CN103957698A - 四重育种 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，所述方法包括将有限数目的父本配子置于花的柱头上，以使母体卵细胞受精，以获得许多接合子，所述父本配子具有四分体或二分体的形式；并且诱导从接合子的母本染色体的丧失，以获得含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合。在优选实施方案中，父本植物显示出在减数分裂过程中的染色体重组抑制或第二次分裂重构（SDR）。

Description

四重育种
发明领域
本发明涉及用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同。本发明进一步涉及含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合，所述集合由遗传上互补的种子对组成，当由该种子生长的植物杂交时，导致基本上相同的杂种。本发明还涉及用于提供亲本植物集合用于生产植物的方法，所述植物的遗传构成与其雄性祖父的遗传构成基本上相同。
发明背景
植物育种对应于用于人类利益的植物物种的驯化，以获得足够质量和数量的食物、饲料和纤维。植物育种是非常古老的人类工作并且仅在二十世纪的过程中，实用性知识接受科学基础。植物育种最初基于选择且繁殖这些植物，所述植物在局部选择地域中胜出。随着遗传规律的再发现和统计工具的开发，植物育种变得基于遗传学的知识，并且在技术上由诸如下述方法支持：加倍单倍体（DH）-参见例如，Haploids in CropImprovement第II版；Palmer C，Keller W和Kasha K（2005）于Biotechnology in Agriculture and Forestry第56版；Nagata T，H和Widholm J.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，ISBN3-500-22224-3-和分子标记-参见例如De Vienne编辑（2003）Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology.Sciencepublishers Inc.Enfield，NH USA.ISBN1-57808-239-0。
植物育种传递适合特定环境的遗传概念，这允许其以经济方式的开发。植物育种的这个目的通过遗传变异的有效利用来实现，所述遗传变异在植物物种的种质内存在。此类遗传概念包含在特定环境中导致希望表型的基因的组合。这意指以生长植物且收获产物所需的最低可能成本，收获的植物部分在产量和质量方面达到最大。当植物育种在商业水平上应用时，种子生产也是重要的问题。种子生产旨在借助于有性生殖的植物增殖，其中遗传组成得到保存。
此外，商品种子需要具有足够质量以允许有效发芽。然而，通过有性生殖的遗传构成的保存是矛盾的，因为有性生殖根本在于产生具有新等位基因组合的后代。在有性生殖过程中起作用的遗传机制已进化为增加遗传变异，以便增强物种在不断改变的环境中的生存机会。减数分裂重组、独立的染色体分配和交配系统是在这方面的主要促成因素。通过有性生殖在后代中的一致性因此仅在亲本植物完全纯合时才能实现。组合此类植物的配子将导致在每个后续代中亲本遗传组成的确切再现。
在许多作物中，商品种子来自两个纯合亲本系的杂交。这种方法确保F1杂种对于几个基因座是杂合的，这可导致杂种优势和均匀性。如果育种者希望改良现有F1杂种变种或近交变种，则他在传统上需要制备杂交且经历几轮经验选择来实现这个目的。
因为与植物生长和发育有关的基因功能的知识仍是有限的，所以育种者在很大程度上仍依赖表型选择。因为尤其是在早代过程中，在近交过程中许多基因处于杂合状态，所以负责赋予个体植物一些的表型值的基因的等位基因变体可以容易地丧失。这是由于下述事实：在有性生殖和近交的过程中，杂合性和特定基因相互作用丧失。因此，在植物育种中，尤其在其中已鉴定遗传上杂合的植物具有高农艺、园艺或观赏价值的那些情况下，这些机制可以反效果起作用。有性生殖将导致所需等位基因的分离。
因此，存在关于技术的强烈需要，所述技术有效允许在具有高农艺、园艺或观赏价值的植物的有性生殖过程中的遗传构成的保存。
延续植物同时保存遗传构成的一个可能性是通过营养繁殖。这允许遗传组成的完全保存，因为增殖唯一地通过有丝分裂而发生。植物已进化出营养繁殖的自然机制，这允许它们很快占据栖息地。例如，营养繁殖可以通过块茎、鳞茎或根茎的形成而发生。备选方法是使用体外或体内培养技术，以产生扦插。当与通过种子繁殖相比较时，营养繁殖技术的商业缺点是下述事实：它是劳动密集的且因此是昂贵的。此外，难以将植物贮存更长时间段，这造成物流问题，并且与其中植物材料通过种子繁殖的情况相比较，植物材料由病原体样病毒感染的危险大得多。
备选地，营养繁殖可以通过无性种子的形成而实现，这一般被称为无融合生殖。这个现象在许多物种中自然发生，并且它可以通过基因工程在有性繁殖的植物物种中诱导。在理论上，这可以通过利用特定基因来实现，所述特定基因自然诱导无融合生殖的三个不同步骤，即不完全减数分裂、孤雌生殖和自主胚乳发育。然而，在实践中，负责不同步骤的基因尚未得到鉴定，并且它们的相互作用可能是相当复杂的。
另一方面，无融合生殖组分的人工改造可能是相当可行的。例如，通过修饰在减数分裂过程中的不同步骤，已显示减数分裂可以基本上转换成有丝分裂。这个所谓的“MiMe方法”利用突变的组合，所述突变抑制双链断裂（spo11-1）、在减数分裂I期过程中诱导姐妹染色单体分离（rec8）且跳过第二次减数分裂细胞分裂（osd1）。组合这种方法与孤雌生殖和自主胚乳形成可以最终导致经改造的无融合生殖（d’Erfurth等人:Turning meiosis into mitosis；PLoS Biology2009；WO/2010/079432）。尽管很长时间以来，无融合生殖技术用于植物育种的潜力已得到广泛公认，但概念证明仍无法获得。
作为另外一种备选方法，可以利用反向育种技术（WO03/017753）。反向育种基于通过基因工程或化学干扰的减数分裂重组的抑制，和源自含有未重组亲本染色体的孢子的加倍单倍体植物（DH）的后续产生。这些DH仅由于在减数分裂过程中发生的独立的亲本染色体分配存在其遗传重组不同。因此，足以利用一个共显性、多态性标记/染色体，以测定哪些源自其的DH或系应通过杂交组合，以重构原始起始植物的遗传组成。像这样，反向育种技术的应用允许任何可育选择植物通过种子的遗传保存，即使它的遗传组成是未知的。
这种技术的缺点在于下述事实：减数分裂重组的完全抑制导致交叉的不存在。这可以导致在减数分裂I期过程中的不适当的染色体分离，这可以导致配子的非整倍性且因此导致减少的配子活力和性能。当在减数分裂I期过程中未形成交叉时，每一条染色体都具有移动到极中任一个的独立的50%机会。这意味着制备具有完全染色体组成的孢子的理论机会为（1/2）n，其中n代表单倍染色体数目。平衡配子的频率因此随增加的单倍染色体数目而降低。尽管许多作物物种具有相对低的染色体数目（例如，黄瓜具有7条染色体/单倍体基因组；菠菜仅具有6条），但还存在经济上重要的具有相对高染色体数目的物种。良好实例是番茄，经济上最重要的蔬菜作物之一，其具有12条染色体/单倍体基因组。这种技术约束显著减少反向育种技术的效率。
作为另一个备选方法可以利用由未减数的孢子再生的植物。这种技术已命名为近反向育种（WO2006/094773）。未减数的孢子优先由于第二次减数分裂的省略而形成。这个自然发生的现象被称为第二次分裂重构（SDR），并且它可以在伴随常规减数分裂事件的有性生殖过程中在植物中发生。
近反向育种技术采用通过由未减数的孢子再生植物的SDR事件，所述未减数的孢子通过自然或经改造的SDR产生。已发现了在突变时引起SDR的基因，例如OSD1和TAM1。所得到的植物（称为SDR-0植物）主要是纯合的，并且它们随后可以用于产生常规DH。在起始植物的父本和母本基因组之间存在多态性的分子标记可以用于鉴定这些SDR-0植物（及其衍生的DH），其在很大程度上关于其遗传组成是互补的。
这些植物的杂交将导致原始起始植物的基因构成的接近完全的重构。然而，由于在SDR-0事件形成的过程中和在其衍生的DH形成的过程中的减数分裂重组，互补性将不是完全的。重构的杂种在一定程度上在遗传上不同于彼此且不同于原始起始杂种植物。然而，当与其中DH直接源自常规减数分裂事件的情况相比较时，这个变异是强烈减少的。此外，这些DH是遗传上固定的，这意味着不存在进一步选择的余地。
在这个过程中整合SDR事件的优点是关于遗传互补性的选择在两步过程中发生。第一个步骤集中于染色体的近侧区域，即包括着丝粒。第二个步骤针对染色体的远端，即由于重组而交换的那些区域。这个延迟的遗传固定减少复杂性，并且增加发现大量互补基因型的机会，尤其当分子标记可用于选择时。
这种方法的进一步优点在于下述事实：SDR可以在有性生殖过程中自然发生，并且它可以像这样利用，而无需进一步干扰有性生殖过程。进一步增加SDR事件的正常流行率的方法是本领域已知的，例如通过用N2O的胁迫处理（如先前在下述植物中描述的：百合:Barba-Gonzalez等人（2006），Euphytica148:303-309；和郁金香：Okazaki等人.（2005），Euphytica143:101-114）。
本发明的目的是进一步增加上述方法用于保存杂合植物的遗传构成的效率，所述植物具有极佳的农艺、园艺或观赏性质。
本发明利用特定突变可以导致在花粉形成过程中小孢子的分离方面的缺陷的观察。这导致四花粉粒簇的形成，所述四花粉粒在其发育自始至终保持物理上附着在一起。尽管在簇中的个体花粉粒在成熟时在四分体中保持在一起，但它们是可育的，并可以各自执行受精且在授粉后产生种子。关于这个所谓的四重表型的生物学解释是溶解果胶层的失败，所述果胶层通常仅在花粉发育的早期存在于小孢子之间。
本发明因此涉及用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，所述方法包括：
a）将有限数目的父本配子置于花的柱头上，以使母体卵细胞受精，以获得许多接合子，所述父本配子具有四分体或二分体的形式；
b）诱导来自接合子的母本染色体的丧失，以获得含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合。
“遗传上相同的”意指一粒种子的所有染色体都与相应配子的染色体相同，并且在种子内的染色体组合与相应配子相同。
在导致本发明的研究中，另外惊讶地发现组合在现有技术中可获得的方法与上述特定突变（其导致在花粉形成过程中小孢子的分离中的缺陷），导致可以由其鉴定具有基本上互补的遗传构成的亲本植物效率中的极大增加，其在杂交后引起具有与其父本祖父基本上相同的遗传构成的杂合植物。本发明可以与之组合的此类方法是例如反向育种和近反向育种。
四重表型（quartet phenotype）例如在Copenhaver等人（2000）Plant Physiology124，7-15中描述。不同的非同源基因中的突变可以导致相似的四重表型（例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的qrt1、qrt2和qrt3）。QRT3基因（在拟南芥属中：At4g20050）已进行分子表征，并且它编码多聚半乳糖醛酸酶的不同类别的成员（Rhee等人.（2003）Plant Physiology133:1170-1180）。这些突变用于提供用于在根据本发明的方法中使用的四分体。
在四花粉粒簇中的个体花粉粒含有单一减数分裂细胞分裂的产物。当个体花粉四重体给植物受精时，当受精效率为100%时，这理想地导致4粒种子的形成。四分体的四个个体花粉粒代表单一减数分裂细胞分裂的产物的事实具有关于其为本发明主题的技术的有利牵涉。
在减数分裂开始时，初始过程是基因组DNA的复制。随后，在前期过程中，同源染色体对齐且折断（synaps），以形成二价染色体。在这个阶段过程中，形成使用对齐的非姐妹染色单体进行修复的双链断裂（DSB）。在修复过程中的染色体相互作用导致称为双重单倍体（holiday）连接的特定结构的形成，所述特定结构被分解。这导致基因转换或交换。交换（CO）事件最终以交叉的形式可见，所述交叉是在减数分裂I期过程中的适当同源分离在结构上所需的。关于本发明，应注意到与CO的分布无关，减数分裂I期的产物关于其等位基因组成始终彼此完全互补。在第二个减数分裂过程中，姐妹染色单体分离到相对极，引起最后的减数分裂产物，即四个单倍体细胞。通常，这四个减数分裂产物在其进一步发育过程中变得彼此脱离，并且它们将与相同花药室内部的源自其他减数分裂事件的花粉粒混合。然而，当母本植物显示出四重表型时，单个减数分裂事件的四个产物在物理上保持在一起。
在四分体中四个花粉粒的集合可以含有可变程度的遗传互补性，其为单倍染色体数目的函数。因为减数分裂I期的产物在彼此间完全互补，所以在四分体中结合在一起的四个花粉粒含有至少50%互补性。关于每个四分体的特定结果由机会决定，并且这个机会遵循由所谓的帕斯卡三角（Pascal’s Triangle）获得的分布（图1）。
例如，黄瓜具有7条单倍染色体。第一次减数分裂导致两个完全互补的减数分裂产物。在第二次减数分裂过程中，染色体可以在减数分裂I期的两个产物各自中随机分离，这可以导致2n=27=128个不同产物。一般而言，可以陈述在n条染色体的情况下，总共2n个不同四分体可以得自单个减数分裂事件。完全互补事件的数目始终是1，即在每行上的第一个数目（图1），而在每行上的第二个数目对应于单倍染色体的数目。相同行中的后续数目对应于在四分体中分别具有2、3、4、5和6条非互补染色体的预期数目的减数分裂产物。
在黄瓜的实例中，具有源于任何给定减数分裂事件的128个不同减数分裂产物，这些数目分别为21、35、35、21和7。因为减数分裂I期的产物彼此完全互补，所以在四分体中不存在染色体无一互补的极端情况，因为始终存在与其他减数分裂I期产物的染色体的互补性。具有一条非互补染色体的事件数目因此是7*2，具有两条非互补染色体的事件数目是21*2，等等。如果例如3条染色体是非互补的，则这暗示其他四条是互补的。在花粉四分体的四个成员中发现某一程度的互补性的概率（机会百分比）由图2中的表格给出。在黄瓜的花粉四分体内遇到具有0、1、2或3条非互补染色体（且因此分别具有7、6、5或4条互补染色体）的减数分裂产物的机会因此分别是1.6%（=（1+1）/128）、10.9%（=（7+7）/128）、32.8%（=（21+21）/128）和54.7%（=（35+35）/128）。
重要的是，在这个背景下的“非互补的”实际上仅指这些染色体的端粒端。如果我们例如具有含3条非互补染色体和在重组后仅40%杂合性的情况，则7条染色体中的4条将是完全互补的，而其他3条染色体仍是60%互补的。本质上，四分体星座（tetrad constellation）因此导致这样的情况：其中花粉粒对于50%的染色体始终至少完全互补配对，和-由于重组-对于剩余染色体仍部分互补配对。本发明因此实现杂种植物的基因型的接近完全重构，同时仍允许与花粉四分体源自其的原始杂种植物相比较0-50%的变异，以执行本发明。
这种方法因此允许杂种植物相同或接近相同的遗传构成的重构。接近相同的重构具有确定优点，因为这允许评估另外的遗传变异对目的杂种表型的作用。这个另外的遗传变异可以证明为对杂种表型具有有利或不利作用，并且这将允许优良杂种表型的进一步遗传改良。关于四条染色体的情况在图3中图解举例说明。
本发明的重要方面是四分小孢子用于给母本植物授粉的用途，这从其杂种后代中消除母本基因组。此类植物的实例近来已由Maruthachalam和Chan（Haploid plants produced bycentromere-mediated genome elimination；Nature464（2010），615-619；美国专利申请20110083202；WO2011044132）在拟南芥属中描述，但这个实例决不限制本发明的应用，因为本发明还可以对于其他单倍体诱导系统执行。
从杂种后代中消除母本基因组因此可以借助于内源着丝粒特异性组蛋白CENH3由经修饰形式的转基因替换来实现。在实践中，经修饰形式的CENH3蛋白质在缺乏功能内源CENH3基因的植物中过表达。
备选地，当在具有相应失活的内源CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因的植物中过表达，CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽也可以用于相同目的。适当地，植物内源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因组编码序列的一种或两种等位基因被失活或敲除，并且优选地，所有等位基因都被失活或敲除。当植物与野生型植物杂交时，生成例如至少0.1%单倍体后代。
优选地，多肽是重组改变的CENH3多肽。多肽可以包含与包含CENH3组蛋白折叠结构域的蛋白质连接的具有至少五个氨基酸（或备选地，至少十个氨基酸）的异源氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与CENH3组蛋白折叠结构域异源。适当地，所述异源氨基酸序列与CENH3组蛋白折叠结构域直接连接，并且多肽缺乏CENH3尾部结构域。备选地，异源氨基酸序列可以经由间插蛋白质序列与CENH3组蛋白折叠结构域连接。这个间插蛋白质序列可以包含CENH3尾部结构域或非CENH3组蛋白H3尾部结构域（并且随后重组蛋白质对应于CENH3蛋白质的尾部交换形式）。
适当地，当干扰蛋白质包含CENH3组蛋白H3尾部结构域时，CENH3尾部结构域可以与CENH3组蛋白折叠结构域异源。当多肽包含CENH3组蛋白折叠结构域和截短的CENH3尾部结构域时，尾部结构域的氨基末端相对于植物的内源尾部结构域是截短的。
由于F1后代是单倍体的事实，用来自野生型父本植物的花粉给此类转基因补助植物授粉导致不育后代。事实上，每个F1后代用于受精和它源于其的花粉粒在遗传上相同。野生型和经修饰的染色体在接合子中的动粒（kinetochore）装配中明显不相容。染色体的自主或诱导倍增导致DH的形成。CENH3是植物中的保守和可能单拷贝的基因，并且这个系统因此还可以应用于作物物种。如果种子形成由于胚乳失衡而有问题，则可以执行胚拯救。
在另一个实施方案中，可以借助于其他单倍体诱导系统或通过种间杂交（如由例如Bains&Howard1950，Nature166:795描述的），从F1后代中消除母本基因组。
在进一步的实施方案中，四重突变还可以与反向育种技术（WO03/017753；Dirks等人.2009，Plant Biotech J7:837-845）组合，从而极大改善反向育种的效率。在这个实施方案中，通过遗传、转基因或化学方法，使四重表型与父本植物中的减数分裂染色体重组抑制组合。虽然四重突变导致在花粉成熟时在四分体中的单次减数分裂的4个产物的物理附着，但重组的抑制确保这些花粉粒含有未重组的亲本染色体。本发明因此确保具有互补遗传组成的DH可以在源自来自单次减数分裂的花粉的四个DH中容易地鉴定，具有一个共显性、多态性标记/染色体。
反向育种的缺点可能是不平衡（非整倍体）孢子的出现。然而，能够在形态上鉴定平衡四分体（例如通过在视觉上选择其中四个花粉粒在大小中相等（其指示所有染色体的相等分布）的四分体，或借助于例如流式细胞术），并且由此类四分体再生的DH自动互补配对。当平衡四分体用于给母本植物授粉时，这从其杂种后代中消除母本基因组，这将导致关于其遗传组成互补配对的4粒单倍体种子。互补DH或其衍生的系的后续杂交将导致原始起始植物的遗传组成的重构。当这个杂交的四个后代植物在杂交前未进行基因分型时，通过使这四个植物中的两个随机杂交获得原始起始植物的遗传组成重构的机会是50%。
在另一个实施方案中，四重表型可以与近反向育种（WO2006/094773）组合。在这个实施方案中，在显示出四重表型的植物中的第二次分裂重构（SDR）的发生将导致通过父本植物的花粉二分体的产生，所述花粉二分体包含具有完全互补的遗传组成的两个二倍体花粉粒，其包括相同的染色体断点。用此类花粉二分体给母本植物授粉将导致两个二倍体植物，并且使这两个植物彼此杂交将导致原始杂种的遗传组成的接近完全重组，所述母本植物从其杂种后代中消除母本基因组。
“接近完全的”在本申请中指的是下述事实：两个植物一起具有与其父本植物相同的遗传材料（因为在减数分裂过程中未丧失或获得DNA），但由于在减数分裂过程中的交换事件，染色体区段的相对基因组位置可以是不同的。然而，染色体断点的位置在两个植物中是相同的，因为它们源于单次有丝分裂事件。互补SDR-0系的鉴定因此通过利用四重表型得到极大促进，并且任何给定杂种的遗传组成的接近完全重构变得容易和有效得多。
由于在SDR-0事件的形成过程中的减数分裂重组，重构将不是100%完全的，因为重构的杂种由于CO在一定程度上在遗传上不同于彼此且不同于原始起始杂种（父本）植物，尤其是在端粒（telomers）处。这个特征因此提供了另外的遗传变异在预先选择的优良杂种植物中产生的另外优点，通过提供备选和轻微不同的基因组排列，同时维持大多数原始杂种的构成。这可以导致杂种表型的进一步改良。
本发明的进一步目的是提供用于获得种子集合的有效方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，并且所述种子集合由遗传上基本上互补的种子对组成，当由该种子对生长的植物杂交时，导致基本上相同的杂种植物。这个杂种植物与产生雄配子的植物在遗传上基本上相同，所述种子集合起于所述雄配子。
如本文使用的“基本上”意指种子对的遗传互补性无需是100%，因为杂种植物的接近完全重构也可能是希望的，如上所述（因为它可以提供进一步改良杂种表型的机会）。此类接近完全重构的杂种植物与原始杂种植物和可通过本发明获得的其他接近完全重构的杂种植物仅基本上相同，因为尽管它具有与原始杂种植物相同或很大程度上相同的遗传材料，由于不同的交换事件，在其基因组中可能存在备选或略微不同的基因组排列，或由于重组，一些基因组区域可以是纯合的。当减数分裂交换发生时，“基本上”因此涉及在花粉粒形成的过程中发生的交换程度，所述花粉粒用于授粉单倍体诱导物母本植物。
在另一个背景下，例如在不存在减数分裂重组的情况下，“基本上”还可以指种子对的选择（从通过本发明获得的种子集合中），所述种子对并非彼此100%遗传上互补的。在也预期落入本发明的范围内的这个实施方案中，例如，可以选择一对种子（从所述种子集合中），该对种子对于n-1条染色体（其中n是物种的单倍染色体数目）彼此互补，并且对于剩余染色体是相同的。对于除了一个外的全部染色体，起因于由这对种子生长的植物的杂交的杂种植物则与原始杂种植物在遗传上相同，并且对于剩余染色体不同（即纯合的）。总体上，植物因此仅是“基本上”遗传上相同的。此类植物可以例如在优选实施方案中执行本发明时获得，伴随减数分裂重组（“反向育种”）的抑制。应当理解相同概念对于n-2条染色体、n-3条染色体等等完成。这个概念允许例如在仅集中于其染色体的子集时的植物基因组和表型分析，并且同时留下杂种基因组的剩余部分不改变。
本发明因此涉及用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，所述方法包括：
a）将有限数目的父本配子置于花的柱头上，以使母体卵细胞受精，以获得许多接合子，所述父本配子具有四分体或二分体的形式；
b）诱导从接合子的母本染色体的丧失，以获得含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合。
在这个方法中，在用于胚珠受精的花粉管中的竞争优选应降到最低或得到阻止，以避免在四分体或二分体中包含的花粉粒中的一些未能给胚珠受精。因此，有限的授粉是优选的，从而使得当存在沉积到其柱头上的花粉粒时，至少存在同样多的已授粉花的雌性生殖器官中的胚珠。每个花粉粒随后应能够给胚珠受精。
在一个实施方案中，父本配子的有限数目因此等于或低于携带柱头的雌性生殖器官中含有的卵细胞数目。
每朵花的卵细胞或胚珠的平均数目是关于父本配子数目的优选上限，是熟悉特定作物的技术人员已知的，所述父本配子数目可以成功地用于这种方法中。它一般略微高于该作物的典型果实中存在的种子的平均数目。对于番茄，例如，每朵花的卵细胞的平均数目为约100，对于芸苔属物种（species）约35，对于拟南芥属约40-50，对于西瓜约200，对于葡萄约4，对于黄瓜约250-300，对于甜椒约100，并且对于甜瓜约500。Burd等人.，Am.J.Bot.96（6），1159-1167（2009）描述了关于在187个被子植物物种中每朵花的胚珠数目的研究。
有限数目的父本配子适当地包含允许以有效方式使用本发明的方法的任何数目。这意指必须避免雄配子中的太多遗传变异，即引起在单个柱头上沉积的雄配子的减数分裂事件数目应保持很低，如果这些减数分裂事件各自在个体配子的基因组中生成很大程度的遗传重排，所述配子构成二分体或四分体（通过染色体重组）。
在优选实施方案中，父本配子的有限数目是二或四（分别对应于在单个花粉二分体或四分体中包含的配子数目，并且因此分别源自在第二次减数分裂的不存在或存在下的单次减数分裂）。这个策略将导致四粒种子（在四分体用于授粉的情况下）或两粒种子（在二分体用于授粉的情况下）的形成，所述种子与源于单次减数分裂的花粉粒在遗传上相同。当配子具有二分体的形式时，允许以有效方式使用本发明方法的父本配子的有限数目可以比二高得多，因为遗传变异的量极大减少，由于在二分体内包含的两个配子在遗传上完全彼此互补。尤其当使用具有二分体形式的配子时，因此有效使用任何数目的配子，其小于每朵花的卵细胞或胚珠的平均数目。
雄配子的四分体或二分体形式是在父本植物中干扰四分小孢子分离的结果。在一个实施方案中，干扰四分小孢子分离包括干扰涉及小孢子之间的果胶层分解的一种或多种靶基因，所述果胶层分解起因于单次减数分裂。一种或多种靶基因可以选自QRT1、QRT2、QRT3或其功能同系物。合适的突变是在靶基因中引入终止密码子或移码，破坏蛋白质结构和/或功能的氨基酸取代，和遗传元件例如T-DNA插入基因的编码序列、启动子或其他调节序列内。在拟南芥属中，qrt1-4突变起因于T-DNA插入QRT1基因的外显子内，qrt1-5突变体中的四重突变体表型通过T-DNA插入QRT1基因的启动子内引起，并且qrt1-6突变通过T-DNA插入QRT1基因的启动子内引起。拟南芥属中的qrt2-1突变体包含在QRT2蛋白质中的第372位上的缬氨酸至丙氨酸的氨基酸取代（GTG至GCG突变），其为这个突变系中的四重表型的潜在原因。
在另一个实施方案中，干扰四分小孢子分离包括通过化学方法干扰起因于单次减数分裂的小孢子之间的果胶层分解。QRT基因产物是在个体雄配子（小孢子）之间存在的果胶多糖（果胶）层分解中起作用的酶，所述个体雄配子源于花粉母细胞的减数分裂。如果这个果胶层未降解，则四个雄配子（小孢子）以四分体形式保持彼此物理上附着。
干扰涉及四分小孢子分离的一种或多种靶基因可以通过许多不同方法来实现。干扰靶基因可以由阻止其转录组成。在一个实施方案中，靶基因的转录可以借助于针对靶基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。
在另一个实施方案中，转录借助于表达对靶基因启动子起作用的负作用转录因子得到阻止。此外，干扰靶基因还可以由使靶基因mRNA或转录物失稳组成。这可以借助于核酸分子来实现，所述核酸分子与靶基因mRNA或转录物互补且选自反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默（VIGS）分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。
干扰靶基因还可以由借助于一种或多种显性负性核酸构建体，或借助于一种或多种化学化合物抑制靶基因表达产物组成。
在另外一个实施方案中，干扰靶基因由一种或多种突变引入靶基因内，导致其生物学功能的扰动组成。一种或多种突变可以随机引入，该引入借助于一种或多种化学化合物（例如甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林（formaline）、聚氨酯、苯酚、环氧乙烷）和/或物理方法（例如UV照射、快中子暴露、X射线、γ照射）和/或遗传元件（例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件）的插入-或具体地，借助于同源重组或基于寡核苷酸的突变诱导。
干扰四分小孢子分离的化学方法包括使用化学抑制剂，其减少QRT基因产物的活性（或稳定性），或使用化学制品，其直接或间接减少QRT基因产物的表达水平，导致起因于单次减数分裂事件的在四个小孢子之间的果胶层的持久性。QRT蛋白质的酶活性可以借助于化学抑制剂得到抑制，从而使得用抑制性化学制品处理在正常小孢子分离的阶段（或先前阶段）过程中的花芽，导致源自单次减数分裂事件的小孢子之间的果胶层的持久性，并且因此在晚期发育阶段过程中和在开花时的四分小孢子的持久性。
在优选实施方案中，除了四重表型外，产生所述雄配子（以四分体或二分体）的父本植物还显示出染色体重组的抑制，其取消染色体交换且导致整条染色体的完整传送。在这个实施方案中，在四分体的个体花粉粒中鉴定两个遗传上互补的基因组的机会是50百分比。当产生所述雄配子的父本植物显示出染色体重组的抑制时，染色体重组的这个抑制通过干扰参与重组的一种或多种靶基因来实现。
在一个实施方案中，靶基因涉及双链断裂，并且它可以选自SPO11、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、RED1、HOP1、RAD50、MRE11、XRS2或其功能同系物。
在另一个实施方案中，靶基因涉及染色体配对和/或链交换，并且它可以选自RHD54/TID1、DMC1、SAE3、RED1、HOP1、HOP2、REC8、MER1、MRE2、ZIP1、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA1、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HIM6、CHK2或其功能同系物。
在另外一个实施方案中，靶基因涉及减数分裂重组过程，并且它可以选自SGS1、MSH4、MSH5、ZIP1和ZIP2或其功能同系物。
在另一个实施方案中，靶基因选自PRD1、PRD2、PRD3、PHS1、NBS1、COM1、MND1、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOC1、ZYP1、MLH1、MLH3或其功能同系物。
干扰涉及重组的一种或多种靶基因可以通过许多不同方法来实现。干扰靶基因可以由阻止其转录组成。
在一个实施方案中，靶基因的转录可以借助于针对靶基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。在另一个实施方案中，转录借助于表达对靶基因启动子起作用的负作用转录因子得到阻止。此外，干扰靶基因还可以由使靶基因mRNA或转录物失稳组成。这可以借助于核酸分子来实现，所述核酸分子与靶基因mRNA或转录物互补且选自反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默（VIGS）分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。干扰靶基因还可以由借助于一种或多种显性负性核酸构建体，或借助于一种或多种化学化合物抑制靶基因表达产物组成。
在另外一个实施方案中，干扰靶基因由一种或多种突变引入靶基因内，导致其生物学功能的扰动组成。一种或多种突变可以随机引入，该引入借助于一种或多种化学化合物（例如甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、聚氨酯、苯酚、环氧乙烷）和/或物理方法（例如UV照射、快中子暴露、X射线、γ照射）和/或遗传元件（例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件）的插入-或具体地，借助于同源重组或基于寡核苷酸的突变诱导。
在另一个优选实施方案中，除了四重表型外，产生所述雄配子的父本植物还显示出在减数分裂过程中的第二次分裂重构（SDR）。在这个实施方案中，父本植物产生雄配子，其为2n并具有二分体的形式，因为第二次减数分裂不发生。在一个二分体中包含的两个雄配子在遗传上完全互补，并且在二分体的两个个体花粉粒中鉴定两个遗传上互补的基因组的机会因此是100百分比。
当产生所述雄配子的父本植物显示出在减数分裂过程中的第二次分裂重构时，这个第二次分裂重构可以自发发生，而不干扰起始生物体。在另一个实施方案中，第二次分裂重构借助于遗传修饰进行诱导。这个遗传修饰可以是瞬时的，或它可以通过将遗传元件（例如转基因、突变、转座子、逆转录病毒元件、T-DNA）稳定掺入基因组内来实现，所述遗传元件增加生物体中的第二次分裂重构事件数目。
在另外一个实施方案中，第二次分裂重构通过对父本植物实施环境胁迫来实现，所述环境胁迫例如温度胁迫、NO2、氧化亚氮（N2O）或其组合（Zhang等人.（2002）Journal of Horticultural Science&Biotechnology78:84-88；WO2006/094773；Barba-Gonzalez等人.（2006），Euphytica148:303-309；Okazaki等人.（2005），Euphytica143:101-114）。
从接合子的母本染色体的丧失以获得含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合可以以不同方式实现。在一个实施方案中，单倍体诱导系可以用作雌性。单倍体诱导系是其中双亲之一的染色体从接合子的基因组中消除，所述接合子在卵细胞由花粉受精后形成。雌性可以例如是不同物种的植物，如已由例如Bains&Howard1950，Nature166:795描述的。在另一个实施方案中，从接合子的母本染色体的丧失起因于使用转基因植物作为母本生物体，所述转基因植物包含异源转基因表达盒，该表达盒包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码重组改变的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相应失活的内源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因，如WO2011/044132中所述的。
本发明还涉及含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合，所述集合由基本上在遗传上互补的种子对组成，所述种子对在杂交时导致基本上相同的杂种，并且所述种子集合可通过本发明的方法获得。这个种子集合的种子都具有相同父本，因为它们源于用有限数目的父本配子给母本植物授粉，所述父本配子具有四分体或二分体的形式，所述父本配子已从单个父本植物中收集。因为这点，并且由于母本染色体从接合子中消除，所以从遗传观点来看，所述种子集合的种子仅具有一个雄性祖父亲本和一个雌性祖母亲本，即其父本的双亲。这在图4中示意性表示。
本发明还涉及用于产生植物的亲本植物集合，所述产生的植物的遗传构成与其雄性祖父的遗传构成基本上相同，所述产生包括在倍增种子的染色体数目之后或之前，由本发明的种子集合的种子生长植物，并且将两个遗传上互补的植物鉴定为亲本植物。此类遗传上互补的植物可以借助于分子（遗传）标记进行鉴定，父本植物（其产生雄配子）对于所述标记是杂合的，并且两个父本祖父母对于所述标记具有不同等位基因。这些标记可以用许多不同方法进行评分，例如特定基因组区的直接DNA测序、AFLP、RFLP、SSR、RAPD、KASPar（KBioscience）、InvaderTM或Invader PlusTM（参见例如De Vienne编辑（2003）Molecular Markersin Plant Genetics and Biotechnology.Science publishers Inc.Enfield，NH USA.ISBN1-57808-239-0）。
本发明进一步涉及用于就其遗传构成筛选种子集合或其生长的植物的方法，以鉴定其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物，并且鉴定其遗传构成与其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一个植物。
其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物随后可以与其遗传构成和其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一个植物杂交，以便获得其遗传构成与其自身祖父的遗传构成基本上相同的后代植物。对于‘其自身祖父’，（杂种）植物意指产生花粉四分体或花粉二分体，用于单倍体诱导系的授粉。这个系谱在图4中图解举例说明且阐明。
本发明进一步涉及在倍增种子的染色体数目之后或之前，所述种子集合用于鉴定两个遗传上互补的植物作为用于杂交的双亲的用途。
本发明可以对其进行实践的作物物种包括例如烟草、白杨、甜菜、油菜、大豆、番茄、黄瓜、小黄瓜、玉米生菜、菠菜、辣椒、矮牵牛、马铃薯、茄子、甜瓜、西瓜、胡萝卜、萝卜、蔬菜芸苔属物种（甘蓝、花椰菜、青花菜、球茎甘蓝、抱子甘蓝）、豆、豌豆、洋葱、草莓、食用甜菜、芦笋和葡萄藤。
本发明进一步在下述条款中描述。
条款
本发明涉及：
1.用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，所述方法包括：
a）将有限数目的父本配子置于花的柱头上，以使母体卵细胞受精，以获得许多接合子，所述父本配子具有四分体或二分体的形式；
b）诱导从接合子的母本染色体的丧失，以获得含有其中母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合。
2.根据条款1的方法，其中父本配子的有限数目等于或低于携带柱头的雌性生殖器官中含有的卵细胞数目。
3.根据条款1或2的方法，其中父本配子的有限数目是二或四。
4.根据条款1-3的任何组合的方法，其中具有四分体或二分体形式的父本配子是干扰四分小孢子分离的结果。
5.根据条款4的方法，其中干扰四分小孢子分离包括干扰涉及小孢子之间的果胶层分解的一种或多种靶基因，所述小孢子起因于单次减数分裂。
6.根据条款5的方法，其中所述一种或多种靶基因选自QRT1、QRT2、QRT3或其功能同系物。
7.根据条款4的方法，其中干扰四分小孢子分离通过化学方法来实现。
8.根据条款1-7的任何组合的方法，其中所述父本植物显示出染色体重组的抑制。
9.根据条款1-7的任何组合的方法，其中所述父本植物显示出在减数分裂过程中的第二次分裂重构（SDR）。
10.根据条款8的方法，其中所述染色体重组的抑制通过干扰参与重组的一种或多种靶基因来实现。
11.根据条款10的方法，其中所述靶基因涉及双链断裂。
12.根据条款11的方法，其中所述靶基因选自SPO11、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、RED1、HOP1、RAD50、MRE11、XRS2或其功能同系物。
13.根据条款10的方法，其中所述靶基因涉及染色体配对和/或链交换。
14.根据条款13的方法，其中所述靶基因选自RHD54/TID1、DMC1、SAE3、RED1、HOP1、HOP2、REC8、MER1、MRE2、ZIP1、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HIM6、CHK2或其功能同系物。
15.根据条款10的方法，其中所述靶基因涉及减数分裂重组过程。
16.根据条款15的方法，其中所述靶基因选自SGS1、MSH4、MSH5、ZIP1和ZIP2或其功能同系物。
17.根据条款5和/或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由阻止其转录组成。
18.根据条款17的方法，其中转录借助于针对所述靶基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。
19.根据条款17的方法，其中转录借助于表达对所述靶基因启动子起作用的负作用转录因子得到阻止。
20.根据条款5和/或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由使所述靶基因mRNA或转录物失稳组成。
21.根据条款20的方法，其中所述靶基因mRNA借助于核酸分子失稳，所述核酸分子与所述靶基因mRNA或转录物互补且选自反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默（VIGS）分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。
22.根据条款5和/或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由抑制所述靶基因表达产物组成。
23.根据条款22的方法，其中所述靶基因表达产物借助于一种或多种显性负性核酸构建体的一种或多种表达产物得到抑制。
24.根据条款22的方法，其中所述靶基因表达产物借助于一种或多种化学化合物得到抑制。
25.根据条款5和/或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由一种或多种突变引入所述靶基因内，导致其生物学功能的扰动组成。
26.根据条款25的方法，其中所述一种或多种突变借助于一种或多种化学化合物和/或物理方法和/或遗传元件的插入而随机引入。
27.根据条款26的方法，其中所述一种或多种化学化合物选自甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、聚氨酯、苯酚和环氧乙烷。
28.根据条款26的方法，其中所述物理方法选自UV照射、快中子暴露、X射线、γ照射。
29.根据条款26的方法，其中所述遗传元件选自转座子、T-DNA、逆转录病毒元件。
30.根据条款25的方法，其中所述一种或多种突变借助于同源重组或基于寡核苷酸的突变诱导而特异性引入。
31.根据条款9的方法，其中第二次分裂重构自发发生，特别地不干扰所述起始生物体。
32.根据条款9的方法，其中第二次分裂重构借助于遗传修饰进行诱导。
33.根据条款32的方法，其中所述遗传修饰是瞬时的。
34.根据条款32的方法，其中所述遗传修饰通过将遗传元件稳定掺入所述基因组内来实现，所述遗传元件增加所述生物体中的第二次分裂重构事件数目。
35.根据条款9的方法，其中第二次分裂重构通过对所述父本植物实施环境胁迫来实现。
36.根据条款35的方法，其中所述环境胁迫选自温度胁迫、NO2、氧化亚氮（N2O）或其组合。
37.根据条款1-36的任何组合的方法，其中从所述接合子的母本染色体的丧失通过使用单倍体诱导系作为所述雌性进行诱导。
38.根据条款37的方法，其中所述雌性是不同物种的植物。
39.根据条款1-37的任何组合的方法，其中所述雌性植物是包含异源转基因表达盒的转基因植物，所述表达盒包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码重组改变的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相应失活的内源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因。
40.含有其中所述母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合，所述集合由遗传上互补的种子对组成，当由所述种子生长的植物杂交时，导致基本上相同的杂种，并且所述种子集合可通过根据条款1-39的任何组合的方法获得。
41.一种用于提供用于产生植物的亲本植物集合的方法，所述产生的植物的遗传构成与其雄性祖父的遗传构成基本上相同，所述方法包括在倍增所述种子的染色体数目之后或之前，由根据条款40的种子集合的种子生长植物，并且将两个遗传上互补的植物鉴定为亲本植物。
42.根据条款41的方法，其中就其遗传构成筛选所述种子集合或其生长的所述植物，以鉴定其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物，并且鉴定其遗传构成与其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一个植物。
43.根据条款40-42的任何组合的方法，其中其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物与其遗传构成和其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一个植物杂交，以便获得其遗传构成与其自身祖父的遗传构成基本上相同的后代植物。
本发明将在下述实施例中进一步举例说明，所述实施例不预期以任何方式限制本发明。在实施例中，参考下述附图：
图1：所谓的帕斯卡三角，描述对于每个花粉四分体的染色体互补性在物种染色体数目函数中的特定后果。从顶部到底部，单倍染色体数目增加，并且在每行上的数目总和始终等于2n，是可以起于其中涉及n条染色体的减数分裂的不同减数分裂产物的总数目。如果以第七行作为例子（对于例如黄瓜，具有7条单倍染色体，n=7），则可见完全互补事件的数目始终是1，即在行上的第一个数目，而在行上的第二个数目对应于单倍染色体的数目。相同行中的后续数目对应于在四分体中分别具有2、3、4、5和6条非互补染色体的预期数目的减数分裂产物。具有一条非互补染色体的总事件数目是7*2，具有两条非互补染色体的总事件数目是21*2，等等。如果例如3条染色体是非互补的，则这暗示其他四条是互补的。重要的是，在这个背景下的“非互补的”实际上仅指这些染色体的端粒端。如果我们例如具有含3条非互补染色体和在重组后仅40%杂合性的情况，则7条染色体中的4条将是完全互补的，而其他3条染色体仍是60%互补的。
图2：这个表格显示作为单倍染色体数目的函数，在花粉四分体的四个成员中发现某一程度的互补性的概率（机会百分比）。对于例如黄瓜（具有n=7），在黄瓜的花粉四分体内遇到具有0、1、2或3条非互补染色体（且因此分别具有7、6、5或4条互补染色体）的减数分裂产物的机会因此分别是1.6%（=（1+1）/128）、10.9%（=（7+7）/128）、32.8%（=（21+21）/128）和54.7%（=（35+35）/128）。
在四重体的四个成员中发现某一程度的互补性的概率（机会百分比）通过图2中的表格给出。在黄瓜的花粉四分体内遇到具有0、1、2或3条非互补染色体（且因此分别具有7、6、5或4条互补染色体）的减数分裂产物的机会因此分别是1.6%（=（1+1）/128）、10.9%（=（7+7）/128）、32.8%（=（21+21）/128）和54.7%（=（35+35）/128）。
图3：具有4条单倍染色体（n=4）的减数分裂事件的图示。杂种植物的一个亲本对杂种贡献蓝色染色体，而另一个亲本对杂种贡献红色染色体。在第一个步骤中，基因组从2n倍增到4n，并且随后交换可以在姐妹染色单体的同源区之间发生，如此处用每条染色体单个交换事件举例说明的。在第一次减数分裂过程中，产生两个二倍体子细胞，其是遗传上完全互补的（即，如果将两者的基因组合在一起，则获得来自分裂前的4n基因组组成）。在该图中，仅显示了减数分裂I期结果的一个可能实例。在第二次减数分裂过程中，产生配子（在这个背景下：小孢子或花粉粒），并且染色体可以随机分离到任一子细胞。这导致2n-1不同对的子细胞（配子）。对于在左侧上的子细胞，该图显示了一个可能的配子对，而对于在右侧上的子细胞，显示了所有8个可能的配子对（=23=2n-1）。
当随后由不同配子再生加倍单倍体植物时（例如通过本发明的方法，通过生成单倍体植物且使其基因组倍增），这些植物可以彼此杂交。紧在不同染色体组下的数目对应于与该图最左侧上的染色体组互补的染色体数目。如果例如含有在最左侧上描绘的四条染色体（即四条完全蓝色的染色体）的植物将与含有四条完全红色的染色体的植物杂交，所述四条完全红色的染色体来自右侧上的八个染色体对中的第一个，则所有4条染色体将是互补的。这个杂交将导致已产生配子的原始杂种植物的确切重构。类似地，使具有四条蓝色染色体的相同植物与在右侧上展示的含有其他可能染色体组的植物（更精确地：八对中每一左侧染色体组）杂交，导致原始杂种植物的完全重构（当所有4条染色体都是完全互补的时），或导致原始杂种植物的接近完全重构（当4条染色体中的一条或两条不是完全互补的时）。超过两条染色体不互补的情况不存在，因为配子源于相同减数分裂事件。此外，由该图明确的是大部分“非互补”染色体事实上是互补的，并且杂交将导致高度杂合的后代；唯一不互补的染色体部分是由于在染色体的端粒处的交换事件，所述交换区域在所得到的后代中将变成纯合的。当与在最左侧上的染色体组相比较，总计在染色体对下的数目，以分组具有0、1或2条非互补染色体的事件时，这导致对于n=4的2-8-6分布，其还可以在图1的三角的第四行中发现（其中它们作为1-4-6-4-1展示）。
在该图的最右侧上，描述了第二个可能的配子对，其可以源自减数分裂II期过程中的最左侧二倍体细胞。在该图底部上列出的数目代表：当来自该对的配子之一与源自最右侧二倍体细胞的16个配子中的任何组合时的互补染色体数目。再次，可以观察到相同结果：在16个配子中，2个是完全互补的（即4条互补染色体），8个具有一条非互补染色体，并且6个具有两条非互补染色体。通过使源自单个减数分裂事件的四个产物保持在一起，并且通过提供获得与这四个减数分裂产物的后代植物在遗传上相同的方法，本发明使鉴定后代植物对的机会达到最大，所述后代植物对在杂交后可以导致原始杂种植物，或在遗传上与原始杂种基本上相同的杂种。
图4：根据本发明的系谱的简化概述，假定不发生重组。起因于两个（纯合）亲本系（分别具有基因型AA和BB）杂交的杂种植物产生以四分体形式的花粉粒。当单个四分体用于给单倍体诱导母本植物（具有随机基因型）授粉时，起因于这个杂交的后代将由一组四粒单倍体种子组成。遗传上，这些种子是A、A、B和B（在不存在重组的情况下），并且不存在来自母本植物的遗传贡献。因此，这四粒单倍体种子仅具有两个祖父母，即产生花粉四分体的杂种父本植物的亲本系。在基因组倍增后，可以获得四个加倍单倍体植物，其在不存在重组的情况下，将始终在遗传上完全互补配对。使来自对中的任何的两个遗传上互补的植物杂交导致原始杂种植物的重构。如图1、2和3举例说明的，当重组的确发生时，情况更复杂。当重组发生时，在花粉四分体的后代中发现一对完全互补植物的机会根据单倍染色体数目而降低时，但在不存在重组的情况下，染色体数目对结果没有作用。
实施例
实施例1
四重花粉脱离芸苔属植物的鉴定
用于执行本发明的基本来源是脱落其以四分体形式的花粉粒的目的物种的植物，由此来自减数分裂的四个产物保持彼此物理上附着。此类植物可以在突变体筛选中或通过转基因方法获得。这个实施例举例说明了第一个选项，而第二个选项将在后续实施例中说明。
为了鉴定显示出四重花粉表型的植物，在表型上筛选甘蓝（Brassicaoleracea）EMS-突变型群体，以检测在个体植物的花药中具有四重表型的花粉粒（即花粉四分体）的出现。在大容量方法中，将来自多个植物的花粉合并在一起，并且在溶液中稀释，从而使得可以明确辨别个体花粉粒。这些花粉库随后通过眼睛在双目镜下进行筛选，但备选地，这个筛选用流式细胞术或通过过滤（使用具有大于个体花粉粒直径，但小于花粉四分体直径的孔径的滤器）也是可能的。在检测花粉库中的所需四重表型后，单独筛选对该库贡献花粉的所有植物，直到阳性鉴定四重突变型植物。在下一代中，证实四重表型的可传性。
实施例2
制备从其F1后代中消除母本基因组的芸苔属植物
Maruthachalam&Chan的出版物（Nature464，615-619；2010）教导了用关于GFP-CENH3-尾部互换蛋白质（tailswap protein）的过表达构建体转化拟南芥cenh3突变型植物，导致在受精后接合子中的异常有丝分裂。在这个异常有丝分裂过程中，从分裂接合子中选择性消除母本染色体。因为CENH3蛋白质在真核生物中是通用的，并且它的功能是非常良好保守的，所以来自拟南芥属的这个策略可广泛应用于其他植物物种中。
为了制备在其F1后代中母本染色体选择性消除的甘蓝植物，制备缺乏蛋白质的功能形式的芸苔属植物，所述蛋白质与来自拟南芥属的CENH3直向同源。这借助于RNAi方法来实现。这种植物随后借助于土壤杆菌属（Agrobacterium）感染在遗传上转化，使用由Maruthachalam&Chan（Nature464，615-619；2010）描述的GFP-CENH3-尾部互换构建体。由于纯合cenh3突变型植物（如在拟南芥属的情况下）的致死率，必须用这种构建体转化杂合沉默的植物。转化体植物随后基于构建体的选择标记进行选择，并且GFP-CENH3-尾部互换融合蛋白的存在和正确表达可以在有丝分裂过程中用荧光显微镜检查进行检测。
实施例3
在拟南芥属中组合四重表型与母本基因组消除
这个实施例举例说明可以如何有效重构杂种植物的基因型。
制备含有RNAi构建体的单拷贝（以纯合状态）的Ler登记的转基因拟南芥植物，所述RNAi构建体靶向QRT1基因（At5g55590），由CaMV35S组成型启动子驱动。备选地，其他技术例如人工微小RNA（amiRNA）可以用于这个目的。这个植物随后与Ws登记的野生型拟南芥植物杂交。
所得到的F1代由具有混合Ler/Ws背景的杂种植物组成，所述杂种植物对于RNAi构建体是半合子。因为RNAi构建体以孢子体和显性方式起作用，所以所有F1植物都显示出四重花粉表型。随后使显示出四重花粉表型的F1植物作为父本与Col-0登记的拟南芥cenh3突变型植物杂交，所述突变型植物已用如由Maruthachalam&Chan（Nature464，615-619；2010）报道的GFP-CENH3-尾部互换构建体进行遗传转化。这个杂交导致在接合子中的第一次有丝分裂过程中母本染色体的消除，导致单倍体种子的形成。
在用于杂交的制备中，父本植物的几乎裂开的花药在双目显微镜下打开，以允许个体的成熟花粉四分体的收集。使用睫毛或细刷毛，将每个花粉四分体小心沉积到母本植物的雌蕊上，并且允许四个花粉粒给四个胚珠受精。允许起因于用单个花粉四分体的这个有限授粉的四粒种子成熟，并且随后收获且允许发芽。备选地，超过一个四分体可以沉积到母本植物的雌蕊上，但应注意花粉粒的数目不超过在物种的雌性生殖部分中的胚珠平均数目。超过一个四分体用于授粉的使用亦即减少由其可以鉴定遗传上互补的后代植物的效率。
起因于转基因Col-0母本植物的有限授粉的幼苗的倍体通过流式细胞术进行测试。它们的倍体是n，除了其中自发基因组倍增至2n已同时发生的一些情况外。对于单倍体个体，基因组倍增随后通过技术人员已知的标准方法（例如秋水仙碱处理）来完成。一旦起因于这个杂交的四个幼苗是2n，就分离它们的基因组DNA并且就覆盖整个拟南芥属基因组的遗传标记进行遗传分析。尤其地，测试在Col-0和Ler之间以及在Col-0和Ws之间多态性的标记，以区分两个亲本基因组对四个后代植物的贡献。由于从接合子中消除母本基因组，四个后代植物仅含有来自杂种父本植物的重组染色体，并且因此它们对于所有Col-0特异性标记都测试阴性。
图2显示在花粉四分体内具有某一数目的互补染色体的后代植物的发生率依赖单倍染色体数目（n）。拟南芥属具有五条染色体，并且由于原始父本植物中的四重花粉表型，四个幼苗的染色体星座起因于单次减数分裂。这暗示对于两个完全互补染色体存在于单个花粉四分体中的理论机会是16个中的1个（6.3%）。机会对于具有含一条非互补染色体的两个基因组是31.3%，并且对于具有含两条非互补染色体的两个基因组是62.5%。在所有情况下，四分体中的个体花粉粒因此彼此至少50%互补。重要的是，如果重组导致例如40%杂合性，则在个体花粉粒的基因组之间的总体互补性始终高于50%，因为即使“非互补”染色体随后仍彼此60%互补。
因此，在理论上，平均仅需要使用花粉四分体的16次个体杂交，以鉴定具有基本上互补的染色体组的两个拟南芥属幼苗。然而，在实践中，因为授粉的效率、种子形成和植物发芽，并且存活一般低于100百分比，所以需要更多。作为概测法，用单个四分体完成多10倍的杂交，即在这种情况下160次，以使成功机会达到最大。
在鉴定后，使两个遗传上基本上互补的植物生长至开花且随后杂交。起因于这个杂交的F1后代的遗传构成在实验上显示为与其父本祖父的遗传构成基本上相同，即具有Ler/Ws杂种背景的qrt1突变型植物。
实施例4
在拟南芥属中伴母本基因组消除的四重表型与非转基因后代的组合
在实施例3中，F1后代保持转基因，因为它保持靶向QRT1基因的RNAi构建体，并且因此还保持四重花粉表型。然而，当在成熟花粉粒中特异性表达绿色荧光蛋白的GFP报道分子盒整合到实施例3中使用的RNAi构建体内时，这允许其中后代植物并非转基因的另一种方法。T-DNA构建体随后还含有在晚期花粉特异性启动子（LAT52启动子；Twell等人，1990，Development109:705-713）下具有核定位信号的GFP蛋白质，其允许这个构建体在成熟花粉粒中的容易视觉检测。
在实施例3中提及的Ler/Ws杂种植物（对于靶向QRT1的RNAi构建体半合子）的花药压片（squashes）中，在视觉上（使用荧光双目镜或显微镜）或通过FACS（荧光激活细胞分选），选择其中四个花粉粒中的两个在其核中不表达GFP的花粉四分体。四个花粉粒中的仅两个因此含有靶向QRT1基因的RNAi构建体。用此类花粉四分体给上述Col-0母本植物授粉导致两个转基因单倍体后代植物（含有RNAi构建体）和两个非转基因单倍体后代植物（不含RNAi构建体），所述授粉诱导在接合子中的第一次有丝分裂过程中母本染色体的消除。
非转基因后代植物根据定义缺乏含有关于QRT1的RNAi构建体的Ler染色体片段，并且这两个植物的杂交因此绝不导致原始F1杂种的确切重构，因为重构的植物对于至少一个Ws染色体区域将是纯合的，所述染色体区域即对应于在Ler亲本植物中含有关于QRT1的RNAi构建体的染色体区域。
实施例5
在甜椒（辣椒（Capsicum annuum））中组合四重花粉表型与第二次分裂重构
当第二次分裂重构（SDR）出现时，第二次减数分裂不发生，并且减数分裂的结果将是两个二倍体花粉粒，而不是四个单倍体花粉粒。因此，当减数分裂产物保持彼此物理上附着时（如关于四重花粉表型的情况）当SDR发生时，植物将产生花粉二分体。在本发明的这个优选实施方案中，两个二倍体减数分裂产物保持彼此物理上附着，并且因为它们的染色体具有相同的重组断裂点，所以两个花粉粒彼此100%遗传互补。
通过RNAi方法获得显示出四重花粉表型的甜椒植物（辣椒），类似于如实施例3中所述。对其后代植物-对于四重表型纯合-实施冷胁迫，以便增加未减数小孢子（配子）形成的频率，如由Zhang等人.（2002）Journal of Horticultural Science&Biotechnology78:84-88和WO2006/094773的实施例2中描述的）。冷处理的植物的花药中产生的最多25%小孢子和花粉具有二分体的形式。分离的小孢子级分通过显微镜分析（备选地可以使用流式细胞术）对于二分体进一步富集。使用这种方法，称为近反向育种（WO2006/094773）的应用可以在优选实施方案中允许。
为了这个目的，根据实施例2中概述的实验方法，制备第二个甜椒植物，其在第一次有丝分裂过程中从其接合子中消除母本基因组。这个转基因甜椒植物用源自上述冷处理的甜椒植物的单个花粉二分体授粉，并且将所得到的两个二倍体种子收获且发芽。在来自花粉四重体中的花药压片中手动选择花粉二分体，所述花粉四重体起因于非SDR减数分裂事件。
随后使由这两个二倍体种子生长的植物杂交，并且使用遗传标记，这个杂交的后代植物的遗传组成可以证实为与甜椒植物的遗传组成基本上相同，所述甜椒植物产生我们用于授粉的花粉二分体。然而，由于在花粉二分体的形成过程中已发生的交换事件，已引入一些端粒变异，其在所选杂种背景中提供了另外的遗传变异。
因此，在这个实施例中通过用花粉二分体（由另一个甜椒植物产生）给单倍体诱导母本植物授粉制备的甜椒植物，与产生用于授粉的花粉二分体的甜椒植物仅在遗传上“基本上相同”，因为由于在花粉二分体的形成过程中已发生的交换事件，另外的遗传变异已在端粒处引入。父本植物的所有遗传材料已得到维持，但它的一些部分已通过交换事件重排，并且这个重排可以引起另外的表型效应。
这个实施例因此允许在所选（良种）杂种植物中引入另外的遗传变异。当与原始杂种表型相比较时，这个另外的变异可以具有另外的正面或负面表型效应，并且它因此提供了进一步改良（和/或细调）杂种表型的有利机会，而不丧失在原始杂种中包含的所需性状的组合。
备选地，显示出四重表型的甜椒植物可以与自然显示出SDR的高于平均程度的甜椒植物杂交。它们的后代随后自然产生高于平均百分比的花粉二分体。另一个策略是使自然显示出SDR的高于平均程度的甜椒植物群体诱变，并且在前面的遗传学方法中，在这个突变型群体中筛选展示四重花粉表型的植物。
在每个和每一个二分体中，两个花粉粒彼此遗传上基本上互补的机会是100%（具有相同的染色体断裂点）。在二分体中包含的两个小孢子根据定义是遗传上基本上互补的，并且使可以源自这些二分体中的任何一个的两个植物杂交始终导致杂种植物，其与产生二分体的原始杂种植物基本上在遗传上相同。这个实施方案因此极大改善近反向育种技术的效率。
一般地，在本发明的这个实施方案中，携带遗传特征的植物通过有限授粉进行授粉，所述遗传特征引起母本染色体从其F1后代中消除。在这个杂交中使用的花粉是得自相同物种的杂种植物的单个花粉二分体，所述杂种植物显示出与SDR组合的四重花粉表型。这个花粉二分体通过下述获得：在视觉上筛选压片花药且随后从四分体星座（其起因于在其过程中未发生SDR的减数分裂）中选择二分体星座，或借助于流式细胞术或细胞分选就二分体富集花粉馏分（在更高流通量设置中）。
在携带遗传特征的母本植物授粉后，所述遗传特征引起母本染色体从其F1后代中消除，在二分体中包含的两个二倍体花粉粒各自给胚珠受精，并且允许种子形成且成熟。在成熟后，将起因于这个杂交的两粒种子收获且发芽。所得到的幼苗随后借助于流式细胞术测试其倍体水平，以证实如预期的，它们真的是2n。
随后，从两个幼苗中分离基因组DNA，并且在两个个体中测试覆盖整个基因组的遗传标记。由于从接合子中消除母本染色体，两个幼苗预期仅具有父本染色体。由于来自两个幼苗的染色体源于单次减数分裂的事实，所有染色体断裂点都是相同的，并且它们的基因组是100%互补的。这通过全基因组标记分析加以证实。
幼苗随后生长至成熟，并且彼此杂交。它们的F1后代与在第一次杂交中用作父本的原始起始杂种植物在遗传上基本上相同，除了在SDR配子的形成过程中已发生的交换事件外。这些交换事件引入一些端粒变异，其在所选杂种背景中提供了另外的遗传变异。
父本祖父生物体的（杂种）基因型的近确切重构在仅两代的时间中实现，并且无需中间体再生或基因组倍增步骤或组织培养。
实施例6
在拟南芥属中组合四重花粉表型与染色体重组的抑制和母本染色体消除
从显示出四重花粉表型的拟南芥属植物和其中染色体重组被部分或完全抑制（通过转基因、突变或化学方法）的另一个拟南芥属植物之间的杂交中，可以选择其中组合两个性质的F2后代植物：起因于单次减数分裂的四个花粉粒保持彼此物理上附着，直到开花和花粉脱落时，并且在减数分裂过程中，同源染色体的重组被抑制。
这个后代植物允许反向育种（WO03/017753；Dirks等人2009）以更有效方式应用。因为减数分裂产物保持彼此物理上附着，所以鉴定具有基本上互补的染色体组的两个花粉粒的机会极大增加。不同四分体数目是物种染色体数目的函数，但在单个四分体内，然而，两个花粉粒具有完全互补的染色体组的机会始终是50%，因为四个花粉粒互补配对。在每个和每一个四分体内，发现两对互补花粉粒的机会因此是100%。
如实施例3中所述，制备含有RNAi构建体的单拷贝（以纯合状态）的拟南芥Ler植物，所述RNAi构建体靶向QRT1基因，由CaMV35S组成型启动子驱动。这个植物随后与含有RNAi构建体的纯合单拷贝的Ws登记的拟南芥植物杂交，所述RNAi构建体靶向DMC1基因，也由CaMV35S组成型启动子驱动。
所得到的F1代由具有混合Ler/Ws背景的杂种植物组成，所述杂种植物对于两个RNAi构建体都是半合子的。因为RNAi构建体两者以孢子体和显性方式起作用，所以F1植物显示出四重花粉表型和在减数分裂过程中染色体重组的抑制。作为不希望有的副作用，染色体重组的抑制还导致不平衡花粉四分体（在平衡四分体旁边）的出现，因为在不存在足够功能DMC1蛋白质的情况下，每条染色体在分裂的子细胞上随机分布。然而，平衡四分体可以在实验上（通过视觉检查和/或流式细胞术）选自花药。
源自F1植物（显示出与染色体重组抑制组合的四重花粉表型）的平衡花粉四分体（对于两个转基因构建体都是半合子的），随后用于给Col-0登记的拟南芥cenh3突变型植物（如由Maruthachalam&Chan，2010制备且报道的）授粉，所述突变型植物已用由Maruthachalam&Chan（2010）报道的GFP-CENH3-尾部互换构建体进行遗传转化，所述授粉导致在接合子中的第一次有丝分裂过程中母本染色体的消除。
当单个平衡花粉四分体用于授粉母本植物的雌蕊时，这个杂交理想地导致四粒单倍体后代种子。允许四粒后代种子发芽，并且用标记遗传测试幼苗。因为在减数分裂过程中未发生染色体重组（由于靶向DMC1的RNAi构建体，所有染色体都整体传递给下一代），所以仅需要极少标记以测试每个染色体，以测定它是继承自Ler祖父还是Ws祖父（事实上，每条染色体的单个多态性标记将是足够的；在我们的实验方法中，我们使用每个染色体臂一个标记，即每条染色体两个标记）。
为了确保母本植物在遗传上对后代没有贡献，还测试Col-0特异性标记，但无法鉴定Col-0代材料，如实施例3中的情况一样。
发现四个后代植物在遗传上完全互补配对，并且基于遗传标记分析，可以有效鉴定这些对。使此类遗传上互补的后代植物对彼此杂交导致原始杂种植物的有效遗传重构，所述原始杂种植物产生用于授粉的花粉四分体，即对于RNAi构建体半合子的Ler/Ws杂种植物。图4举例说明在这个实验中使用的植物系谱。

Claims (24)

1.用于产生种子集合的方法，所述种子与它们起于其的雄配子在遗传上相同，所述方法包括：
a）将有限数目的父本配子置于花的柱头上，以使母体卵细胞受精，以获得许多接合子，所述父本配子具有四分体或二分体的形式；
b）诱导来自所述接合子的母本染色体的丧失，以获得含有其中所述母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合。
2.根据权利要求1的方法，其中所述父本配子的有限数目等于或低于携带所述柱头的雌性生殖器官中含有的卵细胞数目。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述父本配子的有限数目是二或四。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中具有四分体或二分体形式的所述父本配子是干扰四分小孢子分离的结果。
5.根据权利要求4的方法，其中干扰四分小孢子分离包括
干扰涉及所述小孢子之间的果胶层分解的一种或多种靶基因，所述果胶层分解起因于单次减数分裂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述一种或多种靶基因选自QRT1、QRT2、QRT3或其功能同系物。
7.根据权利要求4的方法，其中干扰四分小孢子分离通过化学方法来实现。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述父本植物显示出染色体重组的抑制。
9.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述父本植物显示出在减数分裂过程中的第二次分裂重构（SDR）。
10.根据权利要求8的方法，其中所述染色体重组的抑制通过干扰涉及重组的一种或多种靶基因来实现。
11.根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种靶基因涉及双链断裂，例如SPO11、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、RED1、HOP1、RAD50、MRE11、XRS2或其功能同系物，或其中所述一种或多种靶基因涉及染色体配对和/或链交换，例如RHD54/TID1、DMC1、SAE3、RED1、HOP1、HOP2、REC8、MER1、MRE2、ZIP1、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HIM6、CHK2或其功能同系物，或其中所述一种或多种靶基因涉及减数分裂重组过程，例如SGS1、MSH4、MSH5、ZIP1和ZIP2或其功能同系物，或其中所述一种或多种靶基因选自PRD1、PRD2、PRD3、PHS1、NBS1、COM1、MND1、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOC1、ZYP1、MLH1、MLH3或其功能同系物。
12.根据权利要求5或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由阻止其转录组成。
13.根据权利要求12的方法，其中转录优选借助于针对所述靶基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止，或其中转录优选借助于表达对所述靶基因启动子起作用的负作用转录因子得到阻止。
14.根据权利要求5或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由使所述靶基因mRNA或转录物失稳组成，优选借助于核酸分子，所述核酸分子与所述靶基因mRNA或转录物互补，选自反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默（VIGS）分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸，或其中所述干扰一种或多种靶基因由抑制所述靶基因表达产物组成，优选借助于一种或多种显性负性核酸构建体的一种或多种表达产物，或优选借助于一种或多种化学化合物。
15.根据权利要求5或10的方法，其中所述干扰一种或多种靶基因由一种或多种突变引入所述靶基因内，导致其生物学功能的扰动组成，并且其中所述一种或多种突变优选借助于一种或多种化学化合物和/或通过物理方法和/或通过遗传元件的插入而随机引入，所述一种或多种化学化合物例如甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、聚氨酯、苯酚、环氧乙烷，所述物理方法例如UV照射、快中子暴露、X射线、γ照射，所述遗传元件例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件，和/或其中所述一种或多种突变借助于同源重组或基于寡核苷酸的突变诱导而特异性引入。
16.根据权利要求9的方法，其中第二次分裂重构自发发生，特别地不干扰所述起始生物体。
17.根据权利要求9的方法，其中第二次分裂重构借助于遗传修饰进行诱导，其中所述遗传修饰是瞬时的，或其中所述遗传修饰通过将遗传元件稳定掺入所述基因组内来实现，所述遗传元件增加所述生物体中的第二次分裂重构事件数目，或其中第二次分裂重构通过对所述父本植物实施环境胁迫来实现，所述环境胁迫例如温度胁迫、NO2、氧化亚氮（N2O）或其组合。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中来自所述接合子的母本染色体的丧失通过使用单倍体诱导系作为所述雌性进行诱导。
19.根据权利要求18的方法，其中所述雌性是不同种的植物。
20.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中所述雌性植物是包含异源转基因表达盒的转基因植物，所述表达盒包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码重组改变的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相应失活的内源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因。
21.含有其中所述母本染色体不存在的有限数目种子的种子集合，所述集合由遗传上互补的种子对组成，当由所述种子生长的植物杂交时，导致基本上相同的杂种，并且所述种子集合可通过根据权利要求1-20中任一项的方法获得。
22.一种用于提供用于产生植物的亲本植物集合的方法，所述植物的遗传构成与其雄性祖父的遗传构成基本上相同，所述方法包括在倍增所述种子的染色体数目之后或之前，由根据权利要求21的种子集合的种子生长植物，并且将两个遗传上互补的植物鉴定为亲本植物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述种子集合或其生长的所述植物就其遗传构成进行筛选，以鉴定其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物，并且鉴定其遗传构成与其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一植物。
24.根据权利要求21-23中任一项的方法，其中其遗传构成与其父本祖父的遗传构成基本上相同的植物与其遗传构成和其父本祖母的遗传构成基本上相同的另一植物杂交，以便获得其遗传构成与其自身祖父的遗传构成基本上相同的后代植物。
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