KR20140056294A - 웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 형질전환된 핵산 서열을 보유한 대목을 포함하는 제1 식물을, 상기 제1 식물의 대목 위에 접목되는 제2 식물 유래 접순 (scion)과 접목시킴으로써, 상기 형질전환된 핵산 서열이 상기 제1 식물의 대목에서 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 접목 정션을 통과하여 체계적으로 수송되어, 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포에 도입되며, 상기 체계적으로 수송된 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포에서 발현되는 전사체와 적어도 부분적으로 상보적인 것을 특징으로 하는, 식물의 웅성 감수분열 모세포의 프로세스를 간섭하는 방법에 관한 것이다.

Description

웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법 {METHOD FOR SYSTEMICALLY INFLUENCING PROCESSES IN THE MALE MEIOCYTE}
본 발명은 식물의 웅성 감수 분열 모세포의 세포내 프로세스를 간섭하는 방법에 관한 것이다.
유성 생식은 현화 식물의 생활 주기에서 가장 중요한 프로세스일 것이다. 이는 유기체의 다음 세대를 공급해주며, 모 유기체와 부 유기체의 유전자 특징들이 재조합 (재배합)됨으로써 유전학적 다양성을 확보할 수 있다. 이러한 다음 세대의 다양성은 식물이, 예를 들어, 생물 및 무생물 환경 변화에 보다 쉽고 잘 적응할 수 있게 해준다.
생물학적 연구를 통해, 속씨 식물에서 유성 생식에 중요한 역할을 담당하는 프로세스들과 인자들이 충분히 파악되었다. 필수 단계는 다음과 같다:
- 이배체 감수분열 모세포로부터 수 배우자 (소포자, 화분립) 및 암 배우자 (배주 안에 있는 난세포와 배낭)의 발생 및 성숙화. 반수체 배우자의 발생은 배우자-생성 유기체의 모 게놈 2개가 재조합되는 2가지 버전의 감수분열을 통해 형성된다;
- 수분 (암 생식기관/암술머리에 수 배우자의 착상). 이는, 예를 들어, 바람, 곤충 또는 기타 특정 수분 매개체 (pollinator)에 매개되거나, 또는 자가-수정 종일 경우에는, 중력, 근접 또는 능동적인 수분 기전을 통해 간단하게 매개될 수 있다;
- 화분립의 발아, 및 후속적으로, 이를 수용하며 화학적으로 끌어당기는 난세포 쪽으로 화분관을 통한 정핵 (정세포)의 이동;
- 배낭 내 정핵의 방출과, 그에 따른 중복 수정, 이로써 정세포 하나는 난세포와 융합하여 이배체 배가 되고 다른 정세포는 이배체 중심 세포와 융합하여 삼배체 배젖이 됨;
- 접합체의 유사분열 및 발생 패터닝 (developmental patterning), 이로써 배가 형성됨.
본 발명의 목적에 따르면, 제1 단계, 즉 감수분열 모세포로부터 배우자, 특히 수 배우자를 형성하는 단계가 가장 중요하다. 속씨 식물의 경우, 수 배우자 또는 소포자는 꽃밥 안에서 만들어진다. 이것은, 2번의 감수분열을 포함하는 감수분열을 수행하는 이배체 화분 모 세포 (감수분열 모세포의 한가지 유형임)로부터 기원한다. 감수분열의 최종 결과로 각 화분 모 세포에 대한 반수체 소포자 4개 세트가 만들어지며, 이들 소포자들은 각각 2번의 유사분열을 거쳐 더욱 진행된다. 이들 분열에서 첫번째 분열은 비대칭적이며, 영양 세포 하나와 생식 세포 하나가 만들어지며, 2번째 유사분열에서는 2개의 생식 세포로 분열된다. 그 결과, 2개의 정세포가 모두 영양 세포의 세포질 안에 위치하는 독특한 배열로 정세포를 포함하는 화분립이 생성된다.
제2 유사 분열의 시기는 식물 수 종에 따라 큰 차이가 있으며, 2번째 화분의 유사 분열은 (예를 들어, 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 벼의 경우에서와 같이) 개화 (anthesis) 전, 또는 (예를 들어, 토마토와 담배의 경우에서와 같이) 개화 후 화분관이 생장하는 동안에 발생할 수 있다. 따라서, 종에 따라, 속씨 식물의 꽃은 3세포성 (영양 핵 1개 + 생식 핵 2개를 포함함) 또는 2세포성 화분립 (영양 핵 1개 + 생색 핵 1개를 포함함)을 발산할 수 있다.
세포의 감수분열은, 새로운 유전자 조합이 이루어지는 부모의 유전자 정보를 재배합하는 수단과 반수체 배우체로 게놈을 "양분(undoubling)"하는 수단이 되기 때문에, 배우자를 형성하는 과정에서 본질적으로 중요한 프로세스이다. 감수분열 모세포는 감수분열 모세포 안에서 발생하는 분자적, 생리적 및/또는 발생학적 프로세스에 영향을 줄 수 있으며, 유성 생식, 다음 세대로의 유전 물질 전달 뿐만 아니라 심지어 진화에도 상당한 효과를 줄 가능성이 있기 때문에, 감수분열 모세포에 상당한 연구적 관심이 집중되고 있다.
식물에서, RNA-기반의 침묵화 신호가 다른 기관으로 체계적으로 전달된다는 것은 공지된 사실이다. 이러한 RNA-기반의 신호를 원거리 전달하기 위해, 현화 식물은 체관부로 지칭되는 특수 유관속계 (vascular system)를 이용한다. 체관부는 이온, 당, 뉴클레오티드, 호르몬, 아미노산 및 단백질 등의 소형 분자들을 기원 (생산) 조직으로부터 종실(sink) (소비) 조직으로 지향적으로 전달하는데 일조한다. 다수의 식물 종들에서, 특정 유전자 산물로부터 유래된 소형 폴리뉴클레오티드 분자 (전형적으로 뉴클레오티드 18 -27개 크기의 RNA 분자)들이 체관액에 존재하는 것으로 확인되었으며, 기원-종실 흐름을 따라 재배치되는 것으로 시사되었다.
문헌들을 통해, 원거리 전달 경로를 통해 식물이 소형 간섭 RNA (siRNA) 분자로 인한 체계적인 전사 후 유전자 침묵화 (PTGS)를 유도할 수 있다는 것이 공지되어 있다.
siRNA로 인한 - PTGS는 미지의 기전에 의해 리셋팅되며, 이후 세대에서 재-확립된다. PRTS-리셋팅은 웅성 배우체 (gametophyte)에서 트랜스포존 활성에 대한 실험으로 확인된 바와 같이, 감수분열 중에 발생하는 것으로 보이며, 배우자들에서 다시 확립될 수 있다.
siRNA 타겟팅 트랜스포존 인자 (siRNA targeting transposable element) 전사체는 영양 핵에서 활성화되어, 수정 중인 정세포로 전달되며, 이곳에서 트랜스포존 활성을 하향-조절한다. 즉, 화분립과 수정 중인 화분관 안에서, siRNA-매개 침묵화 기구가 활성화된다. 또한, 꽃밥-특이 유전자가 침묵화될 수 있으므로, PTGS 기전은 포자체 조직에서도 작동한다. GFP 서열을 포함하는 전사체의 과다 발현에 의해 siRNA-매개 침묵화의 전파를 유도하는, GFP를 발현하는 형질전환 세포주를 이용하여 수행한 실험들에서, siRNA 신호가 새 잎과 같은 강력한 종실 조직 (sink tissue)들로 체계적으로 전파되는 것으로 시사되었다.
그러나, 모든 종실 조직들이 PTGS 신호를 받아들일 수 있는 것은 아닌 것으로 보인다. 체계적인 siRNA-매개 GFP-침묵화는 자라나는 꽃봉우리로만 고도로 한정되는 것으로 보고되어 있으며, 꽃밥이나 심피의 감수분열 모세포 (포자형성) 조직에서의 GFP 침묵화는 관찰되지 않았다.
이에, 종래 기술 분야에서는, 원거리 이동 신호가 감수분열 모세포에 접근할 수 없으며, 발생의 가장 초기 단계에 미래 소포자를 보호하는 장벽이 존재하는 것으로 당연시 되었다.
그러나, 본 발명을 도출한 연구에서는, 접목된 가지 (접순) 또는 접순에 의해 발생되는 감수분열 모세포 또는 소포자, 또는 이들 소포자로부터 유래된 식물에 형질전환을 부여하지 않고도, 형질전환 대목 (transgenic rootstock)으로부터 유래된 체계적인 폴리뉴클레오티드 신호를, 감수분열 모세포로 타겟팅할 수 있는 방법을 발견하게 되었다.
본 발명자들은, 웅성 감수분열 모세포에서, 체계적인 신호로서 웅성 감수분열 모세포로 전달되는 폴리뉴클레오티드 신호를 통해, (분자) 세포내 프로세스를 간섭하는 방법을 발견하게 되었다.
또한, 종래 기술 분야에서는, 구성 프로모터 (constitutive promoter)를 이용하여 RNAi 구조체를 과다 발현시킴으로써, 웅성 감수분열 모세포에 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (Dirks R et al, 2009, Plant Biotechnol J 7: 837-845; Reverse Breeding: WO03/017753). 그러나, 웅성 감수분열 모세포를 생산하는 유기체 뿐만 아니라 감수분열 후 생산되는 소포자 50% 이상이 형질전환된 것이라는 점은, 이러한 방식으로 인한 심각한 문제이다. 조절, 효율 및 실무적인 이유로, 분자 재조합 프로세스가 간섭된 감수분열 모세포 기원의 포자로부터 전이유전자가 없는 (transgene-free) 식물을 생산하는 방법을 개발하는 것이 가장 바람직하다. 이러한 소포자는, 예를 들어, 전이유전자가 함유되지 않은 배가 반수체 식물 (DH)을 생산하는데 사용할 수 있다.
종래 기술 분야에는, 시험관내 소포자 배양 (소포자로부터 반수체 소 식물체 재생, 및 이후 예컨대 콜히친을 이용한 게놈 배가) 등의 소포자로부터 반수체 식물을 생산하는 다양한 방법들과, 반수체-유도 세포주를 수분시킨 후 수정으로 접합체에서 모계 염색체를 제거하여, 수분 및 수정에 사용되는 소포자와 유전적으로 동일한 반수체 배를 가진 생장가능한 종자를 생산하는 단계를 포함하는, WO2011044132에 기술된 방법이 개시되어 있다.
본 발명을 도출하는 연구에서, 성숙한 대목에서 형성된 siRNA 신호가 체계적으로 침투할 수 있으며, 정단의 포자형성 세포 (apical sporogenic cell), 특히 감수분열 모세포에서 활성화될 수 있다는 것을, 놀랍게도 발견하게 되었다. 이는, RNAi 구조체를 보유하고 있으며 siRNA 분자를 생산하는 형질전환 대목에 비-형질전환 접순을 접목하고, 상기 비-형질전환 접순에 의해 발생되는 웅성 감수분열 모세포에서 유전자 표현형의 침묵화를 관찰함으로써, 입증하게 되었다. 감수분열 모세포 조직을 타겟팅하는 이러한 체계적인 siRNA 분자들은, 따라서, 후대의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다.
이에, 형질전환된 대목에서 RNAi 구조체로부터 생성되는 siRNA 분자들은, 접목 정션 (graft junction)을 통한 원거리 수송을 통해 접순 전체로 전파될 수 있다. 현 연구들을 통해, 이들 구조체로부터 생성되는 폴리뉴클레오티드 (siRNA) 분자들은, 이후 웅성 감수분열 모세포로 도입되게 강제되어, 상기 모세포 안에서 유전자 침묵화를 구현하거나 또는 이들 감수분열 모세포에서 전사체 또는 게놈 물질을 다른 방식으로 간섭시키는 것으로 확인되었다. 지금까지지, 원거리 전달을 통해 초기 발생 중인 감수분열 모세포 또는 소포자로 분자를 이입하는 것은 불가능한 것으로 여겨졌었다. 놀랍게도, 꽃의 경우, siRNA 분자는 꽃밥과 내부 감수분열 모세포로 선호적으로 타겟팅되지만, 자성 감수분열 모세포 (씨방에 포함된 대포자 모세포)는 이 siRNA 신호를 받아들이지 않는다.
본 발명을 적용하여, 웅성 감수분열 모세포에서 이루어지는 모든 분자 프로세스, 예컨대 감수분열, 염색체 재조합 및 상동성 재조합을 간섭할 수 있으며, 또한, 예를 들어, 이들 감수분열 모세포로부터 유래된 소포자의 동정생식 자극 (androgenetic stimuli)에 대한 무반응 등의, 소포자의 생리 기능을 간섭할 수 있다. "간섭"은 이들 세포내 프로세스의 억제 또는 차단, 또는 이의 강화를 지칭할 수 있다. 또한, 이는, 유전자 및/또는 조절 (cis-작용) 서열에서, (감수분열 모세포에서 상동적인 재조합이 자발적으로 발생하는 동안에) 다음 세대로 전달되는 유전 물질의 특이적인 변형, 예를 들어 부위 특이적인 돌연변이 유발을 허용한다.
중요하게는, 대목만 전이유전자를 가지고 있기 때문에, 본 발명을 적용하더라고, 웅성 감수분열 모세포, 이로부터 발생되는 소포자 또는 접순에는 형질전환이 이루어지지 않는다. 소포자와 접순은 전이유전자-유래 분자를 일시적으로만 발현하며, 이들 분자는 다음 세대로 전달되지 않는다. 전이유전자-유래 분자에 의해 발생되는 분자적 효과만 다음 세대로 전이된다. 접목 정션을 통과하여 전이유전자-비함유 식물 물질로 체계적으로 전달될 수 있는 전이유전자 발현성 우성-네거티브 인자를 사용하면, 이를 안정적으로 형질전환시키지 않고도, 연구자들은 새로운 형질을 농작물에 부여하는데 전이유전자 기법을 충분히 이용할 수 있다.
특이적인 돌연변이는 상동적인 재조합을 통해 (Paszkowski J et al, 1988, EMBO J 7: 4021-4026; Mengiste T and Paszkowski J, 1999, Biol Chem 380: 749-758; Vergunst AC and Hooykaas PJJ, 1999, Crit Rev Plant Sci 18: 1-31), 또는 올리고뉴클레오티드-기반의 돌연변이 유도를 통해 (Oh TJ and May GD, 2001, Curr Opin Biotechnol 12: 169-172; KeyBase technology: WO2010074562, EP2167660, WO2007073149) 식물 게놈에 도입될 수 있다.
이러한 본 발명의 방법은 식물 육종 용도로 사용될 수 있다. 현행 육종법은 느리고, 품종을 개발하는데 5-10년 이상 걸린다. 한가지 문제점은 초기 세대에서 형질을 선별하기 불가능하는 것이다. 이러한 문제는, 아래 실시예 3에 예시한 바와 같이, 양립가능한 형질전환 대목에 접순을 이식하여 비-형질전환 접순에서 배가 반수체 생산을 유도함으로써 해결할 수 있다.
본 발명은 접목 및 형질전환이 가능한 모든 식물 종에 적용할 수 있다. 본 발명이 실시될 수 있는 농작물 종으로는, 예를 들어, 담배, 포풀러, 옥수수, 밀, 보리, 벼, 수수, 사탕무, 평지 (oilseed rape), 라이그라스 (ryegrass), 해바라기, 대두, 토마토, 오이, 커킨 (gherkin). 콘 샐러드, 시금치, 페퍼, 페튜니아, 감자, 가지, 멜론, 당근, 무, 상추, 식물성 십자화과 종 (양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 콜라비, 싹 양배추 (Brussels sprout), 부추, 콩, 완두콩, 꽃상추, 치커리, 양파, 딸기, 회향, 테이블 비트, 샐러리, 샐러리 뿌리, 아스파라거스, 해바라기 및 그레이프 바인 (grape vine)을 포함한다.
본 발명은, 형질전환된 핵산 서열을 보유한 대목을 포함하는 제1 식물을, 상기 제1 식물의 대목에 이식되는 제2 식물 유래의 접순과 접목시켜, 상기 형질전환된 핵산 서열이 제1 식물의 대목에서 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키고, 이 폴리뉴클레오티드 분자가 접목 정션을 통과해 체계적으로 이동하여 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포로 유입되며, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 상기 웅성 감수분열 모세포에서 발현된 전사체와 적어도 부분적으로 상보적인 것인, 식물의 웅성 감소분열 모세포의 프로세스를 간접하는 방법에 관한 것이다.
제1 식물에서 상기 형질전환된 핵산 서열의 발현은, 상기 핵선 서열을, 상기 형질전환된 핵산 서열에 전체 또는 전부위 발현 프로파일, 또는 조직- 또는 세포-타입 특이적인 발현 프로파일을 부여하는, 프로모터 서열과 작동가능하게 연결시킴으로써, 달성된다. 이를 위해, 상기 형질전환된 핵산 서열은, 식물에서 상기 핵산 서열의 발현을 구동할 수 있는 능력을 가진 프로모터 서열의 하류 (3' 말단)에 넣어, 형질전환 구조체에 클로닝한다. 프로모터 서열은 식물 조직에서의 이들의 발현 패턴에 따라 결정되며, 일부는 모든 조직들에서 유전자 발현을 구동하는 능력을 가지는 (전부위 발현) 반면, 일부는 (공간-시기적으로) 좀더 국한된 발현 패턴, 또는 특이적인 세포 타입 또는 조직 타입에 제한된 매우 특이적인 발현 패턴을 가진다.
형질전환된 핵산 서열에 전부위 발현 프로파일을 부여하는 프로모터 서열의 예로는, 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (CaMV 35S), 선택된 유비퀴틴 프로모터, 선택된 액틴 프로모터, 및 그외 다수가 있다. 조직-타입 또는 세포-타입 특이적인 프로모터의 예들 역시 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.
본 발명에서는, 프로모터 서열이 대목을 포함하는 발현 프로파일을 상기 형질전환된 핵산 서열에 부여한다. 이는, 대목이 상기 형질전환된 핵산 서열을 보유하는 상기 제1 식물로부터 유래된 것이기 때문에 바람직하며, 따라서, 상기 핵산 서열은 상기 제1 식물의 대목에서 적어도 발현되어야 한다. 상기 대목은 종실 조직으로 전달되는 체관액이 기원된 소스 조직을 포괄하며, 보다 구체적으로는, 접순의 종실 조직을 포괄한다. 대목은 뿌리를 포함하며, 아울러 줄기 일부 또는 일부 (성숙한) 잎을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 형질전환된 핵산 서열의 발현 산물은 대목 전체에서 또는 이의 일부에서, 예를 들어, 뿌리-, 잎- 또는 줄기-특이적인 프로모터를 이용함으로써, 만들 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형질전환된 핵산 서열은 제1 식물의 대목에서의 발현이 구성적인 발현이다. 다른 구현예로, 상기 형질전환된 핵산 서열은 제1 식물의 대목에서의 발현이 일시적인 발현이다. 일시적인 발현은, 예를 들어, 열-유도성 프로모터, 화합물-유도성 프로모터, 스테로이드-유도성 프로모터 및 알코올-유도성 프로모터로부터 선택되는 유도성 프로모터를 이용함으로써 달성할 수 있다. 일시적인 발현은 유도성 프로모터를 사용하거나, 또는 대목 게놈에 전이유전자를 안정적으로 삽입하는 대신, 대목에 (강력한 프로모터를 구비한) 형질전환 구조체를 일시적으로 도입함으로써, 달성할 수 있다. 이러한 일시적인 형질전환은, 예를 들어, 접순을 대목에 접목한 후, 대목에 부착된 채 있는 잎의 기공을 통해 아그로박테리움을 침투시킴으로써 달성할 수 있다.
일 구현예에서, 웅성 감수분열 모세포에서 프로세스의 간섭은 웅성 감수분열 모세포의 프로세스 억제 또는 차단으로 이루어진다. 다른 구현예로, 웅성 감수분열 모세포에서 프로세스의 간섭은 웅성 감수분열 모세포의 프로세스 강화로 이루어진다. 간섭이 웅성 감수분열 모세포에서 프로세스를 억제 또는 차단하는 것으로 이루어지는 경우, 이는, 형질전환된 핵산 서열로부터 만들어지며, 타겟 유전자 mRNA나 전사체에 적어도 부분적으로 상보적인, 폴리뉴클레오티드 분자를 이용하여, 타겟 유전자의 mRNA를 불안정화게 함으로써, 달성할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 miRNA, 안티센스 RNA, RNAi 분자, siRNA 분자, 바이러스-유도성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공동-억제자 분자 또는 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형질전환된 핵산 서열은 제1 식물의 게놈에 안정적으로 삽입된다. 다른 구현예로, 상기 형질전환된 핵산 서열은 제1 식물의 대목에 일시적으로 존재한다.
일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 제1 식물에서, 바람직하게는 뿌리를 포함하는 발현 도메인에서 구성적으로 생산 및 발현된다. 이는, 폴리뉴클레오티드 분자를 생산 및 발현시키는데 외부적인 처리가 필요하지 않다는 것을 암시한다. 형질전환된 핵산 서열이 작동가능하게 연결되는 프로모터의 특성은 폴리뉴클레오티드 분자의 생성 및 발현에 대한 시기적 공간적 패턴을 결정한다.
다른 구현예로, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 제1 식물에서, 바람직하게는 뿌리를 포함하는 발현 도메인에서 일시적으로 생성 및 발현된다. 이는, 형질전환된 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 프로모터 서열의 활성에 대해 외부적인 인자 또는 처리가 영향을 미치므로, 폴리뉴클레오티드 분자의 생성 및 발현의 시기적 및/또는 공간적 패턴을 유도 및/또는 조정하기 위해, 외부적인 인자 또는 처리가 사용될 수 있다는 것을 내포한다.
이러한 구현예에서, 제1 식물에서 폴리뉴클레오티드 분자의 일시적인 발현은 열-유도성 프로모터, 화합물-유도성 프로모터, 스테로이드-유도성 프로모터 및 알코올-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 유도성 프로모터를 이용하여 달성된다. 대목에 유도성 프로모터의 활성을 유도하는 제제(들) 및/또는 조건(들) (예, 열 충격 또는 열 처리, 특정 화학제, 덱사메타손과 같은 특정 스테로이드, 또는 알코올)의 처리는, 상기 유도성 프로모터를 활성화시키며, 그 결과, 제1 식물에서, 바람직하게는 뿌리를 포함하는 발현 도메인에서, 폴리뉴클레오티드 분자가 일시적으로 발현된다.
형질전환된 핵산 서열로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드 분자는 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포 내에서 발현된 전사체와 적어도 부분적으로 상보적이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 재조합에 참여하는 유전자의 전사체 (전사된 핵산 서열 또는 mRNA)와 적어도 부분적으로 상보적이다. 이러한 구현예에서, 이 유전자는 SPO11, MER1, MER2, MRE2, MEI4, REC102, REC104, REC114, MEK1/MRE4, RED1, HOP1, RAD50, MRE11, XRS2, PRD1, PRD2, PRD3, PHS1, NBS1, COM1, RHD54/TID1, DMC1, SAE3, RED1, HOP1, HOP2, MND1, REC8, MEI5, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RPA1, SMC3, SCC1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, SOLODANCERS, HIM6, CHK2, SGS1, MSH4, MSH5, MER3/RCK, ZIP1, ZIP2, ZIP3, ZIP4, PTD, SHOC1, ZYP1, MLH1, MLH3, 또는 이들의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 적절하게 선택된다.
다른 구현예에서, 제1 식물의 대목에서 형질전화된 핵산 서열에 의해 제조되며 접목 정션을 통과하여 체계적으로 전달되어 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포로 도입되는, 폴리뉴클레오티드 분자는, DNA 폴리뉴클레오티드이다. 이들 DNA 폴리뉴클레오티드는, 전형적으로, 전술한 구현예들의 RNA 폴리뉴클레오티드와 동일한 크기를 가지며, 즉, 뉴클레오티드 약 18개 내지 약 27개의 크기를 가진다. 이들 DNA 폴리뉴클레오티드는 핵 DNA, 플라스미드 DNA, 엽록체 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 기타 DNA 분자로부터 유래될 수 있다.
본 발명은, 또한, 형질전환된 핵산 서열을 보유하는 대목을 포함하는 제1 식물을, 상기 제1 식물의 대목에 이식되는 제2 식물 유래 접순과 접목시킴으로써, 상기 형질전환된 핵산 서열에 의해 제1 식물의 대목에서 폴리뉴클레오티드 분자가 생성되고, 이 폴리뉴클레오티드 분자가 접목 정션을 통과하여 체계적으로 전달되어 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포로 도입되며, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 제2 식물의 게놈에 함유된 DNA 단편과 적어도 부분적으로 상동적인 것인, 식물의 웅성 감소분열 모세포의 게놈 서열을 특이적으로 변형시키는 방법에 관한 것이다.
이러한 구현예에서, 웅성 감소분열 모세포의 게놈 서열과 이의 타겟 뉴클레오티드의 교환을 구현하기 위해서는, 웅성 감소분열 모세포에서의 상동적인 재조합을 이용할 수 있다. 이는, 예를 들어, 염색체의 재조합이 일어나 염색체로의 접근성이 용이해졌을 때, 웅성 감수분열 모세포 내에 소형 DNA 폴리뉴클레오티드를 존재시킴으로써 달성할 수 있다. 특이적인 돌연변이는 상동적인 재조합을 통해 (Paszkowski J et al, 1988, EMBO J 7: 4021-4026; Mengiste T and Paszkowski J, 1999, Biol Chem 380: 749-758; Vergunst AC and Hooykaas PJJ, 1999, Crit Rev Plant Sci 18: 1-31) 또는 올리고뉴클레오티드-기반의 돌연변이 유도에 의해 (Oh TJ and May GD, 2001, Curr Opin Biotechnol 12: 169-172; KeyBase technology: WO2010074562, EP2167660, WO2007073149), 식물 게놈에 도입할 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 폴리뉴클레오티드는, 기본적으로 게놈과 타겟 뉴클레오티드의 교환 또는 점-돌연변이를 만들고자 의도한 게놈내 타겟 서열의 중간 부분에 위치한 하나 이상의 미스매치를 제외하고는, 게놈 서열과 본질적으로 상동적이다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 예시되지만, 이들 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하지 않는다. 실시예들에서, 아래 도면들이 참조된다.
도 1: (a) 접목한 담배 식물의 대표 사진. 비-형질전환 접순을 형질전환 대목에 접목하였으며, 접순에서 잎을 모두 제거하여, 체관부를 따라 이동하는 침묵 신호가 소스 조직 (대목)으로부터 접순의 정단부 (종실 조직)로 가게 하였다. (b) 접목한 식물에서 수확한 화분에 대한 세포측정 (FACS) 분석에 사용된 접목의 조합들을 개략적으로 도시함. 히스토그램은 요오드화 프로피듐으로 염색된 화분 막 및 핵의 크기 (산란 광) 및 형광 강도를 나타낸다. 접목 대조군 (야생형/야생형)으로 수득한 수는 재현성이 높았다. 반면, DMC1 siRNA 형질전환 접순 (역 접목 (reverse graft)) 또는 DMC1 siRNA 주에 접목한 야생형 접순 (진성 접목 (true graft))으로부터 유래된 화분의 크기와 DNA 함량은 유의하게 달라졌다. 번호들은 접목 꽃밥 형성의 대표적인 사진을 표시한다: 비정상적인 화분을 전혀 또는 소량 생산사는 웅성 불임 꽃 (1번 및 2번), 정상적인 화분을 생산하는 꽃밥 (3번).
도 2: (상단 패널) 접순부의 꽃에서 분리된 소포자 사분자를 DAPI로 핵 염색한 현미경 사진 (블루). 불균형한 사분자 (화살촉 표시부). DMC1 siRNA-생산 접순 (중앙 이미지) 및 DMC1 침묵 주에 야생형 식물을 접목한 경우 (우측 이미지), 불균형한 사분자가 형성됨에 유념한다. (하단 패널) 접목부의 꽃에서 수확한 화분의 주사 전자 현미경 사진. 접목 대조군 (야생형/야생형)의 화분립은 형태 및 크기가 정상이었다. 반면, DMC1 침묵성 형질전환주에 야생형 접순을 접목한 주에서는 다양한 크기를 가진 기형 화분립이 형성되었다. 하나의 가지의 기형 화분의 수가 후기 꽃에 비해 초기 꽃에서 많다는 점에 유념한다. 이러한 관찰 결과는, DMC1 siRNA 주에 접목시킨 야생형 접순부에서 나타난 첫번째 꽃에서의 불임 꽃밥 표현형 출현과 관련있다.
도 3: 유색 (좌측) 및 흑백 (우측) 둘다, 35S::YFP-ΔN DMC1 꽃봉오리에서 관찰되는 DMC1 침묵화 신호 전파를 도시한 개략도. 그린 또는 도트형 부분은 YFP 리포터 구조체의 침묵화가 관찰되지 않는 식물의 부분을 나타낸다. 블루 또는 줄친 부분은 DMC1 침묵화가 발생한 부분을 나타낸다 (즉, YFP 신호가 사라짐). DMC1 침묵화 (블루/도트형)는 꽃받침과 심피의 상피와, 꽃밥의 포자형성 조직에서 관찰되었다. YFP 리포터 구조체의 침묵화는 암술, 심피 또는 배주 등의 암 기관 (그린/줄친 부분), 또는 화서 (inflorescence) 상 후기에 형성되는 꽃봉오리에서는 관찰되지 않았다. 관찰되는 DMC1 침묵화 전파가 2번째 줄기에서 자라나는 화서 상 1차 꽃봉오리들에서 반복된다는 점에 주목한다.
실시예들
실시예 1
담배 식물의 안정적인 형질전환
바이너리 벡터를 가지고 있는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 LB4004를 이용하여, Horsch RB et al, 1985, Science 227: 1229-1231에 기술된 방법으로 잎 디스크 형질전환함으로써, 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) var. SR1 형질전환주를 구축하였다.
실시예 2
담배에서 접목 정션을 통과하여 siRNA 원거리 수송을 통한 생체내 염색체 재조합 억제
식물의 웅성 감수분열 모세포에서 전형적으로 발생하는 가장 중요한 프로세스의 예는 감수분열시 염색체의 재조합이다. 본 발명은 소형 간섭 RNA (siRNA) 분자를 생산하는 대목에서 전이유전자를 이용함으로써 감수분열시 염색체 재조합의 간섭을 가능하게 하는데, 상기 siRNA 분자는 형질전환 대목의 꼭대기에 접목된 접순부에 형성된 웅성 감수분열 모세포로 전달된다.
이에 대한 증거를 제공하기 위해, 아라비돕시스 탈리아나 유래의 DMC1 (Disrupted Meiotic cDNA1) 유전자에 대한 이소 발현성 RNAi 헤어핀 구조체 (TAIR: AT3G22880; 구성 프로모터에 의해 발현이 인가됨)를 가진, 담배 형질전환 식물 (Nicotiana tabacum var. SR1)을 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. DMC1은 감수분열 세포 주기에 특이적인 인자로서, 이는 꽃밥의 화분 모세포 및 배주의 대포자 모세포 등의 감수분열 모세포에 존재하는 고도로 보존된 RecA 타입의 재조합효소 패밀리 (DNA 의존형 ATP-ase)에 속한다 (Doutriaux MP et al, 1998, Mol Gen Genet 257: 283-291). DMC1은 상동체간 재조합 (inter-homolog recombination) 및 2가 염색체 형성 (bivalent formation)에 중요한 것으로 입증되었으며, 따라서, 적절한 꽃밥 및 배주 발생에도 중요하다. 기능성 DMC1 유전자 산물의 결핍은 교차점이 형성되지 않는 감수분열(achiasmatic meiosis)을 유도하여, 염색체 수가 비정상적인 특이한 화분립이 형성된다. 포자의 염색체 수는 2번째 감수분열 단계에서 이루어지는 딸 염색분체들의 질서 정연한 감수분열 분리에 따라 결정된다.
식물을 온실 환경에서 토양에서 키웠으며 (16시간 명주기, 낮 온도 25℃, 밤 온도 20℃), DMC1 침묵 표현형을 확실하게 표시하는 형질전환주 3주를 이후 실험을 위해 선별하였다. 이러한 침묵 표현형은 내인성 DMC1 mRNA의 낮은 수준, 감수분열 후 불균형한 소포자 사분자 발생, 적어도 부분적인 웅성 불임 및 변칙적인 형태(이수체)의 화분 발생을 지속적으로 포함하며, 이는 웅성 감수분열 모세포에 DMC1 전사체를 타겟팅하는 siRNA 분자가 존재함으로써 발생하는 감수분열의 기능장애를 의미한다.
야생형 식물 유래 접순을, 선별한 형질전환 주로부터 유래된 3주령 - 4주령의 (첫번째 잎의 길이가 약 10 cm인) 식물에 접목하였다. 식물 한 종의 하위 부 (형질전환 대목)가 다른 식물의 상위 부 (야생형 접순)를 지탱하는 방식으로, 2가지 식물을 결합시킨다. 접목 절개부는 면도날을 이용하여 통상 3번째 잎과 4번째 잎 사이에 45°로 만들었다. 이동하는 동안에는 접목 정션을 정렬하는 동안 접순 줄기를 잠시 물에 담구었다. 접목 정션부에서 약간의 증발을 돕기 위해 파라필름과 감싼 줄기 사이에 스페이스 홀더로서 이쑤시개를 사용하였다.
접목한 후, 접순의 정단부 쪽으로 체관부-매개 분자가 전달되도록, 대목에서 자라는 2번째 가지와 접목의 새잎들을 잘라내었다. 성공적인 접목은, 즉, 대목과 접순 간의 맥관 연결 형성을 유도하며, 체관부에 의한 수송은 종실 조직 (예, 분역 조직 및 새잎) 쪽으로 향해진다. 접순의 정단부가 식물에서 지상에 유일하게 남아있는 종실 조직이 되게 함으로써, 체관부에 의한 수송을, 꽃이 형성될 정단부 쪽으로 효과적으로 향하게 할 수 있다. 접목 대조군, 즉, 야생형 대목에 야생형 접순을 접목시킨 것과, 형질전환 또는 야생형 대목에 형질전환 접순을 접목시킨 것을 실험에 포함시켰다.
접목한 지 약 3주 후 접순의 추대가 이루어졌다. 꽃밥에 대한 예비 실험에서, 접순 또는 대목을 형질전환 주로 사용한 모든 접목들에서는 화분 생성에 결함이 확인되었다 (도 1B). 이 표현형은 DMC1의 침묵 표현형과 일치한다. 전자의 경우, 전체 접순이 형질전환주이고, 따라서, 감수분열 모세포 안에서 DMC1에 대한 siRNA 분자가 만들어졌기 때문이므로, 이러한 현상은 놀랍운 것은 아니었다. 그러나, 후자의 경우, 본 발명에서 교시한 바와 같이, DMC1에 대한 RNAi 헤어핀 구조체에 의해 만들어진 siRNA 분자들이 형질전환 대목으로부터 이동하여, 체관액과 함께 접순으로 체계적으로 수송되어, 접순 꽃봉오리의 포자형성 조직 안에 발생된 웅성 감소분열 모세포로 전달되었음을 암시하는 것이다.
접순 자체가 형질전환주인 접목 대조군의 경우, 이러한 웅성 불임은 모든 꽃에서 관찰되었지만, 접순이 야생형인 접목의 경우 (형질전환 대목에 접목됨) 그 효과는 첫번째 꽃으로만 한정되었다. 첫번째 꽃은 거의 불임이었지만, 후기 꽃들은 완전한 가임성이었다. 체관부-매개 siRNA 신호는 따라서 처음에 형성된 꽃에 선호적으로 유입되고, 첫번째 종실 조직은 체관액이 접순의 정단 쪽으로 향하는 중에 만나게 된다. 웅성 불임 표현형은 또한 2번째 가지에 생긴 첫번째 꽃에서도 관찰되었다.
형질전환 대목에 야생형 접순을 접목한 접목부에서 첫번째 꽃에 대한 보다 충분한 검사를 수행하였으며, 야생형 화분으로부터 입수한 크기 분포 및 형광 방출 간의 높은 재현성 상관성을 기초로, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)로 분석한 결과, 화분의 크기가 야생형 꽃의 화분에 비해 훨씬 높은 다양성을 가진다 (불규칙적인 분포)는 것을 확인하였다 (도 1B).
이러한 관찰 결과는 주사 전자 현미경 관찰로 검증하였으며, DMC1 siRNA를 생산하는 형질전환 대목에 의해 지지되는 야생형 접순의 첫번째 꽃에서 만들어진 화분이 기형이었고, 더 작았다. 후기 꽃들은 화분이 정상이었다 (도 2).
표 1 접목 후 관찰된 DMC1 siRNA 표현형 통계
대목/접순 DMC1 표현형/테스트한 접목 a
야생형 / 야생형 0/13 (0%)
야생형 / DMC1 siRNA 15/15 (100%)
DMC1 siRNA / 야생형 6/13 (46%)
야생형 / YFP-ΔN DMC1 0/8 (0%)
YFP-ΔN DMC1 / DMC1 siRNA 5/5 (100%)
DMC1 siRNA / YFP-ΔN DMC1 3/5 (60%) b
a 불임, 비정상적인 화분 형성, 불균일한 사분자 출현, FACS, 감수분열 모세포의 조직 검경, qPCR 및 DMC1-특이 siRNA 분자의 존재로 평가함.
b 접순의 잎과 첫번째 봉오리에서 YFP-ΔN DMC1 형광의 부재에 의해 입증함.
이 표현형을 추가로 규명하기 위해, 화분 발생의 초기 단계를 조사하였다. 접목 대조군 (야생형 대목에 야생형 접순이 접목된 군)에서, 소포자 사분자는 모두 정상 외양을 나타내었고 균형잡힌 모습이었다 (n=100). 하지만, 형질전환 대목에 야생형 접순을 접목한 군에서는, 사분자의 총 수가 첫번째 꽃 (초기)에서는 적었으며, 이들 사분자의 상당수 (최대 10%, n>100)가, 사분자 세포(tetradic cell) 하나에서 소형 핵의 출현으로 확인되는 바와 같이, 불균일하였다 (도 2). 불균일한 사분자 형성은 감수분열 중 DMC1 활성 소실과 관련된 전형적인 표현형들 중 하나이다.
또한, DMC1은 암 생식기관에서 활성을 나타내지만, 형질전환 대목에 야생형 접순을 접목한 경우, 암 생식기관에서 DMC1 침묵이 이루어진 증거는 명확하지 않았다. 야생형 화분으로 수분시켰을 때, 이 접목부에서 정상적인 갯수의 생육가능한 종자들이 형성되었는데, 이는 정상적인 암 가임성을 의미한다.
RNAi 신호의 체계적인 수송을 통한 웅성 감수분열 모세포에서의 DMC1 침묵화를 추가로 조사하기 위해, 다른 세트로서 형질전환 담배 식물을 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 구축하였다. 이 식물은, 처음 276 bp (즉, N-말단에서 아미노산 92개가 결손됨)가 없는 아라비돕시스 탈리아나의 무기능성의 절단형 DMC1 cDNA를 포함하며, 가시적인 리포터로서 사용되는 노란 형광 단백질 (YFP)가 융합되어 있으며, 콜리플라워 모자이크 35S 프로모터 (CaMV 35S)에 의해 구동되는, 35S::YFP:DN-DMC1 형질전환용 리포터 구조체를 가진다.
이들 형질전환 식물의 가지 - 융합 단백질의 과다 발현으로 인해 전체에 나타나는 형광 신호가 정상적으로 확인됨 - 를, DMC1 침묵화 구조체를 보유한 형질전환 대목 위에 접목시켰다. 접순에서 발아된 꽃봉오리를 조사하였는데, 첫번째 (초기) 꽃봉오리에서 YFP 형광 신호가 심피와 암술머리에서 강하게 확인되었지만, 꽃밥 안에서는 관찰되지 않았다. 이는, 첫번째 꽃봉오리에서 체계적인 침묵 신호가 꽃밥으로 바람직하게 전달되었다는 것을 입증해준다 (도 3).
따라서, 본 실시예는, 감수분열 모세포 또는 이로부터 만들어지는 수 배우체를 형질전환하지 않고도, 담배의 웅성 감수분열 모세포에서 염색체 재조합을 효과적으로 억제시키는 방법을 교시해준다. 본 발명은, 바람직한 구현예로, 즉, 비-형질전환 후대를 이용하여 후향 육종 (Reverse Breeding)을 적용할 수 있다. 이러한 개념은 실시예 3에서 추가로 예시된다.
본 실시예에서, DMC1 유전자를 타겟으로 하였지만, 감수분열에서 염색체 재조합 임의 단계에 기능적으로 참여하는 임의의 다른 유전자를 타겟팅할 수 있으며, 비슷한 결과를 수득할 수 있다.
실시예 3
체계적인 침묵 신호에 의해 매개되는, 비-형질전환성 후향 육종
실시예 2에 개략적으로 나타낸 실험 방법을 브라시카 올레라케아 (Brassica oleracea)에 적용하여, SDS (SOLO DANCERS) 유전자에 대한 이소적으로 발현되는 헤어핀 RNAi 침묵화 구조체를 가진 형질전환 대목을 구축하였다. 이들 형질전환한 대목 위에, 종간 F1 하이브리드 (Raphanus sativus x Brassica oleracea)로부터 유래된 야행성 하이브리드 접순을 접목시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 접순의 잎들을 모두 제거하여 침묵화 신호가 웅성 감수분열 모세포로 향하게 하였다. 접순에 생긴 첫번째 꽃봉오리에는 비정상적인 소포자 사분자들이 상당 비율로 존재하였으며, 이들 꽃은 거의 수 불임이었다.
접순에 생긴 첫번째 꽃봉오리들이 약 3 mm 크기가 되었을 때, 그 안에서 발생 중인 소포자는 시험관내 소포자 재생 (동정생식)을 위한 최적의 단계에 도달되었다. 소포자들을 꽃봉오리에서 취하고, 반수체 포자의 포자체 발생을 유도하기 위한 최적 조건인 32℃에서 2일간 스트레스 처리하였다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법 (Swanson EB et al., Plant Cell Rep 6: 94-97; Takahata Y and Keller WA, Plant Sci 74: 235-242)을 이용하여 균형을 이룬 (정배수체) 소포자를 반수체 소 식물체로 재생시켰으며, 게놈 배가를 위해 이후 콜히친 처리를 사용하여, 염색체의 완전한 상보체 (full complement of chromosome)를 가진 염색체 반수체 또는 배가 반수체 (DH) 소 식물체로 유도하였다.
웅성 감수분열 모세포에서 DMC1 침묵화에 의해 염색체의 재조합이 억제되되므로, 이런 방법으로 수득한 DH 식물의 염색체들은 재조합되지 않았으며, 접목용 접순으로서 사용된 하이브리드 식물의 부모 식물주의 염색체와 동일한 유전자 구성을 가지고 있었다. 이는, 접목에서 접순으로서 사용된 F1 하이브리드의 부모 식물인, 하이라파누스 사티부스 (Raphanus sativus)와 브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea) 간에 다형인 분자 마커 (염색체 당 2개, 즉 염색체 팔 1개당 하나)로 검증하였다.
동일한 분자 마커 세트를 이용하여, 접순의 꽃밥으로부터 채집한 소포자로 재생한 DP 식물들을 스크리닝하여, 유전적으로 상보적인, 즉, F1으로 조합하였을 때 접목의 접순으로 사용된 하이브리드에 존재하는 정확한 염색체 세트에 상응하는 부모 식물의 염색체 세트를 포함하고 있는, 개체들을 동정하였다. 이들 상보적인 개체들을 교배한 결과, 하이브리드 유전자형이 정확하게 재현되었다 (Raphanus sativus x Brassica oleracea).
즉, 본 실시예는, 본 발명을 사용하여 하이브리드 유전자형을 정확하게 재현할 수 있는 방법을 예시해준다. 중요한 점은, 이는, DH가 형성되기 전에 염색체의 재조합 억제가 일시적인 siRNA 신호를 통해 웅성 감수분열 모세포에서 달성되기 때문에, 재현된 하이브리드 식물에 형질전환을 수행하지 않고도 달성된다는 것이다.
전술한 실시예들에 개략적으로 기술된 방법은 또한 다른 식물 종들에도 적용가능하다. 또한, 나무 (예, 포풀러 및 과실 나무, 예, 사과, 배, 체리, 복숭아, 플럼, 바나나, 시트러스 열매, 파파야, 무화과 등) 및 그레이프 바인 등의, 생명 주기가 긴 농작물에 이를 적용하는 것이 특히 유용하다. 본 발명은 이러한 농작물의 종자-번식 특이적인 형질에 적용할 수 있으며, 전이유전자를 함유하지 않은 엘리트 식물주들을 훨씬 빨리 생산할 수 있으며, 수년간 걸리는 전통적인 육종 실험을 피할 수 있다.

Claims (15)

  1. 식물의 웅성 감수분열 모세포 (male meiocytes)에서 세포내 프로세스를 간섭하는 방법으로서,
    형질전환된 핵산 서열을 보유한 대목 (rootstock)을 포함하는 제1 식물을, 상기 제1 식물의 대목 위에 접목되는 제2 식물 유래 접순 (scion)과 접목시키는 단계를 포함하며,
    상기 형질전환된 핵산 서열이 상기 제1 식물의 대목에서 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키고,
    상기 폴리뉴클레오티드 분자가 접목 정션을 통과하여 체계적으로 (systematically) 수송되어, 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포로 도입되며,
    상기 체계적으로 수송된 폴리뉴클레오티드 분자가, 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포에서 발현되는 전사체와 적어도 부분적으로 상보적인 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 식물에서 상기 형질전환된 핵산 서열의 발현이, 상기 핵산 서열을 프로모터 서열에 작동가능하게 연결함으로써 달성되며,
    상기 프로모터 서열은 전부위 발현 프로파일 (ubiquitous expression profile), 조직 특이적인 발현 프로파일 또는 세포 특이적인 발현 프로파일을 상기 형질전환된 핵산 서열에 부여하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 뿌리를 포함한 발현 프로파일을 상기 형질전환된 핵산 서열에 부여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 웅성 감수분열 모세포에서 세포내 프로세스의 간섭이 웅성 감수분열 모세포에서 세포내 프로세스의 억제 또는 차단인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 웅성 감수분열 모세포에서 세포내 프로세스의 억제 또는 차단이, 타겟 유전자의 mRNA나 전사체와 적어도 부분적으로 상보적이며 상기 형질전환된 핵산 서열로부터 생성된, 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 이용하여, 상기 타겟 유전자의 mRNA를 불안정하게 함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 miRNA, 안티센스 RNA, RNAi 분자, siRNA 분자, 바이러스-유도성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공동-억제자 분자 또는 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 식물의 웅성 감수분열 모세포에서 세포내 프로세스에 대한 영향이 식물의 웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스 강화인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 제1 식물에서 일시적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 식물에서의 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 일시적인 발현이, 열-유도성 프로모터, 화합물-유도성 프로모터, 스테로이드-유도성 프로모터 및 알코올-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 유도성 프로모터를 사용함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 일시적인 발현이, 상기 대목 세포의 게놈에 병합되지 않는, 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 코딩하는 구조체 (construct)로부터의 발현에 의해 구현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 구조체가 상기 대목의 잎에 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 침투시킴으로써 상기 대목 세포로 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 염색체 재조합에 참여하는 유전자의 전사체와 적어도 부분적으로 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자가 SPO11, MER1, MER2, MRE2, MEI4, REC102, REC104, REC114, MEK1/MRE4, RED1, HOP1, RAD50, MRE11, XRS2, PRD1, PRD2, PRD3, PHS1, NBS1, COM1, RHD54/TID1, DMC1, SAE3, RED1, HOP1, HOP2, MND1, REC8, MEI5, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RPA1, SMC3, SCC1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, SOLODANCERS, HIM6, CHK2, SGS1, MSH4, MSH5, MER3/RCK, ZIP1, ZIP2, ZIP3, ZIP4, PTD, SHOC1, ZYP1, MLH1, MLH3, 또는 이들의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 식물의 웅성 감수분열 모세포의 게놈 서열을 특이적으로 변형시키는 방법으로서,
    형질전환된 핵산 서열을 보유한 대목을 포함하는 제1 식물을, 상기 제1 식물의 대목 위에 접목되는 제2 식물 유래 접순 (scion)과 접목시키는 단계를 포함하며,
    상기 형질전환된 핵산 서열이 상기 제1 식물의 대목에서 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키고,
    상기 폴리뉴클레오티드 분자가 접목 정션을 통과하여 체계적으로 수송되어, 상기 제2 식물의 접순에 의해 발생된 웅성 감수분열 모세포에 도입되며,
    상기 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 제2 식물의 게놈에 포함된 DNA 분자와 적어도 부분적으로 상보적인 것을 특징으로 하는, 방법.
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