KR20140066254A - 콰르텟 육종 - Google Patents

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KR20140066254A
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던 코르넬리스 마리아 페트뤼스 반
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리즈크 즈완 자드틸트 엔 자드한델 비.브이.
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Abstract

본 발명은, 사분자 또는 이분자 형태를 가진 제한된 수의 부계 생식 세포를 꽃의 암술 머리에 배치하여 모계 난세포와 수정시켜, 복수개의 접합체를 수득하는 단계; 및 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실을 유도하여, 상기 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하는 단계를 포함하는, 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 부계의 식물은 감수분열 중에 염색체 재조합의 억제 또는 제2 감수분열 퇴행 (SDR)을 나타낸다.

Description

콰르텟 육종 {QUARTET BREEDING}
본 발명은 기원이 되는 웅성 생식 세포 (male gamate)와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 그 종자로부터 자라난 자란 식물을 교배하였을 때 본질적으로 동일한 하이브리드 (hybrid)를 형성하는, 유전적으로 상보적인 종자 쌍들로 구성되고, 모계 염색체가 없는 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유전적 구성이 이의 웅성 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 생산하기 위한, 부모 식물 세트를 제공하는 방법에 관한 것이다.
식물 육종은 식품, 사료 및 섬유를 충분한 질과 양으로 수득하기 위해 인간에게 유용한 식물 종들을 재배하는 것이다. 식물 육종은 인류의 매우 오래된 직업으로서, 20세기에는 실무 지식에 과학적 기초가 도입되었다. 식물 육종은 본래 지역적인 선택지에서 우월한 식물을 선별하여 번식시키는 것을 기본으로 한다. 유전자 법칙의 재발견과 통계학적 도구의 개발로, 식물 육종은 유전학 지식을 토대로 하게 되었으며, 기술적으로는 배가 반수체 (DH: doubled haploid) - 예를 들어, Haploids in Crop Improvement II eds; Palmer C, Keller W, and Kasha K (2005) in: Biotechnology in Agriculture and Forestry 56 Eds; Nagata T, Lorz H, and Widholm J. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, ISBN 3-500-22224-3을 참조함 - 및 분자 마커 - 예를 들어, De Vienne ed. (2003) Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology. Science publishers Inc. Enfield, NH USA. ISBN 1-57808-239-0을 참조함 - 와 같은 방법으로부터 지원을 받게 되었다.
식물 육종은 경제적인 방식으로 개발할 수 있도록 특정 환경에 알맞게 구축된 유전적 컨셉을 전달한다. 이러한 식물 육종의 과제는 식물 종들의 생식질에 존재하는 유전자 변이를 효율적으로 활용함으로써 달성된다. 유전적 컨셉은 특정 환경에서 바람직한 표현형을 유도하는 유전자들의 조합을 포함한다. 이는, 식물을 키우고 생산물을 수확하는데 필요한 비용을 가능한 최소화하면서, 수확하는 식물의 부분을 수확량과 품질 측면에서 극대화하는 것을 의미한다. 식물 육종을 상업적인 수준에서 적용했을 때, 종자 생산도 중요한 문제이다. 종자 생산은 유전적 구성이 보존되는 유성 생식에 의한 식물 증식을 목적으로 한다.
아울러, 시판 종자는 효과적인 발아를 가능하게 하기 위한 충분한 품질을 갖추어야 한다. 그러나, 유성 생식은 기본적으로 새로운 조합의 대립유전자를 가진 자손을 만들기 위해 존재하는 것이기 때문에, 유성 생식을 통해 유전적 구성을 보존하는 것과는 모순된다. 유성 생식이 이루어지는 동안에 작동하는 유전자 기전들은 변화하는 환경에서 종들의 생존 기회를 높이기 위해 유전자 변이를 증가시키도록 진화되어 왔다. 이러한 측면에서 감수분열 재조합, 독립적인 염색체 재배열 (chromosome assortment) 및 교배 방식이 주된 기여 인자이다. 유성 생식을 통한 자손의 균일성은, 따라서, 부모 식물들이 완전히 동형 접합체인 경우에만 달성될 수 있다. 이러한 식물의 생식 세포들을 조합하면, 각 자손에서 부모의 유전적 구성이 정확하게 재현될 것이다.
대부분의 농작물에 있어서, 시판 종자들은 2종의 동형 접합체인 부모 식물의 교배를 통해 만들어진다. 이런 방식에 따르면, F1 하이브리드가 몇몇 유전자 좌에 대해 이형 접합성이 되고, 이는 하이브리드 강세 (hybrid vigour) 및 균등성 (uniformity)을 초래할 수 있다. 육종가가 현재의 F1 하이브리드 품종 (hybrid variety) 또는 근친 교배 품종 (inbred variety)을 개선시키고자 한다면, 전통적으로는 이러한 목표를 달성하기 위해 교배하여 여러 번의 실험적인 선별을 진행하여야 할 것이다.
식물 생육 및 개발과 관련된 유전자 기능에 대한 지식은 여전히 제한적이기 때문에, 육종가는 여전히 주로 표현형 선별에 의존하고 있다. 근친 교배하는 동안에, 특히 초기 세대들에서는, 다수의 유전자들이 이형 접합성 상태이기 때문에, 개개 일부계 식물들에 지정되는 표현형 값을 담당하는 유전자에 대한 대립유전자 변이체는 쉽게 없어질 수 있다. 그 이유는, 유성 생식 중에, 근친 교배성 이형 접합성과 특이적인 유전자 상호작용이 소실되기 때문이다. 따라서, 식물 육종에서, 이러한 기전들은, 특히 높은 작물학적, 원예적 또는 관상학적 가치를 가진 유전적으로 이형 접합체인 식물을 동정하는 경우에는, 비생산적으로 작용할 수 있다. 유성 생식으로 바람직한 대립 유전자가 분리 (segregation)되는 결과가 발생할 것이다.
이에, 작물학적, 원예학적 또는 관상학적 가치가 높은 식물을 유성 생식하는 동안에도 유전적 구성을 효과적으로 보존하는 기법이 강력하게 요구되고 있다.
유전적 구성을 유지하면서 식물을 영속시키는 한가지 가능한 방법은 영양 번식에 의한 것이다. 이는, 번식이 유사분열을 통해서만 이루어지기 때문에, 유전적 구성을 완전하게 보존시킬 수 있다. 식물은 신속하게 서식지를 점유할 수 있도록 진화된 자연적인 영양 번식 기전을 가지고 있다. 예를 들어, 영양 번식은 덩이줄기, 구근 또는 뿌리줄기 형성을 통해 이루어질 수 있다. 다른 방법은 삽수 (cutting)를 만드는 데 시험관내 또는 생체내 배양 기법을 이용하는 것이다. 영양 번식 기법의 상업적인 문제점은, 종자를 이용한 번식에 비해, 노동 집약적이고 따라서 비용이 많이 든다는 것이다. 아울러, 장기간 식물을 저장하기 어려워, 실행적인 측면에 문제가 되며, 바이러스와 같은 병원체에 의해 식물 물질이 감염될 위험성이 종자로 번식하는 식물 물질 보다 현저하게 높다.
다른 예로, 영양 번식은 무성 종자를 형성함으로써 달성될 수 있는데, 이를 일반적으로 무수정 생식 (apomixis)이라고 한다. 이 현상은 다수의 종들에서 자연적으로 이루어지는데, 유전자 조작을 통해 유성 번식하는 식물 종에도 유도할 수 있다. 이론적으로, 이는 무수정 생식의 3가지 다른 단계, 즉 비감수분열 (apomeiosis), 단위 생식 (parthenogenesis) 및 자율적인 내배유 발생 (autonomous endosperm development)을 천연적으로 유도하는 특정 유전자들을 이용함으로써 달성할 수 있다. 그러나, 실제, 이러한 여러 단계들을 담당하는 유전자는 아직까지 동정되지 않았으며, 이들의 상호작용이 매우 복잡할 수 있다.
한편, 무수정 생식을 구성하는 인자를 인공적으로 조작하는 것은 실현가능성이 높을 수 있다. 예를 들어, 감수분열의 여러 단계들을 변형하므로써, 감수분열이 본질적으로 유사분열로 변환될 수 있다는 것이 확인되었다. 이른바 "MiMe 방식"은 이중 가닥 브레이크 형성을 억제하고 (spo11-1), 제1 감수분열 중에 자매 염색분체의 분리를 유도하고 (rec8), 제2 감수분열을 건너뛰는 (osd1), 돌연변이들의 조합을 이용한다. 이 방법은 단위 생식 및 자율적인 내배유 발생과 조합하여, 궁극적으로 조작된 무수정 생식이 달성될 수 있다 (d'Erfurth et al: Turning meiosis into mitosis; PLoS Biology 2009; WO/2010/079432). 식물 육종에 있어 무수정 생식의 잠재성은 오랜동안 널리 알려져 있지만, 컨셉의 증거는 아직 없는 실정이다.
또 다른 방법으로서, 후향 육종 기법이 사용될 수 있다 (WO03/017753). 후향 육종은 유전자 조작 또는 화학적 간섭을 통한 감수분열의 재조합 억제와, 재조합되지 않은 부모 염색체를 가진 포자로부터 유래된 배가 반수체 식물 (DH)의 후속적인 생산을 기초로 한다. 이들 DH는 감수분열 중에 발생하는 독립적인 부모 염색체의 재배열 결과로서 오직 이들의 유전적 구성만 다르다. 따라서, 오리지날 출발 식물의 유전적 구성을 재현하기 위해 교배를 통해 조합되어야 하는 것이 어떤 DH 또는 이로부터 유래된 계통인지를 결정하기 위해서는, 염색체에 대해 하나의 공-우성의 (co-dominant), 다형성 마커를 사용하는 것으로도 충분하다. 이와 같이, 후향 육종 기법을 사용하면, 이의 유전적 구성을 모르더라도, 종자를 통해 임의의 생식력을 갖춘 선택 식물을 유전적으로 보존할 수 있다.
이 기법의 문제점은, 감수분열 재조합의 완전한 억제로 키아스마타 (chiasmata)가 형성되지 않는다는 것이다. 이는, 제1 감수분열 중에 부적절한 염색체 분리를 유도하여, 생식 세포의 이수성을 야기할 수 있으며, 따라서 생식 세포의 생존성과 성능이 저하될 수 있다. 제1 감수분열 중에 키아스마타가 형성되지 않을 경우, 각 염색체가 한쪽 극으로 이동할 확률은 서로 독립적으로 50%이다. 이는, 전체 염색체 조성을 가진 포자가 만들어질 이론적인 확률이 (½)n이라는 것을 의미하는데, 이때 n은 반수체 염색체의 갯수이다. 따라서, 균등 생식 세포 (balanced gamete)의 발생률은 반수체 염색체의 수 증가에 따라 감소된다. 다수의 농작물 종들은 상대적으로 염색체 수가 적음에도 불구하고 (예, 오이의 경우 반수체 게놈 당 염색체 수가 7개이며, 시금치는 6개에 불과함), 상대적으로 염색체의 수가 많은 경제적으로 중요한 종들이 있다. 좋은 예는 경제적으로 가장 중요한 채소 작물 중 하나인 토마토인데, 반수체 게놈 당 염색체의 수가 12개이다. 이런 기술적인 제약은 후향 육종 기법의 효율을 현저하게 떨어뜨린다.
또 다른 접근법으로서, 비환원 포자 (unreduced spore)로부터 재생된 식물을 이용할 수 있다. 이 기법은 근접 후향 육종으로 칭해진다 (WO2006/094773). 비환원 포자는 우선적으로 제2 감수분열이 생략된 결과로서 형성된다. 이러한 자연적인 현상은 제2 감수분열 퇴행 (SDR: Second Division Restitution)이라고 하며, 이는 정기적인 감수분열 발생이 수반되는 유성 생식 과정 중에 식물에서 발생할 수 있다.
근접 후향 육종 기법은 천연 또는 조작된 SDR을 통해 생산된 비환원 포자로부터 식물을 재생함으로써 SDR 현상을 이용한다. 돌연변이되었을 때, SDR을 야기하는, OSD1 및 TAM1과 같은 유전자들이 발굴되고 있다. 제조되는 식물 (SDR-0 식물로 지칭됨)은 대부분 동형 접합체이며, 이 식물은 이후 전통적인 DH 생산에 이용될 수 있다. 출발 식물의 부와 모의 게놈 간의 다형성이 존재하는 분자 마커를 이용하여, 게놈 조성 측면에서 매우 상보적인 SDR-0 식물 (및 이로부터 유래된 DH)들을 동정할 수 있다.
이들 식물을 교배하면 오리지날 출발 식물의 유전적 구성이 거의-완벽하게 구현될 것이다. 그러나, SDR-0 현상이 발생하는 동안과 이로부터 유래된 DH가 형성되는 동안에 이루어지는 감수분열 재조합으로 인해, 상보성은 완전해지지 않게 될 것이다. 재구축된 하이브리드들은 서로, 그리고 오리지날 하이브리드 식물과는 어느 정도 유전적으로 다를 것이다. 하지만, 이러한 차이는 DH가 규칙적인 감소분열 현상으로부터 직접 유래되는 경우에 비해 현저하게 줄어들 것이다. 더욱이, 이들 DH는 유전적으로 고정되며, 이는 추가적인 선별의 여지가 없다는 것을 의미한다.
이러한 프로세스에 SDR 현상을 통합하는 경우의 이점은 유전적인 상보성 선별이 2 단계 공정으로 이루어진다는 것이다. 제1 단계는 염색체의 근위 영역, 즉 센트로미어를 비롯한 근위 영역에 집중된다. 제2 단계는 염색체의 원위 말단, 즉, 재조합으로 인해 교환되는 영역에 대한 것이다. 이러한 지연성 유전자 고정은 복잡성을 감소시키며, 특히 분자 마커가 선별에 이용가능한 경우에 대체적으로 상보적인 유전자형을 발굴할 확률을 높여준다.
이런 방식의 다른 이점은 유성 생식 동안에 SDR이 자연적으로 발생할 수 있으며, 유성 생식 프로세스를 추가적으로 개입시키지 않으면서도 그 자체로 이용할 수 있다는 것이다. SDR 현상의 정상적인 발생율을 더욱 높이는 방법, 예를 들어, N2O를 이용한 스트레스 처리를 통한 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (이전에 백합 (Barba-Gonzalez et al (2006), Euphytica 148: 303-309) 및 튤립 (Okazaki et al. (2005), Euphytica 143: 101-114))에서 개시된 바와 같음).
본 발명의 과제는 작물학적, 원예학적 또는 관상학적 특성이 우수한 이형 접합성 식물 (heterozygous plant)의 유전적 구성을 보존하기 위한, 전술한 방법의 효율을 추가로 높이는 것이다.
본 발명은, 특정한 돌연변이가 화분이 형성되는 동안에 소포자의 분리에 결함을 유도할 수 있다는 관찰 결과를 이용한 것이다. 이로써, 발생되는 동안 내내 물리적으로 부착되어 유지되는 4개의 화분립 클러스터가 형성된다. 클러스터에서 각 화분립들은 성숙기에 사분자로 함께 유지되지만, 이들은 번식력을 가지며, 각각 수정할 수 있고, 수분되면 종자를 생성할 수 있다. 이른바 이러한 콰르텟 표현형에 대한 생물학적 설명은, 화분 발생의 초기 단계에 정상적으로는 소포자들에만 존재하는, 펙틴 층의 분해가 이루어지지 않는다는 것이다.
이에, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 사분자 (tetrad) 또는 이분자 (dyad) 형태를 가지는 제한된 수의 부계 생식 세포를 꽃의 암술 머리에 배치하여 모계 난세포와 수정시켜, 복수개의 접합체 (zygote)를 수득하는 단계;
b) 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실을 유도하여, 상기 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하는 단계.
"유전적으로 동일한"은 종자 하나의 염색체 전부가 대응되는 생식 세포의 염색체와 동일하며, 종자에서의 염색체의 조합이 대응되는 생식 세포에서와 동일하다는 것을 의미한다.
본 발명의 토대가 된 연구에서, 아울러, 종래에 이용가능한 방법을, 화분이 형성되는 동안에 소포자의 분리에 결함을 유도하는 전술한 특정한 돌연변이와 조합하면, 본질적으로 상보적인 유전적 구성을 가진 부모 식물을 동정할 수 있으며, 교배 후 부의 조부와 본질적으로 유전적 구성이 동일한 이형 접합성 식물이 형성된다는 점에 매우 효율이 높아진다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 본 발명과 조합될 수 있는 이런 방법으로는 예를 들어 후향 육종 및 근접 후향 육종이 있다.
콰르텟 표현형은, 예를 들어, Copenhaver et al (2000) Plant Physiology 124, 7-15에서 기술되었다. 여러가지 비-상동적인 유전자들에서의 돌연변이도 비슷한 콰르텟 표현형을 발현시킬 수 있다 (예, 아라비돕시스 탈리아나의 qrt1, qrt2 및 qrt3). QRT3 유전자 (아라비돕시스의 경우: At4g20050)는 분자적으로 특정화되었으며, 이 유전자는 폴리갈락투로나제에서 분기한 클래스에 속하는 멤버를 코딩한다 (Rhee et al. (2003) Plant Physiology 133: 1170-1180). 이들 돌연변이는 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 사분자를 제공하는데 유용하다.
4개의 화분립 클러스터에서 각각의 화분립들은 1번의 감수분열 산물을 함유하고 있다. 개개 화분 콰르텟을 이용하여 식물을 수정하면, 이상적으로는 수정율이 100%일 경우 4개의 종자가 만들어진다. 사분자를 구성하는 4개의 개개 화분립들이 단일 감수분열 (single meiosis)의 산물이라 점은, 본 발명의 대상 기법에 대한 흥미로운 함의성을 가진다.
감수분열이 시작되면, 첫번째 과정은 게놈 DNA의 복제이다. 이후, 전기에서는 상동적인 염색체가 정렬 및 분절되어 (synap), 2가를 형성한다. 이 단계에서는, 이중 가닥 브레이크 (DSB)가 만들어지며, 이는 정렬된 비-자매 염색분체 (non-sister chromatid)를 이용하여 복구된다. 복구되는 동안에 염색체의 상호작용으로 해리된 (resolved) 이중 홀리데이 정션 (double holiday junction)이라고 하는 특이적인 구조가 형성된다. 이는 유전자 전환 (gene conversion) 또는 교차 (crossing over) 중 어느 한가지를 유도한다. 교차 (CO) 현상은 궁극적으로 키아스마타 형태로 볼 수 있는데, 제1 감수분열 중에 적절한 상동적인 분리를 위해 구조적으로 필요한 것이다. 본 발명에서는, CO의 분포와는 상관없이, 제1 감수분열의 산물들이 이들의 대립유전자 조성 측면에서 항상 서로 완전하게 상보적이라는 것에 주목하여야 한다. 제2 감수분열에서는, 자매 염색 분체들이 반대 극 쪽으로 분리되어, 최종 감수분열 산물, 즉, 4개의 반수체 세포들이 만들어진다. 정상적으로는 이들 4개의 감수분열 결과물들은 추가적인 발생이 이루어지는 동안에 서로 탈착되며, 동일 꽃밥 안에서 다른 감수분열로부터 유래된 화분립과 어울어지게 될 것이다. 하지만, 모계 식물이 콰르텟 표현형을 나타낸다면, 단일 감수분열을 통과한 4개의 산물들은 물리적으로 함께 잔류하게 될 것이다.
사분자 형태의 4개의 화분립 세트는 가변적인 수준의 유전자 상보성을 가질 수 있으며, 이는 반수체 염색체의 수와 함수 관계이다. 제1 감수분열의 산물들은 서로 완전히 상보적이기 때문에, 사분자로 함께 유지되는 4개의 화분립은 적어도 50%의 상보성을 가진다. 각 사분자에 대한 특정 결과는 우연적으로 결정되며, 이런 우연에는 소위 파스칼의 삼각형으로 주어지는 분포도에 따른다 (도 1).
예를 들어, 오이는 반수체 염색체가 7개이다. 제1 감수분열로 2개의 완전히 상보적인 감수분열 산물이 만들어진다. 제2 감수분열에서는, 제1 감수분열의 2개의 각 산물에서 염색체들이 무작위로 분리될 수 있으며, 이로써, 2n = 27 = 128개의 상이한 산물들이 만들어질 수 있다. 일반적으로, 염색체가 n개인 경우, 총 2n개의 여러가지 사분자들을 단일 감수분열로 수득할 수 있다. 완전히 상보적인 경우의 수는 항상 1이며, 즉, 각 줄에서 첫번째 수 (도 1)이며, 각 줄의 2번째 수는 반수체 염색체의 수이다. 동일 줄에서 그 다음의 수들은 사분자에서 각각 비-상보적인 염색체를 2, 3, 4, 5 및 6개 가지는 감수분열 산물의 예상되는 갯수이다.
예를 들어, 임의의 소정의 감수분열로부터 기원한 128개의 상이한 감수분열 산물을 가지는 오이의 경우, 이러한 경우의 수는 각각 21, 35, 35, 21 및 7이다. 제1 감수분열의 산물들은 서로 완전히 상보적이기 때문에, 어떤 염색체도 상보적이지 않은 극한의 상황은 사분자 내에는 존재하지 않는데, 이는 항상 다른 제1 감수분열 산물인 염색체에 대해 상보적일 것이기 때문이다. 비-상보적인 염색체가 하나 존재하는 경우의 수는 따라서 7 * 2이고, 비-상보적인 염색체가 2개 존재하는 경우의 수는 21 * 2로, 이와 같다. 예를 들어 염색체 3개가 비-상보적이라면, 이는 다른 4개는 상보적이라는 것을 의미한다. 화분 사분자를 구성하는 4개의 멤버들에서 소정의 상보성 수준을 구할 확률 (확률 %)은 도 2의 표에 나타나 있다. 오이의 화분 사분자에서 비-상보적인 염색체가 0, 1, 2 또는 3개인 (그래서, 상보적인 염색체의 수가 각각 7, 6, 5, 또는 4개임) 감수분열 산물을 수득할 확률은 따라서, 각각 1.6% (=(1+1)/128), 10.9% (=(7+7)/128), 32.8% (=(21+21)/128) 및 54.7% (=(35+35)/128)이다.
중요하게도, 문맥에서 "비-상보적인"은 실제 오직 이들 염색체의 텔로미어 말단을 지칭한다. 예를 들어, 비-상보적인 염색체가 3개이고, 재조합 후 이형 접합성이 40%에 불과한 상황인 경우라면, 염색체 7개중 4개는 완전히 상보적일 것이며 다른 염색체 3개는 상보성은 여전히 60%이다. 본질적으로, 사분자 무리 (tetrad constellation)는, 화분립이 염색체의 50%에 대해 쌍으로 적어도 전체적으로 항상 상보적이며, - 재조합의 결과로서 - 나머지 염색체들에 대해서는 여전히 부분적으로 상보적인, 상황을 형성해준다. 본 발명은 따라서, 본 발명을 수행하기 위해 화분 사분자를 제공해준 오리지날 하이브리드 식물과 비교하여 여전히 0 - 50%의 차이는 있지만, 하이브리드 식물의 유전자형을 거의 완전하게 재현 (near-complete reconstitution)한다.
본 방법은, 따라서, 하이브리드 식물의 동일한 또는 거의 동일한 유전적 구성을 재현가능하게 해준다. 거의 동일한 재현은 목적한 하이브리드 표현형에 대한 부가적인 유전적 변이 효과를 평가할 수 있어, 명확하게 유익하다. 이러한 부가적인 유전적 변이가 하이브리드 표현형에 대해 유용한 또는 불리한 효과를 가지는 것을 입증할 수 있어, 우수한 하이브리드 표현형의 추가적인 유전적 개선도 가능해질 것이다. 4개의 염색체의 상태를 도 3에 그래프로 나타낸다.
본 발명의 중요한 측면은 이의 하이브리드 후손으로부터 모계 게놈을 없애는 모 식물의 수분화를 위해 콰르텟 소포자를 이용하는 것이다. 이러한 식물의 예는 최근 Maruthachalam and Chan (Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination; Nature 464 (2010), 615-619; US patent application 20110083202; WO2011044132)에 의해 아라비돕시스에서 개시된 바 있지만, 이 예는 본 발명의 적용예를 결코 한정하는 것이 아니며, 본 발명은 다른 반수체 유도 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.
하이브리드 후손으로부터 모계 게놈의 소거는, 따라서, 변형 버전에 따라 내인성 센트로미어-특이적인 히스톤 단백질 CENH3의 형질전환 치환을 이용함으로써 달성할 수 있다. 실제, CENH3 단백질의 변형 버전은 기능성의 내인성 CENH3 유전자가 결핍된 식물에서 과다발현된다.
다른 예로, 또한 CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 폴리펩타이드도 대응되는 불활성화된 내인성 CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 유전자를 가지는 식물에서 과다발현시 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 적합하게는, 식물의 내인성 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 게놈 코딩 서열의 하나 또는 2개의 대립유전자들은 불활성화되거나 낫-아웃되며, 바람직하게는 모든 대립유전자들이 불활성화되거나 낫-아웃된다. 식물은, 야생형 식물과의 교배시, 예를 들어 적어도 0.1%로 반수체 자손을 생산한다.
바람직하게는, 폴리펩타이드는 재조합에 의해 변형된 CENH3 폴리펩타이드가다. 이 폴리펩타이드는, CENH3 히스톤-폴드 도메인을 포함하는 단백질에 연결된 5개 이상의 아미노산 (또는 다른 예로 10개 이상의 아미노산)으로 구성된 이종의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이 아미노산 서열은 CENH3 히스톤-폴드 도메인에 대해 이종적이다. 적합하게는, 상기 이종의 아미노산 서열은 CENH3 히스톤-폴드 도메인에 직접 연결되며, 폴리펩타이드는 CENH3 테일 도메인이 없다. 다른 예로, 이종의 아미노산 서열은 사이에 개재되는 단백질 서열을 통해 CENH3 히스톤-폴드 도메인에 연결될 수 있다. 이러한 사이에 개재되는 단백질 서열은 CENH3 테일 도메인 또는 비-CENH3 히스톤 H3 테일 도메인을 포함할 수 있다 (그리고, 그런 후 재조합 단백질은 CENH3 단백질의 테일-스왑 (swap) 버전에 해당됨).
적합하게는, 사이에 개재되는 단백질이 CENH3 히스톤 H3 테일 도메인을 포함하는 경우, CENH3 테일 도메인은 CENH3 히스톤-폴드 도메인에 이종적일 수 있다. 폴리펩타이드가 CENH3 히스톤-폴드 도메인과 끝이 절단된 (truncated) CENH3 테일 도메인을 포함하는 경우, 테일 도메인의 아미노 말단은 식물의 내인성 테일 도메인과 비교하여 잘려 짧아져 있다.
야생형 부계 식물 (father plant)의 화분을 형질전환에 의해 보완된 식물 (transgenically complemented plant)에 수분하면, F1 자손이 반수체이기 때문에, 불임 자손이 만들어진다. 실제, 각 F1 자손이 수정에 사용되며 이것이 기원한 화분립과 유전적으로 동일하다. 야생형 염색체와 변형된 염색체는 접합체에서 동원체 조립시 분명히 양립할 수 없다. 염색체의 자발적인 또는 유도된 배가는 DH 형성을 유도한다. CENH3는 식물에서 보존되며, 아마도 단일 카피 유전자이며, 이 시스템은 따라서 농작물 종들에게 적용할 수 있다. 종자 형성이 내배유 불균형으로 인해 문제가 된다면, 배 회생 (embryo rescue)을 수행할 수 있다.
다른 구현예에서, 모계 게놈은 다른 반수체 유도인자 시스템을 이용하거나 또는 종간 교배를 통해 F1 자손으로부터 없앨 수 있다 (예, Bains & Howard 1950, Nature 166: 795).
다른 구현예에서, 콰르텟 돌연변이도 후향 육종 기법과 조합하여 (WO03/017753; Dirks et al. 2009, Plant Biotech J 7: 837-845), 후향 육종의 효율을 크게 개선시킬 수 있다. 이러한 구현예에서, 콰르텟 표현형은 유전자, 이식 유전자 또는 화학적 수단에 의한 부계 식물에서의 감소분열 염색체의 재조합 억제와 조합된다. 콰르텟 돌연변이로 화분 성숙시 1번의 감소분열의 산물 4개가 사분자로 물리적으로 부착되게 되지만, 재조합 억제는, 이들 화분립이 재조합되지 않은 부계 염색체를 함유하게 한다. 즉, 본 발명은, 염색체 당 하나의 공-우성의 다형성 마커를 이용하여 1번의 감소분열으로 수득한 화분으로부터 유래되는 4개의 DH들 중에서 상보적인 유전적 구성 (complementary genetic composition)을 가진 DH를 쉽게 식별할 수 있게 해준다.
후향 육종의 문제점은 비-균등 (이수체) 포자가 생기는 것일 수 있다. 그러나, 균등 사분자는 형태학적으로 식별할 수 있으며 (예, 염색체가 모두 동일하게 배분되었음을 의미하는 화분립 4개가 크기가 동일한 사분자를 가시적으로 선별하거나 또는 예를 들어 유세포 측정을 이용함), 이러한 사분자로부터 재생시킨 DH는 자동적으로 쌍으로 상보적 (pairwise complementary)일 것이다. 균등 사분자가 이의 하이브리드 자손으로부터 모계 게놈을 제거하는 모계 식물의 수분화에 사용되면, 유전적 구성이 쌍으로 상보적인 4개의 반수체 종자가 만들어질 것이다. 상보적인 DH나 이로부터 유래된 계통을 이후에 교배하게 되면 오리지날 출발 식물의 유전적 구성이 재현될 것이다. 이런 교배의 자손 식물 4주가 교배 전에 유전자형이 특정되지 않은 경우, 이들 식물 4주들 중 2주를 랜덤 교배함으로써 오리지날 출발 식물의 유전적 구성을 재구축할 확률은 50%이다.
다른 구현예에서, 콰르텟 표현형은 근접 후향 육종과 조합될 수 있다 (WO2006/094773). 이런 구현예에서, 콰르텟 표현형을 나타내는 식물에서 제2 감수분열 퇴행 (SDR) 발생은 동일한 염색체 브레이크 포인트를 비롯하여 완벽하게 상보적인 유전적 구성을 가진 2개의 이배체 화분립을 포함하는, 부계 식물에 의한 화분 이분자 생성을 야기시킬 것이다. 이러한 화분 이분자를 가진 이의 하이브리드 자손으로부터 모계 게놈을 없애는 모 식물의 수분화로, 2개의 이배체 식물이 생길 것이며, 이들 식물 2주를 서로 교배하면 오리지날 하이브리드의 유전적 구성이 거의 완전히 재현될 것이다.
"거의 완전히 (Near-complete)"는 본 출원에서 2 식물을 합하면 이의 부계 식물과 동일한 유전 물질을 가지지만 (감수분열 중에 DNA가 소실 또는 추가되지 않으므로), 감소분열 중에 교차 발생의 결과로서 염색체 분절들의 상대적인 게놈 위치는 상이할 수 있다는 것을 의미한다. 염색체의 브레이트-포인트 위치는 그러나 2가지 식물에서 동일한데, 그 이유는 이들이 같은 (single) 감수분열로부터 기원한 것이기 때문이다. 상보적인 SDR-0 계통의 동정은 따라서 콰르텟 표현형을 이용함으로써 상당이 용이해지며, 임의의 소정의 하이브리드의 유전적 구성을 거의 완전하게 재현하기가 훨씬 쉬워지고 효율적이게 된다.
SDR-0 현상이 발생되는 동안의 감수분열 재조합으로 인해, 재현된 하이브리드는 서로 그리고 오리지날 출발 하이브리드 (부) 식물과 특히 CO의 결과로서 텔로미어에서 어느 정도 유전적으로 상이할 것이므로, 재현은 100% 완전하지 않을 것이다. 따라서, 이러한 특징은, 오리지날 하이브리드의 구성 대부분을 유지하면서 대안적이고 약간 상이한 게놈 배열을 제공함으로써, 부가적인 유전자 변이가 사전에 선택된 우수한 하이브리드 식물에서 형성되는, 추가적인 이점을 제공한다.
본 발명의 다른 과제는, 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자의 세트를 수득하는 효율적인 방법을 제공하는 것으로, 상기 종자의 세트는, 이로부터 키운 식물을 교배하였을 때, 본질적으로 동일한 하이브리드 식물이 형성되는, 본질적으로 유전적으로 상보적인 종자들의 쌍으로 구성된다. 이 하이브리드 식물은 상기 종자 세트가 기원이 되는 웅성 생식 세포를 생산한 식물과 유전적으로 본질적으로 동일하다.
"본질적으로"는 본원에서, 전술한 바와 같이, (하이브리드 표현형을 추가로 개선시키는 기회를 제공할 수 있기 때문에) 하이브리드 식물의 거의 완전한 재현이 바람직할 수 있어, 종자 쌍들의 유전적 상보성이 100%일 필요는 없음을 의미하고자 한다. 이러한 거의 완전하게 재현된 하이브리드 식물은 오리지날 하이브리드 식물과 본 발명에서 수득가능한 그외 거의 완전하게 재현된 하이브리드 식물과 단순히 본질적으로 동일한데, 그 이유는, 오리지날 하이브리드 식물과 동일하거나 또는 거의 동일한 게놈 물질을 가지고 있음에도 불구하고, 여러가지 교차 현상의 결과로서 이의 게놈에 존재하는 대안적이거나 또는 약간 다른 게놈 배열이 있을 수 있거나, 또는 일부 게놈 영역들이 재조합의 결과로서 상동적일 수 있기 때문이다. 감수분열에서 교차 (meiotic cross-over)가 발생하면, 따라서, "본질적으로"는 반수체-유도체 모 식물을 수분시키는데 사용되는 화분립이 생성되는 동안에 발생하는 교차 수준에 관한 것이다.
다른 내용으로, 예를 들어, 감수분열 재조합이 없을 경우, "본질적으로"는 또한 서로 100% 유전적으로 상보적이지 않은 종자 쌍들을 (본 발명에서 수득되는 종자 세트들에서) 선택하는 것을 지칭한다. 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도되는, 이런 구현예에서, 예를 들어, 종자 한 쌍은 n-1 염색체 (n은 종의 반수체 염색체의 갯수임)에 대해 서로 충분히 상보적이고, 나머지 염색체는 동일한 것으로 (상기 종자 세트로부터) 선택될 수 있다. 이런 종자 쌍으로부터 키운 식물을 교배하여 만든 하이브리드 식물은, 그래서, 염색체 하나를 제외한 모든 것에 대해서는 오리지날 하이브리드 식물과 유전적으로 동일할 것이며, 나머지 염색체는 상이할 것이다 (동형 접합체로 지칭됨). 전반적으로, 따라서, 식물은 오직 "본질적으로" 유전적으로 동일하다. 이런 식물은, 예를 들어, 바람직한 구현예에서 감수분열에서 재조합은 억제하면서 본 발명을 수행할 때 수득할 수 있다 ("후향 육종"). 동일한 컨셉은 n-2 염색체, n-3 염색체, 등등에 대해서도 행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이런 컨셉은 예를 들어 염색체의 서브세트에만 집중하고 나머지 하이브리드 게놈은 변화없이 유지하면서, 식물의 게놈 및 표현형을 분석할 수 있다.
이에, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 사분자 또는 이분자 형태를 가지는 제한된 수의 부계 생식 세포를 꽃의 암술 머리에 배치하여 모계 난세포와 수정시켜, 복수개의 접합체를 수득하는 단계;
b) 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실을 유도하여, 상기 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하는 단계.
본 방법에서, 배주를 수정시키기 위한 화분관에서의 경쟁은, 사분자 또는 이분자로 포함된 화분립들 중 일부가 배주를 수정시키지 못하는 경우를 방지하기 위해, 바람직하게는 최소화 또는 방지되어야 한다. 따라서, 화분립이 이의 암술머리 위에 놓이기 때문에 수분된 꽃의 자성 생식 기관에 가능한 많은 수의 배주가 존재하도록, 제한된 수분화가 바람직하다. 각 화분립은 그런 후 배주를 수정시킬 수 있어야 한다.
일 구현예에서, 따라서, 제한된 수의 부계 생식세포는 배주를 함유한 자성 생식 기관에 포함된 난세포의 갯수와 동일하거나 또는 작다.
꽃 하나 당 난세포 또는 배주의 평균 갯수는 특정 농작물에 익숙한 당업자들에게 공지되어 있으며, 이는 본 발명에서 성공적으로 사용될 수 있는 부계 생식세포 갯수의 바람직한 상한치이다. 이는, 일반적으로, 농작물의 전형적인 열매에 존재하는 종자의 평균 갯수 보다 약간 많다. 토마토는, 예를 들어, 꽃 하나 당 난세포의 평균 갯수는 약 100개이고, 브라시카 종은 약 35개이고, 아라비돕시스는 약 40-50개, 수박은 약 200개, 포도는 약 4개, 오이는 약 250-300개, 피망은 약 100개, 멜론은 약 500개이다. Burd et al., Am. J. Bot. 96(6), 1159-1167 (2009)에는 속씨식물 187종에 대한 꽃의 배주 갯수에 대한 연구 결과가 개시되어 있다.
제한된 수의 부계 생식 세포는 적절하게는 본 발명의 방법을 효과적인 방식으로 이용할 수 있는 임의의 갯수를 포함한다. 이는, 웅성 생식세포에 유전자 변이가 너무 많지 않도록 피해야한다는 것을, 즉, 하나의 암술머리 상에 놓이는 웅성 생식 세포를 만드는 감수분열의 횟수는, 이들 감수분열 각각이 (염색체 재조합을 통해) 이분자 또는 사분자를 구성하는 개개 생식세포의 게놈에 상당한 수준의 유전자 재배열을 형성한다면, 적게 유지되어야 한다는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 제한된 수의 부계 생식 세포는 2개 또는 4개이다 (이는 하나의 화분 이분자 또는 사분자 각각에 포함된 생식 세포의 갯수에 해당되며, 각각 제2 감수분열이 없거나 존재하는 단일 감수분열로부터 유래됨). 이런 전략은 단일 감수분열로부터 기원한 화분립과 유전적으로 동일한, 종자 4개 (사분자의 경우 수분에 사용됨) 또는 종자 2개 (이분자의 경우 수분에 사용됨)를 만들 수 있을 것이다. 생식 세포가 이분자 형태를 가지는 경우, 본 발명의 방법을 효과적인 방법으로 이용할 수 있게 하는 부계 생식 세포의 제한된 수는 2개 보다 훨씬 많을 수 있는데, 그 이유는 이분자내에 포함된 2개의 생식 세포가 서로 유전적으로 충분히 상보적이어서 유전자 변이량이 크게 감소되기 때문이다. 특히, 이분자 형태를 가진 생식 세포를 이용하는 경우, 이는 따라서 꽃 하나 당 난세포 또는 배주의 평균 갯수 보다 적은 임의의 수의 생식 세포를 이용하는 것이 효과적이다.
웅성 생식 세포의 사분자 또는 이분자 형태는 부계 식물에서의 소포자 사분자 분리를 간섭한 결과이다. 일 구현예에서, 소포자 사분자 분리의 간섭은 단일 감수분열로부터 발생한 소포자들 사이에 있는 펙틴 층의 분해에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭을 포함한다. 하나 이상의 타겟 유전자는 QRT1, QRT2, QRT3 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 돌연변이는 타겟 유전자에서의 정지 코돈 도입 또는 프래임 쉬프트, 단백질 구조 및/또는 기능을 파괴하는 아미노산 치환, 및 T-DNA와 같은 유전 인자의 코딩 서열, 프로모터 또는 이 유전자의 다른 조절 서열로의 삽입이다. 아라비돕시스의 경우, qrt1-4 돌연변이는 QRT1 유전자의 엑손으로의 T-DNA 삽입으로 초래되며, qrt1-5 돌연번이에서의 quartet 돌연변이 표현형은 T-DNA를 QRT1 유전자의 프로모터로 삽입함으로써 발생되며, qrt1-6 돌연변이는 QRT1 유전자의 인트론으로의 T-DNA 삽입에 의해 야기된다. 아라비돕시스에서 qrt2-1 돌연변이는 돌연변이 주에서 quartet 표현형의 기저 요인인 QRT2 단백질내 372번 위치에서 발린의 알라닌 아미노산으로의 치환 (GTG -> GCG 돌연변이)을 포함한다.
다른 구현예에서, 소포자 사분자의 분리 간섭은 화학적 수단에 의해 단일 감수분열로 발생되는 소포자들 사이에 존재하는 펙틴 층의 분해 간섭을 포함한다. QRT 유전자 산물은 화분 모 세포의 감수분열로부터 생겨난 개개 웅성 생식 세포 (소포자)들 사이에 존재하는 펙틴 폴리사카라이드 (펙틴) 층을 파괴하는 역할을 하는 효소이다. 이 펙틴 층이 분해되지 않으면, 웅성 생식 세포 (소포자) 4개는 사분자 형태로 서로 물리적으로 부착되어 유지된다.
소포자 사분자 분리에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭은 다수의 여러가지 방식으로 달성할 수 있다. 타겟 유전자의 간섭은 이의 전사 방지로 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 타겟 유전자의 전사는 타겟 유전자 프로모터에 대한, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 분자를 이용함으로써 방지할 수 있다.
다른 구현예에서, 전사는 타겟 유전자 프로모터에 작용하는 네거티브형 전사 인자를 발현함으로써 방지된다. 아울러, 또한, 타겟 유전자의 간섭은 타겟 유전자 mRNA 또는 전사체를 불안정하게 하는 것으로 이루어질 수 있다. 이는, 안티센스 RNA, RNAi 분자, 바이러스-유발성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공-억제자 분자, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타겟 유전자 mRNA 또는 전사체에 상보적인 핵산 분자를 이용함으로써 달성할 수 있다.
또한, 타겟 유전자의 간섭은 하나 이상의 우세한 네거티브 핵산 구조체를 이용하거나 또는 하나 이상의 화합물을 이용함으로써, 타겟 유전자의 발현 산물을 저해하는 것으로 이루어질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 타겟 유전자의 간섭은 타겟 유전자로의 하나 이상의 돌연변이 도입으로 이루어지며, 이로써 이의 생물학적 기능이 교란된다. 하나 이상의 돌연변이는 - 하나 이상의 화합물 (예, 에틸 메탄설포네이트, 니트로소메틸우레아, 하이드록실아민, 프로플라빈, N-메틸-N-니트로소구아니딘, N-에틸-N-니트로소우레아, N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘, 디에틸 설페이트, 에틸렌 이민, 소듐 아지드, 포르말린, 우레탄, 페놀, 에틸렌 옥사이드)을 이용하거나 및/또는 물리적 수단 (예, UV-조사, 고속 중성자 노출, X 선, 감마선 조사)을 이용하거나, 및/또는 유전 인자 삽입 (예, 트랜스포존, T-DNA, 레트로바이러스 인자)을 이용함으로써 - 무작위로, 또는 상동적인 재조합 또는 올리고뉴클레오티드 기반의 돌연변이 유도를 이용함으로써 특이적으로 도입할 수 있다.
소포자 사분자 분리를 간섭하기 위한 화학적 수단은 QRT 유전자 산물의 활성 (또는 안정성)을 감소시키는 화학적 저해제의 사용, 또는 단일 감수분열로 생긴 4개의 소포자들 사이에 존재하는 펙틴 층을 지속시키는 QRT 유전자 산물의 발현 수준을 - 직접 또는 간접적으로 - 감소시키는 화학제의 사용을 포함한다. QRT 단백질의 효소 활성은 화학적 저해제를 이용함으로써 저해할 수 있으며, 그래서, 정상적인 소포자 분리 단계 (또는 선행 단계) 동안에 꽃봉오리를 저해 화학제로 처리하면 단일 감수분열로 유래되는 소포자들 사이에 존재하는 펙틴 층을 지속시켜, 따라서 후기 발생 단계 중에 그리고 개화시에 소포자 사분자를 지속시킨다.
바람직한 구현예에서, (사분자 또는 이분자 형태의) 웅성 생식 세포를 생산한 부계 식물은, - 콰르텟 표현형 외에도 - 염색체 재조합 억제를 나타내어, 염색체 교차가 없고, 전체 염색체가 완전하게 전달되게 한다. 이런 구현예에서, 사분자의 개개 화분립들 중에서 유전적으로 상보적인 2개의 게놈을 동정할 확률은 50%이다. 상기 웅성 생식 세포를 생산한 부계 식물이 염색체 재조합을 억제하는 경우, 염색체 재조합 억제는 재조합에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자를 간섭함으로써 달성된다.
일 구현예에서, 타겟 유전자는 이중 가닥 브레이크에 참여하며, 이는 SPO11, MER1, MER2, MRE2, MEI4, REC102, REC104, REC114, MEK1/MRE4, RED1, HOP1, RAD50, MRE11, XRS2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 타겟 유전자는 염색체 쌍 형성 (chromosome pairing) 및/또는 가닥 교환에 관여하며, 이는 RHD54/TID1, DMC1, SAE3, RED1, HOP1, HOP2, REC8, MER1, MRE2, ZIP1, ZIP2, MEI5, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RPA1, SMC3, SCC1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, SOLODANCERS, HIM6, CHK2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 타겟 유전자는 감수분열의 재조합 과정에 참여하며, 이는 SGS1, MSH4, MSH5, ZIP1 및 ZIP2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 타겟 유전자는 PRD1, PRD2, PRD3, PHS1, NBS1, COM1, MND1, MER3/RCK, ZIP3, ZIP4, PTD, SHOC1, ZYP1, MLH1, MLH3 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
재조합에 참여하는 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭은 다수의 여러가지 방식으로 달성할 수 있다. 타겟 유전자의 간섭은 이의 전사 방해로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 타겟 유전자의 전사는 타겟 유전자 프로모터에 대한, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 분자를 이용함으로써 방지할 수 있다. 다른 구현예로, 전사는 타겟 유전자의 프로모터에 작용하는 네거티브형 전사 인자를 발현하므로써 방지한다. 아울러, 또한, 타겟 유전자의 간섭은 타겟 유전자 mRNA 또는 전사체를 불안정하게 함으로써 이루어질 수 있다. 이는, 안티센스 RNA, RNAi 분자, 바이러스-유발성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공-억제자 분자, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타겟 유전자의 mRNA 또는 전사체에 상보적인 핵산 분자를 이용함으로써 달성된다. 또한, 타겟 유전자의 간섭은 하나 이상의 우세한 네거티브 핵산 구조체를 이용하거나 또는 하나 이상의 화합물을 이용함으로써 타겟 유전자의 발현 산물을 저해하는 것으로 이루어질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 타겟 유전자의 간섭은 타겟 유전자로의 하나 이상의 돌연변이 도입으로 이루어지며, 이로써 이의 생물학적 기능이 교란된다. 하나 이상의 돌연변이는 - 하나 이상의 화합물 (예, 에틸 메탄설포네이트, 니트로소메틸우레아, 하이드록실아민, 프로플라빈, N-메틸-N-니트로소구아니딘, N-에틸-N-니트로소우레아, N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘, 디에틸 설페이트, 에틸렌 이민, 소듐 아지드, 포르말린, 우레탄, 페놀, 에틸렌 옥사이드)을 이용하거나 및/또는 물리적 수단 (예, UV-조사, 고속 중성자 노출, X 선, 감마선 조사)을 이용하거나, 및/또는 유전 인자 삽입 (예, 트랜스포존, T-DNA, 레트로바이러스 인자)을 이용함으로써 - 무작위로, 또는 상동적인 재조합 또는 올리고뉴클레오티드 기반의 돌연변이 유도를 이용함으로써 특이적으로 도입할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 웅성 생식 세포를 생산한 부계 식물은, - 콰르텟 표현형 외에도 - 감수분열 동안에 제2 감수분열 퇴행 (SDR)을 나타낸다. 이 구현예에서, 부계 식물은, 제2 감소분열이 발생하지 않기 때문에, 2n이며 이분자 형태를 가진 웅성 생식 세포를 생산하게 된다. 하나의 이분자에 포함된 2개의 웅성 생식 세포는 유전적으로 충분히 상보적이며, 이분자의 개개 화분립들에서 유전적으로 상보적인 2개의 게놈을 동정할 확률은 따라서 100%이다.
상기 웅성 생식 세포를 생산한 부계 식물이 감수분열 중에 제2 감수분열 퇴행을 나타내는 경우, 이 제2 감수분열 퇴행은 출발 유기체를 방해하지 않으며서 자발적으로 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 제2 감수분열 퇴행은 유전자 변형을 이용함으로써 유도된다. 이러한 유전자 변형은 일시적일 수 있으며, 또는 유전자 인자 (예, 이식 유전자, 돌연변이, 트랜스포존, 레트로바이러스 인자, T-DNA)를 게놈에 안정적으로 삽입함으로써 달성될 수 있으며, 유기체에서 제2 감수분열 퇴행 발생률을 높인다.
또 다른 구현예에서, 제2 감수분열 퇴행은 온도 스트레스, NO2, 아산화질소 (N2O) 또는 이들의 조합 등의 환경 스트레스에 부계 식물을 노출시킴으로써 달성된다 (Zhang et al. (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78: 84-88; WO 2006/094773; Barba-Gonzalez et al. (2006), Euphytica 148: 303-309; Okazaki et al. (2005), Euphytica 143: 101-114).
모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하기 위한 - 접합체로부터 모계 염색체의 소거는, 여러가지 방식으로 달성할 수 있다. 일 구현예로, 반수체 유도 주 (haploid inducer line)를 자성으로 사용할 수 있다. 반수체 유도 주는, 양친 중 한쪽의 염색체가 난세포에 화분이 수정된 후 형성되는 접합체의 게놈으로부터 없어지는 식물이다. 자성은, 예컨대 Bains & Howard 1950, Nature 166: 795에 기술된 바와 같이 여러가지 종의 식물일 수 있다. 다른 구현예로, 접합체에서 모계 염색체의 소거는 모 유기체로서 형질전환 식물을 이용함으로써 이루어지며, 형질전환 식물은 이종의 이식유전자 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 재조합에 의해 변형된 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, WO2011/044132에 기술된 바와 같이 대응되는 불활성화된 내인성 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 유전자를 가진다.
또한, 본 발명은, 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트에 관한 것으로서, 세트는 교배하였을 때 본질적으로 동일한 하이브리드를 형성하는 본질적으로 유전적으로 상보적인 종자 쌍들로 구성되며, 본 발명의 방법으로 수득가능하다. 이 종자 세트의 종자들은, 모계 식물에 사분자 또는 이분자 형태를 가진 제한된 수의 부계 생식 세포을 수분시켜 생겨난 것이며, 부계 생식 세포들은 하나의 (single) 부계 식물로부터 채집된 것이기 때문에, 종자들 모두 부 (father)가 동일하다. 이로 인해, 그리고, 접합체로부터 모계 염색체가 소거되었기 때문에, 상기 종자 세트의 종자들만 유전자 관점에서 하나의 웅성 조부와 하나의 자성 조부, 즉 이의 부의 양친을 가진다. 이는 도 4에서 개략적으로 도시된다.
또한, 본 발명은, 종자의 염색체 수를 배가시킨 후 또는 배가시키기 전에, 본 발명의 종자 세트의 종자들로부터 식물을 키우는 단계, 및 부모 식물로서 유전적으로 상보적인 식물 2주를 동정하는 단계를 포함하는, 유전적 구성 (genetic constitution)이 본질적으로 이의 웅성 조부모의 유전적 구성과 동일한 식물을 생산하기 위한, 부모 식물 세트에 관한 것이다. 이러한 유전적으로 상보적인 식물들은, (웅성 생식 세포를 생산한) 부계 식물에서는 이형 접합성이며, 부의 조부모 양쪽에서는 다른 대립유전자를 가지는, 분자 (유전자) 마커를 이용함으로써, 동정할 수 있다. 이들 마커는 특이적인 게놈 영역, AFLP, RFLP, SSR, RAPD, KASPar (KBioscience), InvaderTM 또는 Invader PlusTM을 직접 DNA 서열분석하는 것과 같은 다양한 여러가지 방법으로 평가할 수 있다 (예, De Vienne ed. (2003) Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology. Science publishers Inc. Enfield, NH USA. ISBN 1-57808-239-0).
본 발명은, 아울러, 유전적 구성이 부의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위한, 그리고, 유전적 구성이 이의 부의 조모의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위한, 종자 세트 또는 이로부터 키운 식물을 유전적 구성에 대해 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
유전적 구성이 이의 부의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물은, 이후, 유전적 구성이 이의 부의 조모의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 다른 식물과 교배하여, 유전적 구성이 그 자신의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 자손 식물을 수득할 수 있다. '그 자신의 조부'는, 반수체 유도 주에 수분하는데 사용되는 화분 사분자 또는 화분 이분자를 생산하는 (하이브리드) 식물을 의미한다. 이 가계도 (pedigree)는 도 4에서 도식으로 기술 및 명시되어 있다.
본 발명은 아울러 교배용 부모로서 유전적으로 상보적인 식물 2주를 동정하기 위한, 종자의 염색체 수를 배가한 후 또는 배가하기 전의, 상기 종자 세트의 이용에 관한 것이다.
본 발명이 실시될 수 있는 농작물 종들로는, 예를 들어, 담배, 포퓰러, 사탕무, 유채 (oilseed rape), 대두 (soybean), 토마토, 오이, 게르킨 (gherkin), 콘 샐러드, 시금치, 페퍼 (pepper), 페튜니아, 감자, 가지, 멜론, 수박, 당근, 무, 브라시카과의 식물 (vegetable Brassica species) (양배추, 꽃양배추 (cauliflower), 브로콜리, 콜라비, 싹양배추 (Brussels sprout)), 콩 (bean), 완두콩, 양파, 딸기, 테이블 비트 (table beet), 아스파라거스 및 포도 (grape vine)를 포함한다.
본 발명은 아래 항목들에서 추가로 기술된다.
항목
본 발명은 하기에 관한 것이다:
1. 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법으로서,
a) 사분자 또는 이분자 형태를 가지는 제한된 수의 부계 생식 세포를 꽃의 암술 머리에 배치하여 모계 난세포와 수정시켜, 복수개의 접합체를 수득하는 단계;
b) 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실을 유도하여, 상기 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 부계 생식 세포의 제한된 수는 상기 암술 머리를 가진 자성 생식 기관에 포함된 난세포의 수와 동일하거나 작은 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부계 생식 세포의 제한된 수가 2 또는 4인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 임의 조합에 있어서, 사분자 또는 이분자 형태를 가지는 상기 부계 생식 세포가 소포자 사분자의 분리를 간섭한 결과물인 것인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 소포자 사분자의 분리 간섭은 단일 감수분열을 통해 생긴 소포자들 사이에 위치한 펙틴 층의 분해에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭을 포함하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자가 QRT1, QRT2, QRT3 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 소포자 사분자의 분리 간섭은 화학적 수단에 의해 달성되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 임의 조합에 있어서, 상기 부계의 식물이 염색체 재조합의 억제를 나타내는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제7항 중 임의 조합에 있어서, 상기 부계ㅇ,; 식물이 감수분열 중에 제2 감수분열 퇴행 (SDR: second division restitution)을 나타내는 것인 방법.
10. 제8항에 있어서, 염색체 재조합의 억제가 재조합에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자를 간섭함으로써 달성되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 이중 가닥 브레이크 (double strand break)에 관여하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 SPO11, MER1, MER2, MRE2, MEI4, REC102, REC104, REC114, MEK1/MRE4, RED1, HOP1, RAD50, MRE11, XRS2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 염색체 쌍 형성 (chromosome pairing) 및/또는 가닥 교환 (strand exchange)에 관여하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 유전자가 RHD54/TID1, DMC1, SAE3, RED1, HOP1, HOP2, REC8, MER1, MRE2, ZIP1, ZIP2, MEI5, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RPA, SMC3, SCC1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, SOLODANCERS, HIM6, CHK2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 감수분열의 재조합 과정에 관여하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 타겟 유전자가 SGS1, MSH4, MSH5, ZIP1 및 ZIP2 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
17. 제5항 및/또는 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 이의 전사 방지인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 전사가, 상기 타겟 유전자 프로모터에 대한, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 분자를 이용하여 방지되는 것인 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 전사가 상기 타겟 유전자의 프로모터에 작용하는 네거티브형 (negatively acting) 전사 인자의 발현을 이용함으로써 방지되는 것인 방법.
20. 제5항 및/또는 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자의 mRNA 또는 전사체를 불안정하게 하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 타겟 유전자의 mRNA는, 안티센스 RNA, RNAi 분자, 바이러스-유발성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공-억제자 분자, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 타겟 유전자의 mRNA 또는 전사체에 상보적인 핵산 분자를 이용함으로써, 불안정하게 되는 것인 방법.
22. 제5항 및/또는 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자의 발현 산물을 저해하는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 타겟 유전자의 발현 산물이 하나 이상의 우세한 네거티브 핵산 구조체 (dominant negative nucleic acid construct)의 발현 산물을 이용하여 저해되는 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 타겟 유전자의 발현 산물이 하나 이상의 화합물을 이용하여 저해되는 것인 방법.
25. 제5항 및/또는 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 도입하여, 이의 생물학적 기능을 교란시키는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 한가지 이상의 화합물 및/또는 물리적 수단에 의해 및/또는 유전 인자의 삽입에 의해 무작위로 도입되는 것인 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 한가지 이상의 화합물이 에틸 메탄설포네이트, 니트로소메틸우레아, 하이드록실아민, 프로플라빈, N-메틸-N-니트로소구아니딘, N-에틸-N-니트로소우레아, N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘, 디에틸 설페이트, 에틸렌 이민, 소듐 아지드, 포르말린, 우레탄, 페놀 및 에틸렌 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 물리적인 수단이 UV-조사, 고속 중성자 노출, X 선, 감마선 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, 상기 유전 인자가 트랜스포존, T-DNA, 레트로바이러스 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
30. 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 상동성 재조합 또는 올리고뉴클레오티드 기반의 돌연변이 유도를 이용함으로써 특이적으로 도입되는 것인 방법.
31. 제9항에 있어서, 상기 제2 감수분열 퇴행이 특히 출발 유기체를 방해하지 않으면서 자발적으로 이루어지는 것인 방법.
32. 제9항에 있어서, 상기 제2 감수분열 퇴행이 유전자 변형에 의해 유도되는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 유전자 변형이 일시적인 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 유전자 변형이 유전 인자를 게놈에 안정적으로 삽입하여, 유기체에서 제2 감수분열 퇴행 발생율을 증가시킴으로써, 달성되는 것인 방법.
35. 제9항에 있어서, 상기 제2 감수분열 퇴행이 상기 부계의 식물을 환경 스트레스에 노출시켜 달성되는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 환경 스트레스가 온도 스트레스, NO2, 아산화질소 (N2O) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
37. 제1항 내지 제36항 중 임의 조합에 있어서, 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소거가 반수체 유도 주(haploid inducer line)를 자성 (female)으로 이용함으로써 유도되는 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 자성이 상이한 종의 식물인 방법.
39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한항에 있어서,
상기 자성 식물이 이종의 이식유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환 식물이고,
상기 발현 카세트는 재조합에 의해 변형된 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 대응되는 불활성화된 내인성 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 유전자를 가지는 것인 방법.
40. 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트로서,
상기 세트는 상기 종자로부터 키운 식물들을 교배하였을 때 본질적으로 동일한 하이브리드를 형성하는, 유전적으로 상보적인 종자 쌍들로 구성되며,
상기 종자 세트는 제1항 내지 제39항 중 임의 조합에 따른 방법으로 수득가능한 것인, 종자 세트.
41. 유전적 구성이 웅성의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 생산하기 위한, 부모 식물 세트를 제공하는 방법으로서,
제40항에 따른 종자 세트의 종자들로부터, 상기 종자의 염색체 수를 배가시킨 후 또는 배가시키기 전에, 식물을 키우는 단계, 및 유전적으로 상보적인 식물 2주를 상기 부모 식물로서 동정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
42. 제41항에 있어서,
상기 종자 세트 또는 이로부터 키운 식물은, 식물의 유전적 구성이 이의 부의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위해, 그리고 식물의 유전적 구성이 이의 부의 조모의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위해, 유전적 구성을 스크리닝하는 것인 방법.
43. 제40 내지 42항 중 임의 조합에 있어서,
상기 유전적 구성이 이의 부의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을, 유전적 구성이 이의 부의 조모의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 다른 식물과 교배하여, 유전적 구성이 자신의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 자손 식물을 수득하는 것인 방법.
본 발명은 아래 실시예들을 들어 추가로 기술되지만, 어떤 방식으로도 실시예들은 본 발명을 한정하지 않는다. 실시예들에서는 아래 도면들이 참조된다:
도 1: 종들의 염색체 수에 따른 각 화분 사분자의 구체적인 염색체 상보성 결과를 나타낸, 소위 파스칼 삼각형. 위에서 아래 방향으로, 반수체 염색체의 수가 커지며, 각 줄의 수들의 합은 항상 2n이며, 이는 염색체 n개가 참여한 감수분열로부터 생길 수 있는 상이한 감수분열 산물의 총 수이다. 예로 (반수체 염색체가 7인 오이의 경우, n=7) 7번째 줄에서, 충분히 상보적인 경우의 수는 항상 1, 즉 줄에서 첫번째 숫자이지만, 줄의 두번째 숫자는 반수체 염색체의 수임을 알 수 있다. 동일 열에서 그 다음번째 숫자들은 사분자에서 각각 비-상보적인 염색체가 2, 3, 4, 5 및 6개인 감수분열 산물의 예상되는 갯수에 해당된다. 비-상보적인 염색체가 하나인 경우의 총 수는 7 * 2이며, 비-상보적인 염색체가 2개인 경우의 총 수는 21 * 2이며, 이와 같다. 예를 들어, 염색체 3개가 비-상보적이라면, 이는, 그외 염색체 4개가 상보적이라는 것을 암시한다. 중요하게는, 본 문맥에서 "비-상보적인"은 실제 이들 염색체들의 텔로미어 말단을 지칭하는 것에 불과하다. 예를 들어, 비-상보적인 염색체가 3개이고, 재조합 후 이형 접합성이 40%에 불과한 경우, 염색체 7개 중 4개가 완전히 상보적일 것이며, 그외 염색체 3개는 여전히 상보성이 60%이다.
도 2: 표는 반수체 염색체의 갯수에 대한 함수로서, 화분 사분자를 구성하는 멤버 4개에서 특정 수준의 상보성을 구할 가능성 (확률 %)을 나타낸다. 예를 들어, 오이 (n=7)의 경우, 오이의 화분 사분자 안에 비-상보적인 염색체가 0, 1, 2, 또는 3개인 (그래서, 상보적인 염색체가 각각 7, 6, 5 또는 4개인) 감수분열의 산물을 접할 확률은, 따라서, 각각 1.6% (=(1+1)/128), 10.9% (=(7+7)/128), 32.8% (=(21+21)/128) 및 54.7% (=(35+35)/128)이다.
콰르텟을 구성하는 멤버 4개에서 특정 수준의 상보성을 구할 가능성 (확률 %)은 도 2에 표로 제시된다. 오이의 화분 사분자 내에서 비-상보적인 염색체가 0, 1, 2, 또는 3개인 (그래서, 상보적인 염색체가 각각 7, 6, 5 또는 4개인) 감수분열의 산물을 접할 확률은 따라서 각각 1.6% (=(1+1)/128), 10.9% (=(7+7)/128), 32.8% (=(21+21)/128) 및 54.7% (=(35+35)/128)이다.
도 3: 반수체 염색체가 4개일 경우의 감수분열 현상을 그래프로 도시한 것이다 (n = 4). 하이브리드 식물의 한쪽 부모는 청색 염색체에 기여하지만, 다른 부모는 하이브리드의 적색 염색체에 기여한다. 제1 단계에서, 게놈이 2n에서 4n으로 배가되며, 염색체 당 한번의 교차 현상으로 도면에 예시된 바와 같이, 이후 자매 염색분체들의 상동적인 영역들 간에 교차가 발생할 수 있다. 제1 감수분열 중에, 2개의 이배체 딸 세포들이 생성되며, 이들은 유전적으로 완전히 상보적이다 (즉, 이들의 게놈을 합하면, 분리 이전에는 게놈 조성이 4n임). 이 도면에서, 제1 감수분열의 결과에 대한 단지 한가지 가능한 예만을 나타낸다. 제2 감수분열 중에는, 생식 세포 (이 문맥에서: 소포자 또는 화분립)가 만들어지며, 염색체가 무작위로 딸 세포 중 어느 하나로 분리된다. 이로써, 딸 세포 (생식 세포)들로 구성된 2n-1개의 쌍들이 만들어진다. 좌측 이배체 세포의 경우, 도면은 한쌍의 가능한 생식 세포를 보여주며, 우측의 이배체 세포의 경우, 모두 8쌍의 가능한 생식 세포들을 보여준다 (= 23 = 2n-1).
이후 배가된 반수체 식물을 (예를 들어, 본 발명의 방법에 의해, 반수체 식물을 재생하고 이의 게놈을 배가함으로써) 여러가지 생식 세포들로부터 재생하게 되면, 이들 식물들을 서로 교배할 수 있다. 여러가지 염색체 세트 바로 아래의 숫자들은 도면의 가장 좌측에 있는 염색체 세트에 상보적인 염색체의 수에 해당한다. 예를 들어, 가장 좌측에 도시된 4개의 염색체 (즉, 전체적으로 청색인 염색체 4개)를 포함하는 식물이 우측의 염색체 쌍 8개 중 첫번째부터 전체적으로 적색인 염색체 4개를 포함하는 식물과 교배한다면, 염색체 4개 모두 상보적일 것이다. 이 교배로, 생식 세포를 생산한 오리지날 하이브리드 식물이 정확하게 재현될 것이다. 마찬가지로, 4개의 청색 염색체를 가진 동일 식물을, 우측에 도시된 다른 가능한 염색체 세트를 포함하는 식물과 교배하면 (보다 정확하게는: 각 8쌍에서 좌측 염색체 세트), (염색체 4개 모두가 완전히 상보적인 경우) 오리지날 하이브리드 식물이 완전하게 재현되거나, 또는 (염색체 4개 중 하나 또는 2개가 완전히 상보적이지 않은 경우) 오리지날 하이브리드 식물이 거의 완전하게 재현될 것이다. 생식 세포가 동일한 감수분열로부터 기원하기 때문에, 상보적이지 않은 염색체의 수가 2개 보다 많을 경우는 존재하지 않는다. 아울러, "비-상보적인" 염색체들의 상당 부분이 실제 상보적이며, 교배를 통해 고도로 이형 접합성인 자손이 만들어질 것이라는 점이 도면으로부터 명확해지며; 단지 비-상보적인 염색체 부분들은 염색체의 텔로미어에서의 교차로 인한 것이며, 교차 영역들은 제조되는 자손에서 동형 접합적이게 될 것이다. 염색체 쌍들의 아래에 기재된 숫자들이 가장 좌측에 놓인 염색체 세트와 비교하여 비-상보적인 염색체를 0, 1 또는 2개 가지는 경우를 그룹으로 합하면, n = 4에 대한 분포는 2 - 8 - 6이며, 이는 또한 도 1의 삼각형의 4번짹 줄에서도 확인할 수 있다 (1 - 4 - 6 - 4 - 1로 열거됨).
도면에서 가장 우측에, 2번째로 가능한 생식 세포의 쌍이 도시되어 있으며, 이는 제2 감수분열 중에 가장 좌측의 이배세 세포로부터 유래될 수 있다. 도면의 하단에 열거된 숫자들은, 이 쌍의 생식 세포들 중 하나를 가장 우측의 이배체 세포로부터 유래된 생식 세포 16개 중 임의의 것과 조합하였을 때의, 상보적인 염색체의 수를 나타낸다. 재차 동일한 결과를 관찰할 수 있으며; 생색 세포 16개 중 2개는 충분히 상보적이며 (즉, 상보적인 염색체 4개), 8개는 비-상보적인 염색체를 하나 가지며, 6개는 비-상보적인 염색체를 2개 가진다. 단일 감수분열로 유래된 산물 4개를 함께 유지시킴으로써, 그리고 이들 4개의 감수분열 산물들과 유전적으로 동일한 자손 식물을 수득하기 위한 수단을 제공함으로써, 본 발명은, 교배하여 오리지날 하이브리드 식물을 만들거나 또는 오리지날 하이브리드와 유전적으로 본질적으로 동일한 하이브리드를 만들 수 있는, 자손 식물들의 쌍들을 동정할 수 있는 가능성을 극대화한다.
도 4: 재조합이 발생하지 않은 것으로 가정한, 본 발명에 따른 가계도의 단순 개략도. (유전자형이 각각 AA 및 BB인) (동형 접합성의) 부모 식물 2주를 교배하여 만든 하이브리드 식물은 사분자 형태로 화분립을 생산한다. 하나의 사분자를 사용하여 (랜덤 유전자형을 가진) 반수체 유도 모 식물에 수분시키면, 이 교배로부터 제조되는 자손은 반수체 종자 4개로 구성된 세트로 구성될 것이다. 유전적으로 이들 종자들은 (재조합이 없는 경우) A, A, B 및 B이며, 모 식물로부터 유래된 유전적 기여는 존재하지 않는다. 그래서, 이들 4개의 반수체 종자들은 오직 2개의 조부모, 즉 화분 사분자를 생산한 하이브리드의 부계 식물의 부모 계통을 가지게 된다. 게놈 배가 후, 배가된 반수체 식물들을 수득할 수 있으며, 이는 - 재조합이 발생하지 않는 경우 - 항상 유전적으로 충분히 상보적인 쌍일 것이다. 임의의 쌍으로부터 유래된 유전적으로 상보적인 식물 2주를 교배하면 오리지날 하이브리드 식물이 재구축된다. 이는 재조합이 발생하는 경우에는 도 1, 2 및 3에 예시된 바와 같이 더욱 복잡하다. 재조합이 발생하면, 화분 사분자의 자손들 중에서 충분히 상보적인 식물 쌍을 찾을 가능성은 반수체 염색체의 수에 대한 함수로 감소되지만, 재조합이 발생하지 않을 경우, 염색체의 수는 결과에 영향을 미치지 않는다.
실시예
실시예 1
콰르텟-화분-방출성 (quartet-pollen-shedding) 브라시카 식물의 동정
본 발명을 수행하기 위한 기본적인 재료는 감수분열로부터 유래된 4개의 산물이 서로 물리적으로 부착되어 유지되는 사분자 형태로 화분립을 발산하는 대상 식물 종이다. 이러한 식물은 형질전환 방법을 통해 또는 돌연변이 스크린으로 수득할 수 있다. 이러한 예는 첫번째 옵션을 설명하며, 2번째 옵션은 이후의 실시예들에서 설명될 것이다.
콰르텟 화분 표현형을 나타내는 식물을 동정하기 위해, 브라시카 올레라시아 (Brassica oleracea) EMS-돌연변이 개체군을 표현형에 대해 스크리닝하여, 개개 식물의 꽃밥에서 콰르텟 표현형 (즉, 화분 사분자)을 가진 화분립의 발생을 검출하였다. 벌크 접근법으로, 다수의 식물로부터 화분을 채집하여 모은 후, 용액에 희석하였으며, 개개 화분립들을 명확하게 식별할 수 있었다. 이들 화분 풀을 쌍안 현미경 하에 눈으로 스크리닝하였지만, 다른 예로 스크린은 또한 유세포 측정 또는 (개개 화분립의 직경 보다 포어 크기가 크지만 화분 사분자의 직경 보다는 작은 필터를 사용한) 여과에 의해서도 가능하다. 화분 풀에서 원하는 콰르텟 표현형을 검출하면, 그 풀에 화분을 제공한 모든 식물을 콰르텟 돌연변이 식물이 명확하게 동정될 때까지 각각 스크리닝하였다. 다음 세대에서, 콰르텟 표현형의 유전성을 검증하였다.
실시예 2
F1-자손으로부터 모계 게놈이 소거된 브라시카 식물의 제작
Maruthachalam & Chan (Nature 464, 615-619; 2010)의 간행물에 따르면, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) cenh3 돌연변이 식물에 GFP-CENH3-테일스왑 (tailswap) 단백질의 과발현 구조체를 형질전환하면 수정 후 접합체에 비정상적인 유사분열이 발생한다고 한다. CENH3 단백질은 진핵 생물에서 보편적이며, 그 기능이 매우 잘 보존되어 있기 때문에, 아라비돕시스에 대한 이런 전략은 다른 식물 종들에게도 널리 적용가능하다.
F1 자손에서 모계 게놈이 선택적으로 소거된 브라시카 올레라시아를 제작하기 위해, 아라비돕시스의 CENH3에 이종상동성 (orthologous)인 단백질의 기능적인 버전이 결핍된 브라시카 식물을 제작하였다. 이는, RNAi 방법을 이용하여 달성하였다. 이 식물은, 이후, Maruthachalam & Chan (Nature 464, 615-619; 2010)에 기술된 GFP-CENH3-tailswap 구조체를 이용한 아그로박테리움 감염을 이용하여 유전적으로 형질전환하였다. 동형 접합성 cenh3 돌연변이 식물 (아라비돕시스의 경우에서와 같이)의 치사성 때문에, 이형 접합성의 침묵 식물에 이 구조체를 형질전환하는 것이 필수적이었다. 그런 후, 형질전환 식물을 구조체의 선별 마커를 이용하여 선별하고, GFP-CENH3-tailswap 융합 단백질의 존재와 정확한 발현을 유사분열 중에 형광 현미경으로 검출할 수 있었다.
실시예 3
아라비돕시스에서 모계 게놈이 제거된 콰르텟 표현형의 조합
본 실시예는 하이브리드 식물의 유전자형을 효율적으로 재구축하는 방법을 기술한다.
Ler으로 등록된 형질전환 아라비돕시스 탈리아나 식물을 제작하였으며, 이것은 CaMV 35S 구성적인 프로모터에 의해 구동되는 QRT1 유전자 (At5g55590)를 타겟팅하는 RNAi 구조체를 (동형 접합체 상태로) 1카피 가지고 있다. 다른 예로, 인공 마이크로-RNA (amiRNA) 등의 다른 기술도 이런 목적으로 사용할 수 있다. 그런 후, 이 식물을 Ws로 등록된 야생형 아라비돕시스 탈리아나 식물과 교배하였다.
제조되는 F1 세대는 RNAi 구조체에 대해 헤미접합성인, 혼성 Ler/Ws 백그라운드를 가진 하이브리드 식물들로 구성되었다. RNAi 구조체는 포자체에 (sporophytically) 작용하며, 우성적인 방식으로 모든 F1 식물들은 콰르텟 화분 표현형을 나타내었다. F1 식물 - 콰르텟 화분 표현형을 나타냄 - 을 부로서, Maruthachalam & Chan (Nature 464, 615-619; 2010)에 보고된 바와 같이 GFP-CENH3-tailswap 구조체가 유전적으로 형질전환된, Col-0로 등록된 아라비돕시스 탈리아나 cenh3 돌연변이 주와 교배하였다. 교배를 통해 접합체에서의 첫번째 유사분열 중에 모계 염색체가 소거되었으며, 반수체 종자들이 만들어졌다.
교배를 준비함에 있어, 부계 식물의 거의 열개성의 꽃밥을 쌍안 현미경 하에 열어, 원숙한 화분 사분자들 각각을 수집하였다. 각 화분 사분자는 속눈썹 또는 미세 블러시모를 이용하여 모 식물의 암술 위에 조심스럽게 놓고, 4개의 화분립으로 4개의 배주를 수정시켰다. 하나의 화분 사분자를 이용한 제한된 수분화로 생긴 종자 4개를 성숙시킨 다음, 수확하여 발아시켰다. 다른 예로, 사분자 하나 보다 많은 수를 모 식물의 암술 위에 둘 수 있지만, 화분립의 수가 종의 자성 생식부내 배주의 평균 갯수를 초과하지 않도록 주의를 기울여야 한다. 수분에 사분자를 1개 보다 많이 사용하면, 즉, 유전적으로 상보적인 자손 식물을 동정할 수 있는 효율이 감소될 것이다.
형질전환 Col-0 모 식물의 제한된 수분화를 통해 발생된 묘목들의 배수성을 유세포 측정으로 테스트하였다. 이들의 배수성은, 2n으로 자발적인 게놈 배가가 발생된 일부 사례를 제외하고는, n이었다. 반수체 개체의 경우, 게놈 배가는 이후 당업자들에게 공지된 표준 방법 (예, 콜히친 처리)으로 달성하였다. 교배를 통해 발생된 4종의 묘목이 2n이 되면, 이들의 게놈 DNA를 분리하여, 전체 아라비돕시스 게놈을 커버하는 유전자 마커로 유전학적으로 분석하였다. 특히, Col-0와 Ler 간에, Col-0와 Ws 간에 마커 다형성을 테스트하여, 4종의 자손 식물에 대한 양쪽 부모 게놈의 기여를 구분하였다. 접합체에서 모게 게놈이 소거되었기 때문에, 자손 식물 4주는 하이브리드 부계 식물 유래의 재조합된 염색체만을 포함하고 있었으며, 그래서 모든 Col-0-특이 마커들에 대한 네거티브를 조사하였다.
도 2는 화분 사분자 안에 상보적인 염색체을 소정의 갯수로 가지는 자손 식물의 발생률이 반수체 염색체 갯수 (n)에 의존한다는 것을 보여준다. 아라비돕시스는 염색에 5개를 가지는데, 오리지날 부계 식물의 콰르텟 화분 표현형으로 인해 묘목 4주의 염색체 배열 (chromosome constellation)은 한번의 감수 분열로부터 기인한 것이다. 이는, 하나의 화분 사분자에 완전히 상보적인 게놈이 2개 존재할 이론적인 확률은 1/16 (6.3%)이라는 것을 암시한다. 비-상보적인 염색체를 1개 가지는 게놈이 2개일 확률은 31.3%이고, 비-상보적인 염색체 2개를 가지는 게놈이 2개일 확률은 62.5%이다. 따라서, 모든 경우에, 사분자내 개객 화분립들은 서로 50% 이상의 상보성을 가진다. 중요한 점은, 재조합이 예를 들어 40% 이형 접합체에서 발생하면, 심지어 "비-상보적인" 염색체들도 서로에 대해 여전히 60%의 상보성을 가질 것이기 때문에, 개개 화분립들의 게놈 간의 전체 상보성이 항상 50% 보다 높을 것이라는 것이다.
따라서, 이론적으로는 본질적으로 상보적인 염색체 세트를 가지는 아라비돕시스 묘목 2주를 동정하기 위해서는 평균적으로 화분 사분자와 단지 16번 교배하면 된다. 그러나, 실제로는, 수분 효율, 종자 형성 및 식물 발아와 생존성이 대체적으로 100% 보다 낮기 때문에, 그 이상이 필요하다. 성공율을 최대화하기 위해서는, 하나의 사분자로 대충 (rule of thumb) 10배로, 즉 이 경우에는 160번 행하였다.
동정한 후, 유전적으로 본질적으로 상보적인 식물 2주를 개화기까지 키워, 교배하였다. 교배에서 생긴 F1 자손의 유전적 구성은, 이의 부의 조부, 즉 Ler/ Ws 하이브리드 백그라운드를 가진 qrt1 돌연변이 식물의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 것으로 실험을 통해 입증되었다.
실시예 4
아라비돕시스에서 모계 게놈이 제거된 콰르텟 표현형과, 비-형질전환 자손의 조합
실시예 3에서, F1 자손은 QRT1 유전자를 타겟팅하는 RNAi 구조체를 보유하고 있기 때문에 형질전환성을 유지하였으며, 그래서 또한 콰르텟 화분 표현형을 유지하였다. 그러나, 성숙한 화분립에서 그린 형광 단백질을 특이적으로 발현하는 GFP 리포터 카세트를 실시예 3에서 사용된 RNAi 구조체에 삽입하였을 때, 자손 식물이 형질전환성이 아닌 다른 방식도 가능하였다. 또한, 후기-화분-특이 프로모터 (LAT52 프로모터; Twell et al, 1990, Development 109: 705-713)하에 핵 위치화 신호와 함께 GFP 단백질을 포함하고 있는 T-DNA 구조체는 성숙한 화분립에서 이 구조체를 쉽게 가시적으로 검출가능하게 해준다.
실시예 3에 언급된 Ler/Ws 하이브리드 식물 (QRT1을 타겟팅하는 RNAi 구조체에 대해 헤미접합성)의 꽃밥 스쿼시에서, (형광 쌍안경 또는 현미경을 이용하여) 가시적으로 또는 FACS (형광 활성화된 세포 분류)에 의해 화분립 4개중 2개가 핵에서 GFP를 발현하지 않는, 화분 사분자를 선별하였다. 화분립 4개중 2개에만 따라서 QRT1을 타겟팅하는 RNAi 구조체가 포함되어 있었다. 접합체에서 첫번째 유사분열 중에 모계 염색체의 소거가 유발된 - 전술한 Col-0 모 식물에, 상기한 화분 사분자를 수분시키면, 반수체의 형질전환 자손 식물 2주 (RNAi 구조체를 보유함)와 반수체의 비-형질전환성 자손 식물 2주 (RNAi 구조체를 보유하지 않음)가 형성되었다.
정의 상 비-형질전환성 자손 식물은 QRT1에 대한 RNAi 구조체를 보유하고 있는 Ler 염색체 단편이 결핍되어 있으며, 이들 식물 2주를 교배해서는 오리지날 F1 하이브리드를 정확하게 재구축할 수 없는데, 그 이유는 재구축된 식물이 하나 이상의 Ws 염색체 영역, 즉 Ler 부모 식물에서 QRT1에 대한 RNAi 구조체를 함유한 염색체 영역에 해당되는 염색체 영역에 대해 동형 접합성일 것이기 때문이다.
실시예 5
피망 (캅시컴 아눔)에서 콰르텟 화분 표현형과 제2 감수분열 퇴행의 조합
제2 감수분열 퇴행 (SDR) 발생할 때, 제2 감수분열은 발생하지 않으며, 감수분열의 결과로, 반수체 화분립 4개 대신, 이배체 화분립이 2개 생길 것이다. 즉, 감수분열 산물은 물리적으로 서로 부착되어 유지되면 - 콰르텟 화분 표현형을 가진 사례에서와 같이 - 식물은 SDR 발생시 화분 이분자를 생산할 것이다. 본 발명의 이러한 바람직한 구현예에서, 2개의 이배체 감수분열 산물은 물리적으로 서로 부착되어 유지되며, 이의 염색체가 동일한 재조합 브레이크 포인트를 가지고 있어, 화분립 2개를 서로 유전적인 상보성이 100%이다.
콰르텟 화분 표현형을 나타내는 피망 (캅시컴 아눔) 식물을 실시예 3에 기술된 바와 같이 마찬가지로 RNAi 방법을 통해 수득하였다. 이의 자손 식물 - 콰르텟 표현형에 대해 동형 접합성임 - 을, Zhang et al. (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78: 84-88과 WO 2006/094773의 실시예 2에 기술된 바와 같이, 비환원 소포자 (생식 세포) 발생율을 높이기 위해, 추위 스트레스에 노출시켰다. 추위 처리한 식물의 꽃밥에서 만들어진 소포자와 화분은 최대 25%가 이분자 형태를 취하였다. 분리한 소포자 분획들은 현미경 분석으로 (또는 유세포 측정을 사용할 수 있음) 추가로 이분자에 대해 농화하였다. 이런 방법을 이용하여, 근접 후향 육종 (WO 2006/094773)이라고 하는 방법을 바람직한 구현예에서 구현할 수 있었다.
이를 위해, 실시예 2에 개략적으로 기술된 실험 방법에 따라, 첫번째 유사분열 중에 접합체에서 모계 게놈이 소거된 2번째 피망 식물을 제작하였다. 이 형질전환 피망 식물을, 상기 추위 처리한 피망 식물의 화분 이분자 하나로 수분시키고, 수득되는 이배체 종자 2개를 수확 및 발아시켰다. 화분 이분자는 비-SDDR 감수분열로부터 기원한 화분 사분자들 중에서 꽃밥 스쿼시에서 수동으로 선별하였다.
이들 이배체 종자 2개로부터 키운 식물을 이후 교배하였고, 유전자 마커를 이용하여, 교배한 식물의 자손의 유전적 구성이 수분화에 사용된 화분 이분자를 생산한 피망 식물의 유전적 구성과 본질적으로 동일하다는 것을 검증할 수 있었다. 그러나, 화분 이분자를 형성되는 동안에 발생된 교차 현상으로 인해, 일부 텔로미어 변이가 생겼으며, 이는 선별된 하이브리드 백그라운드에 부가적인 유전자 변이를 제공하였다.
그래서, 반수체 유도 모 식물을 다른 피망 식물에서 생산된 화분 이분자로 수분시켜 본 실시예에서 제작한 피망 식물은, 화분 이분자 형성 중에 발생된 교차 현상의 결과로서 텔로미어에 부가적인 유전자 변이가 도입되었기 때문에, 수분용 화분 이분자를 생산한 피망 식물과는 유전적으로 오직 "본질적으로 동일"하였다. 부계 식물의 모둔 유전 물질들이 유지되었고, 이의 일부분은 교차 현상을 통해 재배열되었으며, 재배열은 부가적인 표현형 효과를 야기할 수 있다.
즉, 본 실시예는 선별한 (엘리트) 하이브리드 식물에 부가적인 유전자 변이 도입을 허용한다. 이런 부가적인 변이는 오리지날 하이브리드 표현형에 비해 파지티브 또는 네거티브적인 부가적인 표현형 효과를 가질 수도 있으며, 따라서, 이는 오리지날 하이브리드를 구성하는 선택된 형질들의 조합을 유실하지 않고도 하이브리드 표현형을 추가로 개선 (및/또는 미세 조정)하는 흥미로운 기회를 제공해준다.
다른 예로, 콰르텟 표현형을 나타내는 피망 식물을, 상기 평균 수준의 SDR을 천연적으로 나타내는 피망 식물과 교배할 수 있다. 그러면 이들의 자손은 전술한 평균 퍼센트로 화분 이분자를 천연적으로 생산할 것이다. 다른 전략은, 상기 평균 수준을 SDR를 천연적으로 나타내는 피망 식물 개체군에 돌연변이를 야기하고, 정방향 유전학 접근법 (forward genetics approach)으로 이들 돌연변이 개체군에서 콰르텟 화분 표현형을 나타내는 식물을 스크리닝하는 것이다.
이분자 각각 및 전체는, 2개의 화분립이 서로 유전적으로 본질적으로 상보적일 확률이 100%이다 (동일한 염색체 브레이크 포인트를 가짐). 이분자를 구성하는 소포자 2개는 정의 상 유전적으로 본질적으로 상보적이며, 이들 사분자들 중 어느 하나로부터 유래될 수 있는 식물 2주를 교배하면 이분자를 생산한 오리지날 하이브리드 식물과 본질적으로 유전적으로 동일한 하이브리드 식물이 항상 만들어질 것이다. 따라서, 본 구현예는 근접 후향 육종 기법의 효율을 상당히 개선시킨다.
일반적으로, 본 발명의 이러한 구현예에서, F1 자손으로부터 모계 염색체의 소거를 야기하는 유전자 특징을 가진 식물은 제한된 수분화를 통해 수분된다. 교배에 사용된 화분은, SDR과 조합하여 콰르텟 화분 표현형을 나타내는 동일 종의 하이브리드 식물로부터 수득되는 하나의 화분 이분자이다. 이 화분 이분자는 스쿼싱한 꽃밥을 가시적으로 스크리닝한 다음 (SDR이 발생하지 않는 동안에 감수분열을 통해 제조된) 사분자 무리들 중에서 이분자 무리를 선별하거나, 또는 보다 고 성능의 세팅으로서 유세포 측정 또는 세포 분류를 이용하여 화분 분획에서 이분자를 농화함으로써, 수득된다.
F1 자손으로부터 모계 염색체의 소거를 야기하는 유전자 특징을 가지고 있는 모 식물은 수분 후, 이분자를 구성하는 이배체 화분립 2개가 각각 배주를 수정시켜, 종자가 형성 및 성숙된다. 완숙되면, 이 교배로부터 생긴 종자 2개를 수확하여 발아시킨다. 그런 후, 키운 묘목은, 이들이 예상한 바와 같이 실제 2n인지를 검증하기 위해 유세포 측정을 이용하여 배수성 정도를 테스트한다.
이후, 묘목 2주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 전체 게놈을 커버하는 유전자 마커를 사용하여 양쪽 각각을 테스트한다. 접합체에서 모계 염색체가 소거되었기 때문에, 양쪽 묘목들은 오직 부계 염색체만 가질 것으로 예상된다. 양쪽 묘목의 염색체는 단일 감수분열로 기원한 것이기 때문에, 염색체 브레이크 포인트가 모두 동일하며, 이의 게놈들은 상보성이 100%이다. 이는 게놈-와이드 마커 분석을 통해 검증된다.
묘목들을 이후 성숙되게 키워, 서로 교배한다. 이들의 F1 자손은, SDR 생식 세포가 형성되는 동안에 발생된 교차 현상을 제외하고는, 첫번째 교배에서 부로서 사용된 오리지날 출발 하이브리드 식물과 유전적으로 본질적으로 동일하다. 이들 교차 현상은 텔로미어에 일부 변이를 유도하여, 선별된 하이브리드 백그라운드에 부가적인 유전자 변이를 제공한다.
부의 조부 유기체의 (하이브리드) 유전자형에 대한 거의 정확한 재구축이 2세대의 시간만으로도 달성되었으며, 중간 재생 또는 게놈 배가 단계 도는 조직 배양이 필요없다.
실시예 6
아라비돕시스에서 콰르텟 화분 표현형과 염색체 재조합 억제 및 모계 게놈 제거의 조합
콰르텟 화분 표현형을 나타내는 아라비돕시스 식물과, 염색체 재조합이 (형질전환, 돌연변이 또는 화학적 수단에 의해) 부분적으로 또는 완전히 억제된 다른 아라비돕시스 식물의 교배를 통해, 양쪽 특징이 조합된 F2 자손 식물을 선별할 수 있다: 한번의 감수 분열을 통해 생긴 4개의 화분립이 꽃밥 및 화분이 방출될 때까지 서로 물리적으로 부착되어 유지되고, 감수분열 중에 상동적인 염색체 재조합이 억제된다.
이런 후대 식물은 좀더 효율적인 방식으로 후향 육종을 가능하게 한다 (WO 03/017753; Dirks et al 2009). 감수분열의 산물은 서로 물리적으로 부착되어 유지되기 때문에, 본질적으로 상보적인 염색체 세트를 가진 화분립 2개를 동정할 가능성은 크게 증가한다. 상이한 사분자의 갯수는 종의 염색체 갯수와 함수 관계에 있지만, 하나의 사분자에서는, 4개의 화분립이 쌍으로 상보적이기 때문에, 2개의 화분립이 완전히 상보적인 염색체 세트를 가질 가능성은 항상 50%이다. 사분자 각각 및 모두에서, 상보적인 화분립 2쌍을 수득할 가능성은 따라서 100%이다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, CaMV 35S 구성적인 프로모터에 의해 구동되는 QRT1 유전자를 타겟팅하는 RNAi 구조체를 (동형 접합체 상태로) 1카피 가지고 있는, 아라비돕시스 탈리아나 Ler 식물을 제작하였다. 그 후, 이 식물을 또한 CaMV 35S 구성적인 프로모터에 의해 구동되는 DMC1 유전자를 타겟팅하는 RNAi 구조체를 동형 접합체 상태로 1카피 가지고 잇는 아라비돕시스 탈리아나 식물 Ws와 교배하였다.
제조되는 F1 세대는 양쪽 RNAi 구조체에 대해 헤미접합성인, 혼성 Ler/Ws 백그라운드를 가진 하이브리드 식물들로 구성되었다. 양쪽 RNAi 구조체는 포자체에 (sporophytically) 작용하며, 우성적인 방식으로 모든 F1 식물들은 콰르텟 화분 표현형과 감수분열 중의 염색제 재조합 억제를 나타내었다. 염색체 재조합 억제로 인한 바람직하지 못한 부작용으로서, 또한, 비균등 화분 사분자 (나란히 균등한 사분자)가 형성되었는데, 그 이유는 충분히 기능적인 DMC1 단백질의 부재로, 각 염색체가 세포 분열시 딸 세포로 무작위로 분산되기 때문이다. 그러나, 균등한 사분자를 꽃밥으로부터 (윤악 조사 및/또는 유세포 측정에 의한) 실험을 통해 선별할 수 있었다.
양쪽 형질전환 구조체에 대해 헤미접합성이며 콰르텟 화분 표현형과 염색체 재조합 억제를 나타내는 - F1 식물로부터 유래된 균등한 화분 사분자를, 이후에 사용하여, Maruthachalam & Chan (2010)에 기록된 GFP-CENH3-tailswap 구조체로 유전적으로 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 cenh3 돌연변이 식물 Col-0 (Maruthachalam & Chan, 2010에서 제조 및 보고됨)에 수분시켰으며, 그 결과 접합체에서 첫번째 유사 분열 중에 모계 염색체가 소거되었다.
하나의 균등한 화분 사분자를 모 식물의 암술을 수분하는데 사용하였을 때, 이런 교배는 이상적으로는 반수체 자손 종자 4개를 만들어내게 딘다. 자손 종자 4개를 발아시키고, 그 묘목을 마커로 유전자 테스트하였다. 염색체 재조합이 감수분열에서 발생하지 않기 때문에 (DMC1을 타겟팅하는 RNAi 구조체로 인해, 염색체 모두 다음 세대로 전체가 옮겨감), Ler 조부모 또는 Ws 조부모로부터 유전되었는지를 확인하기 위해서는, 각 염색체를 검사할 마커는 단지 몇개만 필요하였다 (실제, 염색체 당 다형성 마커 1개로도 충분할 것이며, 본 실험에서, 본 발명자들은 염색체 암 당 마커 1개, 즉 염색체 당 2개를 사용하였음).
모 식물이 자손에게 유전적으로 기여하지 않았는지는 확실히 하기 위해, Col-0 특이 마커를 테스트하였지만, 실시예 3에서의 경우에서와 같이, Col-0 유전자 물질은 동정할 수 없었다.
자손 식물 4주가 쌍으로 완벽하게 유전적으로 상보적임이 확인되었으며, 유전자 마커 분석을 이용하여 이들 쌍들을 효율적으로 동정할 수 있었다. 유전적으로 상보적인 자손 식물 한쌍을 서로 교배하면, 수분에 사용된 화분 사분자를 생산한 오리지날 하이브리드 식물, 즉, 양쪽 RNAi 구조체들에 대해 헤미접합성인 Ler/Ws 하이브리드 식물의 유전적 구성이 효과적으로 구현되었다. 도 4는 본 실험에 사용된 식물들의 가계도를 나타낸 것이다.

Claims (24)

  1. 기원이 되는 웅성 생식 세포와 유전적으로 동일한 종자 세트를 생산하는 방법으로서,
    a) 사분자 (tetrad) 또는 이분자 (dyad) 형태를 가진 제한된 수의 부계 생식 세포를 꽃의 암술 머리에 배치하여 모계 난세포와 수정시켜, 복수개의 접합체를 수득하는 단계;
    b) 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실을 유도하여, 상기 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트를 수득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부계 생식 세포의 제한된 수는 상기 암술 머리를 가진 자성 생식 기관에 포함된 난세포의 수와 동일하거나 작은 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부계 생식 세포의 제한된 수가 2 또는 4인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 사분자 또는 이분자 형태를 가진 상기 부계 생식 세포가 소포자 사분자의 분리를 간섭한 결과물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소포자 사분자의 분리 간섭이 단일 감수분열 (single meiotic division)을 통해 생긴 소포자들 사이에 위치한 펙틴 층의 분해에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자가 QRT1, QRT2, QRT3 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 소포자 사분자의 분리 간섭이 화학적 수단에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 부계의 식물이 염색체 재조합의 억제를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 부계의 식물이 감수분열시 제2 감수분열 퇴행 (SDR: second division restitution)을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 염색체 재조합의 억제가 재조합에 관여하는 하나 이상의 타겟 유전자를 간섭함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 타겟 유전자가, SPO11, MER1, MER2, MRE2, MEI4, REC102, REC104, REC114, MEK1/MRE4, RED1, HOP1, RAD50, MRE11, XRS2 또는 이의 기능적 상동체와 같이, 이중 가닥 브레이크 (double strand break)에 관여하거나,
    상기 하나 이상의 타겟 유전자가, RHD54/TID1, DMC1, SAE3, RED1, HOP1, HOP2, REC8, MER1, MRE2, ZIP1, ZIP2, MEI5, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RPA, SMC3, SCC1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, SOLODANCERS, HIM6, CHK2 또는 이의 기능적 상동체와 같이, 염색체 쌍 형성 (chromosome pairing) 및/또는 가닥 교환 (strand exchange)에 관여하거나,
    상기 하나 이상의 타겟 유전자가, SGS1, MSH4, MSH5, ZIP1 및 ZIP2 또는 이의 기능적 상동체와 같이, 감수분열의 재조합 과정에 관여하거나, 또는
    상기 하나 이상의 타겟 유전자가, PRD1, PRD2, PRD3, PHS1, NBS1, COM1, MND1, MER3/RCK, ZIP3, ZIP4, PTD, SHOC1, ZYP1, MLH1, MLH3 또는 이의 기능적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제5항 또는 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자의 전사 방지인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 전사가, 상기 타겟 유전자 프로모터에 대한, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 분자를 이용하여 방지되거나, 또는
    상기 전사가 상기 타겟 유전자의 프로모터에 작용하는 네거티브형 (negatively acting) 전사 인자의 발현을 이용함으로써 바람직하게 방지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제5항 또는 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자의 mRNA 또는 전사체를 불안정하게 하는 것이며, 바람직하게는, 안티센스 RNA, RNAi 분자, 바이러스-유발성 유전자 침묵화 (VIGS) 분자, 공-억제자 분자, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 타겟 유전자의 mRNA 또는 전사체에 상보적인 핵산 분자를 이용함으로써, 불안정하게 하는 것이거나, 또는
    상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자의 발현 산물을 저해하는 것이며, 바람직하게는, 하나 이상의 우세한 네거티브 핵산 구조체 (dominant negative nucleic acid construct)의 발현 산물을 이용하거나 또는 바람직하게는 하나 이상의 화합물을 이용하여 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제5항 또는 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 타겟 유전자의 간섭이 상기 타겟 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 도입하여, 생물학적 기능을 교란시키는 것이며,
    상기 하나 이상의 돌연변이가 바람직하게는 에틸 메탄설포네이트, 니트로소메틸우레아, 하이드록실아민, 프로플라빈, N-메틸-N-니트로소구아니딘, N-에틸-N-니트로소우레아, N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘, 디에틸 설페이트, 에틸렌 이민, 소듐 아지드, 포르말린, 우레탄, 페놀 및 에틸렌 옥사이드와 같은, 한가지 이상의 화합물을 이용하거나, 및/또는 UV-조사, 고속 중성자 노출, X 선, 감마선 조사와 같은 물리적 수단에 의해, 및/또는 트랜스포존, T-DNA, 레트로바이러스 인자와 같은 유전 인자의 삽입에 의해 무작위로 도입되거나, 및/또는
    상기 하나 이상의 돌연변이가 상동성 재조합 또는 올리고뉴클레오티드 기반의 돌연변이 유도를 이용함으로써 특이적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 제2 감수분열 퇴행이 특히 출발 유기체를 개입시키지 않으면서 자발적으로 이루어지는 것인 방법.
  17. 제9항에 있어서,
    상기 제2 감수분열 퇴행이 유전자 변형에 의해 유도되며, 상기 유전자 변형은 일시적이거나, 또는 상기 유전자 변형은 유전 인자를 게놈에 안정적으로 삽입하여, 유기체에서 제2 감수분열 퇴행의 발생률을 증가시킴으로써, 달성되거나, 또는
    상기 제2 감수분열 퇴행이 온도 스트레스, NO2, 아산화질소 (N2O) 또는 이들의 조합과 같은 환경 스트레스에 상기 부계의 식물을 노출시킴으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 상기 접합체로부터 모계 염색체의 소실이 반수체 유도 주(haploid inducer line)를 자성 (female)으로서 이용함으로써 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제37항에 있어서, 상기 자성이 상이한 종의 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 자성의 식물이 이종의 이식유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환 식물이고,
    상기 발현 카세트는 재조합에 의해 변형된 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 대응되는 불활성화된 내인성 CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 또는 NUF2 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 모계 염색체가 존재하지 않는, 제한된 수의 종자를 포함하는 종자 세트로서,
    상기 세트는, 상기 종자로부터 키운 식물들을 교배하였을 때 본질적으로 동일한 하이브리드를 형성하는, 유전적으로 상보적인 종자 쌍들로 구성되며,
    상기 종자 세트는 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 방법으로 수득가능한 것을 특징으로 하는, 종자 세트.
  22. 유전적 구성 (genetic constitution)이 웅성의 조부 (male grandparent)의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 생산하기 위한, 부모 식물 세트를 제공하는 방법으로서,
    제21항에 따른 종자 세트의 종자들로부터, 상기 종자의 염색체 수를 배가시킨 후 또는 배가시키기 전에, 식물을 키우는 단계, 및 유전적으로 상보적인 식물 2주를 상기 부모 식물로서 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    식물의 유전적 구성이 부의 조부 (paternal grandfather)의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위해, 그리고 식물의 유전적 구성이 부의 조모 (paternal grandmother)의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을 동정하기 위해, 상기 종자 세트 또는 이로부터 키운 식물에서 유전적 구성을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21 내지 23항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 유전적 구성이 부의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 식물을, 유전적 구성이 부의 조모의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 다른 식물과 교배하여, 유전적 구성이 자신의 조부의 유전적 구성과 본질적으로 동일한 자손 식물을 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
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