WO2011059112A1 - 粒子含有細胞集合体 - Google Patents

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WO2011059112A1
WO2011059112A1 PCT/JP2010/070630 JP2010070630W WO2011059112A1 WO 2011059112 A1 WO2011059112 A1 WO 2011059112A1 JP 2010070630 W JP2010070630 W JP 2010070630W WO 2011059112 A1 WO2011059112 A1 WO 2011059112A1
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cells
particles
cell
cell aggregate
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PCT/JP2010/070630
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田畑泰彦
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
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    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a cell aggregate containing particles for improving cell viability and biological function, and a culture method thereof.
  • Fibronectin production from cells is significantly increased by culturing aggregated cells compared to culturing cells alone (Glimelius B et al., APMIS, 1988), and ES cells are embryos that are aggregates. It has also been found that differentiation is promoted by formation of striatum (EB) (Smith AG et al., Nature, 1988). From such a background, self-assembly of cells is an important technique from the viewpoint of cell biology and cell transplantation.
  • EB striatum
  • microcarrier culture that promotes the production of useful products such as bioactive proteins is being promoted by genetically manipulating cells and culturing them on microcarrier particles.
  • the microcarrier culture method since the cells can be grown only on the surface of the microcarrier, the number of cells that can be grown is limited. As a result, the production efficiency of useful substances is low. Therefore, in recent years, a culture method using cell aggregates has been studied as one method for solving this problem.
  • this method can increase the number of cells and the production ability of important useful substances is also increased (Nam JH, et al. Biotech Prog. 23 (3) .652). -660.2007).
  • the cells inside the aggregate weaken, and the ability to produce useful substances has been problematic.
  • In vitro cell assembly technology, and then applying this technology to two types of cells to promote cell organization is one of the future directions of current embryology and cell biology. .
  • Cell aggregation is one of the key technologies. against this background, it has been desired to develop a device and methodology for continuing the culture even when the cell aggregate size increases.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an aggregate of cells that can be stably cultured for a long period of time, and a material therefor.
  • a cell aggregate containing particles can be obtained by culturing cells with bioabsorbable particles.
  • the particle-containing cell aggregate prepared according to the present invention facilitates the diffusion and exchange of substances between the inside and outside of the cell aggregate, which enables long-term culture of the aggregated cells, improving cell function and differentiation. Can promote.
  • This technology will advance biomedical research on cells using cell aggregates and drug discovery research that examines the metabolism and toxicity of drugs in cells. Moreover, it can be expected to improve the production ability of useful substances using cell aggregates.
  • the cell assembly technique using these particles can be applied to hybrid artificial organs in which cells having functions such as liver, pancreas, and kidney cells are encapsulated with hydrogel for the purpose of immune isolation.
  • encapsulating limits the diffusion and supply of nutrients and enzymes to the cells in the interior, and the diffusion and removal of waste products are worsened, deteriorating the cell environment.
  • it is effective to create a cell aggregate composed of those cells and particles and enhance the cell function.
  • the therapeutic effect can be improved. That is, the present invention provides a particle-containing cell aggregate composed of cultured cells and gelatin hydrogel particles.
  • the gelatin hydrogel particles comprise a cell growth factor.
  • the present invention also provides a method for producing a particle-containing cell aggregate, which comprises culturing cells in a culture solution containing gelatin hydrogel particles.
  • a method for producing a particle-containing cell aggregate which comprises culturing cells in a culture solution containing gelatin hydrogel particles.
  • the presence of the particles increases the efficiency of nutrient supply, oxygen supply, and removal of waste products from the cell aggregate, and the cell state is improved.
  • cell-cell interaction is efficiently performed in a manner close to the state in the body, and long-term culture of cells can be achieved. Long-term culture is expected to expand cell differentiation and functional expression, and greatly expand research.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application Nos. 2009-260192 and 2010-050399, which are the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1 shows the number of viable cells when the cells are cultured alone or with gelatin hydrogel particles.
  • FIG. 2 shows the number of living cells in the particle-containing aggregate when a cell aggregate is formed by changing the ratio between the number of cells and the number of particles.
  • FIG. 3 shows BrdU incorporation into particle-containing cell aggregates. Immunostaining for BrdU (left); counterstaining of the same section with hematoxylin (right).
  • FIG. 4 shows the production of sulfated glycosaminoglycans (sGAGs) in particle-containing and particle-free cell aggregates.
  • ⁇ Cell aggregate containing particles
  • ⁇ Cell aggregate not containing particles.
  • FIG. 5 shows a nuclear staining image of a cross section of a cell aggregate containing particles.
  • FIG. 6 shows the number of viable cells in the cell aggregate when cultured with the ratio of the number of seeded cells / number of added particles changed. * , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates not containing fine particles. # , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates having 1 ⁇ 10 2 added fine particles. * , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates having 1 ⁇ 10 3 added fine particles.
  • FIG. 7 shows the number of viable cells in the cell aggregate when cultured with varying particle size. * , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates not containing fine particles. ⁇ , p ⁇ 0.05; significantly different from aggregates with swollen particle size of 17.67 ⁇ 7.4 ⁇ m.
  • FIG. 8 shows the glucose consumption of cell aggregates containing particles. * , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates not containing fine particles. ⁇ , p ⁇ 0.05; significantly different from aggregates with swollen particle size of 17.67 ⁇ 7.4 ⁇ m. ⁇ , p ⁇ 0.05; significantly different from aggregates with swollen particle size of 47.9 ⁇ 22.2 ⁇ m.
  • FIG. 9 shows the L-lactic acid production / glucose consumption ratio of cell aggregates containing particles. * , P ⁇ 0.05: Significantly different from aggregates not containing fine particles.
  • the gelatin hydrogel particles used in the present invention are fine-particle gelatin hydrogels obtained by forming chemical crosslinks between gelatin molecules using various chemical crosslinkers.
  • Gelatin can be obtained by modifying collagen collected from animals and plants by various treatments such as alkaline hydrolysis, acid hydrolysis, and enzymatic degradation.
  • Gelatin which is a modified form of recombinant collagen, may be used.
  • the hydrogel contains a large amount of water, so that water-soluble nutrients, enzymes, waste products, and the like easily diffuse and move.
  • the particles that can be used in the present invention can be particles made of any material as long as they have the properties of the above-mentioned hydrogel.
  • particles made of hydrogel obtained by chemically crosslinking water-soluble synthetic polymers such as polyacrylamide, polyacrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylate, and polyvinyl alcohol, polysaccharides, proteins, and the like.
  • water-soluble synthetic polymers such as polyacrylamide, polyacrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylate, and polyvinyl alcohol
  • polysaccharides examples include, but are not limited to, glycosaminoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, starch, glycogen, agarose, pectin, and cellulose.
  • Proteins include, but are not limited to, collagen and its hydrolysates gelatin, proteoglycan, fibronectin, vitronectin, laminin, entactin, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, etc. .
  • particles made of a material that can be degraded by cells are suitable for the present invention, and more preferably particles made of gelatin.
  • cell adhesion proteins and peptides such as collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, glycosaminoglycan and the like.
  • a condensing agent that forms a chemical bond between water-soluble carbodiimide such as EDC, propylene oxide, diepoxy compound, hydroxyl group, carboxyl group, amino group, thiol group, and imidazole group can be used. Preference is given to glutaraldehyde.
  • Gelatin can also be chemically crosslinked by heat treatment, ultraviolet irradiation, electron beam irradiation, and the like. These crosslinking treatments can be used in combination. The degree of crosslinking of gelatin can be appropriately selected according to the desired water content, that is, the level of bioabsorbability of the hydrogel.
  • the preferred ranges of the gelatin and cross-linking agent concentration when preparing the gelatin hydrogel are a gelatin concentration of 1 to 20 w / w% and a cross-linking agent concentration of 0.01 to 1 w / w%.
  • the crosslinking reaction conditions There are no particular restrictions on the crosslinking reaction conditions, but the reaction can be carried out, for example, at 0 to 40 ° C. for 1 to 48 hours.
  • concentration of gelatin and the crosslinking agent and the crosslinking time increase, the degree of crosslinking of the hydrogel increases, and the bioabsorbability of the gelatin hydrogel decreases.
  • thermal dehydration crosslinking may be performed at high temperature under reduced pressure.
  • the thermal dehydration crosslinking can be performed at 80 to 160 ° C., preferably 120 to 140 ° C. for 1 to 48 hours under a reduced pressure of about 0.1 Torr, for example.
  • Gelatin hydrogel particles are, for example, equipped with a stirring motor (eg, Shinto Kagaku Co., Ltd., Three One Motor, EYELA miniDC Stirrer, etc.) fixed to a three-necked round bottom flask and a Teflon (registered trademark) propeller.
  • a gelatin solution is put in a device fixed together with olive oil, and then oil such as olive oil is added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to obtain a W / O type emulsion.
  • aqueous gelatin solution previously pre-emulsified in olive oil (for example, using a vortex mixer Advantec TME-21, a homogenizer, polytron PT10-35, etc.) is dropped into olive oil to form finely divided W /
  • An O-type emulsion may be prepared, and an aqueous crosslinking agent solution may be added thereto to cause a crosslinking reaction.
  • the gelatin hydrogel particles thus obtained are collected by centrifugation, washed with acetone, ethyl acetate, etc., and further immersed in 2-propanol, ethanol, etc. to stop the crosslinking reaction.
  • the obtained gelatin hydrogel particles are sequentially washed with distilled water containing 2-propanol, Tween 80, distilled water or the like, and then used for cell culture.
  • gelatin hydrogel particles agglomerate for example, a surfactant or the like may be added or sonication (preferably within about 1 minute under cooling) may be performed.
  • the average particle size of the obtained gelatin hydrogel particles varies depending on the gelatin concentration at the time of preparing the above-mentioned particles, the volume ratio of the gelatin aqueous solution and olive oil, the stirring speed, and the like. In general, the particle size is 500 nm to 1000 ⁇ m, and particles having a necessary size may be appropriately screened and used according to the purpose.
  • particle size may be described as “particle size”. “Particle size” and “particle size” are used interchangeably. Further, by pre-emulsification, fine gelatin hydrogel particles having a particle size of 50 nm to 20 ⁇ m or less can be obtained. Furthermore, particles having a size of 50 nm to 1 ⁇ m can be obtained by causing phase separation from the aqueous solution state and self-assembling. Phase separation is achieved by a known technique such as addition of a second component, change in pH of an aqueous solution, ionic strength, and the like.
  • a preferred particle size in the present invention is about 50 nm to 1000 ⁇ m, particularly about 500 nm to 1000 ⁇ m, more preferably about 1 ⁇ m to 200 ⁇ m, and further preferably about 10 ⁇ m to 160 ⁇ m.
  • Another method for preparing gelatin hydrogel particles includes the following method. Olive oil is put in the same apparatus as the above method, and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm. A gelatin aqueous solution is dropped here to prepare a W / O type emulsion. After cooling this, acetone, ethyl acetate, etc. are added. In addition, the mixture is stirred and uncrosslinked gelatin particles are recovered by centrifugation.
  • the collected gelatin particles are further washed with acetone, ethyl acetate, etc., then 2-propanol, ethanol, etc., and then dried. At this stage, particles having a necessary size may be appropriately screened according to the purpose.
  • the dried gelatin particles are suspended in a cross-linking agent aqueous solution containing 0.1% Tween 80 and allowed to undergo a cross-linking reaction while gently stirring, and depending on the cross-linking agent used, a 100 mM glycine aqueous solution containing 0.1% Tween 80 or 0.1% Gelatin hydrogel particles can be prepared by washing with 0.004N HC1 or the like containing% Tween 80 and stopping the crosslinking reaction.
  • the average particle size of the gelatin hydrogel particles obtained by this method is the same as in the above method.
  • the gelatin hydrogel particles of the present invention can be used after lyophilization and sterilization. Freeze-drying is performed, for example, by putting gelatin hydrogel particles in distilled water, freezing them in liquid nitrogen for 30 minutes or more, or at -80 ° C for 1 hour or more, and then drying them in a freeze dryer for 1 to 3 days. be able to.
  • the particle cell aggregate of the present invention can be formed by culturing cells in a normal medium for cell culture together with hydrogel particles such as gelatin hydrogel particles prepared as described above. As the cells used in the present invention, any cells can be used as long as they are ordinary cultured cells, and may be established cells or primary cultured cells.
  • stem cells such as bone marrow undifferentiated mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, hemangioblasts, neural stem cells, small intestinal stem cells, adipose stem cells, skin stem cells, periodontal tissue stem cells, Tissue stem cells such as ciliary stem cells, limbal stem cells and visceral stem cells, and pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • stem cells such as bone marrow undifferentiated mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, hemangioblasts, neural stem cells, small intestinal stem cells, adipose stem cells, skin stem cells, periodontal tissue stem cells, Tissue stem cells such as ciliary stem cells, limbal stem cells and visceral stem cells, and pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • the culture conditions such as the composition of the medium and the culture temperature, the conditions usually used for culturing the cells can be used.
  • the culture dish coated with polyvinyl alcohol or the like, low protein adsorption, or low cell it is preferable to culture using a substrate having adhesion properties.
  • the ratio between the number of particles and the number of cells varies depending on the diameter of the particles and the nature of the cells. In general, the number of particles / number of cells is not limited to the following, but for example, 0.1 to 30, preferably 0.3 to 10, more preferably 0.5 to 5.
  • the particle cell aggregate according to the present invention can be cultured for 7 to 40 days or more by culturing while appropriately changing the medium.
  • the particle cell aggregate of the present invention not only the aggregate surface but also cells existing inside can survive and proliferate.
  • the particle cell aggregate can be grown to a size of 50 ⁇ m to 3000 ⁇ m in diameter, and in some cases can be grown to a size of about 5000 ⁇ m. Although it depends on the type of cell and the culture method, formation of a 1500 ⁇ m diameter aggregate can be achieved by culturing for 28 days. This is thought to be because the presence of particles in the cell aggregate increases the diffusion of substances inside and outside the aggregate, improving the nutrition, oxygen supply and waste excretion to the cells.
  • the mixing mode of cell aggregates and particles varies depending on the size of the particles. For particles of 100 ⁇ m or larger, the cells first grow on the particle surface.
  • cell aggregates are formed between the particles.
  • particle size is 5 to 20 ⁇ m, cell aggregates containing particles are formed from the beginning of the culture.
  • the cells can be cultured with the particles after incorporating the cell growth factor into the hydrogel particles such as gelatin hydrogel particles obtained as described above.
  • any protein may be used as long as it has an action of promoting cell proliferation and differentiation.
  • basic fibroblast growth factor bFGF
  • acidic fibroblast growth factor aFGF
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ 1 transforming growth factor ⁇ 1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • CTGF connective tissue growth factor
  • hydrogel particles such as gelatin hydrogel particles containing cell growth factors, cell proliferation and differentiation can be promoted.
  • drugs containing low molecular weight drugs, peptide drugs, nucleic acid drugs, etc. that promote cell proliferation and differentiation, increase metabolic activity, or suppress apoptosis are used in the particles. You can also EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • a Teflon (registered trademark) stirring propeller was attached to a fixed stirring motor (manufactured by Shinto Kagaku Co., Ltd., Three One Motor) and fixed together with a 1000 ml round bottom flask. 375 ml of olive oil was added to the flask, and 10 ml of an alkali-treated gelatin aqueous solution (concentration: about 10%) having an isoelectric point of 4.9 was added dropwise while stirring at 37 ° C. and 420 rpm to prepare a W / O emulsion. After stirring for 10 minutes, the flask was cooled to 4 ° C. and stirred for 30 minutes.
  • the crosslinked gelatin hydrogel particles were collected by centrifugation and washed with a 100 mM aqueous glycine solution at 37 ° C. for 1 hour to stop the crosslinking reaction. After the reaction was stopped, the crosslinked gelatin hydrogel particles were washed three times with distilled water and then freeze-dried to obtain dried crosslinked gelatin hydrogel particles (average diameter 10 ⁇ m). When the particles were swollen with water, the water content was about 91.5%.
  • Bone marrow-derived undifferentiated mesenchymal stem cells (MSC) were isolated from rat bone marrow by a conventional method, and cultured to proliferate.
  • MSC and gelatin hydrogel particles were mixed at various ratios and cultured at 37 ° C. for 14 days.
  • Cell culture was performed using a culture solution containing 10 vol% of calf serum in Dulbecco's MEM medium, and the medium was changed every 3 days.
  • an aqueous solution of 1% polyvinyl alcohol manufactured by Unitika Ltd., polymerization degree 1.800, saponification degree 88.0% was poured into a culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes.
  • a culture petri dish washed twice with a phosphate buffer solution (PBS, pH 7.4) and coated with polyvinyl alcohol was used.
  • PBS phosphate buffer solution
  • MSC did not adhere to the petri dish surface, and adhesion on the mixed particles or cells was promoted. As a result, an MSC aggregate containing particles uniformly was formed. As a control, in the absence of particles, formation of cell aggregates without particles was seen. The number of viable cells was quantified using WST-8 reagent, and the ratio to the number of seeded cells was calculated. MSC aggregates containing particles had significantly higher viable cell counts and cell proliferation than cell aggregates without particles (FIG. 1). In the absence of particles, cell aggregates were initially formed, but the aggregate size increased with time, and the cells were thought to have died due to insufficient supply of nutrients and enzymes and poor waste excretion. .
  • the cell aggregates were similarly prepared by changing the ratio of MSC to the number of particles.
  • the number of particles / cell was 0.3 or more, the number of living cells increased with the culture time (FIG. 2). That is, as the particle / cell ratio increased, cell viability increased. This result is thought to be due to the fact that the presence of particles in the cell aggregates increases the diffusion of substances inside and outside the aggregates, improving the nutrition, oxygen supply and waste excretion to the cells.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, an MSC aggregate containing particles was prepared with a particle number / cell number ratio of 0.5, and incorporation of BrdU into this aggregate was examined. BrdU was added to the medium on the 6th day of cell culture, and the cell aggregates were collected on the 7th day to prepare frozen sections. The largest area section through the center of the assembly was immunostained with anti-BrdU antibody. The stained site is where BrdU is highly incorporated into the nucleus, indicating that the cells are proliferating. As a result, it was found that BrdU was taken up into cells on the surface of the aggregate and inside, and the cells existing inside were proliferating (FIG. 3).
  • MSC aggregates containing particles were formed under the same conditions as in Example 3. Next, it was treated with cartilage differentiation medium (high glucose DMEM medium containing 1 wt% transferrin and insulin, 1 mM pyruvate, 100 mM ascorbate-2-phosphate, 100 nM dexamethasone, 10 ng / ml transforming growth factor (TGF) ⁇ 1, Cartilage differentiation was induced by culturing in 1% FCS). As a control, an MSC aggregate containing no particles was used. Cartilage differentiation was evaluated from the amount of sulfated glycosaminoglycan (sGAG) secreted. The measurement of sGAG was performed as follows.
  • TGF- ⁇ 1 aqueous solution was added dropwise to the dried gelatin hydrogel particles produced in Example 1 and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour to impregnate the gelatin hydrogel particles.
  • the amount of impregnated TGF- ⁇ 1 in gelatin hydrogel particles mixed with cells and cultured is 1 ng.
  • MSC aggregates were formed, cartilage differentiation was induced in the same manner as in Example 4, and cartilage differentiation was examined by sGAG secretion.
  • sGAG secretion As a result, when TGF- ⁇ 1 impregnated particles were included, cartilage differentiation was observed, and sGAG secretion increased significantly. This secretion amount was higher than that of the particle-containing cell aggregate of Example 4.
  • Gelatin hydrogel particles were prepared in the same manner as in Example 1. However, thermal dehydration crosslinking (140 ° C., 48 hours, 0.1 Torr condition) was used for particle production. The particle size when swollen with water is 17.6 ⁇ m ⁇ 7.4 ⁇ m (particle size when dried is 10 ⁇ m).
  • the cells were cultured in the same manner as in Example 1 with an MSC number of 1 ⁇ 10 4 cells / well and a particle number of 1 ⁇ 10 4 cells / well, and observation was performed after 7 days of culture. A frozen section of a cell aggregate containing particles was prepared, and cell nuclei were stained (TO-PRO-3 fluorescent dye for cell nucleus staining, manufactured by Invitrogen).
  • FIG. 5 shows a nuclear staining image of a cross section of the cell aggregate: (A) Confocal fluorescence microscope image (red staining; cell nucleus), (B) optical microscope, (C) superposition). As a result, it was found that even inside the assembly, living cells and cells and particles were uniformly mixed.
  • gelatin hydrogel particles were prepared in the same manner as in Example 1, except that the number of stirring during the preparation of the particles was changed to 200, 300, and 450 rpm. After washing and drying with acetone and 2-propanol, each dry particle was sieved to obtain three types of uncrosslinked particles having an average particle size of 10 ⁇ m, 26 ⁇ m, and 44 ⁇ m at the time of drying. This was subjected to thermal dehydration crosslinking at 140 ° C. for 48 hours under a reduced pressure of 0.1 Torr to crosslink gelatin to prepare gelatin hydrogel particles.
  • FIG. 6 shows particles having a particle size of 106 ⁇ m, the number of seeded cells is 1 ⁇ 10 3 cells / well, the number of added particles is 1 ⁇ 10 2 cells / well, 1 ⁇ 10 3 cells / well, or 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • FIG. 7 shows the number of viable cells when the size of the particles used is changed, the number of seeded cells is 1 ⁇ 10 3 cells / well, and the number of added particles is 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • Glucose consumption was selected as an indicator of the cell state associated with the culture, and the glucose consumption of the cells was quantified using Glutest Neo Super (manufactured by ARKRAY, Inc.).
  • the number of cells was 1 ⁇ 10 4 cells / well and the number of particles was 1 ⁇ 10 4 cells / well, and the particle sizes used were 17.6, 47.9, and 106.8 ⁇ m (particle size 10 and 26 when dried) , And 44 ⁇ m).
  • the result is shown in FIG. In either case, it can be seen that glucose is consumed together with the culture, and the cells are growing.
  • the glucose consumption of the cell aggregates containing particles was significantly higher than that of the cell aggregates containing no particles.
  • the particle size is 106 ⁇ m, the consumption is the highest, which is significantly higher than that in flat culture, indicating that the cell growth state is good.
  • L-lactic acid production / glucose consumption ratio was calculated as an index of cellular energy metabolism. If this index is low, it indicates that energy metabolism is progressing aerobically in the cell, which means that the oxygen state of the cell is good.
  • L-lactic acid production was quantified using an E-kit (R-Biopharm AG). The number of cells was 1 ⁇ 10 3 cells / well, the number of particles was 1 ⁇ 10 4 cells / well, and the particle sizes used were 17.6, 47.9, and 106.8 ⁇ m (sizes 10 and 26 when dried) , And 44 ⁇ m). The result is shown in FIG.
  • the ratio of L-lactic acid production / glucose consumption of the cell aggregate containing the particles was significantly lower than that of the cell aggregate containing no particles. Furthermore, this value was at the same level as in flat culture. This indicates that the inclusion of particles improves the oxygen state inside the cell assembly, resulting in increased aerobic energy metabolism in the cell. The value was the same level as that of planar culture that is considered to be superior to the three-dimensional cell aggregate in oxygen and nutrient state.
  • the diameter of the cell aggregate containing particles having a size of 106 ⁇ m was 500 ⁇ m (after 4 days in culture) and 600 ⁇ m (after 7 days in culture).

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Abstract

　本発明は、水溶性合成高分子、多糖およびタンパク質からなる群から選択される一または複数の水溶性合成高分子に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲル粒子と細胞から構成される粒子含有細胞集合体およびその製造方法に関する。

Description

粒子含有細胞集合体
　本発明は、細胞の生存率と生物機能の向上のために粒子を含む細胞集合体ならびにその培養方法に関する。
　幹細胞生物医学研究の進歩によって、細胞の分化、その生物機能発現に関する基礎的知見が集積されてきている。加えて、種々の生体組織から成体（組織）幹細胞が採取され、また、胚性幹（ＥＳ）細胞、ｉＰＳ細胞とともに、それらの細胞の研究、創薬および治療への応用が可能となってきている。これらの流れは幹細胞の増殖、分化やその生物機能の生物医学的な解明を進めるだけではなく、人為的に細胞の分化、生物機能を制御することによって、細胞組織化を実現したり、ヒト細胞の利用による創薬研究および細胞の移植治療効果の向上に対しても、大きく関与している。
　一般に、体内においては、細胞は単独で存在していることはほとんどなく、細胞同士あるいは細胞外マトリクスと相互作用することによって生存し、その生物機能を発揮していることがわかっている。そのため、細胞の自己集合化あるいは組織化が人為的に可能となれば、細胞の機能に関する生物医学研究は発展し、細胞移植による治療効果も高まるであろう。体の最小単位は細胞であるが生物機能の単位は生体組織や臓器を見れば分かるが、細胞の集合体である（藤田尚男，藤田恒夫／著，標準組織学　各論，医学書院，１９９２）。これまでにも、肝細胞を自己集合化させて、細胞集合体（スフェロイド）を形成させることにより、細胞—細胞相互作用のない単独の肝細胞に比較して、肝機能が有意に高まることが報告されている（Ｌａｎｄｒｙ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９８５）。細胞単独の培養に比べて、集合化細胞の培養によって、細胞からのフィブロネクチン産生が有意に高められること（Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＰＭＩＳ，１９８８）、また、ＥＳ細胞も、その集合体である胚様体（ＥＢ）形成により分化が進むこともわかっている（Ｓｍｉｔｈ　ＡＧ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８）。このような背景から、細胞の自己集合化は、細胞生物学および細胞移植の観点から重要な技術である。
　これまでに、培養基材（Ｍｏｒｉ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ，１０６（３），２３７−２４２，２００８）や培養方法（Ｋｕｒｏｓａｗａ　Ｈ，Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ，１０４（４），２９４−２９９，２００７）の工夫によって、細胞の自己集合化を促すことが知られており、予想通り、集合化による細胞の増殖、分化、生物機能発現が高まっている。しかしながら、細胞が増殖するにつれて細胞集合体のサイズが大きくなり、その結果、細胞集合体内部への栄養、酸素の供給と集合体内部からの老廃物の除去が不十分となり、培養の継続が不可能となることが問題となっていた。このため、細胞の相互作用に基づく細胞機能発現、分化、組織化などの検討に必要不可欠な長期間の培養ができず、幹細胞の生物医学研究の進展の妨げとなっていた。加えて、細胞に遺伝子操作を行い、それをマイクロキャリア粒子上で培養することで、生理活性タンパク質などの有用産物の産生を促すマイクロキャリア培養が進められている。しかしながら、マイクロキャリア培養法では、細胞はマイクロキャリア表面でのみ増殖することができるため、増殖できる細胞数に限界がある。これにより有用物質の産生効率が低いことが問題となっている。そこで近年、この問題を解決する１つの方法として細胞集合体を用いた培養法が検討されている。この方法は、マイクロキャリア法に比較して、細胞数を高めることができ、大切な有用物質の産生能も高まっている（Ｎａｍ　Ｊ．Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｐｒｏｇ．２３（３）．６５２−６６０．２００７）。しかしながら、この場合も細胞集合体サイズの増大とともに集合体内部の細胞が弱り、有用物質の産生能が低下することが問題となっていた。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞の集合化技術、次に、この技術を２種類の細胞に応用して細胞の組織化を促す技術は、現在の発生学、細胞生物学が目指す１つの将来の方向性である。細胞集合化はその１つの鍵となる技術である。このような背景から、細胞の集合体サイズが増加しても、培養を続けるための工夫や方法論の開発が望まれていた。
Ｍｏｒｉ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ，１０６（３），２３７−２４２，２００８ Ｋｕｒｏｓａｗａ　Ｈ，Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ，１０４（４），２９４−２９９，２００７ Ｎａｍ　Ｊ．Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｐｒｏｇ．２３（３）．６５２−６６０．２００７
　本発明の目的は、長期間安定して培養を継続することができる細胞の集合体を作成する方法、ならびにそのための材料を提供することである。
　本発明者は、この問題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生体吸収性粒子とともに細胞を培養すると、粒子を含む細胞集合体が得られることを見いだした。本発明にしたがって作製した粒子含有細胞集合体では、細胞集合体内部と外部との物質拡散、交換が容易になり、このことにより、集合化細胞の長期培養が可能となり、細胞機能の向上と分化促進ができる。この技術により、細胞集合体を用いた細胞の生物医学研究や、薬の代謝や毒性を細胞で調べる創薬研究が進展する。また、細胞集合体を用いた有用物質の産生能を向上させることが期待できる。また肝、膵、腎細胞などの機能を持つ細胞を免疫隔離の目的でハイドロゲルでカプセル化して用いるハイブリッド人工臓器に対しても、この粒子を利用した細胞集合体技術を適用することができる。この場合にはカプセル化することが内部の細胞への栄養、酵素の拡散供給を制限し、また老廃物の拡散除去が悪くなり、細胞の環境を悪化させる。この問題を解決するために、それらの細胞と粒子とからなる細胞集合体を作り、その細胞機能を高めることが有効である。これにより治療効果の向上が可能となる。
　すなわち、本発明は、培養細胞とゼラチンハイドロゲル粒子から構成される粒子含有細胞集合体を提供する。本発明の１つの好ましい態様においては、ゼラチンハイドロゲル粒子は細胞増殖因子を含む。本発明はまた、細胞をゼラチンハイドロゲル粒子を含む培養液中で培養することを特徴とする、粒子含有細胞集合体の製造方法を提供する。
　粒子を含んだ細胞集合体では、粒子の存在によって細胞集合体内部への栄養、酸素の供給と細胞集合体内部からの老廃物の除去の効率が高まり、細胞状態がよくなる。その結果として、細胞—細胞間の相互作用が効率よく、体内の状態に近い様式で行われ、細胞の長期培養が達成できると考えられる。長期培養により細胞の分化、機能発現がより高められ研究の展開が大いに期待される。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−２６０１９２号、２０１０−０５０３９９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、細胞を単独で、またはゼラチンハイドロゲル粒子とともに培養したときの生細胞数を示す。
　図２は、細胞数と粒子数との比を変化させて細胞集合体を形成させたときの粒子含有集合体中の生細胞数を示す。
　図３は、粒子含有細胞集合体へのＢｒｄＵの取り込みを示す。ＢｒｄＵの免疫染色（左）；ヘマトキシリンによる同一切片の対比染色（右）。
　図４は、粒子含有細胞集合体および粒子を含んでいない細胞集合体の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の産生を示す。■：粒子を含んだ細胞集合体；□：粒子を含んでいない細胞集合体。
　図５は、粒子を含む細胞集合体の断面の核染色画像を示す。
　図６は、播種細胞数／添加粒子数の比率を変化させて培養したときの細胞集合体中の生細胞数を示す。★，ｐ＜０．０５；微粒子を含まない凝集体に対して有意差あり。＃，ｐ＜０．０５；添加微粒子数１×１０２の凝集体に対して有意差あり。＊，ｐ＜０．０５；添加微粒子数１×１０３の凝集体に対して有意差あり。
　図７は、粒子サイズを変化させて培養したときの細胞集合体中の生細胞数を示す。★，ｐ＜０．０５；微粒子を含まない凝集体に対して有意差あり。†，ｐ＜０．０５；膨潤粒子径１７．６７±７．４μｍの凝集体に対して有意差あり。‡，ｐ＜０．０５；膨潤粒子径４７．９±２２．２μｍの凝集体に対して有意差あり。
　図８は、粒子を含む細胞集合体のグルコース消費量を示す。★，ｐ＜０．０５；微粒子を含まない凝集体に対して有意差あり。†，ｐ＜０．０５；膨潤粒子径１７．６７±７．４μｍの凝集体に対して有意差あり。‡，ｐ＜０．０５；膨潤粒子径４７．９±２２．２μｍの凝集体に対して有意差あり。
　図９は、粒子を含む細胞集合体のＬ−乳酸生産量／グルコース消費量比を示す。★，ｐ＜０．０５；微粒子を含まない凝集体に対して有意差あり。
　本発明で使用されるゼラチンハイドロゲル粒子は、種々の化学的架橋剤を用いてゼラチン分子間に化学架橋を形成させて得られる微粒子状ゼラチンハイドロゲルである。ゼラチンは、動物や植物から採取したコラーゲンを、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体であるゼラチンを用いてもよい。
　ハイドロゲル粒子の架橋度およびサイズに関係なく、ハイドロゲル内には水を大量に含んでいるため、水溶性の栄養物、酵素、老廃物などが容易に拡散移動する。本発明に利用できる粒子は、上記のハイドロゲルの性質をもつものであれば、いずれの材料からなる粒子でも利用することができる。例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルアルコールなどの水溶性合成高分子、多糖、タンパク質などを化学架橋したハイドロゲルからなる粒子である。多糖としては、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、セルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。また、タンパク質としては、コラーゲンおよびその加水分解物であるゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、細胞により分解される材料からなる粒子が本発明には適しており、さらに好ましくはゼラチンからなる粒子である。さらに細胞の培養や増殖を高めるために粒子表面にコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカンなどの細胞接着性タンパク質およびペプチドなどをコーティングあるいは固定化したものを用いることもできる。
　化学的架橋剤としては、ＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、プロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理、紫外線照射、電子線照射などによっても化学架橋することができる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。
　ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１~２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１~１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０~４０℃、１~４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、ゼラチンハイドロゲルの生体吸収性は低くなる。あるいは、減圧下で高温で熱脱水架橋してもよい。熱脱水架橋は、例えば０．１Ｔｏｒｒ程度の減圧下で、８０~１６０℃、好ましくは１２０~１４０℃で１~４８時間で行うことができる。
　ゼラチンハイドロゲル粒子は、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ　ｍｉｎｉＤ．Ｃ．スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００~６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加してゼラチン分子間に架橋を形成することにより作製することができる。あるいは、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ　ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ　ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させてもよい。このようにして得られるゼラチンハイドロゲル粒子を遠心分離により回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄した後、細胞培養に用いる。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
　得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には、粒径は５００ｎｍ~１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。なお、本明細書において、「粒径」を「粒子サイズ」と記載する場合がある。「粒径」と「粒子サイズ」は相互互換的に使用される。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが５０ｎｍ−２０μｍ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲル粒子を得ることができる。さらに、ゼラチンを水溶液状態から相分離を起こさせ、自己集合させることにより、５０ｎｍ−１μｍのサイズの粒子を得ることもできる。相分離は、第２成分の添加、水溶液のｐＨ、イオン強度などの変化など、公知の技術によって達成される。本発明において好ましい粒子サイズは、約５０ｎｍ−１０００μｍであり、特に約５００ｎｍ−１０００μｍであり、より好ましくは約１μｍ−２００μｍであり、さらに好ましくは約１０μｍ~１６０μｍである。
　ゼラチンハイドロゲル粒子を調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００~６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この段階で、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けてもよい。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ　ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
　本発明のゼラチンハイドロゲル粒子は、凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲル粒子を蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１~３日間乾燥させることにより行うことができる。
　本発明の粒子細胞集合体は、細胞を上述のようにして作製したゼラチンハイドロゲル粒子などのハイドロゲル粒子とともに、通常の細胞培養用の培地で培養することにより、形成することができる。本発明において用いられる細胞としては、通常の培養細胞であれば、いずれの細胞も用いることができ、株化された細胞であっても、初代培養細胞であってもよい。本発明の方法にしたがって培養しうる細胞の特に好ましい例は、幹細胞、例えば、骨髄未分化間葉幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞、歯周組織幹細胞、毛様体幹細胞、角膜輪部幹細胞、内臓幹細胞等の組織幹細胞や、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞である。培地の組成物や培養温度等の培養条件は、通常その細胞の培養に用いられている条件を用いることができる。なお、本発明にしたがって粒子細胞集合体を培養する場合には、細胞が培養シャーレの表面に接着して増殖することを防ぐために、ポリビニルアルコール等でコーティングした培養シャーレあるいは低タンパク質吸着あるいは細胞の低付着の性質を持つ基材を用いて培養することが好ましい。粒子数と細胞数との比率は、粒子の直径や細胞の性質によっても異なるが、一般に粒子数／細胞数が、以下に限定されないが、例えば、０．１から３０、好ましくは０．３から１０、より好ましくは０．５から５である。
　本発明にしたがう粒子細胞集合体は、培地を適宜交換しながら培養することにより、７日間から４０日間またはそれ以上培養することができる。下記の実施例に示されるように、本発明の粒子細胞集合体においては、集合体表面のみならず内部に存在する細胞も生存・増殖することができる。粒子細胞集合体は、直径５０μｍから３０００μｍのサイズに増殖させることができ、場合により、５０００μｍ程度の大きさまで成長させることが可能である。細胞の種類と培養方法によっても異なるが、２８日間の培養で１５００μｍ直径の集合体の形成が達成できる。これは、粒子が細胞集合体中に存在することによって、集合体内外の物質拡散が高まり、細胞への栄養、酸素の供給と老廃物排泄がよくなるためであると考えられる。
　粒子のサイズにより細胞集合体と粒子との混合様式が異なる。１００μｍ以上の粒子では、まず、細胞は粒子表面で増殖する。培養を続けると粒子の間に細胞集合体が形成される。２０−１００μｍサイズの粒子では粒子間に細胞集合体が初期に形成され、時間とともに細胞集合体が粒子を取り込んでいくという現象が見られる。粒子サイズが５−２０μｍであれば、培養初期から粒子を含む細胞集合体が形成される。このようにいずれの粒子サイズも細胞集合体は形成されるが、その過程が異なるため細胞集合体の最終使用目的によって用いる粒子サイズを使い分けていくことができる。
　本発明の１つの好ましい態様においては、上述のようにして得られたゼラチンハイドロゲル粒子などのハイドロゲル粒子に細胞増殖因子を取り込ませた後に、細胞をこの粒子とともに培養することができる。細胞増殖因子としては，細胞の増殖や分化を促す作用を有するタンパク質であればいずれのものを用いてもよく，例えば，塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ），酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ），血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ），トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１），血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、あるいはアポトーシスを抑制する性質を持つタンパク質および上記の性質をもつペプチド等を挙げることができる。細胞増殖因子を含むゼラチンハイドロゲル粒子などのハイドロゲル粒子を用いることにより、細胞の増殖や分化を促進することができる。細胞増殖因子以外にも、細胞の増殖、分化を促す、あるいは代謝活性を高める、アポトーシスを抑制するなどの作用をもつ薬物（低分子量薬物、ペプチド薬物、核酸薬物など）を粒子に含ませ、使用することもできる。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　固定した攪拌用モーター（新東科学社製、スリーワンモーター）にテフロン（登録商標）製攪拌用プロペラを取り付け、１０００ｍｌ丸底フラスコと一緒に固定した。フラスコにオリブ油３７５ｍｌを加え、３７℃、４２０ｒｐｍにて攪拌しながら等電点４．９のアルカリ処理ゼラチン水溶液（濃度約１０％）１０ｍｌを滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを調整した。１０分間攪拌後、フラスコを４℃に冷却し、３０分間攪拌した。冷却後、ここに１００ｍｌのアセトンを加え１時間攪拌した後、遠心分離によりゼラチンハイドロゲル粒子を回収した。回収したハイドロゲル粒子をアセトンにて洗浄し、さらに２−プロパノールにて洗浄することにより、未架橋のゼラチンハイドロゲル粒子を得た。このハイドロゲル粒子を乾燥させ、４℃で保存した。
　乾燥した未架橋ゼラチンハイドロゲル粒子５００ｍｇを０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むグルタルアルデヒド（０．０５％）水溶液１００ｍｌに懸濁させ、４℃、２４時間緩やかに攪拌することにより、ゼラチンの架橋反応を行った。反応終了後、架橋ゼラチンハイドロゲル粒子を遠心分離により回収し、１００ｍＭグリシン水溶液にて３７℃、１時間洗浄することにより架橋反応を停止した。反応停止後、架橋ゼラチンハイドロゲル粒子を蒸留水で３回洗浄した後に凍結乾燥を行い、乾燥架橋ゼラチンハイドロゲル粒子（平均直径１０μｍ）を得た。この粒子を水で膨潤させると、含水率は約９１．５％であった。
　ラット骨髄より、常法により骨髄由来未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、培養して増殖させた。次にＭＳＣとゼラチンハイドロゲル粒子を種々の比率で混合し、３７℃で１４日間培養した。ダルベッコＭＥＭ培地に子牛血清を１０ｖｏｌ％含んだ培養液を用いて細胞培養を行い、３日ごとに培地交換した。この時、細胞接着性を下げる目的で、１％ポリビニルアルコール（ユニチカ（株）社製、重合度１．８００，ケン化度８８．０％）水溶液を培養シャーレに流し込み、３７℃で１５分放置、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄してポリビニルアルコールコーティングした培養シャーレを用いた。この培養シャーレを用いることにより、ＭＳＣはシャーレ表面には接着せず、混合した粒子上あるいは細胞同士の接着が促進された。
　その結果、粒子が均一に含まれたＭＳＣ集合体が形成された。対照として、粒子のない場合には、粒子を含まない細胞集合体の形成が見られた。生細胞数をＷＳＴ−８試薬を用いて定量し、播種細胞数に対する比を算出した。粒子を含んだＭＳＣ集合体は、粒子の入っていない細胞集合体に比べて生細胞数が有意に高く、細胞増殖が促進された（図１）。粒子が入っていない場合には、初期に細胞集合体が形成されたが、時間とともに集合体サイズが大きくなり、栄養と酵素の供給不足や老廃物の排泄の悪さから細胞が死滅したと考えられる。
　ＭＳＣと粒子数との比を変化させて、同様に細胞集合体の作製を行った。その結果、粒子数／細胞数が０．３以上において、生細胞数が培養時間とともに高くなった（図２）。すなわち、粒子／細胞比が大きくなるとともに、細胞生存率が増加した。この結果は、粒子が細胞集合体中に存在することによって、集合体内外の物質拡散が高まり、細胞への栄養、酸素の供給と老廃物排泄がよくなったことが理由であると考えられる。
　実施例２と同様にして、粒子数／細胞数比を０．５として粒子を含むＭＳＣ集合体を作製し、この集合体へのＢｒｄＵの取り込みを調べた。細胞培養６日目にＢｒｄＵを培地に添加し、７日目に細胞集合体を回収、凍結切片を作製した。集合体の中心を通る最大面積切片を抗ＢｒｄＵ抗体を用いて免疫染色した。染色されている部位はＢｒｄＵの核への取り込みが高いところであり、細胞が増殖していることを示している。その結果、集合体表面および内部の細胞へのＢｒｄＵの取り込みが認められ、内部に存在している細胞も増殖していることがわかった（図３）。これに対し、粒子を含まないＭＳＣ集合体を用いて同じ条件で培養して、細胞集合体を形成させ、ＢｒｕＵの取り込みを調べたところ、集合体表面近傍の細胞では取り込みが認められたが、内部細胞では取り込みは全く見られず、内部細胞は死滅していることがわかった。
　実施例３と同じ条件で、粒子を含むＭＳＣ集合体を形成させた。次に、それを軟骨分化培地（１ｗｔ％トランスフェリンとインスリン、１ｍＭピルビン酸、１００ｍＭアスコルビン酸—２−リン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｎｇ／ｍｌのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）β１を含む高グルコースＤＭＥＭ培地、１％ＦＣＳ含有）中で培養をすることにより、軟骨分化を誘導した。コントロールとして、粒子を含まないＭＳＣ集合体を用いた。軟骨分化を硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の分泌量から評価した。ｓＧＡＧの測定は以下のように行った。細胞を３００μｇ／ｍｌ濃度のパパイン溶液（２ｍＭジチオトレオールと１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ６．５リン酸水溶液）中で溶解させる。この細胞溶解液（２５μＬ）に１，９−ジメチルメチレンブルー（２２５μＬ）を加え、５２５ｎｍの吸光度を測定する。コンドロイチン硫酸を用いて検量線を作成、それによりｓＧＡＧを定量する。その結果、粒子を含むＭＳＣ集合体においてｓＧＡＧの分泌が２８日間にわたって検出された。一方、粒子を含まない集合体では、ｓＧＡＧ分泌は全く認められなかった。これらの結果は、粒子を含む細胞集合体では軟骨分化が効率よく起こったことを示している（図４）。これは集合体の内部においても、物質が拡散し、細胞の生存状態を良好に保ったためと考えられる。
　実施例１で製造したゼラチンハイドロゲル粒子の乾燥物に、ＴＧＦ−β１水溶液を滴下し、２５℃、１時間放置することによりゼラチンハイドロゲル粒子内に含浸させた。細胞と混合して培養するゼラチンハイドロゲル粒子への含浸ＴＧＦ−β１量は１ｎｇである。この粒子を用いて、ＭＳＣ集合体を形成し、実施例４と同様にして軟骨分化を誘導し、ｓＧＡＧ分泌により軟骨分化を調べた。その結果、ＴＧＦ−β１含浸粒子を含む場合には軟骨分化が認められ、ｓＧＡＧ分泌量は有意に増加した。この分泌量は実施例４の粒子含有細胞集合体よりも高い値を示した。コントロールとして、粒子なし細胞集合体の培養液に同量（１ｎｇ）のＴＧＦ−β１を加えた実験を行ったが、この場合には軟骨分化は見られなかった。
　ＴＧＦ−β１含浸粒子を含むＭＳＣ集合体の軟骨分化培養後、細胞集合体をアルシアンブルーで染色した。その結果、集合体内部に均一にアルシアンブルー染色される軟骨基質の存在が確認された。一方、粒子を含まない集合体では細胞は死滅していた。これらの結果は、粒子の存在により細胞集合体の内部と外部との間の物質の拡散性が高まり、細胞の状態がよくなるとともに、粒子からのＴＧＦ−β１の局所供給によって軟骨分化がさらに促進されたことを示している。
　実施例１と同様にゼラチンハイドロゲル粒子を作製した。ただし、粒子作製に熱脱水架橋（１４０℃、４８時間、０．１Ｔｏｒｒ条件）を用いた。水膨潤時の粒子サイズは１７．６μｍ±７．４μｍ（乾燥時粒子サイズ１０μｍ）である。ＭＳＣ数を１×１０４細胞／ウエル、粒子数を１×１０４個／ウエルとして、実施例１と同様にして培養し、培養７日後に観察を行った。粒子を含む細胞集合体の凍結切片を作製し、細胞核を染色した（細胞核染色用ＴＯ−ＰＲＯ−３　蛍光色素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）。その後、切片を共焦点蛍光顕微鏡と光学顕微鏡にて観察した。図５に細胞集合体の断面の核染色画像を示す：（Ａ）共焦点蛍光顕微鏡画像（赤染；細胞核）、（Ｂ）光学顕微鏡、（Ｃ）重ね合わせ）。その結果、集合体内部においても、生きた細胞れ、また細胞と粒子が均一に混合されていることがわかった。
　架橋方法以外は実施例１と同様の方法でゼラチンハイドロゲル粒子を作製したが、ただし、粒子作製時の攪拌数を２００、３００、および４５０ｒｐｍと変化させた。アセトン、２−プロパノールで洗浄、乾燥させた後、それぞれの乾燥粒子をふるいで分け、乾燥時平均粒子径が１０μｍ、２６μｍ、および４４μｍの３種類の未架橋粒子を得た。これを１４０℃、４８時間、０．１Ｔｏｒｒの減圧下で熱脱水架橋を行うことでゼラチンを架橋し、ゼラチンハイドロゲル粒子を調製した。得られた粒子を蒸留水で膨潤させた時の粒子径は１７．６±７．４μｍ、４７．９±２２．２μｍ、および１０６．８±１７．８μｍであり、含水率は９２．０％であった。
　この３種類のサイズの異なるゼラチンハイドロゲル粒子を用いて、実施例１と同様にＭＳＣとともに培養、粒子を含むＭＳＣ集合体を作製した。図６は粒子サイズ１０６μｍの粒子を用いて、播種細胞数を１×１０３細胞／ウエル、添加粒子数を１×１０２個／ウエル、１×１０３個／ウエルまたは１×１０４個／ウエルとして培養したときの生細胞数を示す。コントロールとして粒子を含んでいない集合体（粒子なし）、通常培養基材を用いた２次元平面培養（平面培養）を用いた。その結果、粒子を含まない細胞集合体では細胞は増殖せず、死んでいくことがわかった。これに比べて、粒子を含んだ細胞集合体では細胞の増殖が見られ、ＭＳＣ／粒子比を選ぶことによって、平面培養よりもよく増殖することがわかった。
　図７は用いる粒子サイズを変化させ、播種細胞数を１×１０３細胞／ウエル、添加粒子数を１×１０４個／ウエルとして培養したときの生細胞数を示す。コントロールとして粒子を含んでいない集合体（粒子なし）、通常培養基材を用いた２次元平面培養（平面培養）を用いた。その結果、粒子サイズに関係なく、いずれの場合にも、粒子を含まない細胞集合体に比べて、細胞の増殖は有意に増大していた。また、粒子サイズが１０６μｍ（乾燥時サイズ４４μｍ）の時には、平面培養に比べて、有意に高い細胞増殖が見られた。
　実施例７と同様の方法で培養実験を行った。培養にともなう細胞状態の指標としてグルコース消費量を選び、グルテストＮｅｏスーパー（アークレイ（株）製）を用いて、細胞のグルコース消費量を定量した。細胞数は１×１０４個／ウエルで粒子数は１×１０４個／ウエルであり、用いた粒子サイズは１７．６、４７．９、および１０６．８μｍ（乾燥時の粒子サイズ１０、２６、および４４μｍ）である。
　その結果を図８に示す。いずれの場合にも、培養とともにグルコースが消費され、細胞が成長していることがわかる。用いた粒子のサイズに関係なく、粒子を含まない細胞集合体に比べて、粒子を含む細胞集合体のグルコース消費量は有意に高い値を示した。また、粒子サイズが１０６μｍの時に、最も高い消費量であり、それは平面培養に比べて、有意に高く、細胞の成長状態がよいことを示している。
　実施例７と同様の方法で培養実験を行った。細胞のエネルギー代謝の指標として、Ｌ−乳酸生産量／グルコース消費量比を算出した。この指標が低ければ、細胞で好気的にエネルギー代謝が進んでいることを示し、細胞の酸素状態がよいことを意味する。Ｌ−乳酸産生はＥ−キット（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ　ＡＧ社製）を用いて定量した。細胞数は１×１０３個／ウエルであり、粒子数は１×１０４個／ウエルであり、用いた粒子サイズは１７．６、４７．９、および１０６．８μｍ（乾燥時サイズ１０、２６、および４４μｍ）である。
　その結果を図９に示す。用いた粒子のサイズに関係なく、粒子を含む細胞集合体のＬ−乳酸産生量／グルコース消費量の比が、粒子を含まない細胞集合体に比べて有意に低下していた。さらに、この値は平面培養と同じレベルであった。このことは、粒子を含むことで細胞集合体内部の酸素状態がよくなり、その結果、細胞の好気的エネルギー代謝が高まったことを示している。その値は、酸素、栄養状態において、３次元の細胞集合体よりも優れていると考えられる平面培養と同じレベルであった。１０６μｍサイズの粒子を含む細胞集合体の直径は、５００μｍ（培養４日後）、６００μｍ（培養７日後）であった。通常、酸素が拡散により供給される距離は１００μｍであるため、細胞集合体サイズが１００μｍより大きくなると細胞集合体内部は酸素欠乏状態となり、細胞が死滅することが知られている。しかしながら、粒子を含ませて細胞集合体を形成させることによって、集合体内部に栄養、酸素を効率よく供給できる環境を作ることができ、５００および６００μｍという大きなサイズをもつ細胞集合体内部においても、細胞は死滅せず、好気的代謝が進行することが可能となった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (15)

  1. 　水溶性合成高分子、多糖およびタンパク質からなる群から選択される一または複数の水溶性合成高分子に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲル粒子と細胞から構成される粒子含有細胞集合体。
  2. 　水溶性合成高分子が、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリレートおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される、請求項１記載の粒子含有細胞集合体。
  3. 　多糖が、グリコサミノグリカン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチンおよびセルロースからなる群から選択される、請求項１または２記載の粒子含有細胞集合体。
  4. 　タンパク質が、コラーゲンおよびその加水分解物であるゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、オステオポンチン、ならびにフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項１~３のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  5. 　ゼラチンが分子間化学架橋を形成させて得られるゼラチンハイドロゲル粒子と細胞から構成される、請求項１~４のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  6. 　前記ハイドロゲル粒子表面に細胞接着性タンパク質または細胞接着性ペプチドがコーティングまたは固定化されている、請求項１~５のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  7. 　前記細胞接着性タンパク質および細胞接着性ペプチドが、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよびグリコサミノグリカンからなる群から選択される、請求項６記載の粒子含有細胞集合体。
  8. 　前記ハイドロゲル粒子の粒径が、５０ｎｍ−１０００μｍである、請求項１~７のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  9. 　前記ハイドロゲル粒子の粒径が、１００μｍ以上、２０−１００μｍ、または５−２０μｍのいずれかである、請求項８記載の粒子含有細胞集合体。
  10. 　前記細胞１個に対して前記ハイドロゲル粒子が０．１−３０個である、請求項１~９のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  11. 　前記ハイドロゲル粒子０．１ｍｇに対して細胞数が３００から３０００個の割合である、請求項１~９のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  12. 　前記ハイドロゲル粒子が、細胞増殖因子を含む、請求項１~１１のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  13. 　前記ハイドロゲル粒子がゼラチンから成る場合、ゼラチンおよび架橋剤の濃度範囲が、ゼラチン濃度１~２０ｗ／ｗ％および架橋剤濃度０．０１~１ｗ／ｗ％である、請求項１~１２のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  14. 　細胞が幹細胞である、請求項１~１３のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体。
  15. 　前記ハイドロゲル粒子を含む培養液中で、細胞を培養する、請求項１~１４のいずれか１項記載の粒子含有細胞集合体の製造方法。
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