ES2962514T3

ES2962514T3 - Procedimientos para crear plantas doble haploides

Info

Publication number: ES2962514T3
Application number: ES16825241T
Authority: ES
Inventors: Fenggao Dong; Michael Graham; Huachun Larue; Daniel Ovadya
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: EP3334279A4; US10772274B2; US20210219507A1; US12108719B2; US11930752B2; CN107846860A; US20200375128A1; US20200375129A1; US20190014731A1; EP3322284A4; EP3322284B1; CN113575427A; BR112018000794A2; CN113575427B; MX2018000582A; EP3334279A1; US20190014730A1; MX2018000583A; EP3334279B1; MX2021008258A

Abstract

Se proporcionan métodos para aumentar la eficiencia de la creación de plantas haploides dobles aumentando el número de posibilidades de formar una semilla haploide doble mediante el tratamiento de una planta monocotiledónea con un regulador del crecimiento vegetal. En determinadas realizaciones, se producen plantas de maíz que comprenden múltiples mazorcas codominantes. También se proporcionan plantas que comprenden el potencial de generar un mayor número de descendencia haploide duplicada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para crear plantas doble haploides

ANTECEDENTES

La evolución y domesticación de las plantas ha seguido en general un patrón común o “síndrome de domesticación” que distingue los cultivos de sus progenitores silvestres. Un elemento común del síndrome de domesticación entre los cultivos surgió de la selección a largo plazo para una dominancia apical aumentada, que se caracteriza por un crecimiento relativamente más firme de un tallo central y sus brotes y flores en comparación con el crecimiento de tallos laterales y brotes axilares, lo que tiene como resultado menos frutos más grandes por planta. La selección de la dominancia apical se considera un síntoma importante de la domesticación en muchas especies, incluso los cultivos de cereales de arroz, trigo, cebada y maíz, así como cultivos de frutos como tomate.

Un desafío fundamental durante la domesticación de las plantas de cultivo fue mejorar la capacidad de cosecha del cultivo en comparación con su progenitor. En entornos desfavorables, las plantas silvestres a menudo florecen y maduran de forma rápida; lo que produce menor cantidad de ramas, inflorescencias, flores y semillas para aumentar la posibilidad de producir al menos un descendiente para continuar el ciclo de vida. En entornos favorables, las plantas silvestres maximizan la probabilidad de reproducción exitosa al producir de manera secuencial más ramas, inflorescencias, flores y semillas en el transcurso del tiempo. Esta última estrategia no es óptima para un cultivo dado que es más efectivo cosechar menos frutos pero más grandes o inflorescencias que maduren de manera simultánea de planta en planta, lo que permite una única cosecha en un momento óptimo de la maduración del fruto o inflorescencia. Por ende, se han seleccionado diversos cultivos para producir menores cantidades de semillas, frutos o inflorescencias más grandes en el tallo principal como un medio para mejorar la capacidad de cosecha.

Quizás la alteración más impactante y más estudiada en la arquitectura vegetal se produjo por la domesticación del maíz. Al seleccionar características que mejoran el rendimiento y la capacidad de cosecha mecánica, los seres humanos han transformado el progenitor del maíz de un ancestro tupido similar a un arbusto con múltiples ramas laterales elongadas inclinadas por florescencias masculinas o femeninas en el cultivo del día de hoy que comprenden un único tallo principal recto con únicamente dos o tres ramas laterales relativamente abreviadas, en donde cada una termina en una única flor femenina (mazorca). Actualmente, en general se acepta que seleccionar con respecto a la dominancia apical en el maíz no solo mejora el rendimiento general en las condiciones de cultivo ideales, sino también hace que la logística de la coordinación de los momentos de florecimiento entre diferentes líneas sea mucho más fácil y agiliza el mantenimiento del campo y la capacidad de cosecha mecánica.

El mecanismo de dominancia apical en el maíz implica la regulación de hormonas, como auxina, que produce el meristemo apical. A medida que la mazorca comienza a madurar, el meristemo apical produce mayores cantidades de auxina. La auxina se transporta del meristemo apical hacia abajo de la planta y suprime el desarrollo de mazorcas más bajas, lo que tiene como resultado mazorcas secundarias que es menos probable que se corten adecuadamente o produzcan semillas viables.

Las plantas con esporófitos haploides contienen un número gamético de cromosomas (n) y pueden originarse de forma espontánea o a través de inducción artificial. Los haploides tienden a ser menos resistentes y fértiles que un esporófito de genotipo similar con número cigótico de cromosomas (2n) y, por lo tanto, poseen beneficios directos limitados para los investigadores que buscan mejorar la genética vegetal.

Aunque se produce una duplicación espontánea de cromosomas, la frecuencia es tan baja (típicamente menor que 5 %) que los investigadores que intentan crear plantas con doble haploides (“plantas DH”) a menudo someten las plantas haploides a tratamientos que promueven la duplicación de cromosomas. Las plántulas vegetales haploides que se someten a un tratamiento de duplicación de cromosomas pueden producir esperma y/u óvulos haploides y, si estas plantas se autofecundan satisfactoriamente, el número cigótico de cromosomas puede recuperarse en la descendencia, lo que restablece el vigor y la fertilidad esperados de un esporófito 2n.

Durante la duplicación de cromosomas, cada homólogo se replica para crear una copia sustancialmente idéntica del original y, por ende, todo el genoma de una planta DH se considera normalmente homocigota en cada locus. Este proceso puede crear líneas completamente homocigotas y homogéneas en menos generaciones que en retrocruzamiento tradicional, lo que mejora la eficacia de selección, reduce la cantidad y longitud de los ciclos de mejoramiento genético y consume menos recursos.

Sin embargo, la probabilidad de generar una menor cantidad de descendientes doble haploides a partir de una planta haploides determinada mediante procedimientos actualmente conocidos en la técnica es tan baja que reduce drásticamente las ventajas de incorporarlos a gran escala en un programa de mejoramiento genético competitivo. Desde los años 50 los investigadores han intentado mejorar las tasas de duplicación en plantas y han elaborado técnicas para más de 250 especies de cultivo. Sin embargo, incluso los mejores procedimientos descritos tienen un rendimiento confiable de tasas de duplicación de únicamente 12 % o menos y típicamente dependen de la aplicación del fármaco antimicrotúbulos colchicina, que es tóxico para las plantas en las concentraciones necesarias. Los efectos también son muy específicos al genotipo.

Asimismo, los procedimientos de duplicación actuales requieren mucho trabajo y a menudo que las plantas sean manipuladas varias veces durante el tratamiento, lo que reduce su tasa de supervivencia. Las plantas haploides a menudo se hacen tan frágiles durante el tratamiento con colchicina que, incluso si sobreviven este tratamiento y se duplican satisfactoriamente, no sobreviven la posterior manipulación y las etapas de procesamiento posterior necesarias para trasplantarlas a un campo, invernadero u otras condiciones de cultivo en donde se puedan recuperar y finalmente crecer para producir semillas. Por lo tanto, los investigadores y criadores de plantas típicamente utilizan un calibrador que caracteriza tanto la probabilidad de que una planta haploide se duplique, como la probabilidad de que la planta sobreviva para producir semillas doble haploides cuando se compara la efectividad general de un procedimiento de duplicación con otro.

SUMARIO

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra mazorcas clasificadas por el pedigrí de su población, la posición en el tallo de maíz y la cantidad de semillas DH<1>que produjeron.

La Figura 2 muestra ocho mazorcas codominantes de maíz numeradas que crecen de una única planta que fue tratada con un regulador de crecimiento vegetal.

La Figura 3 muestra la cantidad total promedio de las semillas producidas de retoños derivados de la misma planta madre que se sometió a un tratamiento de inducción de retoños.

La Figura 4 muestra que las plantas tratadas con PGR produjeron más semillas por planta.

La Figura 5 muestra que, a través de las líneas, las plantas tratadas con PGR produjeron más semillas por planta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la presente se proporcionan procedimientos para inducir o promover el desarrollo de meristemos axilares o inflorescencias adicionales en una planta de de maíz haploide. En determinados aspectos, esto se lleva a cabo con el fin de mejorar la eficacia de la producción de plantas doble haploides (“DH”).

Debe observarse que el término “un” o “una” entidad, se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que “una planta” representa una o más plantas. Como tales, los términos “un” (o “una”), “uno/a o más” y “al menos uno/una se pueden usar de manera indistinta en la presente.

Asimismo, “y/o”, cuando se usa en la presente, se considerará una descripción específica de cada uno de los dos elementos o componentes específicos con o sin el otro. Por lo tanto, se pretende que el término “y/o”, tal como se usa en una expresión tal como “A y/o B” en la presente, incluya “A y B”, “A o B”, “A” (solo) y “B” (solo). De manera similar, se pretende que el término “y/o”, tal como se usa en una expresión tal como “A, B y/o C”, abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entienda comúnmente un experto en la técnica a la que se relaciona la presente descripción. Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente, una “planta” hace referencia a una planta monocotiledónea entera, cualquier parte de esta, o una célula o cultivo de tejido derivado de una planta monocotiledónea, que comprende cualquiera de: plantas enteras, componentes u órganos de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), tejidos vegetales, semillas, células vegetales y/o progenie de la planta. Una célula vegetal es una célula biológica de una planta, tomada de una planta monocotiledónea o derivada mediante cultivo de una célula tomada de una planta monocotiledónea.

Tal como se usa en la presente, una “población de plantas” o “población vegetal” se refiere a un conjunto que comprende cualquier cantidad, que incluye uno, de individuos, objetos o datos a partir de los cuales se toman muestras para evaluación, por ejemplo, para estimar los efectos de QTL. Más comúnmente, las expresiones hacen referencia a una población de cultivo de plantas a partir de la cual se seleccionan miembros y se cruzan para producir una progenie en un programa de mejoramiento genético. Una población de plantas puede incluir la progenie de un único cruce de mejoramiento genético o múltiples cruces de mejoramiento genético y pueden ser plantas en sí mismas o material obtenido de plantas, o representaciones in silico de las plantas. No es necesario que los miembros de la población sean idénticos a los miembros de la población seleccionados para utilizarse en ciclos posteriores de análisis o los seleccionados en última instancia para obtener plantas de progenie final. Con frecuencia, una población vegetal deriva de un único cruce biparental, pero también deriva de dos o más cruces entre los mismos padres o padres diferentes. Pese a que una población de plantas puede comprender cualquier cantidad de individuos, los expertos en la técnica reconocerán que los criadores de plantas suelen emplear tamaños de población que varían de cien o doscientos individuos a varios miles y que el 5-20 % de una población con mayor rendimiento es lo que se selecciona usualmente para utilizar en cruzas posteriores para mejorar el rendimiento de generaciones posteriores de la población.

Tal como se usa en la presente, el término “elemento genético” se refiere a una construcción de ADN recombinante (comúnmente denominados “transgén”) que se ha insertado en el genoma del maíz, a una secuencia de nucleótidos o a un locus genético del genoma de una planta.

Tal como se usa en la presente, las expresiones “que promueve” y “que induce” se utilizan de manera intercambiable para referirse a promover, por ejemplo, el desarrollo de brotes axilares a partir de brotes preexistentes e inducir, por ejemplo, la formación de brotes axilaresde novo.

Tal como se usa en la presente, la expresión sustancia, composición, entidad “que no es de origen natural” y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones o entidades, o cualquier variación gramatical de estas, es una expresión condicional que excluye explícitamente, pero únicamente excluye, las formas de la sustancia, composición, entidad y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones o entidades que los expertos en la técnica consideran “de origen natural” o que un juez, entidad administrativa o judicial determina o interpreta, o puede determinar o interpretar en cualquier momento, “de origen natural”.

Tal como se usan en la presente, los términos “flor” e “inflorescencia” se usan de manera intercambiable.

Tal como se usan en la presente, los términos “maíz” y “choclo” se usan de manera intercambiable.

Tal como se usa en la presente, el término “selecto/a”, “planta selecta”, y similares, describe un grupo, germoplasma o población de al menos una planta de cultivo que fue el resultado de la selección y mejoramiento genético dirigido por humanos para un rendimiento agronómico superior. Una “población selecta” es una variedad de individuos o líneas selectos que se pueden usar para representar el estado de la técnica en términos de genotipos superiores desde el punto de vista agronómico de una especie de cultivo dado, tal como el maíz. De manera similar, un “germoplasma selecto” o “cepa selecta de germoplasma” es un germoplasma superior desde el punto de vista agronómico, que deriva típicamente de y/o es capaz de producir una planta con un rendimiento agronómico superior, tal como una línea selecta de maíz existente o recientemente desarrollada. Por el contrario, una “planta exótica”, “ línea exótica” o “germoplasma exótico” es una planta, línea o germoplasma que deriva de una planta que no corresponde a una línea o cepa selecta de germoplasma disponible. En el contexto de un cruce entre dos plantas o líneas de germoplasma, un germoplasma exótico no se relaciona estrechamente por descendencia al germoplasma selecto con el que se cruza. Más comúnmente, el germoplasma exótico no deriva de ninguna línea selecta de un cultivo sino que se selecciona para introducir elementos genéticos (típicamente alelos deseados) en un programa de mejoramiento genético.

Las plantas de maíz tienden a producir una única mazorca dominante, o principal, que se desarrolla más rápidamente y de forma más completa. A veces se forman mazorcas adicionales más abajo en el tallo de la mazorca dominante (la mazorca secundaria es la siguiente mazorca abajo de la mazorca principal, la tercera mazorca la siguiente más abajo, y así sucesivamente - las cuales se pueden denominar de forma conjunta como mazorcas secundarias), pero su desarrollo es típicamente más retrasado con respecto a la mazorca dominante. Debido a que el desarrollo de mazorcas adicionales, no dominantes, habitualmente se retrasa, la mazorca dominante es normalmente la única que se corta adecuadamente.

Tal como se usa en la presente, la expresión “mazorca/s codominante/s” se refiere a las mazorcas en una planta de maíz que maduran a velocidad/momento similares de tal modo que producen barbas receptoras de la germinación del polen en un período superpuesto. Una planta con mazorcas codominantes tendrá al menos dos mazorcas codominantes. Las mazorcas codominantes pueden numerarse según su posición en el tallo, es decir, la mazorca codominante superior es la primera mazorca codominante, la siguiente mazorca codominante abajo de la primera es la segunda mazorca codominante, la tercera mazorca codominante es la siguiente más abajo, y así sucesivamente.

Tal como se usa en la presente, una planta de control (por ejemplo, una planta de control monocotiledónea, una planta de control de maíz, etc.) es una planta (o población de plantas) reconocida con un fenotipo representativo (por ejemplo, cantidad de inflorescencias, cantidad de retoños, cantidad de mazorcas, cantidad de granos/semillas, altura, biomasa y similares) de una planta que no fue tratada con un regulador de crecimiento vegetal pero que es comparable, en otros aspectos, como las condiciones de crecimiento y la composición genética, con una planta tratada con un regulador de crecimiento vegetal. Por ejemplo, un experto en la técnica considerará que una planta de control tiene uno o más de los siguientes atributos: es el resultado de una semilla derivada del mismo cruce de inducción; tiene al menos un progenitor en común con la planta tratada; comparte un ancestro en común con la planta tratada dentro de doce generaciones; comparte suficiente herencia genética en común con la planta tratada que el experto en la técnica de mejoramiento genético de plantas reconocerá a la planta de control como una comparación válida para establecer una correlación entre la aplicación de un regulador de crecimiento vegetal y el fenotipo resultante; y/o tiene una mazorca dominante y no tiene mazorcas codominantes (maíz). Un experto en la técnica reconocerá que una planta sin tratar, que de casualidad (por ejemplo, un error estadístico), por algún otro tipo de manipulación u otra razón, comprende un fenotipo que varía de un fenotipo representativo para la planta sin tratar, no será una planta de control adecuada.

Eficacias de duplicación

Las plantas haploides que se someten a un tratamiento de duplicación de cromosomas (o, en determinadas realizaciones, las plantas haploides que se someterán a un tratamiento de duplicación de cromosomas), denominadas plantas DH<0>, pueden producir esperma y/o óvulos haploides mediante el contacto con el agente de duplicación de cromosomas, y si las plantas DH<0>se autofecundan satisfactoriamente, el número cigótico de cromosomas puede recuperarse en la descendencia (denominadas semillas, plantas DH<1>, etc.), lo que restablece el vigor y la fertilidad esperados del esporófito 2n. La “eficacia de duplicación” (DE) es una medida general del éxito de la duplicación calculada al dividir la cantidad de plantas DH<0>de una designación que producen semillas DH<1>entre la cantidad total de plantas DH<0>de esa designación que se sometieron a un tratamiento de duplicación de cromosomas.

Si bien la recuperación de una única semilla DH<1>puede contarse técnicamente como un evento de duplicación satisfactorio, los criadores de plantas normalmente requieren una población de al menos varias plantas para generar el poder estadístico necesario para sacar conclusiones confiables de las pruebas estadísticas y genéticas llevadas a cabo en la población. Por ejemplo, un tratamiento de duplicación que produce únicamente una o pocas semillas DH<1>serán de uso limitado en un programa de mejoramiento genético competitivo dado que se necesitará al menos una generación adicional de plantación, cultivo, polinización y cosecha para generar un tamaño de población suficiente para las pruebas estadísticas precisas, particularmente si se planean comparaciones en múltiples entornos. En un programa de mejoramiento genético relativamente amplio, esta etapa de “acumulamiento”(bulking)de semillas puede impulsar el análisis de esa población un temporada completa hacia atrás, lo que típicamente retrasa la liberación de un producto comercial, posiblemente resultando en una pérdida de participación valiosa en el mercado. Dado que los procedimientos que se describen en la presente pueden aumentar la cantidad de semillas DH<1>producidas por una planta DH<0>en una única generación, pueden reducir también la posibilidad de que sea necesaria una generación adicional para acumular (aumentar) la cantidad de semillas DH<1>de un determinado cruce para hacer avanzar esa población a etapas posteriores (por ejemplo, análisis de campo) en una cadena de mejoramiento genético. Por lo tanto, un usuario de los procedimientos descritos en la presente será capaz de desarrollar un germoplasma mejorado para el mercado de forma más rápida que los que utilizan los procedimientos descritos en otros documentos.

Para cuantificar mejor la eficacia del tratamiento de duplicación, las limitaciones de rendimiento mínimo pueden aplicarse durante el proceso de cálculo de DE de modo que una planta DH<0>determinada deba producir al menos una cantidad mínima de semillas DH<1>antes de que se cuente en la proporción de los eventos de duplicación exitosos, es decir, se utilice en el numerador. Se pueden utilizar subíndices para significar la limitación de rendimiento mínimo de modo que DE<20>es la eficacia de duplicación calculada solo cuando las plantas DH<0>que produjeron al menos 20 semillas DH<1>se dividen por la cantidad total de plantas DH<0>sometidas al tratamiento de duplicación. DE<30>representa la DE solo cuando las plantas DH<0>que produjeron al menos 30 semillas DH<1>se dividen por la cantidad total de plantas DH<0>sometidas al tratamiento de duplicación. De manera similar, DE<50>representa la<d>E solo cuando las plantas DH<0>que produjeron al menos 50 semillas DH<1>se dividen por la cantidad total de plantas DH<0>sometidas al tratamiento de duplicación y así sucesivamente.

Promoción e inducción de brote axilar

En la presente se describe el descubrimiento de que ahora es posible aumentar drásticamente la posibilidad de recuperar una cantidad objeto de semillas en una única generación de una planta de maíz DH<0>. Los procedimientos comprenden inducir o promover la planta de maíz para desarrollar al menos un tipo de una variedad de diferentes tipos de brotes axilares que pueden dar lugar a inflorescencias adicionales. Son posibles diversas realizaciones de inducción de brote axilar y/o tratamiento de plantas en diferentes etapas de crecimiento para controlar el tipo de brote axilar que se desarrolla. Los ejemplos no taxativos incluyen brotes múltiples, retoños y mazorcas codominantes, que se definen en detalle en la presente.

La inducción de un brote axilar en monocotiledóneas flexibiliza la dominancia apical que normalmente inhibe el desarrollo de vástagos laterales y/o flores o inflorescencias secundarias. En determinadas realizaciones, un usuario hace que una planta madre produzca una mayor cantidad de inflorescencias femeninas fértiles y óvulos fértiles que los procedimientos actuales de mejoramiento genético de plantas y el cultivo que se enfoca en maximizar el desarrollo de una única inflorescencia femenina.

Si bien se conoce que a menudo surgen y se desarrollan de modo espontáneo, la formación o desarrollo de brotes axilares en el maíz es actualmente un elemento no conveniente que se elimina de los programas de mejoramiento genético por una cantidad de razones que se describen en la presente. Entre estas, existe la idea de que las hormonas responsables de mantener la dominancia apical suprimirán el desarrollo de flores de brotes axilares, por lo que es más efectivo que la planta no desperdicie recursos para desarrollarlos o las estructuras vegetativas que los sostienen. Esto es particularmente evidente en híbridos de maíz modernos, en donde los rendimientos se maximizan típicamente en buenos entornos al cultivar híbridos seleccionados para enfocar sus recursos en el desarrollo de una única mazorca de alto rendimiento que se corte adecuadamente y minimice el desarrollo de brotes axilares o inflorescencias secundarias.

Sin embargo, se ha descubierto que, al someter una planta de maíz haploide a al menos un tratamiento de inducción de brotes axilares de diversos posibles en uno o más puntos de diversos posibles en el ciclo de vida de la planta, es posible liberar la programación de desarrollo para mayor dominancia apical que los criadores de plantas han seleccionado. En determinadas realizaciones, un usuario somete una planta de maíz a un tratamiento que promueve el desarrollo de al menos un brote axilar primordial o preexistente de modo que forma una inflorescencia secundaria (o terciaria o cuaternaria, etc.) en el tallo principal de la planta de maíz. Un usuario puede sincronizar el desarrollo de al menos un brote axilar en una planta de maíz con el desarrollo de otros brotes en la planta de maíz para lograr un desarrollo simultáneo y coordinado de al menos dos mazorcas en la planta que presenta las características esperadas de una mazorca dominante, que incluyen ser receptoras de la polinización a aproximadamente el mismo tiempo (por ejemplo, mazorcas codominantes). Las descripciones y los ejemplos en la presente permiten al usuario elegir y/o desarrollar una combinación adecuada de parámetros de tratamiento de inducción a partir de una amplia variedad de opciones para adecuarse a necesidades específicas.

Por lo tanto, en determinadas realizaciones, un usuario puede recuperar de manera segura una cantidad objetivo de semillas de una planta monocotiledónea DH<0>al inducirla a formar flores adicionales de brotes axilares, polinizar esas flores y luego cosechar la semilla que se forma de esas flores adicionales hasta que se obtenga la cantidad objetivo de semillas. Al combinar todas las semillas producidas por una planta inducida a formar brotes axilares, se pueden aumentar las probabilidades de producir una cantidad deseada de semillas a partir de una única planta madre en una única generación.

Corte

En el maíz, la formación satisfactoria de granos requiere una superposición en el período temporal cuando las estructuras femeninas necesarias para la fertilización se encuentran completamente funcionales y el período temporal cuando el polen es viable y se libera de la panoja. Un corte adecuado describe las circunstancias cuando la superposición de estos períodos temporales es suficiente para fertilizar la mayoría de, si no todos, los ovarios disponibles en la mazorca. Dado que el polen puede ser sensible a la desecación, el calor y otros factores ambientales, el período temporal para un corte adecuado a menudo se limita a varios días o incluso unas pocas horas. Si el polen se libera demasiado temprano de forma tal que la mayoría del polen, o todo, no es viable al momento en que las flores femeninas son receptoras de polinización, entonces el corte no será adecuado, lo que conducirá a muchos óvulos sin fertilizar y un conjunto de semillas deficiente. Se espera que el corte no sea adecuado también cuando el polen se libera de forma tan tardía que las barbas están muertas o las flores femeninas no son aún receptoras de otro modo y/o capaces de soportar la fertilización. En condiciones de crecimiento normales, el desarrollo de mazorcas secundarias normalmente se suprime y retrasa de modo que la mazorca principal sea típicamente la única cuyo desarrollo esté lo suficientemente alineado con el de la panoja para que haya un corte adecuado.

El corte funciona como una conexión tan fundamental en el ciclo de vida del maíz que los productores comerciales y los criadores de maíz consumen recursos considerables para ayudar a asegurarlo. Es común que un programa de mejoramiento genético industrial o competitivo elimine líneas que presentan de otro modo un rendimiento excelente pero no se cortan adecuadamente y, por lo tanto, su mantenimiento no es rentable. Por ejemplo, una población de plantas DH<0>puede presentar una gran tasa de duplicación y contener elementos genéticos excelentes, pero puede eliminarse igual del posterior desarrollo si corta de forma tan deficiente que producir la cantidad suficiente de semillas para autofecundarse y/o mantenerla es un desafío, o si es necesaria más de una generación para producir las semillas suficientes para el análisis de rendimiento.

Agentes de tratamiento de plantas

En determinadas realizaciones que se proporcionan en la presente, una planta puede ponerse en contacto con una amplia variedad de “agentes de tratamiento de plantas”. Por lo tanto, tal como se usa en la presente, un “agente de tratamiento de plantas”, “agente de tratamiento” o “agente” pueden hacer referencia a cualquier compuesto proporcionado de forma exógena que puede introducirse en la superficie de una planta y desplazarse hacia un tejido vegetal. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento de plantas actúa de forma extracelular dentro del tejido vegetal, tal como mediante la interacción con los receptores en la superficie celular externa. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento de plantas entra en las células dentro del tejido. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento de plantas se encuentra comprendido dentro de un líquido. Dichos líquidos incluyen, de modo no taxativo, soluciones, suspensiones, emulsiones y dispersiones coloidales.

Poner en contacto una planta con un agente de tratamiento puede suceder antes, durante o después de la aplicación de otras sustancias. En determinadas realizaciones, el contacto entre la planta y el agente de tratamiento se logra al remojar, sumergir o insertar de otro modo la planta en un depósito de líquido que comprende el agente de tratamiento de plantas. Otros procedimientos para poner en contacto una planta con un agente de tratamiento incluyen pulverizar o rociar la planta con una solución que comprende un agente de tratamiento de plantas o agitar o introducir una planta en una solución que comprende un agente de tratamiento de plantas. En determinadas realizaciones, el contacto entre la planta y el agente de tratamiento se logra al empapar la tierra, que comprende agregar un agente de tratamiento líquido a la tierra o al medio de cultivo cerca de las raíces donde la planta crecerá.

En determinadas realizaciones, los líquidos son de naturaleza acuosa. En determinadas realizaciones, los líquidos acuosos pueden comprender componentes solubles en agua. En determinadas realizaciones, los líquidos acuosos pueden comprender componentes insolubles en agua, pueden comprender un componente insoluble que se vuelve soluble en agua mediante la adición de un tensioactivo, o pueden comprender cualquier combinación de componentes solubles, componentes insolubles y tensioactivos.

Una “solución de tratamiento de plantas” o “solución de tratamiento” puede hacer referencia a cualquier solución de líquido que comprenda un agente de tratamiento de plantas. En determinadas realizaciones, una solución de tratamiento de plantas comprende un agente de tratamiento de plantas y los dos términos pueden utilizarse, a menudo, como sinónimos. Por ejemplo, la administración de una solución de tratamiento de plantas que comprende el agente de tratamiento de plantas colchicina a un meristemo de una planta es esencialmente sinónimo de la administración de un agente de tratamiento de plantas que comprende colchicina a un meristemo de una planta.

Los agentes de tratamiento de plantas incluyen, de modo no taxativo, macromoléculas que incluyen polinucleótidos que incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y/o ARN), polipéptidos, polisacáridos, policétidos y similares. Los polinucleótidos pueden ser de cadena simple o cadena doble y pueden incluir moléculas antisentido y ARN interferentes. Los polinucleótidos pueden incluir mutaciones y/u otras modificaciones diversas, como en sus estructuras principales, que se conocen en la técnica. Los polinucleótidos incluyen “elementos genéticos” que comprenden construcciones de ADN recombinante (comúnmente denominadas “transgenes”) que se han insertado en el genoma de la planta, o una secuencia de nucleótidos, o un locus genético del genoma de una planta. Por lo tanto, un usuario puede administrar una secuencia de ADN o ARN a un tejido diana para alterar la expresión o la herencia de una característica vegetal, por ejemplo, para “transformar” de forma eficaz una planta al insertar un elemento genético en su genoma.

Un agente de tratamiento de plantas comprende un regulador de crecimiento vegetal (PGR). Los PGR son una clase de compuestos que afectan los procesos celulares, el crecimiento, el desarrollo o el comportamiento de una planta o una parte de una planta. Los reguladores del crecimiento de las plantas incluyen citoquininas (p. ej., BAP) y compuestos que inhiben las giberelinas (p. ej., paclobutrazol (PBZ) o uniconazol).

Tal como se usa en la presente, PBZ es paclobutrazol, (2S,3S)-1-(4-clorofenil)-4,4-dimetil-2-(1,2,4-triazol-1-il) pentan-3-ol, también escrito como C15H10CIN30, un regulador del crecimiento vegetal y un fungicida de triazol. Este es un antagonista conocido de la hormona vegetal giberelina que inhibe la biosíntesis de la giberelina, lo que reduce el crecimiento entre nudos y aumenta el grosor del tallo. BAP es 6-Bencilaminopurina, N-(Fenilmetil)-7H-pruin-6-amina, también escrito como C12H11N5. IAA es ácido indol-3-acético e IBA es ácido inodol-3-butírico. Ambas son formas de origen natural de una clase de hormonas vegetales denominadas auxinas. Pueden utilizarse otras variaciones de auxinas con la presente invención, que incluyen auxinas sintéticas, tales como 2,4-D (ácido 2,4-Diclorofenoxiáctico) y 1-NAA (ácido 1-Naftalenacético).

Tal como se usa en la presente uniconazol es (e)-(+/-)-beta-((4-clorofenil)metilen)-alfa-(1,1-dimetiletil)-1h-1,2,4-triazol-1-etanol, también escrito como C15H18CIN3O, también conocido como uniconazol-P. Es un retardante del crecimiento vegetal de tipo triazol y un antagonista conocido de la hormona vegetal giberelina que reduce el crecimiento entre nudos y aumenta el grosor del tallo.

En general, los agentes de tratamiento de plantas utilizados en la presente serán agentes solubles en agua. Sin embargo, el uso de agentes de tratamiento de plantas con solubilidad en agua alta, intermedia, baja o insignificante puede facilitarse, en determinadas realizaciones, mediante el uso de composiciones líquidas que también comprendan diversos agentes acondicionadores o de transferencia. Los agentes acondicionadores o de transferencia pueden comprender cualquier agente que facilite el desplazamiento de los agentes de tratamiento de plantas a la planta (por ejemplo, células vegetales) y/o que facilite la absorción de los agentes de tratamiento de plantas por parte de la planta. Los agentes acondicionadores o de transferencia incluyen, de modo no taxativo, (a) tensioactivos, (b) solventes orgánicos o una solución acuosa o mezclas acuosas de solventes orgánicos, (c) agentes oxidantes, (d) ácidos, (e) bases, (f) aceites, (g) enzimas o combinaciones de estos. En determinadas realizaciones, los procedimientos pueden incluir opcionalmente una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, base o agente oxidante o para inactivar una enzima), una etapa de enjuague o combinaciones de estas, por medio de las cuales el líquido y el agente de tratamiento de plantas contenido en este se tratan antes o después de la administración a la planta. Por lo tanto, los agentes acondicionadores o de transferencia incluyen, de modo no taxativo, emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones tipo micelas. Los ejemplos de adyuvantes útiles incluyen tensioactivos y moléculas eficaces contenidas en estos, que incluyen sales de sodio o litio de ácidos grasos (tales como sebo o aminas de sebo o fosfolípidos). Los agentes acondicionadores o de transferencia pueden comprender sales que incluyen, de modo no taxativo, sodio, amonio, calcio, litio, magnesio, cloruro, sulfuro y sales de sulfato. Determinadas realizaciones de los procedimientos que se proporcionan en la presente utilizan contraiones u otras moléculas que son conocidas por su asociación con agentes de tratamiento de plantas. Para determinados agentes de tratamiento de plantas con carga negativa, tales como los polinucleótidos, pueden utilizarse cationes tales como iones de amonio inorgánico, iones de alquilamonio, iones de litio, poliaminas, tales como espermina, espermidina o putrescina, y similares. Los solventes orgánicos útiles para acondicionar una célula vegetal para la permeación con determinados agentes de tratamiento de plantas, que incluyen, de modo no taxativo, polinucleótidos, son solventes tales como DMSO, DMF, piridina, N-pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol u otros solventes que son miscibles con agua. Pueden utilizarse aceites derivados de forma natural o sintéticos con o sin tensioactivos o emulsionantes, por ejemplo, aceites de origen vegetal, aceites de cultivo (tales como los que se enumeran en el 9.° Compendio de adyuvantes herbicidas, disponible públicamente en la web (internet) en “herbicide.adjuvants.com”). Los aceites útiles en determinadas composiciones líquidas utilizadas en los procedimientos proporcionados en la presente incluyen, de modo no taxativo, aceites parafínicos, ésteres de poliol de ácidos grasos o aceites con moléculas de cadena corta modificadas con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o N-pirrolidina.

En determinadas realizaciones, un agente de tratamiento de plantas puede ser un agente de duplicación de cromosomas. Los agentes de duplicación de cromosomas se utilizan para generar células de plantas doble haploides y plantas doble haploides. Los agentes de duplicación de cromosomas pueden comprender diversos inhibidores mitóticos que provocan la duplicación de cromosomas. En determinadas realizaciones, el agente de duplicación de cromosomas puede ser un compuesto tal como colchicina, aminoprofos-metilo, trifuralina, orizalina, pronamida o clorprofam. En aun otras realizaciones, el agente de duplicación de cromosomas puede ser un agente de duplicación de cromosomas con toxicidad baja para los mamíferos. Diversos agentes de duplicación de cromosomas con toxicidad baja para los mamíferos que pueden utilizarse incluyen, de modo no taxativo, compuestos tales como: i) 1,2,3-trimetoxi-4-((1S,6R)-6-nitro-ciclohex-3-enil)-benceno y otros compuestos relacionados descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2010/0169999; y ii) los compuestos descritos en la patente estadounidense n.° 5,866,513, otorgada a Michelotti et al. La publicación de solicitud de patente estadounidense 2010/0169999; y la patente estadounidense n.° 5,866,513. En particular, los 76 compuestos descritos en la Tabla I y 1a en las columnas 3-4, 5-6 y 7-8 de la patente estadounidense n.° 5,866,513. En determinadas realizaciones, el agente de duplicación de cromosomas es un polinucleótido.

En determinadas realizaciones, se puede utilizar un amplio intervalo de concentraciones químicas y cronogramas de dosificación en conjunto con estos procedimientos y el experto en la técnica puede optimizar la dosis administrada a un determinado genotipo para maximizar la formación de mazorcas codominantes y/o maximizar la actividad de corte y/o la fertilización entre mazorcas codominantes.

Tipos de plantas

A menos que se especifique lo contrario, tal como se usa en la presente, una planta puede ser una planta de maíz entera o parte de una planta de maíz o cultivo de tejido obtenido a partir de una planta de maíz o semilla de planta de maíz; que presenta un tejido al que se le puede administrar un agente de tratamiento de plantas. Una planta puede tener diversos contenidos cromosómicos, tal como haploides, diploides, triploides, tetraploides, etc. Poliploidía se refiere generalmente a tener un nivel de ploidía mayor que triploides. En determinadas realizaciones, se hace una distinción entre los tejidos vegetales que crecen en plantas con cultivo de tejidos y sin cultivo de tejidos.

A menos que se especifique lo contrario, tal como se usa en la presente, la superficie de una planta se refiere a la superficie que generalmente está expuesta al ambiente externo que rodea la planta sin tirar, cortar, etc., la planta para exponer áreas adicionales. Por ejemplo, si una planta se sumerge completamente en una solución, la superficie de la planta es generalmente la parte de la planta que podría ponerse en contacto con la solución.

Un tejido vegetal puede ser cualquier tejido vegetal. En determinadas realizaciones, un tejido vegetal puede incluir un meristemo funcional o un agrupamiento de células capaces de formar un meristemo funcional. Un meristemo funcional se define como un centro de células pluripotentes que tiene la capacidad de producir órganos o tejidos vegetales nuevos. En algunas realizaciones, el tejido vegetal comprende un tejido de meristemo tal como un meristemo apical de la raíz o un meristemo apical del vástago.

En determinadas realizaciones, un agente de tratamiento de plantas se administra a un tejido vegetal seleccionado u objetivo. Un tejido vegetal puede seleccionarse o seleccionarse como objetivo en función de la respuesta del tejido al agente de tratamiento de plantas y/o a la influencia sobre el crecimiento, las características, la genética, el rendimiento, etc., de las plantas que se desea lograr. Por ejemplo, el meristemo apical del vástago, particularmente de una planta DH<0>, puede seleccionarse para la administración de un agente de duplicación de cromosomas. El tejido seleccionado puede ubicarse en la superficie de la planta y/o puede ubicarse por debajo de la superficie de la planta o por debajo de una parte de la superficie de la planta. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, donde incluso la totalidad de la superficie de la planta se pone en contacto con una solución que comprende un agente de tratamiento de plantas, tal como al sumergir la planta completamente, al menos una parte del tejido seleccionado puede no entrar en contacto con la solución.

En determinadas realizaciones, antes de la germinación, la planta o un propágulo de la planta se pone en contacto con un agente de tratamiento de plantas para administrar el agente de tratamiento al menos a un tejido seleccionado de la planta. En determinadas realizaciones, se utilizan técnicas de rescate de embriones conocidas en la técnica para escindir un embrión de la semilla antes de la germinación de esta a efectos de que el embrión entre mejor en contacto con el agente de tratamiento. Después de la escisión, el embrión puede cultivarsein vitroo cultivarse de otro modo en condiciones que promuevan su supervivencia y desarrollo en una plántula. Por lo tanto, la administración de un agente de tratamiento de plantas a los tejidos seleccionados de una planta antes de la germinación puede mejorarse mediante el uso de una variedad de técnicas actualmente conocidas en la técnica, que incluyen las técnicas de rescate de embriones, lo que permite de ese modo que el embrión entre en contacto con el agente de tratamiento de plantas. En determinadas realizaciones, se utilizan estos procedimientos para administrar un agente de duplicación a un meristemo de un embrión haploide a efectos de crear al menos un tejido reproductivo doble haploides capaz de producir gametos haploides funcionales.

Una planta de maíz a utilizarse en los procedimientos descritos en la presente puede encontrarse en cualquiera de diversas etapas de desarrollo. Por ejemplo, las plantas de maíz pueden describirse por su crecimiento vegetativo y las etapas reproductivas y, tal como se usa en la presente, las etapas del desarrollo de los granos de maíz (Procedimiento del cuello de la hoja: V1-Vn, Vt, R1-R6, etc.) son tal como se describen en Abendroth, L.J., R.W. Elmore, M.J. Boyer, y S.K. Marlay, 2011, Corn Growth and Development, PMR 1009, Extensión de la Universidad Estatal de Iowa, Ames, Iowa.

En determinadas realizaciones, el tejido vegetal es un meristema. En determinadas realizaciones, el tejido vegetal comprende un meristemo apical del vástago (SAM). En determinadas realizaciones, el tejido vegetal comprende un meristemo apical del vástago y la planta de maíz se encuentra en la semilla o germina en o entre las etapas de crecimiento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 o V12. En determinadas realizaciones, el tejido vegetal comprende un meristemo apical del vástago y la planta de maíz se encuentra en la semilla o germina en o entre las etapas de crecimiento vegetativo E, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 o V12.

Los procedimientos que se describen en la presente no se ven limitados por determinadas etapas del desarrollo de una planta. Se anticipa que las técnicas para prolongar o modificar de otro modo la duración de las etapas de crecimiento se pueden utilizar en conjunto con la presente invención para expandir las opciones de un usuario del momento en el cual aplicar un PGR para inducir el desarrollo de meristemos apicales del vástago adicionales y/o brotes axilares y/o mazorcas codominantes.

Procedimientos para producir plantas doble haploides

Determinadas realizaciones descritas en la presente proporcionan soluciones a un problema que los expertos en la técnica han intentando resolver durante décadas. Este problema es cómo asegurar que sustancialmente toda planta DH<0>duplicada produzca una cantidad deseada de semillas DH<1>en una única generación. En determinadas realizaciones, la posibilidad de recuperar al menos una cantidad mínima de semillas DH<1>de una planta DH<0>(por ejemplo, al menos una semilla DH<1>, al menos cuatro semillas DH<1>, al menos veinte semillas DH<1>, etc.) se puede mejorar al inducir o promover que una planta DH<0>desarrolle al menos un brote axilar adicional. Este proceso se puede repetir con otros brotes axiales, de manera simultánea y/o secuencial, hasta generar una cantidad objetivo de semillas. Al combinar las semillas producidas por al menos un brote axilar con las semillas producidas por al menos otro brote axilar, y/o la semilla producida por el brote principal de una planta madre DH<0>, estos procedimientos pueden mejorar la posibilidad de recuperar docenas, cientos o incluso miles de semillas DH<1>de una única planta DH<0>.

Los protocolos de duplicación de cromosomas a base de colchicina en general sugieren exposiciones de varios minutos a varias horas y se basan en la esperanza de que durante ese tiempo no solo la colchicina pone en contacto específicamente las células del meristemo apical del vástago que darán lugar a los órganos reproductivos, sino que también el contacto sucede durante los períodos específicos del ciclo celular necesarios para que suceda la duplicación de cromosomas. Las incertidumbres de esto se traducen en los problemas de la baja predictibilidad de la duplicación del maíz y los problemas de eficacia que los criadores de plantas han intentando resolver durante muchos años.

En determinadas realizaciones, la impredictibilidad de los procedimientos DH actuales puede disminuirse al aumentar la cantidad de posibilidades que cada planta de maíz DH<0>madre sola tiene de cumplir las condiciones necesarias para producir una inflorescencia doble haploides. Se ha descubierto que una única planta de maíz haploides puede inducirse actualmente para producir una cantidad objetivo de descendencia DH<1>con mayor frecuencia y confiabilidad. Las plantas haploides pueden inducirse para formar múltiples meristemos axilares en estructuras fértiles productoras de frutos para producir mayores cantidades de semillas DH<1>en comparación con las plantas de control que no se indujeron de esa manera.

Las plantas de maíz haploides que se utilizan para obtener células, semillas y/o plantas doble haploides se pueden obtener mediante cualquier procedimiento. En determinadas realizaciones, las plantas de maíz haploides o las mazorcas haploides derivadas de estas, pueden obtenerse mediante el cruce de una línea inductora (masculina) con una línea deseada (femenina) para inducir la formación de células de plantas haploides en la línea femenina. Las líneas inductoras de ejemplo para el maíz incluyen, de modo no taxativo, Stock 6, RWS, KEMS, inductor haploide krasnodar (KHI), KMS o ZMS, líneas que comprenden una mutación de gametofito indeterminado (ig) y derivados de estos. En otras realizaciones, se pueden utilizar amplios cruces de hibridación para producir haploides. Las descripciones de ejemplo de amplios cruces de hibridación se encuentran en Kasha y Kao, 1970, Nature 225:874-876. También se puede utilizar cualquier otro procedimiento de inducción de haploides junto con estos procedimientos, incluso enfoques transgénicos o moleculares, por ejemplo, los que implican alteraciones de CENH3 u otros procedimientos a base de degradación del genoma.

Determinadas realizaciones proporcionan procedimientos para obtener una célula de planta de maíz doble haploides, en donde el procedimiento comprende poner en contacto una planta de maíz con una solución que comprenda un agente de tratamiento de plantas, en donde el agente de tratamiento de plantas es un agente de duplicación de cromosomas y permite al agente de duplicación provocar la formación de al menos una célula de planta doble haploides. También se proporcionan en la presente procedimientos para obtener una célula de planta de maíz doble haploides, en donde el procedimiento comprende cosechar una célula de planta doble haploides de una semilla que comprende una célula de planta doble haploides. En determinadas realizaciones, la semilla se encuentra en la mazorca cuando se cosecha la célula vegetal de la semilla.

Determinadas realizaciones proporcionan procedimientos para obtener una planta de maíz doble haploides, en donde el procedimiento comprende obtener un embrión de maíz doble haploides obtenido a partir de cualquiera de los procedimientos proporcionados en la presente y administrar los nutrientes suficientes al embrión para permitir el desarrollo del embrión en la semilla vegetal de maíz doble haploides. Un embrión de maíz doble haploides puede formarse mediante los procedimientos que comprenden llevar a cabo cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente para administrar una solución que comprende un agente de tratamiento de plantas al meristemo apical del vástago, en donde el agente de tratamiento de plantas es un agente de duplicación de cromosomas y permitir que el agente de duplicación induzca la duplicación de cromosomas.

En determinadas realizaciones de estos procedimientos, la célula de planta de maíz doble haploides se obtiene a partir de una tercera parte. En otras palabras, la parte que provocó la formación de la célula de planta de maíz doble haploides no es necesariamente la parte que administra los nutrientes para permitir el desarrollo de la célula vegetal en la planta de maíz doble haploides.

También se proporcionan en la presente procedimientos para obtener una semilla que comprende una célula de planta de maíz doble haploides, en donde el procedimiento comprende cosechar una semilla que comprende una célula de planta doble haploides obtenida a partir de los procedimientos para obtener una célula de planta de maíz doble haploides. Una célula de planta de maíz doble haploides puede obtenerse a partir de los procedimientos que comprenden llevar a cabo cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente para administrar una solución que comprende un agente de tratamiento de plantas a la planta, en donde el agente de tratamiento de plantas es un agente de duplicación de cromosomas, y permitir que el agente de duplicación induzca la formación de al menos una célula de planta doble haploides en al menos una de las semillas. En determinadas realizaciones, la semilla cosechada es una semilla fisiológicamente madura.

También se proporcionan en la presente procedimientos para obtener una planta de maíz doble haploides, en donde el procedimiento comprende sembrar una semilla que comprende una célula de planta de maíz doble haploides obtenida a partir de los procedimientos para obtener una semilla que comprende una célula de planta de maíz doble haploides, y permitir que la semilla sembrada se desarrolle en la planta de maíz doble haploides. En determinadas realizaciones, la semilla que comprende la célula de planta de maíz doble haploides se obtiene a partir de una tercera parte. En otras palabras, la parte que cosechó la semilla no es necesariamente la parte que sembró la semilla que comprende la célula de planta doble haploides y permitió que la semilla sembrada se desarrollara en la planta de maíz doble haploides.

En determinadas realizaciones, las células de plantas doble haploides pueden obtenerse al cosechar la semilla DH<1>de una mazorca de maíz DH que se forma en una planta DH<0>tratada con un agente de duplicación de cromosomas mediante los procedimientos proporcionados en la presente. La semilla DH<1>fisiológicamente madura originada de la mazorca DH en la planta madre DH<0>puede cosecharse para obtener una célula de planta doble haploides que está comprendida en la semilla. La semilla DH<1>fisiológicamente madura de la mazorca DH tratada de la planta DH<0>también puede sembrarse y permitir que germine para obtener una planta de maíz doble haploides.

En determinadas realizaciones, una célula de planta haploide puede recuperarse de una mazorca de maíz tratada con un agente de duplicación de cromosomas al rescatar una célula vegetal de un grano en la mazorca. El rescate de células vegetales se puede llevar a cabo al retirar una célula vegetal tratada de una mazorca, colocar la célula vegetal en medio que proporcione el desarrollo vegetal y/o de células vegetales y permitir que suceda el desarrollo vegetal y/o de células vegetales. En determinadas realizaciones, el medio que proporciona el desarrollo vegetal y/o de células vegetales puede incluir una o más fitohormonas, sales y/o azúcares. Diversos medios y técnicas para el rescate de células vegetales se describen en Matthys-Rochon et al., Journal of Experimental Botany, Vol. 49, n.° 322, págs. 839 845, 1998.

Estos procedimientos se pueden ajustar para un amplio intervalo de parámetros para maximizar el corte entre las mazorcas codominantes de sustancialmente cualquier genotipo de plantas. Un experto en la técnica puede ajustar estos procedimientos para una cantidad de variables que se conoce que afectan el desarrollo de plantas en conjunto con estos procedimientos, que incluyen alterar la densidad de la plantación, la dosificación, los procedimientos de tratamiento químico o el momento para mejorar el corte y/o fertilización y/o producción de semillas en un amplio rango de germoplasmas o genotipos vegetales. En determinadas realizaciones, las plantas pueden plantarse a diferentes densidades para afectar la formación de mazorcas codominantes. En determinadas realizaciones, las plantas pueden tratarse con al menos uno de diversos agentes químicos posibles (por ejemplo, agentes que afectan la formación de mazorcas como inhibidores de GA), mediante el uso de al menos uno de varios niveles de dosificación posibles para optimizar la formación y el corte entre al menos dos mazorcas codominantes en sustancialmente cualquier genotipo o conjunto de genotipos. En algunas realizaciones, se puede proporcionar otro tratamiento conocido en la técnica que afecte el desarrollo de plantas para optimizar la formación de mazorcas codominantes. En algunas realizaciones, se puede utilizar una combinación de lo que antecede para optimizar la formación de mazorcas codominantes. En algunas realizaciones, se pueden utilizar tratamientos diferentes en distintos genotipos para optimizar la formación en general de mazorcas codominantes.

Mejoramiento genético de plantas

Los procedimientos que se proporcionan en la presente pueden utilizarse para mejorar la eficacia del mejoramiento genético de plantas en maíz al aumentar la cantidad de descndencia recombinante que una planta madre determinada produce en una única generación. Esta comprensión tiene aplicaciones drásticas y amplias en el mejoramiento genético de plantas dado que aumenta la posibilidad de que una única planta de maíz produzca descendencia con una combinación de elementos genéticos estadísticamente poco probable pero superior. Un criador de plantas que emplee estos procedimientos para integrar determinadas secuencias de ADN, genotipos y/o características fenotípicas en un genoma y/o germoplasma objetivo podrá crear un gameto con una secuencia de ADN que comprenda un conjunto específico de elementos genéticos mediante el uso de menos plantas madre y menos recursos que un criador que utiliza procedimientos actuales conocidos en la técnica. Esto se debe, en parte, al hecho de que los procedimientos descritos en la presente permiten efectivamente a un usuario inducir las plantas madre a producir más semillas por planta, lo que equivale a más meiosis por planta, lo que equivale a más oportunidades por planta para que suceda una recombinación genética deseada. Por lo tanto, más oportunidades de recombinación por planta se traducen a menos plantas (y menos recursos) necesarios para lograr un tamaño de población efectivo necesario para alcanzar una alta probabilidad de recuperar al menos una planta con una combinación deseada de elementos genéticos.

Por ejemplo, cuando los criadores de plantas utilizan una selección recurrente para introgresar un elemento genético deseado en un germoplasma objetivo, dependen de que la recombinación genética suceda entre cromosomas homólogos del germoplasma objetivo y el germoplasma donante en loci, en donde los genomas flanquean los locus genéticos deseados. Un usuario de estos procedimientos tendrá una mayor probabilidad de generar una planta madre con un genoma que comprenda el germoplasma objetivo modificado únicamente por la/s secuencia/s del genoma donante necesario para otorgar el elemento genético deseado, dado que estos procedimientos generan más eventos de recombinación por planta madre y, por lo tanto, un usuario tendrá una mayor probabilidad de crear una planta con la disposición deseada de elementos genéticos incorporados en su genoma que un usuario de otros procedimientos de integración de características.

Los beneficios de esto se hacen más evidentes cuando se intenta introgresar múltiples elementos genéticos en un germoplasma objetivo dado que la cantidad de eventos de recombinación genética necesaria para introgresar elementos genéticos adicionales en un germoplasma objetivo aumenta rápidamente con la cantidad de elementos genéticos adicionales que se desea introgresar. Un usuario de estos procedimientos descubrirá que necesita muchas menos plantas madre para lograr una alta probabilidad de recuperar evento/s de introgresión deseado/s y, por lo tanto, pueden aumentar drásticamente la eficacia de la creación de una disposición deseada de elementos genéticos en un gameto en comparación con uno que utiliza los procedimientos actuales en la técnica que ignora los brotes axilares y/o no induce de manera deliberada brotes axilares para producir frutos.

Esta compresión es particularmente útil en el maíz, dado que cada vez que se induce una inflorescencia adicional para formar una mazorca completa con posibles óvulos (en promedio 500 granos o más para los híbridos de mayor rendimiento), cada uno representa una oportunidad para que tengan lugar las recombinaciones genéticas necesarias durante la meiosis. Por lo tanto, un criador experto en la técnica puede utilizar estos procedimientos para aumentar drásticamente la eficacia de crear una disposición deseada de los elementos genéticos en un gameto en comparación con uno que utiliza procedimientos actuales en la técnica que ignora los brotes axilares o no los induce deliberadamente para formar y producir frutos.

Estos procedimientos pueden combinarse con cualquier procedimiento para prolongar el corte, prolongar la diseminación del polen o prolongar el período durante el cual las mazorcas son receptoras de polinización y fertilización que se conocen en la técnica. Por ejemplo, una panoja puede someterse a un tratamiento que prolongue el período durante el cual la panoja disemina polen. El polen que se disemina puede conservarse para extender el período de tiempo en el cual es capaz de polinización existosa y posterior fertilización. También se pueden utilizar otros procedimientos conocidos para mejorar o extender el corte.

En determinadas realizaciones, los tratamientos de inducción de brote axilar pueden aplicarse en las etapas de crecimiento VE, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 o V12, o cualquier combinación de estos.

Brotes múltiples (Solo con fines ilustrativos, no de acuerdo con la invención reivindicada)

Un tipo de brote axilar inducido es un “brote múltiple”, que deriva de la inducción de una planta para formar un brote axilarde novode células diferenciadas. Este procedimiento reprograma de forma efectiva una o más células de una planta para producir un meristemo, vástago o brote axilarde novo.

Una plántula de maíz o un embrión de planta de maíz pueden someterse a la inducción de brotes axilares mientras se encuentran aún unidas a las semillas (enfoque de semilla directa) o la plántula/embrión puede disecarse de la semilla antes de la germinación (procedimiento de embrión disecado) o la plántula/embrión puede separarse de la semilla después de la germinación (procedimiento del eje del embrión).

En la presente se describe el descubrimiento de diversos usos novedosos para brotes múltiples en maíz, que incluyen el mejoramiento de la eficacia de duplicación (“DH”) al asegurar que la cantidad objetivo de semillas se genere de un cruce o se autogenere. Un usuario que desee asegurar que se genere al menos una cantidad mínima de semillas en una única generación de una planta DH<0>induce la planta DH<0>a formar al menos un brote múltiple doble haploides.

Al menos uno de estos brotes múltiples se cultiva hasta una planta haploide madura que se autofecunda para producir semillas DH<1>. Este proceso se puede repetir, de manera simultánea y/o secuencial, hasta generar la cantidad objetivo deseada de semillas.

Estos procedimientos pueden aumentar en primer lugar la cantidad de semillas doble haploides recuperadas al inducir una planta progenitora diploide a producir al menos dos brotes múltiples diploides que luego se cultivan hasta plantas diploides maduras. Estas plantas progenitoras derivadas de brotes múltiples pueden luego polinizarse con un inductor para formar al menos una semilla haploide, que puede cultivarse posteriormente hasta convertirse en plántulas y someterse a técnicas de duplicación de cromosomas conocidas en la técnica para convertir los haploides en una población de plantas DH<0>. Luego, las plantas DH<0>pueden cultivarse hasta que produzcan flores y luego polinizarse para producir semillas DH<1>.

Como se describe en el presentre documento, una única planta diploide puede someterse a un tratamiento de inducción de brotes múltiples para generar diversos brotes múltiples diploides. Estos brotes múltiples pueden separarse de la planta madre y cultivarse hasta que produzcan flores, en cuyo momento pueden polinizarse mediante un inductor. Incluso si algunas mazorcas derivadas de brotes múltiples producen muy pocas semillas, o ninguna, se espera que este procedimiento pueda repetirse, ya sea de forma secuencia o simultánea, hasta que se genere una cantidad objetivo de semillas cuando se combinen todas las semillas de las mazorcas derivadas de brotes múltiples. Dado que muchas de estas plantas haploides son necesarias, pueden someterse a una duplicación de cromosomas para producir una cantidad deseada de plantas DH.

Las semillas haploides recuperadas y seleccionadas de al menos una mazorca inducida por brote múltiple pueden someterse a todo tipo de análisis que el usuario considere adecuados para determinar cuáles semillas contienen las características específicas. Estos análisis pueden incluir la clasificación de las semillas (incluso los embriones y todos los otros tejidos de la semilla) para identificar y separar las semillas diploides, incluso los procedimientos de clasificación de haploides descritos en la solicitud de patente estadounidense 14/206,238 que se publicó como US20140266196A1.

Los análisis también pueden incluir el genotipado de tejidos mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. Independientemente de cómo se analicen las semillas haploides, un subconjunto de la población puede seleccionarse en función de cualquier criterio para limitar la cantidad de plantas sometidas a las posteriores etapas de duplicación. Por lo tanto, estos procedimientos pueden reducir la cantidad de recursos utilizados para duplicar las plantas que no cumplen con un umbral de selección objetivo.

A diferencia de los procedimientos actuales para producir plantas DH, un usuario de estos procedimientos no depende únicamente en una sola oportunidad para duplicar las células necesarias para producir una mazorca que contenga al menos la cantidad objetivo de óvulos haploides. Por el contrario, el usuario puede producir múltiples mazorcas de una única planta DH<0>y, por ende, combina múltiples oportunidades de duplicación para lograr una cantidad objetivo de óvulos haploides.

Retoños (Solo con fines ilustrativos, no de acuerdo con la invención reivindicada)

Los retoños son un tipo de brote axilar. La inducción de los retoños en monocotiledóneas atenúa la supresión que inhibe el desarrollo de un brote axilar de modo que el brote axilar pueda formar un vástago lateral elongado que en última instancia produce una panoja y al menos una flor femenina conocida como mazorca. Si bien se conoce que se forman espontáneamente, la formación de los retoños es una característica no conveniente que se elimina de los programas de mejoramiento genético del maíz por una variedad de razones, incluso el hecho de que hacen que la conservación de la identidad de plantas circundantes sea más difícil y aumentan la posibilidad de contaminación cruzada de semillas de diferentes tratamientos experimentales. También tienden a crecer más del área normalmente asignada a una planta individual, lo que altera las disposiciones de la plantación, hace el acceso de humanos y máquinas más difícil e interrumpe el mantenimiento, la cultivación y la cosecha eficaces del campo. Asimismo, los retoños compiten con la planta madre (es decir, el tallo principal del que derivaron los retoños) por los recursos cercanos, lo que reduce la precisión de las evaluaciones de fenotipo y el rendimiento general por unidad acre. Por estas y otras razones, los retoños en general se eliminan de los terrenos de investigación y las operaciones comerciales.

Sin embargo, se ha descubierto que al someter una planta de maíz a un tratamiento de inducción de brote axilar en momentos específicos en el ciclo de vida de la planta, es posible generar múltiples vástagos de retoños de una única planta madre que produce mazorcas que cortan adecuadamente con las panojas del mismo vástago y producen excelentes conjuntos de semillas cuando se polinizan. Por lo tanto, estos procedimientos pueden aumentar la posibilidad de recuperar una cantidad objetivo de semillas producidas por una única planta de maíz al inducirla a formar retoños, lo que permite que estos retoños produzcan sus propias mazorcas y luego cosechar las semillas de al menos una de las mazorcas producidas por al menos uno de los retoños. Al combinar las semillas producidas por al menos un retoño con las semillas producidas por al menos otro retoño, y/o las semillas producidas por la planta madre, estos procedimientos pueden aumentar la posibilidad de recuperar docenas, cientos o incluso miles de semillas de una única planta.

En determinadas realizaciones, un procedimiento comprende inducir una planta DH<0>para formar al menos un retoño doble haploides. Al menos uno de estos retoños se cultiva hasta una planta haploide madura que se autofecunda para producir semillas DH<1>. El proceso se puede repetir, de manera simultánea y/o secuencial, hasta generar una cantidad objetivo de semillas. Al combinar las semillas producidas por al menos un retoño con las semillas producidas por al menos otro retoño, y/o las semillas producidas por la planta madre DH<0>, estos procedimientos pueden aumentar la posibilidad de recuperar docenas, cientos o incluso miles de semillas de una única planta DH<0>.

A diferencia de los procedimientos actuales para producir plantas DH, estos procedimientos no se limitan únicamente a una sola oportunidad para duplicar las células necesarias para producir una mazorca o panoja que contenga al menos la cantidad objetivo de óvulos haploides o polen. Por el contrario, producen múltiples mazorcas y panojas de una única planta DH<0>, por ende, combinan múltiples oportunidades de duplicación para producir una mazorca que contenga al menos la cantidad objetivo de óvulos haploides y polen y, posteriormente a la polinización y fertilización, la cantidad objetivo de semillas DH<1>.

Mazorcas codominantes

Determinadas realizaciones proporcionan la producción de mazorcas codominantes. En determinadas realizaciones, el desarrollo de mazorcas codominantes se coordina de modo que al menos dos mazorcas codominantes sean receptoras de polinización en un período que se superponga a la diseminación de polen de las panojas de la misma planta. En determinadas realizaciones, el desarrollo de mazorcas codominantes se coordina de modo que al menos dos mazorcas codominantes sean receptoras de polinización en un período que se superponga a la diseminación de polen de las panojas de otros germoplasmas deseados.

Determinadas realizaciones comprenden someter la planta a un tratamiento de inducción de brote axilar en momentos específicos en el ciclo de vida de una planta. Es posible generar al menos dos mazorcas codominantes en una única planta cuyo desarrollo esté coordinado de modo que las mazorcas corten adecuadamente y produzcan un excelente conjunto de semillas cuando se polinicen. Estos procedimientos pueden mejorar la recuperación de una cantidad objetivo de semillas descendientes de una única planta progenitora al inducir la planta progenitora a formar múltiples mazorcas codominantes que sean todas receptoras de polinización en períodos temporales superpuestos.

En determinadas realizaciones, las semillas se generan en una única generación por una planta DH<0>al inducir la planta DH<0>a formar al menos dos mazorcas codominantes después del tratamiento de duplicación. A diferencia de los procedimientos convencionales para producir plantas DH, estos procedimientos no dependen únicamente de una sola oportunidad para duplicar las células necesarias para producir una mazorca que contenga al menos la cantidad objetivo de óvulos haploides. Por el contrario, se producen múltiples mazorcas de una única planta DH<0>, por ende, combinan múltiples oportunidades de duplicación para producir al menos la cantidad objetivo de gametos y, posteriormente a la polinización y fertilización, por ejemplo, producir la cantidad objetivo de semillas DH<1>.

Una observación inesperada tiene un impacto considerable en la producción de DH. Una vez que una planta DH<0>es tratada con un agente de inducción, no es completamente predecible cuál mazorca en la planta DH<0>producirá la mayor cantidad de semillas DH<1>. En algunos casos, la segunda y/o tercera mazorca tuvo una mejor producción de semillas que la primera mazorca. Sorprendentemente, en algunos casos, la primera mazorca produjo menos semillas, o ninguna, mientras que la segunda y/o tercera mazorca produjeron numerosas semillas.

Asimismo, los resultados representativos descritos en la presente revelan que es estocástico cuál mazorca tiene el mayor potencial de duplicación. Se ha demostrado que no es predecible cuáles meristemos axilares a lo largo del vástago son los más probables a duplicarse mediante un tratamiento de duplicación de cromosomas, incluso entre los miembros estrechamente relacionados de una línea endogámica.

En los casos en donde se han formado demasiadas mazorcas codominantes en la planta madre que no haya recursos suficientes para fomentar completamente su desarrollo, las mazorcas pueden cultivarse de forma separada, por ejemplo,in vitro,en macetas separadas o de cualquier otra manera conocida en la técnica.

En determinadas realizaciones, el tratamiento de inducción de mazorcas codominantes comprende aplicar un inhibidor de ácido giberélico, tal como PBZ, uniconazol, clormequat-CL, mepiquat-CL, AMO-1618, clorfonio-Cl, tetcilacis, ancimidol, flurprimidol, paclobutrazol, uniconazol-P, inabenfida, prohexadiona-CA, trinexapac-etil, daminozida, exo-16,17- o dihidro-GA5-13-acetato o una combinación de cualquier agente de tratamiento de plantas, por ejemplo, una combinación de inhibidor GA con citocinina.

En determinadas realizaciones, las mazorcas codominantes se forman en diferentes vástagos. Por ejemplo, un usuario puede tratar un tallo principal (es decir, la planta madre) con un agente de tratamiento de plantas para hacer que el tallo principal forme al menos un retoño. El usuario cronometra el tratamiento para coordinar el desarrollo de una mazorca en el retoño (es decir, una mazorca de retoño) y una mazorca en la planta madre de modo que ambas mazorcas produzcan barbas y sean receptoras de polinización en un período temporal sustancialmente superpuesto. En determinadas realizaciones, el usuario trata una planta madre para formar al menos dos retoños y cronometra los tratamientos para coordinar el desarrollo de al menos dos mazorcas de retoño que crecen de diferentes retoños de modo que las dos mazorcas de retoño o más produzcan barbas receptoras a la polinización durante un período temporal sustancialmente superpuesto. Por ende, los procedimientos que implican retoños y los procedimientos que implican mazorcas codominantes no son mutualmente exclusivos; es posible incorporar ambos tipos de procedimientos de formación de brotes axilares para lograr resultados mejorados en determinadas situaciones.

Se comprende que para cualquiera de los procedimientos descritos en la presente, el procedimiento puede incluir además seleccionar plantas, por ejemplo en función de atributos deseados como la cantidad de retoños, cantidad de mazorcas codominantes, la eficacia de duplicación, etc.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, las semillas de maíz haploides se obtuvieron mediante la polinización de F1 o F2 que contenían los elementos genéticos deseados con polen de una línea inductora haploide. Las mazorcas se cosecharon cuando las semillas estaban maduras, luego las mazorcas se recubrieron y luego las semillas se clasificaron en haploides y diploides. Las plantas de maíz haploides utilizadas en la presente se obtuvieron mediante la polinización de plantas de maíz F1 y F2 con polen de una línea inductora haploide para formar las poblaciones de inducción haploides derivadas de híbridos F1. Se cosecharon las mazorcas cuando las semillas estaban maduras y recubiertas y las semillas haploides se recuperaron mediante procedimientos estándares de la técnica.

Los ejemplos de líneas inductoras haploides que pueden utilizarse para repetir los experimentos a continuación incluyen Stock 6 (Coe 1959), RWS (Rober et al. 1005), KEMS (Deimling et al. 1997), KMS o ZMS (Chalyk et al. 3994; Chalyk y Chebotar 1000) u otras líneas inductoras obtenidas a partir de estas. La línea inductora también puede presentar al menos una característica de marcador para facilitar la identificación de la descendencia haploide. Se puede configurar que la pureza del grupo haploide sea 95 % o mayor y que se pueda verificar mediante el uso de varios procedimientos conocidos en la técnica.

Ejemplo 1. La capacidad de proliferación de mazorcas de maíz se puede manipular para producir múltiples mazorcas por planta a través de diversos germoplasmas.

Las plántulas V1-V3 de dos únicas líneas de maíz haploide derivado de híbridos F1, derivadas de un grupo heterótico femenino (Germoplasma A) o un grupo heterótico masculino (Germoplasma B), se sometieron a un tratamiento de duplicación de cromosomas a base de colchicina en grandes cantidades al retirar las plántulas del suelo o el medio de crecimiento en la etapa de crecimiento V1-V3 y al alinear sus tallos y envolviéndolos juntos a lo largo de diversas barras de madera en un paquete mantenido junto por una tira de papel de aluminio (las dimensiones de la tira de papel aproximadas fueron 6 in x 18 in). Las plantas agrupadas se sumergieron en una solución de tratamiento de plantas que comprendía 1250 ppm de colchicina en un recipiente de centrifugación y luego la totalidad de la muestra se centrifugó a 50 g durante 3 minutos mientras los meristemos apicales de vástago (SAM) se mantuvieron sumergidos en la solución de agente de tratamiento de plantas.

Posteriormente a la primera centrifugación, la solución de tratamiento de plantas se decantó y las plántulas se sometieron a una centrifugación adicional a 335 g durante 3 minutos. Durante la segunda centrifugación, el paquete de envoltura con barra sostenía las plántulas y evitaba que los SAM entraran en contacto con el agente de tratamiento de reserva que no había sido absorbido por la planta durante la aplicación de la fuerza de centrifugación.

Después de la segunda centrifugación, las plantas se retiraron del recipiente de centrifugación y del paquete de envoltura con barra y se enjuagaron con agua para retirar cualquier solución de colchicina restante y, luego, se recuperaron y se cuidaron en un invernadero con luz, humedad y temperatura controladas durante varios días antes de ser trasplantadas a un vivero. Estos procedimientos de tratamiento a base de centrifugación se describen en mayor detalle en la solicitud internacional número PCT/US2015/028955, sin embargo, también se pueden aplicar tratamientos de duplicación estándares a cualquiera de las etapas de duplicación haploide mencionadas en la presente.

Luego del tratamiento de duplicación de colchicina, se plantaron 15-20 plantas de cada germoplasma en macetas a dos densidades diferentes; como plantas únicas por maceta (individuales) o como dos plantas por maceta (pares).

A continuación, cada planta recibió una de dos dosis diferentes de PBZ, 50 mL (dosis baja) o 60 mL (dosis alta) de una solución de PBZ al 2,5 % (v/v; 0,4 % de ingrediente activo) en agua. Estas dos dosis diferentes se aplicaron al empapar la tierra en la etapa de crecimiento V7 o V8, que tuvieron lugar en un total de 23 o 26 días después de someter las plántulas al tratamiento de duplicación de cromosomas, respectivamente. Un grupo de control de plantas no recibió solución de tratamiento pero se trataron de otro modo exactamente como los grupos experimentales plantados como individuales. Cuando el polen diseminado comenzó en las panojas, la cantidad promedio de mazorcas productoras de barbas (es decir, mazorcas codominantes) se contó para cada dosificación, germoplasma y tiempo de tratamiento y los resultados se resumieron en la Tabla 1.

Tabla 1. La cantidad de mazorcas codominantes formadas por planta en dos únicos germoplasmas haploides inducidos (A y B) luego de tratamientos a una de dos dosis diferentes de PBZ en una de dos etapas de desarrollo diferentes luego del tratamiento de duplicación de cromosomas.

Plantadas como individuales_________Plantadas como pares Etapa de crecimiento!_____Germoplasma______Dosis baja___________ Dosis alta Dosis baja Dosis alta

V7B 2,7 3,3 1,5 1,5

A 3,4 3,9 3 3,4

V8B 2,3 2,2 1,5 1,5

A 2,3 3,5 2,3 2,2 fV7 sucedió 23 días después del tratamiento de duplicación de cromosomas; V8 sucedió 26 días después del tratamiento de duplicación de cromosomas.

Las plantas de control para el Germoplasma A y el Germoplasma B produjeron 1,4 EP y 1,1 EP, respectivamente.

Estos resultados revelan que estos procedimientos continúan siendo útiles entre diferentes densidades de plantación. Ambos germoplasmas formaron más mazorcas individuales cuando los individuos se plantaron solos en macetas, independientemente del momento de tratamiento. Todas las plantas de Germoplasma B emparejadas produjeron menos mazorcas que cualquiera de las plantas de Germoplasma B individuales, independientemente de la dosificación o el momento de tratamiento y la población de Germoplasma B V8 de dosis alta produjo más del doble que sus contrapartes dobles. Esta variación en el efecto que la densidad de plantación tiene en diferentes germoplasmas proporciona a un usuario la comprensión de que el intervalo óptimo de densidades de plantación que se puede emplear en conjunto con estos procedimientos puede variar de germoplasma en germoplasma. Se espera que un usuario pueda ajustar el momento de tratamiento y otras condiciones de tratamiento o crecimiento para optimizar el uso de estos procedimientos con diferentes germoplasmas.

Estos resultados revelan que a través de las variables de dosificación, densidad y germoplasma, los tratamientos aplicados tanto a V7 como a V8 produjeron uniformemente más mazorcas codominantes para ambos germoplasmas que los controles. Por ende, estos procedimientos no se limitan a la aplicación de un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes durante un punto particular del desarrollo vegetal. En una realización, el tratamiento de inducción de mazorcas codominantes sucede en un intervalo de tiempo seleccionado por el usuario, lo que mejora la cantidad de semillas producidas por una planta haploide tratada con un agente de duplicación de cromosomas.

Los resultados revelan que estos procedimientos no se limitan al uso con genotipos vegetales o germoplasmas específicos. Asimismo, ambos germoplasmas mostraron mejoras variables en función de otras variables, tales como la densidad de plantación, los cronogramas de tratamiento, las dosificaciones y otras variables. La cantidad de mazorcas codominantes se mejoró para dos genotipos radicalmente divergentes en un intervalo de diferentes cronogramas de tratamiento. Se anticipa que los usuarios utilizarán estos procedimientos con una amplia variedad de otros germoplasmas y podrán ajustar parámetros tales como la densidad de plantación, el momento de los tratamientos de inducción de mazorca, la dosificación de productos químicos utilizados durante los tratamientos de inducción de mazorca y otras variables que afectan el desarrollo de mazorcas para maximizar el corte entre las mazorcas codominantes y mejorar la cantidad de semillas producidas en una determinada generación.

Estos resultados revelan que el uso de estos procedimientos no se limita a las dosificaciones específicas de los productos químicos que inducen la formación de mazorcas. Aparentemente una variedad de diferentes mejoras de mazorca por planta (EP) se correlacionan con la dosificación. Respecto a una, el promedio EP de todas las plantas tratadas con la dosis alta fue 0,31 mayor que la EP de todas las plantas tratadas con la dosis baja. Esta relación es aun más marcada cuando se consideraron únicamente las individuales (el promedio EP de dosis alta fue 0,55 mayor que la dosis baja). Asimismo, las plantas individuales sometidas a la dosis baja aun produjeron un aumento mínimo de 1,2 EP con respecto a las plantas de control, lo que sugiere que hay efectos de la dosificación incluso fuera del intervalo analizado que podrían utilizarse en conjunto con estos procedimientos.

Ejemplo 2. La cosecha y selección de las semillas de mazorcas codominantes mejora la recuperación de semillas DH<1>en una única generación.

Una población de inducción haploide derivada de híbrido F1 derivada de un Germoplasma A de planta de maíz endogámica femenina se germinó en la tierra y se cuidó en condiciones estándares de invernadero para el crecimiento de maíz durante aproximadamente siete días. Luego las plántulas se sometieron a un tratamiento de duplicación de cromosoma a base de colchicina a grandes cantidades tal como se describió anteriormente. Luego del tratamiento, las plántulas se trasplantaron en macetas y se cuidaron en un invernadero en condiciones estándares de invernadero para el crecimiento de maíz para recuperarlas.

Veintinueve días después del tratamiento de duplicación de colchicina, 77 de las plántulas DHo se sometieron a un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes que comprendía agregar 60 mL de PBZ al 2,5 % (v/v) en agua, que se vertió en la tierra que rodeaba las raíces de cada planta. Luego se cuidaron las plántulas en condiciones estándares de invernadero para el crecimiento de maíz hasta que florecieron, en cuyo momento cada planta que produjo polen se autopolinizó. Luego de aproximadamente 3-4 semanas, las mazorcas se cosecharon y los granos (semillas DH<1>) que se formaron en las plantas DH<0>tratadas se contaron para determinar las eficacias de duplicación.

Las eficacias de duplicación (DE) se calcularon conforme a cuatro diferentes límites, en función de la cantidad mínima de granos que una mazorca tenía que producir para incluirse en el cálculo. DE<04>representa la parte de todas las plantas DH<0>duplicadas que produjeron un total de al menos cuatro semillas cuando se consideraron todas las mazorcas. DE<20>representa la parte de todas las plantas DH<0>duplicadas que produjeron un total de al menos 20 granos cuando se consideraron todas las mazorcas. De manera similar, DE<30>representa la parte de las plantas DH<0>duplicadas que produjeron un total de al menos 30 granos cuando se consideraron todas las mazorcas y DE<50>representa la parte de las plantas DH<0>duplicadas que produjeron un total de al menos 50 granos cuando se consideraron todas las mazorcas.

Asimismo, las eficacias de duplicación que anteceden se calcularon una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal de cada planta (Mazorca^, una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal y en la mazorca secundaria de cada planta (Mazorca<2>), una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal, secundaria y terciaria de cada planta (Mazorca<3>) y, finalmente, al considerar todos los granos que se formaron en todas las mazorcas de cada planta (Mazorcatodas).

Tabla 2. Comparación de eficacias de duplicación producidas por la inducción de mazorcas codominantes a diversos umbrales mínimos de grano/planta. Los subíndices representan la cantidad mínima de granos que una planta tenía que producir para considerarla en el cálculo de DE.

Mazorca<1>71 % 37 % 26 % 23 %

Mazorca<2>76 % 59 % 47 % 36 %

Mazorca<3>76 % 65 % 58 % 50 %

Mazorcatodas 76 % 68 % 58 % 52 %

Estos resultados revelan que las mayores eficacias de duplicación se obtuvieron cuando se incluyeron los granos de mazorcas codominantes. Esta relación se hace incluso más evidente cuando se aplicaron los límites de rendimiento mínimo para que una mazorca se incluyera. Para DE<20>, DE<30>y DE<50>, incluir los granos producidos por todas las mazorcas en cada planta duplicó aproximadamente el DE con respecto al DE de MAZORCA<1>en cada caso. Esto demuestra la utilidad de estos procedimientos con respecto a la gran variedad de límites de rendimiento mínimo.

Estos resultados revelan que un usuario de estos procedimientos debería experimentar una DE más uniforme entre una variedad de límites de rendimiento mínimo diferentes en comparación con los procedimientos actualmente conocidos en la técnica. Si bien la DE de la Mazorca<1>cayó casi la mitad entre DE<04>y DE<20>(de 71 % a 37 %), incluir únicamente una mazorca adicional (Mazorca<2>) tuvo como resultado únicamente una reducción del 22 % en la DE entre DE<04>y DE<20>(de 76 % a 59 %). Esta reducción entre DE<04>y DE<20>fue incluso menor para Mazorcas y Mazorcatodas.

Dado que la DE es un factor de la cantidad de mazorcas con una determinada cantidad de semillas recuperadas de una planta individual en una determinada generación, un usuario de estos procedimientos puede esperar recuperar mayores cantidades de semillas de una planta determinada y, por ende, podrá recuperar más probablemente al menos una cantidad mínima de semillas de cualquier cruce particular que el que utiliza procedimientos actualmente conocidos en la técnica. Por lo tanto, los usuarios de estos procedimientos tendrán más éxito en la recuperación de la cantidad mínima de semillas de un cruce en una única generación que es necesaria para analizar de manera efectiva esa población para tomar decisiones de desarrollo más exactas en un programa de mejoramiento genético y brindar los productos al mercado más rápidamente. Un usuario de estos procedimientos también podrá predecir más fácilmente la DE entre diferentes umbrales de rendimiento mínimo y, por ende, podrá anticipar más fácilmente la designación de recursos entre las poblaciones derivadas de al menos un cruce de inducción.

Ejemplo 3. La inducción de mazorcas codominantes mejora la DE de diversos germoplasmas.

Se analizaron dos poblaciones haploides derivadas de híbrido F1 (una masculina y una femenina) (en la presente mencionadas como H1 y H2) y dos líneas haploides derivadas endogámicas (Germoplasma B masculino y Germoplasma A femenino) en este experimento. Siete días después de la plantación, varias docenas de plántulas de cada grupo se retiraron de la tierra y se sometieron a un tratamiento de duplicación de cromosomas a base de colchicina en grandes cantidades tal como se describió anteriormente. Luego del tratamiento de duplicación de cromosomas, las plántulas se trasplantaron a tierra y se cuidaron en un invernadero en condiciones estándares para el crecimiento del maíz. Cuando las plántulas alcanzaron aproximadamente la etapa V7 o V8 (aproximadamente 29 días después de la duplicación en las condiciones de crecimiento utilizadas), las plántulas se sometieron al tratamiento de inducción de mazorcas codominantes que comprendía 60 mL de PBZ al 2,5 % agregados en la tierra que rodeaba la base de cada tallo.

Luego se cuidaron las plántulas en condiciones estándares de invernadero para el crecimiento de maíz hasta que florecieron, en cuyo momento cada planta que produjo polen se autopolinizó y luego se dejaron sin alterar para esperar la fertilización y producción de granos. Luego de aproximadamente 2-3 semanas, las mazorcas se cosecharon y los granos de estas (DH<1>) se contaron para determinar las eficacias de duplicación.

Las eficacias de duplicación (DE) se calcularon en los diferentes límites descritos en el ejemplo anterior para generar los valores para DE<04>, DE<20>, DE<30>y DE<50>para cada uno de los cuatro fenotipos. Asimismo, las eficacias de duplicación que anteceden se calcularon una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal de cada planta (Mazorca^, una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal y en la mazorca secundaria de cada planta (Mazorca<2>), una vez al considerar únicamente los granos que se formaron en la mazorca principal, secundaria y terciaria de cada planta (Mazorca<3>) y, finalmente, al considerar todos los granos que se formaron en todas las mazorcas de cada planta (Mazorcatodas).

Tabla 3. Eficacias de duplicación de cuatro germoplasmas en función de si se cosechó únicamente la mazorca principal (Mazorca^ o se cosecharon todas las mazorcas (Mazorcatodas).

Mazorc

Control A 72,9 60,7 48,6 48,6 81 76,9 76,9 64,8

A 64,6 37,4 30,6 23,8 81,6 71,4 71,4 64,6

Control B 64,8 44,5 40,5 32,4<6 8 , 8>56,7 56,7 44,5

B 56,7 40,5 40,5 40,5<6 8 , 8>48,6 44,5 44,5

La Tabla 3 revela que estos procedimientos pueden utilizarse con una gran diversidad de germoplasmas, incluso entre líneas endogámicas de diferentes grupos heteróticos y entre híbridos que derivan de líneas endogámicas de diferentes grupos heteróticos. También revela que a través de todos los germoplasmas y los umbrales de rendimiento mínimo, los resultados de Mazorcatodas siempre tuvieron un mejor rendimiento que los resultados de Mazorca^ lo que demuestra que un usuario de estos procedimientos puede esperar mejorar la DE al incluir los granos producidos por todas las mazorcas codominantes adicionales. Estos resultados sugieren que estos procedimientos podrían adaptarse para el uso con sustancialmente cualquier genotipo o germoplasma del maíz.

Ejemplo 4. La inducción de mazorcas codominantes combina la posibilidad de duplicación de los múltiples meristemos axilares para mejorar la DE y producir semillas.

Cuando las mazorcas DH<1>se cosecharon en el experimento descrito en el ejemplo 3, cuatro plantas DH<0>seleccionadas aleatoriamente para cada germoplasma se sometieron a un control adicional que comprendía registrar la cantidad aproximada de semillas producidas por las primeras 3 mazorcas codominantes de cada planta. La Figura<1>muestra las primeras tres mazorcas que se cultivaron de cada una de estas cuatro plantas y esa figura también se representa en la Tabla 4 a continuación. En la Tabla 4, las mazorcas se asignan a una de 4 categorías, en función de la cantidad aproximada de semillas que produjeron: las mazorcas de clase A produjeron aproximadamente 50 semillas, las mazorcas de clase B produjeron aproximadamente 20-49 semillas, las mazorcas de clase C produjeron aproximadamente 1-20 semillas y las mazorcas de clase 0 no produjeron semillas. Dos plantas no produjeron una tercera mazorca.

Tabla 4. Mazorcas clasificadas según la cantidad de semillas DH<1>que produjeron. “-” representa una situación en la cual la planta no formó una tercera mazorca. La mazorca de mayor rendimiento para cada combinación de plantagermoplasma se encuentra en negrita para facilitar las comparaciones.

N.° de planta<1 2>3 4

N.° mazorca<1>.a<2>.a 3.a<1>.a<2>.a 3.a<1>.a<2>.a 3<1>.a<2>.a 3.a Control A B A - C B C A C<0>B B<0>

A C B C C A C C C B A C<0>

Control B C C B A A<0>A<0>C B B C

B C A - B C C C A C C A C

Estos resultados revelan el descubrimiento de que diferentes mazorcas codominantes tienen diferentes potenciales de duplicación. También revela el resultado sorprendente de que las mazorcas de mayor rendimiento pueden no ser la primera mazorca o incluso ni siquiera la primera o segunda mazorca. Por ejemplo, la segunda mazorca produjo la mayor cantidad de semillas en la Planta 1 de los germoplasmas de Control A, Germoplasma A y Germoplasma B. Para la Planta 1 del Control B y la Planta 3 del Germoplasma A, la tercera mazorca presentó el mayor potencial de duplicación.

Este experimento también reveló el sorprendente resultado de que las plantas haploides sometidas a un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes invertirán más recursos para desarrollar las mazorcas que se hayan duplicado satisfactoriamente y que sean capaz de producir descendencia diploide viable, independientemente de la posición relativa de la mazorca en el tallo. Aparentemente, el desarrollo de las mazorcas haploides que no se duplican, y por lo tanto es poco probable que produzcan semillas, se detuvo. Por ejemplo, las mazorcas que no produjeron semillas, o produjeron muy pocas (1-4), en la planta n.° 2 y planta n.° 3 del germoplasma H2 aparentemente se detuvieron mientras la planta continuó claramente a invertir recursos en el desarrollo de las mazorcas que sí produjeron semillas. Esto sugiere que cuando se detiene el desarrollo de una mazorca codominante inducida que crece en una planta DHo se debe a que la mazorca no estaba duplicada y no por la posición de la mazorca en el tallo. Por lo tanto, una mazorca duplicada satisfactoriamente y codominante inducida que crece a partir de un nudo inferior es más probable de seguir el cronograma de desarrollo esperado de una mazorca codominante que una mazorca que crece más arriba en el tallo pero no está duplicada satisfactoriamente.

Ejemplo 5. La inducción de mazorcas codominantes aumenta drásticamente la producción de semillas en diploides (Solo para referencia)

Se plantaron semillas de líneas endogámicas de maíz Germoplasma A y LH244 en la tierra, germinaron y luego se trasplantaron a macetas de 10 pulgadas después de aproximadamente una semana, una plántula por maceta. Las plantas se sometieron a un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes en la etapa V8 que comprendía empapar la tierra que rodea las raíces de cada planta con 50 mL de una solución de PBZ al 2,5 % (v/v; 0,4 % de ingrediente activo). Las plantas se cuidaron en un invernadero hasta su madurez sexual, luego se autopolinizaron. Cuando la producción de semillas se completó, se contó la cantidad de mazorcas codominantes y la cantidad total de granos producidos por cada planta. Las plantas de control para cada germoplasma se procesaron de la misma manera que los grupos tratados, con la excepción de que las plantas de control no se sometieron al tratamiento de inducción de mazorcas codominantes.

Tabla 5. Cantidad promedio de mazorcas por planta y promedio de granos totales por planta recuperados de dos genotipos sometidos a un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes en comparación con un tratamiento de control.

Promedio mazorcas por Promedio granos totales po

Tratada Cont Tratada Contr Germop 8 3,5 1677 746

LH244 5,1 2,5 1126 557

La Tabla 5 revela el resultado sorprendente de que es posible aumentar drásticamente el promedio total de granos por planta producidos por dos líneas endogámicas diferentes al someter las plantas a un tratamiento de inducción de mazorcas codominantes. Ambos germoplasmas, muy distintos entre sí, respondieron al tratamiento de inducción de mazorcas codominantes al aumentar el promedio total de los granos por planta y el promedio de mazorcas por plantas a más del doble. Asimismo, todas las mazorcas registradas de los grupos tratados en la Tabla 5 fueron codominantes.

Se muestra en la Figura 2 un ejemplo representativo de una planta de Germoplasma A que produjo 8 mazorcas después del tratamiento con estos procedimientos.

Si bien las plantas de control produjeron múltiples mazorcas, no produjeron mazorcas codominantes; únicamente las mazorcas principales en las plantas de control cortaron adecuadamente para producir semillas.

Ejemplo 6. La inducción de retoños aumenta drásticamente la producción de semillas en diploides (Solo para referencia)

Las plantas de maíz diploides de una línea endogámica común se sometieron a un tratamiento de inducción de retoños que comprendía empapar la tierra que rodea las raíces con 100 mL de una solución de PBZ al 2,5 % (v/v; 0,4 % de ingrediente activo) aproximadamente una semana después de la germinación y luego se permitieron crecer hasta la madurez sexual en macetas de 10 pulgadas en un invernadero. Un grupo de control de plantas se cultivó en circunstancias idénticas, con la excepción de que no se sometieron al tratamiento de inducción de retoños.

El inhibidor de GA tuvo como resultado la expresión de plantas madre de entrenudos acortados e indujo las plantas madre a producir retoños. Luego se formaron tres grupos de tratamiento de los retoños: se permitió que los retoños del tratamiento “Co-hab” continuaran a crecer en la misma maceta con la planta madre; los del tratamiento “-Madre” también se mantuvieron en la misma maceta, pero la planta madre se retiró de esta; y los del grupo de tratamiento “Trasplantados” se trasplantaron de la maceta que contenía la planta madre en macetas separadas de 10 pulgadas, una planta por maceta. Se permitió que todos los retoños de origen natural producidos por el grupo de control crecieran en la misma maceta que la planta madre, de manera similar al tratamiento co-hab. Se permitió que todas las plantas crecieran hasta la madurez sexual y se autopolinizaran cuando se formaron las barbas y las panojas. Cuando la producción de semillas se completó, se contó y graficó en la Figura 3 el promedio total de la cantidad de semillas producidas por todas las plantas que derivaban de la misma semilla de planta madre.

Estos resultados revelan que es posible aumentar drásticamente el promedio total de semillas por plantas al someter las plantas a un tratamiento de inducción de retoño, lo que se observa por el hecho de que el grupo de tratamiento trasplantado produjo más del doble de la cantidad de semillas que el grupo de control. También revela que la mejor recuperación de semillas tuvo lugar cuando los retoños se trasplantaron de la planta madre.

Ejemplo 7. El procedimiento de inducción de retoños y duplicación de plantas haploides (Solo para referencia)

Una planta madre haploide se someterá a un tratamiento de duplicación y luego se plantará en una maceta, la tierra que rodea las raíces se empapará con 100 mL de paclobutrazol al 2,5 % y luego se cuidará en condiciones estándares de invernadero para el crecimiento de maíz durante diversos días. El inhibidor de GA resultará en la expresión de la planta madre de entrenudos acortados y una producción aumentada de retoños. Una de las plantas hijas de retoños se pueden separar de la planta madre, trasplantarse en una maceta separada y cultivarse mediante procedimientos estándares de gestión de invernaderos para recuperar en última instancia una planta hija con una morfología haploide normal. Esta planta hija producirá abundante polen y una mazorca firme que se corte adecuadamente y produzca varias docenas de semillas DH<1>cuando se autofecunde.

Se anticipa que estos procedimientos de inducción de retoño se pueden utilizar en conjunto con los procedimientos DH para aumentar drásticamente la posibilidad de recuperar semillas DH<1>de una determinada planta madre DH<0>. Se anticipa que un usuario puede inducir una planta DH<0>a formar retoños doble haploides, en donde cada uno genera mazorcas que se cortan adecuadamente con sus respectivas panojas para producir docenas de semillas doble haploides. Se espera que el usuario pueda utilizar estos procedimientos para generar la mayor cantidad de retoños como sea necesario para obtener una cantidad deseada de semillas DH<1>.

Ejemplo 8. La inducción de brote múltiple se puede utilizar en conjunto con procedimientos DH para generar rápidamente plantas homocigotas para múltiples características (Solo para referencia)

Las semillas de una planta de maíz diploide se esterilizaron en la superficie que comprendió la inmersión mediante procedimientos estándares en la técnica y luego se germinaronin vitroen medio de cultivo. Una de las plántulas resultantes se disecó de su semilla dos días después de la germinación (procedimiento de eje de embrión). El eje disecado luego se sometió a un tratamiento de inducción de brote múltiple que comprendía la transferencia a un medio nuevo de inducción de brote múltiple que contenía citocinina en la forma de 10 mg/L BAP Después de siete días en el medio de inducción de brote múltiple, las plántulas tratadas se transfirieron nuevamente a un medio de regeneración libre de hormonas.

Después de aproximadamente veinte días, los brotes múltiples inducidos se podían ver en las regiones de nudos del tallo. Estos brotes múltiples se disecaron de la planta madre y se transfirieron del medio de enraizamiento que comprendía IBA e IAA. Luego de aproximadamente una semana, las plantas derivadas de brote múltiple se trasplantaron en macetas de 10 pulgadas y se permitió que crecieran en un invernadero hasta que fuera claro que cada vástago derivado de brote múltiple que crece de forma autónoma hubiera formado mazorcas y panojas que cortaron. Luego cada mazorca se polinizó a partir de la panoja que crecía en la misma maceta y luego se permitió que todas las plantas crecieran en condiciones de invernadero hasta obtener semillas. En cada caso, las plantas derivadas de brote múltiple produjeron mazorcas que tuvieron, cada una, docenas de semillas.

Este ejemplo revela que los brotes múltiples inducidos de una única planta madre se pueden cultivar para producir mazorcas fértiles y panojas que se corten adecuadamente y produzcan excelentes conjuntos de semillas. Por lo tanto, se anticipa que un usuario de estos procedimientos puede utilizar brotes múltiples para aumentar la posibilidad de recuperar al menos una semilla de una determinada planta.

En una realización, el usuario induce una planta madre haploide sometida a la duplicación de cromosomas a un tratamiento de inducción de brotes múltiples para producir múltiples brotes doble haploides. Estos brotes múltiples se pueden cultivar para producir semillas DH.

En otra realización, el usuario somete una planta diploide que contiene al menos una característica deseada en un estado heterocigoto a un tratamiento de inducción de brote múltiple para producir diversos brotes múltiples diploides. Estos brotes múltiples se separan de la planta madre y se cultivan para producir panojas y mazorcas. A continuación, el usuario poliniza las plantas diploides derivadas de brote múltiple con un inductor haploide materno para generar descendencia haploide, al menos una que contenga el alelo deseado de la característica. La descendencia haploide puede luego someterse a un tratamiento de duplicación de colchicina para producir una planta doble haploides que contenga la característica deseada en la condición homocigota. Este procedimiento tiene el potencial para aumentar drásticamente la eficacia de crear una planta homocigota para más de una característica dado que el usuario puede inducir la formación de muchas nuevas inflorescencias de una única planta madre, lo que aumenta la posibilidad de producir un óvulo que contenga las características deseadas en un estado homocigoto de una planta madre. Una vez que una planta haploide que contiene las características deseadas en la condición homocigota se genera, el usuario puede someter a la planta a un tratamiento de duplicación de cromosomas para recuperar un diploide homocigoto.

Ejemplo 9. Manipulación de granos por planta en poblaciones doble haploides mediante el uso del regulador de crecimiento vegetal paclobutrazol.

Se plantaron plántulas doble haploides en la tierra un día después de tratarse con el agente de duplicación haploide colchicina y un total de siete días después de la germinación. Se trataron plantas de cuatro germoplasmas diferentes con Paczol (2,5 % en 60 mL equivalentes a 0,4 % de ingrediente activo Paclobutrazol) aproximadamente 37 días después de empapamiento de semillas (aproximadamente etapa V11) para formar múltiples mazorcas codominantes. Todas las plantas se polinizaron a mano durante dos días consecutivos. Las plantas con mazorcas codominantes se polinizaron a mano en dos mazorcas separadas en cada planta (las mazorcas principales y secundarias estaban en el tallo principal). Luego de completar el experimento, se determinó la cantidad total de granos por planta. La Tabla 6 a continuación ilustra los resultados de las plantas tratadas y sin tratar en cada población de germoplasma.

Tabla 6. Tratamiento con paczol de poblaciones de germoplasma dihaploides.

La cantidad de granos por planta fue casi el doble tras el tratamiento con Paczol. Ver Figuras 4 y 5.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un regulador del crecimiento vegetal para producir mazorcas codominantes en una planta de maíz haploide, que comprende poner en contacto la planta de maíz haploide con un regulador del crecimiento vegetal seleccionado del grupo que consiste en inhibidores del ácido giberélico, citoquininas y cualquier combinación de los mismos, en el que la planta de maíz haploide produce mazorcas codominantes.

2. Un procedimiento para aumentar la probabilidad de recuperar semillas DH<1>de una planta de maíz DH<0>, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la planta de maíz DH<0>con un regulador del crecimiento vegetal seleccionado del grupo que consiste en inhibidores del ácido giberélico, citoquininas y cualquier combinación de los mismos en la etapa de desarrollo V2, V3, V4, VS, V6, V7, V8, V9, V10, V11 o V12* y poner en contacto la planta de maíz DH<0>con un agente de duplicación de cromosomas en cualquier etapa de su ciclo de vida, para producir una planta de maíz DH<0>que produce al menos dos mazorcas codominantes y es capaz de producir al menos una semilla de maíz DH<1>.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la planta de maíz DH<0>con al menos dos mazorcas codominantes es capaz de producir un número total de semillas de maíz DH<1>que es mayor que el número de semillas de maíz DH<1>capaces de ser producidas por la planta de maíz DH<0>de control que exhiben una mazorca dominante.

4. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que la planta de maíz DH<0>produce una primera mazorca codominante y una segunda mazorca codominante y la segunda mazorca codominante es capaz de producir más semillas de maíz DH<1>que la primera mazorca codominante.

5. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que la planta de maíz DH<0>produce una primera mazorca codominante, una segunda mazorca codominante y una tercera mazorca codominante, y la tercera mazorca codominante es capaz de producir más semillas de maíz DH<1>que la primera mazorca codominante.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además genotipar la planta de maíz DH<0>antes de poner en contacto la planta de maíz DH<0>con el regulador del crecimiento de la planta o el agente de duplicación de cromosomas.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el procedimiento da como resultado una eficiencia de duplicación de DE<4>de al menos 15 %, da como resultado una eficiencia de duplicación de DE<20>de al menos 15 %, da como resultado una eficiencia de duplicación de DE<30>de al menos 15 %, y/o da como resultado una eficiencia de duplicación de DE<50>de al menos 15 %.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el regulador del crecimiento de las plantas es un inhibidor del ácido giberélico.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la planta de maíz se pone en contacto con el regulador del crecimiento de la planta en la etapa de desarrollo V6, V7, V8, V9 o V10.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que se producen tres o más, cuatro o más, o cinco o más mazorcas codominantes.