WO2011149248A2 - 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고수율로 제조하는 방법 - Google Patents

글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고수율로 제조하는 방법 Download PDF

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서정우
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Definitions

  • the present invention is characterized in that in a microorganism having the ability to produce coenzyme B12, and having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid using glycerol as a carbon source, a mutant microorganism inserted or amplified a propanediol-using protein gene is cultured in a glycerol-containing medium. It relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid.
  • 3-hydroxypropionic acid along with lactic acid and succinic acid, has attracted attention as one of the three major biomass-derived platform chemicals, 1,3-propanediol and acrylic acid (although it can be used as a raw material for the production of acrylic acid, acrylamide, malonic acid, and biopolymer (polyhydroxypropionic acid), the development of mass production technology is very important.
  • Biological methods include Suthers et al., A glycerol dehydratase gene from Klebsiella pneumoniae and an aldehyde derived from Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae.
  • a method for producing 3-hydroxypropionic acid from glycerol using recombinant E. coli overexpressing a dehydrogenase gene (US 6852517) has been reported.
  • Rathnasingh et al. Reported a new recombinant E. coli with improved 3-hydroxypropionic acid production from glycerol (Rathnasingh et al., Biotechnol. Bineng . 104: 729-39. 2009).
  • the method for producing 3-hydroxypropionic acid from glycerol by using recombinant E. coli has a disadvantage of supplying the culture medium with an expensive adenosylcobalamine (coenzyme B12), which is a coenzyme required for reactivation of glycerol dehydratase enzyme. .
  • the present inventors confirmed that high expression of the aldehyde dehydrogenase gene in Klebsiella pneumoniae can produce 3-hydroxypropionic acid with high production rate without adding coenzyme 12.
  • the present inventors have made efforts to develop a method for increasing the amount of 3-hydroxypropionic acid produced from glycerol by Krebsiella pneumoniae.
  • the propanediol-using protein gene of Lactobacillus reuteri was used as Krebsiela.
  • overexpressed in pneumoniae it was confirmed that 3-hydroxypropionic acid can be produced in high yield, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a mutant microorganism capable of producing high yield of 3-hydroxypropionic acid from glycerol.
  • the present invention provides a mutant microorganism having the ability to produce coenzyme B12, inserting or amplifying propanediol-using protein gene in a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid using glycerol as a carbon source .
  • the present invention also provides 3-hydroxypropionic acid suffering from coenzyme B12 production ability, and inserting or amplifying the propanediol-using protein gene in a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid using glycerol as a carbon source. It provides a method for producing a mutant microorganism having an acid function.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the mutant microorganisms in a glycerol-containing medium to produce 3-hydroxypropionic acid; And (b) provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising the step of recovering the produced 1,3-propanediol.
  • the present invention also relates to glycerol dehydrogenase gene (DhaD), transcriptional activator gene (DhaR), 1,3-propanediol oxidoreductase gene (DhaT) and glycerol dehydra, in Krebsiella pneumoniae.
  • DhaD glycerol dehydrogenase gene
  • DhaR transcriptional activator gene
  • DhaT 1,3-propanediol oxidoreductase gene
  • glycerol dehydra in Krebsiella pneumoniae.
  • DhaBA2 kinase reactivation factor II gene
  • a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase a gene encoding aldehyde dehydrogenase
  • propanediol utilizing protein gene It provides a Krebsciella pneumoniae variant characterized by.
  • the present invention also relates to glycerol dehydrogenase gene (DhaD), transcriptional activator gene (DhaR), 1,3-propanediol oxidoreductase gene (DhaT) and glycerol dehydra, in Krebsiella pneumoniae. And a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, a gene encoding aldehyde dehydrogenase, and a propanediol utilizing protein gene. It provides a method for producing a Krebssiella pneumoniae variant.
  • the present invention also comprises the steps of: (a) culturing the Klebsiella pneumoniae variant in a glycerol containing medium to produce 3-hydroxypropionic acid; And (b) provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising the step of recovering the 3-hydroxypropionic acid produced.
  • Figure 2 shows the construction of the recombinant plasmid pVOT.
  • Figure 3 shows the manufacturing process of the Krebsela pneumoniae AK mutant strain.
  • the present invention relates to a mutant microorganism having a coenzyme B12 generating ability, and to inserting or amplifying a propanediol-using protein gene in a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid using glycerol as a carbon source and a method for producing the same. will be.
  • the propanediol-using protein gene may be characterized in that the propanediol-using protein (PduP) gene of Lactobacillus reuteri , has the ability to produce coenzyme B12, 3-hydroxy using glycerol as a carbon source Microorganisms having the ability to produce hydroxypropionic acid may be characterized as belonging to the genus Klebsiella .
  • PduP propanediol-using protein
  • the microorganism having the ability to produce coenzyme B12, and having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid using glycerol as a carbon source may be characterized in that the microorganisms blocked the glycerol oxidation pathway.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the mutant microorganisms in a glycerol containing medium to produce 3-hydroxypropionic acid; And (b) relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising the step of recovering the produced 1,3-propanediol.
  • the present invention relates to glycerol dehydrogenase gene (DhaD), transcriptional activator gene (DhaR), 1,3-propanediol oxidoreductase gene (DhaT) and glycerol di
  • the hydratase reactivation factor II gene (DhaBA2) is deleted, a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, a gene encoding aldehyde dehydrogenase, and a propanediol utilizing protein gene are introduced. It relates to Krebssiella pneumoniae variants characterized in that there is and a method for producing the same.
  • the propanediol using protein gene may be characterized in that the propanediol using protein (PduP) gene of Lactobacillus reuteri , the Krebssiella pneumoniae variant is Krebssiella pneumoniae It may be characterized as AK-VOTLp (KCTC 11689BP).
  • PduP propanediol using protein
  • KCTC 11689BP AK-VOTLp
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the Krebssiella pneumoniae variant in a glycerol containing medium to produce 3-hydroxypropionic acid; And (b) relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising the step of recovering the 3-hydroxypropionic acid produced.
  • the recovery of 3-hydroxypropionic acid from the culture of the mutant may use a conventional separation technique, for example distillation, electrodialysis, pervaporation, chromatography, solvent extraction, reaction extraction, etc. In order to separate substances of high purity, these may be used in combination.
  • "amplification" of a gene means that the gene present on the individual's chromosome or in the plasmid can be overexpressed by additional "introduction". Inserting a gene on a chromosome or transforming a gene into an individual using a recombinant vector.
  • the method for inserting the gene on the chromosome of the cell in the present invention can be used a commonly known genetic engineering method, for example retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, herpes simplex virus vector, The method using a poxvirus vector, a lentiviral vector, or a nonviral vector is mentioned.
  • a plasmid was prepared for overexpressing propanediol-using protein genes in Krebssiella pneumoniae that are believed to be involved in the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol in the Krebssiella pneumoniae strain.
  • PduP propanediol-using protein
  • GenBank database No. BAG26139 chromosomal DNA of Lactobacillus reuteri as a template using the following primer sequence, and then cloned into pGEM TEasy vector. After confirmation, plasmid DNA was prepared (FIG. 1).
  • DhaT 1,3-propanediol oxidoreductase gene
  • the prepared pVOTLp and pVOT were introduced into the Krebssiella pneumoniae MGH78578 strain (named Cu), respectively, in which plasmid DNA was cured.
  • Cu Krebssiella pneumoniae MGH78578 strain
  • the pVOT plasmid was prepared by the method described in FIG. 2, and recombined with Krebsiella pneumoniae and deposited in Klebsiella pneumoniae AK-VOT (KCTC11421BP) at the Korea Research Institute of Biotechnology.
  • DhaB enzyme reactivation factor, DhaT gene, DhaR modulator and DhaD of dha regulators (FIG. 2) by homologous recombination method using the plasmid DNA-treated Krebsela pneumoniae MGH78578 strain (Cu) as a parent strain
  • a recombinant strain AK lacking both oxidation and reduction pathways was prepared.
  • DNA fragments for preparing plasmid for homologous recombination using the chromosomal DNA of Krebsiella pneumoniae MGH78578 strain as a template were amplified by PCR using the following primer sets.
  • the amplified DNA fragment was cloned using pGEM TEasy vector to confirm the nucleotide sequence, and then plasmid DNA was prepared as shown in FIG. 3.
  • DNA fragments obtained by treatment of the plasmid with Bam HI- Bgl II were introduced into the Klebsiella pneumoniae Cu strain by electroshock method, and recombinant strains forming colonies were isolated in apramycin-added medium.
  • a recombinant strain Krebssiella pneumoniae AK strain (KCTC11419BP) in which the DhaB enzyme reactivation factor, the DhaT gene, the DhaR regulator, and the DhaD gene of the dha regulator was removed and the lacZ promoter and apramycin resistance gene were inserted was obtained. .
  • Plasmid pVOTLp gene containing propanediol-using protein gene and plasmid DNA containing DhaB reactivating enzyme gene and 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme gene were subjected to electric shock method for the Klebsiella pneumoniae Cu strain and AK Introduced into strain.
  • AK-VOTLp which is a recombinant strain prepared in this Example, was deposited at the Genetic Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC 11689BP).
  • Example 2 Cultivation of propepdiol-using protein gene high expressed Klebsiella pneumoniae recombinant strain
  • the recombinant strain prepared in Example 1 was incubated at 120 rpm for 20 hours at 37 ° C. using 50 ml of medium containing glycerol as the sole carbon source, and then the yield of 3-hydroxypropionic acid was analyzed by chromatography.
  • composition of the medium used is as follows:
  • a 5L fermenter was used to investigate the extent of propagation of the Klebsiella pneumoniae AK-VOTLp strain, and at the same time, the amount of glycerol remaining in the culture supernatant and the amount of metabolites including 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol were measured. Analyzed by chromatography.
  • composition of the medium is as follows:
  • the effective volume of 5L fermenter was 2L, the final concentration was IPTG 0.5 mM, tetracycline 10 ⁇ g / L, inoculation amount 1%, incubation temperature 37 ° C., stirring speed 200 rpm, air injection rate was 0.5 vvm.
  • the total glycerol was consumed at 28 hours of culture, and the yield, conversion rate and productivity of 3-hydroxypropionic acid were 2.2 g / L, 0.11 (mol / mol), and 0.08 g / Lh, respectively. It was.
  • 3-hydroxypropionic acid can be produced in high yield from glycerol without adding expensive coenzyme B12 cofactor.

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Abstract

본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고가의 코엔자임 B12 보조인자를 첨가하지 않고도, 글라이세롤로부터 고수율로 3-하이드록시프로피온산을 제조할 수 있다.

Description

글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고수율로 제조하는 방법
본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid)은 젖산, 숙신산과 더불어 바이오매스 유래의 3대 플랫폼 화학원료로 주목을 받고 있는 물질로서, 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol), 아크릴산 (acrylic acid), 아크릴아미드 (acrylamide), 말론산 (malonic acid), 바이오폴리머 (poly-hydroxypropionic acid)의 제조를 위한 원료로 활용이 가능하지만, 대량생산 기술의 개발이 매우 중요하다.
3-하이드록시프로피온산을 제조하기 위한 화학공정으로는 팔라듐 촉매를 이용하여 1,3-프로판디올로부터 제조하는 방법 (US5321156), 팔라듐, 백금 촉매를 이용하여 3-하이드록시프로피온알데히드로부터 제조하는 방법 (US5831121), 이온교환수지를 이용하여 아크릴산으로부터 제조하는 방법 (JP2000-159724), 산 혹은 염기 촉매를 이용하여 에폭사이드 유도체로부터 제조하는 방법 (KR10-0408806) 등이 보고되어 있다.
생물학적 방법으로는 위스콘신 대학의 Suthers등이 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase)유전자와 대장균 혹은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알데하이드 디하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 유전자를 과발현한 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 방법을 보고하였다 (US 6852517). 최근에는 Rathnasingh 등이 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산 생산량이 향상된 새로운 재조합 대장균을 보고하였다 (Rathnasingh et al., Biotechnol. Bineng. 104:729-39. 2009).
그러나, 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 방법은 글리세롤 디하이드라타제 효소의 재활성화를 위해 필요한 보조효소인 고가의 adenosylcobalamine (코엔자임 B12)를 배양액에 공급해 주어야 하는 단점이 있다.
한편, 본 발명자들은 크렙시엘라 뉴모니아에서 알데히드 디하이드로게나제 유전자를 고발현시킬 경우, 코엔자임 12를 첨가하지 않아도, 높은 생산율로 3-하이드록시프로피온산을 제조할 수 있다는 것이 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 크렙시엘라 뉴모니아에 의한 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산량을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 유전자를 크렙시엘라 뉴모니아에 과발현 시키는 경우, 고수율로 3-하이드록시프로피온산을 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 글라이세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 글라이세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고수율 생산할 수 있는 변이 미생물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시킨 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산 고생산능을 가지는 변이미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 크렙시엘라 뉴모니아에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 프로판디올 이용 단백질 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 크렙시엘라 뉴모니아에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)를 결실시키고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 프로판디올 이용 단백질 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 크렙시엘라 뉴모니아 변이체를 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 재조합 플라스미드 pVOTLp의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pVOT의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 3는 크렙시엘라 뉴모니아 AK 변이균주의 제작과정을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체저인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시킨 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로판디올 이용 단백질 유전자는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라(Klebsiella)속인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 글리세롤 산화경로가 차단된 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 크렙시엘라 뉴모니아에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 프로판디올 이용 단백질 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 프로판디올 이용 단백질 유전자는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 크렙시엘라 뉴모니아 변이체는 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTLp(KCTC 11689BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 크렙시엘라 뉴모니아 변이체를 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 배양액으로부터의 3-하이드록시프로피온산의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그라피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자의 "증폭"이란 개체의 염색체 상에 존재하거나, 플라스미드에 존재하는 유전자를 추가로 "도입"하여 과발현될 수 있도록 하는 것이며, 본 발명에서 유전자의 "도입"이란, 개체의 염색체 상에 유전자를 삽입시키거나, 재조합 벡터를 이용하여 유전자를 개체에 형질전환시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 유전자를 세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 프로판디올 이용 단백질 유전자 고발현된 크렙시엘라 뉴모니아 재조합 균주의 제조
(1) 프로판디올 이용 단백질 유전자 고발현 플라스미드의 제작
크렙시엘라 뉴모니아 균주에서 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산에 관여하는 것으로 판단되는 프로판디올 이용 단백질 유전자를 크렙시엘라 뉴모니아에서 과발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 하기의 프라이머 서열을 사용하여 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자 (GenBank database No. BAG26139)를 증폭한 후, pGEM TEasy 벡터로 클로닝하여 염기서열을 확인한 후 플라스미드 DNA를 제조하였다 (도 1).
서열번호 1 : 5’-TCTAGAatgcagattaatgatattgaaagtgct-3’ (PduP-F)
서열번호 2 : 5’-GGATCCCTCGAGttaataccagttacgtactgagaatcc-3’ (AldHk-R)
도 1에서 나타난 바와 같이, lacZ 프로모터 하류에 락토바실러스 루테리 프로판디올 이용 단백질 PduP 유전자를 도입한 후, DhaB 재활성화 효소 유전자와 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 유전자 (DhaT)가 포함된 플라스미드인 pVOT에 삽입하여, 프로판디올 이용 단백질 유전자 및 DhaB 재활성화 효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOTLp를 제작하였다.
상기 제작된 pVOTLp 및 pVOT는 플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(Cu로 명명)에 각각 도입하여, 크렙시엘라 뉴모니아 Cu/pVOT 및 크렙시엘라 뉴모니아 Cu/pVOTLp를 제조하였다.
pVOT 플라스미드는 도 2에 기재된 방법으로 제작되었으며, 크렙시엘라 뉴모니아에 재조합하여, Klebsiella pneumoniae AK-VOT(KCTC11421BP)로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁되어 있다.
(2) 글리세롤 산화 환원경로가 결손된 크렙시엘라 뉴모니아 재조합 균주의 제작
플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(Cu)를 모균주로 하여 상동성재조합 방법으로 dha 레귤론(도 2)의 한 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자를 apramycin 내성 유전자로 치환하여 산화, 환원 경로가 모두 결손된 재조합 균주 AK를 제조하였다.
크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주의 염색체 DNA를 주형으로하여 상동성 재조합(homologous recombination) 용 플라스미드를 제조하기 위한 DNA 단편들을 하기의 프라이머 세트들을 사용하여 PCR로 증폭하였다.
dhaBI 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 3 : 5’-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3’(dhaBI XbaI-480bpF)
서열번호 4 : 5’-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3’(dhaBI BamHI-480bpR)
dhaK 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 5 : 5’-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3’(dhaK HindIII-200-700 bpF)
서열번호 6 : 5’-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3’(dhaK BglII-200-700bpR)
dhaR 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 7 : 5’-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3’(dhaR bglII-200-700bpF)
서열번호 8 : 5’-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3’(dhaR HindIII-200-700bpR)
Apr 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 9 : 5’-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3’ Apr HpaI F
서열번호 10 : 5’-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3’ Apr HindIII-BglIIR
증폭된 DNA 단편을 pGEM TEasy 벡터를 이용하여 클로닝하여 염기서열을 확인한 후, 도 3에 나타낸 바와 같이 플라스미드 DNA를 제작하였다.
도 3에 나타낸 방법으로, AK 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB’)-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaK 유전자의 아미노말단(dhaK’)이 연결된 플라스미드 DNA를 제작하였다.
상기 플라스미드를 BamHI-BglII로 처리하여 회수한 DNA 단편을 전기충격법으로 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주에 도입한 후 apramycin이 첨가된 배지에서 콜로니를 형성하는 재조합 균주들을 분리하였다. 그 결과, dha 레귤론의 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자가 제거되고 lacZ 프로모터와 apramycin 내성 유전자가 삽입된 재조합 균주 크렙시엘라 뉴모니아 AK 균주(KCTC11419BP)를 수득하였다.
(3) 글리세롤 혐기대사 산화경로가 차단된 변이주에서 프로판디올 이용 단백질 유전자의 과발현
프로판디올 이용 단백질 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOTLp 유전자 및 DhaB 재활성화 효소 유전자와 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 효소 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 전기 충격법으로 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주와 AK 균주로 도입하였다. 본 실시예에서 제작한 재조합 균주인 균주인 AK-VOTLp는 한국생명공학연구원 내 유전자원센터에 기탁하였다 (KCTC 11689BP).
표 1
Figure PCTKR2011003798-appb-T000001
실시예 2: 프로판디올 이용 단백질 유전자 고발현된 크렙시엘라 뉴모니아 재조합 균주의 배양
실시예 1에서 제조된 재조합 균주를 글리세롤을 유일 탄소원으로 포함하는 배지 50ml를 사용하여, 37℃에서 20시간, 120rpm으로 배양한 다음, 3-하이드록시프로피온산의 생산량을 크로마토그래피로 분석하였다.
사용된 배지의 조성은 다음과 같다:
0.1M 포타슘포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 20g/L 글리세롤 혹은 글루코즈를 첨가한 후, 2g/l (NH4)2SO4, 0.2g/l MgSO4, 0.002g/l CaCl22H2O, 1g/l 효모추출물, 1ml 철 용액 [5g/l FeSO47H2O, 4ml HCl(37%,w/v)] 및 1ml 미량원소용액 [70mg/l ZnCl2, 100mg/l MnCl24H2O, 60mg/l H3BO3, 200mg/l CoCl24H2O, 20mg/l CuCl22H2O, 25mg/l NiCl26H2O, 35mg/l Na2MoO42H2O, 4ml HCl(37%,w/v)]을 첨가하였다. IPTG농도는 0.5mM로 하고 항생제는 테트라사이클린 10μg/ml으로 하였다.
크로마토그래피는 Agilent 1200 (refactive index detector, RID)에 Aminex HPX-87H (Bio-Rad, 300 mm x 78 mm) 컬럼을 사용하였고 이동상은 0.5mM H2SO4 (유속 0.8 ml/min)를 사용하였으며, 표준물질은 시판 3-하이드록시프로피온산(Tokyo Chemical Industry Co., LTD)을 사용하였다.
그 결과, 프로판디올 이용 단백질 유전자가 과발현된 재조합 균주에서 3-하이드록시프로피온산 생산량은 2배 이상 증가하는 것으로 확인되었다(표 2).
또한, 글리세롤 산화경로가 차단되지 않은 모균주(Cu)에 pduP유전자가 도입된 Cu/pVOTLp 균주에서도 pduP유전자가 도입되지 않은 균주보다 2-하이드록시프로피온산 생산량이 증가한 것으로 확인되었다 (표 3).
표 2
Figure PCTKR2011003798-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2011003798-appb-T000003
실시예 3. 5-L 발효조를 이용한 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTLp의 배양
5L 발효조를 이용하여 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTLp 균주의 증식 정도를 조사하고, 동시에 배양 상등액의 글리세롤의 잔존량과 3-하이드록시프로피온산, 1,3-프로판디올을 비롯한 대사산물들의 생성량을 크로마토그래피법으로 분석하였다.
배지조성은 다음과 같다:
20 g/l 글리세롤, 3.4g/l K2HPO4, 1.3g/l KH2PO4, 0.2g/l MgSO4, 0.002g/l CaCl22H2O, 1g/l 효모추출물, 1ml 철용액 [5g/l FeSO47H2O, 4ml HCl(37%,w/v)] 및 1ml 미량원소용액 [70mg/l ZnCl2, 100mg/l MnCl24H2O, 60mg/l H3BO3, 200mg/l CoCl24H2O, 20mg/l CuCl22H2O, 25mg/l NiCl26H2O, 35mg/l Na2MoO42H2O, 4ml HCl(37%,w/v)].
표 4
Figure PCTKR2011003798-appb-T000004
5L 발효조에 유효용적을 2L로하고, 최종농도가 IPTG 0.5 mM, 테트라사이클린 10μg/L으로 하였으며, 접종량 1%, 배양온도 37ㅀC, 교반속도 200 rpm, 공기 주입속도는 0.5 vvm으로 하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 배양 28 시간째에 글리세롤을 전부 소모하였으며 이때 3-하이드록시프로피온산의 생산량, 전환율 및 생산성은 각각 2.2 g/L, 0.11 (mol/mol), 0.08 g/Lh이었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
수탁번호
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC11689BP
수탁일자 : 20100426
본 발명에 따르면, 고가의 코엔자임 B12 보조인자를 첨가하지 않고도, 글라이세롤로부터 고수율로 3-하이드록시프로피온산을 제조할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.
Figure PCTKR2011003798-appb-I000001

Claims (13)

  1. 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시킨 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 프로판디올 이용 단백질 유전자는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 글리세롤 산화경로가 차단되어 있는 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  5. 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 프로판디올 이용 단백질 유전자를 삽입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산 고생산능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 프로판디올 이용 단백질 유전자는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산 고생산능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산 고생산능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  8. 다음 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  9. 크렙시엘라 뉴모니아에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 프로판디올 이용 단백질 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체.
  10. 제9항에 있어서, 프로판디올 이용 단백질 유전자는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)의 프로판디올 이용 단백질 (PduP) 유전자인 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체.
  11. 제9항에 있어서, 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTLp(KCTC 11689BP)인 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체.
  12. 크렙시엘라 뉴모니아에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)를 결실시키고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 프로판디올 이용 단백질 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체의 제조방법.
  13. 다음 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법:
    (a) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 크렙시엘라 뉴모니아 변이체를 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계.
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