CN108347892A

CN108347892A - 葫芦科中的非转基因单倍体诱导系

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Publication number: CN108347892A
Application number: CN201680065324.0A
Authority: CN
Inventors: C·M·P·范邓恩; C·L·C·利弗尔特; S·莫瓦赫迪
Original assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Current assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2018-07-31
Also published as: US20180325058A1; CA3004169A1; AU2016353975A1; NL2015753B1; EP3373725A1; MX2018005120A; WO2017081011A1

Abstract

本发明涉及包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。优选地，与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比，经修饰的CENH3基因包含至少一个突变，所述至少一个突变导致编码的经修饰的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中的至少一个非保守氨基酸变化或导致编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。本发明还涉及用于产生单倍体或双单倍体植物的方法以及由此获得的植物。

Description

葫芦科中的非转基因单倍体诱导系

本发明涉及可用作非转基因单倍体诱导系的葫芦科(Cucurbitaceae)的突变型植物。本发明还涉及所述植物的部分以及所述植物的后代。

在植物育种中，主要目标是在单一基因组中尽可能多地组合所需性状，同时尽可能多地消除不想要的性状。这是一个缓慢的过程，需要许多个体品系的杂交，在几个生长季节期间评估此类杂交的结果，并选择有前景的后代进行进一步研究。通常选定的品系表现出一些非常好的特征(诸如，例如，较大的果实、耐旱性、抗病性、较快的萌发能力等)，但也有许多不被消费者和/或被植物种植者接受的次优性质。然后需要将选定品系的有趣特征引入商业上可接受的遗传背景中，而不丧失任何商业上重要的性状，最终得到纯种育种系，其中所有期望的性状都被遗传上固定。这种努力通常需要多代回交，因为遗传上不连锁的性状倾向于彼此分离，因此这是一个非常缓慢的过程。取决于物种的平均世代时间(从种子到种子)，新的植物品种的产生可能需要8至20年。纯育种品系可以例如用作杂交品种的亲本。将两个自交系(其基因组高度纯合)互相杂交，并且出售产生的杂交种子。杂交品系通常显示其亲本的优良特性的组合，并且由于其基因组的高杂合性(杂种优势)，它们通常优于它们的两个亲本。

可以通过使用双单倍体(doubled haploid,DH)品系来加速植物育种，该品系在一代内具有完全纯合的基因组。DH的一个重要有利方面是它们是能育的且可以无限地进行有性繁殖。

DH可以通过例如雄核发育或雌核发育方案或通过使用单倍体诱导系统从植物的孢子产生。随后将这些单倍体植物的基因组加倍，这解释了它们为什么是完全纯合的。基因组加倍既可以自发发生，或可以通过添加有丝分裂阻断性的化学物质诸如秋水仙碱、氨磺乐灵或氟乐灵诱导。这导致形成双单倍体植物(DH植物，DH)，其能够产生种子。以这种方式，双单倍体系是永生化的。每个DH系代表来源于起始植物的亲本的性状的一种特定组合，其源于减数分裂期间所有遗传上不连锁的性状的改组。

通过以下过程从起始植物的孢子产生DH：首先通过雄核发育诸如小孢子培养或花药培养，通过雌核发育，或通过诱导由受精事件产生的合子的母本或父本染色体的丧失来产生单倍体植物，然后使由此获得的单倍体植物的基因组加倍。技术人员非常熟悉产生DH的这些方法，并且他知道哪种方法在他喜欢的植物物种中效果最好。基因组加倍可以自发发生，或者其可通过应用化学物质诸如秋水仙碱、氨磺乐灵或氟乐灵来诱导。这些化学物质在有丝分裂期间破坏纺锤体的形成，并且通常用于阻断有丝分裂。

由受精事件产生的合子的母本染色体的丧失可通过使用单倍体诱导系作为杂交中的雌性来诱导。已在各种植物物种中描述了单倍体诱导系统，例如当雌性杂交配偶体是与雄性杂交配偶体不同的物种的植物时。在种间杂交中，诸如在小麦与珍珠粟之间、大麦和球茎大麦之间以及烟草(红花烟草(Nicotiana tabacum))与非洲烟草(Nicotianaafricana)之间的杂交中，经常观察到亲本之一的基因组的丧失。

对于葫芦科家族成员，有DH的高效体外产生方案可供利用(参见，例如&Niemirowicz-Szczytt 2013,Folia Hort.25:67-78；美国专利5,492,827)。然而，DH方案不适用于所有的基因型，并且几种类型的葫芦不适合于标准体外单倍体诱导技术。由于一直没有描述过导致亲本基因组之一的丧失的种间杂交，因此一直以来不可能体内获得DH。与体外方法相比，在体内产生DH具有明确的物流有利方面(logistic advantages)：它不太费劳力，并且其不需要用于植物材料无菌培养的细胞生物学实验室或受控生长设施。

因此，本发明的一个目的是提供用于属于葫芦科的植物的体内单倍体诱导系统。

在文献中，已经描述了用于拟南芥的通过基因组消除获得单倍体植物的体内系统。该系统基于重组改变的CENH3(着丝粒组蛋白H3)多肽在具有相应的失活内源CENH3基因的植物中的转基因表达(Maruthachalam Ravi和Simon WL Chan；Haploid plantsproduced by centromere-mediated genome elimination；Nature 464(2010),615-619；US-2011/0083202；WO2011/044132)。CENH3是作为动粒复合体一部分的着丝粒组蛋白，其在有丝分裂和减数分裂期间在染色体分离中发挥重要作用。CENH3由高度可变的N端尾部结构域和保守的组蛋白折叠结构域(HFD)组成。将拟南芥CENH3的N-末端尾部结构域与另一个组蛋白的N-末端尾部结构域交换并且同时融合至绿色荧光蛋白(GFP)导致其中表达该重组融合蛋白的拟南芥植物部分不育的情况。当与野生型拟南芥植物杂交时，表达该重组融合蛋白的亲本的染色体在胚发生过程中发生错误分离，导致相应的亲本基因组消除以及单倍体植物的产生，所述单倍体植物的染色体完全来源于野生型亲本。随后可如上所述实现基因组加倍。CENH3似乎是一个必需基因，因为拟南芥中的无效突变体显示胚致死性。

然而，根据例如欧洲目前的法律，通过该方法产生的单倍体植物被认为是转基因的，具有转基因生物(GMO)身份，尽管它们本身不含转基因构建体。对于任何具有GMO身份的品系获得商业用途以及动物和/或人消费的批准，其需要经历广泛的监管程序，这是非常昂贵和耗时的。此外，在全球食品市场的重要部分，转基因食品不允许供人消费，也不受公众理解。

因此，本发明的另一个目的是提供一种用于属于葫芦科的植物的体内单倍体诱导系统，其产生可在商业上出售而不需要监管批准的非转基因植物。

在导致本发明的研究中，开发了在CENH3基因中具有单倍体诱导效应的新突变的葫芦科植物。令人惊讶地发现，当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时，这些新的突变体产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

因此，本发明提供了包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，该突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。本发明的突变型植物可以用作杂交的雌性亲本或雄性亲本，并且在两种情况下都可以获得单倍体后代。

本发明还涉及植物的部分、种子和其它繁殖材料以及植物的后代。所述部分、种子、繁殖材料和后代在其基因组中包含所述突变。

合适地，本发明的经修饰的CENH3基因不是天然存在的，并且其包含已经由人诱导的突变。可以通过本领域已知的许多方法将突变引入植物基因组的DNA序列中。随机诱变包括使用化合物来诱导突变(诸如甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸乙酯、苯酚和环氧乙烷)，使用物理手段诱导突变(诸如紫外线照射、快中子暴露、X射线、γ照射)以及插入遗传元件(诸如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件)。还可通过同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统(诸如CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1)，以靶向、受控的方式引入突变。

植物基因组中突变的存在可以通过现有技术中已知的许多不同技术来检测，包括但不限于DNA测序、RNA测序、SNP微阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)、测定、KASP^TM测定、TaqMan^TM测定。

术语“经修饰的CENH3基因”是指CENH3基因，其为天然存在的(野生型)CENH3基因的非天然存在的变体，其相对于相应的野生型CENH3基因包含至少一个非同义的核苷酸变化并编码经修饰的CENH3蛋白。非同义的核苷酸变化是编码核苷酸序列中的点突变，其改变了其编码的蛋白质的氨基酸序列。这可以是错义突变，所述错义突变是其中单个核苷酸变化导致编码与相应野生型序列中不同的氨基酸的密码子的点突变，或者其可以是无义突变，所述无义突变是其中单个核苷酸变化导致密码子改变为提前终止密码子的点突变。错义突变导致与相应的野生型蛋白相比具有至少一个氨基酸变化的经修饰的CENH3蛋白表达，无义突变导致与相应的野生型蛋白相比被截短的经修饰的CENH3蛋白表达。

术语“经修饰的CENH3蛋白”是指作为天然存在的(野生型)CENH3蛋白的非天然存在的变体的CENH3蛋白，当与相应的野生型蛋白序列相比时，其包含至少一个氨基酸变化或提前终止密码子。

与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比，本发明的经修饰的CENH3基因合适地包含至少一个突变，所述至少一个突变导致编码的蛋白质中的至少一个氨基酸变化或导致编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。

在一个优选的实施方案中，经修饰的CENH3蛋白中的修饰包括组蛋白折叠结构域中的突变(图2)，所述突变影响编码的CENH3蛋白的功能。在一个实施方案中，所述突变是无义突变，即其导致提前终止密码子(TAA、TAG或TGA)发生，从而导致编码蛋白的更短的截短形式表达。在另一个实施方案中，所述突变导致编码的蛋白质中的氨基酸变化，使得编码的蛋白质的正常功能受损。

优选地，经修饰的CENH3蛋白质包含经预测就蛋白质的生物学功能而言不被耐受的氨基酸变化。可在计算机中，例如利用SIFT(Ng和Henikoff,2001,Genome Res.11:863-874)预测给定蛋白质的背景中氨基酸取代的作用。

当氨基酸被具有不同化学性质的另一种氨基酸取代(即非保守性氨基酸取代，也称为非保守性氨基酸变化)时(例如，当疏水性、非极性氨基酸诸如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp或Met被亲水性的极性氨基酸诸如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn或Gln取代时，或当酸性带负电荷的氨基酸诸如Asp或Glu被碱性带正电荷的氨基酸诸如Lys、Arg或His取代时)，“不被耐受的”氨基酸变化可发生。

在一个实施方案中，本发明的植物是在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:1)的位置102处具有提前终止密码子的黄瓜(黄瓜(cucumber)植物，所述提前终止密码子是由编码基因序列中的该位置处的CAA密码子(编码谷氨酰胺，Q)突变成TAA终止密码子导致的。所述植物表达CENH3蛋白的截短形式(SEQ ID No:4)。

本发明还涉及在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:2)的位置102处具有提前终止密码子的甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜(watermelon))植物，所述提前终止密码子是由编码基因序列中的该位置处的CAA密码子(编码谷氨酰胺，Q)突变成TAA终止密码子导致的。所述植物表达CENH3蛋白的截短形式(SEQ ID No:5)。

本发明还涉及在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:3)的位置122处具有提前终止密码子的西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜(watermelon))植物，所述提前终止密码子是由编码基因序列中的该位置处的CAA密码子(编码谷氨酰胺，Q)突变成TAA终止密码子导致的。所述植物表达CENH3蛋白的截短形式(SEQ ID No:6)。

本发明还涉及在对应于来自黄瓜或甜瓜的直向同源蛋白中的位置102和来自西瓜的直向同源蛋白中的位置122的位置处具有提前停止密码子的葫芦科植物，如图1的比对中所示，所述提前停止密码子适当地是由编码基因序列中该位置处的CAA或CAG密码子(编码谷氨酰胺，Q)突变成TAA或TAG终止密码子导致的。

在另一个实施方案中，所述植物是在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:1)的位置115处具有缬氨酸的黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜(cucumber))植物，所述缬氨酸是由编码基因序列中该位置处的GAT密码子(编码天冬氨酸，D)突变成GTT密码子(编码缬氨酸，V)导致的。经修饰的蛋白质序列为SEQ ID No:7。

本发明还涉及在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:2)的位置115处具有缬氨酸的甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜(melon))植物，所述缬氨酸是由编码序列中该位置处的GAC密码子(编码天冬氨酸，D)突变成GTC密码子(编码缬氨酸，V)导致的。经修饰的蛋白质序列是SEQID No:8。

本发明还涉及在CENH3蛋白序列(SEQ ID No:3)的位置135处具有缬氨酸的西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜(watermelon))植物，所述缬氨酸是由编码基因序列中该位置处的GAT密码子(编码天冬氨酸，D)突变成GTT密码子(编码缬氨酸，V)导致的。经修饰的蛋白质序列为SEQ ID No:9。在来自西瓜的CENH3蛋白中，位置135对应于来自黄瓜和甜瓜的直向同源蛋白中的位置115，如可在图1中看到的。

本发明还涉及这样的葫芦科植物，所述植物在对应于来自黄瓜或甜瓜的直向同源蛋白中的位置115和对应于来自西瓜的直向同源蛋白中的位置135的位置处具有缬氨酸，如图1的比对中所示，所述缬氨酸合适地是由编码基因序列中该位置处的CAA或CAG密码子(编码谷氨酰胺，Q)突变成TAA或TAG终止密码子导致的。

来自黄瓜、甜瓜和西瓜的野生型编码DNA序列(CDS)可分别见于SEQ ID No:10、11和12，并且上文中提及的密码子在其中加下划线。

因此，本发明提供了包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体，其中所述修饰优选导致编码的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中出现提前终止密码子或导致非保守氨基酸变化。

本发明还提供了包含编码对应于SEQ ID No:4或SEQ ID No:7的蛋白质的经修饰的CENH3基因的突变型黄瓜植物，所述突变型黄瓜植物与具有2n条染色体的野生型黄瓜植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

本发明还提供了包含编码对应于SEQ ID No:5或SEQ ID No:8的蛋白质的经修饰的CENH3基因的突变型甜瓜植物，所述植物当与具有2n条染色体的野生型甜瓜植物杂交时产生后代，其中至少0.1％有n条染色体。

本发明还提供了包含编码对应于SEQ ID No:6或SEQ ID No:9的蛋白质的经修饰的CENH3基因的突变型西瓜植物，所述突变型西瓜植物当与具有2n条染色体的野生型西瓜植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

本发明还涉及所述突变型植物用于产生单倍体或双单倍体植物的用途。

本发明还涉及用于产生单倍体或双单倍体植物的方法，其包括：

a)提供根据本发明的葫芦科的突变型植物；

b)将所述突变型植物作为一个亲本与相同物种的野生型植物作为另一亲本杂交；

c)生长来自杂交的后代种子；

d)选择具有仅包含来自野生型亲本的染色体的单倍体基因组的后代植物和具有仅包含来自野生型亲本的染色体的二倍体基因组的后代植物；

e)任选地将步骤d)中选择的单倍体后代植物的基因组加倍。

本发明还涉及可通过上述方法获得的葫芦科的单倍体和双单倍体植物。

本发明还提供属于葫芦科的植物，其中除了CENH3基因中的所述至少一个突变以外，所述植物在另一个着丝粒组蛋白编码基因中具有至少一个突变。

在一个实施方案中，另一个着丝粒组蛋白编码基因中的所述至少一个突变位于CENP-C(着丝粒蛋白C)基因中。因此，本发明还提供了葫芦科的突变型植物，其包含经修饰的CENH3基因和经修饰的CENP-C基因，该突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

合适地，所述突变型植物中的经修饰的CENH3基因与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比包含至少一个突变，所述至少一个突变导致编码的经修饰的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中的至少一个非保守氨基酸变化或导致编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。合适地，所述突变型植物中的经修饰的CENP-C基因与在其它方面相同的天然存在的CENP-C基因相比包含至少一个突变，其中所述突变导致出现提前终止密码子或导致不被耐受的氨基酸变化，优选在编码的经修饰的CENP-C蛋白的C端区域中。C-末端区域包含CENP-C蛋白序列的C-末端处约85个氨基酸的高度保守区域。

本发明还提供了突变型黄瓜植物，其包含编码对应于SEQ ID No:4或SEQ ID No:7的蛋白质的经修饰的CENH3基因和编码与SEQ ID No:13的CENP-C蛋白相比包含至少一个非保守氨基酸变化或提前终止密码子(优选在C末端区域中)的蛋白质的经修饰的CENP-C基因，所述突变型黄瓜植物在与具有2n条染色体的野生型黄瓜植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。所述C末端区域始于SEQ ID No:13的序列中的位置646，并且其在该序列中加以下划线表示。

本发明还提供了突变型甜瓜植物，其包含编码对应于SEQ ID No:5或SEQ ID No:8的蛋白质的经修饰的CENH3基因和编码修饰的CENP-C蛋白质的经修饰CENP-C基因，所述修饰的CENP-C蛋白质与SEQ ID No:14的CENP-C蛋白相比包含至少一个不被耐受的氨基酸变化或提前终止密码子(优选在C末端区域)，所述突变型甜瓜植物在与具有2n条染色体的野生型甜瓜植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。所述C末端区域始于SEQ IDNo:14的序列的位置645，并且其在该序列中加以下划线表示。

本发明可应用于属于葫芦科(Cucurbitaceae)的植物。这种植物科包括各种商业上重要的属，诸如南瓜属(Cucurbita)、黄瓜属(Cucumis)、葫芦属(Lagenaria)、西瓜属(Citrullus)、丝瓜属(Luffa)、冬瓜属(Benincasa)、苦瓜属(Momordica)和括楼属(Trichosantes)。这些属包括以下蔬菜种：黄瓜属的种(黄瓜、甜瓜、小黄瓜)、南瓜属的种(小西葫芦、南瓜、西葫芦)、西瓜属的种(西瓜)、冬瓜(Benincasa cerifera)(冬瓜)、瓠瓜(Lagenaria leucantha)(葫芦)、丝瓜(Luffa acutangula)(脊葫芦(ridge gourd))、丝瓜(Luffa cylindrica)(丝瓜(sponge gourd))、苦瓜(Momordica charantia)(苦瓜(bittergourd))和瓜叶栝楼(Trichosantes cucumerina)(蛇瓜)等。

下面的实施例将进一步说明本发明。在这些实施例中参考以下附图。

附图

图1：来自甜瓜(甜瓜(Cucumis melo))、西瓜(西瓜(Citrullus lanatus))和黄瓜(黄瓜(Cucumis sativus))的CENH3蛋白序列的比对。比对之下的星号表示在来自所有三种物种的蛋白质中相同的氨基酸位置。序列保守性在组蛋白折叠域(其始于氨基酸基序PGTVAL)中尤其高。

图2：来自甜瓜(甜瓜(Cucumis melo))、西瓜(甜瓜(Citrullus lanatus))和黄瓜(黄瓜(Cucumis sativus))的CENH3蛋白序列的组蛋白折叠结构域(HFD)区域的序列比对。该结构域的序列在所有三个物种中几乎完全相同。

实施例

实施例1

葫芦科中的CENH3直向同源物的鉴定

通过使用核苷酸Blasting程序(BLASTN)将CENH3的保守组蛋白折叠结构域与葫芦科作物物种的基因组序列进行比较，在葫芦科物种中鉴定了CENH3基因的直向同源物。该搜索导致黄瓜(SEQ ID No:1，由SEQ ID No:10编码)、甜瓜(SEQ ID No:2，由SEQ ID No:11编码)和西瓜(SEQ ID No:3，由SEQ ID No:12编码)中的CENH3基因以及它们编码的CENH3蛋白的鉴定。图1显示这三种蛋白质序列之间的比对。

序列比较显示CENH3的HFD区在属于葫芦科的这三种商业上重要的蔬菜物种中非常保守。仅在HFD结构域中的96个位置中的两个位置观察到差异。这显示于图2的比对中。这种高度保守性表明，可以可靠地预期经发现在这些物种之一中导致单倍体诱导表型的任何突变在另外的物种中引起相同的表型。因此，可将从葫芦科物种之一的CENH3中具有突变的HFD的植物的研究中获得的信息直接移换至其它葫芦科物种，因为该突变的作用在其它葫芦科物种中是相同的。

实施例2

具有单倍体诱导表型的cenh3突变型黄瓜植物的鉴定

使用EMS(甲磺酸乙酯)对黄瓜(黄瓜(Cucumis sativus))品系KK5735的植物进行诱变。在TILLING方法(靶向诱导的基因组局部损伤)中，随后对EMS诱变群体的6144株植物筛选CENH3基因中的点突变。该筛选导致许多在CENH3的HFD中具有突变的植物的鉴定。

在该筛选中鉴定了表达在位置102(其中野生型序列具有谷氨酰胺，Q，参考SEQ IDNo:1中的氨基酸位置)处具有提前终止密码子的突变的CENH3蛋白的黄瓜植物，并且发现该植物具有以杂合状态存在的所述突变。在该突变型植物中表达的CENH3蛋白对应于SEQ IDNo:4。SIFT分析预测了所述突变在功能上不被耐受。

用来自野生型黄瓜植物的花粉对该植物进行授粉，该植物在遗传上与KK 5735系不同，使得可以选择一组多态性分子标记，采用该多肽性分子标记，该杂交的两个亲本以及它们的杂交后代可通过其基因组的分子标记分析来明确地鉴定。

收获杂交后获得的果实，收集种子并播种于琼脂培养基(含有10g L^-1蔗糖的0.5xMS盐)中，并在长日照条件(16小时光照，8小时黑暗)于25℃孵育。当幼苗足够大时，从子叶中获取组织样品以进行分子标记分析。该分析揭示大多数后代植物是母系KK5735和遗传上不同的父系的杂种，但约1％的后代植物显示与父系遗传上相同。

将这些植物移植至温室中的土壤中以供进一步分析。流式细胞术显示，这些小植株中的大多数是单倍体，尽管其中一些自发地使其基因组加倍，并已变成双单倍体。将单倍体后代植物用秋水仙碱处理以诱导基因组加倍。

实施例3

具有单倍体诱导表型的cenh3突变型甜瓜植物的鉴定

使用EMS(甲磺酸乙酯)对甜瓜(甜瓜(Cucumis melo))Charentais型品系ME 5.176的植物进行诱变。在TILLING方法(靶向诱导的基因组局部损伤)中，随后对EMS诱变群体的约6000株植物筛选CENH3基因中的点突变。该筛选导致许多在CENH3的HFD中具有突变的植物的鉴定。

在该筛选中鉴定了表达突变的CENH3蛋白的甜瓜植物，其中CENH3的位置115处的氨基酸是缬氨酸，而甜瓜中该蛋白质的野生型形式(SEQ ID No：2)在该位置处具有天冬氨酸。该突变型植物中表达的CENH3蛋白对应于SEQ ID No:8，并且该经修饰的形式被称为D115V。通过SIFT分析预测D>V突变在功能上不被耐受。发现该植物对于该突变是杂合的，将其自交以获得对于该突变为纯合的植物。

随后用来自在遗传上与品系ME 5.176不同的野生型罗马甜瓜(Charentaismelon)植物的花粉对D115V突变纯合型甜瓜植物进行授粉，使得可以选择一组多态性分子标记，利用所述多态性分子标记，通过对它们的基因组进行分子标记分析能够明确地鉴定该杂交的两个亲本以及它们的杂交后代。收获杂交后获得的果实，收集种子并播种于琼脂培养基(含有10g L^-1蔗糖的0.5x MS盐)中，并在长日照条件(16小时光照，8小时黑暗)下于25℃培育。当幼苗足够大时，从子叶中获取组织样品以进行分子标记分析。该分析揭示大多数后代植物是母系ME 5.176和遗传上不同的父系的杂种，但约1.5％的后代植物显示与父系遗传上相同。将这些植物移植至温室中的土壤中以供进一步分析。流式细胞术显示，这些小植株中的大多数是单倍体，尽管其中一些自发地使其基因组加倍，并已变成双单倍体。将单倍体后代植物用秋水仙碱处理以诱导基因组加倍。

序列

SEQ ID No:1

>CsCENH3_黄瓜

MARARHPPRRKSNRTPSGSGAAQSSPTAPSTPLNGRTQNVRQAQNSSSRTIKKKKRFRPGTVALKEIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRWQAEALVALQEAAEDFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:2

>CmCENH3_甜瓜

MARARHPVQRKSNRTSSGSGAALSPPAVPSTPLNGRTQNVRKAQSPPSRTKKKKIRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRWQAEALVALQEAAEDFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:3

>CENH3_西瓜

MARGRHPAQRKSNRMPSGTGSAQSSPAAPSTGLRDISREGGSKYLEYLVYLPLSGRTQSVGQAQSSPLRTTKKKKRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSYQLAPQITRWQAEALVALQEAAEDFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:4

>CsCENH3_黄瓜_Q102*

MARARHPPRRKSNRTPSGSGAAQSSPTAPSTPLNGRTQNVRQAQNSSSRTIKKKKRFRPGTVALKEIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRW

SEQ ID No:5

>CmCENH3_甜瓜_Q102*

MARARHPVQRKSNRTSSGSGAALSPPAVPSTPLNGRTQNVRKAQSPPSRTKKKKIRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRW

SEQ ID No:6

>CENH3_西瓜_Q122*

MARGRHPAQRKSNRMPSGTGSAQSSPAAPSTGLRDISREGGSKYLEYLVYLPLSGRTQSVGQAQSSPLRTTKKKKRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSYQLAPQITRW

SEQ ID No:7

>CsCENH3_黄瓜_D115V

MARARHPPRRKSNRTPSGSGAAQSSPTAPSTPLNGRTQNVRQAQNSSSRTIKKKKRFRPGTVALKEIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRWQAEALVALQEAAEVFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:8

>CmCENH3_甜瓜_D115V

MARARHPVQRKSNRTSSGSGAALSPPAVPSTPLNGRTQNVRKAQSPPSRTKKKKIRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSNQLAPQITRWQAEALVALQEAAEVFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:9

>CENH3_西瓜_D135V

MARGRHPAQRKSNRMPSGTGSAQSSPAAPSTGLRDISREGGSKYLEYLVYLPLSGRTQSVGQAQSSPLRTTKKKKRFRPGTVALREIRNLQKSWNLLIPASCFIRAVKEVSYQLAPQITRWQAEALVALQEAAEVFLVHLFEDTMLCAIHAKRVTIMKKDFELARRLGGKGRPW

SEQ ID No:10

>CsCENH3_黄瓜_CDS

ATGGCGCGAGCCAGGCATCCACCCCGAAGAAAGTCCAATCGCACGCCATCAGGTTCTGGAGCTGCACAGTCTTCCCCAACTGCCCCTTCGACGCCACTTAATGGGAGAACGCAAAATGTCAGGCAAGCTCAAAACTCATCGTCAAGAACAATAAAGAAAAAAAAACGCTTCAGACCAGGGACAGTGGCATTAAAAGAAATTCGGAATCTCCAGAAATCATGGAATCTGCTAATTCCAGCTAGCTGTTTCATTCGAGCAGTGAAAGAAGTAAGCAACCAGTTGGCTCCACAGATTACGCGTTGGCAAGCTGAAGCTTTAGTAGCTCTTCAGGAAGCAGCAGAAGATTTTTTGGTTCACCTATTTGAAGATACCATGCTGTGTGCTATTCATGCCAAACGTGTAACTATCATGAAAAAGGATTTTGAACTGGCACGTCGGTTAGGAGGGAAAGGGAGGCCATGGTGA

SEQ ID No:11

>CmCENH3_甜瓜_CDS

ATGGCGCGAGCCAGGCATCCAGTCCAAAGAAAGTCCAATCGCACGTCATCAGGTTCTGGAGCTGCACTGTCTCCCCCAGCTGTCCCTTCGACGCCACTCAATGGGAGAACACAAAATGTCAGGAAAGCTCAAAGCCCACCATCAAGAACAAAGAAAAAAAAAATACGCTTCAGACCAGGAACGGTGGCATTGAGAGAAATTCGGAATCTCCAGAAATCATGGAATCTGCTAATTCCAGCTAGCTGTTTCATCCGAGCAGTGAAAGAAGTAAGCAACCAGTTGGCTCCACAGATTACGAGATGGCAAGCTGAAGCTTTAGTAGCTCTTCAGGAAGCCGCAGAAGACTTTTTGGTTCACCTATTTGAAGATACCATGCTGTGTGCTATTCATGCCAAGCGTGTAACTATCATGAAAAAGGATTTTGAACTGGCACGTCGATTAGGAGGGAAAGGGAGGCCATGGTGA

SEQ ID No:12

>ClCENH3_西瓜_CDS

ATGGCGCGAGGGAGGCATCCAGCCCAAAGGAAGTCCAATCGCATGCCATCAGGTACTGGATCTGCACAGTCTTCCCCAGCTGCGCCTTCGACGGGCTTGAGAGATATCTCAAGAGAGGGAGGGTCCAAGTACCTTGAATACTTGGTTTATCTTCCACTTAGTGGAAGAACACAAAGTGTGGGGCAAGCTCAAAGCTCACCATTGAGGACAACAAAGAAAAAAAAACGTTTCAGACCAGGGACGGTAGCATTGAGGGAAATTCGGAATCTCCAGAAATCATGGAATCTGCTAATTCCAGCTAGCTGTTTCATCCGAGCAGTGAAAGAAGTAAGCTACCAGTTGGCTCCACAGATTACCCGTTGGCAAGCTGAAGCTTTAGTAGCTCTTCAGGAAGCAGCAGAAGATTTTTTGGTTCATCTATTTGAAGATACCATGCTGTGTGCTATTCATGCCAAGCGTGTAACTATCATGAAAAAGGATTTTGAACTGGCACGTCGGTTAGGAGGGAAAGGGAGGCCATGGTGA

SEQ ID No:13

>CENPC_黄瓜

MITMANEEARHSDVIDPLAAYSGINLFSTAFGTLPDPSKPHDLGTDLDGIHKRLKSMVLRSPSKLLEQARSILDGNSNSMISEAATFLVKNEKNEEATVKAEENLQERRPALNRKRARFSLKPDARQPPVNLEPTFDIKQLKDPEEFFLAYEKHENAKKEIQKQTGAVLKDLNQQNPSTNTRQRRPGILGRSVRYKHQYSSIATEDDQNVDPSQVTFDSGIFSPLKLGTETHPSPHIIDSEKKTDEDVAFEEEEEEEELVASATKAENRINDILNEFLSGNCEDLEGDRAINILQERLQIKPLTLEKLCLPDLEAIPTMNLKSSRSNLSKRSLISVDNQLQKIEILKSKQDNVNLVNPVSTPSSMRSPLASLSALNRRISLSNSSSDSFSAHGIDQSPSRDPYLFELGNHLSDAVGNTEQSSVSKLKPLLTRDGGTVANGIKPSKILSGDDSMSNISSSNILNVPQVGGNTALSGTYASTEAKNVSVSSTDVEINEKLSCLEAQADAVANMQIEDHEGSASEQPKLSEVDLIKEYPVGIRSQLDQSAATCTENIVDGSSRSSGTEHRDEMEDHEGSASEQPKSSKVDVIKEYPVAIQSQLDQSTTTTCAENIADGASRSSGTDHHDGEQVKPKSRANKQHKGKKISRRQSLAGAGTTWQSGVRRSTRFKTRPLEYWKGERLLYGR VHESLTTVIGLKYVSPAKGNGKPTMKVKSLVSNEYKDLVELAALH

SEQ ID No:14

>CENPC_甜瓜

MTMVNEETRPSDVIDPLAAYSGINLFPTAFGTLTDPSKPHDLGTDLDGIHKRLKSMVLRSPSKLLEQARSILDGNSKSMISEAATFLVKNEKNEAASVKAEENPQERRPALNRKRARFSLKPDAGQPPVNLEPTFDIKQLKDPEEFFLAYEKHENAKKEIQKQMGAVLKDLNQQNPSTNTRQRRPGILGRSVRYKHQYSSITTEDDQNVDPSQVTFDSGVFSPLKLGTETHPSPHIIDSEKKTDEDVAFEEEEEEEELVASATKAENRVNDILDEFLSGNCEDLEGDRAINILQERLQIKPLTLEKLCLPDLEAIPTMNLKSTRGNLSKRSLISVDNQLQKTETLKSKEDNENLVNLVSTPSSMRSPLASLSALNRRISLSNSSGDSFSAHGIDRSPARDPYLFELGNHLSDAVGITEHSSVSKLKPLLTRDGGTIANGIQPSKILSGDDSMSKISSSNILNVLQVGSNTALSGTYASTDAKNVSGSSTDVEINEKLSCLEAQADVVANMQIDHQGSASEQPKLSEVDLIEEYPVGIRSQLDQSAATCTENIVDGSSRSSGTEHHDEMEDHEGSASEQPNSSKVDMIKEYPVGIQIQLDQSTTTTTCAEKIVDGTSRSSGTDHHDEEQVKPKSRANKQRKGKKISGRQSLAGAGTTWKSGVRRSTRFKIRPLEYWKGERMLYGRV HESLATVIGLKYVSPEKGNGKPTMKVKSLVSNEYKDLVDLAALH

Claims

1.一种包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

2.权利要求1的突变型植物，其中与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比，所述经修饰的CENH3基因包含至少一个突变，所述至少一个突变导致所述编码的经修饰的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中的至少一个非保守氨基酸变化或导致所述编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。

3.权利要求1或2的突变型植物，其中所述植物是黄瓜(Cucumis sativus)植物，并且所述经修饰的CENH3基因编码对应于SEQ ID No:4或SEQ ID No:7的蛋白质。

4.权利要求1或2的突变型植物，其中所述植物是甜瓜(Cucumis melo)植物，并且所述经修饰的CENH3基因编码对应于SEQ ID No:5或SEQ ID No:8的蛋白质。

5.权利要求1或2所述的突变型植物，其中所述植物是西瓜(Citrullus lanatus)植物，并且所述经修饰的CENH3基因编码对应于SEQ ID No:6或SEQ ID No:9的蛋白质。

6.权利要求1-5中任一项的突变型植物的部分，特别是种子和其它繁殖材料，所述部分在其基因组中包含所述突变。

7.权利要求1-5中任一项的突变型植物用于产生单倍体或双单倍体植物的用途。

8.一种产生单倍体或双单倍体植物的方法，其包括：

a)提供根据权利要求1-5的任一项的突变型植物；

c)生长来自杂交的后代种子；

d)选择具有仅包含来自所述野生型亲本的染色体的单倍体基因组的后代植物和具有仅包含来自所述野生型亲本的染色体的二倍体基因组的后代植物；

e)任选地将步骤d)中选择的单倍体后代植物的基因组加倍。

9.通过权利要求8的方法能够获得的双单倍体植物。