CN108929916A

CN108929916A - 与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记及其应用与引物

Info

Publication number: CN108929916A
Application number: CN201810911614.3A
Authority: CN
Inventors: 陈学好; 何梦晓; 许学文; 齐晓花; 徐强
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2018-08-12
Filing date: 2018-08-12
Publication date: 2018-12-04

Abstract

本发明属于基因工程技术领域。与黄瓜单性结实基因QTL紧密连锁的InDel标记，命名为Chr7InDel01。Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处。本发明还提供了一组用于检测上述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对。本发明还提供了上述Chr7InDel01在黄瓜强/弱单性结实性品种鉴定中的应用。本发明运用变异组学与群体遗传学的方法获得了与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实品种选育的进程。

Description

与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记及其应用与引物

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，涉及一个与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记。

背景技术

黄瓜是我国主要的蔬菜作物之一，种植面积和产量均居世界第一。在设施栽培条件下，少或无虫媒和低温弱光会导致黄瓜授粉受精不良，结实率低下，降低早熟栽培或反季节栽培应有的效益。单性结实是指其子房不经过授粉受精或别的刺激而发育成果实的现象，强单性结实性黄瓜品系在不良环境中也可以获得稳定的结实率，而且单性结实的果实因不受精而无籽，瓜瓤偏少，果肉较厚，口感比有籽黄瓜好很多，其商品价值也高。有研究表明，黄瓜种子的发育对茎蔓的生长和后续的坐果有强烈的抑制作用，这样会导致黄瓜的光合面积减少，产量降低。因此，强单性结实性的种质资源是黄瓜良种选育的重要基础。

关于黄瓜单性结实QTL及分子标记的分析工作一直是研究的热点领域。陈学好等(2008)发现了一个与黄瓜非单性结实基因遗传连锁距离为18.9 cM的ISSR分子标记；闫立英(2009)以全雌黄瓜单性结实自交系‘6401’和非单性结实自交系‘6429’为亲本建立F₂分离群体，用BSA方法构建单性结实和非单性结实近等基因池，用两池DNA筛选了 76个ISSR引物，在单性结实池中扩增出一条分子量约为470bp的特异条带。经F₂单株验证，该特异条带能在大多数单性结实单株中稳定出现。用MapMaker3.0软件进行连锁分析表明，该特异带与黄瓜单性结实性存在连锁关系，遗传距离为22.5cM，将连锁标记命名为161470；王鱼等（2011）使用全雌黄瓜单性结实自交系‘6401’和非单性结实自交系‘6429’为亲本建立F₂分离群体，用BSA方法构建了单性结实和非单性结实基因池，对共386对SSR引物进行了多态性筛选。对表现多态性的SSR引物在F₂群体中进行验证，发现引物SSR22338是与单性结实QTL位点连锁的标记；武喆等（2015）综合重测序、SSR标记、转录组及qRT-PCR研究表明，黄瓜2号染色体上一个QTL区域可能与单性结实性状相关，其中五个基因被初步认定为是候选基因；Calvin D. Lietzow等（2016）在北美加工型黄瓜中利用SSR标记检测到6号和7号染色体上有3个稳定的QTLs。

发明内容

本发明提供了一个与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记及其应用与用于扩增上述InDel标记的引物对。本发明运用变异组学与群体遗传学的方法获得了与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实品种选育的进程。

本发明的第一个目的是提供一个与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记为Chr7InDel01，位于黄瓜第7号染色体4,108,811处。在双亲的Chr7InDel01处，父本（弱单性结实性黄瓜品系）有插入如下碱基：AAAATATTTACCAAAATTT，而母本（强单性结实性黄瓜品系）在此处的碱基仅为A。

本发明的第二个目的是提供一组用于检测上述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对，包括Chr7InDel01标记的上游引物5′-TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATG-3′，反向引物5′-CGATAATGACGTGGGTTGTG-3′。

本发明的第三个目的是公开了所述的InDel标记及其衍生的引物在黄瓜单性结实分子标记辅助育种中的应用：若在Chr7InDel01处有插入碱基‘AAAATATTTACCAAAATTT’的黄瓜品种，为弱单性结实性品种；若在Chr7InDel01处碱基仅为A的黄瓜品种，则为强单性结实性品种。

本发明所述的应用，具体方法是：

1）提取待检测黄瓜基因组DNA；

2）以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用Chr7InDel01的引物对进行PCR扩增反应；

3）经上述PCR扩增后电泳，如条带与‘ZK’一致，则为弱单性结实性黄瓜品系；如条带与‘BY’一致，则为强单性结实性黄瓜品系。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用变异组学与群体遗传学的方法获得与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实性品种选育进程。同时，此InDel标记也将为黄瓜单性结实基因精细定位、克隆和创新种质奠定重要的技术基础。

附图说明

图1是部分SSR标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；

图1中：P₁：弱单性结实性亲本‘ZK’，P₂：强单性结实性亲本‘BY’，M为20bp marker。

图2是SSR标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；

图2中：P₁：弱单性结实性亲本‘ZK’，P₂：强单性结实性亲本‘BY’，其余为F₂，M为20bpmarker。

图3是InDel标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；

图3中：P₁：弱单性结实性亲本‘ZK’，P₂：强单性结实性亲本‘BY’，M为20bp marker。

图4是Chr7InDel01在重组株中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图，图4中：M为20bp marker。

图5是InDel标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；

图5中：P₁：弱单性结实性亲本‘ZK’，P₂：强单性结实性亲本‘BY’，1至4为弱单性结实性的F₂，5至8为强单性结实性的F₂，M为20bp marker。

图6是Chr7InDel01在十个黄瓜自交系中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；

图6中：左边五个为弱单性结实性品系，右边五个为强单性结实性品系，M为20bpmarker。

具体实施方式

实施例一

1 遗传分离群体的构建与单性结实率的统计

BY（母本），强单性结实性，欧洲温室水果型黄瓜，全雌性，果实短，表皮光滑无刺瘤。ZK（父本），弱单性结实性，华北型黄瓜，全雌性，果实长，表皮有刺瘤。双亲均为扬州大学黄瓜遗传育种与生长发育调控团队自主培育品种，均有留种，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证。

本实验案例利用这两个亲本配制杂交组合F₁，F₁自交产生F₂群体，再以‘ZK’为轮回亲本配制回交后代，而后获得F₂、BC₁、BC₂、BC₃群体。

单性结实率的统计方法为将于第二天开放的雌花进行夹花，避免授粉，五天后统计雌花的单性结实率，每次统计后摘除统计过的果实，以免影响上方节位的果实发育。统计主蔓20节以内的单性结实率。

单性结实率=单性结实的果实数量∕夹雌花总数*100%

2 黄瓜单性结实基因的初步定位

2.1 黄瓜基因组DNA的提取

使用试剂盒法提取黄瓜亲本及F₂群体基因组DNA。

2.2 多态性SSR引物筛选

SSR引物来自于Ren 等(2009)在PLoS ONE 上发表的文章《An Integrated GeneticAnd Cytoenetic Map of Cucumber Genome》及Cavagnaro等(2010)在BMC Genomics上发表的《Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber(Cucumis sativus L.)》。SSR的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min（每个循环降低2℃），72℃延伸1min，共6个循环；94℃变性30s，58-50℃退火1min（每个循环降低1℃），72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸7min；4℃保存。采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR的特异性。选用510对SSR标记在亲本间进行多态性标记筛选，共有452对引物可以扩增出稳定条带，其中90对引物在两亲本中表现出特异性，多态率为19.9%。图1是部分SSR标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。最后再利用亲本间具有多态性的SSR引物在F₂群体（88株）中进行多态性验证，结合F₂的性状，构建了一张含有7个连锁群，90个SSR标记的连锁图谱，总长为652cM。图2是SSR标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。

2.3 黄瓜单性结实QTL初步定位

结合F₂每个单株的单性结实率和遗传连锁图谱，利用符合区间作图法（CIM）对黄瓜单性结实基因进行定位分析，似然比LOD≥3，在2号、5号和7号染色体上共获得了3个QTLs，分别命名为par2、par5和par7，LOD值分别为2. 8、2.9、7.9，遗传贡献率分别为4.9%、2.4%、13.6%，所以我们认为par7是控制黄瓜单性结实性状的主效QTL，物理位置在3453423和6946714之间，区间大小为3.49Mb，离染色体的起始端较近。

2.4 InDel分子标记的开发及精细定位

以弱单性结实性自交系‘ZK’为轮回亲本进行回交，用par7两端的SSR标记SSR22643和SSR19437鉴定回交群体重组株，保留QTL区间两端标记为H的BC₁单株。在106株BC₁中，共筛选出了38株重组株；用初步定位筛选出来的88对在亲本间具有多态性的SSR标记（除QTL两端标记）继续筛选重组株，保留与轮回亲本带型一致性比例最高的单株3株。在38株BC₁重组株中，一致性比例最高的3株分别有72、63、54个SSR标记与轮回亲本完全一致；重复筛选步骤，获得了68株BC₃重组株。进行双亲的Hi-seq建库重测序，双亲均获得了11G 以上cleandata，Q30均在85%以上，分析出了par7区域内所有InDel位点。随后在par7区域内随机选取20个InDel标记，并分别设计引物，采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测它们的特异性，有3个InDel标记在亲本间呈现了多态性，图3是InDel标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。继续在BC₃重组株中进行验证，结合BC₃重组株的单性结实率，我们定位到黄瓜单性结实QTL在Chr7InDel01和SSR19437之间，图4是Chr7InDel01在重组株中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。

实施例二：

在F₂群体中选取4株单性结实率最高单株和4株单性结实率最低的单株，分别提取它们的DNA，使用Chr7InDel01所衍生的标记进行PCR扩增，扩增出的序列有两种，带型与父本（ZK）一致的，其核苷酸序列有173bp，具体为‘TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATGAAATTTGAAAATATTTACCAAAATTTGTAACTATGATATATCTTAAATTTTTTGAAAACAAAAGTCTAATTTCAAATTCATTCAATCTTAAATTTTGAATTAACCATAAACCTATAATCATAAACGTCCACAACCCACGTCATTATCG’；带型与母本（BY）一致的，其核苷酸序列有155bp，具体为‘TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATGAAATTTGAGTAACTATGATATATCTTAAATTTTTTGAAAACAAAAGTCTAATTTCAAATTCATTCAATCTTAAATTTTGAATTAACCATAAACCTATAATCATAAACGTCCACAACCCACGTCATTATCG’。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明，带型与母本（BY）一致的都为强单性结实性单株，而带型与父本（ZK）一致的品种都为弱单性结实性单株，图5是Chr7InDel01在重组株中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测结果。

实施例三：

选取8个已知单性结实率的黄瓜自交系，其中4个为强单性结实性品种：BGF、XDX、Katya、DDX；4个为弱单性结实性品种：ALTNA、GY14、XF、GY2。其中BGF、XDX、DDX和XF为扬州大学黄瓜遗传育种与生长发育调控团队自主培育品种；均有留种并保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证；Katya由荷兰瓦格宁根大学提供；ALTNA、GY14和 GY2来自于美国农业部国家种质资源保存中心（USDA）。分别提取上述8个品种及亲本基因组DNA，使用Chr7InDel01所衍生的标记进行PCR扩增。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明，带型与母本（BY）一致的品种都为强单性结实性黄瓜品种，而带型与父本（ZK）一致的品种都为弱单性结实性品种，图6是Chr7InDel01在包括双亲的十个黄瓜自交系中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测结果。

本发明运用变异组学与群体遗传学的方法获得了与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实品种选育的进程。同时，这个InDel记也将为黄瓜单性结实基因的精细定位、克隆及创新种质、选育强单性结实黄瓜新品种及其标记指纹和数字指纹图谱的建立奠定重要的技术基础。

<110>扬州大学

<120>与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记及其应用与引物

<160>5

SEQ ID NO.1

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

AAAATATTTA CCAAAATTT 19

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TGTTGTTGTT GCTATATGGG TAATG 25

SEQ ID NO.3

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CGATAATGAC GTGGGTTGTG 20

SEQ ID NO.4

<210>4

<211>173

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

TGTTGTTGTT GCTATATGGG TAATGAAATT TGAAAATATT TACCAAAATT TGTAACTATG 60

ATATATCTTA AATTTTTTGA AAACAAAAGT CTAATTTCAA ATTCATTCAA TCTTAAATTT120

TGAATTAACC ATAAACCTAT AATCATAAAC GTCCACAACC CACGTCATTA TCG 173

SEQ ID NO.5

<210>5

<211>155

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TGTTGTTGTT GCTATATGGG TAATGAAATT TGAGTAACTA TGATATATCT TAAATTTTTT 60

GAAAACAAAA GTCTAATTTC AAATTCATTC AATCTTAAAT TTTGAATTAA CCATAAACCT 120

ATAATCATAA ACGTCCACAA CCCACGTCAT TATCG 155

Claims

1.与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，将InDel标记命名为Chr7InDel01；Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处，在双亲的Chr7InDel01处，父本即弱单性结实性黄瓜品系有插入如下碱基：AAAATATTTACCAAAATTT，而母本即强单性结实性黄瓜品系在此处的碱基仅为A。

2.一组用于检测权利要求1所述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对，其碱基序列为：

上游引物5′-TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATG-3′，

反向引物5′-CGATAATGACGTGGGTTGTG-3′。

3.权利要求1所述的Chr7InDel01在黄瓜强/弱单性结实性品种鉴定中的应用：Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处；

若在Chr7InDel01处有插入碱基‘AAAATATTTACCAAAATTT’的黄瓜品种，为弱单性结实性品种；

若在Chr7InDel01处碱基仅为A的黄瓜品种，则为弱单性结实性品种。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待检测黄瓜基因组DNA；

（2）以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对，进行PCR扩增反应，（3）经上述PCR扩增后进行电泳检测，如条带与父本‘ZK’一致，则为弱单性结实性黄瓜品系；如条带与母本‘BY’一致，则为强单性结实性黄瓜品系。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应体系共10微升：1微升10 ×上样缓冲液loading buffer，0.2微升dNTP，0.5微升上游引物，0.5 微升下游引物，0.1微升rTaq酶，6.7微升ddH2O，1微升DNA。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min，每个循环降低2℃，72℃延伸1min，共6个循环；94℃变性30s，58-50℃退火1min，每个循环降低1℃，72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

7.权利要求1所述的InDel及衍生的引物在黄瓜单性结实分子标记辅助育种中的应用。