CN103763917A - 用于系统性影响雄性母细胞中的过程的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于干扰植物的雄性母细胞的过程的方法，其通过将包含转基因地具有核酸序列的砧木的第一植物与来自嫁接至所述第一植物的砧木上的第二植物的接穗组合来进行，其中所述转基因核酸序列在第一植物的砧木中产生多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被系统性运输通过嫁接连接处，进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞，并且其中所述系统性运输的多核苷酸分子至少部分地互补于在第二植物的接穗产生的雄性母细胞中表达的转录物。

Description

用于系统性影响雄性母细胞中的过程的方法
发明领域
本发明涉及用于干扰植物的雄性母细胞中的过程的方法。
发明背景
有性繁殖可以说是有花植物的生命周期中的最基本的过程。其提供了生物体的下一代，并且通过父本和母本生物体的遗传特性的重组（改组），其允许产生遗传多样性。下一代中的该多样性允许植物例如更好地和更容易地适应它们的生物和非生物环境的变化。
生物学研究已导致对在被子植物的有性繁殖中起着重要作用的过程和因子的彻底理解。基本阶段是：
-来自二倍体性母细胞的雄配子(小孢子,花粉粒)和雌配子(胚珠内的胚囊内的卵细胞)的形成和成熟。单倍体配子的形成通过两次减数分裂发生，在该过程中产生配子的生物体的两个亲本基因组组合；
-传粉(雄配子在雌性生殖器官/柱头上的沉积),其可以例如通过风、昆虫或其它专门的传粉者介导，或当其涉及自花授粉物种时仅通过重力、靠近或主动传粉机制来介导;
-花粉粒的萌发和随后雄核(精细胞)通过花粉管向接受和化学吸引卵细胞的转移;
-精核在接受胚囊内的释放，这导致双受精，其中一个精细胞与卵细胞融合以产生二倍体胚，并且另一个精细胞与二倍体中央细胞融合以产生三倍体胚乳；
-受精卵的有丝分裂和发育模式，这导致胚的形成。
为了本发明的目的，第一阶段是最重要的：配子，特别是雄配子从性母细胞的形成。在被子植物中，雄配子或小孢子在花药内形成。它们源自经历减数分裂的二倍体花粉母细胞(一种类型的性母细胞)，所述减数分裂包括两轮减数分裂。减数分裂的最终结果是对于每一个花粉母细胞一组4个单倍体小孢子，并且这些小孢子各自通过经历两次有丝分裂进一步发育。这些分裂的第一次分裂是不对称的，其产生营养细胞和生殖细胞，而第二次有丝分裂涉及生殖细胞的分裂。结果产生在独特星座(constellation)中包含两个精细胞的花粉粒，因为精细胞都位于营养细胞的细胞质内。
第二次有丝分裂的时限在植物界变化极大，第二次花粉有丝分裂可在开花之前发生(如在例如拟南芥和稻的情况下一样)或在花粉管生长过程中在开发后发生(例如，在蕃茄和烟草中)。取决于物种，被子植物的花从而可散布三细胞的(包含一个营养核+2个生殖核)或双细胞的花粉粒(包含一个营养核+一个生殖核)。
减数细胞分裂在配子形成过程中具有基本重要性，因为其提供了用于改组亲本遗传信息以便新的遗传组合产生的手段，和用于使单倍体配子的基因组“不成倍”的手段。性母细胞已接受相当多的研究关注，因为如果能够影响在性母细胞内发生的分子、生理和/或发育过程，则可潜在地对有性繁殖，对遗传物质至下一代的传递，以及甚至对进化具有巨大影响。
已知，在植物中，基于RNA的沉默信号系统性地传输至远端器官。为了进行这样的基于RNA的信号的远距离传输，有花植物使用称为韧皮部的专门的脉管系统。韧皮部帮助小分子例如离子、糖、核苷酸、激素、氨基酸和蛋白质从源（生产性）组织至库（消费）组织的定向传送。在许多植物物种中，已显示来源于特定基因产物的小的多核苷酸分子（通常具有18至27个核苷酸的大小的RNA分子）存在于韧皮汁液中，并且被指出在源-库流之后重新定位。
根据文献已知长距离运输途径允许植物诱导与小干扰RNA(siRNA)分子相关的系统性转录后基因沉默(PTGS)。
PTGS–与siRNA相关的–通过未知机制被重新设定并且在下一代中重新建立。PTGS-重新设定似乎在减数分裂过程中发生，并且可在配子中再次建立，如在关于雄配子体中的转座子活性的研究中显示的。
靶向转座元件转录物的siRNA在营养核中被激活，并且转移进入受精精细胞，在那里它们下调转座子活性。因此，在花粉粒和受精花粉管中，siRNA介导的沉默机器是有活性的。PTGS机制在孢子体组织中也是有功能的，因为花药特异性基因可被沉默。利用转基因表达GFP的品系（其中通过包含GFP序列的转录物的过表达诱导siRNA相关的沉默传输）进行的研究表明了siRNA信号至强库组织例如新形成的叶中的系统性传输。
然而，似乎并非所有库组织可接受PTGS信号。系统性siRNA介导的GFP沉默据报导在正在生长的花蕾中是极其有限的，并且从未观察到花药或心皮的减数分裂（产孢子）组织中GFP的沉默。
因此在现有技术中假定性母细胞是长距离移动信号不可到达的，并且存在这样的屏障：在它们的最早发育期保护将来的小孢子。
然而，在导致本发明的研究中，发现性母细胞可如何被来自转基因砧木的系统性多核苷酸信号靶向，而无需使嫁接在其上的枝条(接穗)或由接穗产生的性母细胞或小孢子或来源于这些小孢子的植物成为转基因的。
本发明人发现如何通过作为系统性信号被传输至雄性母细胞中的所述多核苷酸信号干扰雄性母细胞中的（分子）过程。
在现有技术中，还已知利用组成型启动子的RNAi构建体的过表达可导致雄性母细胞中的基因表达沉默(Dirks R等人,2009,PlantBiotechnol J7:837-845;Reverse Breeding:WO03/017753)。然而，该方法的相当大的缺点是产生雄性母细胞的生物体以及至少50%的减数分裂后产生的小孢子是转基因的。由于管控、效率和实际原因，非常期望开发用于从源自性母细胞（其中分子重组过程已被干扰）的孢子产生无转基因的植物的方法。这样的小孢子可以例如用于产生无转基因的加倍的单倍体植物(DH)。
现有技术公开了用于从小孢子产生单倍体植物的各种方法，例如体外小孢子培养(从小孢子再生单倍体小植株，和随后利用秋水仙碱进行基因组加倍),和WO2011044132中公开的方法，所述方法包括单倍体诱导系的授粉,所述单倍体诱导系在受精后从受精卵消除母本染色体，导致包含在遗传上与用于授粉和受精的小孢子相同的单倍体胚胎的可育性种子的形成。
在导致本发明的研究中，因此令人惊讶地发现在成熟砧木中产生的siRNA信号可系统性地渗透并且在顶端产孢子细胞、特别是性母细胞中具有活性。这通过将非转基因接穗嫁接至具有RNAi构建体并且产生siRNA分子的转基因砧木，通过观察由非转基因接穗形成的雄性母细胞中基因的沉默表型来显示。这样的靶向减数分裂组织的系统性siRNA分子从而可影响基因在后代中的表达。
从转基因砧木的RNAi构建体产生的siRNA分子从而可通过穿过嫁接连接处的长距离运输来进行传输，并且遍布接穗。目前的研究显示从这些构建体产生的多核苷酸(siRNA)分子随后可被迫进入雄性母细胞并且影响其中的基因沉默，或以另一种方式干扰这些性母细胞中的转录物或基因组物质。到目前为止，通过长距离运输将分子输入早期发育中的性母细胞或小孢子被认为是不可能的。令人惊讶地，在花内，siRNA分子优选靶向花药和其中的性母细胞，而雌性母细胞(子房中包含的大孢子母细胞)不接受siRNA信号。
本发明可被用于干扰在雄性母细胞中发生的所有分子过程，例如减数分裂、染色体重组和同源重组，并且还干扰小孢子的生理学，例如对来源于这些性母细胞的小孢子的雄激素性刺激的应答。“干扰”可以是指这些过程的抑制或阻断，或其增强。其还允许例如通过基因和/或调控(顺式作用)序列中的定点诱变(在其中同源重组自发地在性母细胞中发生的阶段)转移至下一代的遗传物质的特定改变。
重要地，本发明的应用不会使雄性母细胞、从其发育的小孢子或接穗成为转基因的，因为仅砧木具有转基因。小孢子和接穗仅包含瞬时表达的转基因来源的分子，其不会被传递至下一代。仅由转基因来源的分子带来的分子效应被传递至下一代。表达可系统性移动通过嫁接连接处进入无转基因的植物材料的显性阴性因子的转基因的使用允许研究者充分利用转基因技术来赋予农作物植物新性状，而不使它们成为稳定地转基因的。
可将特定的突变通过同源重组(Paszkowski J等人,1988,EMBOJ7:4021-4026;Mengiste T and Paszkowski J,1999,Biol Chem380:749-758;Vergunst AC and Hooykaas PJJ,1999,Crit Rev Plant Sci18:1-31)或通过基于寡核苷酸的突变诱导(Oh TJ and May GD,2001,CurrOpin Biotechnol12:169-172;KeyBase technology:WO2010074562,EP2167660,WO2007073149)引入植物基因组。
本发明的方法可用于植物育种目的。目前的育种方法是缓慢的，花费>5-10年来开发栽培品种。不利方面之一是早期世代的性状选择的无效性。该问题可通过诱导非转基因接穗中的加倍单倍体产生（通过将非转基因接穗嫁接至相容的转基因砧木上）来克服，如由下文中的实施例3中举例说明的。
本发明可用于可被嫁接和转化的所有植物物种。可对其实施本发明的农作物种类包括例如烟草、白杨、玉米、小麦、大麦、稻、高粱、甜菜、油料种子、裸麦草、向日葵、大豆、蕃茄、黄瓜、腌食用小黄瓜、作沙拉用的玉米、菠菜、胡椒、牵牛花、马铃薯、茄子、甜瓜、胡萝卜、萝卜、莴苣、蔬菜芸苔种类(甘蓝、花椰菜、绿花椰菜、苤蓝、抱子甘蓝)、韭、豆、豌豆、苦苣、菊苣、洋葱、草莓、茴香、食用甜菜、芹菜、块根芹菜、芦笋、向日葵和葡萄树。
本发明从而涉及用于干扰植物的雄性母细胞中的过程的方法，该方法通过将包含转基因地具有核酸序列的砧木的第一植物与来自嫁接至所述第一植物的砧木上的第二植物的接穗组合来进行，其中所述转基因核酸序列在第一植物的砧木中产生多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被系统性运输通过稼接连接处，进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞，并且其中所述多核苷酸分子至少部分地与由第二植物的接穗产生的雄性母细胞中表达的转录物互补。
转基因核酸序列在第一植物中的表达通过将所述核酸序列可操作地连接至启动子序列来实现，所述启动子序列赋予所述转基因核酸序列遍在性或系统性表达谱，或组织或细胞类型特异性表达谱。为此目的，将转基因核酸序列在具有在植物中驱动所述核酸序列的表达的能力的启动子序列的下游(在3’末端)克隆进入转基因构建体。启动子序列的差异在于它们在植物组织中的表达模式，一些启动子具有在所有组织（遍在表达）中驱动基因表达的能力，而其它启动子具有（在空间-时间上）更狭窄的表达模式，或被限定于特定组织类型或细胞类型的非常特定的表达模式。
赋予转基因核酸序列遍在表达谱的启动子序列的实例是例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、选择的遍在蛋白启动子、选择的肌动蛋白启动子和许多其它启动子。组织或细胞类型特异性启动子的实例对于本领域技术人员来说也是已知的。
为了本发明的目的，启动子序列赋予所述转基因核酸序列包括砧木的表达谱。这是期望的，因为仅使用来自具有转基因核酸序列的所述第一植物的砧木，从而所述核酸序列应当至少在所述第一植物的砧木中表达。砧木包括从其将韧皮汁液运输至库组织，更具体地运输至接穗的库组织的源组织。砧木包括根并且可额外地包含一部分茎和一些（成熟的）叶。根据本发明，转基因核酸序列的表达产物可在完整的砧木中或其部分中产生，例如通过使用根、叶或茎特异性启动子。
在一个实施方案中，转基因核酸序列在第一植物的砧木中的表达是组成型的。在另一个实施方案中，转基因核酸序列在第一植物的砧木中的表达是瞬时的。瞬时表达例如可通过使用诱导型启动子来获得，所述诱导型启动子选自热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和醇诱导型启动子。瞬时表达可通过使用诱导型启动子或通过将转基因构建体（具有强启动子）瞬时引入砧木而非将转基因稳定地整合在砧木基因组中来获得。这样的瞬时转化可以例如通过农杆菌（Agrobacterium）渗透（经过叶的气孔）来实现，所述叶在接穗稼接至砧木后仍然与砧木连接。
在一个实施方案中，干扰雄性母细胞中的过程是雄性母细胞中的过程的抑制或阻断。在另一个实施方案中，干扰雄性母细胞中的过程是雄性母细胞的过程的增强。当干扰是雄性母细胞中的过程的抑制或阻断时，这可通过使用多核苷酸分子进行的使靶基因mRNA去稳定来实现，所述多核苷酸分子至少部分地与靶基因mRNA或转录物互补，并已从转基因核酸序列产生。多核苷酸分子可选自miRNA、反义RNA、RNAi分子、siRNA分子、病毒诱导的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子或RNA寡核苷酸。
在一个实施方案中，所述转基因核酸序列被稳定地整合进入第一植物的基因组。在另一个实施方案中，所述转基因核酸序列短暂地存在于第一植物的砧木中。
在一个实施方案中，所述多核苷酸分子在第一植物中，优选在包括根的表达域中组成型地产生和表达。这暗示着无需外部处理来产生和表达多核苷酸分子。与转基因核酸序列可操作地连接的启动子序列的性质决定了多核苷酸分子的产生和表达的时间和空间模式。
在另一个实施方案中，所述多核苷酸分子在第一植物中，优选在包括根的表达域中瞬时产生和表达。这暗示着外来因素或处理可用于诱导和/或调节（依靠这些外来因子或处理对转基因核酸序列可操作地连接的启动子序列的活性的影响）多核苷酸分子的产生和表达的时间和空间模式。
在本实施方案中，多核苷酸分子在第一植物中的瞬时表达通过使用诱导型启动子来实现，所述启动子选自热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和醇诱导型启动子。利用诱导诱导型启动子的活性的试剂和/或条件（例如，热激或热处理、特定化学药品、特定类固醇例如地塞米松，或醇）进行的砧木的处理激活诱导型启动子，这导致多核苷酸分子在第一植物中，优选在包括根的表达域中瞬时表达。
来源于转基因核酸序列的多核苷酸分子至少部分地与由第二植物的接穗产生的雄性母细胞中表达的转录物互补。在一个实施方案中，多核苷酸分子至少部分地与参与染色体重组的基因的转录物（转录的核酸序列或mRNA）互补。在本实施方案中，基因适当地选自SPO11、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、RED1、HOP1、RAD50、MRE11、XRS2、PRD1、PRD2、PRD3、PHS1、NBS1、COM1、RHD54/TID1、DMC1、SAE3、RED1、HOP1、HOP2、MND1、REC8、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA1、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HIM6、CHK2、SGS1、MSH4、MSH5、MER3/RCK、ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOC1、ZYP1、MLH1、MLH3或它们的功能性同源物。
在另一个实施方案中，通过第一植物的砧木中的转基因核酸序列产生的和被系统性运输通过嫁接连接处进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞的多核苷酸分子是DNA多核苷酸。这些DNA多核苷酸通常与先前的实施方案的RNA多核苷酸具有相同的大小，即为约18个核苷酸至约27个核苷酸。这些DNA多核苷酸可来源于细胞核DNA，来源于质粒DNA，来源于叶绿体DNA，来源于线粒体DNA或来源于其它DNA分子。
本发明还涉及用于特异性改变植物的雄性母细胞的基因组序列的方法：通过将包含转基因地具有核酸序列的砧木的第一植物与来自嫁接至所述第一植物的砧木上的第二植物的接穗组合来进行，其中所述转基因核酸序列在第一植物的砧木中产生多核苷酸分子，该多核苷酸分子被系统性地运输通过嫁接连接处进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞，并且其中所述多核苷酸分子至少部分地与第二植物的基因中包含的DNA片段同源。
在本实施方案中，有利方面是利用雄性母细胞中的同源重组来实现雄性母细胞的基因组序列中的靶向核苷酸交换。这可以例如通过在其中染色体重组发生的阶段和其中染色体更容易接近的阶段中，雄性母细胞中的小RNA多核苷酸的存在来实现。可通过同源重组(Paszkowski J等人,1988,EMBO J7:4021-4026;Mengiste T andPaszkowski J,1999,Biol Chem380:749-758;Vergunst AC andHooykaas PJJ,1999,Crit Rev Plant Sci18:1-31)或通过基于寡核苷酸的突变诱导(Oh TJ and May GD,2001,Curr Opin Biotechnol12:169-172;KeyBase technology:WO2010074562,EP2167660,WO2007073149)将特定突变引入植物基因组。用于该目的的多核苷酸与基因组序列基本上同源，除基本上位于意欲在基因组中产生靶向核苷酸交换或点突变的基因组中靶向序列的中间的一个或多个错配外。
本发明还在下面的实施例中进一步举例说明，所述实施例无意以任何方式限定本发明。在实施例中，参考下列附图。
图1:(a)嫁接的烟草植物的代表性照片。非转基因接穗被嫁接至转基因砧木上，并且从接穗除去所有叶子，以迫使韧皮部分流动沉默信号从源组织(砧木)流入接穗的顶部区域(库组织)。(b)用于从嫁接的植物收获的花粉的细胞计数（FACS）分析的嫁接组合的示意图。柱状图显示碘化丙啶-染色的花粉外被和细胞核的尺寸（散射光）和荧光强度。通过对照嫁接（野生型/野生型）获得的数目是高度可重现的。相反地，来自DMC1siRNA转基因接穗(倒转嫁接)或嫁接至DMC1siRNA品系上的野生型接穗(真实嫁接)的花粉的尺寸和DNA含量被显著改变。编号是指形成不产生或产生很少量的异常花粉的雄性不育花(编号1和2)的接穗花药和具有常规花粉产生的花药(编号3)的代表性图像。
图2:(上图框)从接穗花分离的小孢子四分体中的DAPI染色的细胞核(蓝色)的显微图像。注意产生DMC1siRNA的接穗(中间图像)和嫁接至DMC1沉默品系上的野生型植物（右边的图像）上的不平衡四分体（箭头）的外观。(下图框)从接穗花收获的花粉的扫描电子显微镜图像。来自对照嫁接（野生型/野生型）的花粉粒在形状和尺寸上是正常的。相反地，嫁接在转基因DMC1沉默品系上的野生型接穗产生在尺寸上是变化的畸形花粉粒。注意，在一个枝条内，畸形花粉的数目在初期花中比在晚期花中多。该观察与出现在在嫁接至DMC1siRNA品系上的野生型接穗上形成的第一花上的不育性花药表型相关。
图3:观察到的DMC1沉默信号在35S::YFP-ΔN DMC1花蕾中的传输的示意图（以彩色（左）以及黑白色（右）显示）。绿色或以点表示的部分表示其中未观察到YFP报道构建体的沉默的植物的部分。蓝色或带条纹的部分表示DMC1沉默(=YFP信号的消失)的存在。在萼片和心皮的表皮中以及在花药的产孢子组织中观察到DMC1沉默(蓝色/带点的)。在雌性器官例如雌芯、心皮或胚珠(绿色/带条纹的)或花序上后来形成的花蕾中未观察到YFP报道构建体的沉默。注意，观察到的DMC1沉默的传输在来自次级枝条的花序中出现的初期花蕾内重现。
实施例
实施例1
烟草植物的稳定转化
通过利用由Horsch RB等人,1985,Science227:1229-1231等人描述的方法，用具有二元载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LB4004转化叶盘获得转基因烟草SR1变种。
实施例2
通过穿过烟草的嫁接连接处的siRNA的长距离运输抑制体内染色体重组
通常在植物的雄性母细胞中发生的过程的重要实例是减数分裂染色体重组。本发明允许通过砧木中的转基因干扰减数分裂染色体重组，所述转基因产生短干扰RNA(siRNA)分子，所述分子被递送进入由嫁接在转基因砧木的顶部的接穗产生的雄性母细胞。
为了提供该现象的证据，按照实施例1的方法产生具有来自拟南芥的DMC1基因(破坏的减数分裂cDNA1)(TAIR:AT3G22880;由组成型启动子驱动的表达)的异位表达的RNAi发夹构建体的转基因烟草植物(烟草SR1变种)。DMC1是存在于性母细胞例如花药中的花粉母细胞和胚珠中的大孢子母细胞中的减数分裂细胞周期特异性因子和高度保守的RecA-型重组酶家族的成员(DNA依赖性ATP酶)(Doutriaux MP等人,1998,Mol Gen Genet257:283-291)。已显示DMC1对于同源物间的重组和二价体形成是至关重要的，从而对于正确的花粉和胚珠发育是至关重要的。功能性DMC1基因产物的缺乏诱导无交叉减数分裂，从而导致异常花粉粒的形成，所述异常花粉粒包含异常数目的染色体。孢子中的染色体数目取决于在第二减数期中发生的姊妹染色单体的有序减数分离。
将植物在温室条件下生长于土壤中(16小时的光照，25℃的日温和20℃的夜温)，选择3个明确地显示DMC1的沉默表型的转基因品系来进行进一步实验。该沉默表型包括一致地低水平的内源DMC1mRNA，减数分裂后不平衡小孢子四分体的形成，至少部分雄性不育和不规则形状（非整倍体）花粉的产生，这表明功能失调的减数分裂，其由靶向DMC1转录物的siRNA在雄性母细胞中的存在引起。
将来自野生型植物的接穗嫁接至来自这些选择的转基因品系的3至4周龄的植物(具有长度为约10cm的第一叶)。两个植物由此被组合，其中一个植物的底部(转基因砧木)支持另一个植物的上部分(野生型接穗)。利用保险刀片以45°的角度，通常在第三和第四叶之间产生嫁接切口。在转移过程中，将接穗茎短暂地浸没于水中，直至嫁接连接处对齐。牙签在石蜡膜与包裹好的茎之间用作空间支持物以帮助一些来自嫁接连接处的蒸发。
在嫁接后，切除接穗上新出现的叶子和砧木上出现的次级枝条，以迫使韧皮部介导的分子朝向接穗的顶部区域的递送。成功的嫁接即导致砧木与接穗之间的脉管连接的形成，韧皮部运输朝向库组织(例如分生组织区域和新出现的叶)。通过确保接穗的顶部区域作为植物的唯一地上库组织，可将韧皮部运输有效地朝向其中将形成花的该顶部区域。实验包括对照嫁接，即嫁接至野生型砧木上的野生型接穗，和嫁接至转基因或野生型砧木上的转基因接穗。
接穗抽苔在嫁接后约3周发生。花药的预检显示在其中接穗或砧木是转基因的所有嫁接中缺乏花粉产生(图1B)。该表型与DMC1的沉默表型是一致的。在前一种情况下，这不令人惊讶，因为整个接穗是转基因的，从而在性母细胞内产生针对DMC1的siRNA分子。然而，在后一种情况下，其暗示着-如由本发明教导的-由针对DMC1的RNAi发夹构建体产生的siRNA分子从转基因砧木被移动并且通过韧皮汁液系统性运输进入接穗，并且被递送进入在接穗的花蕾的产孢子组织内产生的雄性母细胞。
在其中接穗本身是转基因的对照嫁接中，在所有花中观察到该雄性不育性，然而在其中接穗是野生型(嫁接至转基因砧木上)的嫁接中，效应被限定于第一花。第一花几乎是不育的，然而后期的花完全可育。韧皮部介导的siRNA信号从而优选进入初始产生的花，其为韧皮汁液在其朝向接穗的顶点的途径中遇到的第一库组织。雄性不育表型也在在次级枝条上发育的第一花中被观察到。
进行来自嫁接至转基因砧木上的野生型接穗的第一花的更全面的检查，并且–基于来自野生型花粉的大小分布与荧光发射之间的高度可重现的关系-荧光激活细胞分选(FACS)分析显示相较于来自野生型花的花粉，在花粉尺寸上高得多的可变性（不规则分布）(图1B)。
通过扫描电子显微镜术确认了该观察，由得到产生DMC1siRNA的转基因砧木支持的野生型接穗的第一花产生的花粉表现出畸形和更小。来自后一种花的花粉是正常的（图2）。
表1在嫁接后观察到的DMC1siRNA表型的统计
Figure BDA0000463664410000121
a通过不育性、异常花粉产生、不平衡四分体的出现、FACS、减数分裂的细胞学检查、qPCR和DMC1-特异性siRNA分子的存在评价的。
b通过接穗叶和初级芽中YFP-ΔN DMC1荧光的缺乏而验证的。
为了进一步阐明该表型，研究了花粉发育的早期阶段。在对照嫁接(至野生型砧木上的野生型接穗)中，小孢子四分体全都具有正常外观并且是平衡的(n=100)。然而，在嫁接至转基因砧木上的野生型接穗中，四分体的总数在第一（早期）花中较少，相当数目的这类四分体（达到10%,n>100)是不平衡的，如通过一个四分体细胞中小的细胞核的出现所指示的(图2)。不平衡四分体形成是与在减数分裂过程中DMC1活性的丢失相关的典型表型之一。
虽然DMC1在雌性生殖器官中也具有活性，但在嫁接至转基因砧木上的野生型接穗的雌性生殖器官中未显示DMC1沉默的证据。当用野生型花粉授粉时，它们产生正常数目的可育性种子，表明正常雌性能育性。
为了进一步研究通过RNAi信号的系统性运输进行的雄性母细胞中的DMC1沉默，使用实施例1中描述的方法产生了另一组转基因烟草植物。这些植物具有35S::YFP:ΔN-DMC1转基因报道构建体，所述构建体包含功能失调的截短的拟南芥的DMC1cDNA，所述DMC1cDNA缺乏前276bp(即导致N末端92个氨基酸的缺失)，融合至用作可视报道分子的黄色荧光蛋白(YFP)，并且由组成型花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)驱动。
随后将正常显示遍在荧光信号（因融合蛋白的过表达而引起的）的来自这些转基因植物的枝条嫁接至具有DMC1沉默构建体的转基因砧木上。检查在接穗上新出现的花蕾，在第一（早期）花蕾中，YFP荧光信号在心皮和柱头中是强烈的，但不存在于花药内。这表明在初期花蕾中，系统性沉默信号优选被递送进入花药（图3）。
因此，本实施例教导了如何在烟草的雄性母细胞中高效地抑制染色体重组而无需使这些性母细胞或其产生的雄配子成为转基因的。本发明允许在优选实施方案中应用逆向育种(WO03017753)，即利用非转基因后代。该概念在实施例3中进行进一步解释。
虽然在本实施例中，DMC1基因被靶向，但是在功能上参与减数分裂染色体重组的任何步骤的任何其它基因都可被靶向而具有相当的结果。
实施例3
通过系统性沉默信号介导的芸苔的非转基因逆向育种
将实施例2中概述的实验方法用于甘蓝，导致具有异位表达的针对SDS(SOLO DANCERS)基因的发夹RNAi沉默构建体的转基因砧木。将来自种间F1杂种(萝卜x甘蓝)的野生型杂种接穗嫁接至这些转基因砧木,并且通过除去所有接穗的叶迫使沉默信号进入雄性母细胞，如实施例2中所描述的。由接穗产生的第一花蕾包含显著比例的异常小孢子四分体，并且这些花大部分是雄性不育的。
当在接穗上产生的第一花蕾在尺寸上为约3mm时，在其中发育的小孢子已达到进行小孢子体外再生（单雄生殖）的最佳阶段。从这些花蕾中纯化小孢子，并且给它们施加2天32℃的应激处理，所述应激处理对于诱导单倍体孢子的孢子体发育是最佳的。使用本领域技术人员已知的方法(例如Swanson EB等人,Plant Cell Rep6:94-97;Takahata Y和Keller WA,Plant Sci74:235-242)将平衡的(整倍体)小孢子再生成单倍体小植株,随后将秋水仙碱处理用于基因组加倍，从而导致具有完全补足的染色体的单倍体或加倍的单倍体(DH)小植株。
由于通过雄性母细胞中的DMC1沉默对染色体重组的抑制，通过该方法获得的DH植物中的染色体未被重组，从而它们具有与已用作用于嫁接的接穗的杂种植物的亲本品系的染色体完全一样的遗传组成。这通过在萝卜与甘蓝（在嫁接中用作接穗的F1杂种的亲代）之间是多态的分子标记物(每染色体2个，即每染色体臂1个)得以确认。
通过使用相同组的分子标记物，筛选从从接穗的花药收集的小孢子再生的DH植物以鉴定遗传上互补（即包含成组的当在F1中组合时对应于存在于用作用于嫁接的接穗的杂种中的染色体的精确组的亲代染色体）的个体。这些互补个体的杂交导致杂种基因型(萝卜x甘蓝)的精确重建。
本实施例从而例示了如何将本发明用于精确地重建杂种基因型。重要地是，这在不使重构的杂种植物变成转基因的情况下实现，因为在DH产生之前染色体重组的抑制已通过雄性母细胞中的瞬时siRNA信号实现。
上述实施例中概述的方法还可用于其它植物物种。还特别地将其用于具有长生命周期的农作物物种，例如树(例如白杨，和果树例如苹果树、梨树、樱桃树、桃树、李树、香蕉树、柑橘属树、木瓜树、无花果树等)和葡萄树。本发明可用于这样的农作物的种子繁殖特异性性状，可快得多地产生无转基因良种品系，并且可避免数年的常规育种努力。

Claims (15)

1.一种用于干扰植物的雄性母细胞中的过程的方法，其通过将包含转基因地具有核酸序列的砧木的第一植物与来自嫁接至所述第一植物的砧木上的第二植物的接穗组合来进行，其中所述转基因核酸序列在第一植物的砧木中产生多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被系统性运输通过嫁接连接处，进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞，并且其中所述系统性运输的多核苷酸分子至少部分地互补于在第二植物的接穗产生的雄性母细胞中表达的转录物。
2.权利要求1中所述的方法，其中转基因核酸序列在第一植物中的表达通过将所述核酸序列可操作地连接至启动子序列来实现，所述启动子序列赋予所述转基因核酸序列遍在性表达谱，或组织或细胞类型特异性表达谱。
3.权利要求2中所述的方法，其中所述启动子序列赋予所述转基因核酸序列包括根的表达谱。
4.权利要求1-3中所述的方法，其中干扰雄性母细胞中的过程是：抑制或阻断雄性母细胞中的过程。
5.权利要求4中所述的方法，其中抑制或阻断雄性母细胞中的过程通过使用多核苷酸分子进行的使靶基因mRNA去稳定来实现，所述多核苷酸分子至少部分地与靶基因mRNA或转录物互补，并已从转基因核酸序列产生。
6.权利要求5中所述的方法，其中所述多核苷酸分子选自miRNA、反义RNA、RNAi分子、siRNA分子、病毒诱导的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子或RNA寡核苷酸。
7.权利要求1-3中所述的方法，其中植物的雄性母细胞中的过程的影响是：植物的雄性母细胞中的过程的增强。
8.权利要求1-7中所述的方法，其中所述多核苷酸分子在第一植物中瞬时表达。
9.权利要求8中所述的方法，其中所述多核苷酸分子在第一植物中的瞬时表达通过使用诱导型启动子来实现，所述诱导型启动子选自热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和醇诱导型启动子。
10.权利要求8中所述的方法，其中所述多核苷酸分子的瞬时表达通过从编码未被整合在砧木细胞的基因组中的多核苷酸分子的构建体表达来实现。
11.权利要求10中所述的方法，其中通过用农杆菌对砧木上的叶子进行渗入来将构建体递送至砧木细胞。
12.权利要求1-11中所述的方法，其中所述多核苷酸分子至少部分地与参与染色体重组的基因的转录物互补。
13.权利要求12中所述的方法，其中所述基因选自SPO11、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、RED1、HOP1、RAD50、MRE11、XRS2、PRD1、PRD2、PRD3、PHS1、NBS1、COM1、RHD54/TID1、DMC1、SAE3、RED1、HOP1、HOP2、MND1、REC8、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA1、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HIM6、CHK2、SGS1、MSH4、MSH5、MER3/RCK、ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOC1、ZYP1、MLH1、MLH3或它们的功能性同源物。
14.权利要求1-13的任一项中所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA多核苷酸。
15.一种用于特异性改变植物的雄性母细胞的基因组序列的方法，其通过将包含转基因地具有核酸序列的砧木的第一植物与来自嫁接至所述第一植物的砧木上的第二植物的接穗组合来进行，其中所述转基因核酸序列在第一植物的砧木中产生多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被系统性运输通过嫁接连接处，进入由第二植物的接穗产生的雄性母细胞，并且其中所述多核苷酸分子至少部分地与第二植物的基因组中包含的DNA片段同源。
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