WO2011086322A1 - Proteines interagissant avec gcp3 et applications - Google Patents

Proteines interagissant avec gcp3 et applications Download PDF

Info

Publication number
WO2011086322A1
WO2011086322A1 PCT/FR2011/050050 FR2011050050W WO2011086322A1 WO 2011086322 A1 WO2011086322 A1 WO 2011086322A1 FR 2011050050 W FR2011050050 W FR 2011050050W WO 2011086322 A1 WO2011086322 A1 WO 2011086322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sequence
seq
proteins
sequence seq
Prior art date
Application number
PCT/FR2011/050050
Other languages
English (en)
Inventor
Natacha Janski
Etienne Herzog
Jean-Luc Evrard
Anne-Catherine Schmit
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite De Strasbourg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs), Universite De Strasbourg filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Publication of WO2011086322A1 publication Critical patent/WO2011086322A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Definitions

  • the present invention relates to a new family of proteins called “GIPs” for "GCP3 Interacting Proteins” and their applications, particularly in the medical and agricultural fields.
  • GCP3 is a member of the microtubule nucleation complex
  • MTOCs see Figure 1
  • This complex is essential for the in vivo assembly of microtubules and the formation of the mitotic spindle during mitosis.
  • a classical cell cycle is divided into two major periods and subdivided into four phases: the interphase grouping the G1, S and G2 phases and the mitosis corresponding to the M phase.
  • the cell After the replication of the chromosomal DNA, the cell prepares to enter into mitosis.
  • a first G2 / M transition step called prophase, the chromosomal DNA, present in the nucleus as chromatin (DNA + histones), condenses into structures called chromosomes. Since the DNA was duplicated before the onset of mitosis, there are two identical copies of the DNA in the cell, split into two chromatids per chromosome.
  • Prophase is also characterized by a reorganization of the cell cytoskeleton consisting of microtubules and actin microfilaments.
  • Prometaphase begins at the moment of rupture of the nuclear envelope and corresponds to the establishment of links between the microtubules of the spindle and each of the two chromatids chromosomes.
  • the next phase, called metaphase is the collection of chromosomes on the equatorial plane of the cell. Chromatids separate during anaphase, migrate to opposite poles of the cell, allowing a balanced distribution of the previously duplicated genome (karyokinesis). Finally, during telophase, chromatids begin to decondest and DNA becomes diffuse again.
  • phase G1 the nuclear envelope is reconstituted and microtubules located at the equator contribute with actin filaments to the separation of the cytoplasm of each daughter cell (cytokinesis). Each nucleus-son is then well located in a daughter cell which is again composed of a copy of the initial genetic inheritance (phase G1).
  • Endoreduplication is a type of cell cycle that does not involve cell division.
  • endoreduplication is a cell cycle in which chromosomal DNA replicates during interphase, which is not followed by a mitotic phase. This is a repeated succession of G1 / S / G2 phases. This leads to single-nucleus cells containing many copies of genomic DNA.
  • the cell becomes polyploid, that is to say that the amount of DNA generally included in a cell, 2C for a diploid cell, goes to 4C, 8C or much more.
  • Nuclear volume and cell size are known to increase as the amount of chromosomal DNA is multiplied in the cell nucleus. Therefore, endoreduplication has the effect of increasing the size of an organism or part of an organism (for example, a tissue) and especially that of a plant or part of a plant. This property can therefore be advantageously used in the agronomic field to improve the quantity and / or quality of fruit, roots and / or seeds (enrichment pulp or reserve product).
  • the present invention therefore relates to an isolated polypeptide whose amino acid sequence comprises the consensus sequence SEQ ID No. 1:
  • the invention relates to an isolated polypeptide whose amino acid sequence comprises the consensus sequence SEQ ID No. 2 and / or the sequence SEQ ID No. 3:
  • SVIKELRKATEALKAAENMTS (SEQ ID NO: 3) and isolated nucleic acids encoding a protein or protein fragment comprising SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 3.
  • the second consensus sequence corresponds to the consensus sequence of the GIP proteins of animal origin and the sequence SEQ ID No. 3 corresponds to the human GIP.
  • an isolated nucleic acid encoding human GIP may comprise the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) and / or the sequence shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 5):
  • sequence SEQ ID No. 4 corresponds to the nucleotide sequence coding for the human GIP protein
  • sequence SEQ ID No. 5 corresponds to the complete nucleotide sequence of the messenger RNA of human GIP.
  • the invention more particularly proposes an in vitro method for inducing apoptosis in a cell, characterized in that the function of any one of the proteins (i) to (v) is inhibited:
  • a protein comprising a sequence of 60 to 100 amino acids, said sequence having at least 30% homology and at least 18% identity with the sequence SEQ ID No. 3
  • a protein interacting with the GCP3 protein of said cell.
  • the aim is the percentage of identical or similar residues between two sequences.
  • the percentage of homology will be at least 35% and more preferably at least 40% and the percentage of identity will be at least 20% and more preferably at least 25%.
  • the inhibition of the GIP protein when the inhibition of the GIP protein (s) takes place within an isolated cell, it causes apoptosis of the cell. Apoptosis is also obtained in response to the inhibition of GIP protein in a cell culture of animal origin. On the other hand, within a plant tissue, the inhibition of GIP proteins mainly leads the plant cells towards the endoreduplication pathway.
  • cells of plant origin frequently contain two GIP proteins whereas cells of animal origin comprise only a single GIP protein. Therefore, in order to induce apoptosis in an isolated plant cell, the two GIP proteins present in the cell will be preferentially inhibited. However, depending on the conditions of inhibition of the two GIP proteins, it may result in a residual expression of at least one of the proteins then having the effect of inducing endoreduplication rather than apoptosis.
  • the inhibition of the function of the protein can be obtained by any method known to those skilled in the art.
  • the inhibition may in particular result from a mechanism preventing the protein from functioning or from a mechanism blocking the synthesis of this protein.
  • a mechanism preventing the protein from functioning mention will be made of the mechanisms in which the function can be blocked by an antigen-antibody or protein-inhibitor type interaction.
  • the first case it involves inducing the expression of a second protein having the specific recognition characteristics of epitopes of the protein chosen from the proteins (i) to (v).
  • the second case it involves inducing an interaction of the protein selected from the proteins (i) to (v) with an affine molecule (peptide or chemical) blocking its natural interaction with GCP3 or other proteins of the signaling pathways, wherein said protein selected from the proteins (i) to (v) acts.
  • Aurora kinases are enzymes involved in cell division: they play a regulatory role in the maturation of centrosomes, the separation and condensation of chromosomes, the control point of the mitotic spindle and cytokinesis. In the latter case, it is a question of inducing the expression of a protein or part of a protein chosen from proteins (i) to (v) carrying a mutation on the phosphorylation site rendering the latter inoperative.
  • the mechanisms blocking the synthesis of the protein chosen from the proteins (i) to (v) more particularly include any genetic modification aimed at inhibiting the expression of the gene coding for said protein, such as a mutation of said gene.
  • any mechanism is sought to prevent the gene from expressing itself.
  • the invention therefore also relates to isolated interfering RNA (siRNA) molecules comprising at least one portion which hybridises with one of the nucleic acids described above.
  • the SiRNAs will comprise an RNA strand chosen from the following sequences:
  • AAAGCUUCUGGGUUAAUUC (SEQ ID NO: 1 1).
  • the invention encompasses an isolated interfering RNA (siRNA) molecule comprising at least one portion that hybridizes with one of the nucleic acids described above for use as a medicament, particularly for cancer treatment such as than cancer of the cervix, breast, colon or brain.
  • the interfering RNA molecule will be inserted into a vector allowing its delivery or its expression and will be in the form of a pharmaceutical composition, with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention relates more particularly to plant GIP proteins and their applications to a method for increasing the size of a plant or part of a plant by inhibiting at least one GIP protein whose inactivation results in a endoreduplication of plant cells.
  • the invention also relates to a genetically modified plant or plant part and the corresponding plant production method.
  • the plant GIP proteins have the consensus sequence SEQ ID No. 12:
  • the invention relates to the isolated polypeptides, comprising the consensus sequence SEQ ID No. 13:
  • SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 respectively correspond to the consensus sequences of Poet and Solanaceae GIPs. These two families of plants are of particular interest in the agricultural field. Indeed, plants such as wheat, barley, corn, rye and sugar cane belong to the family of poaceae while tomato, aubergine, potato or pepper belong to the Solanaceae family.
  • the invention relates more particularly to a genetically modified plant characterized in that the function of any one of the proteins (i) to (viii) is inhibited:
  • a protein comprising a sequence of 60 to 100 amino acids, said sequence having at least 50% homology and at least 40% identity with the sequence SEQ ID No. 15
  • a protein comprising a sequence of 60 to 100 amino acids, said sequence having at least 50% homology and at least 40% identity with the sequence SEQ ID No. 16
  • sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 16 respectively correspond to the amino acid sequences of the proteins yAiGIPI and> AfGIP2 which interact with the protein> 4fGCP3, one of the components of the MTOCs of Arabidopsis thaliana.
  • the identification of these yAiGIPI and> AfGIP2 proteins of Arabidopsis thaliana is more fully described in Example 1 below, and the sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 16 are given in FIGS. 3B and 4B respectively.
  • the aim is the percentage of identical or similar residues between two sequences.
  • percent identity we aim for the percentage of identical residues between two sequences.
  • the percentage of homology will be at least 65% and more preferably at least 70% and the percentage of identity will be at least 50% and more preferably at least 60%.
  • These preferred percentages relate more particularly to dicotyledonous plants. Indeed, Arabidopsis thaliana being a dicotyledonous plant, stronger homology and identity are recorded in this type of plants.
  • certain plants, and more particularly terrestrial plants may comprise at least two GIPs proteins, homologous to yAiGIPI and / or> AfGIP2.
  • the inventors have demonstrated that, surprisingly, if the inhibition of a single GIP protein had a very relative influence on the endoreduplication and consequently on the size of these plants or the part of these plants in which the endocycle replaces the normal cell cycle, the combined inhibition of at least two GIPs detected in these plants significantly favored endoreduplication. This resulted in a very pronounced phenotype in which a marked increase in the size of the cells of the plant was evidenced, for example a thickening of the root (see for example Figures 14 C and D).
  • the invention relates more particularly to a genetically modified plant, preferably a terrestrial plant, in which the function of two proteins selected from the proteins (i) to (viii) is inhibited, and more particularly one of these functions. being totally inhibited ("knock out”) and the other being partially inhibited (“knock down”).
  • the partial inhibition of the function of the protein is regulated so as to selectively inhibit an organ of the plant and / or a stage of development thereof.
  • transgenital plant is defined as opposed to aquatic plants (for example, an algae).
  • the inhibition of the function of the protein can be obtained by any method known to those skilled in the art.
  • the inhibition may in particular result from a mechanism preventing the protein from functioning or from a mechanism blocking the synthesis of this protein. This inhibition will be targeted preferentially in the part of plant considered of interest.
  • a mechanism preventing the protein from functioning mention will be made of the mechanisms in which the function can be blocked by an antigen-antibody or protein-inhibitor type interaction.
  • the first case it involves inducing the expression of a second protein having the specific recognition characteristics of epitopes of the protein selected from the proteins (i) to (viii).
  • the second case it involves inducing an interaction of the protein selected from the proteins (i) to (viii) with an affine molecule (peptide or chemical) blocking its natural interactions with GCP3 or other protein pathways, in wherein said protein selected from the proteins (i) to (viii) acts.
  • Another mechanism to block the protein is to prevent its phosphorylation by an Aurora kinase.
  • transgenes In the latter case, it involves inducing the expression of a protein or part of a protein selected from the proteins (i) to (viii) carrying a mutation on the phosphorylation site rendering the latter inoperative.
  • the expression of the transgenes will advantageously be targeted in particular cells or tissues by using a suitable promoter placed upstream of the coding sequence.
  • the mechanisms blocking the synthesis of the protein chosen from proteins (i) to (viii) more particularly include any genetic modification aimed at inhibiting the expression of the gene coding for said protein, such as a mutation of said gene.
  • the plant will be modified by inhibition of the expression of at least two genes coding for at least two proteins chosen from the proteins (i) to (viii).
  • any mechanism is sought to prevent the gene from expressing itself.
  • the mutation of the endogenous gene coding for the protein chosen from the proteins (i) to (viii) by insertion of a sequence (transfer DNA, transposon) or by sequence deletion (point, partial or total) makes it possible to produce the expression of truncated or inactive proteins or, in the extreme case, no protein expression.
  • This last case occurs when the coding sequence is completely deleted, or the mutation generates a stop codon 5 'of the coding phase (N-terminal of the protein) or else that the mutation has induced a shift in the reading phase of the the DNA resulting in an amino acid sequence not in accordance with the native sequence of the active protein.
  • Example 7 by crossing two simple mutants of insertion of T-DNA concerning respectively the genes At4g09550 (SEQ ID No. 17) and At1 g73790 (SEQ ID No. 18) of Arabidopsis thaliana, a double descendant insertion mutant was created.
  • the invention also covers a plant part genetically modified according to the invention and more particularly an organ of the plant such as the fruit, petal, flower, leaf, seed, root, stem, plant tissue, a cell or any other part of a plant.
  • the genetically modified plants according to the invention are advantageously crucifers such as cabbage, rapeseed, mustard, turnip, arugula, wallflowers or radish.
  • genes homologous to> AfGIP1 and> AfGIP2 such as cereals, fruit or decorative trees, fruit, vegetable or decorative plants and in particular, rice, spelled, rapeseed, pepper, papaya, orange, coffee, melon, strawberry, gerbera, soya, licorice, cotton tree, sunflower, hops, lettuce, lotus, apple, cassava, alfalfa, pines, peas, aspen, apricot, sugar cane, sesame, eggplant, potatoes, sorghum , corn, wheat, vine, poplar or tobacco.
  • the genetically modified plants according to the invention are produced using a method comprising the inhibition of the function of any of the proteins (i) to (viii).
  • this production method will involve the inhibition of the function of two proteins among the proteins (i) to (viii), one of these functions being totally inhibited and the other being partially inhibited.
  • This inhibition may for example be effected by inhibiting the expression of the gene coding for one of the proteins (i) to (viii) or by deleting the gene coding for the proteins (i) to (viii).
  • the partial inhibition of the function of the protein is regulated so as to selectively target an organ of the plant and / or a stage of development thereof.
  • the inhibition is regulated using a siRNA directed against the protein to partially inhibit or a peptide or protein part inhibiting the protein to partially inhibit, the expression of that siRNA, peptide or part of protein being dependent on an organ-specific promoter ("dependent organ promoter") such as the fruit and / or a stage of plant development (“temporally regulated promoter”), such as ripening.
  • dependent organ promoter such as the fruit
  • temporary organ promoter a stage of plant development
  • targeted endoreduplication is induced on the fruit.
  • the invention finally relates to a method for increasing the size of a plant or part of the plant in which the plant or part of the plant is modified so as to inhibit the function of any of the proteins (i ) to (viii).
  • the function of two proteins among the proteins (i) to (viii) is inhibited, one of these functions being completely inhibited and the other being partially inhibited, the partial inhibition of the function of the protein being able to be partially inhibited.
  • Figure 1 shows the different GCPs ("Gamma-tubulin Complex Proteins”) and in particular GCP3, their involvement in microtubule nucleation complexes (Microtubule Organizing Centers or MTOCs) and their counterparts in different species, identified by name or their molecular weight in kilo Daltons.
  • GCPs Gamma-tubulin Complex Proteins
  • MTOCs Microtubule Organizing Centers
  • Figure 2 shows the complete nucleotide sequence of human GIP, the coding part being indicated in upper case.
  • Figures 3 and 4 depict the genomic DNA sequences ⁇ GIP1 ( Figure 3A) and the corresponding protein ( Figure 3B) as well as those of AGIP2 ( Figures 4A and 4B).
  • the exons, the introns and the coding sequence are indicated by the two initiation and termination codons (ATG and TGA / TAA).
  • FIGS. 3B and 4B show the predictions of phosphorylation sites (S) and that which is conserved in all GIP sequences of eukaryotes (H).
  • FIG. 5 shows the comparison of the protein sequences of AGIPI and
  • Figure 6 shows the AT4G09550 gene structures of yAiGIPI (Fig.
  • Figure 7 depicts the promoter region d7 IGIP1.
  • Figure 8 is an evolutionary tree of GIPs.
  • Figure 9 compares 1 amino acid sequences corresponding to complete GIP proteins identified in 72 different species of plants.
  • Figure 10 shows the results of an in vitro test (GST pull-down) between GCP 1, 2 and 3 and GIP1 and 2 of A thaliana. Assays were performed between GST-fusion proteins (GST-gamma-tubulin, GST-AGCP2, GST-AGCP3, GST-AIGIP1, GST-AIGII) and the two radiolabeled proteins yA1GIP1 and AIG2. GST alone was used as a negative control.
  • GST-fusion proteins GST-gamma-tubulin, GST-AGCP2, GST-AGCP3, GST-AIGIP1, GST-AIGII
  • Figure 11 presents the results of an in vivo interaction test in yeast two-hybrid system.
  • Figure 12 shows the comparative expression rates of A thaliana GIPs.
  • Figure 13 shows the antibody specificity results tested by Immunoblotting.
  • Figure 14 illustrates the localization of endogenous GIPs in BY-2 (AC) and Arabidopsis (D) tobacco cells by immunostaining division.
  • Figure 15 illustrates immunostaining of xenopus cells in culture with rabbit polyclonal antibodies (@: antibodies) anti-> AfGIP1 or anti-HsGIP ("homo sapiens GIP").
  • Figure 16 illustrates immunostaining of xenopus cells in culture with anti-HsGIP monoclonal antibodies.
  • Figure 17 shows an SDS-Page gel illustrating the results of the phosphorylation of the protein yAiGIPI by the kinase> AfAurora1.
  • Figure 18 shows illustrations of the phenotypes obtained with these double mutants gip1 gip2.
  • FIG. 19 shows the sequences of the simple mutants gip1 and gip2 (with the insertion sites of the T-DNAs) and the results of an RT-PCR analysis of the expression of the GIP1 and GIP2 genes in the double mutant plants resulting from of the crossing of simple mutants.
  • Figure 20 illustrates the developmental phases (at 7, 21 and 45 days after germination, "JAG") obtained with the double mutant plants.
  • Figure 21 illustrates propidium iodide labeling of the meristem of dual mutant plants.
  • Figure 22 shows a two-to-two comparison of HsGIP expression levels in healthy (light bar) and cancer (dark bar) tissues.
  • Figure 23 illustrates the apoptosis of HeLa and HEK 293 cells following GIP suppression by introduction of siRNA into these cells.
  • the GIP1 protein was identified by yeast double-hybrid screening of an Arabidopsis thaliana cDNA library (3-week-old seedlings, Clontech®) using as bait the> 4fGCP3 protein, an essential component of the nucleation complex of microtubules.
  • At4g09550 SEQ ID No. 17
  • sequence of which is indicated in FIG. 17
  • Figure 5A shows the comparison of the protein sequences d7 ⁇ fGIP1 and> AfG1 P2.
  • the consensual motifs (X) and the phosphorylation potential site (S) conserved in eukaryotes are indicated.
  • the pseudo leucine-zipper and "D box" are indicated by the arrows.
  • the homologous gene At1 g73790 thus shows a strong homology with GI P1 and was thus named GI P2.
  • the dsGCP1 or ⁇ -tubulin, AtGCP2, AtGCP3, and AtGI P'I and AtG ⁇ P2 cDNAs were cloned into the pGEX-2TK vector and the E. coli Rosetta strain bacteria were selected after transformation. Expression of the fusion proteins or GST alone was made in this bacterial strain. The soluble proteins of the extract were fixed on Sepharose 4B glutathione beads. On the other hand, yAiGI PI and 3 ⁇ 4iGI P2 marked [35S] methionine were produced by in vitro translation into a rabbit reticulocyte lysate. GST pull-down tests have been conducted. The results were that only> 4fCGP3 interacts with yAiGIPI (Janski et al., 1997) and> AfGIP2, confirming previously obtained results in a dual hybrid system.
  • Figure 10A shows a Coomassie-stained SDS-PAGE gel of the glutathione-sepharose bead bound fraction.
  • the expected size fusion proteins are the majority bands, indicated by the clear arrowheads.
  • Figure 10B shows an autoradiograph of the gel, where the radiolabelled proteins ( * ) of the bound fraction are revealed. No labeling was found in the negative control tracks, whereas in the pull-down test, yAiGIPI and> AfGIP2 co-precipitated with GST-> AfGCP3. All other tracks show no interaction.
  • FIG. 11 It has been demonstrated (FIG. 11) that ⁇ GIP2 and ⁇ GIPI interact precisely with the first 200 amino acids of the N-terminal region ⁇ GCP3.
  • GIP1-GIP1 and GIP1-GIP2 an additional positive interaction has also been shown between the GIPs themselves (GIP1-GIP1 and GIP1-GIP2). Indeed, in FIG. 11, it can be seen that not only> AfGIP1 and> AfGIP2 interact with> AfGCP3 and between them but also that the GIPs interact with the N-terminal domain of GCP3 (r1). This suggests that these proteins can form oligomers in vivo.
  • GIPs are much more clearly expressed in young Arabidopsis (leaves) or meristematic tissues (root apices and young flowers) than in differentiated tissues.
  • FIG. 14 the following are presented: in the first line (A) / column (B, D), the anti-GIP labeling, in the second column (B, D) that of the microtubules, in the second line (A) / third column ( B, D) DNA.
  • GIP enters the nucleus in G2 then is exported in 2 polar croissants. Diffuse staining is also visible in the bipolar spindle, which is more intense in anaphase-telophase kinetochorian fibers.
  • An intensity measurement of the fluorescent markers (LSM510 software image analysis) in a telophase cell shows that GIP is located at the polar ends of the two daughter cells.
  • the interphase BY-2 cells reveal an increase in the density of nuclear pole marking at the end of the G2 phase (nuclear croissants) corresponding to the initiation sites of the mitotic spindle formation. In mitosis, the marking of the polar regions of the spindle remains strong. The intensity of the labeling is not increased at the level of the phragmoplast relative to the background noise. Less intense labeling of the nucleoplasm is also observed.
  • GIP GIP
  • Example 2 homologs of fGIPI and d7 ⁇ .GIP2 in plants Bioinformatic analyzes were conducted and the search for homologues was done among the plants using primarily the BLAST alignment tool. The results of this research are presented in Table 1 below. It gives the accession numbers of the sequences listed in NCBI, as well as the denomination used for the construction of the phylogenetic tree ( Figure 8). The degrees of homology and identity between yAiGIPI and all other sequences are shown in columns 5 and 6 of this table. Table 1: Comparison of plant GIPs
  • Lactuca virosa Rye lettuce i gb
  • sequences are generally short and highly conserved. In addition, they correspond to proteins of unknown function.
  • the sequences have between 64 and 98 amino acids and exhibit a high percentage of identity and homology.
  • the percentage calculation method was generated by compared to yAiGIPI (ClustalW with Gonnet matrix against yAiGIPI and> AfGIP2 simultaneously).
  • Example 2 the accession numbers of the sequences listed in NCBI and the denomination used for the construction of the phylogenetic tree are shown in Table 2 (FIG. 8). The degrees of homology and identity between HsGIP and all other sequences are shown in columns 5 and 6 of this table.
  • the 18 sequences are generally short and very conserved. They also correspond to proteins of unknown function.
  • the sequences have between 62 and 18 amino acids and exhibit a high percentage of identity and homology.
  • Example 4 Immunolabelling of Xenopus Cells in Culture with Anti- ⁇ 4 GIP1 or Anti-HsGIP Rabbit Polyclonal Antibodies
  • the recombinant HsGIP and ⁇ 1GIPI proteins cloned into the pET102D vector were produced in E. coli and purified on nickel resin. The production of antibodies has been entrusted to the IGBMC pet shop (Strasbourg). IgG fractions were used on methanol fixed cultured xenopus cells for immunostaining. Primary antibodies were revealed by fluorescent anti-rabbit secondary antibodies and observations made by confocal microscopy.
  • the structures revealed are the nuclei with the anti-> AfGIP1 (@> 4fGIP - Figure 15a) and the centrosomes / fusions with the anti-HsGIP (@HsGIP - Figure 15b) or the centrosomes and the midbody (Figure 15c). Simultaneous labeling of DNA (DAPI) and microtubules (@tubuline) confirms these locations. The superposition of the 3 channels is presented in the photographs indicated by "fusion".
  • the coding phases of the yAiGIPI and HsGIP (homo sapiens GIP) proteins were amplified by PCR with the Phusion® Master Mix from New England Biolabs and cloned into the pET102D-TOPO prokaryotic expression vector (Invitrogen TM).
  • the expression of the different proteins was carried out in E.coli BL21 cells (DES3) after induction with IPTG (Isopropyl ⁇ -Dl-thiogalactopyranoside). Purification has been performed on Ni Sepharose 6 Fast Flow resin (GE Healthcare).
  • the recombinant proteins thus obtained were used by AbD Serotec for the screening of an F (ab ') 2 library of human HuCAL® GOLD antibodies.
  • the seven best clones selected were requalified by Elisa test and purified in the form of 250 ⁇ g of F (ab ') 2 dimer merged with bacterial alkaline phosphatase and bearing the V5 and Strepl1 epitopes.
  • Xenopus cells (the human and xenopic GIP sequences being almost identical) in culture were fixed with methanol and used for immunolocalization tests with the selected antibodies at a concentration of 0.001 g / L.
  • Fluorescent secondary antibodies F (ab ') 2 human or anti-V5 were used to reveal the primary antibodies by confocal microscopy. The following cell structures were revealed more or less intensively according to the primary antibody used: nuclei, fusorial poles, centrosomes, mitotic spindle and midbodies (see Figure 16).
  • Figure 16a illustrates immunostaining with monoclonal antibody # 1 (HsGIP # 1) which marks the nuclei and poles of mitotic spindles. Midbody is also revealed with this antibody ( Figure 16b).
  • the recombinant yAiGIPI and AfAurora1 proteins cloned into the pET102D vector were produced in E. coli and purified on nickel resin.
  • Phosphorylation reactions are carried out with at least 400 ng of each protein in reaction volumes of 20 ⁇ l in the presence of 10 ⁇ of 32P ⁇ - ⁇ for 30 minutes at room temperature.
  • the reaction buffer has the following composition: 10 mM Tris HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 .
  • the proteins are then separated by SDS-PAGE. The gel is fixed / stained in ethanol / acetic acid / coomassie blue solution and then dried and autoradiographed to reveal the radiolabelled (phosphorylated) proteins. A kination of the protein yAiGIPI is thus revealed (FIG.
  • FIG. 17 at the bottom of the gel on the right) indicating that the GIP proteins are substrates, and their derivatives of the possible inhibitors, for the Aurora kinases (see FIG. 17 -> AfAurora: control with kinase alone, PM marker: reference molecular weight marker,> 4fAurora /> 4fGIP1: kinase-mixed assay and GIP).
  • the left half of the figure represents the SDS-PAGE gel stained blue Coomassie.
  • the right half corresponds to the autoradiography of this same gel to reveal the radiolabelled proteins.
  • Example 7 T-DNA insertion mutants and endoreduplication
  • a line of Arabidopsis thaliana from the GABI-Kat collection http://www.GABI-Kat.de) (Bielefeld, Germany) and corresponding to the mutant 213D01-014134 has a T-DNA inserted into the upstream intron of the coding sequence of the GIP1 gene.
  • the gip2 mutant comes from INRA (Versailles, France) (364E06 or 615G1 1) and the insertion is located in part 5'UTR of the exon. Homozygous plants such as gip2 gip2 do not have a very significant phenotype during development compared to wild plants.
  • Figure 19 shows the results of RT-PCR analysis of GIP1 and GIP2 gene expression in double mutant plants:
  • Figure 20 illustrates the development of double mutant plants (C, D) compared to control plants (A, B) at 7, 21 and 45 JAG (days after germination).
  • Figure 20E shows the floral stem of the mutant (right) compared to the control (left).
  • FIG. 20J The plant flowers are illustrated in F: control, G: heterozygous GIP1 + I-gip2-1 and H, I: homozygotes gip1 gip2.
  • FIG 20J the floral organs are presented after clarification of Hoyer.
  • Figure 20K is presented a diagram of ploidy measurements of flower buds.
  • Figures L-P show the detail of a stamen with stomata, rare microspores and lignified cells (L-O) and illustrates the early termination of egg development (P).
  • microtubule cytoskeleton of the double mutants gip1 gip2 is modified compared to that of control seedlings.
  • the resulting endoreduplication cells which are much larger than average in size, have intertwined cortical microtubules, indicating a loss of growth polarity.
  • the division patterns observed show massive bipolar spindles often oblique, leading to a loss of organization of cells in regular rows.
  • Plantlets taken 8 days after germination were stained for 5 minutes in a 10 ⁇ g / ml solution of propidium iodide before being rinsed with water and observed by confocal microscopy.
  • death of quiescent center cells and / or initial cells in the roots of these young gip1 gip2 plants can be observed. Since these cells are the stem cells of the root, it seems that a more or less early death according to the residual level of GIP1 will lead to the phenotypes observed, of the complete lethality, in the case of a non-expression of GIP1, to possible development until flowering (except for sporogenesis) in the case of sufficient residual expression of GIP1.
  • the fact that the whole plant is affected by an insufficient level of expression of GIP1 suggests that the expression of this gene is absolutely necessary for the survival of the quiescent and initial cells in all the meristems of the plant.
  • EXAMPLE 8 Overexpression of the GIP Protein in Cancer Cells
  • the IST (In Silico Transcriptomics - www.genesapiens.org) database was used to determine the levels of expression of HsGIP (ENSG00000204899) in the collections of this database. It groups together 3,670 specimens specifically concerning the expression of HsGIP in both healthy tissue and cancerous tissue. Extraction of these data by cell type makes it possible to correlate an abnormally high level of HsGIP expression in many cancers (see FIG. 22).
  • HsGIP expression levels in healthy (light bar) and cancer (dark bar) tissues are compared in pairs. In all cases, the expression levels of HsGIP are higher in the cancerous tissues.
  • Example 9 Induction of Apoptosis of a Cell by Inhibition of the GIP Protein Three siRNA double strands were designed and then ordered from Sigma. The sense sequences are respectively:
  • HeLa or HEK 293 cells are cultured in 1 ml of Dulbecco's modified medium (DMEM-Invitrogen TM) supplemented with 10% fetal calf serum (FBS-Invitrogen TM) for 24 hours at 37.degree. ° C to obtain a confluence of 30 to 50%.
  • DMEM-Invitrogen TM Dulbecco's modified medium
  • FBS-Invitrogen TM 10% fetal calf serum
  • the cells are then transfected with 2 ⁇ l of Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen TM) and 25 or 100 nM final of siRNA according to the protocol of the supplier.
  • the culture medium is changed 24 hours after transfection with fresh medium (DMEM, 10% FBS) and the cells are then left for an additional 24 hours in culture.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle famille de protéines appelées « GIPs » pour « GCP3 |nteracting Pjoteins » et leurs applications dans les domaines médical et agricole. Elle vise en particulier différentes séquences consensus de GIP, des méthodes d'induction de l'apoptose chez une cellule et d'endoréduplication chez une plante et leurs applications au traitement du cancer et à la réalisation de plantes transgéniques.

Description

Protéines interagissant avec GCP3 et applications
La présente invention concerne une nouvelle famille de protéines appelées « GIPs » pour « GCP3 Interacting Proteins » et leurs applications, en particulier dans les domaines médical et agricole.
La protéine GCP3 est un membre du complexe de nucléation des microtubules
(MTOCs, voir figure 1 ). Ce complexe est essentiel à l'assemblage in vivo des microtubules et à la formation du fuseau mitotique lors de la mitose.
Chez les eucaryotes, un cycle cellulaire classique est divisé en deux grandes périodes et subdivisé en quatre phases : l'interphase regroupant les phases G1 , S et G2 et la mitose correspondant à la phase M.
Durant l'interphase, l'ADN chromosomique contenu dans le noyau subit une réplication (phase S).
Après la réplication de l'ADN chromosomique, la cellule se prépare à entrer en mitose. Dans une première étape de transition G2/M, appelée prophase, l'ADN chromosomique, présent dans le noyau sous forme de chromatine (ADN + histones), se condense en structures appelées chromosomes. L'ADN ayant été dupliqué avant le début de la mitose, il y a deux copies identiques de l'ADN dans la cellule, réparties dans deux chromatides par chromosome. La prophase se caractérise également par une réorganisation du cytosquelette de la cellule constitué de microtubules et de microfilaments d'actine. Cette réorganisation se réalise selon des mécanismes variables en fonction des espèces concernées (champignons / plantes / animaux), mais aboutissant tous à la formation d'un fuseau mitotique bipolaire. La prométaphase commence au moment de la rupture de l'enveloppe nucléaire et correspond à la mise en place de liaisons entre les microtubules du fuseau et chacune des deux chromatides des chromosomes. La phase suivante, appelée métaphase, correspond au rassemblement des chromosomes sur le plan équatorial de la cellule. Les chromatides se séparent durant l'anaphase, migrent vers les pôles opposés de la cellule, ce qui permet une répartition équilibrée du génome précédemment dupliqué (caryocinèse). Enfin, lors de la télophase, les chromatides commencent à se décondenser et l'ADN redevient diffus. Dans le même temps, l'enveloppe nucléaire se reconstitue et des microtubules localisés à l'équateur contribuent avec des filaments d'actine à la séparation des cytoplasmes de chaque cellule fille (cytocinèse). Chaque noyau-fils est alors bien localisé dans une cellule fille qui est à nouveau composé d'un exemplaire du patrimoine génétique initial (phase G1 ).
Le travail des inventeurs a permis de mettre en évidence que les protéines GIPs, conservées dans l'ensemble des eucaryotes, sont impliquées dans les mécanismes régulant le cycle cellulaire. En effet, l'inhibition de la fonction d'une protéine GIP produit une perturbation du phénomène de mitose. Lorsque cette inhibition a lieu au sein d'une cellule isolée, elle provoque la formation d'un fuseau mitotique monopolaire et par la suite l'apoptose de la cellule.
Lorsque cette inhibition a lieu au sein d'une culture de cellules d'origine animale, elle provoque une apoptose desdites cellules. Cette propriété peut avantageusement être mise à profit dans des thérapies anti-cancéreuses.
En revanche, lorsque l'inhibition a lieu au sein d'une plante, elle provoque une endoréduplication au sein de cellules de cette plante et donc l'accroissement de la taille desdites cellules.
L'endoréduplication est un type de cycle cellulaire ne comportant pas de division cellulaire.
Contrairement au cycle cellulaire classique, l'endoréduplication est un cycle cellulaire dans lequel l'ADN chromosomique se réplique durant l'interphase qui n'est pas suivie d'une phase mitotique. Il s'agit ainsi d'une succession répétée de phases G1/S/G2. Ce phénomène conduit à des cellules à noyau unique contenant beaucoup de copies de l'ADN génomique.
Si le phénomène d'endoréduplication se répète, la cellule devient polyploïde, c'est- à-dire que la quantité d'ADN généralement comprise dans une cellule, soit 2C pour une cellule diploïde, passe à 4C, 8C ou largement plus.
Si l'on constate des phénomènes d'endoréduplication chez certains insectes ou mammifères, ce phénomène reste cependant caractéristique des organismes végétaux.
Il est connu que le volume nucléaire et la taille d'une cellule augmentent lorsque la quantité d'ADN chromosomique est multipliée dans le noyau cellulaire. Par conséquent, l'endoréduplication a pour effet d'accroître la taille d'un organisme ou d'une partie d'un organisme (par exemple, un tissu) et tout particulièrement celle d'une plante ou d'une partie de plante. Cette propriété peut donc être avantageusement mise à profit dans le domaine agronomique de façon à améliorer la quantité et/ou la qualité de fruits, de racines et/ou de graines (enrichissement en pulpe ou en produit de réserve).
La présente invention est donc relative à un polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°1 :
[Ml LVT]-X-X-X-[LV]-X-X-X-[LIVF]-[DTS]-X-X-X-[LI FVM]-X-X-[CLIAVF]-[I LVME]-X- [LMFVA]-X-X-X-G-X-X-[PGA]-X-X-[LIV]-[VIAS]-X-[VILAW]-[VIFLG] (SEQ ID N°1 ) Cette séquence correspond à la séquence consensus des protéines GIPs sur l'ensemble des eucaryotes et est spécifique des protéines GIPs. L'invention vise également l'acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°1. Une recherche d'homologues faite par BLAST parmi un grand nombre d'espèces d'eucaryotes a permis d'identifier au moins une protéine pour chaque organisme, homologue à la protéine yAiGIPI et/ou >AfGIP2. Ces résultats sont présentés dans les tableaux 1 et 2 des exemples 2 et 3 ci-après.
Selon un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°2 et/ou la séquence SEQ ID N°3:
[LVIA]-X-X-[ILVMT]-[SAN]-X-[ILYVM]-[LV]-X-X-[GDNQ]-[LIV]-[DTS]-X-X-X-[LIFVM]-X-X- [CLIA]-[VLI]-X-[LM]-X-X-X-G-[VIA]-X-[PG]-X-X-[LI]-[ASV]-X-[VILA]-[IVFL]-X-X-[LIMVA]
(SEQ ID N°2)
MASSSGAGAAAAAAAANLNAVRETMDVLLEISRILNTGLDMETLSICVRLCEQGINPEALS
SVIKELRKATEALKAAENMTS (SEQ ID N°3) et les acides nucléiques isolés codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant les séquences SEQ ID N°2 et/ou SEQ ID N°3.
La seconde séquence consensus correspond à la séquence consensus des protéines GIP d'origine animale et la séquence SEQ ID N°3 correspond à la GIP humaine.
En particulier, un acide nucléique isolé codant pour la GIP humaine peut comprendre la séquence de nucléotides suivante (SEQ ID N°4) et/ou la séquence présentée en figure 2 (SEQ ID N°5) :
ATGGCGAGTAGCAGCGGTGCTGGGGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCGGCGAATC TGAATGCGGTGCGGGAGACCATGGACGTTCTGCTTGAGATTTCAAGAATTTTGAA TACTGGCTTAGATATGGAAACTCTGTCTATTTGTGTACGGCTTTGTGAACAAGGAA TTAACCCAGAAGCTTTATCATCGGTTATTAAGGAGCTTCGCAAGGCTACTGAAGC ACTGAAGGCTGCTGAAAATATGACAAGCTGA (SEQ ID N°4)
La séquence SEQ ID N°4 correspond à la séquence nucléotidique codante pour la protéine GIP humaine, tandis que la séquence SEQ ID N°5 correspond à la séquence nucléotidique complète de l'ARN messager de la GIP humaine.
L'invention propose plus particulièrement une méthode in vitro d'induction de l'apoptose chez une cellule, caractérisée en ce que en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est inhibée :
(i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1
(ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2
(iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°3
(iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 30% d'homologie et au moins 18% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 (v) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite cellule.
Par pourcentage d'homologie, on vise le pourcentage de résidus identiques ou similaires entre deux séquences.
Par pourcentage d'identité, on vise le pourcentage de résidus identiques entre deux séquences.
De préférence, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 35 % et plus préférentiellement d'au moins 40 % et le pourcentage d'identité sera d'au moins 20 % et plus préférentiellement d'au moins 25 %.
Comme indiqué ci-avant, lorsque l'inhibition de la ou les protéine(s) GIP a lieu au sein d'une cellule isolée, elle provoque l'apoptose de la cellule. L'apoptose est également obtenue en réponse à l'inhibition de la protéine GIP au sein d'une culture de cellules d'origine animale. En revanche, au sein d'un tissu végétal, l'inhibition des protéines GIP conduit majoritairement les cellules végétales vers la voie de l'endoréduplication.
On notera que les cellules d'origine végétale comportent fréquemment deux protéines GIP tandis que les cellules d'origine animale ne comprennent qu'une unique protéine GIP. Par conséquent, afin d'induire l'apoptose chez une cellule végétale isolée, on inhibera préférentiellement les deux protéines GIP, présentes dans la cellule. Toutefois, selon les conditions d'inhibition des deux protéines GIP, il peut en résulter une expression résiduelle d'au moins une des protéines ayant alors pour effet d'induire l'endoréduplication plutôt que l'apoptose.
L'inhibition de la fonction de la protéine peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. L'inhibition peut en particulier résulter d'un mécanisme empêchant la protéine de fonctionner ou d'un mécanisme bloquant la synthèse de cette protéine.
A titre d'exemple de mécanisme empêchant la protéine de fonctionner, on citera les mécanismes dans lesquels la fonction peut être bloquée par une interaction de type antigène-anticorps ou protéine-inhibiteur. Dans le premier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une seconde protéine possédant les caractéristiques de reconnaissance spécifiques d'épitopes de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v). Dans le deuxième cas, il s'agit d'induire une interaction de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v) avec une molécule affine (peptidique ou chimique) bloquant ses capacités naturelles d'interaction avec GCP3 ou d'autres protéines des voies signalétiques, dans lesquelles ladite protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) agit. Un autre mécanisme permettant de bloquer la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est d'empêcher la phosphorylation de la protéine par une kinase Aurora. Les kinases Aurora sont des enzymes impliquées dans la division cellulaire : elles ont un rôle de régulation dans la maturation des centrosomes, la séparation et la condensation des chromosomes, le point de contrôle du fuseau mitotique et la cytokinèse. Dans ce dernier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une protéine ou partie de protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) portant une mutation sur le site de phosphorylation rendant cette dernière inopérante.
Les mécanismes bloquant la synthèse de la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) comprennent plus particulièrement toute modification génétique visant l'inhibition de l'expression du gène codant pour ladite protéine, telle qu'une mutation dudit gène.
Par inhibition de l'expression d'un gène, on vise tout mécanisme permettant d'empêcher le gène de s'exprimer.
A titre d'exemple, les méthodes suivantes peuvent être employées:
a) l'induction de l'expression d'une séquence complémentaire (siRNA) exogène à un fragment d'ARN messager transcrit endogène du gène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) conduit à l'hybridation des deux séquences. Ceci bloque la traduction des ARNs messagers dudit gène en protéine par mise en place d'une signalisation de dégradation enzymatique desdits ARNs.
b) la mutation du gène endogène codant pour la protéine choisie parmi les protéines
(i) à (v) par insertion d'une séquence (ADN de transfert; transposon) ou par délétion de séquence (ponctuelle, partielle ou totale) permet de produire l'expression de protéines tronquées ou inactives ou dans le cas extrême, aucune expression de protéine. Ce dernier cas arrive lorsque la séquence codante est totalement délétée, ou que la mutation génère un codon stop en 5' de la phase codante (N-terminal de la protéine) ou encore que la mutation ait induit un décallage de la phase de lecture de l'ADN aboutissant à une séquence d'amino-acides non conforme à la séquence native de la protéine active.
L'invention vise donc également les molécules d'ARN interférant (siRNA) isolées comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un des acides nucléiques décrits ci- avant. Avantageusement, les SiRNA comprendront un brin d'ARN choisi parmi les séquences suivantes :
GAACGUGGCUCCAAAUUCA (SEQ ID N°6),
UGAAUUUGGAGCCACGUUC (SEQ ID N°7),
GGACGUUCUGCUUGAGAUU (SEQ ID N°8),
- AAUCUCAAGCAGAACGUCC (SEQ ID N°9),
GAAU U AACCCAGAAGCU U U (SEQ ID N°10), et
AAAGCUUCUGGGUUAAUUC (SEQ ID N°1 1 ).
L'induction de l'apoptose au sein d'une cellule s'avère d'un intérêt particulier pour traiter certaines maladies dont le cancer. En outre, comme cela indiqué dans l'exemple 8, il a été démontré que les cellules tumorales présentaient une expression accrue des protéines GIP. Par conséquent, l'invention couvre une molécule d'ARN interférant (siRNA) isolée comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un des acides nucléiques décrits ci- avant pour une utilisation comme médicament, en particulier pour un traitement contre le cancer tel que le cancer du col de l'utérus, du sein, du colon ou du cerveau. Avantageusement, la molécule d'ARN interférant sera insérée dans un vecteur permettant sa délivrance ou son expression et se présentera sous la forme d'une composition pharmaceutique, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un second mode de réalisation, l'invention concerne plus particulièrement les protéines GIP végétales et leurs applications à une méthode pour accroître la taille d'une plante ou partie de plante par inhibition d'au moins une protéine GIP dont l'inactivation entraîne une endoréduplication des cellules végétales. L'invention vise également une plante ou partie de plante génétiquement modifiée et la méthode de production de plantes correspondantes.
Les protéines GIP végétales présentent la séquence consensus SEQ ID N°12:
[RK]-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-[AVT]-[FIH]-X-[MI]-[SA]-[NQS]-[ILFVM]-[LV]-
[DENQG]-X-G-[LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-X-G-X- N-P-[EDG]-[ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-[RQGS] (SEQ ID N°12) L'invention couvre également l'acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°12.
Plus particulièrement, l'invention vise les polypeptides isolés, comprenant la séquence consensus SEQ ID N°13 :
K-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-A-[FIH]-Q-[MI]-[SA]-[NQS]-[IL]-[LV]-[DE]-T-G-[LI]-D-R-H- T-L-[STA]-[IVL]-[LI]-M-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-R-G-[AT]-N-P-[EDG]-[ASV]-[LVI]-[AV]- [AV]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-S-S-[AT]-A-P-P (SEQ ID N°13)
ou la séquence consensus SEQ ID N°14 :
[RK]-D-[SA]-L-[ED]-[LVIA]-[AVT]-[FIH]-H-M-[SA]-[NQS]-[ILFVM]-[LV]-[DENQG]-X-G- [LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-L-G-X-N-P-[EDG]- [ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-R-[RQ]-E-[NTS]-P (SEQ ID N°14) et les acides nucléiques isolés codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°13 ou la séquence consensus SEQ ID N°14.
Les séquences consensus SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14 correspondent respectivement aux séquences consensus des GIP de poacées et de solanacées. Ces deux familles de plantes présentent un intérêt particulier dans le domaine agricole. En effet, des plantes telles que le blé, l'orge, le maïs, le seigle et la canne à sucre appartiennent à la famille des poacées tandis que la tomate, l'aubergine, la pomme de terre ou le poivron appartiennent à la famille des solanacées.
L'invention concerne plus particulièrement une plante génétiquement modifiée caractérisée en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii) est inhibée :
(i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°12
(ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°13
(iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°14
(iv) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°15
(v) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°16
(vi) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°15
(vii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°16
(viii) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite plante de type sauvage.
Les séquences SEQ ID N°15 et SEQ ID N°16 correspondent respectivement aux séquences en acides aminés des protéines yAiGIPI et >AfGIP2 qui interagissent avec la protéine >4fGCP3, l'un des composants des MTOCs d'Arabidopsis thaliana. L'identification de ces protéines yAiGIPI et >AfGIP2 d'Arabidopsis thaliana est plus amplement décrite dans l'exemple 1 ci-après, et les séquences SEQ ID N°15 et SEQ ID N°16 sont données en figures 3B et 4B respectivement.
Une recherche d'homologues faite par BLAST parmi un grand nombre d'espèces de la lignée verte (Chlorophytes) a permis d'identifier au moins une protéine pour chaque végétal, homologue à la protéine yAiGIPI et/ou >AfGIP2. Ces résultats sont présentés dans le tableau 1 de l'exemple 2 ci-après. On notera que les séquences sont généralement courtes (entre 60 et 100 acides aminés) et très conservées (fort pourcentage d'homologie). En outre, elles correspondaient à des protéines de fonction encore inconnue.
Par pourcentage d'homologie, on vise le pourcentage de résidus identiques ou similaires entre deux séquences.
Par pourcentage d'identité, on vise le pourcentage de résidus identiques entre deux séquences. De préférence, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 65 % et plus préférentiellement d'au moins 70 % et le pourcentage d'identité sera d'au moins 50 % et plus préférentiellement d'au moins 60 %. Ces pourcentages préférés concernent plus particulièrement les plantes dicotylédones. En effet, Arabidopsis thaliana étant une plante dicotylédone, de plus fortes homologie et identité sont recensées chez ce type de plantes.
Comme indiqué dans le tableau 1 de l'exemple 2, certaines plantes, et plus particulièrement les plantes terrestres, peuvent comporter au moins deux protéines GIPs, homologues à yAiGIPI et/ou >AfGIP2. Les inventeurs ont mis en évidence que, de manière surprenante, si l'inhibition d'une seule protéine GIP avait une influence très relative sur l'endoréduplication et par conséquent sur la taille de ces plantes ou de la partie de ces plantes dans laquelle l'endocycle remplace le cycle cellulaire normal, l'inhibition combinée d'au moins deux protéines GIPs détectées chez ces plantes, favorisait notablement l'endoréduplication. Ceci se traduisait par un phénotype très marqué dans lequel un fort accroissement de la taille des cellules de la plante était mis en évidence, par exemple un épaississement de la racine (voir par exemple les figures 14 C et D).
Par conséquent, l'invention concerne plus particulièrement une plante génétiquement modifiée, de préférence une plante terrestre, dans laquelle la fonction de deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée, et plus particulièrement l'une de ces fonctions étant totalement inhibée (« knock out ») et l'autre étant partiellement inhibée (« knock down »). De préférence, l'inhibition partielle de la fonction de la protéine est régulée de manière à inhiber sélectivement un organe de la plante et/ou un stade du développement de celle-ci.
La terminologie « plante terrestre » se définit par opposition aux plantes aquatiques (par exemple, une algue).
L'inhibition de la fonction de la protéine peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. L'inhibition peut en particulier résulter d'un mécanisme empêchant la protéine de fonctionner ou d'un mécanisme bloquant la synthèse de cette protéine. Cette inhibition sera ciblée préférentiellement dans la partie de plante jugée d'intérêt.
A titre d'exemple de mécanisme empêchant la protéine de fonctionner, on citera les mécanismes dans lesquels la fonction peut être bloquée par une interaction de type antigène-anticorps ou protéine-inhibiteur. Dans le premier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une seconde protéine possédant les caractéristiques de reconnaissance spécifiques d'épitopes de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (viii). Dans le deuxième cas, il s'agit d'induire une interaction de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (viii) avec une molécule affine (peptidique ou chimique) bloquant ses capacités naturelles d'interaction avec GCP3 ou d'autres protéines des voies signalétiques, dans lesquelles ladite protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) agit. Un autre mécanisme permettant de bloquer la protéine est d'empêcher sa phosphorylation par une kinase Aurora. Dans ce dernier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une protéine ou partie de protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) portant une mutation sur le site de phosphorylation rendant cette dernière inopérante. L'expression des transgènes sera avantageusement ciblée dans des cellules ou tissus particuliers par usage d'un promoteur adéquat placé en amont de la séquence codante.
Les mécanismes bloquant la synthèse de la protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) comprennent plus particulièrement toute modification génétique visant l'inhibition de l'expression du gène codant pour ladite protéine, telle qu'une mutation dudit gène. Avantageusement et en particulier lorsqu'il s'agit de plantes terrestres, la plante sera modifiée par inhibition de l'expression d'au moins deux gènes codant pour au moins deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii).
Par inhibition de l'expression d'un gène, on vise tout mécanisme permettant d'empêcher le gène de s'exprimer.
A titre d'exemple, les méthodes suivantes peuvent être employées:
a) l'induction de l'expression d'une séquence complémentaire (siRNA) exogène à un fragment d'ARN messager transcrit endogène du gène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) conduit à l'hybridation des deux séquences. Ceci bloque la traduction des ARNs messagers dudit gène en protéine par mise en place d'une signalisation de dégradation enzymatique desdits ARNs.
b) la mutation du gène endogène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) par insertion d'une séquence (ADN de transfert; transposon) ou par délétion de séquence (ponctuelle, partielle ou totale) permet de produire l'expression de protéines tronquées ou inactives ou dans le cas extrême, aucune expression de protéine. Ce dernier cas arrive lorsque la séquence codante est totalement délétée, ou que la mutation génère un codon stop en 5' de la phase codante (N-terminal de la protéine) ou encore que la mutation ait induit un décalage de la phase de lecture de l'ADN aboutissant à une séquence d'amino-acides non conforme à la séquence native de la protéine active.
Dans l'exemple 7, par croisement de deux simple mutants d'insertion d'ADN-T concernant respectivement les gènes At4g09550 (SEQ ID N°17) et At1 g73790 (SEQ ID N°18) d'Arabidopsis thaliana, un descendant double mutant d'insertion a été créé.
L'invention couvre également une partie de plante génétiquement modifiée selon l'invention et plus particulièrement un organe de la plante tel que le fruit, le pétale, la fleur, la feuille, la graine, la racine, la tige, un tissu végétal, une cellule ou toute autre partie d'une plante. Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont avantageusement des crucifères telles que les choux, le colza, la moutarde, le navet, la roquette, les giroflées ou le radis. Toutefois, ces modifications génétiques peuvent aussi être réalisées sur toutes plantes d'intérêt agronomique ou horticole qui possèdent également des gènes homologues à >AfGIP1 et >AfGIP2, tel que les céréales, les arbres fruitiers ou décoratifs, les plantes fruitières, potagères ou décoratives et plus particulièrement, le riz, l'épeautre, le colza, le poivron, la papaye, l'oranger, le caféier, le melon, le fraisier, le gerbera, le soja, la réglisse, l'arbre à coton, le tournesol, le houblon, la laitue, le lotus, le pommier, le manioc, la luzerne, les pins, les pois, le tremble, l'abricotier, la canne à sucre, le sésame, l'aubergine, la pomme de terre, le sorgho, le maïs, le blé, la vigne, le peuplier ou le tabac.
Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont produites à l'aide d'une méthode comportant l'inhibition de la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii). Avantageusement, cette méthode de production comportera l'inhibition de la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (viii), l'une de ces fonctions étant totalement inhibée et l'autre étant partiellement inhibée. Cette inhibition pourra par exemple s'effectuer par inhibition de l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (viii) ou par suppression du gène codant pour les protéines (i) à (viii). Avantageusement, l'inhibition partielle de la fonction de la protéine est régulée de manière à cibler sélectivement un organe de la plante et/ou un stade du développement de celle-ci. Par exemple, l'inhibition est régulé à l'aide d'un siRNA dirigé contre la protéine à inhiber partiellement ou d'un peptide ou partie de protéine inhibant la protéine à inhiber partiellement, l'expression de ce siRNA, peptide ou partie de protéine étant sous la dépendance d'un promoteur spécifique d'un organe (« promoteur organe dépendant ») tel que le fruit et/ou un stade du développement de la plante (« promoteur temporellement régulé »), tel que la maturation. De cette manière, on provoque une endoréduplication ciblée sur le fruit. L'invention vise enfin une méthode pour accroître la taille d'une plante ou d'une partie de la plante dans laquelle on modifie la plante ou la partie de la plante de manière à inhiber la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii). Avantageusement, la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée, l'une de ces fonctions pouvant être totalement inhibée et l'autre pouvant être partiellement inhibée, l'inhibition partielle de la fonction de la protéine pouvant être régulée de manière à inhiber sélectivement un organe de la plante et/ou un stade du développement de celle- ci.
L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent, avec références au figures : La figure 1 présente les différentes GCPs (« Gamma-tubulin Complex Proteins ») et en particulier les GCP3, leur implication dans les complexes de nucléation des microtubules (Microtubule Organizing Centres ou MTOCs) et leurs homologues dans différentes espèces, identifiées par leur nom ou leur masse moléculaire en kilo Daltons.
La figure 2 présente la séquence nucléotidique complète de la GIP humaine, la partie codante étant indiquée en majuscule.
Les figures 3 et 4 décrivent les séquences d'ADN génomique d7\fGIP1 (Fig. 3A) et de la protéine correspondante (Fig. 3B) ainsi que celles d'AGIP2 (Fig. 4A et 4B). Sur les figures 3A et 4A, sont indiqués les exons, les introns et la séquence codante est repérée par les deux codons d'initiation et de terminaison (ATG et TGA/TAA). Sur les figures 3B et 4B, sont indiqués les prédictions de sites de phosphorylation (S) et celui qui est conservé chez toutes les séquences GIP des eucaryotes (H).
La figure 5 présente la comparaison des séquences protéiques d'AGIPI et
AGIP2 (Fig. 5A) et la structure tridimentionnelle des GIPs (Fig. 5B).
La figure 6 présente les structures des gènes AT4G09550 de yAiGIPI (Fig.
6A) et AT1 G7379 de AÎGIP2 (Fig. 6B) obtenues à partir des sites suivants : http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/AT4G09550
http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/AT1 G73790
La figure 7 décrit la région promotrice d7\fGIP1 .
La figure 8 est un arbre évolutif des GIPs.
La figure 9 compare 1 15 séquences d'amino acides correspondant à des protéines GIP complètes identifiées dans 72 espèces différentes de plantes. La figure 10 présente les résultats d'un test in vitro (GST pull-down) entre les GCP 1 , 2 et 3 et les GIP1 et 2 d'A thaliana. Les essais ont été réalisés entre les protéines de fusion à la GST (GST-gamma-tubuline, GST-AGCP2, GST- AGCP3, GST-AÎGIP1 , GST-AÎGIP2) et les deux protéines radiomarquées yAiGIPI et AÎGIP2. La GST seule a été utilisée comme témoin négatif.
La figure 1 1 présente les résultats d'un test d'interaction in vivo en système double hybride de levure.
La figure 12 présente les taux comparatifs d'expression des GIPs d'A thaliana.
La figure 13 présente les résultats de spécificité des anticorps testée par Immunoblotting. La figure 14 illustre la localisation des GIPs endogènes dans des cellules de tabac BY-2 (A-C) et d'Arabidopsis (D) en division par immunomarquage. La figure 15 illustre l'immunomarquage de cellules de xénope en culture avec des anticorps (@ : anticorps) polyclonaux de lapin anti->AfGIP1 ou anti- HsGIP (« homo sapiens GIP »).
La figure 16 illustre l'immunomarquage de cellules de xénope en culture avec des anticorps monoclonaux anti-HsGIP.
La figure 17 présente un gel SDS-Page illustrant les résultats de la phosphorylation de la protéine yAiGIPI par la kinase >AfAurora1 . La figure 18 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2.
La figure 19 présente les séquences des simple mutants gip1 et gip2 (avec les sites d'insertion des ADN-T) et les résultats d'une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes issues du croisement des simple mutants.
La figure 20 illustre les phases de développement (à 7, 21 et 45 jours après germination, « JAG ») obtenues avec les plantes double mutantes.
La figure 21 illustre un marquage à l'iodure de propidium du méristème de plantes double mutantes.
La figure 22 présente une comparaison deux à deux les taux d'expression de HsGIP dans des tissus sains (barre claire) et cancéreux (barre foncée). La figure 23 illustre l'apoptose de cellules HeLa et HEK 293 suite à la suppression de GIP par introduction de siRNA dans ces cellules. Exemple 1 : Caractérisation des protéines GIPs
1. Identification de la protéine GIP1
La protéine GIP1 a été identifiée par criblage double hybride de levure d'une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana (plantules de 3 semaines, Clontech®) en utilisant comme appât la protéine >4fGCP3, un des composants essentiels du complexe de nucléation des microtubules.
Le gène ainsi révélé est At4g09550 (SEQ ID N°17) dont la séquence est indiquée figure 3.
Ce gène code pour une protéine de fonction inconnue, nommée « >AfGCP3 Interacting Protein 1 » (>AfGIP1 ). 2. Recherche in silico d'homologues de GIP1
L'analyse des banques de données (http://www.arabidopsis.org/Blast/), a permis d'identifier un gène homologue At1 g73790 (SEQ I D N°18) (Figure 4).
La figure 5A présente la comparaison des séquences protéiques d7\fGIP1 et >AfGI P2. Sur cette figure, sont indiqués les motifs consensuels (X ), le site potentiel de phosphorylation (S) conservés chez les eucaryotes. Les pseudo leucine-zipper et « D box » sont indiquées par les flèches.
Le gène homologue At1 g73790 montre donc une forte homologie avec GI P1 et a été ainsi nommé GI P2.
Une structure tridimensionnelle théorique des protéines GI P a été obtenue après analyse bioinformatique (Voir figure 5B). Le domaine N-terminal flottant (en haut à droite de la photo de la figure 5B) est suivi de trois hélices alpha et la région la plus conservée entre espèces est la partie C-terminale (en bas à gauche).
L'organisation structurale des gènes yAiGI PI et ¾iGI P2 a été comparée (Figure 6) et montre des variations importantes dans la partie promotrice suggérant une régulation différentielle. Des cis-éléments régulateurs liés à une activité cycle cellulaire-dépendante sont trouvés dans la région promotrice d7\fGIP1 (Figure 7).
D'autres membres de la famille des GI Ps ont été identifiés chez les eucaryotes en général et l'Homme en particulier et un arbre phylogénétique a été ainsi réalisé en appliquant la méthode "Neighbor joining" (Figure 8). Il a été trouvé que ces protéines étaient généralement codées par un gène unique par organisme, sauf pour les plantes terrestres où ces protéines sont généralement codées par au moins deux gènes (voir exemple 2).
Elles sont fortement homologues entre-elles (Figure 9) avec une moyenne de d'homologie de 79%. Les acides aminés conservés (ou identiques) et similaires sont surlignés respectivement de gris foncé et gris clair. Ceci suggère une conservation de leur(s) fonction(s) et des propriétés maintenues tout au long de l'évolution. Elles présentent dans leurs séquences certains motifs proches d'une "D box", un pseudo "leucine zipper" et des sites de phosphorylation potentiels (Figure 5).
3. Vérification de l'interaction AfGCP3-AfGIP1 par GST pull-down
Les ADNc d7\fGCP1 ou γ-tubuline, AtGCP2, AtGCP3, et AtGI P'l et AtG\P2 ont été clonés dans le vecteur pGEX-2TK et les bactéries E. coli souche Rosetta ont été sélectionnées après transformation. L'expression des protéines de fusion ou de la GST seule a été faite dans cette souche bactérienne. Les protéines solubles de l'extrait ont été fixées sur billes de gluthathion Sépharose 4B. D'autre part, yAiGI PI et ¾iGI P2 marquées à la méthionine[35S] ont été produites par traduction in vitro dans un lysat de réticulocytes de lapin. Des tests de GST pull-down ont ainsi été menés. Les résultats ont été que seule >4fCGP3 interagit avec yAiGIPI (Janski et al., 1997) et >AfGIP2, confirmant les résultats obtenus précédemment en système double hybride.
4. Interactants des protéines GIPs d'Arabidopsis thaliana
La recherche d'interactants a été réalisée par GST pull down (Figure 10) et par système double hybride (Figure 1 1 ).
Sur la figure 10A, est présenté un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie de la fraction liée aux billes de glutathion-sépharose. Les protéines de fusion de taille attendue sont les bandes majoritaires, indiquées par les têtes de flèche claire. Sur la figure 10B , est présenté une autoradiographie du gel, où les protéines radiomarquées (*) de la fraction liée aux billes sont révélées. Aucun marquage n'est retrouvé dans les pistes des témoins négatifs, alors que dans le test de pull-down, yAiGIPI et >AfGIP2 ont co- précipité avec la GST->AfGCP3. L'ensemble des autres pistes ne révèle aucune interaction.
Il a été démontré (Figure 1 1 ) qu7\fGIP2, comme yAiGIPI interagissent précisément avec les 200 premiers acides aminés de la région N-terminale d7\fGCP3. De plus, par système double hybride, une interaction positive supplémentaire a aussi été montrée entre les GIPs elles-mêmes (GIP1 -GIP1 et GIP1 -GIP2). En effet, sur la figure 1 1 , on constate que non seulement >AfGIP1 et >AfGIP2 interagissent avec >AfGCP3 et entre elles mais également que les GIPs interagissent avec le domaine N-terminal de GCP3 (r1 ). Ceci suggère que ces protéines puissent former des oligomères in vivo.
5. Données bioinformatiques sur l'expression des GIPs
L'outil "genevestigator" a été utilisé (http://www.genevestigator.ethz.ch/)
Les GIPs s'expriment nettement plus dans les tissus jeunes d'Arabidopsis (feuilles) ou méristématiques (apex racinaires et jeunes fleurs) que dans des tissus différenciés.
Ceci renforce le lien entre l'expression des protéines GIPs et la division cellulaire en général.
Une étude comparative d'expression entre yAiGIPI et >AfGIP2 suggère que GIP2 joue un rôle prépondérant lors de la gamétogenèse (Figure 12).
6. Obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre les GIPs
Afin de permettre l'étude de ces protéines, des anticorps polyclonaux ont été produits dans des lapins. Deux d'entre eux ont été dirigés contre le peptide d'vAiGI P1 suivant DEEASRTARESLEL-(C) (SEQ ID N°19) et ont été commandés à la société Sigma. Quatre autres sérums ont été obtenus par injection d'une protéine de fusion y4fGIP1-6His à des lapins des animaleries de l'Esplanade (CNRS-UdS) (Strasbourg, FRANCE) et de l'IGBMC (Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire, lllkirch, FRANCE).
En testant les sérums sur différents extraits cellulaires, un marquage spécifique des GIPs d'Arabidopsis a été révélé en Western blot, à la fois par un sérum anti-peptide et un sérum anti-GIP1 complète, sur la protéine endogène présente dans des extraits totaux de cellules d'Arabidopsis thaliana (Figure 13A). Une confirmation de reconnaissance antigénique a été obtenue sur extraits de plantes transgéniques exprimant les fusions GIP1 :E-tag:eGFP (Figure 13B).
7. Localisation intracellulaire par immunomarquage
La localisation des GIPs endogènes a été analysée sur cellules de tabac BY-2 (Nagata et al., 1992 , Int. Rev. Cytol., 132, 1 -30) en culture au cours du cycle cellulaire.
Sur la figure 14, sont présentés : en première ligne (A)/ colonne (B, D), le marquage anti-GIP, en deuxième colonne (B, D) celui des microtubules, en deuxième ligne (A)/ troisième colonne (B, D) l'ADN. En interphase, GIP entre dans le noyau en G2 puis est exporté en 2 croissants polaires. Un marquage diffus est également visible au niveau du fuseau bipolaire, plus intense au niveau des fibres kinétochoriennes en anaphase- télophase. Une mesure d'intensité des marqueurs fluorescents (analyse d'image par logiciel LSM510) dans une cellule en télophase montre que GIP est localisé aux extrémités polaires des deux cellules filles.
Les cellules BY-2 en interphase révèlent une augmentation de densité du marquage aux pôles nucléaires en fin de phase G2 (croissants nucléaires) correspondant aux sites d'initiation de la formation du fuseau mitotique. En mitose, le marquage des régions polaires du fuseau reste fort. L'intensité du marquage n'est pas augmentée au niveau du phragmoplaste par rapport au bruit de fond. Un marquage moins intense du nucléoplasme est aussi observé.
Ces résultats montrent une localisation des GIPs aux centres organisateurs des microtubules (surface du noyau), suggérant un rôle dans la régulation de l'activité de nucléation.
La présence de GIP dans le noyau suggère qu'elle puisse jouer un autre rôle, notamment comme facteur régulateur du cycle cellulaire.
Exemple 2 : Homologues dT fGIPI et d7\.GIP2 chez les plantes Des analyses bioinformatiques ont été menées et la recherche d'homologues a été faites parmi les plantes en utilisant principalement l'outil d'alignement BLAST. Les résultats de ces recherches sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Y sont indiqués les numéros d'accession des séquences répertoriées dans NCBI, ainsi que la dénomination utilisée pour la construction de l'arbre phylogénétique (figure 8). Les degrés d'homologie et d'identité entre yAiGIPI et toutes les autres séquences sont indiquées en colonne 5 et 6 de ce tableau. Tableau 1 : Comparaison des GIPs de plantes
Nom Nom commun Réf. Database taille (aa) Homologie Identité Scientifique
Amborella gb|FD440559.1 74 75% 58% trichopoda
! Antirrhinum ! Gueule de loup emb|AJ799576.1 69 86% 63% ! majus
\ Arabidopsis ! Arabette des At4g09550.1 71 100% 100% \ thaliana ! dames
Arabidopsis i Arabette des At1 g73790 67 87% 76% thaliana i dames
I Brassica napus \ Colza gb|EE437549.1 64 85% 74%
I Brassica napus ! Colza gb|EE480929.1 68 84% 73%
I Brassica napus ! Colza gb|EL625962.1 69 82% 71 %
I Brassica napus ! Colza gb|EE558825.1 69 87% 78% Brassica I Moutarde gb|EE535651 .1 69 82% 71 % oleracea I sauvage
Brassica rapa Navet gb|ES936722.1 69 82% 71 %
Bruguiera dbj|BP942562.1 73 85% 72% gymnorrhiza
Capsicum Poivron gb|GD069637.1 73 80% 64% annuum
! Carica papaya ! Papaye gb|EX277998.1 68 85% 73%
! Carica papaya ! Papaye gb|EX258842.1 68 83% 71 %
Carica papaya ! Papaye gb|EX289432.1 68 83% 71 %
Carica papaya Papaye gb|EX279448.1 72 80% 69%
Carica papaya Papaye gb|EX272788.1 7 67% 56%
Catharanthus Pervenche de gb|EG559135.1 83 75% 62% roseus Madagascar
! Citrus sinensis Oranger doux gb|CF653581 .1 73 82% 73%
! Citrus sinensis Oranger doux gb|CF653278.1 72 70% 61 %
! Citrus unshiu ! Oranger Satsuma i dbj|DC900652.1 73 82% 73%
\ Coffea arabica i Caféier d'Arabie gb|GT016862.1 80 79% 62% \ Coffea ! Caféier robusta gb|DV692355.1 80 83% 67% \ canephora
! Coffea i Caféier robusta gb|EE200008.1 80 79% 62% canephora i Cucumis melo : Melon i emb|AM714745.2 71 88% 73% i Cucumis melo Melon i emb|AM735136.2 72 85% 69%
Cyamopsis Guar : gb|EG979173.1 73 86% 73% ; tetragonoloba
i Diospyros kaki i Plaqueminier dbj|DC587664.1 75 84% 68%
! Euphorbia esula i Euphorbe ésule i gb|DV157029.1 69 85% 71 %
I Festuca ; Fétuque i gb|DT687331 .1 92 60% 46% I arundinacea
Festuca Fétuque I gb|DT705327.1 92 59% 45% arundinacea
Fragaria vesca Fraisier des bois : gb|DV439268.1 72 81 % 63% i Gerbera hybrida i Gerbera : emb|AJ764484.1 69 87% 76% i Glycine max i Soja gb|GE042228.1 73 87% 75%
\ Glycyrrhiza i Réglisse : dbj|FS278006.1 74 86% 78% uralensis
! Gossypium Arbre à coton ] gb|BE055016.2 73 84% 69% ! arboreum
\ Gossypium Coton mexicain i gb|DW512395.1 73 84% 69% hirsutum
Guizotia Niger ; gb|GE569580.1 69 85% 71 % ; abyssinica
; Helianthus i Tournesol ; gb|CD854455.1 69 90% 76% annuus
! Helianthus ; Tournesol ; gb|GE516206.1 69 89% 74% annuus
! Helianthus exilis : Tournesol ] gb|EE660243.1 69 90% 76% serpentine
Humulus lupulus Houblon ! gb|ES652466.1 67 83% 64% : Kadua \ gb|CB084509.1 73 87% 68% centranthoides
i Lactuca virosa ; Laitue vireuse i gb|DW173950.1 75 87% 78%
! Lofus japonicus i Lotus i gb|GO029829.1 74 87% 78%
! Macrotyloma ! Gahat i gb|DR989162.1 73 86% 73% ! uniflorum
I Ma/us x Pommier i gb|CN926550.1 72 91 % 78% domestica
; Malus x ; Pommier : gb|DR990583.1 72 94% 78% i domestica
i Manihot Manioc ; gb|FF535362.1 72 83% 75% esculenta
! Manihot ! Manioc i dbj|DB942966.1 75 76% 62% ! esculenta
! Marchantia i dbj|BJ847813.1 70 65% 53% polymorpha
Medicago Luzerne tronquée ; gb|GT138663.1 71 83% 69% ; trunculata
i Medicago i Luzerne tronquée gb|EY477452.1 71 83% 69% trunculata
Nicotiana gb|EB692453.1 74 82% 68% langsdorffii i Nicotiana Tabac i emb|AM824392.1 74 82% 68% tabacum
Nicotiana 1 Tabac \ gb|FG628953.1 71 92% 78% tabacum
! Nicotiana Tabac ; emb|AM793301 .1 71 81 % 67% tabacum
Nicotiana Tabac ; gb|FG6401 18.1 82 71 % 59% \ tabacum
! Oryza sativa ; Riz i gb|CF989340.1 95 60% 45%
\ Oryza sativa ! Riz \ emb|CR290439.1 99 60% 48%
\ Panicum i Panic érigé \ gb|FL924617.1 74 76% 58% \ virgatum
Panicum Panic érigé i gb|FE597824.1 95 61 % 45% virgatum
Panicum Panic érigé ; gb|FL838883.1 95 61 % 45% ; virgatum
Pétunia axillaris i Pétunia emb|FN015871 .1 75 81 % 65%
! Physcomitrella ; dbj|DC931782.1 68 73% 61 % patens
Physcomitrella ; gb|FC379761 .1 68 71 % 57% patens
\ Picea glauca Epinette blanche \ gb|EX355173.1 69 82% 68%
! Picea glauca Epinette blanche \ gb|EX398197.1 69 72% 57%
Picea glauca Epinette blanche ; gb|EX346914.1 69 68% 53%
: Picea sitchensis i Epinette de Sitka gb|DR534840.1 69 74% 59% i Pinus contorta i Pin tordu i gb|GT262365.1 69 82% 68%
Pinus taeda i Pin à torches i gb|BG318923.1 69 82% 68%
Pisum sativum ; Pois ; gb|FG531097.1 71 83% 69%
Populus ! Peuplier de ; gb|CX169916.1 74 85% 66% deltoïdes Virginie
! Populus Peuplier de \ gb|CX174820.1 70 81 % 69% 1 deltoïdes Virginie
Populus nigra i Peuplier noir : dbj|DB891 109.1 70 81 % 69%
\ Populus tremula i Tremble gb|BU836668.1 74 82% 66%
! Populus tremula i Tremble i gb|DN496059.1 70 90% 78%
\ Populus i Peuplier de \ gb|CV246545.1 74 85% 66% \ trichocarpa ! l'Ouest
Populus ! Peuplier de i gb|DT494575.1 70 81 % 69% trichocarpa l'Ouest
\ Prunus Abricot ; gb|CV046837.1 72 81 % 68%
: armeniaca
: Raphanus i Ravenelle ! gb|EX759388.1 68 86% 74% raphanistrum
! Rubus ulmifolius i Ronce à feuille ] gb|FF684136.1 71 88% 67%
i d'orme
\ Saccharum i Canne à sucre \ gb|CA28971 1 .1 98 56% 41 % \ officinarum
Saccharum Canne à sucre : gb|CA241809.1 98 65% 48% officinarum
Saccharum Canne à sucre ! gb|CA276569.1 96 58% 41 % officinarum i Salvia sclarea Sauge sclarée j dbj|AB492074.1 70 88% 67% turkestanica
Sesamum Sésame I gb|BU668335.1 72 85% 72% indicum
Solanum : gb|DN983292.1 73 85% 68% chacoense
! Solanum ! Aubergine j dbj|FS086566.1 73 84% 68% ! melongena
\ Solanum ! Pomme de terre i gb|CX162769.1 76 85% 68% ! tuberosum
Solanum i Pomme de terre j gb|CV496214.1 76 82% 68% tuberosum
: Sorghum bicolor ; Sorgho gb|CX608909.1 95 56% 43% ; Syntrichia ruralis gb|CN2091 1 1.1 71 76% 57%
I Taraxacum kok- I Pissenlit de : gb|DR402985.1 72 84% 75% \ saghyz I Russie
! Taraxacum ! Pissenlit ; gb|DY839988.1 72 84% 69% officinale
! Triticum ! Blé tendre i gb|CD881387.1 95 57% 44% aestivum
\ Triticum : Petit épeautre gb|BQ802467.1 95 60% 46%
\ monococcum
! Triticum i Petit épeautre : gb|BQ803829.1 94 61 % 44% monococcum
I Vigna : gb|FG909268.1 73 85% 73%
I unguiculata
! Vigna ; gb|FF382276.1 73 84% 72% unguiculata
Vitis vinifera i Vigne gb|CD802262.1 73 81 % 72%
Vitis vinifera Vigne : gb|CA817836.1 73 80% 71 %
! Vitis vinifera Vigne ; gb|EC992233.1 73 79% 67%
! Vitis vinifera Vigne ; gb|EC991719.1 73 85% 67%
! Welwitschia ; gb|CK767759.1 72 73% 58% mirabilis
! Zea mays ! Maïs ; gb|FL065038.1 96 56% 41 % Zea mays : Maïs : gb|FL152568.1 96 56% 41 %
Zea mays i Maïs gb|CF631456.1 96 57% 43%
Zea mays ! Maïs ; gb|FL065041.1 98 58% 42%
! Zostera marina Zostère marine ; emb|AM771477.1 86 61 % 44% moyennes 75,576577 79% 65%
On notera que les 1 15 séquences sont généralement courtes et très conservées. En outre, elles correspondent à des protéines de fonction encore inconnue. Les séquences possèdent entre 64 et 98 acides aminés et présentent un fort pourcentage d'identité et d'homologie. La méthode de calcul des pourcentages a été générée par rapport à yAiGIPI (ClustalW avec matrice de Gonnet contre yAiGIPI et >AfGIP2 simultanément).
Il a été constaté que la présence de plus d'un gène GIP se généralise pour les plantes terrestres et s'est donc produit par duplication au cours du Silurien/Dévonien (ère primaire). Cette duplication s'est conservée jusqu'aux plantes les plus évoluées analysées (Angiospermes) dont on connaît le génome complet.
Exemple 3 : Protéines GIP chez les animaux
Comme dans l'exemple 2, sont indiqués dans le tableau 2, les numéros d'accession des séquences répertoriées dans NCBI, ainsi que la dénomination utilisée pour la construction de l'arbre phylogénétique (figure 8). Les degrés d'homologie et d'identité entre HsGIP et toutes les autres séquences sont indiquées en colonne 5 et 6 de ce tableau.
Tableau 2 : Comparaison des GIPs d'animaux
Nom Scientifique Nom commun Réf. Database taille (aa) Homologie Identité Acropora palmata Corail corne d'élan gb|EY024092.1 72 71 % 44 %
Aedes aegypti Moustique gb|DV2791 12.1 85 50 % 27 %
Calanus finmarchicus Copépode gb|EL965448.1 101 56 % 38 % Capitella sp. Annélide gb|EY518366.1 76 79 % 58 % Ciona intestinalis Cione intestinale gb|FF977949.1 65 56 % 43 %
Huître creuse du
Crassostrea gigas gb|FP000860.1 70 74 % 58 %
Japon
Cryptosporidium
gb|EAL37150.1 66 56 % 31 % hominis
Danio rerio Poisson zèbre gb|BG305388.1 75 83 % 72 %
Drosophila
Mouche du vinaigre gb|HDC08084.1 82 44 % 21 % melanogaster
ref|NP_001 1578
Gallus gallus Coq doré 79 % 78 %
22.1
Homo sapiens Homme gb|EAW80513.1 79 100 % 100 %
, ., Crevette pattes
Litopenaeus vannamei . . . gb|FE090915.1 74 ! 66 % 48 %
^ blanches
Monosiga brevicollis gb|EDQ89917.1 >62 53 % 46 % Nom Scientifique Nom commun Réf. Database taille (aa) Homologie Identité
Plasmodium emb|CAD52532
72 ! 56 % 38 % falciparum .1
Schistosoma gb|BU714295.1 83 ! 48 % 26 %
Schitosome
japonicum
Toxoplasma gondii gb|EEA98898.1 92 I 55 % 36 %
Trichoplax adhaerens gb|EDV20763.1 1 18 I 48 % 37 %
Xenopus laevis Dactylère du Cap gb|BG162997.1 72 ! 96 % 78 %
Comme dans l'exemple précédent, les 18 séquences sont généralement courtes et très conservées. Elles correspondent également à des protéines de fonction encore inconnue. Les séquences possèdent entre 62 et 1 18 acides aminés et présentent un fort pourcentage d'identité et d'homologie.
Exemple 4 : Immunomarquaqe de cellules de xénope en culture avec des anticorps polyclonaux de lapin anti->4fGIP1 ou anti-HsGIP Les protéines recombinantes HsGIP et yAiGIPI clonées dans le vecteur pET102D ont été produites dans E.coli et purifiées sur résine de nickel. La production d'anticorps à été confiée à l'animalerie de l'IGBMC (Strasbourg). Les fractions IgG ont été utilisées sur des cellules de xénope en culture fixées au méthanol pour des immunomarquages. Les anticorps primaires ont été révélés par des anticorps secondaires fluorescents anti-lapin et les observations faites par microscopie confocale. Les structures révélées sont les noyaux avec les anti->AfGIP1 (@>4fGIP - figure 15a) et les centrosomes/pôles fusoriaux avec les anti-HsGIP (@HsGIP - figure 15b) ou encore les centrosomes et le midbody (figure 15c). Le marquage simultané de l'ADN (DAPI) et des microtubules (@tubuline) permet de confirmer ces localisations. La superposition des 3 canaux est présentée dans les photographies indiquées par « fusion ».
Exemple 5 : Préparation d'anticorps monoclonaux anti-GIP et immunomarquaqe
Les phases codantes des protéines yAiGIPI et HsGIP (homo sapiens GIP) ont été amplifiées par PCR avec le Phusion® Master Mix de la société New England Biolabs et clonées dans le vecteur d'expression procaryotique pET102D-TOPO (Invitrogen™). L'expression des différentes protéines a été réalisée dans les cellules E.coli BL21 (DES3) après induction à l'IPTG (Isopropyl β-D-l -thiogalactopyranoside). La purification a été réalisée sur résine Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). Les protéines recombinantes ainsi obtenues ont été utilisées par la société AbD Serotec pour le criblage d'une banque de F(ab')2 d'anticorps humains HuCAL® GOLD. Les sept meilleurs clones sélectionnés ont été requalifiés par test Elisa et purifiés sous la forme de 250 μg de dimères F(ab')2 en fusion avec une phosphatase alcaline bactérienne et portant les épitopes V5 et Strepll.
Des cellules de xénope (les séquences de GIP humaine et xénope étant quasi identiques) en culture ont été fixées au méthanol et utilisées pour des tests d'immunolocalisation avec les anticorps sélectionnés à une concentration de 0,001 g/ L. Des anticorps secondaires fluorescents anti-F(ab')2 humain ou anti-V5 ont été utilisés pour révéler les anticorps primaires par microscopie confocale. Les structures cellulaires suivantes ont été révélées de façon plus ou moins intense selon l'anticorps primaire utilisé : noyaux, pôles fusoriaux, centrosomes, fuseau mitotique ainsi que les midbodies (voir figure 16). La figure 16a illustre l'immunomarquage avec l'anticorps monoclonal N°1 (HsGIP N°1 ) qui marque les noyaux et les pôles des fuseaux mitotiques. Le midbody est aussi révélé avec cet anticorps (Figure 16b). Le marquage avec l'anticorps monoclonal N°4 (Figure 16c) révèle le fuseau métaphasique et le midbody à l'équateur entre les deux noyaux fils. Exemple 6 : Phosphorylation de la protéine >4Κ3ΙΡ1 par la kinase >4fAurora1
Les protéines recombinantes yAiGIPI et >AfAurora1 clonées dans le vecteur pET102D ont été produites dans E.coli et purifiées sur résine de nickel.
Des réactions de phosphorylation sont effectuées avec au moins 400 ng de chaque protéine dans des volumes réactionnels de 20 μί en présence de 10 μθί de 32P γ-ΑΤΡ pendant 30 minutes à température ambiante. Le tampon réactionnel a la composition suivante : 10 mM Tris HCI pH 7,5, 100 mM KCI, 2 mM MgCI2, 0, 1 mM CaCI2. Les protéines sont alors séparées par SDS-PAGE. Le gel est fixé/coloré dans une solution éthanol/acide acétique/bleu de coomassie puis séché et autoradiographié pour révéler les protéines radiomarquées (phosphorylées). Une kination de la protéine yAiGIPI est ainsi révélée (figure 17 en bas du gel à droite) indiquant que les protéines GIP sont des substrats, et leur dérivés des possibles inhibiteurs, pour les kinases de type Aurora (voir figure 17 - >AfAurora : contrôle avec kinase seule ; marqueur de PM : marqueur de poids moléculaires de référence ; >4fAurora/>4fGIP1 : essai avec en mélange kinase et GIP). La moitié gauche de la figure représente le gel SDS-PAGE coloré au bleu de coomassie. La moitié droite correspond à l'autoradiographie de ce même gel pour révéler les protéines radiomarquées.
Exemple 7 : Mutants d'insertion d'ADN-T et endoréduplication
1. Origine et caractérisation génétique
Une lignée d'Arabidopsis thaliana provenant de la collection GABI-Kat (http://www.GABI-Kat.de) (Bielefeld, Allemagne) et correspondant au mutant 213D01- 014134 a un ADN-T inséré dans l'intron en amont de la séquence codante du gène GIP1 . Le mutant gip2 provient de l'INRA (Versailles, France) (364E06 ou 615G1 1 ) et l'insertion est située en partie 5'UTR de l'exon. Les plantes homozygotes gip1 comme gip2 ne présentent pas de phénotype très significatif au cours du développement comparées à des plantes sauvages.
En revanche des doubles homozygotes gip1 gip2 présentent un phénotype très fortement affecté dans le développement et la croissance. En effet, la figure 18 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2 :
A. Plantules 6 jours après germination. Le mutant présente un retard de germination par rapport au témoin à cotylédons déployés.
B. Plantules WT (gauche) et mutantes (droite) après 6 jours de germination à l'obscurité. L'allongement de cellules de l'hypocotyle est marqué chez les 2 types de plantules.
C. D. Pointes de racine WT et mutées marquées au DAPI.
E, F. Racines de mutants présentant des vrilles et des anomalies de l'épiderme à différenciation précoce.
G. Coloration de l'amidon au lugol.
H. Coloration des parois à l'iodure de propidium. Le méristème et la coiffe sont affectés
Des analyses géniques ont confirmé la présence des ADN-T dans les allèles de GIP 1 et GIP2.
La figure 19 présente les résultats d'une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes :
A. Position de l'insertion d'ADN-T dans les séquences de gip1 et gip2.
B. Présence des ARNm de GIP1 et GIP2 chez ColO (ligne 2) et d'ARNm de GIP1 dans les plantes gip1/+ gp2Jg\p2 (ligne 3) et l'ARNm de GIP2 chez les plantes gip1/gip1 gip2/+ (ligne 4). Absence des transcrit de ces gènes dans les plantes double mutantes gip1/gip1 gp2Jg\p2 (ligne 6). Cependant, la présence d'une faible quantité de transcrits de GIP1 chez les plantes gip1/gip1 gip2/+ (ligne 4) et gip1/gip1 g\p2Jg\p2 (ligne 5) a été observée. Par conséquent, des ARNm de GIP1 ont été parfois détectés en faible quantité par PCR semi-quantitative, suggérant la présence résiduelle possible de protéines GIP1 chez certains double mutants. Ceci peut être à l'origine de la variété de stades développementaux observés. En effet, la germination des graines semble être stoppée au cours de son développement selon la persistance ou non de l'expression de protéine GIP1 . Ainsi, soit la germination est totalement inhibée (létalité du double mutant knock out), soit elle est perturbée à des niveaux variables (double mutants knock down).
2. Anomalies cellulaires et tissulaires des mutants gip
Le phénotype observé révèle des anomalies dans l'organisation des méristèmes racinaires (Figure 18) et caulinaires. Un grand nombre de cellules présente des anomalies de ploïdie, suggérant de l'endoréduplication (Figure 18 D).
La figure 20 illustre le développement des plantes double mutantes (C, D) en comparaison avec les plantes témoins (A, B) à 7, 21 et 45 JAG (jours après germination). La figure 20E présente la hampe florale du mutant (droite) comparée au témoin (gauche).
Les fleurs de plantes sont illustrées en F : témoin, G : hétérozygote GIP1+I- gip2-l- et H,l : homozygotes gip1 gip2. En figure 20J, sont présentés les organes floraux après éclaircissement de Hoyer. En figure 20K, est présenté un diagramme de mesures de ploïdie des boutons floraux. Enfin, les figures 20 L-P présentent le détail d'une étamine avec stomates, rares microspores et cellules lignifiées (L-O) et illustre l'arrêt précoce du développement des ovules (P).
Parmi les plantules développant une hampe florale, des anomalies de croissance et différenciation restent importantes. Une analyse comparée de la morphologie des fleurs double mutantes gip1 gip2 et sauvages montre que le développement des verticilles floraux et la gamétogenèse sont perturbés, rendant ces plantes stériles. Une analyse de la ploïdie des boutons floraux par FACS confirme un accroissement de ploïdie de 2C jusqu'à 32C (Figure 20K).
Le cytosquelette microtubulaire des double mutants gip1 gip2 est modifié par rapport à celui de plantules témoins. Les cellules résultant d'endoréduplication, de taille très largement supérieures à la moyenne présentent des microtubules corticaux entrecroisés, indiquant une perte de polarité de croissance. Les figures de division observées montrent des fuseaux bipolaires massifs souvent obliques, conduisant à une perte de l'organisation des cellules en files régulières.
L'ensemble de ces résultats montre que les protéines GIPs joue un rôle d'une part dans la formation et/ou l'organisation du cytosquelette et d'autre part dans la régulation du cycle cellulaire et la maintenance du génome, éléments essentiels au développement des plantes et des êtres vivants en général.
3. Mort GIP dépendante des cellules initiales ou du centre quiescent dans les pointes de racine (et plus généralement les méristèmes)
Il a été démontré, dans les doubles mutants gip1 gip2 disponibles, que si le gène GIP2 est bien totalement éteint (knock-out), il peut subsister une expression variable du gène GIP1 (knock-down). Cette expression résiduelle est variable selon chaque plantule mutante et par conséquent, explique la variabilité des phénotypes observés.
Des plantules prises 8 jours après germination ont été colorées pendant 5 minutes dans une solution à 10 μg/ml d'iodure de propidium avant d'être rincées à l'eau et observées en microscopie confocale. Sur la figure 21 , on peut observer la mort des cellules du centre quiescent et/ou des cellules initiales dans les racines de ces jeunes plantes gip1 gip2. Ces cellules étant les cellules souches de la racine, il semble qu'une mort plus ou moins précoce en fonction du taux résiduel de GIP1 va conduire aux phénotypes observés, de la létalité complète, dans le cas d'une non-expression de GIP1 , à un développement possible jusqu'à la floraison (excepté pour la sporogénèse) dans le cas d'une expression résiduelle suffisante de GIP1 . Le fait que toute la plante soit affectée par un niveau d'expression insuffisant de GIP1 suggère que l'expression de ce gène est absolument nécessaire à la survie des cellules quiescentes et initiales dans tous les méristèmes de la plante.
Exemple 8 : Sur-expression de la protéine GIP dans les cellules cancéreuses La base de donnée IST (In Silico Transcriptomics - www.genesapiens.org) a été utilisée afin de déterminer les niveaux d'expression de HsGIP (ENSG00000204899) dans les collections de cette base de donnée. Elle regroupe 3670 échantillons concernant plus spécifiquement l'expression de HsGIP tant dans des tissus sains que dans des tissus cancéreux. Une extraction de ces données par type cellulaire permet de corréler un taux d'expression de HsGIP anormalement élevé dans de nombreux cancers (voir figure 22).
Sur cette figure, sont comparés deux à deux les taux d'expression de HsGIP dans des tissus sains (barre claire) et cancéreux (barre foncée). Dans tous les cas, les taux d'expression de HsGIP sont supérieurs dans les tissus cancéreux. Exemple 9 : Induction de l'apoptose d'une cellule par inhibition de la protéine GIP Trois siRNA double brins ont été conçus puis commandés à la société Sigma. Les séquences sens sont respectivement :
GAACGUGGCUCCAAAUUCA GGACGUUCUGCUUGAGAUU
GAAUUAACCCAGAAGCUUU
Dans une plaque 12 puits, sont placées, au fond de chaque puits, des lamelles rondes stériles. Les cellules HeLa ou HEK 293 sont mises à cultiver dans 1 mL de milieu de culture constitué par du milieu modifié de Dulbecco (DMEM-Invitrogen™) supplémenté par 10% de sérum foetal de veau (FBS-Invitrogen™) pendant 24 heures à 37°C afin d'obtenir une confluence de 30 à 50%. Les cellules sont alors transfectées avec 2 μί de Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™) et 25 ou 100 nM final de siRNA selon le protocole du fournisseur. Le milieu de culture est changé 24 h après transfection par du milieu frais (DMEM, 10% FBS) puis les cellules sont encore laissées 24 heures supplémentaires en culture. Le milieu est alors éliminé puis remplacé par la solution de fixation à 37°C constituée par du tampon PBS + 4% formaldéhyde. Cette solution est remplacée 15 minutes plus tard par une solution de PBS-borohydrure de sodium (1 mg/mL) pendant trois fois 10 minutes. Après un dernier rinçage au PBS, les lames sont utilisées pour visualisation au microscope en présence de DAPI afin d'observer le matériel chromosomique et les figures d'apoptose (voir figure 23). Sur cette figure, est illustré l'introduction de siRNA dans des cellules HeLa :
23A. Contrôle sans siRNA.
23B. Contrôle négatif siRNA.
23C, 23E. Deux SiRNA dans la séquence codante d'HsGIP sur cellules Hek 293. 22D, 23F. Les mêmes siRNA dans la séquence codante d'HsGIP sur cellules HeLa. On peut constater que les noyaux des cellules sont fortement fragmentés, le cytosquelette microtubulaire ne se forme plus et que les cellules meurent.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°1 :
[MILVT]-X-X-X-[LV]-X-X-X-[LIVF]-[DTS]-X-X-X-[LIFVM]-X-X-[CLIAVF]-[ILVME]-X- [LMFVA]-X-X-X-G-X-X-[PGA]-X-X-[LIV]-[VIAS]-X-[VILAW]-[VIFLG]
2. Polypeptide isolé selon la revendication 1 , dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°2:
[LVIA]-X-X-[ILVMT]-[SAN]-X-[ILYVM]-[LV]-X-X-[GDNQ]-[LIV]-[DTS]-X-X-X-[LIFVM]-X- X-[CLI A]-[VLI]-X-[LM]-X-X-X-G-[VI A]-X-[PG]-X-X-[LI]-[ASV]-X-[VI LA]-[I VFL]-X-X-
[LIMVA]
3. Polypeptide isolé selon la revendication 2, dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence SEQ ID N°3 :
MASSSGAGAAAAAAAANLNAVRETMDVLLEISRILNTGLDMETLSICVRLCEQGINPE ALSSVIKELRKATEALKAAENMTS
4. Acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.
5. Acide nucléique isolé dont la séquence de nucléotides comprend la séquence SEQ ID N°4 :
ATGGCGAGTAGCAGCGGTGCTGGGGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCGGCGAATC TGAATGCGGTGCGGGAGACCATGGACGTTCTGCTTGAGATTTCAAGAATTTTGAA TACTGGCTTAGATATGGAAACTCTGTCTATTTGTGTACGGCTTTGTGAACAAGGAA TTAACCCAGAAGCTTTATCATCGGTTATTAAGGAGCTTCGCAAGGCTACTGAAGC ACTGAAGGCTGCTGAAAATATGACAAGCTGA
6. Méthode in vitro d'induction de l'apoptose chez une cellule, caractérisée en ce que en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est inhibée :
(i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1
(ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2
(iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°3
(iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3
(v) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite cellule.
7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la phosphorylation d'une des protéines (i) à (v) par une kinase Aurora est empêchée.
8. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (v) est inhibée.
9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'inhibition de l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (v) est obtenue par insertion d'une molécule d'ARN interférant (siRNA).
10. Molécule d'ARN interférant isolée comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5.
1 1. Molécule d'ARN interférant isolée comprenant un brin d'ARN choisi parmi les séquences suivantes :
- GAACGUGGCUCCAAAUUCA (SEQ ID N°6),
UGAAUUUGGAGCCACGUUC (SEQ ID N°7),
GGACGUUCUGCUUGAGAUU (SEQ ID N°8),
AAUCUCAAGCAGAACGUCC (SEQ ID N°9),
GAAU U AACCCAGAAGCU U U (SEQ ID N°10), et
- AAAGCUUCUGGGUUAAUUC (SEQ ID N°1 1 ).
12. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la molécule d'ARN interférant est une molécule selon la revendication 10 ou 1 1.
13. Molécule d'ARN interférant isolée selon la revendication 10 ou 1 1 , pour une utilisation comme médicament.
14. Utilisation d'une molécule d'ARN interférant selon la revendication 10 ou 1 1 , pour la fabrication d'un médicament contre le cancer, en particulier le cancer du col de l'utérus, du sein, du colon, du cerveau.
15. Composition pharmaceutique comportant une molécule d'ARN interférant selon l'une quelconque des revendications 10 ou 1 1 , avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
16. Polypeptide isolé selon la revendication 1 , comprenant la séquence SEQ ID N°12:
[RK]-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-[AVT]-[FIH]-X-[MI]-[SA]-[NQS]-[ILFVM]-[LV]- [DENQG]-X-G-[LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-X-G-X- N-P-[EDG]-[ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-[RQGS]
17. Polypeptide isolé selon la revendication 16, comprenant la séquence SEQ ID
N°13 :
K-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-A-[FIH]-Q-[MI]-[SA]-[NQS]-[IL]-[LV]-[DE]-T-G-[LI]- D-R-H-T-L-[STA]-[IVL]-[LI]-M-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-R-G-[AT]-N-P-[EDG]-[ASV]- [LVI]-[AV]-[AV]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-S-S-[AT]-A-P-P
18. Polypeptide isolé selon la revendication 16, comprenant la séquence SEQ ID
N°14 : [RK]-D-[SA]-L-[ED]-[LVIA]-[AVT]-[FIH]-H-M-[SA]-[NQS]-[ILFVM]-[LV]-[DENQG]-X-G- [LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[ED]-L-G-X-N-P-[EDG]- [ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-R-[RQ]-E-[NTS]-P
19. Acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°12, SEQ ID N°13 ou SEQ ID N°14
20. Plante génétiquement modifiée caractérisée en ce que la fonction d'une protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) est totalement inhibée et la fonction d'une seconde protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) est partiellement inhibée :
(i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°12
(ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°13
(iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°14
(iv) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°15
(v) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°16
(vi) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins
40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°15
(vii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°16
(viii) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite plante de type sauvage.
21. Plante génétiquement modifiée selon la revendication 20, dans laquelle l'expression des gènes codant pour les deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée.
22. Plante génétiquement modifiée selon la revendication 20 ou 21 , dans laquelle le gène codant pour la protéine totalement inhibée est muté.
23. Partie d'une plante génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 20 à 22.
24. Méthode de production d'une plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comporte l'inhibition de la fonction de deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii), l'une de ces fonctions étant totalement inhibée et l'autre étant partiellement inhibée :
(i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°12
(ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°13
(iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°14
(iv) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°15 (v) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°16
(vi) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°15
(vii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°16
(viii) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite plante de type sauvage.
25. Méthode de production selon la revendication 24, dans laquelle l'expression des gènes codant pour les deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée.
26. Méthode de production selon la revendication 24 ou 25, dans laquelle le gène codant pour la protéine totalement inhibée est muté.
27. Méthode de production selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, dans laquelle l'inhibition partielle de la fonction de la protéine est régulée de manière à cibler sélectivement un organe de la plante et/ou un stade du développement de celle-ci.
28. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, pour accroître la taille d'une plante ou d'une partie de la plante.
PCT/FR2011/050050 2010-01-12 2011-01-12 Proteines interagissant avec gcp3 et applications WO2011086322A1 (fr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1050189 2010-01-12
FR1050189A FR2955013A1 (fr) 2010-01-12 2010-01-12 Methode pour accroitre la taille d'une plante ou partie de plante
FR1053378A FR2955114A1 (fr) 2010-01-12 2010-04-30 Proteines interagissant avec gcp3 et applications
FR1053378 2010-04-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011086322A1 true WO2011086322A1 (fr) 2011-07-21

Family

ID=42670644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2011/050050 WO2011086322A1 (fr) 2010-01-12 2011-01-12 Proteines interagissant avec gcp3 et applications

Country Status (2)

Country Link
FR (2) FR2955013A1 (fr)
WO (1) WO2011086322A1 (fr)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001029221A2 (fr) * 1999-10-20 2001-04-26 Zymogenetics, Inc. Nouvelles proteines et polynucleotides codant ces proteines
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
EP1586645A2 (fr) * 1999-02-25 2005-10-19 Ceres Incorporated Fragments d'ADN avec des séquences déterminées et polypeptides encodées par lesdits fragments
US20060107345A1 (en) * 2003-09-30 2006-05-18 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1586645A2 (fr) * 1999-02-25 2005-10-19 Ceres Incorporated Fragments d'ADN avec des séquences déterminées et polypeptides encodées par lesdits fragments
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
WO2001029221A2 (fr) * 1999-10-20 2001-04-26 Zymogenetics, Inc. Nouvelles proteines et polynucleotides codant ces proteines
US20060107345A1 (en) * 2003-09-30 2006-05-18 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProt [online] 20 May 2008 (2008-05-20), XP002615070, Database accession no. q08ag7 *
JANSKI N ET AL: "Identification of a novel small Arabidopsis protein interacting with gamma-tubulin complex protein 3", CELL BIOLOGY INTERNATIONAL, ACADEMIC PRESS, GB LNKD- DOI:10.1016/J.CELLBI.2007.11.006, vol. 32, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), pages 546 - 548, XP022681976, ISSN: 1065-6995, [retrieved on 20071121] *
JANSKI N: "Étude du mécanisme de nucléation des microtubules chez les plantes supéreures :caractérisation des protéines GCPs et GIPs d'Arabidopsis thaliana", THESIS,, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 225PP, XP009143849 *
JANSKI NATACHA: "Etude du mecanisme de nucleation des microtubules chez les plantes superieures: caracterisation des proteines GCPs et GIPs d'Arabidopsis thaliana", 21 April 2008 (2008-04-21), XP002615069, Retrieved from the Internet <URL:http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:8080/922/> [retrieved on 20101221] *
NAGATA ET AL., INT. REV. CYTOL., vol. 132, 1992, pages 1 - 30

Also Published As

Publication number Publication date
FR2955114A1 (fr) 2011-07-15
FR2955013A1 (fr) 2011-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chang et al. Hair, encoding a single C2H2 zinc‐finger protein, regulates multicellular trichome formation in tomato
ES2955100T3 (es) Gen modificado que da como resultado el cuajado de frutos partenocárpico
ES2502415T3 (es) Protección de proteínas KRP mutantes negativas dominantes contra la inhibición activa del complejo ciclina-CDK por parte de KRP de tipo salvaje
ES2863223T3 (es) Composiciones y procedimientos para alterar la floración y arquitectura de las plantas para mejorar el potencial de rendimiento
JP2019503187A (ja) 圃場栽培植物体におけるカドミウム蓄積の低減
CN107250355A (zh) 烟草植物中腋芽生长的遗传控制
KR20140068008A (ko) ACCase 억제인자에 대해 저항성인 벼를 생산하는 조성물 및 방법
CN109134632A (zh) 调控植物根发育的蛋白及其编码基因和应用
CN108463103A (zh) 烟草黄连素桥酶样核酸的靶向诱变
Betsch et al. TCTP and CSN4 control cell cycle progression and development by regulating CULLIN1 neddylation in plants and animals
Li et al. A calcium-dependent protein kinase, ZmCPK32, specifically expressed in maize pollen to regulate pollen tube growth
US9901047B2 (en) Solanum lycopersicum plants having pink fruits
CN106232818A (zh) 改良植株
CN114763375A (zh) 一种调控水稻籽粒品质的基因及其应用
ES2376003T3 (es) Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal.
ES2910505T3 (es) Gen de regulación de la partenocarpia y uso del mismo
CN108290934A (zh) 制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法
JP2017522053A (ja) 淡紅色で光沢のある果実を有するトマト植物
DK2992756T3 (en) Reduced onions that do not generate tear-inducing component
WO2011086322A1 (fr) Proteines interagissant avec gcp3 et applications
CN110241130A (zh) 控制植物粒数和粒重的gsn1基因、编码蛋白及其应用
KR20180093477A (ko) 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법
CN114828621A (zh) 具有番茄斑萎病毒抗性的茄科植物、茄科植物细胞及茄科植物的制作方法
JP5637348B2 (ja) イネ雑種弱勢原因遺伝子ｈｗｃ１、ｈｗｃ２を利用した雑種弱勢の人為的誘導
EP2900817B1 (fr) Plants de solanum lycopersicum présentant des modifications non transgéniques dans le gène acs4

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11705013

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11705013

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1