ES2955100T3 - Gen modificado que da como resultado el cuajado de frutos partenocárpico - Google Patents
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Abstract
Gen PIN4 modificado, cuyo tipo salvaje es el identificado en SEQ ID No. 1, que codifica la proteína de SEQ ID No. 5, o cuyo tipo salvaje codifica una proteína que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID No. 5, cuyo gen PIN4 modificado codifica una proteína que comprende un cambio de aminoácido como resultado de la modificación, y cuya proteína modificada es capaz de inducir el cuajado de frutos partenocárpicos cuando está presente en una planta. La invención también se refiere a plantas y frutos que portan el gen. Estas plantas son capaces de producir frutos partenocárpicos y los frutos no contienen semillas. La invención se refiere además al uso del gen en el mejoramiento y producción de plantas capaces de producir frutos partenocárpicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Gen modificado que da como resultado el cuajado de frutos partenocárpico
La presente invención se refiere a un gen modificado que puede inducir partenocarpia. La invención se refiere además al uso del gen modificado para inducir partenocarpia en una planta, a métodos para obtener un gen modificado y al uso de marcadores para identificar tal gen modificado.
La invención también se refiere a plantas que tienen un gen modificado que puede inducir partenocarpia, así como a métodos para obtener tales plantas y a métodos para obtener frutos partenocárpicos.
Por lo general, se forma un fruto en una planta después de la polinización del estigma y la posterior fertilización de los óvulos. El éxito de la polinización y la fertilización que da como resultado el cuajado de semillas y el desarrollo de frutos está regulado por un proceso complejo en el que diversos factores endógenos como hormonas, hidratos de carbono y diversas enzimas desempeñan un papel importante. Las hormonas clave que se sabe que están implicadas en este mecanismo son, por ejemplo, fitocininas, ácido abscísico, etileno, auxinas, brasinoesteroides y giberelinas. La relevancia de cada hormona puede variar mucho entre las diferentes especies de plantas.
El cuajado de semillas y el desarrollo de frutos son procesos vegetales fundamentales y estrechamente interconectados. Por lo tanto, la formación de frutos en la mayoría de los casos requiere la fertilización como desencadenante de la iniciación, y los factores endógenos que controlan y guían estos procesos interactúan estrechamente. Lo más probable es que la razón detrás de esta dependencia sea que una función principal del fruto es proteger las semillas y los embriones durante su desarrollo. Además, el desarrollo de frutos requiere una gran cantidad de energía, que se desperdiciaría biológicamente si no se desarrollaran las semillas. Además, los frutos sirven como una forma de facilitar la dispersión de semillas maduras, cuando, por ejemplo, los frutos comestibles son consumidos por animales y seres humanos.
Además de los factores endógenos que afectan al cuajado de semillas y al desarrollo de frutos, los factores exógenos o ambientales también desempeñan un papel importante. Las temperaturas extremas, la sequía, la gran cantidad de humedad, la duración del día y la disponibilidad de nutrientes, así como la presencia de insectos y enfermedades pueden influir en el desarrollo adecuado de las flores, la formación de gametos, la polinización, la fertilización y el desarrollo de frutos y semillas. Un productor que depende de la cantidad de frutos para obtener un rendimiento rentable puede enfrentarse a una reducción de los ingresos cuando alguno de estos factores no es el óptimo. Dado que la falta de polinización, fertilización y/o desarrollo de semillas en la mayoría de los cultivos no dará como resultado el crecimiento de los frutos, las condiciones favorables durante el desarrollo temprano del fruto son esenciales para obtener un rendimiento óptimo.
En varios cultivos se ha intentado obtener frutos sin semillas, ya que generalmente es una característica muy deseable y apreciada por los consumidores. Además, la posibilidad de obtener frutos sin semillas también puede ser ventajosa para los productores, ya que se vuelven menos dependientes de las circunstancias ambientales. Los frutos sin semillas también pueden ser una gran ventaja para la industria de procesamiento, ya que no es necesario quitar las semillas de los frutos durante el proceso de procesamiento. Obviamente, el desarrollo de frutos sin semillas no es un objetivo fácil, ya que estos frutos carecen de la fertilización y la formación de semillas que son los desencadenantes comúnmente reconocidos para el inicio del desarrollo de los frutos.
Sin embargo, en algunos cultivos se ha alcanzado este objetivo. Para algunos cultivos es posible inducir el desarrollo de frutos partenocárpicos mediante la aplicación exógena de reguladores de crecimiento, como auxina, fitocinina o ácido giberélico. Sin embargo, esto tiene diversos aspectos negativos, ya que aumenta los costos, puede dar como resultado la deformación de los frutos u otros defectos, y no siempre es apreciado por los consumidores. Además, esta inducción exógena de partenocarpia solo funcionará en ciertos cultivos.
Otra forma de obtener frutos sin semillas es mediante el uso de triploides, que es el método común en, por ejemplo, el plátano y la sandía. Sin embargo, esto complica el mejoramiento ya que se necesita la reproducción vegetativa (plátano) o el uso de progenitores tetraploides (sandía). Además, se requiere la polinización en la sandía para inducir el desarrollo del fruto.
Otra opción para obtener frutos sin semillas es utilizar o modificar la capacidad genética de un cultivo para la partenocarpia, que es la capacidad de cuajar frutos sin polinización ni fertilización. Esto se ha explotado con éxito en pepino, cítricos y ciertos tipos de uvas, y también es una posibilidad en tomate. Cuando se poliniza el estigma de una planta que tiene la capacidad de partenocarpia facultativa, el fruto todavía cuajará semillas, pero sin polinización se desarrollarán frutos sin semillas. En una planta con partenocarpia obligada, incluso la polinización no dará como resultado el cuajado de semillas. Cuando el objetivo de tener partenocarpia es obtener frutos sin semillas, en lugar de obtener frutos en condiciones ambientales difíciles, se debe encontrar un medio para prevenir la polinización. La prevención de la polinización se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de plantas exclusivamente femeninas, la autoincompatibilidad o la esterilidad masculina.
En ciertos cultivos, el deseo de desarrollar frutos sin semillas tiene una alta prioridad, pero hasta ahora no ha sido posible lograr esta ambición utilizando una base genética. Uno de estos cultivos es el melón, Cucumis melo, que comprende muchos tipos de frutos. Las plantas de Cucumis melo muestran diversos fenotipos de expresión sexual que van desde todos femeninos hasta todos hermafroditas, siendo los más comunes monoicos y andromonoicos. Desafortunadamente, a diferencia de las especies relacionadas Cucumis sativus, no se ha encontrado partenocarpia natural. Cucumis sativus y Cucumis melo, sin embargo, no se pueden cruzar entre sí para, por ejemplo, introgresar la partenocarpia del pepino al melón.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar una base genética que conduzca a la inducción de partenocarpia en una planta.
Durante la investigación que condujo a la presente invención, se produjo una planta mutante de Cucumis melo que mostró cuajado de frutos partenocárpico. Se descubrió que esta partenocarpia era el resultado de una mutación en el gen PIN4.
Por lo tanto, la invención se refiere a un gen PIN4 modificado, cuyo tipo silvestre es como se identifica en Id. de sec. n.° 1, que codifica la proteína de Id. de sec. n.° 5, o cuyo tipo silvestre codifica una proteína que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80 % con Id. de sec. n.° 5, gen PIN4 modificado que codifica una proteína que comprende una sustitución de aminoácidos no conservadora, sustitución de aminoácidos no conservadora que es una sustitución de un aminoácido cargado negativamente o no cargado por un aminoácido cargado positivamente, de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido polar no cargado por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido no hidrófobo, o de un aminoácido cargado negativamente por un aminoácido cargado positivamente o no cargado, en el bucle intracelular de la estructura proteica como resultado de la modificación, y proteína modificada que puede inducir el cuajado de frutos partenocárpico cuando está presente en una planta. El cambio de aminoácidos se compara con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína.
En una realización, la similitud de secuencia de la proteína de tipo silvestre codificada es, en orden de mayor preferencia, al menos del 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %. El experto en la técnica está familiarizado con los métodos para el cálculo de la similitud de secuencias. La similitud de secuencia adecuada se calcula utilizando la herramienta Sequence Identities And Similarities (SIAS), a la que se puede acceder en imed.med.ucm.es/Tools/sias. Para el cálculo de la similitud se tuvo en cuenta la similitud por defecto de los aminoácidos tal como se indica en el diagrama de dicho sitio, utilizando agrupaciones de aminoácidos en función de sus propiedades físico-químicas.
La invención se refiere además a un gen PIN4 modificado, cuyo tipo silvestre codifica una proteína como se identifica en Id. de sec. n.° 5, o Id. de sec. n.° 12, o Id. de sec. n.° 13, o Id. de sec. n.° 14, o Id. de sec. n.° 15, o Id. de sec. n.° 16, gen modificado que codifica una proteína modificada que comprende un cambio de aminoácidos en el bucle intracelular de la estructura proteica como resultado de la modificación, proteína alterada que puede inducir el cuajado de frutos partenocárpico cuando está presente en una planta.
La familia de proteínas PIN-FORMED (PIN) es un grupo de proteínas de transporte de salida de auxina que regulan la salida de auxina de la célula y, por lo tanto, son esenciales para la distribución temporal y espacial de la auxina durante diversos procesos en el desarrollo de la planta. La familia de proteínas PIN se ha estudiado en diversos cultivos, a partir de los cuales se hizo evidente que los genes PIN están involucrados en diferentes procesos de desarrollo, incluida la embriogénesis, la morfogénesis de brotes y raíces y las respuestas trópicas.
Se demostró que silenciar o regular por disminución los ortólogos de genes PIN puede tener diferentes efectos en diferentes especies de cultivos. El co-silenciamiento mediado por iARN de SlPIN3 y PIN4 en Solanum lycopersicum dio como resultado un fuerte efecto sobre el fenotipo vegetativo de la planta, mientras que no se encontraron efectos importantes sobre el desarrollo del fruto (Pattison y Catala, The Plant Journal (2012) 70, 585-598. Evaluating auxin distribution in tomato (Solanum lycopersicum) through an analysis of the PIN and AUX/LAX gene families. Blackwell Publishing Ltd.). Otro estudio mostró que la regulación por disminución de la expresión de SIPIN4, que es el gen PIN más expresado en ovarios y frutos de Solanum lycopersicum, dieron como resultado la partenocarpia obligatoria o facultativa (Mounet y col., Journal of Experimental Botany, 2012. Down-regulation of a single auxin efflux transport protein in tomato induces precocious fruit development. Disponible en línea en www.jxb.oxfordjournals.org). Sin embargo, un estudio anterior indicó que mutantes de AtPIN1 o AtPIN3 en Arabidopsis, que se establecen para ser los genes PIN que se expresan más en ovarios de Arabidopsis, no condujo a un fenotipo partenocárpico.
Cucumis melo es un cultivo en el que el cuajado de frutos partenocárpico no puede ser inducido fácilmente por la aplicación exógena de auxina. Por lo tanto, no se esperaba que una sola mutación en un regulador de salida de auxina condujera directamente a la inducción del cuajado de frutos partenocárpico. La mutación que se identificó según la invención mostró de forma muy sorprendente un cuajado de frutos partenocárpico notablemente agradable.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un gen PIN4 modificado que cuando está presente en el genoma conduce a un cambio de aminoácidos en su proteína codificada, proteína modificada que conduce a la inducción de partenocarpia cuando está presente en una planta.
En esta solicitud, el término “ modificación” o “ modificado” se refiere a un cambio en la secuencia codificante del gen PIN4 de tipo silvestre que conduce a una versión modificada o alterada del gen de tipo silvestre. El cambio en la secuencia codificante conduce a su vez a un cambio de aminoácidos en la proteína codificada y, por lo tanto, a una proteína PIN4 modificada. Como se usa en el presente documento, “ tipo silvestre” se refiere a la forma de un organismo, cepa, gen, característica o rasgo tal como ocurriría en la naturaleza, y contrasta con la forma mutada o modificada, por ejemplo.
Las proteínas PIN se pueden dividir en dos tipos, comúnmente denominadas proteínas PIN “ largas” y “ cortas” . La característica estructural común de las proteínas PIN es la presencia de dos dominios transmembrana hidrófobos que están separados por un bucle hidrofílico intracelular. La longitud del bucle determina el tipo de PIN, por lo que el bucle es mucho más largo para las proteínas PIN “ largas” en comparación con las proteínas PIN “ cortas” .
La estructura y secuencia de los dominios transmembrana está altamente conservada entre todas las proteínas PIN. Sin embargo, la secuencia y estructura del bucle muestra más variación, aunque también en el bucle se pueden identificar tramos conservados de residuos de aminoácidos. Esta conservación y variación es la base para la agrupación de proteínas PIN en ocho grupos. PIN4 pertenece a los tipos de proteínas PIN “ largas” y se agrupa en el grupo 7, al que también pertenecen PIN3 y PIN7 (Krecek y col., Genome Biology 2009, 10:249. The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. BioMed Central Ltd. Disponible en línea en genomabiology.com/2009/10/12/249).
En general, el bucle intracelular de la proteína PIN4 comienza aproximadamente en la posición de aminoácido 150 y termina aproximadamente en la posición de aminoácido 500. El bucle intracelular de Id. de sec. n.° 5 y las Id. de sec. n.° 12-16 en particular comienza en la posición 153. El bucle intracelular de las Id. de sec. n.° 5 y 12 termina en la posición 496. El bucle intracelular de Id. de sec. n.° 13 termina en la posición 501, el bucle intracelular de Id. de sec. n.° 14 termina en la posición 509, el bucle intracelular de Id. de sec. n.° 15 termina en la posición 510 y el bucle intracelular de SEQ ID NO. 16 termina en la posición 513.
Durante la investigación que condujo a la presente invención, se identificó una serie de mutaciones de SNP inducidas por EMS en el gen PIN4 de Cucumis melo. Cinco de los SNP identificados dieron como resultado un cambio de aminoácidos en la proteína y uno dio como resultado un codón de PARADA (Tabla 1).
Tabla 1: Mutaciones de SNP de PIN4 y el efecto sobre la secuencia de proteína PIN4 codificada. Las posiciones son como en las secuencias de Cucumis melo, Id. de sec. n.° 1 (ADN genómico (ADNg) de CmPIN4 de tipo silvestre), Id. de sec. n.° 2 (secuencia de ADN codificante (CDS) de CmPIN4 de tipo silvestre) e Id. de sec. n.° 5 (proteína CmPIN4 de tipo silvestre)
El fenotipado de plantas de C. melo que comprenden estas y otras mutaciones de SNP se realizó en el invernadero (Ejemplo 2). Se evitó la polinización, para poder observar cuajado de frutos partenocárpico. Inicialmente se observó que dos de los SNP inducidos que se enumeran en la Tabla 1 dio como resultado un cuajado de frutos partenocárpico en ausencia de polinización. El cuajado de frutos partenocárpico se encontró en la planta con ID 320, que comprendía el SNP de C a T en la posición 997 del ADNg, correspondiente a la posición 497 de la CDS, y para la planta con ID 431, que comprendía el SNP de G a A en la posición 1740 del ADNg, correspondiente a la posición 1240 de la CDS. Durante el posterior fenotipado, también se encontró cuajado de frutos partenocárpico en la planta con ID 363, que comprende un SNP de C a A en la posición 1384 del ADNg, correspondiente a la posición 884 de la CDS (Tabla 1; Figura 1, Id. de sec. n.° 3 y 4, e Id. de sec. n.° 17).
Dicho SNP de C a T da como resultado un cambio de aminoácidos de prolina (P) a leucina (L) en la posición 166 de la proteína CmPIN4 de tipo silvestre. Dicho SNP de G a A da como resultado un cambio de aminoácidos de ácido glutámico (E) a lisina (K) en la posición 414 de la proteína CmPIN4 de tipo silvestre. Dicho SNP de C a A da como resultado un cambio de aminoácidos de serina (S) a tirosina (Y) en la posición 295 de la proteína CmPIN4 de tipo silvestre (Figura 2, Id. de sec. n.° 5-7 e Id. de sec. n.° 18).
En una realización, la invención proporciona un gen PIN4 modificado que tiene un cambio de aminoácidos en el bucle intracelular de la proteína PIN4 como resultado de la modificación, proteína alterada que conduce a la inducción de partenocarpia en una planta. La invención también se refiere a la proteína modificada de dicho gen PIN4 modificado. En una realización, el cambio de aminoácidos en la proteína es un cambio que da como resultado una modificación de la estructura del bucle de la proteína PIN4, estructura proteica modificada que conduce a la inducción de partenocarpia en una planta. Se espera que la estructura de la proteína modificada afecte la funcionalidad de la proteína, dando como resultado de ese modo la inducción de la partenocarpia.
En una realización particular, el cambio de aminoácidos en la proteína es un cambio de un aminoácido no cargado o cargado negativamente a un aminoácido cargado positivamente.
En otra realización, el cambio de aminoácidos en la proteína es un cambio de un aminoácido no hidrófobo no cargado a un aminoácido hidrófobo.
Ciertas sustituciones de aminoácidos producen un cambio conservador, lo que significa que dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden realizar sobre la base de propiedades químicas, por ejemplo, similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia o la naturaleza anfipática de los residuos, en cuyo caso la proteína resultante aún puede funcionar normalmente. La sustitución de aminoácidos puede ocurrir en una región de la proteína que no afecta significativamente la estructura o función de la proteína. Por el contrario, una sustitución de aminoácidos que se produce en una posición bien conservada o invariable que es esencial para la estructura y/o función de la proteína, o sustituciones con aminoácidos que no comparten propiedades químicas conservadas (por ejemplo, hidrófobos frente a cargados frente a polares), puede conducir a cambios de aminoácidos no conservadores.
Durante la investigación para esta invención, las modificaciones de proteínas que se identificaron y dieron como resultado el cuajado de frutos partenocárpico comprendían un cambio de aminoácidos en el bucle intracelular de la estructura proteica. Las otras dos sustituciones de aminoácidos también están ubicadas en el bucle de la proteína, pero parecen haber dado como resultado un cambio conservador, que no ha conducido a la inducción de la partenocarpia.
El cambio de aminoácidos de P a L en la posición 166 de la proteína CmPIN4 conduce a la alteración de un aminoácido altamente conservado en esta posición. Este aminoácido está posicionado al comienzo de la estructura del bucle y se sabe que la prolina es un factor importante en la determinación de la estructura de la proteína. Es muy probable que un cambio de aminoácidos en esta posición de como resultado un cambio en la estructura de la proteína, más específicamente en este caso en la estructura del bucle intracelular.
El cambio de aminoácidos de S a Y en la posición 295 de la proteína CmPIN4 conduce a la modificación de un aminoácido conservado al final de un tramo de aminoácidos altamente conservados en esta región. La modificación es un cambio de un aminoácido polar no cargado a un aminoácido hidrófobo.
Además, el cambio de aminoácidos de E a K en la posición de proteína 414 de la proteína CmPIN4 se distingue de los otros cambios de aminoácidos de Tabla 1 ya que se encuentra que los aminoácidos involucrados en esta modificación tienen residuos cargados de manera opuesta. Como resultado de esto, la carga del aminoácido en esta posición ha cambiado de negativa (E) a positiva (K). También es muy probable que un cambio de carga en el bucle o en esta zona del bucle tenga un efecto sobre la estructura 3D del bucle intracelular de la proteína PIN4.
El bucle es la parte principal de una proteína PIN que establece la interacción con sustratos u otras proteínas para realizar su función en los diversos procesos de desarrollo en los que está involucrada. No se espera que un cambio menor en esta estructura conduzca directamente a una regulación por disminución o al silenciamiento de la expresión o actividad génica. Sin embargo, es muy probable que un cambio en la estructura del bucle afecte la función de la proteína, por ejemplo, en el reconocimiento del sustrato o la interacción con otras proteínas en los procesos posteriores. Sin desear limitarse a la teoría, se espera por tanto que en los mutantes identificados un cambio en esta estructura de bucle haya conducido a una alteración en la función de la proteína, alteración que haya dado como resultado la inducción de partenocarpia. La alteración en la función de la proteína podría haber provocado, por ejemplo, una acumulación de auxina en los ovarios que estimula el desarrollo de los frutos.
Entre los aminoácidos, la lisina (K), la histidina (H) y la arginina (R) tienen carga positiva. Los aminoácidos cargados negativamente son el ácido glutámico (E) y el ácido aspártico (D); todos los demás aminoácidos no tienen carga. Cuando un aminoácido cargado negativamente, es decir, E o D, o un aminoácido no cargado, dentro del bucle
intracelular de una proteína PIN4 se altera en un aminoácido cargado positivamente, es decir, K, H o R, se predice que dará como resultado un cambio de estructura dentro del bucle de la proteína. El cambio de estructura afecta la función de la proteína, lo que en una planta de la invención da como resultado la inducción de partenocarpia.
En una realización, el cambio de aminoácidos de la proteína de la invención se logra mediante un solo SNP en el gen PIN4, y es en particular un cambio de prolina (P) a leucina (L), o un cambio de ácido glutámico (E) a lisina (K), o un cambio de serina (S) a tirosina (Y).
Como se mencionó anteriormente, la estructura de los dominios transmembrana está altamente conservada dentro de todas las proteínas PIN. Sin embargo, la secuencia y estructura del bucle también muestra tramos conservados. La identificación de ortólogos de PIN4 en diferentes cultivos y una alineación de secuencias múltiples de proteínas PIN ha revelado que los aminoácidos que se modificaron en esta invención están de hecho altamente conservados sobre todas las proteínas PIN ortólogas conocidas (resultados no mostrados), y en particular sobre todas las proteínas PIN4.
Un examen más detallado de la región de las posiciones 411 a 414 de Id. de sec. n.° 5 revela que las regiones correspondientes de todas las proteínas PIN4 ortólogas contienen un tramo de aminoácidos QNGE (Tabla 2, Id. de sec. n.° 8) o QNGD (Id. de sec. n.° 9), lo que significa que la carga en la posición 414 o la posición correspondiente en una proteína ortóloga siempre es negativa. Un cambio de aminoácidos en este tramo de E o D a un aminoácido cargado positivamente, preferiblemente de E a K (Id. de sec. n.° 10) o de D a H (Id. de sec. n.° 11), por lo tanto, dará como resultado un cambio en la estructura terciaria en este área de la proteína.
Tabla 2: Tramo de la secuencia de aminoácidos modificada y de tipo silvestre de PIN4 que da como resultado la partenocarpia
Por lo tanto, la invención en una realización se refiere a una proteína PIN4 que tiene un cambio de aminoácidos de E a K o de D a H en el tramo de aminoácidos QNGE o QNGD altamente conservado del bucle intracelular, proteína alterada que conduce a la inducción de partenocarpia cuando está presente en una planta. El tramo QNGE o QNGD se encuentra preferiblemente en las posiciones 411-414 de Id. de sec. n.° 5, mediante lo cual E está en la posición 414, o en las posiciones correspondientes de las proteínas ortólogas que tienen las Id. de sec. n.° 12-16 (Fig. 3). Las posiciones correspondientes son las siguientes: posiciones 411-414 de Id. de sec. n.° 12; posiciones 413-416 de Id. de sec. n.° 13; posiciones 417-420 de Id. de sec. n.° 14; posiciones 413-416 de Id. de sec. n.° 15; posiciones 416-419 de Id. de sec. n.° 16. Por lo tanto, la posición de E o D respectivamente en esas proteínas se refiere a 414 en Id. de sec. n.° 12; 416 en Id. de sec. n.° 13; 420 en Id. de sec. n.° 14; 416 en Id. de sec. n.° 15; 419 en Id. de sec. n.° 16 (Tabla 3).
En otra realización, la invención se refiere a una sustitución de aminoácidos no conservadora de prolina (P), preferiblemente de prolina en la posición 166 de la proteína CmPIN4 de Id. de sec. n.° 5, o en la posición 166 de una proteína ortóloga como se presenta en las Id. de sec. n.° 12-16. Preferiblemente, esta prolina conservada se sustituye por leucina, o cualquier otro cambio de aminoácidos no conservador que modificaría la estructura y/o la funcionalidad de la proteína PIN4 codificada. El experto en la técnica está familiarizado con sustituciones que serían cambios de aminoácidos no conservadores para un aminoácido dado.
Un análisis adicional de la región de aminoácidos de la mutación S a Y en la posición 295 de Id. de sec. n.° 5 reveló que en las secuencias de proteína PIN4 ortólogas en esta región se encuentra un tramo de aminoácidos casi idéntico que termina con SA, en las Id. de sec. n.° 5, 12 y 13, o CA en las Id. de sec. n.° 14, 15 y 16. En las Id. de sec. n.° 5, 12 y 13 se encuentra serina (S) en la posición 295. En las Id. de sec. n.° 14, 15 y 16 se encuentra cisteína (C) en la posición 290 de la proteína.
En una realización, la invención se refiere a una mutación que conduce a una sustitución de aminoácidos no conservadoras de serina (S) en la posición 295 de las Id. de sec. n.° 5, 12 o 13; o de cisteína (C) en la posición 290 de las Id. de sec. n.° 14, 15 o 16. La sustitución es preferiblemente por un aminoácido que tenga diferentes propiedades químicas, tal como un aminoácido hidrófobo o cargado. En una realización particular, la mutación conduce a una sustitución por tirosina (Y).
Tabla 3: Proteínas PIN4 y ejemplos de posiciones para mutaciones que dan como resultado un cuajado de frutos partenocárpico
La invención vincula por primera vez modificaciones genéticas del gen PIN4 per se a la inducción del cuajado de frutos partenocárpico. Si bien las mutaciones de PIN4 que se han identificado en el curso de esta investigación ilustran el efecto causal entre las mutaciones antes mencionadas del gen CmPIN4 y el rasgo de la invención, estas ciertamente no son las únicas mutaciones del gen PIN4 que conduciría a la característica de la invención y, por lo tanto, la invención no debería limitarse a estas mutaciones específicas sino extenderse a todas las demás modificaciones, en particular las mutaciones de la secuencia de ADN del propio gen PIN4 que conducen al mismo efecto de cuajado de frutos partenocárpico cuando se expresa en una planta.
La presente invención es ampliamente aplicable a todas las especies de plantas y cultivos que albergan un homólogo funcional del gen CmPIN4 en su genoma, es decir, un homólogo que realiza la misma función biológica o una similar. La identificación de ortólogos de PIN4, es decir genes PIN4 en otras especies, se puede realizar en muchos cultivos, cuyos métodos son conocidos en la técnica. En la presente investigación, se utilizó un programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) para comparar el ADN y la secuencia de proteínas de PIN4 de Cucumis melo frente a secuencias de otros genomas vegetales. Esto dio como resultado la identificación de un número de candidatos de genes ortólogos PIN4. Para algunas especies de plantas, las secuencias ortólogas de la proteína PIN4 fueron identificadas por Blast X o Blast P como mejores aciertos recíprocos a la secuencia de proteínas PIN4 de Cucumis melo. Las secuencias de proteínas de los ortólogos de PIN4 se identificaron a través de este método. Múltiples alineaciones de secuencias de las secuencias de proteínas usando CLUSTAL confirmaron que estas eran proteínas PIN4 ortólogas (Figura 4).
En una realización, la invención se refiere a versiones modificadas de los genes PIN4 de Cucumis melo, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum lycopersicum, Solanum melongena o Capsicum annuum, por lo que la versión modificada del gen PIN4 conduce a una proteína PIN4 modificada. En particular, la invención se refiere a un gen PIN4 modificado de Cucumis melo. Una vez que las secuencias de ADN de los genes PIN4 ortólogos y sus proteínas PIN4 codificadas se conocen, esta información puede usarse para modular o modificar las proteínas codificadas por dichos genes usando los métodos descritos en el presente documento.
En una realización, la invención se refiere a una planta que comprende el gen PIN4 modificado como se describe en el presente documento, planta que muestra el cuajado de frutos partenocárpico como resultado de la presencia de la proteína PIN4 modificada. El gen PIN4 modificado puede estar presente en forma heterocigota u homocigota.
En una realización, la planta que comprende el gen PIN4 modificado y/o la proteína PIN4 modificada de la invención, y que muestra cuajado de frutos partenocárpico, es una planta de la especie Cucumis melo, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum lycopersicum, Solanum melongena o Capsicum annuum. Preferiblemente, una planta de la invención es una planta de Cucumis melo.
Opcionalmente, una modificación del gen PIN4 y/o la proteína PIN4 como se describe en el presente documento pueden combinarse entre sí, o con otra modificación en el mismo gen o en otro gen para obtener el fenotipo partenocárpico.
Partenocarpia o cuajado de frutos partenocárpico como se usa en el presente documento en relación con una planta de la invención es el cuajado de frutos que se produce sin necesidad de polinización. Después de la polinización, una planta de la invención desarrolla preferiblemente semillas viables en el fruto. La partenocarpia de la invención es una forma de partenocarpia facultativa, que es ventajosa porque permite que se produzca la producción de semillas tras la polinización. La capacidad de cuajado de frutos partenocárpico significa que la planta puede desarrollar un fruto partenocárpico cuando una flor no está polinizada, pero puede desarrollar un fruto regular con semillas después de que haya tenido lugar la polinización.
La polinización se puede prevenir de diversas maneras. De las flores hermafroditas, o “ perfectas” , así como de las flores masculinas, las anteras pueden ser emasculadas. Las flores masculinas también se pueden eliminar parcial o completamente para dar como resultado la no funcionalidad de las anteras. Alternativamente, se puede usar o inducir
la esterilidad masculina, que puede ser esterilidad masculina genética, esterilidad masculina citoplásmica, esterilidad masculina posicional o funcional, o cualquier otra alternativa que dé como resultado la esterilidad masculina.
Para las flores femeninas en plantas ginoicas, es decir, totalmente femeninas, se debe tener cuidado de que no haya plantas de la misma especie con polen viable en las cercanías, y/o que no haya insectos polinizadores alrededor. En una situación particular, las flores o plantas femeninas pueden encerrarse o cultivarse en un entorno protegido para que el polen no pueda alcanzar el estigma y dar como resultado la polinización y la fertilización. En las plantas monoicas, que tienen flores masculinas y femeninas separadas, las flores femeninas pueden cubrirse o cerrarse para evitar la polinización, o las flores masculinas pueden emascularse o eliminarse.
La invención proporciona además una planta de Cucumis melo que comprende un gen PIN4 modificado y una proteína PIN4 modificada como se describe en el presente documento, en donde las flores femeninas cuajan frutos sin polinización. En una realización particular, las anteras o flores masculinas no se desarrollan ni abortan antes de la plena floración.
En una realización, la invención se refiere a una planta de Cucumis melo que comprende un gen PIN4 modificado, por lo que la modificación da como resultado una proteína PIN4 modificada, en particular una proteína PIN4 que tiene una modificación no conservadora en el bucle intracelular, cuya modificación da como resultado la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico.
En una realización, la invención se refiere a una planta de Cucumis melo que pude cuajar frutos partenocárpicamente como resultado de un SNP en el gen PIN4 en la posición 497 o en la posición 1240 o en la posición 884 de Id. de sec. n.° 2, en particular un SNP de C a T en la posición 497, o un SNP de G a A en la posición 1240, o un SNP de C a A en la posición 884.
En una realización, la invención se refiere a una planta de Cucumis melo que puede cuajar frutos partenocárpicamente como resultado de una proteína PIN4 que tiene una modificación en la posición 166 o la posición 295 o la posición 414 de Id. de sec. n.° 5, en particular una modificación de P a L en la posición 166 representada por Id. de sec. n.° 6, o una modificación de S a Y en la posición 295 representada por Id. de sec. n.° 18, o una modificación de E a K en la posición 414 representada por Id. de sec. n.° 7.
El gen PIN4 modificado de la invención se puede utilizar para la inducción de partenocarpia en una planta, en particular en una planta de la especie Cucumis melo, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum lycopersicum, Solanum melongena o Capsicum annuum, más particular en una planta de Cucumis melo.
Un gen PIN4 modificado puede introgresarse de una planta que comprende el gen PIN4 modificado en una planta que carece del gen PIN4 modificado pero que tiene otras características deseadas, utilizando cruces cuando las plantas son sexualmente compatibles, combinado opcionalmente con técnicas que ayudan al desarrollo de semillas viables o facilitan el desarrollo en una planta. El uso del gen PIN4 modificado de la invención comprende el uso mediante la introgresión del gen desde una planta donante que comprende el gen PIN4 modificado y que tiene la capacidad para el cuajado de frutos partenocárpico, en una planta receptora que carece del gen PIN4 modificado. La introgresión del gen PIN4 modificado conduce a la capacidad para el cuajado de frutos partenocárpico en la planta receptora.
El gen PIN4 modificado puede, por ejemplo, ser introgresado desde una planta de Cucumis melo que comprende el gen PIN4 modificado como se describe en el presente documento en una planta de Cucumis melo que carece del gen PIN4 modificado utilizando técnicas estándar de reproducción.
La selección de plantas que han obtenido el rasgo partenocárpico de la invención a partir de una planta portadora del gen PIN4 modificado se inicia en la F1 o en cualquier otra generación a partir de un cruce entre la planta receptora y una planta donante, de manera adecuada mediante el uso de un marcador molecular que se basa en la modificación del gen PIN4 que subyace al rasgo. El experto en la técnica está familiarizado con la creación y el uso de marcadores moleculares para identificar dichas modificaciones. En una realización particular, ejemplos de marcadores moleculares adecuados son marcadores para identificar el SNP C997>T997 o el Sn P G1740>A1740 o el SNP C1384>A1384 en el gen PIN4 de Cucumis melo según la Id. de sec. n.° 1. Tal marcador puede ser un marcador de SNP que comprenda el SNP que se va a identificar, o cualquier otro marcador molecular que el experto en la técnica pueda diseñar basándose en una modificación del genoma que subyace al rasgo. Otros marcadores moleculares usados rutinariamente para la identificación de variaciones o modificaciones del genoma son, por ejemplo, pero no se limitan a, RFLP, SSLP, AFLP, RAPD, VNTR, SSR, STR, DArT y marcadores RAD.
La invención también se refiere al uso de un marcador molecular para identificar una modificación en un gen PIN4 que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico en una planta, preferiblemente un marcador para identificar un SNP correspondiente a una sustitución de nucleótidos en la posición 497 o la posición 1240 o la posición 884 de Id. de sec. n.° 2, o para identificar un SNP que da como resultado un sustitución de aminoácidos en la posición 166 o posición 414 o posición 295 de Id. de sec. n.° 5, o un marcador para identificar un SNP que da como resultado una sustitución de aminoácidos en las posiciones correspondientes de las Id. de sec. n.° 12-16. Tal marcador puede ser un marcador molecular que comprenda el SNP que se va a identificar, u otro marcador que el experto en la técnica
pueda diseñar fácilmente cuando se conoce la posición de la modificación a identificar. En una realización particular, la invención se refiere al uso de un marcador basado en o que comprende SNP C997>T997 o SNP G1740>A1740 o SNP C1384>A1384 del gen CmPIN4, o basado en o que comprende SNP correspondientes en posiciones correspondientes de genes ortólogos como se identifican en el presente documento, que codifican las proteínas de las Id. de sec. n.° 12-16.
Alternativamente, la selección para el gen PIN4 modificado se inicia en la F2 o en cualquier otra generación de un cruce o, alternativamente, de un retrocruzamiento. La selección de plantas en la F2 se puede realizar opcionalmente de manera fenotípica basándose en la observación del cuajado de frutos partenocárpico, así como mediante el uso de marcador(es) molecular(es) que detecta(n) directa o indirectamente la modificación del gen PIN4 que subyace al rasgo.
La selección de plantas que tienen el gen PIN4 modificado, que cuando está presente de forma heterocigota u homocigota conduce a la inducción del cuajado de frutos partenocárpico, también puede iniciarse en la F3 o en una generación posterior.
Opcionalmente, el cruzamiento puede ir seguido de técnicas de rescate de embriones u otras técnicas que den como resultado una combinación e introgresión exitosas, técnicas que son conocidas por el experto en la técnica.
La invención también se refiere a un fruto producido por una planta de la invención, planta que comprende el gen PIN4 modificado como se describe en el presente documento. El fruto es adecuadamente un fruto sin semillas, que se ha desarrollado en una planta de la invención sin polinización, o alternativamente, un fruto con semillas que se ha desarrollado en una planta de la invención después de que haya tenido lugar la polinización. Las semillas de este fruto todavía comprenden el gen PIN4 modificado de la invención y por lo tanto también forman parte de la invención.
Como se usa en el presente documento, un fruto sin semillas es un fruto que se ha desarrollado sin que haya tenido lugar la polinización y, por lo tanto, no se han formado semillas viables en el fruto. En algunos casos, se pueden observar algunas semillas rudimentarias, pero dado que no se fertilizan, ya que no tuvo lugar la polinización, no son semillas debidamente desarrolladas y no germinarán cuando se siembren.
Un método para la producción de un fruto sin semillas, en particular un fruto sin semillas de Cucumis melo, puede comprender proporcionar una planta que tiene un gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico, hacer crecer dicha planta y permitir que el fruto se desarrolle sin polinización. El fruto producido y partes del fruto, opcionalmente en forma procesada, también forman parte de esta invención.
La invención también se refiere al uso de una planta de la invención que comprende un gen PIN4 modificado para la producción de frutos sin semillas, en particular para la producción de frutos sin semillas de Cucumis melo, en donde el fruto se desarrolla sin polinización.
Una planta de la invención que comprende un gen PIN4 modificado se puede utilizar como fuente de material de propagación.
Una planta de la invención que comprende un gen PIN4 modificado se puede utilizar en el fitomejoramiento.
Una célula de una planta como se reivindica puede estar en forma aislada o puede ser parte de la planta completa o partes de la misma. Tal célula alberga el gen PIN4 modificado que conduce a la inducción de la partenocarpia. Cada célula de una planta de la invención porta la información genética que conduce a la inducción de la partenocarpia. Tal célula también puede ser una célula regenerable que puede usarse para regenerar una nueva planta de la invención.
El tejido de una planta como se reivindica puede ser tejido no diferenciado o tejido ya diferenciado. Los tejidos no diferenciados son, por ejemplo, puntas de tallo, anteras, pétalos, polen y pueden usarse en micropropagación para obtener nuevas plántulas que se cultivan en nuevas plantas de la invención. El tejido también puede crecer a partir de una célula de la planta de la invención.
La invención según otro aspecto de la misma se refiere a la semilla, en donde la planta que se puede cultivar a partir de la semilla es una planta de la invención, que comprende el gen PIN4 modificado que conduce a la inducción de la partenocarpia. La invención también se refiere a semillas de una planta como se reivindica, que se pueden obtener después de la polinización. Las semillas albergan el gen PIN4 modificado que, cuando se cultiva una planta a partir de las semillas, convierte a esta planta en una planta de la invención.
La invención también se refiere a la descendencia de las plantas, células, tejidos y semillas de la invención, descendencia que comprende el gen PIN4 modificado que conduce a la inducción de la partenocarpia. Tal progenie puede ser en sí misma plantas, células, tejidos o semillas.
Como se usa en el presente documento, la palabra “ descendencia” pretende significar el primero y todos los demás descendientes de un cruce con una planta de la invención que tiene un gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico.
“ Descendencia” también incluye plantas que portan el gen PIN4 modificado de la invención y tienen el rasgo de la invención, y se obtienen de otras plantas o de la descendencia de las plantas de la invención mediante propagación o multiplicación vegetativa. La descendencia de la invención comprende adecuadamente el gen PIN4 modificado y la proteína PIN4 modificada y el rasgo de la invención.
El rasgo de la invención como se usa en el presente documento es la capacidad del cuajado de frutos partenocárpico sin polinización como resultado de la presencia de un gen PIN4 modificado y/o una proteína PIN4 modificada.
Las partes de una planta reivindicada que son adecuadas para la reproducción sexual se seleccionan, por ejemplo, del grupo que consiste en microsporas, polen, ovarios, óvulos, sacos embrionarios y ovocitos. Las partes de una planta reivindicada que son adecuadas para la reproducción vegetativa son, en particular, esquejes, raíces, tallos, células, protoplastos. Las partes de las plantas tal como se mencionan anteriormente se consideran material de propagación. La planta que se produce a partir del material de propagación comprende el gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico.
Un cultivo de tejido de una planta que porta el gen PIN4 modificado de la invención, que también es material de propagación. El cultivo de tejidos comprende células regenerables. Tal cultivo de tejidos puede seleccionarse o derivarse de cualquier parte de la planta, en particular de hojas, polen, embriones, cotiledón, hipocótilos, células meristemáticas, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, semillas y tallos. El cultivo de tejido se puede regenerar en una planta que porta el gen PIN4 modificado de la invención, cuya planta regenerada expresa el rasgo de la invención y también es parte de la invención.
La semilla híbrida se puede obtener mediante un método que comprende cruzar una primera planta progenitora con una segunda planta progenitora y cosechar la semilla híbrida resultante, en donde dicha primera planta progenitora y/o dicha segunda planta progenitora tiene el gen PIN4 modificado de la invención. La planta híbrida resultante que comprende el gen PIN4 modificado de la invención y que muestra el rasgo de la invención es también una planta de la invención.
En una realización, la planta de la invención que comprende el gen PIN4 modificado de manera homocigota o heterocigota es una planta de una línea endogámica, un híbrido, un haploide doble o una planta de una población segregante.
Un método para la producción de una planta que tiene el gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico puede comprender usar una semilla que comprende el gen PIN4 modificado para hacer crecer dicha planta.
Un método para la producción de semillas que comprende cultivar plantas a partir de semillas de la invención puede comprender permitir que las plantas produzcan semillas al permitir que ocurra la polinización y cosechar esas semillas. La producción de las semillas se realiza adecuadamente mediante cruce o autopolinización. Preferiblemente, las semillas así producidas tienen la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico en las plantas que crecen de las mismas.
Un método para la producción de una planta que tiene el gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico, puede comprender el uso de cultivo de tejidos de material vegetal que lleva el gen PIN4 modificado en su genoma.
Un método para la producción de una planta que tiene el gen PIN4 modificado que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico, puede comprender el uso de la reproducción vegetativa de material vegetal que lleva el gen PIN4 modificado en su genoma.
Un método para la producción de una planta que tiene el gen PIN4 modificado puede comprender el uso de una técnica de generación de doble haploide para generar una línea de doble haploide a partir de una planta que comprende el gen PIN4 modificado.
En una realización, la invención se refiere a un método para la producción de una planta que puede cuajar frutos partenocárpicamente, que comprende modificar el gen CmPIN4 de Id. de sec. n.° 1, o modificando un ortólogo de dicho gen PIN4 que codifica una proteína que tiene cualquiera de las secuencias que se encuentran en las Id. de sec. n.° 12-16, en donde la modificación conduce a una sustitución de aminoácidos no conservadora en el bucle intracelular de la proteína codificada, y cuya proteína modificada conduce a la inducción del cuajado de frutos partenocárpico. Dicha modificación puede dar lugar a una estructura modificada del bucle intracelular de la proteína y/o un cambio en la funcionalidad de la proteína, lo que dota a la planta de la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico.
La modificación del gen PIN4 puede introducirse mediante mutagénesis. La mutagénesis comprende la introducción aleatoria de al menos una modificación por medio de uno o más compuestos químicos, como metanosulfonato de etilo (EMS), nitrosometilurea, hidroxilamina, proflavina, N-metil-N-nitrosoguanidina, N-etil-N-nitrosourea, N-metil-N-nitronitrosoguanidina, sulfato de dietilo, etilenimina, azida de sodio, formalina, uretano, fenol y óxido de etileno, y/o por medios físicos, como radiación ultravioleta, exposición rápida a neutrones, rayos X, irradiación gamma, y/o por inserción de elementos genéticos, tales como transposones, ADN-T, elementos retrovirales. La mutagénesis también comprende la introducción más específica y dirigida de al menos una modificación por medio de recombinación homóloga, inducción de mutación basada en oligonucleótidos, nucleasas con dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) o sistemas de repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR).
En una realización, la invención se refiere a una planta que comprende el gen PIN4 modificado como se describe en el presente documento, por lo que el gen PIN4 modificado se obtiene y/o identifica mediante el uso de TILLING.
En una realización, el gen PIN4 modificado es un gen PIN4 exógeno que puede introducirse en una planta mediante un método transgénico o un método cisgénico. El uso de un gen PIN4 modificado de la invención para producir una planta que puede cuajar frutos partenocárpicamente comprende la introducción de un gen PIN4 exógeno modificado por un método transgénico o cisgénico.
Figuras
F igura 1: Secuencias de ADNg de tipo silvestre (Id. de sec. n.° 1) y CDS (Id. de sec. n.° 2) del gen PIN4 de Cucumis melo.
Id. de sec. n.° 3 muestra la CDS que tiene el SNP de C a T en la posición 497 (posición 997 del ADNg) de Cucumis melo.
Id. de sec. n.° 4 muestra la CDS que tiene el SNP de G a A en la posición 1240 (posición 1740 del ADNg) de Cucumis melo.
Id. de sec. n.° 17 muestra la CDS que tiene el SNP de C a A en la posición 884 (posición 1384 del ADNg) de Cucumis melo.
Figura 2: Secuencia de proteína de tipo silvestre (Id. de sec. n.° 5) de la proteína PIN4 de Cucumis melo. Id. de sec. n.° 6 proporciona la proteína modificada que tiene un cambio de aminoácidos de P a L en la posición 166. Id. de sec. n.° 7 proporciona la proteína modificada que tiene un cambio de aminoácidos de E a K en la posición 414. Id. de sec. n.° 18 proporciona la proteína modificada que tiene un cambio de aminoácidos de S a Y en la posición 295.
F igura 3: Secuencias de proteínas de las proteínas CmPIN4 ortólogas: Id. de sec. n.° 12: Cucumis sativus; Id. de sec. n.° 13: Citrullus lanatus; Id. de sec. n.° 14: Capsicum annuum; Id. de sec. n.° 15: Solanum melongena; Id. de sec. n.° 16: Solanum lycopersicum.
Figura 4: Secuencias de proteína PIN4 alineadas de Cucumis melo (melón) - Id. de sec. n.° 5; Cucumis sativus (pepino) - Id. de sec. n.° 12; Citrullus lanatus (sandía) - Id. de sec. n.° 13; Capsicum annuum (pimiento) - Id. de sec. n.° 14; Solanum melongena (berenjena) - Id. de sec. n.° 15; Solanum lycopersicum (tomate) - Id. de sec. n.° 16.
Los siguientes símbolos se utilizan debajo de la alineación:
* -- todos los residuos en esa columna son idénticos
: -- se han observado sustituciones conservadas
. -- se han observado sustituciones semi-conservadas
-- sin coincidencia (espacio)
F igura 5: Fruto de Cucumis melo sin semillas que resulta de una planta de Cucumis melo que tiene un gen PIN4 modificado. La Fig. 5a muestra un fruto cortado por la mitad; la Fig. 5b muestra una rodaja de un fruto sin semillas.
F igura 6: Identidad de secuencia y similitud de secuencia de las proteínas PIN4 de tipo silvestre de Cucumis melo (melón) - Id. de sec. n.° 5; Cucumis sativus (pepino) - Id. de sec. n.° 12; Citrullus lanatus (sandía) - Id. de sec. n.° 13; Capsicum annuum (pimiento) - Id. de sec. n.° 14; Solanum melongena (berenjena) - Id. de sec. n.° 15; Solanum lycopersicum (tomate) - Id. de sec. n.° 16. La identidad de secuencia se calcula utilizando un método que tiene en cuenta los espacios; la similitud de secuencia se basa en la agrupación de aminoácidos que tienen propiedades similares. Véase el método SIAS para ambas opciones.
Ejem plos
Ejemplo 1
Inducción de mutaciones de SNP en Cucumis melo por EMS
Se indujeron mutaciones de SNP en una población de plantas de Cucumis melo, con el objetivo de obtener frutos de melón partenocárpicos. Se separaron aproximadamente 10.000 semillas de un genotipo de melón en dos lotes, los cuales fueron tratados con diferentes dosis de EMS. Para un lote se utilizó una dosis del 1,0 % y para el otro lote del 1,5 % de EMS.
Se germinaron semillas y se seleccionaron 77 individuos de los cuales se hicieron esquejes para su posterior análisis. Se realizó el fenotipado (E jem plo 2) y se obtuvieron muestras de ADN para una mayor caracterización y validación de las mutaciones inducidas.
La caracterización de varias mutaciones inducidas mostró que seis de las mutaciones de SNP inducidas estaban ubicadas en el gen PIN4 (Tabla 1). Basándose en estas mutaciones, se desarrollaron marcadores de SNP para su posterior análisis.
Ejemplo 2
Fenotipado de plantas de Cucumis melo con mutaciones de PIN4
Se observaron esquejes de plantas que tenían mutaciones inducidas por EMS en el invernadero. El objetivo de este ensayo de fenotipado fue determinar la presencia de cuajado de frutos partenocárpico. Por lo tanto, se evitó la polinización de las flores femeninas.
En un primer ensayo de fenotipado en dos de los eventos mutantes, identificados por los números de planta 320 y 431 (Tabla 1), cada uno de los cuales estuvo representado por varios esquejes que tenían la misma mutación, se observó cuajado de frutos partenocárpico. Los frutos partenocárpicos mostraron un tamaño razonable y tenían un grado Brix muy bueno que oscilaba entre 9 y 15. Los frutos maduraron normalmente y tenían un sabor comparable al del progenitor original. Los frutos no polinizados no tenían semillas. Además, no se observó ninguna cavidad vacía en el lugar de la cavidad habitual de la semilla (F igura 5).
El fenotipado adicional de plantas mutantes también identificó el cuajado de frutos partenocárpico en esquejes de la planta identificada con el número 363 (Tabla 1).
Las flores femeninas de las plantas identificadas parecían desarrollarse normalmente. Las flores masculinas de esas plantas fueron abortadas o no se desarrollaron adecuadamente. Después de la polinización con polen del progenitor original, se desarrollaron frutos con semillas, lo que demuestra que estas plantas mutantes tienen partenocarpia facultativa.
Ejemplo 3
Mutaciones de PIN4 en Capsicum annuum
Una población de plantas de Capsicum annuum también se trató por EMS. Se tomó una muestra de ADN y se analizó específicamente para identificar mutaciones en el gen PIN4 de Capsicum annuum. Se identificaron varias mutaciones que dieron como resultado un cambio de aminoácido en el bucle intracelular de la proteína CaPIN4 como se presenta en Id. de sec. n.° 14 (F igura 3; Tabla 4). La presencia de la proteína modificada en una planta de Capsicum annuum produce partenocarpia.
Tabla 4: Mutaciones de SNP de PIN4 en Capsicum annuum y su efecto sobre la proteína PIN4 codificada
Claims (15)
1. Gen PIN4 modificado, cuyo tipo silvestre es como se identifica en Id. de sec. n.° 1, que codifica la proteína de Id. de sec. n.° 5, o cuyo tipo silvestre codifica una proteína que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80 % con Id. de sec. n.° 5, gen PIN4 modificado que codifica una proteína que comprende una sustitución de aminoácidos no conservadora, sustitución de aminoácidos no conservadora que es una sustitución de un aminoácido cargado negativamente o no cargado por un aminoácido cargado positivamente, de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido polar no cargado por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido no hidrófobo, o de un aminoácido cargado negativamente por un aminoácido cargado positivamente o no cargado, en el bucle intracelular de la estructura proteica como resultado de la modificación, y proteína modificada que puede inducir el cuajado de frutos partenocárpico cuando está presente en una planta.
2. Gen PIN4 modificado según la reivindicación 1, cuyo tipo silvestre codifica una proteína como se identifica en Id. de sec. n.° 5 o Id. de sec. n.° 12 o Id. de sec. n.° 13 o Id. de sec. n.° 14 o Id. de sec. n.° 15 o Id. de sec. n.° 16, gen modificado que codifica una proteína modificada que comprende una sustitución de aminoácidos no conservadora, sustitución de aminoácidos no conservadora que es una sustitución de un aminoácido cargado negativamente o no cargado por un aminoácido cargado positivamente, de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido polar no cargado por un aminoácido hidrófobo, de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido no hidrófobo, o de un aminoácido cargado negativamente por un aminoácido cargado positivamente o no cargado, en el bucle intracelular de la estructura proteica como resultado de la modificación, proteína alterada que puede inducir el cuajado de frutos partenocárpico cuando está presente en una planta.
3. Gen PIN4 modificado según la reivindicación 1 o 2, en donde la sustitución de aminoácidos de la proteína da como resultado un cambio en la estructura de la proteína, cambio en la estructura que conduce a la capacidad del cuajado de frutos partenocárpico cuando la proteína está presente en una planta.
4. Gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en donde la modificación da como resultado la sustitución del ácido glutámico por lisina, o la sustitución del ácido aspártico por histidina, y el gen modificado codifica en particular una proteína que tiene una sustitución de ácido glutámico en la posición 414 de Id. de sec. n.° 5, preferiblemente una sustitución de ácido glutámico por lisina que da como resultado Id. de sec. n.° 7, o la proteína codificada comprende una sustitución de ácido glutámico, preferiblemente una sustitución de ácido glutámico por lisina, en la posición 414 de Id. de sec. n.° 12, o en la posición 416 de Id. de sec. n.° 13, o la proteína codificada comprende una sustitución de ácido aspártico, preferiblemente una sustitución de ácido aspártico por histidina, en la posición 420 de Id. de sec. n.° 14, o en la posición 416 de Id. de sec. n.° 15, o en la posición 419 de Id. de sec. n.° 16; o
en donde la modificación da como resultado una sustitución de aminoácidos no conservadora de prolina, preferiblemente una sustitución de prolina por leucina, y el gen modificado codifica en particular una proteína que tiene una sustitución de prolina no conservadora en la posición 166 de Id. de sec. n.° 5, o de Id. de sec. n.° 12, o de Id. de sec. n.° 13, o de Id. de sec. n.° 14, o de Id. de sec. n.° 15, o de Id. de sec. n.° 16, sustitución que es preferiblemente una sustitución de prolina a leucina; o
en donde la modificación da como resultado una sustitución de aminoácidos no conservadora de serina o cisteína, preferiblemente la sustitución de serina o cisteína por tirosina, y el gen modificado codifica en particular una proteína que tiene una sustitución de serina no conservadora en la posición 295 de Id. de sec. n.° 5, o de Id. de sec. n.° 12, o de Id. de sec. n.° 13, sustitución que es preferiblemente una sustitución de serina a tirosina, o el gen modificado codifica una proteína que tiene una sustitución de cisteína no conservadora en la posición 290 de Id. de sec. n.° 14, o de Id. de sec. n.° 15, o de Id. de sec. n.° 16, sustitución que es preferiblemente una sustitución de cisteína a tirosina.
5. Planta que comprende un gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, planta que puede cuajar frutos partenocárpicamente como resultado de la presencia de la proteína modificada codificada por el gen PIN4 modificado, que es en particular una planta de cualquiera de las especies Cucumis melo, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum lycopersicum, Solanum melongena o Capsicum annuum, preferiblemente de la especie Cucumis melo.
6. Semilla que comprende un gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la planta que crece a partir de la semilla puede cuajar frutos partenocárpicamente como resultado de la presencia de la proteína modificada, que es en particular una semilla de cualquiera de las especies Cucumis melo, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum lycopersicum, Solanum melongena o Capsicum annuum, preferiblemente de la especie Cucumis melo.
7. Planta de Cucumis melo que comprende un gen PIN4 modificado que codifica una proteína PIN4 modificada, modificación que da como resultado la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico, en donde la proteína modificada está representada por Id. de sec. n.° 6, o por Id. de sec. n.° 7, o por Id. de sec. n.° 18.
8. Descendencia de una planta según la reivindicación 5 o 7, o de una semilla según la reivindicación 6, que comprende un gen PN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, planta descendiente que puede cuajar frutos partenocárpicamente como resultado de la presencia de la proteína modificada.
9. Método para la producción de un fruto sin semillas, en particular un fruto sin semillas de Cucumis melo, que comprende proporcionar una planta que tiene un gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, hacer crecer dicha planta y permitir que el fruto se desarrolle sin polinización.
10. Fruto sin semillas producido por el método según la reivindicación 9.
11. Fruto que comprende un gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el fruto es sin semillas o en donde el fruto tiene semillas como resultado de la polinización del estigma de una planta que comprende un gen PIN4 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
12. Uso de una planta según la reivindicación 5 o la reivindicación 7, o de la descendencia según la reivindicación 8, para la producción de un fruto sin semillas, en particular para la producción de un fruto sin semillas de Cucumis melo, en donde el fruto se desarrolla sin polinización.
13. Uso de un marcador molecular para identificar una modificación en un gen PIN4 que conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico en una planta, en donde el marcador es un marcador que comprende un SNP en la posición 497 o la posición 1240 o la posición 884 de Id. de sec. n.° 2, o un marcador que comprende un SNP en las posiciones correspondientes que codifican las proteínas de las Id. de sec. n.° 12-16, en donde en particular el SNP en la posición 497 es de C a T, el SNP en la posición 1240 es de G a A y el SNP en la posición 884 es de C a A.
14. Marcador molecular que comprende un SNP en la posición 497 o la posición 1240 o la posición 884 de Id. de sec. n.° 2, en particular un s Np en la posición 497 de C a T, un SNP en la posición 1240 de G a A o un SNP en la posición 884 de C a A.
15. Método para producir una planta que puede cuajar frutos partenocárpicamente, que comprende modificar el gen CmPIN4 de Id. de sec. n.° 1, o modificar un ortólogo de dicho gen PIN4 que codifica una proteína que tiene cualquiera de las secuencias que se encuentran en las Id. de sec. n.° 12-16, en donde la modificación conduce a una sustitución de aminoácidos no conservadora en el bucle intracelular de la estructura proteica de la proteína codificada, y la presencia de tal proteína modificada conduce a la capacidad de cuajado de frutos partenocárpico, en donde el gen PIN4 es en particular un gen endógeno.
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