FR2955114A1 - Proteines interagissant avec gcp3 et applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle famille de protéines appelées « GIPs » pour « GCP3 Interacting Proteins » et leurs applications dans les domaines médical et agricole. Elle vise en particulier différentes séquences consensus de GIP, des méthodes d'induction de l'apoptose chez une cellule et d'endoréduplication chez une plante et leurs applications au traitement du cancer et à la réalisation de plantes transgéniques.

Description

-1- La présente invention concerne une nouvelle famille de protéines appelées « GIPs » pour « GCP3 Interacting Proteins » et leurs applications, en particulier dans les domaines médical et agricole. La protéine GCP3 est un membre du complexe de nucléation des microtubules (MTOCs, voir figure 1). Ce complexe est essentiel à l'assemblage in vivo des microtubules et à la formation du fuseau mitotique lors de la mitose. Chez les eucaryotes, un cycle cellulaire classique est divisé en deux grandes périodes et subdivisé en quatre phases : l'interphase regroupant les phases G1, S et G2 et la mitose correspondant à la phase M.

Durant l'interphase, l'ADN chromosomique contenu dans le noyau subit une réplication (phase S). Après la réplication de l'ADN chromosomique, la cellule se prépare à entrer en mitose. Dans une première étape de transition G2/M, appelée prophase, l'ADN chromosomique, présent dans le noyau sous forme de chromatine (ADN + histones), se condense en structures appelées chromosomes. L'ADN ayant été dupliqué avant le début de la mitose, il y a deux copies identiques de l'ADN dans la cellule, réparties dans deux chromatides par chromosome. La prophase se caractérise également par une réorganisation du cytosquelette de la cellule constitué de microtubules et de microfilaments d'actine. Cette réorganisation se réalise selon des mécanismes variables en fonction des espèces concernées (champignons / plantes / animaux), mais aboutissant tous à la formation d'un fuseau mitotique bipolaire. La prométaphase commence au moment de la rupture de l'enveloppe nucléaire et correspond à la mise en place de liaisons entre les microtubules du fuseau et chacune des deux chromatides des chromosomes. La phase suivante, appelée métaphase, correspond au rassemblement des chromosomes sur le plan équatorial de la cellule. Les chromatides se séparent durant l'anaphase, migrent vers les pôles opposés de la cellule, ce qui permet une répartition équilibrée du génome précédemment dupliqué (caryocinèse). Enfin, lors de la télophase, les chromatides commencent à se décondenser et l'ADN redevient diffus. Dans le même temps, l'enveloppe nucléaire se reconstitue et des microtubules localisés à l'équateur contribuent avec des filaments d'actine à la séparation des cytoplasmes de chaque cellule fille (cytocinèse). Chaque noyau-fils est alors bien localisé dans une cellule fille qui est à nouveau composé d'un exemplaire du patrimoine génétique initial (phase G1). Le travail des inventeurs a permis de mettre en évidence que les protéines GIPs, conservées dans l'ensemble des eucaryotes, sont impliquées dans les mécanismes régulant le cycle cellulaire. En effet, l'inhibition de la fonction d'une protéine GIP produit une perturbation du phénomène de mitose. Lorsque cette inhibition a lieu au sein d'une

-2- cellule isolée, elle provoque la formation d'un fuseau mitotique monopolaire et par la suite l'apoptose de la cellule. Lorsque cette inhibition a lieu au sein d'une culture de cellules d'origine animale, elle provoque une apoptose desdites cellules. Cette propriété peut avantageusement être mise à profit dans des thérapies anti-cancéreuses. En revanche, lorsque l'inhibition a lieu au sein d'une plante, elle provoque une endoréduplication au sein de cellules de cette plante et donc l'accroissement de la taille desdites cellules. L'endoréduplication est un type de cycle cellulaire ne comportant pas de division cellulaire. Contrairement au cycle cellulaire classique, l'endoréduplication est un cycle cellulaire dans lequel l'ADN chromosomique se réplique durant l'interphase qui n'est pas suivie d'une phase mitotique. Il s'agit ainsi d'une succession répétée de phases Gl/S/G2. Ce phénomène conduit à des cellules à noyau unique contenant beaucoup de copies de l'ADN génomique. Si le phénomène d'endoréduplication se répète, la cellule devient polyploïde, c'est-à-dire que la quantité d'ADN généralement comprise dans une cellule, soit 2C pour une cellule diploïde, passe à 4C, 8C ou largement plus. Si l'on constate des phénomènes d'endoréduplication chez certains insectes ou mammifères, ce phénomène reste cependant caractéristique des organismes végétaux. Il est connu que le volume nucléaire et la taille d'une cellule augmentent lorsque la quantité d'ADN chromosomique est multipliée dans le noyau cellulaire. Par conséquent, l'endoréduplication a pour effet d'accroître la taille d'un organisme ou d'une partie d'un organisme (par exemple, un tissu) et tout particulièrement celle d'une plante ou d'une partie de plante. Cette propriété peut donc être avantageusement mise à profit dans le domaine agronomique de façon à améliorer la quantité et/ou la qualité de fruits, de racines et/ou de graines (enrichissement en pulpe ou en produit de réserve). La présente invention est donc relative à un polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°1: [MI LVT]-X-X-X-[LV]-X-X-X-[LIVF]-[DTS]-X-X-X-[LI FVM]-X-X-[CLIAVF]-[l LVME]-X- [LM FVA]-X-X-X-G-X-X-[PGA]-X-X-[LIV]-[VIAS]-X-[VILAW]-[VIFLG] (SEQ ID N°1) Cette séquence correspond à la séquence consensus des protéines GIPs sur l'ensemble des eucaryotes et est spécifique des protéines GIPs. L'invention vise également l'acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°1.

-3- Une recherche d'homologues faite par BLAST parmi un grand nombre d'espèces d'eucaryotes a permis d'identifier au moins une protéine pour chaque organisme, homologue à la protéine AtGIP1 et/ou AtGIP2. Ces résultats sont présentés dans les tableaux 1 et 2 des exemples 2 et 3 ci-après.

Selon un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°2 et/ou la séquence SEQ ID N°3: [LVIA]-X-X-[I LVMT]-[SAN]-X-[I LYVM]-[LV]-X-X-[G D NQ]-[LIV]-[DTS]-X-X-X-[LI FVM]-X-X- [CLIA]-[VLI]-X-[LM]-X-X-X-G-[VIA]-X-[PG]-X-X-[LI]-[ASV]-X-[VI LA]-[IVFL]-X-X-[LI MVA] (SEQ ID N°2) MASSSGAGAAAAAAAANLNAVRETMDVLLEISRILNTGLDMETLSICVRLCEQGINPEALS SVIKELRKATEALKAAENMTS (SEQ ID N°3) et les acides nucléiques isolés codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant les séquences SEQ ID N°2 et/ou SEQ ID N°3.

La seconde séquence consensus correspond à la séquence consensus des protéines GIP d'origine animale et la séquence SEQ ID N°3 correspond à la GIP humaine. En particulier, un acide nucléique isolé codant pour la GIP humaine peut comprendre la séquence de nucléotides suivante (SEQ ID N°4) et/ou la séquence présentée en figure 2 (SEQ ID N°5) : ATGGCGAGTAGCAGCGGTGCTGGGGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCGGCGAATC TGAATGCGGTGCGGGAGACCATGGACGTTCTGCTTGAGATTTCAAGAATTTTGAA TACTGGCTTAGATATGGAAACTCTGTCTATTTGTGTACGGCTTTGTGAACAAGGAA TTAACCCAGAAGCTTTATCATCGGTTATTAAGGAGCTTCGCAAGGCTACTGAAGC ACTGAAGGCTGCTGAAAATATGACAAGCTGA (SEQ ID N°4) La séquence SEQ ID N°4 correspond à la séquence nucléotidique codante pour la protéine GIP humaine, tandis que la séquence SEQ ID N°5 correspond à la séquence nucléotidique complète de l'ARN messager de la GIP humaine. L'invention propose plus particulièrement une méthode in vitro d'induction de l'apoptose chez une cellule, caractérisée en ce que en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est inhibée : (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2 (iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°3 (iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 30% d'homologie et au moins 18% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 2955114 -4- (v) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite cellule. Par pourcentage d'homologie, on vise le pourcentage de résidus identiques ou similaires entre deux séquences. Par pourcentage d'identité, on vise le pourcentage de résidus identiques entre deux 5 séquences. De préférence, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 35 % et plus préférentiellement d'au moins 40 % et le pourcentage d'identité sera d'au moins 20 % et plus préférentiellement d'au moins 25 %. Comme indiqué ci-avant, lorsque l'inhibition de la ou les protéine(s) GIP a lieu au 10 sein d'une cellule isolée, elle provoque l'apoptose de la cellule. L'apoptose est également obtenue en réponse à l'inhibition de la protéine GIP au sein d'une culture de cellules d'origine animale. En revanche, au sein d'un tissu végétal, l'inhibition des protéines GIP conduit majoritairement les cellules végétales vers la voie de l'endoréduplication. On notera que les cellules d'origine végétale comportent fréquemment deux 15 protéines GIP tandis que les cellules d'origine animale ne comprennent qu'une unique protéine GIP. Par conséquent, afin d'induire l'apoptose chez une cellule végétale isolée, on inhibera préférentiellement les deux protéines GIP, présentes dans la cellule. L'inhibition de la fonction de la protéine peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. L'inhibition peut en particulier résulter d'un mécanisme empêchant 20 la protéine de fonctionner ou d'un mécanisme bloquant la synthèse de cette protéine. A titre d'exemple de mécanisme empêchant la protéine de fonctionner, on citera les mécanismes dans lesquels la fonction peut être bloquée par une interaction de type antigène-anticorps ou protéine-inhibiteur. Dans le premier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une seconde protéine possédant les caractéristiques de reconnaissance 25 spécifiques d'épitopes de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v). Dans le deuxième cas, il s'agit d'induire une interaction de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v) avec une molécule affine (peptidique ou chimique) bloquant ses capacités naturelles d'interaction avec GCP3 ou d'autres protéines des voies signalétiques, dans lesquelles ladite protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) agit. Un autre mécanisme 30 permettant de bloquer la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est d'empêcher la phosphorylation de la protéine par une kinase Aurora. Les kinases Aurora sont des enzymes impliquées dans la division cellulaire : elles ont un rôle de régulation dans la maturation des centrosomes, la séparation et la condensation des chromosomes, le point de contrôle du fuseau mitotique et la cytokinèse. Dans ce dernier cas, il s'agit 35 d'induire l'expression d'une protéine ou partie de protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) portant une mutation sur le site de phosphorylation rendant cette dernière inopérante. 2955114 -5- Les mécanismes bloquant la synthèse de la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) comprennent plus particulièrement toute modification génétique visant l'inhibition de l'expression du gène codant pour ladite protéine, telle qu'une mutation dudit gène. Par inhibition de l'expression d'un gène, on vise tout mécanisme permettant 5 d'empêcher le gène de s'exprimer. A titre d'exemple, les méthodes suivantes peuvent être employées: a) l'induction de l'expression d'une séquence complémentaire (siRNA) exogène à un fragment d'ARN messager transcrit endogène du gène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) conduit à l'hybridation des deux séquences. Ceci bloque la 10 traduction des ARNs messagers dudit gène en protéine par mise en place d'une signalisation de dégradation enzymatique desdits ARNs. b) la mutation du gène endogène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) par insertion d'une séquence (ADN de transfert; transposon) ou par délétion de séquence (ponctuelle, partielle ou totale) permet de produire l'expression de protéines 15 tronquées ou inactives ou dans le cas extrême, aucune expression de protéine. Ce dernier cas arrive lorsque la séquence codante est totalement délétée, ou que la mutation génère un codon stop en 5' de la phase codante (N-terminal de la protéine) ou encore que la mutation ait induit un décallage de la phase de lecture de l'ADN aboutissant à une séquence d'amino-acides non conforme à la séquence native de la protéine active. 20 L'invention vise donc également les molécules d'ARN interférant (siRNA) isolées comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un des acides nucléiques décrits ci-avant. Avantageusement, les SiRNA comprendront un brin d'ARN choisi parmi les séquences suivantes : - GAACGUGGCUCCAAAUUCA (SEQ ID N°6), 25 - UGAAUUUGGAGCCACGUUC (SEQ ID N°7), - GGACGUUCUGCUUGAGAUU (SEQ ID N°8), - AAUCUCAAGCAGAACGUCC (SEQ ID N°9), - GAAUUAACCCAGAAGCUUU (SEQ ID N°10), et - AAAGCUUCUGGGUUAAUUC (SEQ ID N°11). 30 L'induction de l'apoptose au sein d'une cellule s'avère d'un intérêt particulier pour traiter certaines maladies dont le cancer. En outre, comme cela indiqué dans l'exemple 8, il a été démontré que les cellules tumorales présentaient une expression accrue des protéines GIP. Par conséquent, l'invention couvre une molécule d'ARN interférant (siRNA) isolée 35 comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un des acides nucléiques décrits ci- avant pour une utilisation comme médicament, en particulier pour un traitement contre le

-6- cancer tel que le cancer du col de l'utérus, du sein, du colon ou du cerveau. Avantageusement, la molécule d'ARN interférant se présentera sous la forme d'une composition pharmaceutique, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un second mode de réalisation, l'invention concerne plus particulièrement les protéines GIP végétales et leurs applications à une méthode pour accroître la taille d'une plante ou partie de plante par inhibition d'au moins une protéine GIP dont l'inactivation entraîne une endoréduplication des cellules végétales. L'invention vise également une plante ou partie de plante génétiquement modifiée et la méthode de production de plantes correspondantes.

Les protéines GIP végétales présentent la séquence consensus SEQ ID N°12: [RK]-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-[AVT]-[FI H]-X-[Ml]-[SA]-[NQS]-[I LFVM]-[LV]- [D E NQG]-X-G-[LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[ED] -X-G-X- N-P-[E DG]-[ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-[RQGS] (SEQ ID N°12) L'invention couvre également l'acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°12. Plus particulièrement, l'invention vise les polypeptides isolés, comprenant la séquence consensus SEQ ID N°13 : K-[EDQ]-[SA]-L-[EDN]-[LVIA]-A-[Fl H]-Q-[Ml]-[SA]-[NQS]-[l L]-[LV]-[DE]-T-G-[LI]-D-R-H- T-L-[STA]-[IVL]-[LI]-M-[AST]-[LF]-[CS]-[E D]-R-G-[AT]-N-P-[EDG]-[ASV]-[LVI]-[AV]- [AV]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-S-S-[AT]-A-P-P (SEQ ID N°13) ou la séquence consensus SEQ ID N°14 : [RK]-D-[SA]-L-[ED]-[LVIA]-[AVT]-[FI H]-H-M-[SA]-[NQS]-[I LFVM]-[LV]-[DENQG]-X-G- [LI]-D-R-[HQP]-X-L-[STA]-[IVL]-[LI]-[IVM]-[AST]-[LF]-[CS]-[E D]-L-G-X-N-P-[E DG]- [ASV]-[LVI]-[AV]-[AVT]-[VIL]-[VI]-[KR]-[EQ]-[LVF]-R-[RQ]-E-[NTS]-P (SEQ ID N°14) et les acides nucléiques isolés codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°13 ou la séquence consensus SEQ ID N°14 Les séquences consensus SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14 correspondent respectivement aux séquences consensus des GIP de poacées et de solanacées. Ces deux familles de plantes présentent un intérêt particulier dans le domaine agricole. En effet, des plantes telles que le blé, l'orge, le maïs, le seigle et la canne à sucre appartiennent à la famille des poacées tandis que la tomate, l'aubergine, la pomme de terre ou le poivron appartiennent à la famille des solanacées. L'invention concerne plus particulièrement une plante génétiquement modifiée caractérisée en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii) est inhibée :

-7- (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°12 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°13 (iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°14 (iv) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°15 (v) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°16 (vi) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°15 (vii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°16 (viii) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite plante de type sauvage. Les séquences SEQ ID N°15 et SEQ ID N°16 correspondent respectivement aux séquences en acides aminés des protéines AtGIP1 et AtGIP2 qui interagissent avec la protéine AtGCP3, l'un des composants des MTOCs d'Arabidopsis thaliana. L'identification de ces protéines AtGIP1 et AtGIP2 d'Arabidopsis thaliana est plus amplement décrite dans l'exemple 1 ci-après, et les séquences SEQ ID N°15 et SEQ ID N°16 sont données en figures 3B et 4B respectivement.

Une recherche d'homologues faite par BLAST parmi un grand nombre d'espèces de la lignée verte (Chlorophytes) a permis d'identifier au moins une protéine pour chaque végétal, homologue à la protéine AtGIP1 et/ou AtGIP2. Ces résultats sont présentés dans le tableau 1 de l'exemple 2 ci-après. On notera que les séquences sont généralement courtes (entre 60 et 100 acides aminés) et très conservées (fort pourcentage d'homologie). En outre, elles correspondaient à des protéines de fonction encore inconnue. Par pourcentage d'homologie, on vise le pourcentage de résidus identiques ou similaires entre deux séquences. Par pourcentage d'identité, on vise le pourcentage de résidus identiques entre deux séquences. De préférence, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 65 % et plus préférentiellement d'au moins 70 % et le pourcentage d'identité sera d'au moins 50 % et plus préférentiellement d'au moins 60 %. Ces pourcentages préférés concernent plus particulièrement les plantes dicotylédones. En effet, Arabidopsis thaliana étant une plante dicotylédone, de plus fortes homologie et identité sont recensées chez ce type de plantes. 2955114 -8- Comme indiqué dans le tableau 1 de l'exemple 2, certaines plantes, et plus particulièrement les plantes terrestres, peuvent comporter au moins deux protéines GIPs, homologues à AtGIP1 et/ou AtGIP2. Les inventeurs ont mis en évidence que, de manière surprenante, si l'inhibition d'une seule protéine GIP avait une influence très relative sur 5 l'endoréduplication et par conséquent sur la taille de ces plantes ou de la partie de ces plantes dans laquelle l'endocycle remplace le cycle cellulaire normal, l'inhibition combinée d'au moins deux protéines GIPs détectées chez ces plantes, favorisait notablement l'endoréduplication. Ceci se traduisait par un phénotype très marqué dans lequel un fort accroissement de la taille des cellules de la plante était mis en évidence, par exemple un 10 épaississement de la racine (voir par exemple les figuresl4 C et D). Par conséquent, l'invention concerne plus particulièrement une plante génétiquement modifiée, de préférence une plante terrestre, dans laquelle la fonction de deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée. La terminologie « plante terrestre » se définit par opposition aux plantes aquatiques 15 (par exemple, une algue). L'inhibition de la fonction de la protéine peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. L'inhibition peut en particulier résulter d'un mécanisme empêchant la protéine de fonctionner ou d'un mécanisme bloquant la synthèse de cette protéine. Cette inhibition sera ciblée préférentiellement dans la partie de plante jugée d'intérêt. 20 A titre d'exemple de mécanisme empêchant la protéine de fonctionner, on citera les mécanismes dans lesquels la fonction peut être bloquée par une interaction de type antigène-anticorps ou protéine-inhibiteur. Dans le premier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une seconde protéine possédant les caractéristiques de reconnaissance spécifiques d'épitopes de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (viii). Dans le 25 deuxième cas, il s'agit d'induire une interaction de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (viii) avec une molécule affine (peptidique ou chimique) bloquant ses capacités naturelles d'interaction avec GCP3 ou d'autres protéines des voies signalétiques, dans lesquelles ladite protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) agit. Un autre mécanisme permettant de bloquer la protéine est d'empêcher sa phosphorylation par une kinase 30 Aurora. Dans ce dernier cas, il s'agit d'induire l'expression d'une protéine ou partie de protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) portant une mutation sur le site de phosphorylation rendant cette dernière inopérante. L'expression des transgènes sera avantageusement ciblée dans des cellules ou tissus particuliers par usage d'un promoteur adéquat placé en amont de la séquence codante. 35 Les mécanismes bloquant la synthèse de la protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) comprennent plus particulièrement toute modification génétique visant l'inhibition 2955114 -9- de l'expression du gène codant pour ladite protéine, telle qu'une mutation dudit gène. Avantageusement et en particulier lorsqu'il s'agit de plantes terrestres, la plante sera modifiée par inhibition de l'expression d'au moins deux gènes codant pour au moins deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (viii). 5 Par inhibition de l'expression d'un gène, on vise tout mécanisme permettant d'empêcher le gène de s'exprimer. A titre d'exemple, les méthodes suivantes peuvent être employées: a) l'induction de l'expression d'une séquence complémentaire (siRNA) exogène à un fragment d'ARN messager transcrit endogène du gène codant pour la protéine choisie 10 parmi les protéines (i) à (viii) conduit à l'hybridation des deux séquences. Ceci bloque la traduction des ARNs messagers dudit gène en protéine par mise en place d'une signalisation de dégradation enzymatique desdits ARNs. b) la mutation du gène endogène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (viii) par insertion d'une séquence (ADN de transfert; transposon) ou par délétion de 15 séquence (ponctuelle, partielle ou totale) permet de produire l'expression de protéines tronquées ou inactives ou dans le cas extrême, aucune expression de protéine. Ce dernier cas arrive lorsque la séquence codante est totalement délétée, ou que la mutation génère un codon stop en 5' de la phase codante (N-terminal de la protéine) ou encore que la mutation ait induit un décallage de la phase de lecture de l'ADN aboutissant à une 20 séquence d'amino-acides non conforme à la séquence native de la protéine active. Dans l'exemple 7, par croisement de deux simple mutants d'insertion d'ADN-T concernant respectivement les gènes At4g09550 (SEQ ID N°17) et At1g73790 (SEQ ID N°18) d'Arabidopsis thaliana, un descendant double mutant d'insertion a été créé. L'invention couvre également une partie de plante génétiquement modifiée selon 25 l'invention et plus particulièrement un organe de la plante tel que le fruit, le pétale, la fleur, la feuille, la graine, la racine, la tige, un tissu végétal, une cellule ou toute autre partie d'une plante. Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont avantageusement des crucifères telles que les choux, le colza, la moutarde, le navet, la roquette, les giroflées ou 30 le radis. Toutefois, ces modifications génétiques peuvent aussi être réalisées sur toutes plantes d'intérêt agronomique ou horticole qui possèdent également des gènes homologues à AtGIP1 et AtGIP2, tel que les céréales, les arbres fruitiers ou décoratifs, les plantes fruitières, potagères ou décoratives et plus particulièrement, le riz, l'épeautre, le colza, le poivron, la papaye, l'oranger, le caféier, le melon, le fraisier, le gerbera, le soja, 35 la réglisse, l'arbre à coton, le tournesol, le houblon, la laitue, le lotus, le pommier, le 2955114 -10- manioc, la luzerne, les pins, les pois, le tremble, l'abricotier, la canne à sucre, le sésame, l'aubergine, la pomme de terre, le sorgho, le maïs, le blé, la vigne, le peuplier ou le tabac. Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont produites à l'aide d'une méthode comportant l'inhibition de la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii). 5 Avantageusement, cette méthode de production comportera l'inhibition de la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (viii). Cette inhibition pourra par exemple s'effectuer par inhibition de l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (viii) ou par suppression du gène codant pour les protéines (i) à (viii). L'invention vise enfin une méthode pour accroître la taille d'une plante ou d'une partie de la plante dans laquelle on 10 modifie la plante ou la partie de la plante de manière à inhiber la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (viii). Avantageusement, la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (viii) est inhibée. L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent, avec références au figures : 15 - La figure 1 présente les différentes GCPs (« Gamma-tubulin Complex Proteins ») et en particulier les GCP3, leur implication dans les complexes de nucléation des microtubules (Microtubule Organizing Centres ou MTOCs) et leurs homologues dans différentes espèces, identifiées par leur nom ou leur masse moléculaire en kilo Daltons. 20 - La figure 2 présente la séquence nucléotidique complète de la GIP humaine, la partie codante étant indiquée en majuscule. - Les figures 3 et 4 décrivent les séquences d'ADN génomique d'AtGIPl (Fig. 3A) et de la protéine correspondante (Fig. 3B) ainsi que celles d'AtGIP2 (Fig. 4A et 4B). Sur les figures 3A et 4A, sont indiqués les exons, les introns et la 25 séquence codante est repérée par les deux codons d'initiation et de terminaison (ATG et TGA/TAA). Sur les figures 3B et 4B, sont indiqués les prédictions de sites de phosphorylation (S) et celui qui est conservé chez toutes les séquences GIP des eucaryotes (). - La figure 5 présente la comparaison des séquences protéiques d'AtGIP1 et 30 AtGIP2 (Fig. 5A) et la structure tridimentionnelle des GIPs (Fig. 5B). - La figure 6 présente les structures des gènes AT4G09550 de AtGIP1 (Fig. 6A) et AT1 G7379 de AtGIP2 (Fig. 6B) obtenues à partir des sites suivants : http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/AT4G09550 http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/ATlG73790 35 - La figure 7 décrit la région promotrice d'AtGIPl. - La figure 8 est un arbre évolutif des GIPs. 2955114 -11- - La figure 9 compare 115 séquences d'amino acides correspondant à des protéines GIP complètes identifiées dans 72 espèces différentes de plantes. - La figure 10 présente les résultats d'un test in vitro (GST pull-down) entre les GCP 1, 2 et 3 et les GIP1 et 2 d'A. thaliana. Les essais ont été réalisés entre 5 les protéines de fusion à la GST (GST-gamma-tubuline, GST-AtGCP2, GSTAtGCP3, GST-AtGIP1, GST-AtGIP2) et les deux protéines radiomarquées AtGIP1 et AtGIP2. La GST seule a été utilisée comme témoin négatif. - La figure 11 présente les résultats d'un test d'interaction in vivo en système double hybride de levure. 10 - La figure 12 présente les taux comparatifs d'expression des GIPs d'A. thaliana. - La figure 13 présente les résultats de spécificité des anticorps testée par Immunoblotting. - La figure 14 illustre la localisation des GIPs endogènes dans des cellules de 15 tabac BY-2 (A-C) et d'Arabidopsis (D) en division par immunomarquage. - La figure 15 illustre l'immunomarquage de cellules de xénope en culture avec des anticorps (@ : anticorps) polyclonaux de lapin anti-AtGIP1 ou anti- HsGIP (« homo sapiens GIP »). - La figure 16 illustre l'immunomarquage de cellules de xénope en culture 20 avec des anticorps monoclonaux anti-HsGIP. - La figure 17 présente un gel SDS-Page illustrant les résultats de la phosphorylation de la protéine AtGIP1 par la kinase AtAuroral. - La figure 18 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2. 25 - La figure 19 présente les séquences des simple mutants gip1 et gip2 (avec les sites d'insertion des ADN-T) et les résultats d'une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes issues du croisement des simple mutants. - La figure 20 illustre les phases de développement (à 7, 21 et 45 jours après 30 germination, « JAG ») obtenues avec les plantes double mutantes. La figure 21 présente une comparaison deux à deux les taux d'expression de HsGIP dans des tissus sains (barre claire) et cancéreux (barre foncée). - La figure 22 illustre l'apoptose de cellules HeLa et HEK 293 suite à la suppression de GIP par introduction de siRNA dans ces cellules. 35 Exemple 1 : Caractérisation des protéines GIPs

-12- 1. Identification de la protéine GIP1 La protéine GIP1 a été identifiée par criblage double hybride de levure d'une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana (plantules de 3 semaines, Clontech®) en utilisant comme appât la protéine AtGCP3, un des composants essentiels du complexe de nucléation des microtubules. Le gène ainsi révélé est At4g09550 (SEQ ID N°17) dont la séquence est indiquée figure 3. Ce gène code pour une protéine de fonction inconnue, nommée «AtGCP3 Interacting Protein 1 » (AtGIP1).

2. Recherche in silico d'homologues de GIP1 L'analyse des banques de données (http://www.arabidopsis.org/Blast/), a permis d'identifier un gène homologue At1g73790 (SEQ ID N°18) (Figure 4).

La figure 5A présente la comparaison des séquences protéiques d'AtGIP1 et AtGIP2. Sur cette figure, sont indiqués les motifs consensuels (X ), le site potentiel de phosphorylation (S) conservés chez les eucaryotes. Les pseudo leucine-zipper et « D box » sont indiquées par les flèches. Le gène homologue At1g73790 montre donc une forte homologie avec GIP1 et a été ainsi nommé GIP2. Une structure tridimensionnelle théorique des protéines GIP a été obtenue après analyse bioinformatique (Voir figure 5B). Le domaine N-terminal flottant (en haut à droite de la photo de la figure 5B) est suivi de trois hélices alpha et la région la plus conservée entre espèces est la partie C-terminale (en bas à gauche).

L'organisation structurale des gènes AtGIP1 et AtGIP2 a été comparée (Figure 6) et montre des variations importantes dans la partie promotrice suggérant une régulation différentielle. Des cis-éléments régulateurs liés à une activité cycle cellulaireûdépendante sont trouvés dans la région promotrice d'AtGIP1 (Figure 7). D'autres membres de la famille des GIPs ont été identifiés chez les eucaryotes en général et l'Homme en particulier et un arbre phylogénétique a été ainsi réalisé en appliquant la méthode "Neighbor joining" (Figure 8). Il a été trouvé que ces protéines étaient généralement codées par un gène unique par organisme, sauf pour les plantes terrestres où ces protéines sont généralement codées par au moins deux gènes (voir exemple 2).

Elles sont fortement homologues entre-elles (Figure 9) avec une moyenne de d'homologie de 79%. Les acides aminés conservés (ou identiques) et similaires sont

-13- surlignés respectivement de gris foncé et gris clair. Ceci suggère une conservation de leur(s) fonction(s) et des propriétés maintenues tout au long de l'évolution. Elles présentent dans leurs séquences certains motifs proches d'une "D box", un pseudo "leucine zipper" et des sites de phosphorylation potentiels (Figure 5). 3. Vérification de l'interaction AtGCP3-AtGIP1 par GST pull-down Les ADNc d'AtGCP1 ou y-tubuline, AtGCP2, AtGCP3, et AtGIP1 et AtGIP2 ont été clonés dans le vecteur pGEX-2TK et les bactéries E. coli souche Rosetta ont été sélectionnées après transformation. L'expression des protéines de fusion ou de la GST seule a été faite dans cette souche bactérienne. Les protéines solubles de l'extrait ont été fixées sur billes de gluthathion Sépharose 4B. D'autre part, AtGIP1 et AtGIP2 marquées à la méthionine[35S] ont été produites par traduction in vitro dans un lysat de réticulocytes de lapin. Des tests de GST pull-down ont ainsi été menés. Les résultats ont été que seule AtCGP3 interagit avec AtGIP1 (Janski et al., 1997) et AtGIP2, confirmant les résultats obtenus précédemment en système double hybride.

4. Interactants des protéines GIPs d'Arabidopsis thaliana La recherche d'interactants a été réalisée par GST pull down (Figure 10) et par système double hybride (Figure 11).

Sur la figure 10A, est présenté un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie de la fraction liée aux billes de glutathion-sépharose. Les protéines de fusion de taille attendue sont les bandes majoritaires, indiquées par les têtes de flèche claire. Sur la figure 10B , est présenté une autoradiographie du gel, où les protéines radiomarquées (*) de la fraction liée aux billes sont révélées. Aucun marquage n'est retrouvé dans les pistes des témoins négatifs, alors que dans le test de pull-down, AtGIP1 et AtGIP2 ont coprécipité avec la GST-AtGCP3. L'ensemble des autres pistes ne révèle aucune interaction. Il a été démontré (Figure 11) qu'AtGIP2, comme AtGIP1 interagissent précisément avec les 200 premiers acides aminés de la région N-terminale d'AtGCP3. De plus, par système double hybride, une interaction positive supplémentaire a aussi été montrée entre les GIPs elles-mêmes (GIP1-GIP1 et GIP1-GIP2). En effet, sur la figure 11, on constate que non seulement AtGIP1 et AtGIP2 interagissent avec AtGCP3 et entre elles mais également que les GIPs interagissent avec le domaine N-terminal de GCP3 (ri). Ceci suggère que ces protéines puissent former des oligomères in vivo. 5. Données bioinformatiques sur l'expression des GIPs

-14- L'outil "genevestigator" a été utilisé (http://www.genevestigator.ethz.ch/) Les GIPs s'expriment nettement plus dans les tissus jeunes d'Arabidopsis (feuilles) ou méristématiques (apex racinaires et jeunes fleurs) que dans des tissus différenciés. Ceci renforce le lien entre l'expression des protéines GIPs et la division cellulaire en général. Une étude comparative d'expression entre AtGIP1 et AtGIP2 suggère que GIP2 joue un rôle prépondérant lors de la gamétogenèse (Figure 12).

6. Obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre les GIPs Afin de permettre l'étude de ces protéines, des anticorps polyclonaux ont été produits dans des lapins. Deux d'entre eux ont été dirigés contre le peptide d'AtGIP1 suivant DEEASRTARESLEL-(C) (SEQ ID N°19) et ont été commandés à la société Sigma. Quatre autres sérums ont été obtenus par injection d'une protéine de fusion AtGIP1-6His à des lapins des animaleries de l'Esplanade (CNRS-UdS) (Strasbourg, FRANCE) et de l'IGBMC (Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire, Illkirch, FRANCE). En testant les sérums sur différents extraits cellulaires, un marquage spécifique des GIPs d'Arabidopsis a été révélé en Western blot, à la fois par un sérum anti-peptide et un serum anti-GIP1 complète, sur la protéine endogène présente dans des extraits totaux de cellules d'Arabidopsis thaliana (Figure 13A). Une confirmation de reconnaissance antigénique a été obtenue sur extraits de plantes transgéniques exprimant les fusions GIP1:E-tag:eGFP (Figure 13B).

7. Localisation intracellulaire par immunomarquage La localisation des GIPs endogènes a été analysée sur cellules de tabac BY-2 (Nagata et al., 1992 , Int. Rev. Cytol., 132, 1-30) en culture au cours du cycle cellulaire. Sur la figure 14, sont présentés : en première ligne (A)/ colonne (B, D), le marquage anti-GIP, en deuxième colonne (B, D) celui des microtubules, en deuxième ligne (A)/ troisième colonne (B, D) l'ADN. En interphase, GIP entre dans le noyau en G2 puis est exporté en 2 croissants polaires. Un marquage diffus est également visible au niveau du fuseau bipolaire, plus intense au niveau des fibres kinétochoriennes en anaphase-télophase. Une mesure d'intensité des marqueurs fluorescents (analyse d'image par logiciel LSM510) dans une cellule en télophase montre que GIP est localisé aux extrémités polaires des deux cellules filles.

Les cellules BY-2 en interphase révèlent une augmentation de densité du marquage aux pôles nucléaires en fin de phase G2 (croissants nucléaires) correspondant aux sites 2955114 -15- d'initiation de la formation du fuseau mitotique. En mitose, le marquage des régions pôlaires du fuseau reste fort. L'intensité du marquage n'est pas augmentée au niveau du phragmoplaste par rapport au bruit de fond. Un marquage moins intense du nucléoplasme est aussi observé. 5 Ces résultats montrent une localisation des GIPs aux centres organisateurs des microtubules (surface du noyau), suggérant un rôle dans la régulation de l'activité de nucléation. La présence de GIP dans le noyau suggère qu'elle puisse jouer un autre rôle, notamment comme facteur régulateur du cycle cellulaire. 10 Exemple 2 : Homologues d'AtGIP1 et d'AtGIP2 chez les plantes

Des analyses bioinformatiques ont été menées et la recherche d'homologues a été faites parmi les plantes en utilisant principalement l'outil d'alignement BLAST. Les 15 résultats de ces recherches sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Y sont indiqués les numéros d'accession des séquences répertoriées dans NCBI, ainsi que la dénomination utilisée pour la construction de l'arbre phylogénétique (figure 8). Les degrés d'homologie et d'identité entre AtGIP1 et toutes les autres séquences sont indiquées en colonne 5 et 6 de ce tableau. 20 Tableau 1 : Comparaison des GIPs de plantes Nom commun Ref. Database taille (aa) Homologie Identité gblFD440559.1 74 .......................................................................... ................. ........................... 75% 58% ................................ ................................ Gueule de loup emb1AJ799576.1 69 86% 63% .......................................................................... ............................................... ................................................................... Nom Scientifique Amborella trichopoda .................................. Antirrhinum majus .................................. Arabidopsis thaliana Arabidopsis Arabette des thaliana dames .......................................................................... .............. Brassica napus i Colza : Brassica napus Colza : Brassica napus Colza : Brassica napus Colza : Brassica Moutarde oleracea sauvage : Brassica rapa i Navet : Bruguiera gymnorrhiza Capsicum annuum At1g73790 67 87% 76% : .... gb. EE437549 . . . . . .. 1 6...4 :' 8...5.. % 74% gblEE480929.1 68 84% 73% : gblEL625962.1 69 82% 71% : gblEE558825.1 69 87% 78% : gblEE535651.1 69 82% 71% : gbIES936722.1 69 82% 71% : dbj1BP942562.1 73 85% 72% gblGD069637.1 73 80% 64% Poivron Arabette des At4g09550.1 71 dames 100% 100% Ca/icy papaya Papaye gbEX277008 - - 68 85% -- 73% ' ' ' Ca/icy papaya Papaye gbEX258842~1 68 83% 71% ' ' ' Ca/icy papaya Papaye gbEX280432~1 68 83% 71% ' ' ' Ca/icypapaya Pa paya gb~EX270448~1 72 8096 8096 ' ' ' . Ca/icypepeya__.Papaya gbEX272788.1 71 67% 56% Catharanthus Pervenche de gblEG559135.1 83 75% 62% Madagascar roseus Citrmoinemo ' Citrmoinemo ' Oranger doux gbl{~F85358173 82% 73% ' ' Oranger doux gb~{~F8~3278~1 72 70% 61% ............................................. ~ ! ' ' Onangar8a~uma dbjl 00000852.1 -7 3 82% 73% Coffea arabica ~

Coffea oanmphwra Coffea Caféier robusta oanmphwra

.~ ~ Cucumis melo Melon .. . Cucumis melo Melon tetragonoloba Diospyros kaki Plaqueminier Festuca Fétuque arundinacea

'! . Feotuoa Fétuque gblOT705327.1 92 gblGT0188821 80 7096 8296 ' ! ~ ' gblOV8923551 80 83% 67% gblEE200008.1 80 79% 62% amb1AN714745.2 71 88% 73% ~ amb1AN735138.2 72 85% 69% ~ ~ . gblEG979173.1 73 86% 73% dbj.87884. 1 75 8496 8896 ' gblOV1570201 69 85% 71% ~ . gblOT887331.1 92 60% 46% arundinacea ' Fnygariavmooa Fraisier des bois ' Gm/bmny hybrida Gerbera ----------------------------- Glycine max Soja g b 1 73 87% 75% ------------- ------- Glynynhira ----------------------------- Réglisse dbjlFS278006.1 ! ' 78% 74 86% uralensis ......................................... ................. Gossypium Arbre à coton gblBE055018.2 73 84% 69% arboreum ------- ~ ~ Gossypium Coton mexicain gblOVV512305.1 73 84% 69% hirsutum ' --------------- ------- Guizotia Niger gblGE569580.1 69 85% 71% abyssinica Tournesol gblCD854455.1 69 000/ 780/ Helianthus annuus ......................................... ................. Helianthus Tournesol gblGE518208.1 69 89% 74% annuus ' ------- Helianthus exilis Tournesol gblEE880243.1 69 90% 76% serpentine .. ... ....... gblE8852488.1 67 83% 64% Kadua gblCB0845001 73 870/ 680/ centranthoides ------- ` ' 730501 75 87. 7~6 gblDW173950.1 --------------- ------- ------------------ 74 87~ Lotus japonicus : Lotus _. gbG0020820.1 786 ------- ------------------- 73 86% gblOR0801821 73% uniflorum Cafeler d Arable Caféier robusta ---' ---' ....................... ................... .% gblOV4302881 72 818396 ~ b 69 87% 76% ' ' ---' . . .. .. . ! . ! .. Maluox Pommier gblCNO285501 72 91% 78% domestica Pommier gblOR000583.1 72 040/ 780/ Malus x domestica Manioc gblFF535362.1 72 83% 75% Manihot esculenta . . ~ ~~ ~ Man/hct Manioc dbjlO8042088.1 75 76% 62% esculenta ! . ................. 65% 53% dbjl8J8478131 70 polymorpha ........................................ ' ------- Medicago Luzerne tronquée 1 71 83% 69% trunculata __- Medicago Luzarna~onquéa gblEY4774521 71 830/ 800/ ~~~~~~^ .~ Nicotiana gblE8802453.1 74 82% 68% langsdorffii ~ Nicotiana Tabac amb1AN824302.1 74 82% 68% tabacum ------- ' ----------' Nicotiana Tabac gblFG8280531 71 92% 78% tabacum ................. ......................................... Nicotiana Tabac amblAM703301.1 71 81% 67% tabacum Tabac gblFG8401181 82 7196 5096 Nicotiana tabacum ' O/yzaoabwy RizgblCF989340.1 000096 4596 O/yzaoabwy Riz b 1 99 60% 48% Panicum Panic érigé gblFL0248171 74 76% 58% virgatum ---' ' Panicum Panic érigé gblFE507824.1 95 61% 45% virgatum Panic érige gblFL838883.1 95 8196 4596 Panicum virgatum ......................................... Petunia axillaris Péb~nia amblFN015871~1 75 81% 65% '! ~ ............. . ~ 73% 61% patmns ......................................... ................. Physcomitrella gblFC370781.1 68 71% 57% patens Epinette blanche gblEX355173.1 69 820/ 8806 Picea glauca Epinette blanche gblEX398197.1 69 7296 57% Epinette blanche gblEX346914.1 69 8896 5396 ~o~~tcheno Epinette de Sitka gblOR534840.1 69 ~ 7496 59% ' --------- ' Pin tordu gblGT2823851 Pinus contorta 69 82% 68% ' ------------------------------ ' ----- Pinus taeda Pin à torches gbl8G318023.1 69 82% 68% ' ' ----- ------------------------------ Pois gblFG5310071 Fisumoabvum 71 83% 69% --------------- ------- Populus Peuplier de gblCX1800181 ~ ' 85% 66% 74 dmltwkdeo Virginie 70 810/ 800/ Populus Peuplier de gblCX174820.1 deltoides Virginie ' Pwpuù/oni/ny Peuplier noir dbjlO8801100.1 70 81% 69% ' Populuotremula Tremble gbI 8U8~0~1 ~ ~~ ~~ ! ~ ~ ~ ' ` .. Populus Peuplier de gblCV2485451 74 85% 66% trichocarpa l'Ouest Populus Peuplier de gblOT404575.1 70 8196 8096 trichocarpa l'Ouest .............................. --------------- Prunus Abricot gblCVO46837.1 72 81% 68% armeniaca .~ gblEX750388.1 68 86% 74% Raphanuo Ravenelle raphanistrum ' ................. Ronce à feuille gblFF8841381 71 88% 67% - d'orme ' ----.... ~ ' ------- Saccharum Canne à sucre gblCA2807111 98 56% 41% officinarum Saccharum Canne a sucre gblCA2418001 98 8596 4896 officinarum ~ Saccharum Canne à sucre gblCA2785801 96 58% 41% officinarum . . turkestanica dbjlAB492074.1 ~ 67% 70 88% '! ~ ' 85% ' Smoanu/nr Sésame gblBU8883351 72 72% indicum ......................................... ....................... ' Solanum gblON083202.1 73 85% 68% chacoense Aubergine dbj1F8088588.1 73 8496 8896 Solanum nnelwngmna .. . ~ .................... ....... Solanum Pomme de terre gblCX182780.1 76 85% 68% tubermum . . Solanum Pomme de terre gblCV4082141 ~ 68% 76 82% tuberosum gblCX8080001 4396 95 gblCN200111.1 71 7896 5796 Taraxacum kok- Pissenlit de gblOR402085.1 72 8496 7596 saghyz Russie ' ' ' Taraxacum Pissenlit gblDY839988.1 72 84% 69% officinale ........................................ ' ' ------- Triticum Blé tendre gblCD881387.1 95 57% 44% aestivum .............................. .~ 7ribounr Petit épeautre gblBQ802487.1 95 60% 46% monococcum . . ' --------- ' ' Triticum Petit épeautre gblBQ803820.1 94 61% 44% monococcum gblFG909268.1 73 850/ 730/ Vigna unguiculata ........................................ ' ' ' Vigna gbl FF382276.1 73 84% 72% unguiculata ' Vitis vinifera Vigne gblCO802282.1 73 81% 72% ------------------------------ ' ' Vitis vinifera Vigne gb~~A8178381 73 80% 7196 ------------------------------ ' ' Vitis vinifera Vigne gb~E{~0022331 73 79% 67% .............................................................. Vitis vinifera Vigne gbE.001710.1 73 85% 67% Welwitschia gblCK767759.1 72 73% 58% mirabilis Maïs gblFL065038.1 96 560/ 410/ Zea mays .......... ............ ~ ' ^ `-'`-'` ' 2955114 -19- .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... ............ . . Zea . mays Maïs gb. FL1 . . . 52568.. 1 96 56% 41% : : 7% 43%.* Zea . mays Maïs gblCF631 . 456 . . .1 96 : :....5 8% . Zea . mays Maïs gb. FL065041 . . . . . . .. 1 98 42% : : 5 . Zostera . marina Zostère . .marine . emb1AM771477.1 86 61% 44% ; : ; : moyennes 75,576577 79% 65% On notera que les 115 séquences sont généralement courtes et très conservées. En outre, elles correspondent à des protéines de fonction encore inconnue. Les séquences possèdent entre 64 et 98 acides aminés et présentent un fort pourcentage 5 d'identité et d'homologie. La méthode de calcul des pourcentages a été générée par rapport à AtGIP1 (ClustalW avec matrice de Gonnet contre AtGIP1 et AtGIP2 simultanément). Il a été constaté que la présence de plus d'un gène GIP se généralise pour les plantes terrestres et s'est donc produit par duplication au cours du Silurien/Dévonien (ère 10 primaire). Cette duplication s'est conservée jusqu'aux plantes les plus évoluées analysées (Angiospermes) dont on connaît le génome complet. Exemple 3 : Protéines GIP chez les animaux 15 Comme dans l'exemple 2, sont indiqués dans le tableau 2, les numéros d'accession des séquences répertoriées dans NCBI, ainsi que la dénomination utilisée pour la construction de l'arbre phylogénétique (figure 8). Les degrés d'homologie et d'identité entre HsGIP et toutes les autres séquences sont indiquées en colonne 5 et 6 de ce tableau. 20 Tableau 2 : Comparaison des GIPs d'animaux Nom Scientifique Nom commun Ref. Database taille (aa) Homologie Identité Acropora palmata Corail corne d'élan gblEY024092.1 72 71 % 44 % Aedes aegypti Moustique gblDV279112.1 85 50 % 27 % Ca/anus finmarchicus Copépode gbIEL965448.1 101 56 % 38 % Capitella sp. Annélide gblEY518366.1 76 79 % 58 % Ciona intestinales Cione intestinale gblFF977949.1 65 56 % 43 % Crassostrea gigas Huître creuse du gblFP000860.1 70 74 % 58 % Japon -20- Nom Scientifique Nom commun Ref. Database taille (aa) Homologie Identité Cryptosporidium gbIEAL37150.1 66 56 % 31 % hominis Danio rerio Poisson zèbre gblBG305388.1 75 83 % 72 % Drosophila Mouche du vinaigre gbIHDC08084.1 82 44 % 21 % melanogaster Gallus gallus Coq doré refINP_0011578 72 79 % 78 % 22.1 Homo sapiens Homme gblEAW80513.1 79 100 % 100 % Litopenaeus vannamei Crevette pattes gbIFE090915.1 74 66 % 48 % blanches Monosiga brevicollis gblEDQ89917.1 >62 53 % 46 % Plasmodium embICAD52532 72 56 % 38 % falciparum .1 Schistosoma Schitosome gbIBU714295.1 83 48 % 26 % japonicum Toxoplasma gondii gblEEA98898.1 92 55 % 36 % Trichoplax adhaerens gblEDV20763.1 118 48 % 37 % Xenopus laevis Dactylère du Cap gblBG162997.1 72 96 % 78 % Comme dans l'exemple précédent, les 18 séquences sont généralement courtes et très conservées. Elles correspondent également à des protéines de fonction encore inconnue. Les séquences possèdent entre 62 et 118 acides aminés et présentent un fort pourcentage d'identité et d'homologie.

Exemple 4 : Immunomarquade de cellules de xénope en culture avec des anticorps polvclonaux de lapin anti-AtGIP1 ou anti-HsGIP Les protéines recombinantes HsGIP et AtGIP1 clonées dans le vecteur pET102D ont été produites dans E.coli et purifiées sur résine de nickel. La production d'anticorps à été confiée à l'animalerie de l'IGBMC (Strasbourg). Les fractions IgG ont été utilisées sur des cellules de xénope en culture fixées au méthanol pour des immunomarquages. Les anticorps primaires ont été révélés par des anticorps secondaires fluorescents anti-lapin et les observations faites par microscopie confocale. Les structures révélées sont les noyaux avec les anti-AtGIP1 (@AtGIP ù figure 15a) et les centrosomes/pôles fusoriaux avec les anti-HsGIP (@HsGIP - figure 15b) ou encore les centrosomes et le midbody

-21- (figure 15c). Le marquage simultané de l'ADN (DAPI) et des microtubules (@tubuline) permet de confirmer ces localisations. La superposition des 3 canaux est présentée dans les photographies indiquées par « fusion ».

Exemple 5 : Préparation d'anticorps monoclonaux anti-GIP et immunomarquage

Les phases codantes des protéines AtGIP1 et HsGIP (homo sapiens GIP) ont été amplifiées par PCR avec le Phusion® Master Mix de la société New England Biolabs et clonées dans le vecteur d'expression procaryotique pET102D-TOPO (InvitrogenTM) L'expression des différentes protéines a été réalisée dans les cellules E.coli BL21(DES3) après induction à l'IPTG (Isopropyl R-D-1-thiogalactopyranoside). La purification a été réalisée sur résine Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). Les protéines recombinantes ainsi obtenues ont été utilisées par la société AbD Serotec pour le criblage d'une banque de F(ab')2 d'anticorps humains HuCAL® GOLD. Les sept meilleurs clones sélectionnés ont été requalifiés par test Elisa et purifiés sous la forme de 250 pg de dimères F(ab')2 en fusion avec une phosphatase alcaline bactérienne et portant les épitopes V5 et Strepll. Des cellules de xénope (les séquences de GIP humaine et xénope étant quasi identiques) en culture ont été fixées au méthanol et utilisées pour des tests d'immunolocalisation avec les anticorps sélectionnés à une concentration de 0,001 pg/pL. Des anticorps secondaires fluorescents anti-F(ab')2 humain ou anti-V5 ont été utilisés pour révéler les anticorps primaires par microscopie confocale. Les structures cellulaires suivantes ont été révélées de façon plus ou moins intense selon l'anticorps primaire utilisé : noyaux, pôles fusoriaux, centrosomes, fuseau mitotique ainsi que les midbodies (voir figure 16). La figure 16a illustre l'immunomarquage avec l'anticorps monoclonal N°1 (HsGIP N°1) qui marque les noyaux et les pôles des fuseaux mitotiques. Le midbody est aussi révélé avec cet anticorps (Figure 16b). Le marquage avec l'anticorps monoclonal N°4 (Figure 16c) révèle le fuseau métaphasique et le midbody à l'équateur entre les deux noyaux fils.

Exemple 6 : Phosphorvlation de la protéine AtGIP1 par la kinase AtAuroral

Les protéines recombinantes AtGIP1 et AtAuroral clonées dans le vecteur pET102D ont été produites dans E.coli et purifiées sur résine de nickel.

Des réactions de phosphorylation sont effectuées avec au moins 400 ng de chaque protéine dans des volumes réactionnels de 20 pL en présence de 10 pCi de 32P

-22- y-ATP pendant 30 minutes à température ambiante. Le tampon réactionnel a la composition suivante : 10 mM Tris HCI pH 7,5, 100 mM KCI, 2 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2. Les protéines sont alors séparées par SDS-PAGE. Le gel est fixé/coloré dans une solution éthanol/acide acétique/bleu de coomassie puis séché et autoradiographié pour révéler les protéines radiomarquées (phosphorylées). Une kination de la protéine AtGIP1 est ainsi révélée (figure 17 en bas du gel à droite) indiquant que les protéines GIP sont des substrats, et leur dérivés des possibles inhibiteurs, pour les kinases de type Aurora (voir figure 17 - AtAurora : contrôle avec kinase seule ; marqueur de PM : marqueur de poids moléculaires de référence ; AtAurora/AtGIP1 : essai avec en mélange kinase et GIP). La moitié gauche de la figure représente le gel SDS-PAGE coloré au bleu de coomassie. La moitié droite correspond à l'autoradiographie de ce même gel pour révéler les protéines radiomarquées.

Exemple 7 : Mutants d'insertion d'ADN-T et endoréduplication 1. Origine et caractérisation génétique Une lignée d'Arabidopsis thaliana provenant de la collection GABI-Kat (http://www.GABI-Kat.de) (Bielefeld, Allemagne) et correspondant au mutant 213D01-014134 a un ADN-T inséré dans l'intron en amont de la séquence codante du gène GIP1.

Le mutant gip2 provient de l'INRA (Versailles, France) (364E06 ou 615G11) et l'insertion est située en partie 5'UTR de l'exon. Les plantes homozygotes gip1 comme gip2 ne présentent pas de phénotype très significatif au cours du développement comparées à des plantes sauvages. En revanche des doubles homozygotes gip1 gip2 présentent un phénotype très fortement affecté dans le développement et la croissance. En effet, la figure 18 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2 : A. Plantules 6 jours après germination. Le mutant présente un retard de germination par rapport au témoin à cotylédons déployés. B. Plantules WT (gauche) et mutantes (droite) après 6 jours de germination à l'obscurité.

L'allongement de cellules de l'hypocotyle est marqué chez les 2 types de plantules. C, D. Pointes de racine WT et mutées marquées au DAPI. E, F. Racines de mutants présentant des vrilles et des anomalies de l'épiderme à différenciation précoce. G. Coloration de l'amidon au lugol.

H. Coloration des parois à l'iodure de propidium. Le méristème et la coiffe sont affectés 2955114 -23- Des analyses géniques ont confirmé la présence des ADN-T dans les allèles de GIP 1 et GIP2. La figure 19 présente les résultats d'une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes : 5 A. Position de l'insertion d'ADN-T dans les séquences de gipl et gip2. B. Présence des ARNm de GIP1 et GIP2 chez ColO (ligne 2) et d'ARNm de GIP1 dans les plantes gipl/+ gip2/gip2 (ligne 3) et l'ARNm de GIP2 chez les plantes gipl/gip1 gip2/+ (ligne 4). Absence des transcrit de ces gènes dans les plantes double mutantes gipl/gipl gip2/gip2 (ligne 6). Cependant, la présence d'une faible quantité de transcrits de GIP1 10 chez les plantes gipl/gipl gip2/+ (ligne 4) et gipl/gipl gip2/gip2 (ligne 5) a été observée. Par conséquent, des ARNm de GIP1 ont été parfois détectés en faible quantité par PCR semi-quantitative, suggérant la présence résiduelle possible de protéines GIP1 chez certains double mutants. Ceci peut être à l'origine de la variété de stades développementaux observés. En effet, la germination des graines semble être stoppée au 15 cours de son développement selon la persistance ou non de l'expression de protéine GIP1. Ainsi, soit la germination est totalement inhibée (létalité du double mutant knock out), soit elle est perturbée à des niveaux variables (double mutants knock down).

2. Anomalies cellulaires et tissulaires des mutants gip 20 Le phénotype observé révèle des anomalies dans l'organisation des méristèmes racinaires (Figure 18) et caulinaires. Un grand nombre de cellules présente des anomalies de ploïdie, suggérant de l'endoréduplication (Figure 18 D). La figure 20 illustre le développement des plantes double mutantes (C, D) en comparaison avec les plantes témoins (A, B) à 7, 21 et 45 JAG (jours après germination). 25 La figure 20E présente la hampe florale du mutant (droite) comparée au témoin (gauche). Les fleurs de plantes sont illustrées en F : témoin, G : hétérozygote GIP1+/- gip2-1- et H,l : homozygotes gipl gip2. En figure 20J, sont présentés les organes floraux après éclaircissement de Hoyer. En figure 20K, est présenté un diagramme de mesures de ploïdie des boutons floraux. Enfin, les figures 20 L-P présentent le détail d'une étamine 30 avec stomates, rares microspores et cellules lignifiées (L-O) et illustre l'arrêt précoce du développement des ovules (P). Parmi les plantules développant une hampe florale, des anomalies de croissance et différenciation restent importantes. Une analyse comparée de la morphologie des fleurs double mutantes gipl gip2 et sauvages montre que le développement des verticilles 35 floraux et la gamétogenèse sont perturbés, rendant ces plantes stériles. Une analyse de 2955114 -24- la ploïdie des boutons floraux par FACS confirme un accroissement de ploïdie de 2C jusqu'à 32C (Figure 20K). Le cytosquelette microtubulaire des double mutants gip1 gip2 est modifié par rapport à celui de plantules témoins. Les cellules résultant d'endoréduplication, de taille 5 très largement supérieures à la moyenne présentent des microtubules corticaux entrecroisés, indiquant une perte de polarité de croissance. Les figures de division observées montrent des fuseaux bipolaires massifs souvent obliques, conduisant à une perte de l'organisation des cellules en files régulières. L'ensemble de ces résultats montre que les protéines GIPs joue un rôle d'une part 10 dans la formation et/ou l'organisation du cytosquelette et d'autre part dans la régulation du cycle cellulaire et la maintenance du génome, éléments essentiels au développement des plantes et des êtres vivants en général.

Exemple 8 : Sur-expression de la protéine GIP dans les cellules cancéreuses 15 La base de donnée IST (In Silico Transcriptomics - www.genesapiens.org) a été utilisée afin de déterminer les niveaux d'expression de HsGIP (ENSO00000204899) dans les collections de cette base de donnée. Elle regroupe 3670 échantillons concernant plus spécifiquement l'expression de HsGIP tant dans des tissus sains que dans des tissus 20 cancéreux. Une extraction de ces données par type cellulaire permet de corréler un taux d'expression de HsGIP anormalement élevé dans de nombreux cancers (voir figure 21). Sur cette figure, sont comparés deux à deux les taux d'expression de HsGIP dans des tissus sains (barre claire) et cancéreux (barre foncée). Dans tous les cas, les taux d'expression de HsGIP sont supérieurs dans les tissus cancéreux. 25 Exemple 9 : Induction de l'apoptose d'une cellule par inhibition de la protéine GIP

Trois siRNA double brins ont été conçus puis commandés à la société Sigma. Les séquences sens sont respectivement : 30 - GAACGUGGCUCCAAAUUCA - GGACGUUCUGCUUGAGAUU - GAAUUAACCCAGAAGCUUU Dans une plaque 12 puits, sont placées, au fond de chaque puits, des lamelles rondes stériles. Les cellules HeLa ou HEK 293 sont mises à cultiver dans 1 mL de milieu 35 de culture constitué par du milieu modifié de Dulbecco (DMEM-InvitrogenTM) supplémenté par 10% de sérum foetal de veau (FBS-InvitrogenTM) pendant 24 heures à 37°C afin

-25- d'obtenir une confluence de 30 à 50%. Les cellules sont alors transfectées avec 2 pL de LipofectamineTM 2000 (InvitrogenTM) et 25 ou 100 nM final de siRNA selon le protocole du fournisseur. Le milieu de culture est changé 24 h après transfection par du milieu frais (DMEM, 10% FBS) puis les cellules sont encore laissées 24 heures supplémentaires en culture. Le milieu est alors éliminé puis remplacé par la solution de fixation à 37°C constituée par du tampon PBS + 4% formaldéhyde. Cette solution est remplacée 15 minutes plus tard par une solution de PBS-borohydrure de sodium (1 mg/mL) pendant trois fois 10 minutes. Après un dernier rinçage au PBS, les lames sont utilisées pour visualisation au microscope en présence de DAPI afin d'observer le matériel chromosomique et les figures d'apoptose (voir figure 22). Sur cette figure, est illustré l'introduction de siRNA dans des cellules HeLa : 22A. Contrôle sans siRNA.

22B. Contrôle négatif siRNA.

22C, 22E. Deux SiRNA dans la séquence codante d'HsGIP sur cellules Hek 293.

22D, 22F. Les mêmes siRNA dans la séquence codante d'HsGIP sur cellules HeLa. On peut constater que les noyaux des cellules sont fortement fragmentés, le cytosquelette microtubulaire ne se forme plus et que les cellules meurent.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS1. Polypeptide isolé dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence consensus SEQ ID N°1: [M I LVT]-X-X-X-[LV]-X-X-X-[LIVF]-[DTS]-X-X-X-[LI FVM]-X-X-[CLIAVF]-[I LVM E]-X- [LM FVA]-X-X-X-G-X-X-[PGA]-X-X-[LIV]-[VIAS]-X-[Vl LAW]-[Vl FLG]
2. 2. Acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence consensus SEQ ID N°1.
3. 3. Polypeptide isolé selon la revendication 1, dont la séquence d'aminoacides 10 comprend la séquence consensus SEQ ID N°2: [LVIA]-X-X-[I LVMT]-[SAN]-X-[I LYVM]-[LV]-X-X-[G DNQ]-[LIV]-[DTS]-X-X-X-[L I FVM]-X- X-[CLIA]-[VLI]-X-[LM]-X-X-X-G-[VIA]-X-[PG]-X-X-[LI]-[ASV]-X-[VI LA]-[IVFL]-X-X- [L I MVA]
4. 4. Acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine 15 comprenant la séquence consensus SEQ ID N°2.
5. 5. Polypeptide isolé selon la revendication 3, dont la séquence d'aminoacides comprend la séquence SEQ ID N°3 : MASSSGAGAAAAAAAANLNAVRETMDVLLEISRILNTGLDMETLSICVRLCEQGINPE ALSSVI KELRKATEALKAAENMTS 20
6. 6. Acide nucléique isolé codant pour une protéine ou un fragment de protéine comprenant la séquence SEQ ID N°3.
7. 7. Acide nucléique isolé dont la séquence de nucléotides comprend la séquence SEQ ID N°4 : ATGGCGAGTAGCAGCGGTGCTGGGGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCGGCGAATC 25 TGAATGCGGTGCGGGAGACCATGGACGTTCTGCTTGAGATTTCAAGAATTTTGAA TACTGGCTTAGATATGGAAACTCTGTCTATTTGTGTACGGCTTTGTGAACAAGGAA TTAACCCAGAAGCTTTATCATCG GTTATTAAGGAGCTTCG CAAGGCTACTGAAG C ACTGAAGGCTGCTGAAAATATGACAAGCTGA
8. 8. Méthode in vitro d'induction de I'apoptose chez une cellule, caractérisée en ce que 30 en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (iv) est inhibée : (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2 (iii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°3 (iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, 35 ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 2955114 -27-
9. 9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle la phosphorylation d'une des protéines (i) à (iv) par une kinase Aurora est empêchée.
10. 10. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est inhibée. 5
11. 11. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle l'inhibition de l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est obtenue par insertion d'une molécule d'ARN interférant (siRNA).
12. 12. Molécule d'ARN interférant isolée comprenant au moins une portion qui s'hybride avec un acide nucléique selon la revendication 2, 4, 6 ou 7.
13. 13. Molécule d'ARN interférant isolée selon la revendication 12, comprenant un brin d'ARN choisi parmi les séquences suivantes : - GAACGUGGCUCCAAAUUCA (SEQ ID N°6), - UGAAUUUGGAGCCACGUUC (SEQ ID N°7), - GGACGUUCUGCUUGAGAUU (SEQ ID N°8), AAUCUCAAGCAGAACGUCC (SEQ ID N°9), GAAUUAACCCAGAAGCUUU (SEQ ID N°10), et - AAAGCUUCUGGGUUAAUUC (SEQ ID N°11).
14. 14. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle la molécule d'ARN interférant est une molécule selon la revendication 12 ou 13.
15. 15. Molécule d'ARN interférant isolée selon la revendication 12 ou 13, pour une utilisation comme médicament.
16. 16. Utilisation d'une molécule d'ARN interférant selon la revendication 12 ou 13, pour la fabrication d'un médicament contre le cancer, en particulier le cancer du col de l'utérus, du sein, du colon, du cerveau.
17. 17. Composition pharmaceutique comportant une molécule d'ARN interférant selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.