WO2012046727A1 - ウイルスベクターの製造方法 - Google Patents

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和久 新村
敬章 片山
研輔 酒井
俊浩 小代
広文 吉岡
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N2740/10051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a viral vector and a medium for producing a viral vector.
  • gene therapy using viral vectors has been developed for the treatment of cancer and infectious diseases, and many clinical trials have been conducted.
  • many attempts have been made for gene therapy using retrovirus vectors or adenovirus vectors.
  • transfer vectors used for the production of a recombinant retroviral vector used to incorporate a target gene include the virus particle structural protein genes (gag, pol, pol) from the genome of wild-type Moloney leukemia virus (MoMLV). env) has been removed, such as pLXSN (Genbank Access M28248) and pMFG. In addition to these, further modified vectors are used in human clinical trials.
  • Production of a recombinant retroviral vector involves culturing a virus-producing cell induced by transfection of a DNA vector into which a target gene has been inserted into a packaging cell (Psi-Crip, GP + E86, GP + envAm12, PG13, etc.) This is done by collecting the supernatant containing the viral vector. Furthermore, a production cell clone that stably produces a retroviral vector for expression of the target gene is selected from the infected cells by a method such as infecting the supernatant again with the packaging cells. Through these steps, a master cell bank (MCB) and a working cell bank (WCB) are prepared, and a genetically modified retroviral vector for gene therapy is stably produced.
  • MCB master cell bank
  • WB working cell bank
  • virus titer In order to improve the titer of virus produced by retrovirus-producing cells, culture of retrovirus-producing cells is extremely important. That is, it is necessary to examine the culture conditions for obtaining a high virus titer (hereinafter sometimes referred to as virus titer).
  • methods for increasing titer include superinfection (for example, Non-patent Document 1), addition of histone deacetylase inhibitor sodium butyrate or trichostatin A (for example, non-patented)
  • references 2 and 3 There are references 2 and 3). However, the remarkable effect is not acquired in either.
  • the object of the present invention is to develop a medium used for the production of virus vectors, particularly a medium used for culturing virus-producing cells that makes it possible to maintain a high virus titer.
  • An object of the present invention is to provide a production method and a method for producing a transformed cell population using a viral vector produced by the method.
  • the present inventors use a medium containing retinoic acids and histone deacetylase (hereinafter sometimes referred to as histone deacetylase) inhibitors as active ingredients.
  • histone deacetylase hereinafter sometimes referred to as histone deacetylase
  • the inventors have found that by culturing virus-producing cells, high virus production can be continued for a long period of time, and surprisingly, a virus supernatant having a high virus titer can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides: [1] A method for producing a viral vector comprising a step of culturing cells having the ability to produce a viral vector in a medium containing retinoic acids and a histone deacetylase inhibitor as active ingredients, [2] The production method according to [1], wherein the medium further contains lipids as an active ingredient, [3] The production method according to [1] or [2], wherein the cell is a cell capable of continuously producing a viral vector.
  • virus production can be continued for a long time and a high virus titer can be obtained as compared with the conventional method. Therefore, in the method of the present invention, a large amount of virus can be recovered by a single culture preparation. Moreover, since the viral vector prepared from the virus-producing cells cultured in the medium of the present invention has a high virus titer, it exhibits higher gene transfer efficiency than the conventional method.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the gene transfer efficiency to the SUP-T1 cell in the retroviral vector obtained using the culture medium A, B group, C group, etc. It is a figure which shows the gene expression intensity
  • the present invention discloses a medium suitable for culturing cells that produce viral vectors.
  • the aforementioned medium is a basic medium prepared by mixing components necessary for cell culture, and contains retinoic acids and histone deacetylase inhibitor as active ingredients.
  • the medium may further contain lipids.
  • retinoic acid is also called vitamin A acid, which is either all-trans-retinoic acid in which all double bonds in the chain are trans or 9-cis-retinoic acid in which the 9-position has a cis structure.
  • vitamin A acid is either all-trans-retinoic acid in which all double bonds in the chain are trans or 9-cis-retinoic acid in which the 9-position has a cis structure.
  • Other retinoic acid isomers, retinoic acid derivatives, and artificially synthesized synthetic retinoids can also be used in the present invention.
  • the above-mentioned retinoic acid, retinoic acid isomers, retinoic acid derivatives, and artificially synthesized synthetic retinoids or salts thereof are collectively referred to herein as retinoic acids.
  • the retinoic acid to be used may be one kind or a combination of plural kinds.
  • the concentration of retinoic acid used in the present invention in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration that acts as an active ingredient.
  • ATRA all-trans-retinoic acid
  • it is preferably 1 nM to 10 ⁇ M, more preferably 5 nM to 200 nM, and particularly preferably 10 to 100 nM.
  • the “histone deacetylase inhibitor” is not limited as long as it has histone deacetylase inhibitory activity.
  • Aliphatic acids such as butyric acid, phenylbutyric acid, valpro
  • Hydroxamic acids such as trichostatin A, oxamflatin, suberoylilide, salts and derivatives thereof, (3) cyclic peptides such as trapoxin , Apicidin, FK228, salts and derivatives thereof, and (4) benzamide, salts and derivatives thereof can be used.
  • NaB sodium butyrate
  • TSA trichostatin A
  • the concentration of the histone deacetylase inhibitor used in the present invention in the medium may be a concentration that acts as an active ingredient, and is not particularly limited.
  • TSA for example, preferably 10 nM to 50 ⁇ M. More preferably, it is 20 nM to 10 ⁇ M, and particularly preferably 100 nM to 3 ⁇ M.
  • NaB for example, it is preferably 1 nM to 50 mM, more preferably 1 mM to 10 mM.
  • Lipids may be further added to the medium containing the retinoic acids and histone deacylase inhibitor of the present invention.
  • Lipids include fatty acids (arachidonic acid, linoleic acid, linolenic acid, myristic acid, oleic acid, palmitoyl acid, palmitic acid and their salts), steroids such as cholesterol and dexamethasone, tocopherol acetic acid, triglycerides, phospholipids (Glycerophospholipid, sphingophospholipid, inositol phospholipid, etc.) and the like can be used. You may add these components to a culture medium individually or in combination of multiple things. For example, a fatty acid concentrate that is commercially available as a medium additive for the purpose of substituting serum components may be contained as it is.
  • the concentration of lipids arbitrarily selected from the lipids used in the present invention in the medium may be any concentration that acts as an active ingredient, and is not particularly limited, but preferably the total amount of lipids 0.01 mg / L to 8.0 mg / L, more preferably 0.03 mg / L to 5.0 mg / L, and particularly preferably 0.1 mg / L to 4.0 mg / L.
  • the volume ratio is preferably 1 / 10,000 to 1/50 (V / V), more preferably 1 / 3,000 to 1/75 (V / V). Particularly preferred is 1/1000 to 1/100 (V / V).
  • the components of the basic medium include energy sources such as amino acids, sugars, and organic acids, vitamins, buffer components for adjusting pH, inorganic salts, and the like. Further, it may contain a pH indicator such as phenol red.
  • a basic medium a known medium containing no serum, for example, DMEM, IMDM, Ham F12 medium or the like may be used, and these can be obtained as commercial products from Invitrogen, Sigma, and the like.
  • Commercially available media such as Opti-ProSFM, VP-SFM, 293SFMII (all manufactured by Invitrogen), HyQ SFM4 MegaVir (manufactured by High Clone) can also be used.
  • serum-added medium may be used, use of a serum-free medium is preferable in order to prevent contamination with unknown viruses derived from serum.
  • serum albumin highly purified from human blood eg, a serum albumin preparation approved as a pharmaceutical product
  • highly purified serum albumin derived from animals e.g., highly purified serum albumin derived from animals, or recombinant serum albumin
  • a serum medium is preferably used (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-105033).
  • virus-producing cells cultured in the medium of the present invention there is no particular limitation on the virus-producing cells cultured in the medium of the present invention, but for example, retrovirus-producing cells are suitable.
  • the present invention relates to a method for producing a viral vector characterized by using the above-mentioned medium.
  • the viral vector produced according to the present invention is not particularly limited.
  • retrovirus vectors including oncovirus vectors, lentivirus vectors and their modifications
  • adenovirus vectors including oncovirus vectors, lentivirus vectors and their modifications
  • adenovirus vectors adeno-associated virus vectors
  • simian virus vectors vaccinia virus vectors
  • Sendai virus vectors and the like can be mentioned.
  • a retroviral vector that is, a genetically modified retroviral vector is exemplified.
  • a replication-defective retrovirus vector in which unlimited infection and gene transfer are prevented is preferably used in the present invention.
  • Known replication-defective retrovirus vectors include MFG vector and ⁇ -SGC vector (International Publication No.
  • retroviral vectors such as LXIN (Clontech), DON-AI (Takara Bio), lentiviral vectors [human immunodeficiency virus (HIV) -derived vectors, simian immunodeficiency virus (SIV) -derived vectors, etc. Or a vector obtained by modifying these (for example, a pseudo-type vector).
  • Any foreign gene may be introduced into the virus vector.
  • the foreign gene to be introduced is not particularly limited, and any gene [such as an enzyme, cytokine, or receptor, etc., may be used depending on the use of the cell population transformed by the viral vector produced according to the present invention described below.
  • any gene such as an enzyme, cytokine, or receptor, etc.
  • Examples of these foreign genes include genes that express MazF, which is a sequence-specific RNase (for example, International Publication No. 2007/020873 pamphlet and International Publication No. 2008).
  • an appropriate marker gene such as an extracellular domain gene ( ⁇ LNGFR), a neomycin resistance gene, a fluorescent protein gene, or the like of Low affinity Nervous Factor Receptor may be simultaneously introduced.
  • the foreign gene can be used by inserting it into a viral vector so that it can be expressed, for example, under the control of an appropriate promoter.
  • an enhancer sequence, terminator sequence, or intron sequence may be present in the vector.
  • a virus vector is produced by culturing virus-producing cells produced by introducing the DNA encoding the virus vector into a virus packaging cell line in the medium of the present invention.
  • the packaging cell line is not particularly limited, and known packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL-10686), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 and GP + envAm-12 (US Pat. No. 5, 278,056), Psi-Crip [Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 85, 6460-6464 (1988)], etc. can do.
  • a retrovirus-producing cell is introduced by introducing a packaging plasmid (retrovirus packaging kit: manufactured by Takara Bio Inc.) containing genes necessary for retrovirus particle production into 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency. Can also be produced.
  • the method of the present invention can be used for both virus-producing cells prepared to produce recombinant virus vectors transiently and virus-producing cell lines capable of continuously producing viruses.
  • a cryopreserved product such as a master cell bank (MCB) or a working cell bank (WCB) of a virus-producing cell line by an appropriate means
  • the plant is directly planted in the medium, and culture is started.
  • the cells are grown to produce virus.
  • Virus-producing cells can be cultured under normal culture conditions. For example, culture at a humidity of 95% and a CO 2 concentration of 5% is exemplified, but the present invention is not limited to such conditions. Cultivation can be performed, for example, at 30 to 37 ° C., but may be performed at a temperature other than the above range as long as desired cell growth and viral vector production can be achieved.
  • a viral vector is obtained by collecting the supernatant from the culture solution thus obtained.
  • the virus vector is produced as a filtrate obtained by filtering the supernatant with the above-mentioned supernatant, a virus vector concentrated or purified by a known method, and frozen by an appropriate method, for example, Stored until use. By culturing virus-producing cells using the above-described medium of the present invention, a virus vector having a higher titer than the conventional culture method can be obtained.
  • the present invention also provides a method for producing a cell population containing transformed cells, characterized in that target cells are transformed with the viral vector produced by the method of the present invention.
  • the number of desired genes introduced into cells by the viral vector is not limited, and may be one gene or a plurality of genes. Transformation of target cells with a viral vector may be performed by a known method suitable for the viral vector.
  • a retroviral vector a substance that improves gene transfer efficiency such as retronectin (RetroNectin, registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used at the time of gene transfer.
  • retronectin Rostin, registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.
  • the present invention provides a cell population obtained by the above-described method for producing a cell population of the present invention, and uses of the cell population.
  • the cell population obtained by the method of the present invention can be used for various uses, for example, production of useful substances, and the cell population itself can also be used for treatment of diseases.
  • the method of the present invention it is possible to obtain a cell population containing cells carrying a therapeutically useful foreign gene.
  • the above cell population may have various diseases such as cancer, leukemia, malignant tumor, hepatitis, or infectious disease (for example, influenza, tuberculosis, HIV (Human Immunodefectivity Virus, human). It can be used for treatment of immunodeficiency virus) infection, AIDS, MRSA infection, VRE infection, or deep mycosis.
  • the cell population produced by the method of the present invention includes bone marrow transplantation, donor lymphocyte infusion for the purpose of preventing infection or remission of recurrent leukemia in an immunodeficient state such as after irradiation, anticancer drug treatment, It can be used in combination with conventional therapies such as radiation therapy, antibody therapy, thermotherapy, and other immunotherapy.
  • the cell population containing the transformed cells obtained in the present invention When the cell population containing the transformed cells obtained in the present invention is used for treatment or prevention of a disease, an effective amount of the cells is administered to a subject to be treated or prevented, that is, a human or non-human animal.
  • the administration method of the cell population may be selected appropriately depending on the disease, and examples thereof include intravenous, arterial, subcutaneous or intraperitoneal administration by injection or infusion.
  • the cell population obtained in the present invention can be a medicine, that is, a therapeutic or preventive agent for a disease, and the disease can be treated or prevented by administering the drug to a subject.
  • the medicine can be produced by formulating the cell population according to a method known in the pharmaceutical field.
  • the cell population produced by the method of the present invention is mixed with a known organic or inorganic carrier, excipient or stabilizer suitable for parenteral administration as an active ingredient, and prepared as an infusion or injection. be able to.
  • RetroI Trichostatin A-supplemented Medium GT-T-RetroI (manufactured by Takara Bio Inc., hereinafter referred to as RetroI), which is a serum-free medium for culturing virus-producing cells, was used as a basic medium A (medium A), and retinoic acid.
  • ATRA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a final concentration of 10 nM or 100 nM
  • TSA trichostatin A
  • 1 and B-2 (hereinafter referred to as medium B group) were prepared.
  • fatty acid concentrate (Gibco, hereinafter referred to as lipid) is added to medium B-1 so that the solution ratio (V / V) is 1/100, 1/250, 1/1000, respectively.
  • Medium C-1, C-2 and C-3 (hereinafter referred to as medium C group) were prepared.
  • medium D in which only TSA was added to medium A final concentration 500 nM
  • medium E in which only ATRA was added final concentration 10 nM
  • Example 2 Culture of retrovirus-producing cells Working cell bank (WCB) of retrovirus-producing cells (PG13: ATCC CRL-10686: used as packaging cells) producing a mouse-derived recombinant retrovirus vector carrying a fluorescent reporter protein (ZsGreen) gene ) was thawed in a 37 ° C. water bath. The thawed cell solution is transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 10 mL of complete medium [DMEM medium (10% FBS, manufactured by SFC Bioscience) containing 10% fetal bovine serum] is added and centrifuged (500 Xg for 5 minutes at 20 ° C.). After centrifugation, the supernatant was removed, suspended in 10 mL complete medium, and cell count was performed.
  • DMEM medium 10% FBS, manufactured by SFC Bioscience
  • a cell suspension is prepared to 78.5 ⁇ 10 4 cells / mL using complete medium, and 1 mL of the above cell suspension is added to a 100 mm dish (manufactured by Iwaki) for cell culture. 14.7 mL of the medium was added and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., humidity 95%, CO 2 concentration 5%). The passage was performed at a passage interval of 3 days, the seeding cell density at the first passage was 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and the liquid volume was 0.2 mL / cm 2 .
  • the seeded cell density is 0.9 ⁇ 10 4 cells / cm 2
  • the liquid volume is 0.2 mL / cm 2
  • 2 mL each for each well of a 6-well treatment plate for cell culture manufactured by BD Falcon.
  • the liquid volume was 0.1 mL / cm 2 ).
  • each medium was collected and replaced with a new same medium.
  • the culture was performed at 32 ° C., 95% humidity and 5% CO 2 concentration.
  • the medium was exchanged and collected four times in total for four consecutive days, and the fourth time was only the collection of the medium without adding the medium.
  • the collected culture supernatant (first time, second time, third time, fourth time) is filtered with a 0.22 ⁇ m pore size filter (Millipore), and after each aliquot is dispensed as a retrovirus supernatant. Stored at ⁇ 80 ° C.
  • RetroNectin registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.
  • ACD-A diluted with ACD-A to a final concentration of 20 ⁇ g / mL
  • the retronectin solution was removed from the plate
  • 0.5 mL of ACD-A was added to each well and removed, and the plate was used twice.
  • 1 mL of each virus dilution was added to each well of the plate and centrifuged (32 ° C., 2000 ⁇ g, 2 hours).
  • Flow cytometry analysis was performed according to the instrument instruction using a BD FACSCanto II flow cytometer (Becton Dickinson).
  • the expression rate of ZsGreen can be determined by gating the target cell population on a two-parameter histogram (x-axis: FSC, y-axis: SSC) of forward scattered light (FSC) and side scattered light (SSC).
  • the cell population in the gate is expanded with a histogram of GFP detection parameters (x axis: GFP fluorescence intensity, y axis: cell number), and cells with higher GFP fluorescence intensity compared to isotype control are defined as ZsGreen positive cells.
  • the ratio (%) of the number of ZsGreen positive cells to the total number of cells in the gate was used as a gene transfer efficiency (GT%), and the fluorescence intensity (MFI: Mean Fluorescence Intensity) was measured.
  • GT% gene transfer efficiency
  • MFI Mean Fluorescence Intensity
  • the measurement result of gene transfer efficiency is shown in FIG.
  • the virus supernatant liquid of each day obtained by the culture method of Example 2-2 was evaluated, and the average value of the virus supernatant liquid for 4 days was calculated.
  • the gene transfer efficiency of the retrovirus supernatants collected using the medium B group and the group C showed a gene transfer efficiency more than twice that of the medium A as the basic medium. That is, a virus with a titer higher than that of medium A was obtained, and the ZsGreen gene was introduced with high efficiency.
  • the culture medium groups B and C were compared with culture media D and E, the above effects were higher than those of TSA or ATRA alone.
  • “NGMC” means a non-transfected cell and represents a negative control.
  • FIGS the same meaning is used in FIGS.
  • the measurement results of the fluorescence intensity (hereinafter referred to as gene expression intensity) are shown in FIG.
  • the virus supernatant liquid of each day obtained by the culture method of Example 2-2 was evaluated, and the average value of the virus supernatant liquid for 4 days was calculated.
  • the fluorescence intensity of the retrovirus supernatant recovered using the medium B group and the group C showed a fluorescence intensity about twice as high as that of the medium A. That is, a virus with a titer higher than that of medium A was obtained, and the gene was introduced with high efficiency, whereby the fluorescent reporter protein (ZsGreen) was highly expressed.
  • ZsGreen fluorescent reporter protein
  • Example 3 Preparation of NaB-added medium To medium A described in Example 1, ATRA was added to a final concentration of 10 nM and 100 nM, and sodium butyrate (NaB) was added to a final concentration of 5 mM. Medium F-1 and F-2 were prepared. Furthermore, lipid was added to the medium F so that the solution ratio (V / V) would be 1/100, 1/250, 1/1000, thereby preparing media G-1, G-2, and G-3, respectively. . Further, medium H in which only NaB was added to medium A (final concentration 5 mM) and medium E in which only ATRA was added (final concentration 10 nM) were prepared. Table 2 shows the composition of these media.
  • Example 4 Culture of Retrovirus Producing Cells Virus supernatant was prepared using the retrovirus producing cells described in Example 2.
  • a virus supernatant was obtained in the same manner as in Example 2-1, using the media A, F group, G group, H and E of Example 3.
  • Gene transfer was performed in the same manner as in Example 2-2, and evaluation of gene transfer efficiency was performed in the same manner as in Example 2-3.
  • the measurement results of gene transfer efficiency are shown in FIG.
  • the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant collected using the medium F group and the group G was about twice as high as that of the medium A. That is, in the medium F group and the group G, a virus having a higher titer than that in the medium A was obtained, and the ZsGreen gene was introduced with high efficiency. Moreover, even when compared with the culture media H and E (NaB or ATRA alone), a high effect was obtained.
  • the measurement result of fluorescence intensity is shown in FIG.
  • the virus supernatant liquid of each day obtained by the culture method of Example 2-2 was evaluated, and the average value of the virus supernatant liquid for 4 days was calculated.
  • the transgenic cells obtained from the retrovirus supernatant collected using the medium F group and the group G showed a fluorescence intensity about twice as high as that when the medium A was used. . That is, a virus with a titer higher than that of medium A was obtained, and the gene was introduced with high efficiency, whereby the fluorescent reporter protein (ZsGreen) was highly expressed.
  • the fluorescence intensity of the cells was high as compared with the cases where the media H and E were used.
  • Example 5 Preparation of medium supplemented with VPA
  • retinoic acid ATRA
  • VPA valproic acid
  • medium I group medium I group
  • medium J group medium J group
  • medium H medium H in which only NaB was added to medium A
  • medium F-1 in which NaB (final concentration 5 mM) and ATRA final concentration 10 nM
  • Example 6 Culture of Retrovirus-Producing Cells Virus supernatants were prepared using the retrovirus-producing cells described in Example 2.
  • a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1 using the medium A, Group I, Group J, H, and F-1 of Example 5.
  • the number of days for virus recovery is 4 days in Example 2-1
  • the virus supernatant collected in 3 days is mixed and evaluated.
  • Gene transfer was carried out in the same manner as in Example 2-2 except that the virus dilution was 10 times, and the evaluation of gene transfer efficiency was carried out in the same manner as in Example 2-3.
  • the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant recovered using medium I group was about twice as high as that of medium A. That is, in the medium I group, a virus having a higher titer than that in the medium A was obtained, and the ZsGreen gene was introduced with high efficiency. In addition, even when compared with the medium J group (VPA alone), a high effect was obtained. As in the results of FIG. 2 of Example 4, the medium F-1 was highly effective even when compared with the medium H (NaB alone).
  • Example 7 Production of Retrovirus Producing Cells Using HEV293T cells (ATCC CRL-11268) with Retrocovirus Packaging using codon-transformed TCR and siRNA co-expression retrovirus vector (MS-MA24-siTCR) described in WO2008 / 153029 pamphlet Kit Eco (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for transfection according to the product protocol to obtain various ecotropic retrovirus supernatants. This virus supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Milex HV, manufactured by Millipore), PG13 cells were infected by a method using polybrene, and cells were cloned by a limiting dilution method.
  • Milex HV manufactured by Millipore
  • the working cell bank (WCB) prepared from the clonal cells obtained in Example 7-1 was thawed in a 37 ° C. water bath.
  • the thawed cell solution is transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 10 mL of complete medium [DMEM medium (10% FBS, manufactured by SFC Bioscience) containing 10% fetal bovine serum] is added and centrifuged (500 Xg for 5 minutes at 20 ° C.). After centrifugation, the supernatant was removed, suspended in 10 mL complete medium, and cell count was performed.
  • DMEM medium 10% FBS, manufactured by SFC Bioscience
  • a cell suspension is prepared to 78.5 ⁇ 10 4 cells / mL using complete medium, and 1 mL of the above cell suspension is added to a 100 mm dish (manufactured by Iwaki) for cell culture. 14.7 mL of the medium was added and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., humidity 95%, CO 2 concentration 5%). The passage was performed at a passage interval of 3 days, the seeding cell density at the first passage was 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and the liquid volume was 0.2 mL / cm 2 .
  • the seeded cell density is 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2
  • the liquid volume is 0.2 mL / cm 2
  • 45.0 mL per CELLBIND-treated T225 flask manufactured by CORNING
  • the culture supernatant was removed and replaced with the mediums H, F-1, K, L, and B-1 shown in Table 4 (the liquid volume was 0.1 mL / cm 2 ).
  • Dexamethasone (DEX) manufactured by Nacalai Tesque was added to the culture media K and L to a final concentration of 100 nM.
  • each medium was collected and replaced with a new same medium.
  • the culture was performed at 32 ° C., 95% humidity and 5% CO 2 concentration.
  • the medium was exchanged and collected three times in total for three consecutive days, and the medium was not collected for the third time, and only the medium was collected.
  • the collected culture supernatants (first, second and third) are mixed, filtered through a 0.22 ⁇ m pore size filter (Millipore), and dispensed in small portions as a retrovirus supernatant at ⁇ 80 ° C. saved.
  • RetroIII Gene transfer evaluation of retrovirus supernatant The gene transfer efficiency of the retrovirus supernatant was measured. Retronectin was dissolved in PBS to a concentration of 25 ⁇ g / mL and anti-CD3 antibody (OKT3, Janssen Pharma Co., Ltd.) to a concentration of 5 ⁇ g / mL. 1 mL of each well was added to a 6-well plate treated with this solution and left at 37 ° C. for 5 hours. Thereafter, the solution was removed, and each well was washed twice with 1 mL each using GT-T-RetroIII (manufactured by Takara Bio Inc., hereinafter referred to as RetroIII).
  • GT-T-RetroIII manufactured by Takara Bio Inc.
  • IL-2 manufactured by NOVARTIS
  • Fungizone manufactured by Bristol-Myers Squibb
  • CM culture medium
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • the gene transfer operation was performed as follows. A stock solution and a 5-fold diluted solution were prepared for each of the retrovirus supernatants collected using the media H, F-1, K, L, and B-1. At this time, ACD-A, 5% albumin solution and 2% albumin solution were used for dilution. A 24-well non-treatment plate was used as a container for gene introduction. For 24-well non-treatment plates, 0.5 mL of RetroNectin previously diluted with ACD-A to a final concentration of 20 ⁇ g / mL was added to each well and treated at 4 ° C. overnight, and the RetroNectin solution was removed from the plate.
  • the wells were washed twice with 0.5 mL each using ACD-A. 1 mL of each virus dilution was added to each well of the plate and centrifuged (32 ° C., 2000 ⁇ g, 2 hours). After centrifugation, the virus dilution supernatant was removed from each well, and each well was washed three times with 0.5 mL of a 1.5% albumin solution. The cultured cell suspension was collected and suspended in CM so as to be 0.145 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cells were stained with MAGE-A4 tetramer-PE (Ludwig) and Human CD8-APCcy7 (Becton Dickinson) and flow cytometer was used to determine the percentage of cells that were CD8 positive and tetramer positive. Specifically, 0.3 ⁇ 10 6 cells after infection culture were transferred to an Eppendorf tube, and the cells were precipitated by centrifugation (4 ° C., 500 ⁇ g, 5 minutes).
  • the precipitated cells were suspended in 950 ⁇ L of 0.5% BSA / PBS, and the cells were precipitated again by centrifugation (4 ° C., 500 ⁇ g, 5 minutes). After removing the supernatant again, the suspension was suspended in a mixed solution obtained by adding 8 ⁇ L of 0.5% BSA to 1 ⁇ L of MAGE-A4 tetramer-PE, and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 1 ⁇ L of Human CD8-APCcy7 was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • Flow cytometry analysis was performed using a BD FACSCanto II flow cytometer according to the instrument instructions.
  • the abundance ratio of tetramer positive cells in CD8 positive cells can be determined by isotype control on a two-parameter histogram of APCcy7 and PE detection parameters (x axis: APCcy7 fluorescence intensity, y axis: PE fluorescence intensity).
  • x axis APCcy7 fluorescence intensity
  • PE fluorescence intensity fluorescence intensity region of non-expressing cells of APCcy7 (CD8) and PE (MAGE-A4 tetramer)
  • the region was divided into four regions, the fluorescence intensity region of APCcy7 and PE expressing cells was determined, and the ratio of the number of cells ( %).
  • GT% Gene Transduction efficiency
  • GT% CD8 and tetramer positive cell count / CD8 positive cell count
  • Fig. 6 shows the measurement results of gene transfer efficiency.
  • the introduction efficiency of the retrovirus supernatant recovered using F-1, K, L, and B-1 is higher than that of medium H in which NaB is added to medium A, which is a basic medium.
  • the gene transfer efficiency was remarkably high. That is, not only the fluorescent protein-expressing virus vectors described in Examples 2 and 4, but also high-titer viruses were obtained and the target gene was introduced with high efficiency even in a pilot scale higher than the experimental scale.
  • RNA copy number of retrovirus supernatant was measured.
  • the number of RNA copies was calculated using Retrovirus Titer Set (for Real TIME PCR) (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the standard usage method in the instruction manual.
  • FIG. 7 similar to the results of the gene transfer efficiency of Example 7-4, NaB was added to medium A as the basic medium by combining one or both of ATRA and DEX with NaB.
  • RNA copy number hereinafter referred to as RNA COPY in the figure significantly higher than that of the prepared medium H.
  • Example 8 Preparation of TSA-supplemented medium 2
  • DEX dexamethasone
  • ATRA retinoic acid
  • TSA trichostatin A
  • TSA was added to medium A to a final concentration of 50 nM and 500 nM
  • medium D group mediums D-1 and D-2 (hereinafter referred to as medium D group)
  • NaB alone final concentration 5 mM
  • medium H medium H
  • Medium N was prepared by adding NaB (final concentration 5 mM), retinoic acid (ATRA) at a final concentration of 100 nM
  • DEX dexamethasone
  • Example 9 Culture of retrovirus-producing cells Virus supernatants were prepared using the retrovirus-producing cells described in Example 7-1. In this example, a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1 using the medium described in Example 8. However, although the number of days for virus recovery is 4 days in Example 2-1, in this example, the virus supernatant collected in 3 days is mixed and evaluated.
  • Fig. 8 shows the measurement results of gene transfer efficiency.
  • M-1 and D-1, M-2 and D-2, and H and N were compared, the retro collected using a medium containing NaB or TSA, ATRA and DEX in combination.
  • the introduction efficiency of the virus supernatant was significantly higher than that of Group D, which is a medium supplemented with NaB and TSA alone, and H.
  • TSA was effective from 50 nM to 500 nM.
  • RNA copy number of retrovirus supernatant was measured.
  • RNA copy number was calculated using Retrovirus Titer Set (for Real TIME PCR) according to the standard usage method of the instruction manual. As shown in FIG. 9, the results are similar to the results of the gene transfer efficiency of Example 9-2.
  • ATRA By combining both DEX and NaB or TSA, the RNA copy number was significantly higher than that of the medium supplemented with NaB or TSA alone.
  • TSA was effective from 50 nM to 500 nM.
  • Example 10 Preparation of TSA-added medium 3 A medium was prepared in the same manner as in Example 1 so that the final concentrations shown in Table 6 were obtained.
  • Example 11 Culture of Retrovirus-Producing Cells Virus supernatant was prepared using the retrovirus-producing cells described in Example 2. Using the medium described in Example 10, a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1. However, in this example, the virus supernatant liquid collected and mixed in 4 days and the virus supernatant liquid collected and mixed in 3 days are evaluated in this example. Gene transfer was carried out in the same manner as in Example 2-2 except that the virus dilution was 10 times, and gene transfer efficiency and fluorescence intensity were evaluated in the same manner as in Example 2-3.
  • the measurement result of gene transfer efficiency is shown in FIG. As shown in FIG. 10, the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant recovered using the medium O group was about 6 to 8 times higher than that of the medium A. In addition, the gene transfer efficiency was more effective than the control group for 4 days than for 3 days.
  • the measurement result of fluorescence intensity is shown in FIG. As shown in FIG. 11, the fluorescence intensity of the retrovirus supernatant collected using the medium O group was about 2 to 3.5 times higher than that of the medium A.
  • Example 12 Preparation of medium supplemented with 9-cis retinoic acid (9-cis) (manufactured by Nacalai Tesque), AM80 A medium was prepared in the same manner as in Example 1 so that the final concentrations shown in Table 7 were obtained. Here, Tamibarotene (manufactured by Sigma) was used for AM80.
  • Example 13 Culture of retrovirus-producing cells Using the retrovirus-producing cells described in Example 2, a virus supernatant was prepared. Using the medium described in Example 12, a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1. However, although the number of days for virus recovery is 4 days in Example 2-1, in this example, the virus supernatant collected in 3 days is mixed and evaluated. Gene transfer was carried out in the same manner as in Example 2-2 except that the virus dilution was 10 times, and the evaluation of gene transfer efficiency was carried out in the same manner as in Example 2-3.
  • the measurement result of gene transfer efficiency is shown in FIG. As shown in FIG. 12, the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant collected using the medium P group and the R group was about 1.5 to 2 times higher than that of the medium A. In addition, the gene transfer efficiency of the medium Q group and the S group of 9-cis and AM80 alone is the same as or lower than that of the medium A.
  • Example 14 Preparation of medium supplemented with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) (manufactured by CAYMAN) A medium was prepared in the same manner as in Example 1 so that the final concentrations shown in Table 8 were obtained.
  • SAHA suberoylanilide hydroxamic acid
  • Example 15 Culture of Retrovirus-Producing Cells Virus supernatant was prepared using the retrovirus-producing cells described in Example 2. Using the medium described in Example 14, a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1. However, although the number of days for virus recovery is 4 days in Example 2-1, in this example, the virus supernatant collected in 3 days is mixed and evaluated. Gene transfer was carried out in the same manner as in Example 2-2 except that the virus dilution was 10 times, and the evaluation of gene transfer efficiency was carried out in the same manner as in Example 2-3.
  • the measurement result of gene transfer efficiency is shown in FIG. As shown in FIG. 13, the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant recovered using the medium T group was about 1.4 to 1.9 times higher than that of the medium A. Moreover, the SAHA concentration showed higher gene transfer efficiency than the corresponding U group medium.
  • Example 16 Preparation of NaB-added medium 2 As a basic medium (medium V) in which inactivated FBS was added to DMEM as a cell culture medium at a solution ratio (V / V) of 1/10, retinoic acid (ATRA) was added to a final concentration of 100 nM, and Medium B was prepared by adding sodium butyrate (NaB) to a final concentration of 5 mM. Furthermore, medium X in which only NaB was added to medium V (final concentration 5 mM) and medium Y in which only ATRA was added (final concentration 100 nM) were prepared. Table 9 shows the composition of each medium.
  • medium V basic medium
  • ATRA retinoic acid
  • NaB sodium butyrate
  • Table 9 shows the composition of each medium.
  • Example 17 Culture of Retrovirus Producing Cells A virus supernatant was prepared using the retrovirus producing cells described in Example 2. Using the medium described in Example 16, a virus supernatant was obtained by the method of Example 2-1. However, although the number of days for virus recovery is 4 days in Example 2-1, in this example, the virus supernatant collected in 3 days is mixed and evaluated. Gene transfer was carried out in the same manner as in Example 2-2 except that the virus dilution was 10 times, and the gene transfer efficiency and fluorescence intensity were evaluated in the same manner as in Example 2-3.
  • FIG. 14 The measurement results of gene transfer efficiency are shown in FIG. As shown in FIG. 14, the gene transfer efficiency in the retrovirus supernatant recovered using the medium W was about 1.2 times higher than that of the medium V.
  • the measurement result of fluorescence intensity is shown in FIG. As shown in FIG. 15, the fluorescence intensity of the retrovirus supernatant recovered using the medium W was about 1.5 times higher than that of the medium V.
  • a virus supernatant having a high virus titer can be easily obtained, so that a virus vector and a high titer composition containing the vector can be easily prepared.
  • the viral vector and the composition obtained using the culture medium of the present invention are very useful in the field of gene therapy.

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Abstract

　本発明は、ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法、および有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地を提供する。

Description

ウイルスベクターの製造方法
　本発明は、ウイルスベクターの製造方法、及びウイルスベクター製造のための培地に関する。
　先天性遺伝子疾患の治療のほか癌や感染症の治療を目的としてウイルスベクターを用いた遺伝子治療が開発され、臨床的に多くの試験が実施されている。特に、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを利用した遺伝子治療について多くの試みがなされている。
　目的遺伝子を組み込むために使用される遺伝子組換えレトロウイルスベクター作製のために使用されるトランスファーベクターの例としては、野生型モロニー白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のゲノムからウイルス粒子構造タンパク質遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が除去されたｐＬＸＳＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｍ２８２４８）やｐＭＦＧ等がある。これらの他にさらに改変したベクターがヒトを対象とした臨床試験に使用されている。
　遺伝子組換えレトロウイルスベクターの製造は、目的遺伝子を挿入したＤＮＡベクターのパッケージング細胞（Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ、ＧＰ＋Ｅ８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、ＰＧ１３等）へのトランスフェクションにより誘導されたウイルス産生細胞を培養し、目的のウイルスベクターを含有する上清を採取することにより実施される。さらに、この上清を再度パッケージング細胞に感染させる等の方法で、感染細胞の中から目的遺伝子発現用のレトロウイルスベクターを安定に産生する産生細胞クローンを選択することも行われる。このような工程で、マスターセルバンク（ＭＣＢ）、そしてワーキングセルバンク（ＷＣＢ）が調製され、遺伝子治療用の遺伝子組換えレトロウイルスベクターが安定して製造される。
　レトロウイルス産生細胞が産生するウイルスの力価を向上させるためには、レトロウイルス産生細胞の培養は極めて重要である。つまり、高いウイルス力価（以下、ウイルスタイターと記載することもある）が得られる培養条件の検討が必要である。現在までに力価を上げる方法として、重複感染（例えば、非特許文献１）や、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、酪酸ナトリウム、又はトリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ　Ａ）の添加（例えば、非特許文献２および３）がある。しかし、いずれもその顕著な効果は得られていない。
ジャーナル　オブ　ヒューマン　ジーン　セラピー（Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎe　Ｔｈｅｒ）、第６巻、第１１９５－１２０２頁（１９９５） ジーン　セラピー（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第３巻、第７５６－７６０頁（１９９６） バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２９巻、第８８４－８９０頁（２０００）
　本発明の目的は、ウイルスベクターの製造に使用される培地、特に高いウイルスタイターを維持することを可能にするウイルス産生細胞の培養に使用される培地を開発し、当該培地を用いたウイルスベクターの製造方法、及び当該方法で製造されるウイルスベクターを用いた形質転換細胞集団の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素（以下、ヒストンデアセチラーゼと記載する場合がある）阻害物質を含む培地を用い、ウイルス産生細胞を培養することで、長期間にわたって高いウイルス産生を継続することができ、驚くべきことに高いウイルス力価のウイルス上清が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明を概説すれば、本発明は、
［１］ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法、
［２］培地が、有効成分として、更に脂質類を含む［１］記載の製造方法、
［３］細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である［１］又は［２］に記載の製造方法、
［４］ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである［１］～［３］いずれか記載の製造方法、
［５］ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンＡ及び酪酸ナトリウムから成る群より選択される少なくとも１種の物質である［１］～［４］いずれか記載の製造方法、
［６］［１］～［５］いずれか記載の方法で製造されたウイルスベクター、
［７］［６］に記載のウイルスベクターを用いて細胞を形質転換することを特徴とする形質転換された細胞集団の製造方法、
［８］［７］に記載の製造方法で得られた形質転換された細胞集団、
［９］医薬に使用するための［８］記載の細胞集団、
［１０］医薬の製造に用いる［８］記載の細胞集団、
［１１］［８］記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬、
［１２］対象に有効量の［１１］記載の医薬を投与する工程を含む疾病の治療方法又は予防方法、
［１３］有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地、
に関する。
　本発明のウイルスベクターの製造方法によれば、従来法と比べて、長期間ウイルス産生を継続することでき、かつ高いウイルス力価が得ることができる。したがって、本発明の方法では、一回の培養調製でウイルス量を多く回収することができる。また、本発明の培地で培養したウイルス産生細胞から調製されたウイルスベクターは、高いウイルス力価を有するので、従来法より高い遺伝子導入効率を示す。
培地Ａ、Ｂ群、Ｃ群等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ａ、Ｂ群、Ｃ群等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞へ導入した遺伝子発現強度を示す図である。 培地Ａ、Ｆ群、Ｇ群等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ａ、Ｆ群、Ｇ群等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞へ導入した遺伝子発現強度を示す図である。 培地Ａ、Ｉ群、Ｊ群等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ｈ、Ｆ－１、Ｋ、Ｌ、Ｂ－１を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＰＢＭＣへの遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ｈ、Ｆ－１、Ｋ、Ｌ、Ｂ－１を使用して得られたレトロウイルスベクターの、ＲＮＡコピー数を示す図である。 培地Ｍ群、Ｄ群、Ｈ、Ｎを使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＰＢＭＣへの遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ｍ群、Ｄ群、Ｈ、Ｎを使用して得られたレトロウイルスベクターの、レトロウイルスベクターの、ＲＮＡコピー数を示す図である。 培地Ａ、Ｏ群、Ｄ、Ｅ群、Ｈ、Ｆ－１を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ａ、Ｏ群、Ｄ、Ｅ群、Ｈ、Ｆ－１を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞へ導入した遺伝子発現強度を示す図である。 培地Ａ、Ｐ群、Ｑ群、Ｒ群、Ｓ群、Ｅ、Ｈ、Ｆ－１を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ａ、Ｔ群、Ｕ群、Ｅ－２、Ｈを使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙを使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞への遺伝子導入効率を示す図である。 培地Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙを使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＳＵＰ－Ｔ１細胞へ導入した遺伝子発現強度を示す図である。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　本発明は、ウイルスベクターを産生する細胞の培養に適した培地を開示する。前記の培地は、細胞の培養に必要な成分を混合して作製された基本培地に、有効成分して、レチノイン酸類及びヒストンデアセチラーゼ阻害物質が含有されてなるものである。当該培地には、更に脂質類が含まれてもよい。
　本発明において、「レチノイン酸」は、ビタミンＡ酸とも呼ばれ、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓのａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸又は９位がｃｉｓ構造をとる９－ｃｉｓ－レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体、レチノイン酸誘導体、及び人為的に合成した合成レチノイドも本発明において使用することができる。前記のレチノイン酸、レチノイン酸異性体、レチノイン酸誘導体及び人為的に合成した合成レチノイド又はそれらの塩を、本明細書ではレチノイン酸類と総称する。更に、本発明において、使用するレチノイン酸類は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
　本発明に使用されるレチノイン酸類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸（以下、ＡＴＲＡと記載する）の場合、例えば、好適には１ｎＭ～１０μＭ、より好適には５ｎＭ～２００ｎＭであり、特に好適には１０～１００ｎＭである。
　本発明において、「ヒストン脱アセチル化酵素（ヒストンデアセチラーゼ）阻害物質」としては、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有するものであれば良く、（１）脂肪族酸類、例えば酪酸、フェニル酪酸、バルプロ酸、これらの塩、誘導体等、（２）ヒドロキサム酸類、例えばトリコスタチン（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）Ａ、オキサムフラチン、スベロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ）、これらの塩、誘導体等、（３）環状ペプチド、例えばトラポキシン（ｔｒａｐｏｘｉｎ）、アピシヂン（ａｐｉｃｉｄｉｎ）、ＦＫ２２８、これらの塩、誘導体等、（４）ベンズアミド、その塩、誘導体等、が使用できる。
　本発明を限定するものではないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質として、酪酸ナトリウム（以下、ＮａＢと記載する）又はヒストンデアセチラーゼのアイソフォーム阻害域の広いトリコスタチンＡ（以下、ＴＳＡと記載する）が好適に使用される。
　本発明に使用されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、ＴＳＡの場合、例えば、好適には１０ｎＭ～５０μＭ、より好適には２０ｎＭ～１０μＭ、特に好適には１００ｎＭ～３μＭである。ＮａＢの場合、例えば、好適には１ｎＭ～５０ｍＭ、より好適には１ｍＭ～１０ｍＭである。
　本発明のレチノイン酸類及びヒストンデアシラーゼ阻害物質を含む培地に、更に脂質類を含有させても良い。脂質類としては、脂肪酸類（アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸やそれらの塩等）、コレステロール、デキサメタゾン等のステロイド類、トコフェロール酢酸、トリグリセリド、リン脂質類（グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、イノシトールリン脂質等）等を使用することができる。これらの成分は単独でもしくは複数のものを組み合わせて培地に添加してもよい。例えば、血清成分を代替することを目的に培地添加剤として市販されている脂肪酸濃縮液をそのまま含有させても良い。
　本発明に使用される前記脂質類から任意に選択される脂質類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、好適には脂質類の総量として０．０１ｍｇ／Ｌ～８．０ｍｇ／Ｌ、より好適には０．０３ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、特に好適には０．１ｍｇ／Ｌ～４．０ｍｇ／Ｌである。例えば、脂肪酸濃縮液では容液比で、好適には１／１０，０００～１／５０（Ｖ／Ｖ）、より好適には１／３，０００～１／７５（Ｖ／Ｖ）であり、特に好適には１／１，０００～１／１００（Ｖ／Ｖ）である。
　上記基本培地の成分としては、アミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、ｐＨ調整のための緩衝成分、無機塩類等があげられる。また、フェノールレッドのようなｐＨ指示薬を含有していてもよい。このような基本培地として血清を含有しない公知の培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２培地等を使用してもよく、これらはインビトロジェン社、シグマ社等から市販品として入手することができる。Ｏｐｔｉ－ＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ、２９３ＳＦＭＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）、ＨｙＱ　ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（ハイクローン社製）等の市販の培地も使用することができる。血清添加培地を使用してもよいが、血清由来の未知のウイルスの混入を防ぐために、無血清培地の使用が好ましい。無血清培地を使用する場合は、ヒト血液より高度に精製された血清アルブミン（例えば医薬品として認可された血清アルブミン製剤）や動物由来の高度に精製された血清アルブミン、又は組み換え血清アルブミンを含有する無血清培地が好適に使用される（特開２００７－１０５０３３号公報）。
　本発明の培地により培養されるウイルス産生細胞には特に限定はないが、例えばレトロウイルス産生細胞が好適である。
　本発明は、上記の培地を使用することを特徴とするウイルスベクターの製造方法に関する。
　本発明により製造されるウイルスベクターには特に限定はない。例えば、レトロウイルスベクター（オンコウイルスベクター、レンチウイルスベクターやそれらの改変体を包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が挙げられる。好適にはレトロウイルスベクター、すなわち遺伝子組み換えレトロウイルスベクターが例示される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止された複製能欠損レトロウイルスベクターが本発明に好適に使用される。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、ＭＦＧベクターやα－ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［ヌクレイック　アシドズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第３５８７－３５９６頁（１９９０）］、ＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ＤＯＮ－ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター等］あるいはこれらを改変したベクター（例えばシュードタイプベクター）が例示される。
　前記のウイルスベクターには任意の外来遺伝子を導入してもよい。導入される外来遺伝子には特に限定はなく、下記記載の本発明により製造されたウイルスベクターにより形質転換される細胞集団の用途に応じて、任意の遺伝子［酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、リボザイムをコードするもの］が使用できる。これら外来遺伝子としては、例えば、細胞の医療への利用を目的とするものとして、配列特異的ＲＮＡ分解酵素であるＭａｚＦを発現する遺伝子（例えば、国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレット）、腫瘍抗原やウイルス抗原を認識する抗体可変領域又はＴ細胞レセプターをコードする遺伝子、患者において欠失もしくは機能喪失している遺伝子等が挙げられる。また、Ｌｏｗ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメイン遺伝子（ΔＬＮＧＦＲ）、ネオマイシン耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
　前記外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにウイルスベクターに挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列、又はイントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
　本発明では、前記のウイルスベクターをコードするＤＮＡをウイルスパッケージング細胞株に導入して作製されたウイルス産生細胞を本発明の培地中で培養することにより、ウイルスベクターの製造が実施される。
　前記のパッケージング細胞株には特に限定はなく、公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ［プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシーズ　オブ　ジ　ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、第８５巻、第６４６０－６４６４頁（１９８８）］等を使用することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞にレトロウイルス粒子産生に必要な遺伝子が搭載されたパッケージングプラスミド（レトロウイルスパッケージングキット：タカラバイオ社製、等）を導入してレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
　本発明の方法は、一過性に組換えウイルスベクターを産生するよう作製されたウイルス産生細胞、継続的にウイルスを産生する能力を有するウイルス産生細胞株のいずれにも利用することができる。後者を使用する場合には、ウイルス産生細胞株のマスターセルバンク（ＭＣＢ）やワーキングセルバンク（ＷＣＢ）のような凍結保存物を適切な手段で解凍後、前記の培地に直接植えて培養を開始し、前記細胞を増殖させ、ウイルスを産生させる。組換えウイルスベクターの大量調製のためには、さらに前記の培地にウイルス産生細胞株を適応させる馴化の工程を加えることが好ましい。
　ウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。例えば、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば３０～３７℃で実施できるが、所望の細胞の増殖、ウイルスベクターの産生が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度で実施してもよい。本発明では、こうして得られる培養液より上清を採取して、ウイルスベクターを得る。本発明において、ウイルスベクターは前記の上清のまま、上清をフィルターろ過して得られたろ液、公知の方法により濃縮もしくは精製されたウイルスベクターとして製造され、適切な方法により、例えば凍結して、使用するまで保存される。上記の本発明の培地を用いたウイルス産生細胞の培養によると、従来の培養方法より高い力価のウイルスベクターを得ることができる。
　また、本発明は、本発明の方法により製造されたウイルスベクターにより標的細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞を含有する細胞集団の製造方法も提供する。なお、前記ウイルスベクターにより細胞に導入される所望の遺伝子の数に限定はなく、１個の遺伝子であっても良く、複数の遺伝子であっても良い。ウイルスベクターによる標的細胞の形質転換は当該ウイルスベクターに適した公知の方法で行えばよい。例えばレトロウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入の際にレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、タカラバイオ社製）等の遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。
　本発明では高いウイルス力価のウイルスベクターを得られることから、当該ベクターを使用することにより、所望の遺伝子を保持する細胞を高い比率で含む細胞集団を得ることができる。
　本発明は、前記の本発明の細胞集団の製造方法により得られる細胞集団、並びに当該細胞集団の用途を提供する。本発明の方法により得られる細胞集団は種々の用途、例えば有用物質の生産に使用することができ、また、当該細胞集団自体を疾患の治療に使用することもできる。
　本発明の方法により、治療上有用な外来遺伝子を保持する細胞を含有する細胞集団を得ることができる。前記の細胞集団は、保持する遺伝子により付与される形質に応じて種々の疾患、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染症疾患（例えばインフルエンザ、結核、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ、ヒト免疫不全ウイルス）感染症、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、もしくは深在性真菌症）等の治療に使用することができる。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。
　本発明で得られる形質転換細胞を含有する細胞集団を疾病の治療又は予防に使用する場合には、当該細胞の有効量が治療又は予防の対象、すなわちヒト又は非ヒト動物に投与される。細胞集団の投与方法は疾病に応じて適切なものを選択すればよく、例えば注射又は点滴による静脈、動脈、皮下、又は腹腔内等への投与が例示される。
　本発明で得られる細胞集団は医薬、すなわち疾病の治療剤又は予防剤となすことができ、当該医薬を対象に投与することにより、疾病を治療又は予防することができる。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、前記の細胞集団を製剤化して製造することができる。例えば、本発明の方法により製造された細胞集団を有効成分として、非経口投与に適した公知の有機又は無機の担体、賦形剤又は安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製することができる。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　トリコスタチンＡ添加培地の調製
　ウイルス産生細胞培養用無血清培地であるＧＴ－Ｔ－ＲｅｔｒｏＩ（タカラバイオ社製、以下、ＲｅｔｒｏＩと記載する）を基本培地Ａ（培地Ａ）として、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（和光純薬社製）を最終濃度１０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように添加し、さらにトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（シグマ社製）をそれぞれ最終濃度５００ｎＭになるように添加した、培地Ｂ－１及びＢ－２（以下、培地Ｂ群と記載する）を作製した。さらに、培地Ｂ－１に脂肪酸濃縮液（ギブコ社製、以下ｌｉｐｉｄと記載する）を溶液比（Ｖ／Ｖ）で１／１００、１／２５０、１／１０００となるようにそれぞれ添加して、培地Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－３（以下、培地Ｃ群と記載する）を作製した。さらに培地ＡにＴＳＡのみ添加（終濃度５００ｎＭ）した培地Ｄ、及びＡＴＲＡのみ添加（終濃度１０ｎＭ）した培地Ｅを作製した。各培地の組成を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２
１．レトロウイルス産生細胞の培養
　蛍光レポータータンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）遺伝子を搭載したマウス由来組換えレトロウイルスベクターを産生するレトロウイルス産生細胞（ＰＧ１３：ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６：をパッケージング細胞とした）のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を３７℃のウォーターバスにて解凍した。解凍された細胞液を１５ｍＬ遠心チューブに移し、完全培地［１０％ウシ胎児血清（１０％ＦＢＳ、エスエーエフシー　バイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）］を１０ｍＬ加え、遠心処理（５００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。遠心後、上清を除去し、１０ｍＬの完全培地に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、完全培地を用いて、細胞懸濁液を７８．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、細胞培養用の１００ｍｍディッシュ（イワキ社製）に前記の細胞懸濁液１ｍＬ、及び完全培地１４．７ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。継代間隔は３日とし、１継代目の播種細胞密度を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として継代操作を行った。２継代目は播種細胞密度を０．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として、細胞培養用の６穴トリートメントプレート（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに２ｍＬずつ添加した。２継代目実施の３日後、培養上清液を取り除き、実施例１に記載の培地Ａ、Ｂ－１、Ｂ－２、Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－３、Ｄ、Ｅにそれぞれ置換した（液量は０．１ｍＬ／ｃｍ２）。その翌日に、各培地を回収し、それぞれ新しい同じ培地に交換した。なお、２継代の３日後からは、３２℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％にて培養を行った。上記の培地の交換と回収を４日間連続で計４回行い、４回目は培地の添加を行わず培地の回収のみ行った。回収した培養上清液（１回目、２回目、３回目、４回目）は、０．２２μｍのポアサイズのフィルター（ミリポア社製）でろ過し、各回ごとにレトロウイルス上清液として小分け分注後－８０℃保存した。
２．レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価
　上記のように培地Ａ～Ｅを用いて回収した各レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。培地Ａ～Ｅを用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて５倍希釈液を調製した。このとき希釈には、ＡＣＤ－Ａ（テルモ社製）及びヒト血清アルブミン「アルブミナー２５％」（ＣＳＬベーリング社製）をそれぞれ５倍希釈、及び１２．５倍希釈してアルブミンの終濃度がそれぞれ５％、２％になるように生理食塩水に添加したもの（以下、５％アルブミン溶液、及び２％アルブミン溶液と記載）を用いた。遺伝子導入用の容器は２４穴ノントリートメントプレート（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いた。２４穴ノントリートメントプレートは、予めＡＣＤ－Ａで最終濃度２０μｇ／ｍＬになるように希釈したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標、タカラバイオ社製）を各ウェルに０．５ｍＬ添加して４℃で一晩処理し、プレートからレトロネクチン溶液を取り除いた後、ＡＣＤ－Ａを各ウェルに０．５ｍＬ添加して取り除くという洗浄作業を２回行ったものを使用した。このプレートの各ウェルに各ウイルス希釈液を１ｍＬ添加し、遠心処理（３２℃、２０００×ｇ、２時間）した。遠心後、各ウェルよりウイルス希釈液上清を取り除き、ヒト血清アルブミン「アルブミナー２５％」を１６．６７倍希釈してアルブミンの終濃度が１．５％になるように生理食塩水に添加したもの（以下、１．５％アルブミン溶液と記載）０．５ｍＬずつで各ウェルを３回洗浄した。ヒトＴリンパ球性白血病細胞ＳＵＰ－Ｔ１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１９４２）を、ＳＵＰ－Ｔ１用の培養用培地［１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）］に、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。前記の洗浄後の２４穴ノントリートメントプレートの各ウェルにこの懸濁液１ｍＬ（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を添加し、遠心処理（３２℃、１０００×ｇ、１０分）した。遠心後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて１日間培養を行った。次の日、ＳＵＰ－Ｔ１用の培養用培地を１ｍＬそれぞれ添加し、更に１日間培養した。培養後、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、蛍光レポータータンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）の発現を調べた。感染培養後の細胞０．５×１０６ｃｅｌｌｓをエッペンドルフチューブに移し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞は終濃度が０．５％となるようにＢＳＡ（ウシ胎児血清アルブミン、シグマ社製）を添加したリン酸バッファー（ギブコ社製）（以下、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）９５０μＬに懸濁し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて再度細胞を沈殿させた。上清を再度取り除いた後、０．５％ＢＳＡ（シグマ社製）を添加したリン酸バッファー（ギブコ社製）４００μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をフローサイトメトリー測定に供した。
３．フローサイトメトリー解析
　フローサイトメトリー解析はＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ　フローサイトメーター（ベクトン　ディッキンソン社）を用いて機器指示書に従い行った。ＺｓＧｒｅｅｎの発現率の求め方は、前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）の２パラメータヒストグラム（ｘ軸：ＦＳＣ、ｙ軸：ＳＳＣ）上で、目的細胞集団をゲートでくくり、そのゲート中の細胞集団をＧＦＰ検出パラメーターのヒストグラム（ｘ軸：ＧＦＰの蛍光強度、ｙ軸：細胞数を示す）で展開し、アイソタイプコントロールと比較してＧＦＰ蛍光強度の高い細胞をＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞として定義し、前述のゲート中全細胞数に対するＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞数の比率（％）を遺伝子導入率（ＧＴ％：Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）とし、及び蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
　遺伝子導入効率の測定結果を図１に示す。
　実施例２－２の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、４日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図１に示されるように、培地Ｂ群、Ｃ群を用いて回収したレトロウイルス上清液の遺伝子導入効率は、基本培地である培地Ａよりも２倍以上の遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地Ａよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が導入された。また、培地Ｂ群、Ｃ群ともに培地Ｄ、Ｅと比較しても、ＴＳＡ又はＡＴＲＡ単独よりも高い前記効果が得られた。
　なお、図中、「ＮＧＭＣ」は非遺伝子導入細胞を意味し、陰性対照を示す。以下図２～図１５中も同様の意味である。
　蛍光強度（以下、遺伝子発現強度を意味する）の測定結果を図２に示す。
　実施例２－２の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、４日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図２に示されるように、培地Ｂ群、Ｃ群を用いて回収したレトロウイルス上清液の蛍光強度は、培地Ａよりも２倍程度高い蛍光強度を示した。すなわち、培地Ａよりも高タイターのウイルスが得られ高効率に遺伝子が導入されることにより蛍光レポータータンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）が高発現された。また、培地Ｄ、Ｅと比較しても、ＴＳＡ又はＡＴＲＡ単独よりも高い前記効果が得られた。
実施例３　ＮａＢ添加培地の調製
　実施例１記載の培地Ａに、ＡＴＲＡを最終濃度１０ｎＭ、及び１００ｎＭとなるように添加し、さらに酪酸ナトリウム（ＮａＢ）を最終濃度５ｍＭになるように添加して、培地Ｆ－１、Ｆ－２をそれぞれ作製した。更に、培地Ｆにｌｉｐｉｄを溶液比（Ｖ／Ｖ）で１／１００、１／２５０、１／１０００となるように添加して、培地Ｇ－１、Ｇ－２、Ｇ－３をそれぞれ作製した。さらに培地ＡにＮａＢのみ添加（終濃度５ｍＭ）した培地Ｈ、及びＡＴＲＡのみ添加（終濃度１０ｎＭ）した培地Ｅを作製した。これらの培地組成を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例３の培地Ａ、Ｆ群、Ｇ群、Ｈ及びＥを用いて、実施例２－１と同様にしてウイルス上清液を取得した。遺伝子導入は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図３に示す。
　図３に示されるように、培地Ｆ群、Ｇ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ａよりも２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地Ｆ群、Ｇ群では培地Ａよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が導入された。また、培地Ｈ、Ｅ（ＮａＢ又はＡＴＲＡ単独）と比較しても、高い効果が得られた。
　蛍光強度の測定結果を図４に示す。
　実施例２－２の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、４日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図４に示されるように、培地Ｆ群、Ｇ群を用いて回収したレトロウイルス上清液で得られた遺伝子導入細胞は、培地Ａを用いた場合よりも２倍程度高い蛍光強度を示した。すなわち、培地Ａよりも高タイターのウイルスが得られ高効率に遺伝子が導入されることにより蛍光レポータータンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）が高発現された。また、培地Ｈ、Ｅを用いた場合と比較しても細胞の蛍光強度は高かった。
実施例５　ＶＰＡ添加培地の調製
　実施例１記載の培地Ａに、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を最終濃度１０ｎＭとなるように添加し、さらにバルプロ酸（ＶＰＡ）（和光純薬工業）を最終濃度５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように添加した、培地Ｉ－１、Ｉ－２、及びＩ－３（以下、培地Ｉ群と記載する）を作製した。また、比較対照として、培地ＡにＶＰＡを最終濃度５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように添加した、培地Ｊ－１、Ｊ－２、及びＪ－３（以下、培地Ｊ群と記載する）を作製した。さらに培地ＡにＮａＢのみ添加（終濃度５ｍＭ）した培地Ｈ、及びＮａＢ（終濃度５ｍＭ）とＡＴＲＡ（終濃度１０ｎＭ）を添加した培地Ｆ－１を作製した。これらの培地組成を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例５の培地Ａ、Ｉ群、Ｊ群、Ｈ、及びＦ－１を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例２－１では４日間としているが、本実施例では３日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を１０倍とした以外は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図５に示す。
　図５に示されるように、培地Ｉ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ａよりも２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地Ｉ群では培地Ａよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が導入された。また、培地Ｊ群（ＶＰＡ単独）と比較しても、高い効果が得られた。なお、実施例４の図２の結果と同様、培地Ｆ－１は、培地Ｈ（ＮａＢ単独）と比較しても、高い効果が得られた。
実施例７　
１．レトロウイルス産生細胞の作製
　国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレット記載のコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター（ＭＳ－ＭＡ２４－ｓｉＴＣＲ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１１２６８）に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種エコトロピックレトロウイルス上清液を獲得した。このウイルス上清液を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ　ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＰＧ１３細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、限界稀釈法により細胞のクローン化を行った。
２．レトロウイルス産生細胞のパイロットスケール培養
　実施例７－１で得られたクローン細胞から作製したワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を３７℃のウォーターバスにて解凍した。解凍された細胞液を１５ｍＬ遠心チューブに移し、完全培地［１０％ウシ胎児血清（１０％ＦＢＳ、エスエーエフシー　バイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）］を１０ｍＬ加え、遠心処理（５００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。遠心後、上清を除去し、１０ｍＬの完全培地に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、完全培地を用いて、細胞懸濁液を７８．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、細胞培養用の１００ｍｍディッシュ（イワキ社製）に前記の細胞懸濁液１ｍＬ、及び完全培地１４．７ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。継代間隔は３日とし、１継代目の播種細胞密度を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として継代操作を行った。２継代目は播種細胞密度を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として、細胞培養用のＣＥＬＬＢＩＮＤ処理Ｔ２２５フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）１個あたりに４５．０ｍＬずつ添加した。２継代目実施の３日後、培養上清液を取り除き、表４記載の培地Ｈ、Ｆ－１、Ｋ、Ｌ、及びＢ－１にそれぞれ置換した（液量は０．１ｍＬ／ｃｍ２）。なお、デキサメタゾン（ＤＥＸ）（ナカライテスク社製）は、培地Ｋ、Ｌに最終濃度１００ｎＭとなるように添加した。培地置換の翌日に、各培地を回収し、それぞれ新しい同じ培地に交換した。なお、２継代の３日後からは、３２℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％にて培養を行った。上記の培地の交換と回収を３日間連続で計３回行い、３回目は培地の添加を行わず培地の回収のみ行った。回収した培養上清液（１回目、２回目、３回目）は、混合した後０．２２μｍのポアサイズのフィルター（ミリポア社製）でろ過し、レトロウイルス上清液として小分け分注後－８０℃保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
３．レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価
　レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。
　レトロネクチンを２５μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶液を表面処理した（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ）６穴プレートに各ウェル１ｍＬずつ添加し、３７℃で５時間放置した。その後溶液を除き、ＧＴ－Ｔ－ＲｅｔｒｏIII（タカラバイオ社製、以下、ＲｅｔｒｏIIIと記載する）を用いて１ｍＬずつ各ウェルを２回洗浄した。次に、ＲｅｔｒｏIIIにＩＬ－２（ＮＯＶＡＲＴＩＳ社製）を最終濃度６００ＩＵ／ｍＬ、ファンギゾン（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）を最終濃度０．５μｇ／ｍＬ、自己血漿０．６％となるように調製した培養用培地（以下、ＣＭと記載する）を１ｍＬずつで各ウェルを洗浄し、レトロネクチン／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを作製した。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、０．２×１０６個／ｍＬとなるように、ＣＭで調製し、この懸濁液６．７ｍＬをフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートに０．７ｍＬ／ｃｍ２となるように加え、培養を開始した。（０．１４×１０６ｍＬ／ｃｍ２）
　培養開始より４日目に遺伝子導入操作を下記のように行った。培地Ｈ、Ｆ－１、Ｋ、Ｌ、及びＢ－１を用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて原液、５倍希釈液を調製した。このとき希釈には、ＡＣＤ－Ａ、５％アルブミン溶液及び２％アルブミン溶液を用いた。遺伝子導入用の容器は２４穴ノントリートメントプレートを用いた。２４穴ノントリートメントプレートは、予めＡＣＤ－Ａで最終濃度２０μｇ／ｍＬになるように希釈したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを各ウェルに０．５ｍＬ添加して４℃で一晩処理し、プレートからＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を取り除いた後、ＡＣＤ－Ａを用いて０．５ｍＬずつで各ウェルの洗浄を２回行ったものを使用した。このプレートの各ウェルに各ウイルス希釈液を１ｍＬ添加し、遠心処理（３２℃、２０００×ｇ、２時間）した。遠心後、各ウェルよりウイルス希釈液上清を取り除き、１．５％アルブミン溶液０．５ｍＬずつで各ウェルを３回洗浄した。培養細胞懸濁液を回収し、ＣＭに、０．１４５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。前記の洗浄後の２４穴ノントリートメントプレートの各ウェルにこの懸濁液１ｍＬ（０．０７２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を添加し、遠心処理（３２℃、１０００×ｇ、１０分）した。遠心後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて４時間培養を行った。その後、細胞懸濁液をＣＭで５倍希釈し、表面処理した（ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ）６ウェルプレートに添加し培養を継続した。培養開始から７日目に細胞懸濁液と等量のＣＭを加え、２倍希釈して培養を更に継続した。
　培養開始から１０日目に、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、ＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー－ＰＥ（ルードヴィッヒ社製）、及びＨｕｍａｎ　ＣＤ８－ＡＰＣｃｙ７（ベクトン　ディッキンソン社製）にて染色し、フローサイトメーターによりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。具体的には、感染培養後の細胞０．３×１０６ｃｅｌｌｓをエッペンドルフチューブに移し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞は９５０μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて再度細胞を沈殿させた。上清を再度取り除いた後、ＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー－ＰＥ１μＬに０．５％ＢＳＡを８μＬ添加した混合液で懸濁し、３０分、４℃で反応させた。その後、Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８－ＡＰＣｃｙ７を１μＬ加え、３０分、４℃で反応させた。反応後、９５０μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて上清を取り除く工程を２回行った後、４００μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をフローサイトメトリー測定に供した。
４．フローサイトメトリー解析
　フローサイトメトリー解析はＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ　フローサイトメーターを用いて機器指示書に従い行った。ＣＤ８陽性細胞中のテトラマー陽性細胞の存在比率の求め方は、ＡＰＣｃｙ７、ＰＥ検出パラメーターの２パラメータヒストグラム（ｘ軸：ＡＰＣｃｙ７の蛍光強度、ｙ軸：ＰＥの蛍光強度を示す）上で、アイソタイプコントロールによりＡＰＣｃｙ７（ＣＤ８）、ＰＥ（ＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー）非発現細胞の蛍光強度領域を確認後、その領域を境に４分割し、ＡＰＣｃｙ７、ＰＥ発現細胞の蛍光強度領域を定め、その細胞数の割合（％）を測定した。測定後、遺伝子導入効率（ＧＴ％：Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、下記の式により求めた。
　ＧＴ％　＝　ＣＤ８、及びテトラマー陽性細胞数　／　ＣＤ８陽性細胞数
　遺伝子導入効率の測定結果を図６に示す。図６に示されるように、Ｆ－１、Ｋ、Ｌ、及びＢ－１を用いて回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、基本培地である培地ＡにＮａＢを添加した培地Ｈよりも顕著に高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、実施例２および４に記載の蛍光蛋白質発現ウイルスベクターに限らず、また、実験スケール以上のパイロットスケールにおいても、高タイターのウイルスが得られ高効率に目的遺伝子が導入された。
　５．レトロウイルス上清液のＲＮＡコピー数評価
　レトロウイルス上清液についてＲＮＡコピー数の測定を行った。
　測定は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｉｔｅｒ　Ｓｅｔ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　ＴＩＭＥ　ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）を用いて、取扱説明書の標準的な使用方法に従ってＲＮＡコピー数を算出した。結果については、図７に示されるように実施例７－４の遺伝子導入効率の結果と同様、ＡＴＲＡ、ＤＥＸの片方、又は両方をＮａＢと組み合わせることにより、基本培地である培地ＡにＮａＢを添加した培地Ｈよりも顕著に高いＲＮＡコピー数(以下、図中ＲＮＡ　ＣＯＰＹと記載）を示した。
実施例８　ＴＳＡ添加培地の調製２
　培地Ａにデキサメタゾン（ＤＥＸ）を最終濃度１００ｎＭ、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を最終濃度１μＭとなるように添加し、さらにトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）をそれぞれ最終濃度５０ｎＭ、５００ｎＭになるように添加した、培地Ｍ－１、及びＭ－２（以下、培地Ｍ群と記載する）を作製した。さらに培地ＡにＴＳＡを終濃度５０ｎＭ、５００ｎＭになるように添加した、培地Ｄ－１、及びＤ－２（以下、培地Ｄ群と記載する）ＮａＢのみ添加（終濃度５ｍＭ）した培地Ｈ、及びＮａＢ（終濃度５ｍＭ）、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を最終濃度１００ｎＭ、デキサメタゾン（ＤＥＸ）を最終濃度１００ｎＭ添加した培地Ｎを作製した。各培地の組成を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例９
１．レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例７－１記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例８記載の培地を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例２－１では４日間としているが、本実施例では３日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。
２．レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価
　遺伝子導入はＣＤ８抗体をＨｕｍａｎ ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ベクトン　ディッキンソン社製）を用いて実施した以外は実施例７－３と同様に行った。遺伝子導入効率の評価は、実施例７－４と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図８に示す。図８に示されるように、Ｍ－１とＤ－１、Ｍ－２とＤ－２、及びＨとＮを比較すると、ＮａＢ又はＴＳＡと、ＡＴＲＡ、ＤＥＸを併用した培地を用いて回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、ＮａＢ、ＴＳＡ単独添加培地であるＤ群、及びＨよりも顕著に高い遺伝子導入効率を示した。また、ＴＳＡは５０ｎＭより５００ｎＭで効果があった。
３．レトロウイルス上清液のＲＮＡコピー数評価
　レトロウイルス上清液についてＲＮＡコピー数の測定を行った。
　測定は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｉｔｅｒ　Ｓｅｔ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　ＴＩＭＥ　ＰＣＲ）を用いて、取扱説明書の標準的な使用方法に従ってＲＮＡコピー数を算出した。結果については、図９に示されるように実施例９－２の遺伝子導入効率の結果と同様、Ｍ－１とＤ－１、Ｍ－２とＤ－２、及びＨとＮを比較すると、ＡＴＲＡ、ＤＥＸの両方をＮａＢ、又はＴＳＡと組み合わせることにより、ＮａＢ、又はＴＳＡ単独添加培地よりも顕著に高いＲＮＡコピー数を示した。また、ＴＳＡは５０ｎＭより５００ｎＭで効果があった。
実施例１０　ＴＳＡ添加培地の調製３
　実施例１と同様の方法で表６記載の最終濃度となるように培地を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例１１　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例１０記載の培地を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を本実施例では４日間で回収して混合したウイルス上清液と、３日間で回収して混合したウイルス上清液を評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を１０倍とした以外は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率及び蛍光強度の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図１０に示す。
　図１０に示されるように、培地Ｏ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ａよりも６～８倍程度高い遺伝子導入効率を示した。また、遺伝子導入効率は、３日間より４日間の方が対照群からの上昇効果が大きかった。
　蛍光強度の測定結果を図１１に示す。
　図１１に示されるように、培地Ｏ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での蛍光強度は、培地Ａよりも２～３．５倍程度高い蛍光強度を示した。
　実施例１２　９－ｃｉｓレチノイン酸（９－ｃｉｓ）（ナカライテスク社製）、ＡＭ８０添加培地の調製
　実施例１と同様の方法で表７記載の最終濃度となるように培地を調製した。ここで、ＡＭ８０にタミバロテン（シグマ社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例１３　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例１２記載の培地を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例２－１では４日間としているが、本実施例では３日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を１０倍とした以外は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図１２に示す。
　図１２に示されるように、培地Ｐ群、Ｒ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ａよりも１．５～２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。なお、９－ｃｉｓ、ＡＭ８０単独の培地Ｑ群、Ｓ群の遺伝子導入効率は培地Ａと同程度か減少する。
実施例１４　スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（ＣＡＹＭＡＮ社製）添加培地の調製
　実施例１と同様の方法で表８記載の最終濃度となるように培地を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例１５　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例１４記載の培地を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例２－１では４日間としているが、本実施例では３日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を１０倍とした以外は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図１３に示す。
　図１３に示されるように、培地Ｔ群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ａよりも１．４～１．９倍程度高い遺伝子導入効率を示した。また、ＳＡＨＡ濃度が対応するＵ群培地よりも高い遺伝子導入効率を示した。
実施例１６　ＮａＢ添加培地の調製２
　細胞培養用培地であるＤＭＥＭに非働化ＦＢＳを溶液比（Ｖ／Ｖ）で１／１０加えた基本培地（培地Ｖ）として、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を最終濃度１００ｎＭとなるように添加し、さらに酪酸ナトリウム（ＮａＢ）を最終濃度５ｍＭになるように添加して、培地Ｗを作製した。さらに培地ＶにＮａＢのみ添加（終濃度５ｍＭ）した培地Ｘ、及びＡＴＲＡのみ添加（終濃度１００ｎＭ）した培地Ｙを作製した。各培地の組成を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例１７　レトロウイルス産生細胞の培養
　実施例２記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例１６記載の培地を用いて、実施例２－１の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例２－１では４日間としているが、本実施例では３日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を１０倍とした以外は実施例２－２と同様に行い、遺伝子導入効率、蛍光強度の評価は、実施例２－３と同様に行った。
　遺伝子導入効率の測定結果を図１４に示す。
　図１４に示されるように、培地Ｗを用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Ｖよりも１．２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。
　蛍光強度の測定結果を図１５に示す。
　図１５に示されるように、培地Ｗを用いて回収したレトロウイルス上清液での蛍光強度は、培地Ｖよりも１．５倍程度高い蛍光強度を示した。
　本発明の培地を用いることにより、高いウイルス力価のウイルス上清が容易に得られることから、ウイルスベクター及び当該ベクターを含有する高力価組成物を容易に調製することが可能となる。本発明の培地を用いて得られたウイルスベクターや前記組成物は遺伝子治療の分野で非常に有用である。

Claims (13)

  1. 　ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法。
  2. 　培地が、有効成分として、更に脂質類を含む請求項１記載の製造方法。
  3. 　細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項１～３いずれか記載の製造方法。
  5. 　ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンＡ及び酪酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種の物質である請求項１～４いずれか記載の製造方法。
  6. 　請求項１～５いずれか記載の方法で製造されたウイルスベクター。
  7. 　請求項６記載のウイルスベクターを用いて細胞を形質転換することを特徴とする形質転換された細胞集団の製造方法。
  8. 　請求項７に記載の製造方法で得られた形質転換された細胞集団。
  9. 　医薬に使用するための請求項８記載の細胞集団。
  10. 　医薬の製造に用いる請求項８記載の細胞集団。
  11. 　請求項８記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬。
  12. 　対象に有効量の請求項１１記載の医薬を投与する工程を含む疾病の治療方法又は予防方法。
  13. 　有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地。
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