en sangre") en la sangre humana, que son adecuados para la medición de la presepsina, y por lo tanto el inventor ha completado la presente invención.
En concreto, con respecto a la variación de los valores medidos entre los distintos lotes, se usaron 3 lotes de anticuerpos policlonales específicos de P03 y 3 lotes de anticuerpos S68 y se midió la concentración de presepsina. También se midió la concentración de presepsina de una pluralidad de muestras (en concentración conocida de presepsina). A continuación, se realizó un análisis de correlación entre los valores medidos obtenidos y la concentración conocida, y se evaluó el coeficiente de varianza (CV) de las pendientes de las líneas de regresión en los Ejemplos. El CV (10,6 %) del sistema de ensayo de los anticuerpos policlonales específicos de P03 fue menor que el de los anticuerpos S68 (20 %), lo que confirma que el sistema de ensayo que usa los anticuerpos policlonales específicos de P03 tiene la baja variación entre los distintos lotes en los valores medidos en los ejemplos.
Con respecto a la reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular en sangre, se confirmó mediante los ejemplos que la reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular en sangre estaba por debajo del límite de detección en el sistema de ensayo ELISA usando los anticuerpos policlonales específicos de P03.
La purificación específica de los anticuerpos policlonales durante el proceso de producción de los mismos se lleva a cabo generalmente con antígenos administrados (el péptido S68 de la presente invención) y no se contempla generalmente que haya un péptido distinto para la purificación específica más adecuado que el antígeno administrado. Es sorprendente que los anticuerpos que son más adecuados para la medición de la presepsina que los anticuerpos S68 se obtengan ahora por purificación específica usando el péptido P03 que tiene una secuencia que contiene una parte del péptido S68.
Por lo tanto,se describe a continuación la presente invención.
[1] Anticuerpos policlonales antipresepsina, en donde los anticuerpos se unen específicamente a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[2] Los anticuerpos según [1], en los que la unión entre los anticuerpos y la presepsina está inhibida competitivamente en un 30 % o más en un sistema de reacción ELISA competitivo, en donde se une un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a la reacción de los anticuerpos y la presepsina, y en donde la unión entre los anticuerpos y la presepsina se inhibe competitivamente en menos del 30 % en un sistema de reacción ELISA competitivo, en donde un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 se añade a la reacción de los anticuerpos y la presepsina.
1. [3] Los anticuerpos según uno cualquiera de [1] a [2], en los que un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich construido por los anticuerpos tiene una incidencia de reacción cruzada con CD14 soluble de alto peso molecular en sangre humana menor que un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich que usa anticuerpos policlonales antipresepsina obtenidos de un mamífero inmunizado con un péptido de SEQ ID NO: 2 como inmunógeno y usando para la purificación una columna de afinidad inmovilizada por péptidos SEQ ID NO: 2.
[4] Los anticuerpos según uno cualquiera de [1] a [3], en los que un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich construido por los anticuerpos es adecuado para medir una concentración de presepsina de muestras (en una concentración conocida de presepsina) que contienen presepsina para llevar a cabo el análisis de correlación de los valores medidos y la concentración conocida, un coeficiente de varianza (CV) de las pendientes de las líneas de regresión es del 15 % o menos.
[5] Los anticuerpos según uno de los [1] a [4], en donde los anticuerpos se unen a la presepsina con una afinidad (KD) inferior a 10-7 M.
[6] Los anticuerpos según cualquiera de [1] a [5], en donde los anticuerpos se obtienen purificando anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado por un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[7] Los anticuerpos según uno cualquiera de [1] a [5], obtenidos sometiendo los anticuerpos policlonales a un tratamiento para aumentar la proporción de anticuerpos que se unen específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde los anticuerpos policlonales se obtienen de un mamífero no humano inmunizado con un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 hasta la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, donde el tratamiento es la purificación.
[8] Los anticuerpos según la reivindicación [1] que se obtienen mediante purificación, usando una columna en la que se ha inmovilizado un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado usando, como inmunógeno, un péptido que incluye residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[9] Los anticuerpos según [8], sometidos además a un tratamiento que elimina los anticuerpos unidos a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[10] Los anticuerpos según [8], sometidos además a un tratamiento que reduce la actividad de unión de los anticuerpos que se unen a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[11] Un procedimiento para producir anticuerpos policlonales antipresepsina, que comprende al menos los siguientes pasos; el paso de obtener anticuerpos policlonales de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos de la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y la etapa de purificación de los anticuerpos obtenidos usando una columna en la que se ha inmovilizado un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[12] El procedimiento para producir anticuerpos policlonales antipresepsina según [11], que comprende además el paso de eliminar los anticuerpos que se unen a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[13] Un procedimiento para medir la presepsina, que comprende al menos el paso de exponer los anticuerpos según uno cualquiera de [1] a [10] a una muestra que contiene presepsina.
[14] Un kit para medir la presepsina, o para detectar la sepsis, o para ayudar a la detección o al diagnóstico de la sepsis, comprendiendo dicho kit al menos los anticuerpos según uno cualquiera de [1] a [10].
Efecto de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos policlonales antipresepsina que tienen una excelente reactividad con la presepsina y que son adecuados para la medición de la presepsina de las muestras. De este modo, es posible aumentar la calidad y la precisión de la medición de la presepsina.
En una forma de realización preferente, el anticuerpo de la presente invención tiene una menor variación entre los distintos lotes de anticuerpos en los valores medidos durante la medición de presepsina usando los anticuerpos y, por lo tanto, es posible proporcionar de forma estable anticuerpos que tienen una calidad constante y excelente en la práctica para resultar adecuados en la medición de presepsina.
Por lo general, es importante que en la medición de muestras que usan anticuerpos (en particular en los medicamentos de diagnóstico), las pendientes de las líneas de regresión, tal como se muestra en el ejemplo 5, caigan dentro de un cierto intervalo, incluso entre diferentes lotes de anticuerpos. En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención tienen un CV de las pendientes de las líneas de regresión de aproximadamente el 10 % y, por lo tanto, las pendientes de las líneas de regresión tienden a caer dentro de un estándar incluso entre diferentes lotes de anticuerpos.
En otra forma realización preferente, los anticuerpos definidos en las reivindicaciones se unen a la presepsina en un sistema ELISA de tipo sándwich y provocan una reacción cruzada con la sCD14 de alto peso molecular en la sangre humana menor en comparación con los anticuerpos S68, y por lo tanto permiten una medición con alta especificidad.
Breve descripción de los dibujos
[Fig. 1]
La Fig. 1 muestra una línea de regresión de los anticuerpos policlonales específicos de P03 (P03-A) obtenidos en el Ejemplo 5.
[Fig. 2 ]
La Fig. 2 muestra una línea de regresión de los anticuerpos policlonales específicos de P03 (P03-B) obtenidos en el Ejemplo 5.
[Fig. 3]
La Fig. 3 muestra una línea de regresión de los anticuerpos policlonales específicos de P03 (P03-C) obtenidos en el Ejemplo 5.
Medios y procedimientos para llevar a cabo la invención
En lo sucesivo, se describirá con más detalle la presente invención. Los siguientes ejemplos describen la presente invención
1. Anticuerpos de la presente invención
La presente invención proporciona los siguientes anticuerpos policlonales antipresepsina (en adelante denominados "anticuerpos de la presente invención"):
(1) anticuerpos policlonales antipresepsina (anticuerpos policlonales específicos de P03) que se unen específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; o
(2) anticuerpos policlonales antipresepsina cuyo porcentaje de contención de los anticuerpos policlonales antipresepsina (anticuerpos policlonales específicos de P03), que se unen específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, es mayor que un porcentaje de contención de anticuerpos policlonales antipresepsina (anticuerpos policlonales específicos de P03) que se unen específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en el anticuerpo S68.
La "presepsina" también se denomina sCD14-ST (subtipo de antígeno CD14 soluble). Tal como se ha descrito anteriormente, hay dos formas de CD14 que son el CD14 unido a la membrana (mCD14) y el CD14 soluble (sCD14), y en la sangre hay varios CD14 solubles con diferentes pesos moleculares. La presepsina es un fragmento de un CD14 soluble y es una sustancia que tiene las características indicadas en los puntos 1) a 3) siguientes:
1) tiene un peso molecular de 13 ± 2 kDa según SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
2) tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 11 de la secuencia de aminoácidos (secuencia de aminoácidos de longitud completa del CD14 soluble humano) de SEQ ID NO: 3 en el extremo N-terminal; y
3) se une específicamente a un anticuerpo preparado usando un péptido (péptido S68) que consta de 16 residuos de aminoácidos (correspondientes a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 53 a 68 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3) descrito en SEQ ID NO: 2 para el antígeno.
En la presente invención, la presepsina se refiere a la presepsina humana, a menos que se demuestre en particular de otro modo. Por ejemplo, la presepsina es una presepsina estándar (rsCD14-ST desvelada en el Ejemplo 16 del documento WO2005/108429). Como alternativa, se usa una sustancia que tiene una actividad de unión igual que la presepsina y que está parcialmente modificada a partir de la presepsina.
Tal como se describe en el presente documento, los "anticuerpos policlonales antipresepsina" son anticuerpos policlonales que reconocen inmunológicamente la presepsina y/o anticuerpos policlonales que tienen una reacción antígeno-anticuerpo normal con la presepsina. La reacción antígeno-anticuerpo puede verificarse mediante procedimientos de aglutinación, procedimientos de tipo sándwich, procedimientos directos en fase sólida, procedimientos competitivos, etc. Expresando la unión entre los anticuerpos y el sujeto reconocido por éstos como una afinidad, la constante de disociación de equilibrio (KD) es generalmente inferior a 10'7 M.
Tal como se describe en el presente documento, "péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" significa péptido P03. Tal y como se usa aquí, "péptido P03" significa un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la posición 52 hasta la posición 61 del CD14 soluble humano de longitud completa (SEQ ID NO: 3).
El término "que se une específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" significa que los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (péptido P03), pero no se unen a otros péptidos de la secuencia de aminoácidos de la presepsina. En otras palabras, los anticuerpos reconocen específicamente un epítopo en la secuencia de aminoácidos del péptido P03, pero no reconocen otros péptidos. Con más detalle, por ejemplo, según la descripción del Ejemplo 3 de la presente invención, el término se puede describir por el hecho de que cuando se lleva a cabo un ensayo de inhibición competitiva de péptidos (preferentemente usando la absorbancia), la inhibición competitiva de la unión entre los anticuerpos de la presente invención y la presepsina es del 30 % o más por medio de la adición del péptido P03 y es inferior al 30 % por medio de la adición de otros péptidos. Tal como se describe en el presente documento, "otros péptidos" es, por ejemplo, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (péptido P01), un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (péptido P02), un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (péptido P04), un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (péptido P05), un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (péptido P06), un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (péptido P07) y un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (péptido P08). "Unión específica a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" incluye la unión específica al péptido P03 inmovilizado en una columna. El "péptido P03 inmovilizado en una columna" puede incluir el péptido P03 que tiene cisteína unida en los extremos N- o C-terminal y por lo tanto se une a la columna a través de la cisteína.
En este caso, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (péptido P01) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 46 a la posición 55 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (péptido P02) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 49 a la posición 58 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (péptido P04) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 55 a la posición 64 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (péptido P05) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 58 a la posición 67 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 10 (péptido P06) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 61 a la posición 70 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (péptido P07) corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 64 hasta la posición 73 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (péptido P08) corresponde a la secuencia de aminoácidos de la posición 67 a la posición 76 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Tal como se describe en el presente documento, "un porcentaje de contenido, en los anticuerpos policlonales antipresepsina, de anticuerpos policlonales antipresepsina que se unen específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 mayor que un porcentaje de contenido, en anticuerpos S68, de anticuerpos policlonales antipresepsina que se unen específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" significa que la proporción de anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos policlonales antipresepsina es mayor que la proporción de los anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos S68. Los anticuerpos de este tipo tienen un porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales específicos de P03 que tienen propiedades preferentes mayor que las de los anticuerpos S68, y por lo tanto muestran capacidades superiores en comparación con los anticuerpos s 68.
Dichos anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 hasta la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 mediante un tratamiento para aumentar la proporción de anticuerpos que se unen específicamente a un péptido (péptido P03) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Los detalles se describen a continuación.
Por "anticuerpos S68" se entienden los anticuerpos policlonales antipéptido S68 obtenidos mediante la purificación de anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado con el péptido S68 como inmunógeno, usando una columna inmovilizada con péptido S68. El "péptido S68" es un péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (secuencia de aminoácidos desde la posición 53 hasta la posición 68 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3). Un procedimiento detallado para preparar anticuerpos S68 se divulga en el Ejemplo 1 del documento WO2004/044005 y se describe a continuación en el Ejemplo 1 del presente documento.
El cálculo del porcentaje de contenido de policlonal específico de P03 en los anticuerpos policlonales antipresepsina y en los anticuerpos S68 puede realizarse, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 6, purificando los anticuerpos policlonales antipresepsina o los anticuerpos S68 (A), y obteniendo a continuación anticuerpos policlonales específicos de P03 (B), midiendo después la cantidad de proteína para (A) y (B), y determinando la proporción de (B) en relación con (A), pero no está particularmente limitado. La cantidad de proteína se mide usando, por ejemplo, un procedimiento descrito en el Ejemplo 1-3.
Los porcentajes de contenido de los anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos policlonales antipresepsina y en los anticuerpos S68 se comparan preferentemente de la siguiente manera: los porcentajes de contenido se calculan para más de un lote de los respectivos anticuerpos policlonales antipresepsina y anticuerpos S68 y se comparan las medias de los porcentajes de contenido. Preferentemente son 3 lotes o más, aunque no se limita a ello.
Algunos de los aspectos preferentes de la divulgación son anticuerpos policlonales antipresepsina que tienen un alto porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales antipresepsina (anticuerpos policlonales específicos de P03) que se unen específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en los anticuerpos policlonales antipresepsina.
La frase "que tiene un alto porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos policlonales antipresepsina" significa que la proporción de anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos policlonales antipresepsina es preferentemente del 40 % o más, más preferentemente del 50 % o más, aún más preferentemente del 60 % o más y en particular preferentemente del 70 % o más. El porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales específicos de P03 en los anticuerpos policlonales puede calcularse tal como se ha descrito anteriormente.
En este aspecto, los anticuerpos incluidos en los anticuerpos policlonales antipresepsina son los anticuerpos policlonales específicos de P03, y además (1) anticuerpos policlonales antipresepsina que reconocen el péptido P03 y que reconocen otros péptidos, y (2) anticuerpos policlonales antipresepsina que no reconocen el péptido P03 pero que reconocen otros péptidos. Los "otros péptidos" son, por ejemplo, el péptido P01, el péptido P02, el péptido P04, el péptido P05, el péptido P06, el péptido P07 y el péptido P08.
Los anticuerpos de este tipo se pueden obtener, por ejemplo, sometiendo anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos de la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, a un tratamiento para aumentar la proporción de anticuerpos que se unen específicamente a un péptido (péptido P03) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Los detalles se describen a continuación.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" significa "un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo", a menos que se indique lo contrario. El término "fragmento de unión a antígeno" significa un fragmento que tiene la misma propiedad de unión a antígeno que el anticuerpo original en el fragmento parcial de anticuerpo. Ejemplos del fragmento de unión al antígeno son Fab, Fab' y F(ab')2.
Los anticuerpos de la presente invención se obtienen de mamíferos no humanos. Los anticuerpos de la presente invención se obtienen de mamíferos no humanos, como por ejemplo, un conejo, una cabra, un caballo, una oveja, un cerdo, una rata y un ratón. Debido a la facilidad de preparación de los anticuerpos, es preferente que se trate de un conejo o una cabra, y más preferentemente de un conejo.
Los anticuerpos de la presente invención tienen una excelente reactividad con la presepsina y son adecuados para la medición de la presepsina en muestras. La reactividad de los anticuerpos de la presente invención con la presepsina puede evaluarse mediante un sistema ELISA de tipo sándwich construido con los anticuerpos de la presente invención. El sistema ELISA de tipo sándwich es preferentemente uno que usa (a) los anticuerpos de la presente invención y (b) el anticuerpo F1106-13-3 o el anticuerpo F1031-8-3 (divulgado en el Ejemplo 3 del documento WO2004/044005). En más detalle, según la descripción del Ejemplo 2, la reactividad de los anticuerpos de la presente invención con la presepsina puede evaluarse por absorbancia cuando los anticuerpos de la presente invención inmovilizados en una fase sólida reaccionan con la presepsina. Tal como se describe en el ejemplo 2, la relación (relación S/N) de la absorbancia de los anticuerpos que reaccionan con 500 pg/ml de presepsina con respecto a la absorbancia obtenida cuando los anticuerpos se dejan reaccionar con 0 pg/ml de presepsina, que se considera como 1, puede usarse para evaluar la reactividad con la presepsina. La relación S/N de los anticuerpos de la presente invención es preferentemente de 36 o más, más preferentemente de 40 o más e incluso más preferentemente de 45 o más. La relación S/N de los anticuerpos de la presente invención es mayor que la de los anticuerpos S68, y es preferentemente 1,2 veces o más, más preferentemente 2 veces o más e incluso más preferentemente 2 a 3 veces mayor que la de los anticuerpos S68.
Los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a la presepsina y tienen preferentemente una mayor afinidad con la presepsina que la que tienen los anticuerpos S68. Los anticuerpos de la presente invención tienen preferentemente una afinidad a la presepsina (la constante de equilibrio de disociación, KD) de menos de 10-7 M y más preferentemente de menos de 10-8 M. La constante de equilibrio de disociación de los anticuerpos de la presente invención a la presepsina está, por ejemplo, en el intervalo de 10-7 M a 10-13 M. La afinidad (la constante de equilibrio de disociación, KD) puede medirse, por ejemplo, con BIAcore (GE Healthcare).
Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por una inhibición competitiva del 30 % o más para la unión entre los anticuerpos y la presepsina según un sistema de reacción (preferentemente usando absorbancia) en el que se usa el péptido P03 para la reacción competitiva para inhibir la unión entre los anticuerpos y la presepsina, y una inhibición competitiva del 30 % o menos para la unión entre los anticuerpos y la presepsina según un sistema de reacción (preferentemente usando absorbancia) en el que se usa el péptido P05 para la reacción competitiva para inhibir la unión entre los anticuerpos y la presepsina. Preferentemente, el sistema de reacción es ELISA de tipo sándwich. Más preferentemente, el sistema de reacción es un ELISA de tipo sándwich en el que (a) los anticuerpos de la presente invención y (b) el anticuerpo F1106-13-3 o el anticuerpo F1031-8-3 (divulgados en el Ejemplo 3 del documento WO2004/044005). Más detalladamente, la reacción de inhibición competitiva puede evaluarse mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.
Más preferentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden estar caracterizados por una inhibición competitiva de menos del 30 % por el péptido P01, el péptido P06, el péptido P07 y el péptido P08. Aún más preferentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por ser inhibidos competitivamente en menos de un 30 % por al menos un péptido seleccionado entre el péptido P02 y el péptido P04. Más preferentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por ser inhibidos competitivamente en menos de un 30 % por el péptido P02 y el péptido P04.
Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a la presepsina y tienen una baja incidencia de reacción cruzada con la CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa y de aproximadamente 49 kDa (en lo sucesivo también denominada "sCD14 de alto peso molecular en sangre") que son las principales CD14 solubles en la sangre humana. La presepsina tiene un peso molecular diferente al de la sCD14 de alto peso molecular y tiene una secuencia de aminoácidos más corta que la sCD14 de alto peso molecular. Debido a las razones descritas anteriormente, la presepsina tiene una estructura diferente de la sCD14 de alto peso molecular en la sangre y el anticuerpo tiene diferentes reactividades con las moléculas, por lo que se considera que los anticuerpos de la presente invención se unen más fuertemente a la presepsina.
La reacción cruzada puede evaluarse construyendo un sistema ELISA de tipo sándwich usando los anticuerpos de la presente invención. El sistema ELISA de tipo sándwich es más preferentemente uno en el que (a) los anticuerpos de la presente invención y (b) el anticuerpo F1106-13-3 o el anticuerpo F1031-8-3 (divulgados en el Ejemplo 3 del documento WO2004/044005). Más detalladamente, la reacción cruzada puede evaluarse mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Según el Ejemplo 4, la reacción cruzada con los anticuerpos de la presente invención se pueden evaluar por absorbancia cuando los anticuerpos de la presente invención inmovilizados en una fase sólida reaccionan con sCD14 de alto peso molecular en suero.
En cuanto a la sCD14 de alto peso molecular, la CD14 soluble humana de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 3, se puede usar o se puede preparar por adsorción en columna de afinidad usando el anticuerpo 3C10 de fluido corporal de sujetos humanos normales, por ejemplo (véase el Ejemplo 23 en el documento WO2005/108429). Las muestras que contienen sCD14 de alto peso molecular en sangre pueden prepararse usando suero humano normal y suero humano absorbido por CD14 (suero que contiene una cantidad reducida de sCD14 de alto peso molecular en sangre), por ejemplo. El suero humano absorbido por CD14 puede obtenerse según la descripción del ejemplo 4, aplicando suero humano normal a una columna de afinidad de anticuerpos anti-CD14 inmovilizados, por ejemplo.
La reacción cruzada se puede calcular, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente ecuación
reacción cruzada (%) = (concentración determinada representando gráficamente la absorbancia
de una muestra que contienen sCD14 de alto peso molecular en sangre, medida con los
anticuerpos en una curva estándar de presepsina / concentración de sCD14 de alto peso
molecular usado para la medición ) x 100
La reacción cruzada de los anticuerpos de la presente invención a la sCD14 de alto peso molecular, determinada según la ecuación anterior, está preferentemente en el límite de detección o por debajo del mismo.
Preferentemente, un sistema de ensayo ELISA que usa anticuerpos de la presente invención puede tener una incidencia de reacción cruzada (tiene menor reacción cruzada (%)) con sCD14 de alto peso molecular en sangre menor que un sistema de ensayo ELISA que usa anticuerpos S68. Al comparar las incidencias de la reacción cruzada, es preferente comparar los promedios de la reacción cruzada de más de un lote (por ejemplo, de 3 lotes o más) de anticuerpos.
Los anticuerpos de la presente invención se caracterizan porque cuando los anticuerpos se usan para la medición de la presepsina del suero humano, la variación de los valores medidos entre las diferencias entre los distintos lotes de los anticuerpos es menor en comparación con los anticuerpos S68 y los anticuerpos tienen una alta uniformidad entre los distintos lotes del anticuerpo. La concentración de presepsina en el suero humano puede medirse con objeto de evaluar la variación de los valores medidos de un lote a otro construyendo un sistema ELISA de tipo sándwich usando los anticuerpos de la presente invención. El sistema ELISA de tipo sándwich es más preferentemente uno en el que se usa (a) los anticuerpos de la presente invención y (b) el anticuerpo F1106-13-3 o el anticuerpo F1031-8-3 (divulgados en el Ejemplo 3 del documento WO2004/044o05).
En más detalle, se puede evaluar la variación de los valores medidos entre los distintos lotes, según el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. De acuerdo con la descripción del ejemplo 5, los anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, se usan 3 lotes) se inmovilizan en una fase sólida, se mide la concentración de presepsina de más de una muestra (de concentración conocida de presepsina) y se realiza un análisis de correlación con los valores medidos obtenidos y la concentración conocida para determinar las líneas de regresión, y se puede determinar el coeficiente de varianza (CV) de las pendientes de las líneas de regresión. El CV de las pendientes determinadas puede usarse para evaluar la variación de los valores medidos de los diferentes lotes de los anticuerpos. El CV de la pendiente de los anticuerpos según una realización preferente de la presente invención es preferentemente del 15 % o menos, más preferentemente del 13 % o menos y en particular preferentemente del 11 % o menos. En otro aspecto, el CV de las pendientes de los anticuerpos de la presente invención es menor que el de los anticuerpos S68, y la diferencia de la pendiente es preferentemente del 3 % o más, más preferentemente del 5 % o más y aún más preferentemente del 8 % o más. Para medir las muestras estándar con concentración conocida de presepsina es preferente usar un kit de medición de presepsina que use anticuerpos S68 (tal como PATHFAST™ Presepsin, Mitsubishi Chemical Medience Corporation).
En cuanto a los anticuerpos de la presente invención, cuando se construye un sistema de medición y se mide la presepsina en más de una muestra (con concentración conocida de presepsina), es preferente que los anticuerpos tengan una buena correlación entre los valores medidos y las concentraciones conocidas. Por tener una buena correlación se entiende un coeficiente de correlación preferentemente de 0,9 o más y más preferentemente de 0,95 o más.
En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos de la presente invención están purificados.
Los anticuerpos de la presente invención pueden obtenerse, por ejemplo, purificando anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido (por ejemplo, el péptido S68), como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Alternativamente, los anticuerpos de la presente invención pueden obtenerse sometiendo los anticuerpos policlonales a un tratamiento para aumentar una proporción de anticuerpos que se unen específicamente a un péptido (péptido P03) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, siendo los anticuerpos policlonales obtenidos de un conejo inmunizado usando un péptido (por ejemplo, el péptido S68), como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 hasta la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
A continuación se describe un procedimiento específico para producir los anticuerpos de la presente invención.
2. Procedimiento para producir anticuerpos de la presente invención
La presente invención proporciona un procedimiento para producir los anticuerpos policlonales antipresepsina, que comprende el paso de: obtener anticuerpos policlonales de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos de la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y la etapa de purificación de los anticuerpos obtenidos usando una columna con péptido inmovilizado (péptido P03) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En la producción de los anticuerpos de la presente invención, el péptido usado como inmunógeno incluye residuos de aminoácidos de la posición 1 a la posición 9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El término "9 o más residuos de aminoácidos consecutivos" es preferentemente 10 o más consecutivos, más preferentemente 12 o más consecutivos, particularmente preferentemente 16 residuos de aminoácidos consecutivos. Además, el péptido usado como antígeno no está limitado, en cuanto a las otras partes de la secuencia de aminoácidos, en la medida en que el péptido incluya 9 o más aminoácidos consecutivos en los residuos de aminoácidos indicados en la SEQ ID NO: 2, pero es preferente que el péptido tenga una secuencia de aminoácidos que proceda en su totalidad de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La cisteína se puede insertar en los extremos N o C (preferentemente en el extremo N) del péptido para permitir la unión de un vehículo descrito a continuación a través de un grupo SH. El péptido usado como inmunógeno es, de manera particularmente preferente, un péptido (péptido S68) que consiste en 16 residuos de aminoácidos consecutivos (es decir, todos los residuos de aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y puede tener cisteína insertada en los extremos N- o C-terminal (preferentemente N-terminal) del mismo.
Un procedimiento para preparar un péptido usado como inmunógeno puede ser un procedimiento que use un sintetizador de péptidos usado de manera general (sintetizador de péptidos 433A, PerkinElmer Japan Co., Ltd.) o un procedimiento de recombinación de genes (División de Investigación del Cáncer, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio Ed., Shin Saibo Kogaku Jikken Protcol (New Protocols of Cellular Engineering Experiments), Shujunsha Co., Ltd.).
Por ejemplo, un péptido que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 se puede sintetizar en el sintetizador de péptidos 433A por el procedimiento Fmoc, y tras la desprotección con TFA y la separación de la resina, el péptido puede purificarse usando una columna HPLC C18 (Capcell-pak, Shiseido Company, Limited) y puede prepararse el péptido deseado.
Cuando un antígeno es una proteína, la proteína puede usarse directamente como inmunógeno. Sin embargo, cuando un péptido incluye de 8 a 30 residuos de aminoácidos o menos, puede ser por lo general que el péptido no tenga inmunogenicidad debido al bajo peso molecular. En este caso, el péptido puede unirse a un vehículo o el péptido puede usarse para preparar un péptido MAP por el procedimiento del péptido de antígenos múltiples (MAP) para impartir el peso molecular que exhibe inmunogenicidad, a fin de obtener el inmunógeno.
En cuanto al vehículo unido al péptido descrito anteriormente, puede ser una proteína portadora o un polímero. La proteína portadora que puede usarse es una proteína heterogénea tal como la albúmina de suero bovino, la hemocianina keyhole-limpet (KLH), la tiroglobulina y la ovoalbúmina. Estas proteínas portadoras pueden unirse al péptido usando un grupo funcional de cadena lateral en un aminoácido del péptido o de la proteína portadora, o pueden unirse introduciendo un grupo maleimida, un grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) o un grupo aldehído. En este caso, un aminoácido (por ejemplo, la cisteína), cuyo grupo funcional puede ser usado, se puede unir al péptido. El polímero puede ser sacáridos tales como el manano o el quitosano, o la polivinilpirrolidona (PVA). Estos polímeros pueden estar unidos al péptido por adsorción o mediante enlace químico, como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente invención, el inmunógeno es el péptido S68 unido a KLH (péptido S68-KLH) a través de la cisteína insertada en el extremo N-terminal.
Usando el inmunógeno preparado del modo anterior, los anticuerpos policlonales dirigidos al inmunógeno pueden prepararse según una técnica bien conocida (por ejemplo, véase Men-eki Jikken Sosaho (Immunological Experimental Procedures), Ed. de la Sociedad Japonesa de Inmunología, publicada por la Sociedad Japonesa de Inmunología).
Se inmuniza a un mamífero no humano con el inmunógeno preparado como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, se inmuniza a un mamífero no humano con de 20 a 1000 |jg de inmunógeno mezclados con un adyuvante tal como el adyuvante completo no de Freund, el adyuvante RIBI o el ALUM. El mamífero no humano es preferentemente un conejo, una cabra, un caballo, una oveja, un cerdo, una rata o un ratón, entre los cuales se prefieren un conejo o una cabra, y más preferentemente un conejo. La inmunización puede llevarse a cabo mediante administración intramuscular, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intraperitoneal o administración en los ganglios linfáticos. La inmunización de refuerzo puede llevarse a cabo mediante la administración similar del inmunógeno mezclado con un adyuvante, tal como el adyuvante incompleto de Freund, el adyuvante RIBI o el ALUM, o mediante la administración directa del inmunógeno por vía intravenosa en un intervalo de 1 a 4 semanas tras la administración inicial.
Los anticuerpos policlonales dirigidos al inmunógeno se pueden recoger de la sangre o del líquido peritoneal, preferentemente de la sangre, del mamífero no humano inmunizado según el procedimiento anterior. La sangre se extrae del mamífero no humano inmunizado según un procedimiento normal de extracción de sangre, tal como la arteria carótida, la vena auricular, el corazón o la vena de la pierna. De la sangre recogida, el antisuero puede separarse por centrifugación. Para la preparación de anticuerpos policlonales, se usa de manera preferente antisuero obtenido de individuos de mamíferos no humanos inmunizados que tengan un título de anticuerpos. El título de anticuerpos en el antisuero puede medirse, por ejemplo, permitiendo la reacción del péptido P03 marcado con el antisuero y midiendo después la actividad de la etiqueta unida al péptido P03, o permitiendo la reacción del péptido P03 inmovilizado en una placa con el antisuero y detectando la cantidad de anticuerpos unidos al péptido P03 usando un anticuerpo secundario marcado. A continuación, se somete el antisuero a la precipitación de una fracción de yglobulina mediante desalación, en la que se añade sulfato de amonio o sulfato de sodio, y diálisis en un tampón adecuado, y después se pueden preparar los anticuerpos policlonales dirigidos al inmunógeno (por ejemplo, anticuerpos policlonales purificados de la fracción IgG) usando una matriz de afinidad que pueda purificar específicamente la y-globulina, tal como la proteína A y la proteína G.
Los anticuerpos policlonales así preparados pueden contener, además de los anticuerpos policlonales específicos de P03, anticuerpos policlonales antipresepsina distintos de los anticuerpos policlonales específicos de P03. En la presente invención, los anticuerpos policlonales así preparados se someten a un tratamiento que aumenta la proporción de anticuerpos que se unen específicamente al péptido P03. El tratamiento puede incluir, por ejemplo, una purificación.
Para purificar los anticuerpos policlonales antipresepsina que se unen al péptido P03 (denominados "anticuerpos policlonales purificados P03") de los anticuerpos policlonales obtenidos, la purificación se lleva a cabo usando una matriz de afinidad. Más detalladamente, la matriz de afinidad es una columna en la que está inmovilizado el péptido P03. Puesto que el péptido P03 se une a la columna a través de un grupo SH, la cisteína puede unirse a los extremos N o C. La secuencia de aminoácidos del péptido P03 que tiene cisteína enlazada en su extremo N-terminal y la secuencia de aminoácidos del péptido P03 con cisteína enlazada en su extremo C-terminal se indican en la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. Preferentemente, la columna inmovilizada con péptidos P03 es una columna a la que se unen tanto el péptido P03 con cisteína enlazada en su extremo N-terminal como el péptido P03 con cisteína enlazada en su extremo C-terminal. Los anticuerpos policlonales P03 purificados pueden prepararse purificando la fracción de IgG purificada obtenida tal como se ha indicado anteriormente en una columna de este tipo.
Los anticuerpos policlonales purificados P03 son anticuerpos obtenidos por medio de purificación usando el péptido P03, como se ha indicado anteriormente, y uniéndose al péptido P03, y el porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales específicos P03 en los anticuerpos policlonales purificados P03 es mayor que el porcentaje de contenido de anticuerpos policlonales específicos P03 en los anticuerpos S68. Por lo tanto, los anticuerpos policlonales purificados P03 pueden presentar excelentes propiedades derivadas de los anticuerpos policlonales específicos P03 en comparación con los anticuerpos S68.
Según sea necesario, la especificidad de los anticuerpos obtenidos puede confirmarse llevando a cabo un ensayo de inhibición competitiva de péptidos de acuerdo con la descripción del Ejemplo 3 y, según el resultado del mismo, los anticuerpos pueden someterse al tratamiento siguiente.
Por ejemplo, los anticuerpos policlonales purificados P03 preparados pueden contener, además de los anticuerpos policlonales específicos P03, anticuerpos policlonales que se unen a al menos un péptido seleccionado entre el péptido P02 y el péptido P04, por ejemplo, el péptido P02 o el péptido P04.
En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos policlonales purificados P03 obtenidos pueden someterse, además, a un tratamiento que elimine los anticuerpos que se unen al péptido P04 o, preferentemente, los anticuerpos que se unen al péptido P02 y al péptido P04. Ejemplos del tratamiento que elimina los anticuerpos que se unen a los péptidos incluyen la purificación mediante una matriz de afinidad. Más detalladamente, por ejemplo, cuando el anticuerpo contiene anticuerpos que se unen al péptido P04, se usa una columna inmovilizada con el péptido P04 para la matriz de afinidad. Puesto que el péptido P04 se une a la columna a través de un grupo SH, la cisteína puede unirse en los extremos N- o C-terminal. Preferentemente, la columna inmovilizada con péptidos P04 es una columna a la que se unen tanto el péptido P04 con cisteína enlazada en su extremo N-terminal como el péptido P04 con cisteína enlazada en su extremo C-terminal. Llevando a cabo la purificación usando dicha columna, los anticuerpos que se unen al péptido P04 pueden ser eliminados de los anticuerpos policlonales purificados P03. Cuando los anticuerpos también contienen anticuerpos que se unen al péptido P02, se puede usar una columna inmovilizada con el péptido P02 para la purificación de manera similar a la anterior. En consecuencia, los anticuerpos policlonales antipresepsina que se unen específicamente al péptido P03 (denominados "anticuerpos policlonales específicos de P03") pueden obtenerse a partir de anticuerpos policlonales purificados de P03.
En otras realizaciones de la presente invención, los anticuerpos policlonales purificados P03 obtenidos pueden someterse, además, a un tratamiento que reduzca la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P04 o, preferentemente, a un tratamiento que reduzca una actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P02 y de los anticuerpos que se unen al péptido P04. Ejemplos del tratamiento que reduce la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P04 incluyen un tratamiento en el que el péptido P04 se añade a los anticuerpos policlonales purificados P03 para permitir la reacción antígeno-anticuerpo y se bloquea una actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P04. Un tratamiento que reduce la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P02 también puede llevarse a cabo de manera similar a la anterior. En consecuencia, puede reducirse la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P04 o, preferentemente, la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P02 y de los anticuerpos que se unen al péptido P04 en los anticuerpos policlonales purificados P03.
Se puede preparar un fragmento de unión a antígeno a partir de los anticuerpos policlonales así producidos según un procedimiento bien conocido.
Entre los fragmentos de unión a antígenos, Fab indica un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígenos en la que aproximadamente la mitad de la cadena H en el lado N-terminal y una cadena L completa están unidas mediante un enlace disulfuro. Los Fab pueden prepararse, por ejemplo, tratando los anticuerpos IgG policlonales con una proteasa papaína para fragmentar los anticuerpos y purificarlos, si es necesario, según un procedimiento bien conocido.
El F(ab')2 está unido a Fab con un enlace disulfuro de una región bisagra. Los F(ab')2 pueden prepararse tratando los anticuerpos IgG policlonales con la proteasa pepsina para fragmentar los anticuerpos y purificarlos, si es necesario, según un procedimiento bien conocido.
Fab' es un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión al antígeno y que se obtiene mediante la digestión del enlace disulfuro de una región bisagra de F(ab')2. El Fab' puede prepararse, por ejemplo, tratando el F(ab')2 con un reactivo reductor, el ditiotreitol, para digerir el enlace disulfuro de una región bisagra y purificarlo, si es necesario, según un procedimiento bien conocido.
3. Procedimiento para medir la presepsina
La presente invención proporciona un procedimiento (denominado "procedimiento de medición de la presente invención") para medir inmunológicamente la presepsina usando los anticuerpos de la presente invención, en donde el procedimiento incluye el paso de exponer los anticuerpos de la presente invención a una muestra que contiene presepsina. En el presente documento, el término "medición" puede usarse indistintamente con términos tales como "detección", "cuantificación", "ensayo" y se usa para incluir los significados de las determinaciones cuantitativas y cualitativas. La medición de la presepsina se realiza preferentemente in vitro.
Puesto que la presepsina es un marcador conocido para la detección de la sepsis, el procedimiento puede considerarse como un procedimiento para detectar la sepsis, que comprende el paso de exponer los anticuerpos de la presente invención a una muestra que contiene presepsina.
A saber, el procedimiento puede considerarse como un procedimiento para detectar la sepsis o un procedimiento para ayudar a la detección o al diagnóstico de la sepsis, comprendiendo el procedimiento 1) el paso de medir la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto usando los anticuerpos de la presente invención, y 2) el paso de comparar la concentración de presepsina obtenida en 1) con un valor de corte para juzgar si la concentración es o no superior al valor de corte. El valor de corte es de 314 a 600 pg/ml, preferentemente de 400 a 580 pg/ml, más preferentemente de 450 a 550 pg/ml y aún más preferentemente de 500 pg/ml.
En la presente invención, "detección de una enfermedad" puede entenderse como "ayuda a la detección de una enfermedad" o "ayuda al diagnóstico de una enfermedad".
Los anticuerpos también pueden usarse para la detección o la evaluación de al menos una enfermedad seleccionada entre, por ejemplo, la discriminación entre la sepsis y el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), la evaluación del riesgo de la gravedad de la sepsis, la predicción del pronóstico de la sepsis (predicción de la mortalidad), la evaluación del grado de gravedad de la sepsis, la detección de la infección del sitio quirúrgico la detección de la coagulación intravascular diseminada (CID), la detección de la CID infecciosa, la detección de una cardiopatía, la detección de la infección respiratoria asociada a la infección bacteriana, la detección de la enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), la detección de la neutropenia febril (FN), la detección del síndrome hemofagocítico (HPS) y la evaluación de la función de los fagocitos.
El término "infección del sitio quirúrgico", tal como se usa aquí, significa enfermedades infecciosas que son causadas después de la cirugía, e incluye todas las infecciones debidas a la cirugía y las terapias adyuvantes necesarias para ello. La infección del sitio quirúrgico incluye todas las enfermedades diagnosticadas como infección del sitio quirúrgico según la Guía para la prevención de la infección del sitio quirúrgico, 1999 (CDC).
En cuanto a las enfermedades cardíacas, por ejemplo, se incluyen el síndrome coronario agudo (SCA), la insuficiencia cardíaca aguda, la insuficiencia cardíaca aguda descompensada (ICAD), la insuficiencia cardíaca crónica, la enfermedad arterial coronaria, la angina de pecho, el infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular isquémico, la hemorragia cerebral y el accidente isquémico transitorio.
La infección respiratoria asociada a la infección bacteriana puede ser una infección del tracto respiratorio inferior o una neumonía. La infección del tracto respiratorio inferior incluye la infección aguda del tracto respiratorio inferior y la infección crónica del tracto respiratorio inferior. La infección aguda de las vías respiratorias inferiores incluye la traqueítis aguda, la bronquitis aguda y la bronquiolitis aguda, y la mayoría de ellas se producen debido a la propagación de una infección vírica desde las vías respiratorias superiores a las inferiores y, en algunas de estas enfermedades, se produce entonces una infección secundaria por bacterias. Si se observan signos de infección bacteriana secundaria, se puede adaptar la administración de antibióticos. La infección crónica del tracto respiratorio inferior es una afección patológica en la que se ha establecido una infección bacteriana persistente en el tracto respiratorio inferior con trastornos orgánicos debidos a bronquiectasias o a la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, e incluye la infección persistente y la exacerbación aguda. Las enfermedades que provocan trastornos orgánicos en las vías respiratorias inferiores son las bronquiectasias, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la bronquitis crónica, la panbronquiolitis difusa, la tuberculosis pulmonar obsoluta, la neumoconiosis, la infección por micobacterias no tuberculosas, la aspergilosis broncopulmonar alérgica, la fibrosis pulmonar y el asma bronquial crónica. Tanto para la infección persistente como para la exacerbación aguda, se aplica la administración de antibióticos. La neumonía incluye la adquirida en la comunidad y la adquirida en el hospital. Preferentemente, la neumonía es una neumonía adquirida en la comunidad.
La evaluación de la función de los fagocitos incluye (a) la medición de la capacidad fagocítica de los neutrófilos, los granulocitos y/o los leucocitos, (b) la evaluación de la función inmunitaria mediante la medición de la capacidad fagocítica de los neutrófilos, los granulocitos y/o los leucocitos, (c) la evaluación de la calidad de las células implantables tras el trasplante de células autólogas o el trasplante de células alogénicas y (d) la detección de una enfermedad asociada a la fagocitosis de los fagocitos. Algunos ejemplos de enfermedades asociadas a la fagocitosis por parte de los fagocitos son las enfermedades autoinmunes, la artritis reumatoide, la inflamación de las mamas, la gota, la glomerulonefritis, la colitis ulcerosa, la fiebre mediterránea, la otitis media, la rinitis, la neumonía, la tuberculosis, la cistitis, la infección del líquido amniótico y la piospermia. La muestra usada para detectar la enfermedad asociada a la fagocitosis de los fagocitos son fluidos corporales tales como el líquido tisular, la linfa, el líquido sinovial, la leche, el líquido cefalorraquídeo, el pus, la saliva, el líquido lagrimal, el moco, la secreción nasal, el esputo, la orina, el líquido peritoneal, el líquido amniótico y el semen, así como los fluidos de lavado obtenidos tras el lavado de la cavidad nasal, los bronquios, los pulmones, la piel, la cavidad peritoneal, varios órganos, las articulaciones y los huesos.
Ejemplos del procedimiento para medir inmunológicamente la presepsina usando los anticuerpos de la presente invención incluyen el inmunoensayo enzimático (en lo sucesivo también denominado EIA o ELISA), el inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA), inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), procedimiento de anticuerpos fluorescentes (FAT), inmunoensayo enzimático fluorescente (FEIA), inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunocromatografía, procedimiento de aglutinación y ensayo competitivo. En la presente invención, se puede usar cualquiera de los procedimientos directos e indirectos. También puede usarse un procedimiento de sensibilización, en el que la detección se realiza tras la formación de complejos biotina-avidina (estreptavidina).
El EIA es uno de los inmunoensayos que usa un anticuerpo marcado con enzimas e incluye un procedimiento directo y un procedimiento indirecto. Entre los ejemplos preferidos se encuentra el ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) de tipo sándwich.
El ELISA de tipo sándwich es un procedimiento en el que la medición se realiza usando dos o más anticuerpos con diferentes sitios de reconocimiento de antígenos y formando complejos anticuerpo-antígeno-anticuerpo con un antígeno a detectar dispuesto entre dos tipos de anticuerpos, y uno de los anticuerpos previamente inmovilizado en una fase sólida.
El inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA) es un procedimiento en el que un antígeno de una muestra reacciona con un anticuerpo inmovilizado en partículas o perlas magnéticas, seguido de una reacción con un anticuerpo marcado con enzimas, un lavado (separación B/F), una reacción enzimática mediante la adición de un sustrato de quimioluminiscencia y la medición de la intensidad de la luminiscencia.
Por ejemplo, un antígeno en una muestra puede reaccionar con un anticuerpo conjugado con biotina en una fase líquida, el anticuerpo puede ser atrapado por partículas magnéticas unidas con estreptavidina y se puede dejar que un anticuerpo marcado con enzimas reacciones después del lavado (separación B/F), seguido por un tratamiento similar al anterior.
Cuando se usa una fosfatasa alcalina (ALP) como enzima de etiquetado, es preferente que el sustrato de quimioluminiscencia usado sea CDP-Star™, AMPPD™ o CSPD™. Cuando la enzima marcada es la HRP, se usa preferentemente luminol como sustrato de quimioluminiscencia.
Generalmente, se dice que la sensibilidad de detección es alta en el orden de quimioluminiscencia > fluorescencia > absorbancia (coloración), y el procedimiento de medición se puede seleccionar según la sensibilidad deseada.
El inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA) es un procedimiento en el que un antígeno de una muestra reacciona con un anticuerpo inmovilizado en partículas magnéticas, seguido de una reacción con un anticuerpo marcado con una sustancia quimioluminiscente, un lavado (separación B/F) y la medición de la intensidad de la luminiscencia. Como sustancia de etiquetado se usa el acridinio.
El inmunoensayo enzimático fluorescente (FEIA) es un procedimiento en el que un antígeno de una muestra reacciona con un anticuerpo inmovilizado, seguido de la reacción con un anticuerpo marcado con enzimas, el lavado (separación B/F), la reacción enzimática mediante la adición de un sustrato de fluorescencia y la medición de la intensidad de la fluorescencia. Como enzima de etiquetado se usa la HRP o la ALP. Es preferente que se use Amplex™ Red como sustrato de fluorescencia cuando la enzima de etiquetado es la HRP, y que se use 4-MUP (fosfato de 4-metiltilfenilo) o AttoPhos™ como sustrato de fluorescencia cuando la enzima de etiquetado es la ALP.
El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un procedimiento en el que se deja reaccionar un antígeno de una muestra, un anticuerpo inmovilizado en partículas magnéticas y un anticuerpo marcado con una sustancia de electroquimioluminiscencia, seguido de un lavado (separación B/F) y la medición de la intensidad de la luminiscencia de la energía eléctrica. Como sustancia de etiquetado se usa el rutenio. Cuando se usa Ru(bpy)3 como sustancia de etiquetado, la luminiscencia de excitación se repite debido a la oxidación basada en la carga de un electrodo y la reacción de reducción por tripropilamina (TPA) .
El radioinmunoanálisis ((RIA) es un procedimiento de medición que usa una sustancia marcada con un radioisótopo. Por ejemplo, tras la reacción de un antígeno en una muestra y un anticuerpo inmovilizado en perlas, se deja reaccionar un anticuerpo marcado con un radioisótopo (1251) y tras el lavado (separación B/F) la dosis de 1251 puede medirse.
La inmunocromatografía es un inmunoensayo basado en la acción capilar de una sustancia a detectar que migra en una tira reactiva mientras se disuelve un reactivo. Es un procedimiento en el que se forma un inmunocomplejo entre tres sustancias, a saber, un antígeno en una muestra, un anticuerpo marcado en una tira reactiva y un anticuerpo captador, y se observa el color del producto marcado. Como etiqueta de un anticuerpo se usa oro coloidal, enzimas o sustancias fluorescentes. Cuando se usa un anticuerpo marcado con enzimas, se aplica un sustrato para la enzima en una tira reactiva para el desarrollo del color.
Un procedimiento de flujo continuo es un procedimiento en el que sobre un soporte insoluble, que es una membrana, un antígeno que hay que detectar junto con una solución en una muestra forma un complejo anticuerpo-antígenoanticuerpo. En ese momento, una sustancia que no está inmovilizada en la membrana pasa perpendicularmente a través de la membrana desde la superficie anterior a la superficie posterior de la membrana, y es eliminada.
El procedimiento de aglutinación es un procedimiento en el que un antígeno de una muestra reacciona con un anticuerpo en un reactivo y se observa su aglutinación. El procedimiento incluye un procedimiento que no usa una fase sólida, un procedimiento de aglutinación de partículas (PA) en el que se usan partículas preparadas artificialmente como fase sólida, y un procedimiento de aglutinación de látex (LA) en el que se usan partículas de látex.
En el ensayo competitivo, por ejemplo, se fija un anticuerpo a una fase sólida y se hace reaccionar simultáneamente con una muestra para la prueba y una cierta cantidad de un antígeno etiquetado, y así se puede medir una cantidad de antígeno en la muestra a partir de la cantidad del producto etiquetado unido.
Los anticuerpos de la presente invención se usan preferentemente para los procedimientos de medición anteriores.
La muestra usada para la medición de la presepsina no está particularmente limitada, pero es preferentemente una muestra acuosa. Ejemplos de ello son fluidos corporales tales como la sangre (sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, etc.), la orina, el líquido tisular, el líquido linfático, el líquido sinovial, la leche, el líquido cefalorraquídeo, el pus, la saliva, el líquido lagrimal, el moco, la secreción nasal, el esputo, el líquido peritoneal, el líquido amniótico y el semen, así como los líquidos de lavado obtenidos tras el lavado de la cavidad nasal, los bronquios, los pulmones, la piel, la cavidad peritoneal, diversos órganos, las articulaciones, los huesos, los sobrenadantes de cultivos celulares y los eluyentes de columna. Dichas muestras pueden usarse directamente para la medición o después de la dilución o la extracción con diversos tampones, seguida de una concentración.
Además, en caso de usar sangre total como muestra, la muestra de sangre total se analizará en un plazo de 72 h, 48 h, 24 h, 12 h, 6 h o 4 h después de la recogida de la muestra de sangre total. La recogida de la muestra de sangre total puede realizarse usando un tubo de recogida de sangre con EDTA o un tubo de recogida de sangre con heparina. Preferentemente, la muestra de sangre total se analiza, dentro de las 6 horas siguientes a su recogida, en un tubo de recogida de sangre con EDTA o, dentro de las 4 horas siguientes a su recogida, en un tubo de recogida de sangre con heparina.
4. Kit de medición de sCD14-ST
La presente invención proporciona un kit (denominado "kit de medición de la presente invención") para medir la presepsina que incluye como un componente esencial los anticuerpos de la presente invención.
El kit de medición de la presente invención incluye preferentemente un reactivo auxiliar para medir la presepsina. Ejemplos del reactivo auxiliar incluyen un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario, un anticuerpo marcado, una enzima de marcado, una sustancia de marcado tal como el oro coloidal, un sustrato cromogénico, un sustrato de fluorescencia (tal como Amplex™ Red, AttoPhos™ y 4-MUP), un sustrato de quimioluminiscencia (tal como luminol, CDP-Star™, AMPPD™ y CSPD™), una sustancia de unión específica tal como biotina-estreptavidina, un soporte insoluble, un agente de bloqueo, un diluyente, una solución de lavado y una sustancia estándar.
Los kits de medición de la presente invención se combinan y usan adecuadamente según el procedimiento de medición de la presepsina.
El anticuerpo primario es preferentemente un anticuerpo que se une a la presepsina y es más preferentemente un anticuerpo que reconoce un epítopo diferente del reconocido por los anticuerpos de la presente invención. Ejemplos de ello son el anticuerpo F1106-13-3 y el anticuerpo F1031-8-3 descritos en el Ejemplo 3 del documento WO2004/044005.
Cualquiera de los anticuerpos de la presente invención y el anticuerpo primario pueden ser marcados. Si ninguno de los anticuerpos de la presente invención o el anticuerpo primario están marcados, puede usarse un anticuerpo secundario marcado.
Entre los ejemplos del vehículo insoluble se encuentran las partículas magnéticas, las perlas, el vidrio, la celulosa, la nitrocelulosa, los polímeros sintéticos porosos, las fibras de vidrio, la poliacrilamida, el nylon, el poliestireno, el cloruro de polivinilo, el polipropileno, las placas de plástico, las partículas de látex, las telas no tejidas y el papel de filtro.
Una etiqueta para un anticuerpo pueden ser preferentemente enzimas tales como la peroxidasa (HRP), la fosfatasa alcalina (ALP) y la p-galactosidasa y el oro coloidal.
Por ejemplo, cuando se usa la HRP, un sustrato cromogénico puede ser la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) o la ofenilendiamina (OPD). Cuando se usa la ALP, un sustrato cromogénico puede ser el p-nitrofenilfosfato (pNPP). Algunos ejemplos de sustrato cromogénico cuando se usa la p-galactosidasa son el o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPD).
Por ejemplo, un kit de medición para ELISA de tipo sándwich puede contener los anticuerpos de la presente invención y un anticuerpo primario (cualquiera de los anticuerpos puede estar marcado con una enzima), un sustrato cromogénico, un diluyente y una sustancia estándar. Cuando ninguno de los anticuerpos de la presente invención o el anticuerpo primario están marcados, el kit puede contener también un anticuerpo secundario marcado.
Un kit de medición para inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA) puede contener, por ejemplo, un anticuerpo inmovilizado en partículas magnéticas, un anticuerpo marcado con enzimas, un sustrato de quimioluminiscencia, un diluyente y una solución de lavado.
Un kit de medición para el inmunoensayo enzimático fluorescente (FEIA) puede contener, por ejemplo, un anticuerpo inmovilizado en partículas magnéticas, un anticuerpo marcado con enzimas, un sustrato de fluorescencia, un diluyente y una solución de lavado.
Un kit de medición para el inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) puede contener, por ejemplo, un anticuerpo biotinilado, un anticuerpo marcado con Ru(bpy)3, partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina y tripropilamina.
Un kit de medición para inmunocromatografía es una tira reactiva que incluye una unidad de adición de muestra, una unidad de reactivo, una unidad de detección y una unidad absorbente que se proporcionan de manera que una muestra líquida añadida a una unidad de adición de prueba migra, en el orden mencionado, a través de las unidades. Por ejemplo, la unidad de reactivos puede estar impregnada de un segundo anticuerpo marcado y en la unidad de detección puede haber un vehículo insoluble unido a un primer anticuerpo.
La tira reactiva puede ilustrarse por medio de una que contenga un vehículo poroso. Entre los ejemplos de vehículos porosos se encuentran la nitrocelulosa, la celulosa, los derivados de la celulosa, el nylon, las fibras de nylon, las fibras de vidrio y los polímeros sintéticos porosos. La unidad absorbente pueden ser polímeros absorbentes tales como esponjas hechas con materiales absorbentes de agua, filtros de celulosa, papel de filtro.
Tal como se ha informado de que los pacientes con sepsis tienen un aumento característico de la concentración de presepsina en sangre, el kit de medición de presepsina de la presente invención puede ser un kit para detectar la sepsis o un kit para ayudar a la detección o el diagnóstico de la sepsis.
El kit de medición de la presente invención también puede usarse como agente de diagnóstico de la sepsis o como agente auxiliar para el diagnóstico de la sepsis. Cuando el kit de medición de presepsina se usa con un propósito de detección de la sepsis, se determina que un sujeto tiene una posibilidad de sufrir sepsis cuando la concentración de presepsina en una muestra del sujeto, medida usando los anticuerpos de la presente invención, es superior a un valor de corte, por lo que esto puede ayudar a la detección o al diagnóstico. El valor de corte es de 314 a 600 pg/ml, preferentemente de 400 a 580 pg/ml, más preferentemente de 450 a 550 pg/ml y más preferentemente de 500 pg/ml.
Además, un kit de medición de la presepsina puede usarse para la detección o la evaluación, por ejemplo, de al menos una enfermedad seleccionada de entre, por ejemplo, la distinción de la sepsis del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), la evaluación del riesgo de la gravedad de la sepsis, el pronóstico que ayuda a la detección de la sepsis (predicción de la mortalidad), la evaluación del grado de gravedad de la sepsis, la detección de la infección del sitio quirúrgico, la detección de la coagulación intravascular diseminada (CID), la detección de la CID infecciosa, la detección de la cardiopatía, la detección de la infección respiratoria asociada a la infección bacteriana, la detección de la enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), la detección de la neutropenia febril (FN), la detección del síndrome hemofagocítico (HPS) y para evaluar la función de los fagocitos. El kit de medición de presepsina puede ser un kit para al menos una detección o una evaluación de enfermedades como las descritas anteriormente.
5. Procedimiento para la terapia de pacientes con sepsis
Se divulga además un procedimiento de tratamiento de un paciente con sepsis, que comprende el tratamiento de la sepsis en un sujeto que ha sido sometido a un procedimiento de ayuda a la detección de la sepsis usando los anticuerpos de la presente invención.
El procedimiento de ayuda a la detección de la sepsis es el descrito anteriormente. El tratamiento de la sepsis incluye, por ejemplo, la administración de agentes antibacterianos o esteroides, vasopresores, reposición de líquidos, administración de oxígeno, control de la respiración artificial, hemodiafiltración continua y plasmaféresis, pero no está limitado de manera particular.
6. Procedimiento de cribado de medicamentos de prueba (o terapéuticos)
Se desvela, además, un procedimiento para el cribado de un fármaco de prueba (o un fármaco terapéutico), que comprende el paso de determinar una concentración de presepsina en una muestra de un sujeto administrado con el fármaco de prueba (o el fármaco terapéutico), usando los anticuerpos de la presente invención o el kit de medición de la presente invención. No hay limitación referente a la enfermedad a la que se dirige un fármaco de prueba siempre que sea una enfermedad en la que la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto esté aumentada. Preferentemente, la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto se compara entre antes y después de la administración de un fármaco de prueba para determinar si la concentración de presepsina después de la administración de un fármaco de prueba se reduce o no en comparación con antes de la administración. Alternativamente, se determina si la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto tras la administración de un fármaco de prueba se reduce o no en comparación con el nivel de una persona normal.
El procedimiento de cribado de un fármaco de prueba puede comprender el siguiente paso:
1) una etapa de determinación de la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto al que se le ha administrado un fármaco de prueba.
7. Procedimiento de cribado de anticuerpos policlonales antipresepsina
La presente invención proporciona un procedimiento para el cribado de anticuerpos, con objeto de obtener un anticuerpo policlonal antipresepsina útil para la medición de la presepsina en una muestra, en donde el procedimiento incluye al menos los siguientes pasos:
1) la etapa de obtención de candidatos a anticuerpos policlonales antipresepsina; y
2) el paso de construir un sistema de medición de presepsina con los anticuerpos candidatos y seleccionar los anticuerpos en un sistema de reacción para la reacción competitiva de un péptido (péptido P03) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para inhibir la unión entre los anticuerpos y la presepsina, inhibiendo los anticuerpos seleccionados competitivamente la unión de los anticuerpos y la presepsina en un 30 % o más, y
en un sistema de reacción para permitir la reacción competitiva de un péptido (péptido P05) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 para inhibir la unión entre los anticuerpos y la presepsina, inhibiendo los anticuerpos seleccionados competitivamente la unión de los anticuerpos y la presepsina en menos de un 30 %.
El ensayo de inhibición competitiva puede llevarse a cabo según la descripción del Ejemplo 3.
Preferentemente, el procedimiento puede incluir además el paso de seleccionar anticuerpos que tengan una inhibición competitiva por el péptido P01, el péptido P02, el péptido P04, el péptido P06, el péptido P07 y/o el péptido P08 inferior al 30 %. Los péptidos se pueden seleccionar de manera conveniente.
La presente invención se describe más específicamente a continuación por medio de ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos policlonales purificados específicamente con el péptido S68 o el péptido P03
Se purificaron específicamente los anticuerpos policlonales de conejo contra el péptido S68, obtenidos mediante la inmunización de conejos con un péptido inmunógeno S68, usando columnas de afinidad en las que se inmovilizaron el péptido P03 (SEQ ID NO: 1) y el péptido S68 (SEQ ID NO: 2), respectivamente.
1-1: Preparación de anticuerpos policlonales de conejo contra el péptido S68
Según el procedimiento divulgado en el Ejemplo 1 del documento WO2004/044005, los conejos fueron inmunizados con un inmunógeno S68 péptido-KLH. A continuación, se preparó el antisuero según un procedimiento convencional y se prepararon 3 lotes de fracciones de IgG purificadas (A, B y C) mediante precipitación con sulfato de amonio y purificación con proteína A (Prosep-A, Millipore Corporation).
1-2: Preparación de la columna de afinidad inmovilizada con péptido P03 y de la columna de afinidad inmovilizada con péptido S68
Según el manual, se empaquetaron 3,0 ml de SulfoLink Coupling Gel (ThermoFisher Scientific) en una columna que se lavó con 6 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 5 mM EDTA (pH 8,5). Se cerró el fondo de la columna con una tapa. Se disolvieron péptido S68 (2,5 mg) con cisteína enlazada en el extremo N-terminal y péptido P03 (3,0 mg, una mezcla de cantidades iguales de SEQ ID NO: 4 y 5) con enlaces de cisteína en los extremos N- o C-terminal, respectivamente, en 50 mM Tris, 5 mMEDTA (pH 8,5) a 1 mg/ml.
El péptido P03 con cisteína enlazada en el extremo N-terminal (SEQ ID NO: 4: CKRVDADADPR).
Péptido P03 con cisteína enlazada en el extremo C-terminal (SEQ ID NO: 5: KRVDADADPRC).
Se añadieron las soluciones peptídicas preparadas al gel de cada columna y se selló la parte superior de cada columna. Se mezclaron las columnas por inversión a temperatura ambiente durante 15 minutos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiraron las tapas de la parte superior e inferior de las columnas y se recogieron las soluciones de reacción por goteo natural. Se lavó el gel con 3 volúmenes de gel de Tris 50 mM, EDTA 5 mM (pH 8,5), seguido de un bloqueo de los grupos activos no reactivos con una solución que contenía 50 mM de cisteína. Tras la reacción, se lavó el gel con 16 volúmenes de gel de NaCl 1 M y 16 volúmenes de gel de tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Se guardó el gel en un refrigerador después de añadir una solución de NaCl/PBS 1 M.
1-3: Preparación de anticuerpos específicamente purificados
Se inyectaron el gel inmovilizado con péptido S68 y el gel inmovilizado con péptido P03, preparados en 1-2, respectivamente en columnas de 1 ml que se lavaron con PBS y se equilibraron. Se aplicaron 3 lotes de fracciones de IgG purificadas (50 mg cada una) obtenidas en 1-1 a dos columnas de afinidad inmovilizadas con péptidos diferentes a un flujo de 0,5 ml/min y se lavó con PBS la fracción no adsorbida. A continuación, se eluyeron las columnas con tampón Glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5) y se recogieron las fracciones de los picos. Se neutralizaron las fracciones eluidas obtenidas, se concentraron y se dializaron con PBS (pH 7,4). Se verificó en SDS-PAGE la pureza de los anticuerpos obtenidos, y se observó una única banda de alrededor de 150 kDa. La concentración de proteínas se midió con DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Los resultados de la concentración de proteínas de los anticuerpos preparados se muestran en la Tabla 1. S68-A, S68-B y S68-C indican anticuerpos obtenidos por purificación específica en la columna de afinidad inmovilizada con péptidos S68 y P03-A, P03-B y P03-C indican anticuerpos obtenidos por purificación en la columna de afinidad inmovilizada con péptidos P03.
Tabla 1
[Cuadro 1]
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Ejemplo 2: Evaluación de la reactividad con presepsina
Usando seis anticuerpos diferentes específicamente purificados preparados en el Ejemplo 1, se prepararon sistemas ELISA de tipo sándwich y un producto estándar de presepsina (rsCD14-ST divulgado en el Ejemplo 16 de WO2005/108429) y se evaluó la reactividad de estos anticuerpos (en lo sucesivo, los anticuerpos obtenidos por purificación específica en la columna de afinidad inmovilizada por péptidos P03 se denominan "anticuerpos policlonales purificados P03" y los anticuerpos obtenidos por purificación específica en la columna de afinidad inmovilizada por péptidos S68 se denominan "anticuerpos S68").
2-1: Preparación de placas inmovilizadas con anticuerpos
Se diluyeron seis anticuerpos preparados en el Ejemplo 1 respectivamente en PBS (pH 7,4) a 5 pg/ml y se dispensaron en placas inmunológicas (MAXISORP, placa C8, Nunc). Las placas se sellaron y se incubaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se lavaron cinco veces las placas con PBS frío (pH 7,4) y se añadieron 200 ml de solución de bloqueo para preparar las placas en las que se inmovilizaron los respectivos anticuerpos.
2-2: Comparación de la reactividad de anticuerpos específicamente purificados mediante ELISA de tipo sándwich Se diluyó el producto estándar de presepsina a 500 pg/ml en un diluyente de muestra (D-PBS (pH 7,4) que contenía el 0,1 % de BSA). Se añadieron a cada placa preparada en 2-1 50 pl por pocillo de diluyente de la muestra (correspondiente a 0 pg/ml de producto estándar de presepsina) o 500 pg/ml de producto estándar de presepsina y se dejó que la reacción se desarrollara en un agitador (TAITEc bioShaker M-BR-022UP) a 500 rpm y 25 °C durante 1 h. Una vez completada la reacción, se lavaron las placas cinco veces con solución salina que contenía 0,05 % de Tween® 20 en un lavador de placas (Biotec MW-96AR, Nunc-ImmunoWash), seguido de la adición de 50 pl por pocillo de una solución de un anticuerpo F1106-13-3 marcado con peroxidasa (divulgado en el Ejemplo 3 de W02004/044005) diluida en un diluyente de anticuerpos marcados a 0,125 pg/ml. Tras la reacción a 25 °C y 500 rpm durante 2 h, se lavaron las placas igualmente cinco veces, se añadió a cada pocillo una solución de tetrametilbencidina (TMB, BioFx) y se dejó que la reacción continuara a temperatura ambiente durante 20 min. Se añadieron a cada pocillo 50 pl de solución de ácido sulfúrico 1 M para terminar la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm/650 nm en un espectrofotómetro de placa (CORONA ELECTRIC MTP-300). En la Tabla 2 se muestra la absorbencia de los anticuerpos cuando se añadieron 0 pg/ml o 500 pg/ml de producto estándar de presepsina.
Como resultado, la relación S/N (Absorbancia a la adición de 500 pg/ml de producto estándar de presepsina / Absorbancia de 0 pg/ml de producto estándar de presepsina) determinada sobre la base de la absorbancia fue de 44 a 57 para los anticuerpos policlonales purificados P03, mientras que fue de 17 a 35 para los anticuerpos S68. Se comprobó que la relación S/N de los anticuerpos policlonales purificados P03 era de 2 a 3 veces mayor que la de los anticuerpos S68. Como resultado, se descubrió que incluso si los anticuerpos se obtenían de los mismos anticuerpos policlonales, la purificación con la columna de afinidad inmovilizada por péptidos P03 podía preparar anticuerpos que tuvieran una mayor reactividad a la presepsina que la purificación con la columna inmovilizada por péptidos S68.
[Tabla 2]
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 3: Evaluación de la especificidad: reacción de inhibición competitiva de péptidos
Con el fin de evaluar la especificidad de seis anticuerpos diferentes preparados en el Ejemplo 1, se usó el ELISA de tipo sándwich preparado en el Ejemplo 2 y se añadieron péptidos parciales procedentes del péptido S68 (10 aminoácidos cada uno, véase la Tabla 3) a la reacción respectivamente de los anticuerpos con la presepsina para realizar un ensayo de inhibición competitiva.
3-1: Preparación de péptidos
Se sintetizaron ocho péptidos con el péptido P01 que comprendía 10 aminoácidos incluyendo 3 aminoácidos N-terminales del péptido s 68 y los otros péptidos que comprendían 3 aminoácidos desplazados del mismo hacia el lado del extremo C-terminal (Tabla 3). Los péptidos sintetizados se diluyeron en PBS (pH 7,4) hasta 20 mg/ml para preparar péptidos inhibidores.
[Tabla 3]
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
3-2: Evaluación de la especificidad
Se diluyó el producto estándar de presepsina en PBS (pH 7,4) para preparar un producto estándar de 400 pg/ml. Como control, se usó PBS (pH 7,4) sin péptido. Según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, se añadieron 25 pl del péptido inhibidor preparado en 3-1 y 25 pl del producto estándar de presepsina a las placas preparadas con los respectivos anticuerpos específicamente purificados y se dejaron reaccionar a 25 °C y 500 rpm durante 1 h. Tras lavar las placas, se añadió un anticuerpo marcado y se dejó reaccionar de forma similar. A partir de la absorbencia obtenida, se consideró que un péptido cuya absorbencia se redujo en un 30 % o más en comparación con la del control, tenía actividad de unión.
Como resultado, los anticuerpos S68 contenían anticuerpos que reaccionaban con los péptidos P01 a P05, mientras que 2 lotes de los anticuerpos policlonales purificados P03 contenían anticuerpos que reaccionaban con el péptido P03 y el péptido P04 y 1 lote de los anticuerpos policlonales purificados P03 contenía anticuerpos que reaccionaban con el péptido P02, el péptido P03 y el péptido P04. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
[Tabla 4]
Figure imgf000019_0002
Ejemplo 4: Comparación de la reacción cruzada con la sCD14 de alto peso molecular en sangre
Se midió mediante ELISA de sándwich la reacción cruzada de seis anticuerpos, obtenidos en el Ejemplo 1, con sCD14 de alto peso molecular en sangre. A partir de los resultados del Ejemplo 3, se encontró que los anticuerpos policlonales purificados P03 contenían anticuerpos que se unían al péptido P03 y al péptido P04. Así, en el ELISA que usa los anticuerpos policlonales purificados P03, se añadió una concentración final de 20 pg/ml de péptido P04 a los diluyentes de sCD14 de alto peso molecular en sangre y al producto estándar de presepsina para bloquear la actividad de unión de los anticuerpos que se unen al péptido P04, evaluando así los anticuerpos (anticuerpos policlonales específicos P03) que se unen específicamente al péptido P03.
4-1: Preparación de sCD14 de alto peso molecular en sangre
Se preparó de la siguiente manera sCD14 de alto peso molecular en sangre. Se aplicó suero humano normal a una columna en la que se colocó un anticuerpo anti-CD14 (F1024-1-3: divulgado en el Ejemplo 2 del documento WO01/072993), se inmovilizó y se absorbió CD14 para preparar suero humano absorbido CD14. Se midió, con el kit ELISA CD14 (R&D Systems, Inc., #DC140), la concentración de sCD14 de alto peso molecular en sangre en suero humano absorbido y en suero humano normal. El suero humano normal tenía una concentración de sCD14 de alto peso molecular en sangre de 1603 ng/ml y el suero humano absorbido por CD14 tenía 21 ng/ml. Se mezclaron los sueros para preparar una serie de diluciones de sCD14 de alto peso molecular.
4-2: Medición de la reacción cruzada
Se preparó una serie de diluciones de sCD14 de alto peso molecular en sangre (21 a 1603 ng/ml), se diluyó 20 veces en un diluyente y se midió la absorbancia por ELISA usando los respectivos anticuerpos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. También se midieron los productos estándar de presepsina (0 a 500 pg/ml) y se preparó una curva estándar de presepsina basada en la absorbancia obtenida. Se midió mediante ELISA, usando los anticuerpos, la absorbencia de una muestra que contenía sCD14 de alto peso molecular en sangre (1603 ng/ml), se trazó sobre la curva estándar de presepsina y se determinó la concentración correspondiente a la absorbencia. Se calculó la reacción cruzada dividiendo la concentración obtenida por la concentración (como la medición se realizó tras una dilución de 20 veces, se usaron 80 ng/m) de sCD14 de alto peso molecular en la sangre usada para la medición
Reacción cruzada (%) = (concentración determinada representando gráficamente la
absorbancia de una muestra que contienen sCD14 de alto peso molecular en sangre, medida con
los anticuerpos en una curva estándar de presepsina / concentración de sCD14 en sangre de alto
peso molecular usado para la medición ) x 100
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Como resultado, se encontró que en el sistema de ensayo ELISA usando los anticuerpos policlonales específicos de P03, la reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular en sangre estaba en del límite de detección, o por debajo del mismo, y los anticuerpos policlonales específicos de P03 tenían una rara reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular en sangre. A partir de los resultados, se demostró que el ELISA preparado con anticuerpos policlonales específicos de P03 permite medir la presepsina con mayor precisión que el ELISA que usa anticuerpos s 68.
Cuadro 5 (ND: en el límite de detección o por debajo de él)
[Tabla 5]
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 5: Medición de muestras de pacientes con sepsis de concentración conocida.
Usando el ELISA preparado con seis anticuerpos diferentes obtenidos en el Ejemplo 1, se midieron 22 muestras de pacientes con sepsis que tenían una concentración conocida y se realizó un análisis de correlación. Se midió, con el kit de medición de presepsina usando anticuerpos S68, la presepsina de las muestras con concentración conocida. Según el ejemplo 4, se añadió una concentración final de 20 pg/ml del péptido P04 a los diluyentes del producto estándar de presepsina y a las muestras de los pacientes para bloquear los anticuerpos que se unen al péptido P04 en los anticuerpos policlonales purificados P03, evaluando así los anticuerpos policlonales específicos P03.
5-1: Medición de muestras de pacientes con sepsis mediante ELISA de tipo sándwich
Usando el ELISA de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 2, se midieron productos de presepsina estándar (0 a 500 pg/ml, 8 puntos con n = 2 cada uno) y muestras de pacientes de sepsis diluidas 20 veces en un diluyente (n = 2). Se preparó una curva estándar a partir de las absorbancias de los productos estándar de presepsina usando SoftMax Pro (Molecular Devices, Llc.) y se calculó la concentración de cada muestra. Se excluyeron del análisis los valores medidos con un coeficiente de varianza (CV) igual o superior al 30 %.
5-2: Análisis de correlación de los resultados medidos
Con los valores medidos obtenidos en 5-1 y la concentración conocida, se realizó un análisis de correlación en Excel 2007 para determinar las líneas de regresión. Las líneas de regresión preparadas para los anticuerpos policlonales específicos de P03 (3 lotes) se muestran en las Figs. 1 a 3. Los resultados del análisis de regresión se muestran en el cuadro 6.
Como resultado, el coeficiente de varianza (CV) de las pendientes de las líneas de regresión para 3 lotes de anticuerpos S68 fue del 20 %, mientras que el CV para 3 lotes de anticuerpos policlonales específicos de P03 fue del 10,6 %. Mediante el uso de los anticuerpos policlonales específicos para P03, se sugiere que se puede preparar un

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpos policlonales antipresepsina, en donde los anticuerpos se unen específicamente a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
2. Los anticuerpos según la reivindicación 1,
en donde la unión entre los anticuerpos y la presepsina es inhibida competitivamente en un 30 % o más en un sistema de reacción ELISA competitivo, en el que un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es añadido a la reacción de los anticuerpos y la presepsina, y
en donde la unión entre los anticuerpos y la presepsina es inhibida competitivamente en menos del 30 % en un sistema de reacción ELISA competitivo, en donde un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 es añadido a la reacción de los anticuerpos y la presepsina.
3. Los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich construido por los anticuerpos tiene una incidencia de reacción cruzada con CD14 soluble de alto peso molecular en sangre humana menor que un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich que usa anticuerpos policlonales antipresepsina obtenidos de un mamífero inmunizado con un péptido de SEQ ID NO: 2 como inmunógeno y usando para la purificación una columna de afinidad inmovilizada por péptidos de SEQ ID NO: 2.
4. Los anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich construido por los anticuerpos es adecuado para medir una concentración de presepsina de las muestras (en una concentración conocida de presepsina) que contienen presepsina para llevar a cabo un análisis de correlación de los valores medidos y de la concentración conocida, siendo un coeficiente de varianza (CV) de las pendientes de las líneas de regresión del 15 % o menos.
5. Los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los anticuerpos se unen a la presepsina con una afinidad (KD) inferior a 10-7 M.
6. Los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los anticuerpos se obtienen purificando anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado con un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
7. Los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, obtenidos sometiendo a los anticuerpos policlonales a un tratamiento para aumentar la proporción de anticuerpos que se unen específicamente al péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 1, en donde los anticuerpos policlonales se obtienen de un mamífero no humano inmunizado con un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos desde la posición 1 hasta la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde el tratamiento es la purificación.
8. Los anticuerpos de la reivindicación 1 que se obtienen mediante la purificación, usando una columna en la que se inmoviliza un péptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que además puede tener una cisteína en su extremo N-terminal o C-terminal, de anticuerpos policlonales obtenidos de un mamífero no humano inmunizado usando, como inmunógeno, un péptido que incluye residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
9. Los anticuerpos según la reivindicación 8, sometidos además a un tratamiento que elimina la unión de los anticuerpos a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
10. Los anticuerpos según la reivindicación 8, sometidos además a un tratamiento que reduce la actividad de unión de los anticuerpos que se unen a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
11. Un procedimiento para producir anticuerpos policlonales antipresepsina, que comprende al menos los siguientes pasos: el paso de obtener anticuerpos policlonales de un mamífero no humano inmunizado usando un péptido, como inmunógeno, que incluye residuos de aminoácidos de la posición 1 a la posición 9 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que incluye 9 o más residuos de aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y la etapa de purificación de los anticuerpos obtenidos usando una columna en la que se ha inmovilizado un péptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que además puede tener una cisteína en su extremo N-terminal o C-terminal,.
12. El procedimiento para producir anticuerpos policlonales antipresepsina según la reivindicación 11, que comprende además el paso de eliminar los anticuerpos que se unen a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
13. Un procedimiento para medir la presepsina, que comprende al menos el paso de exponer los anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a una muestra que contiene presepsina.
14. Un kit para medir la presepsina, o para detectar la sepsis, o para ayudar a la detección o al diagnóstico de la sepsis, comprendiendo dicho kit al menos los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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