CN104212758A - 一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种构建不同遗传性状嵌合的多细胞结构的方法。将需要嵌合的具有不同遗传背景的细胞群落进行免疫荧光的染色，观察确定这些细胞是否具有细胞间连接；将有细胞间连接的细胞混合后加入培养液置于低蛋白吸附的离心管内，室温下放置10-20分钟，使细胞在重力作用下沉淀到离心管底部，再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构；没有细胞间连接的细胞操作如下：分别用连接NHS的互补核酸单链标记所要连接的不同遗传背景的细胞，混合标记后的细胞，置于容器中生长形成有功能的三维结构。本发明可缩短操作时间，而且方法更为简单，提高了效率，嵌合效果好。

Description

一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为细胞培养，尤其是构建不同遗传性状嵌合的多细胞结构的方法。

背景技术

生物学上的嵌合，是指遗传学上有不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。遗传嵌合体是研究基因功能十分有效的工具。在同一环境中、同一个体内、同一器官的不同部位由不同遗传背景的细胞构成，从而可以对比得到差异基因在该器官的作用。

体外的多细胞结构不同于单细胞的培养，多个细胞可以在体外合适的生长环境中，相互作用形成有功能的结构单位，部分模拟其来源组织在体内行使的功能。

创建遗传性状嵌合的多细胞结构，需要实现：不同遗传性状的细胞彼此相互紧密接触；促使细胞彼此相互紧密接触的因子在短时间被自然降解从而使之后各细胞间的相互作用是主动的；细胞形成有序的多细胞结构并行使一定的生物学功能。

此外，遗传性状嵌合的多细胞结构与遗传性状纯和的多细胞结构的发育过程及生物学功能不应该存在显著差异。

使用传统的手段，为研究目的而创建遗传嵌合体，需要对生物个体进行较多而且复杂的基因操作，耗时长，效率低。

发明内容

本发明旨在提供一种体外的多细胞结构的构建方法，能使多细胞在体外形成有功能的三维结构，而其中的各细胞拥有不同的遗传背景。

这种构建遗传性状嵌合多细胞结构的方法包括以下步骤：

（1）将需要嵌合的具有不同遗传背景的细胞群落进行免疫荧光的染色，观察确定这些细胞是否拥有显著的细胞间连接（cell junctions），如果有，进行步骤（2）的a或b的操作；如果没有，进行步骤（2）的b操作。此处“显著”的定义是针对免疫荧光染色的强度。比如说，对于MDCK细胞，选取E-Cadherin的作为标记；通过对二维分散单独培养的细胞和二维密集培养的细胞进行免疫荧光的染色及成像，可以看到密集培养的细胞间有明显的荧光信号的富集，据此确认MDCK细胞间有显著的粘着连接（adherens junctions），可以采用a或b的操作。

（2）培养细胞构建，采用以下a或b的操作：

a.将所需不同遗传背景的细胞分别悬浮后，按比例混合，加入培养液置于低蛋白吸附的离心管内，室温下放置10-20分钟，使细胞在重力作用下沉淀到离心管底部，再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构；或者，

b.用核酸标记细胞的方法促进细胞连接：

1）制备序列互补的核酸单链，并用N-羟基琥珀酰亚胺标记正义和反义的核酸单链，得到NHS-DNA分子；

2）用其中的正义链NHS-DNA分子标记一种所需连接的细胞，用反义链标记另一种细胞；

3）将标记后的两种不同遗传背景的细胞及培养液混合，并放置5-10分钟；

4）再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构

优选的，上述不同遗传背景的细胞包括：基于同一基础细胞通过基因工程手段实现遗传差异的细胞（例如：以MDCK细胞为基础细胞，通过反转录病毒实现不同外源基因的导入），和/或来源不同的细胞。

步骤（1）中，免疫荧光染色后，根据荧光，检测细胞间粘着连接的强度，作为选择构建操作的指标。荧光染色为通用实验手段,例如，基础细胞为MDCK细胞时，对细胞群落进行免疫荧光的染色并检测E-Cadherin蛋白，观察细胞之间有无明显的粘着连接。

步骤（2）的1）中，所述的核酸单链长度为20～30个碱基，单链无二级结构，GC含量在45%～55%左右。

步骤（2）的4）中，用细胞分选仪筛选混合后连接形成的细胞多聚体再进行培养，所述的细胞多聚体具有2-4个细胞。

本发明的优点在于，可通过先确定不同遗传性状的细胞有无细胞间连接，来采用不同的细胞连接方法。对于存在细胞间连接的细胞，可以简单利用重力的的作用，使细胞之间相互连接，从而构建三维多细胞结构。这样缩短操作时间，而且方法更为简单，提高了效率，嵌合效果好。

附图说明

图1为实施例1中，表达绿色和红色荧光蛋白的MDCK细胞简单混合后的图片。

图2为实施例2中，表达定位于细胞核的绿色荧光蛋白的MDCK细胞与普通MDCK细胞构成的三维多细胞结构。

图3为实施例2中，表达定位于微丝的绿色荧光蛋白的MDCK细胞与普通MDCK细胞构成的三维多细胞结构。

图4为实施例3中，用DNA标记的方法，连接表达了绿色和红色荧光蛋白的细胞，通过细胞分选仪筛选后马上获得的多细胞结构。

图5为实施例3中，表达绿色和红色荧光蛋白的细胞多聚体嵌合体生长96小时后的状态，原先的2-4个细胞的聚合体已经通过细胞分裂，形成了约10-20个细胞；且这些多细胞结构开始定向分泌，形成中空的腔；左上的图A为明场成像图，左下的图C为红色荧光的照片，右图的图B为绿色荧光的照片。

具体实施方式

实施例1

以MDCK细胞株为基础细胞，两种不同的细胞中分别表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

将上述表达绿色和红色荧光蛋白的两种细胞按10：1的比例简单混合，培养96小时后的结果如图1所示，图A为检测绿色荧光蛋白的照片，图B为检测红色荧光蛋白的照片，图C照片展示二维平面内所有细胞生长的状态。两种细胞简单混合并未产生三维多细胞结构。本实施例为对照例。

实施例2

以MDCK细胞株为基础细胞，在MDCK细胞中表达绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白的表达位置分别定位于微丝和细胞核。在预实验中，对用多聚甲醛固定的生长于二维平面普通的MDCK细胞株以及表达绿色荧光蛋白的MDCK细胞群落（二维分散单独培养的细胞和二维密集培养的细胞）进行免疫荧光的染色并检测E-Cadherin蛋白，可以观察到，密集培养的细胞间有明显的荧光信号的富集，据此可以确认上述普通的MDCK细胞之间以及表达绿色荧光蛋白的MDCK细胞之间均有明显的粘着连接。

将表达绿色荧光蛋白的MDCK细胞和普通MDCK细胞分别悬浮后，按1：1或1：2的比例混合。取9000个混合的细胞和250微升培养液，放在低蛋白吸附的小离心管内，室温（15～30℃）下静置10分钟。由于重力的作用，细胞逐渐沉到底部。由于细胞表面的蛋白无法和离心管发生作用，而细胞间容易形成连接，因此细胞选择彼此相互连接。

随后使用宽口的移液管将细胞和培养液放入细胞培养皿进行培养，使其生长，最终形成有功能的三维结构。

细胞培养液为通用配方的MEM。表达绿色和红色的荧光蛋白由Clontech公司的pMSCV系列质粒包装反转录病毒导入MDCK细胞。

结果如图2和图3所示。

图2为表达定位于细胞核的绿色荧光蛋白的MDCK细胞与普通MDCK细胞构成的三维多细胞结构纵剖面图，可以看到这种三维多细胞结构具有中空的腔，由定向分泌而形成，显示该多细胞结构有定向分泌的功能。其中图A体现嵌合体的程度，一类细胞表达了细胞核定位的绿色荧光蛋白，另一类则没有任何荧光；图B显示三维多细胞结构。

图3为表达定位于微丝的绿色荧光蛋白的MDCK细胞与普通MDCK细胞构成的三维多细胞结构纵剖面图，可以看到这种三维多细胞结构具有中空的腔，由定向分泌而形成，显示该多细胞结构有定向分泌的功能。图A体现嵌合体的程度，部分细胞表达了定位于微丝的绿色荧光蛋白，剩余的则没有任何荧光；图B显示三维多细胞结构。荧光表达量的不一样是由于荧光融合蛋白整合到基因组位置不同而导致表达量的差异。此外，微丝的极性化分布，也反映了体外的多细胞结构有与体内类似的结构。

实施例3

以MDCK细胞株为基础细胞，两种不同的细胞中分别表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

将上述细胞群落及普通的MDCK细胞株进行免疫荧光的染色，检测E-Cadherin蛋白，对于有明显细胞间连接的MDCK细胞，可以用实施例2的方法促进细胞连接，也可以采用以下核酸标记细胞的方法。

如果没有检测到E-Cadherin蛋白，这些MDCK细胞之间没有明显的细胞间连接，采用以下核酸标记细胞的方法来促进细胞的连接：

（1）制备可标记细胞的序列互补的核酸单链，分别制备互补的正义链和反义链，其长度为20～30个碱基，，单链无二级结构，GC含量在50%，核苷酸单链自身不发生聚合。

使用NHS（N-hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺)标记正义和反义的核酸单链，形成NHS-DANA分子。

生物学上常用NHS将化学物质修饰到蛋白质。因为细胞表面有很多的跨膜蛋白，因此通过有NHS标记的核酸可以在NHS与蛋白质反应后连到细胞的表面。

（2）将正义链和反义链的NHS-DNA分子分别与两种需要连接的细胞连接，得到NHS-DNA标记细胞，并将标记后的细胞悬浮在pH=7.2～7.5的磷酸缓冲液中。从两种需要连接的NHS-DNA标记细胞中取样，用荧光标记的核酸，如FAM-DNA对上述细胞表面核酸标记的程度进行定量。以确保两类细胞表面核酸标记的程度类似。

将两种表面带有NHS-DNA分子标记的细胞分散在细胞培养液中，按需要的细胞数量比例混合（如1：1），在其表面发生核酸双链的相互作用，即使没有显著细胞间连接的细胞也将连到一起。混合后放置10分钟，DNA分子的聚合就已经将细胞连接到一起。

（3）使用宽口的移液管将细胞和培养液放入细胞培养皿，使其生长，最终形成有功能的三维结构。环境中存在大量的核酸酶，标记的核酸链在培养环境中，30-60分钟内会被降解，从而避免了过多干扰细胞间的相互作用。

通过上述方法，可以得到表达绿色荧光蛋白MDCK细胞与普通MDCK细胞嵌合体的三维多细胞结构、表达红色荧光蛋白MDCK细胞与普通MDCK细胞嵌合体的三维多细胞结构，以及表达红色荧光蛋白MDCK细胞与表达绿色荧光蛋白MDCK细胞嵌合体的三维多细胞结构。

所得到的三维多细胞结构具有中空的腔，由定向分泌而形成。

DNA分子与NHS连接、以及NHS-DNA分子与细胞连接按照现有常规的实验方法操作。

实施例4

以MDCK细胞株为基础细胞，两种不同的细胞中分别表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。采用实施例2或3的方法将上述两种细胞连接到一起。

为了满足某些实验精确嵌合的需要，可以利用两类细胞带有的不同的荧光，使用细胞分选仪，采用大口的喷射口，仅仅采集同时拥有两种荧光的多细胞聚合体（或是采用实施例2中的方法，细胞随重力下沉中自然相连的，或是采用实施例3的方法，细胞之间由核酸辅助相连的），而后在细胞培养皿、培养瓶或12孔板中生长。所选用的细胞分选仪为BD Biosciences FACSAria2cell sorter。

图4为通过DNA标记，将表达绿色和红色荧光蛋白的细胞连接在一起，并通过细胞分选仪得到的细胞多聚体荧光照片，绝大部分的细胞多聚体（2-4个细胞）同时具有两种荧光，是嵌合体。细胞分选仪筛选中的加电喷射步骤会导致少部分的细胞多聚体损失若干细胞，而表现为一种荧光的缺失；因此建议在操作中选择尽可能低的流速，避免过快的喷射。图A为细胞多聚体的绿色荧光照片，图B为细胞多聚体的红色荧光照片。本实施例中，使用BD Biosciences FACSAria2cell sorter时的流速为1000个细胞/分钟（最低流速），用其他型号细胞分选仪时，可采用仪器最低的流速。

上述细胞多聚体生长96小时后的多细胞结构状态如图5所示。可以看到DNA标记并没有影响细胞的生长发育。原先的2-4个细胞的聚合体已经通过细胞分裂，形成了约10-20个细胞；且这些多细胞结构开始定向分泌，形成中空的腔。图A为明场成像图片，图B为多细胞结构的绿色荧光照片，图C为细胞多聚体的红色荧光照片。

Claims (6)

1.一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将需要嵌合的具有不同遗传背景的细胞群落进行免疫荧光的染色，确定这些细胞是否具有细胞间连接；对于有细胞间连接的细胞进行步骤（2）的a或b的操作；对于没有细胞间连接的细胞进行步骤（2）的b操作；

（2）培养细胞构建，采用以下a或b的操作：

a.将所需不同遗传背景的细胞分别悬浮后，按比例混合，加入培养液置于低蛋白吸附的离心管内，室温下放置10-20分钟，使细胞在重力作用下沉淀到离心管底部，再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构；

或者，

b.用核酸标记细胞的方法促进细胞连接：

1）制备序列互补的核酸单链，并用N-羟基琥珀酰亚胺标记正义和反义的核酸单链，得到NHS-DNA分子；

2）用其中的正义链NHS-DNA分子标记一种所需连接的细胞，用反义链标记另一种细胞；

3）将标记后的两种不同遗传背景的细胞及培养液混合，并放置5-10分钟；

4）再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构。

2.权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，所述不同遗传背景的细胞，包括：基于同一基础细胞通过基因工程手段实现遗传差异的细胞，或来源不同的细胞。

3.权利要求2所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，所述的基础细胞为MDCK细胞。

4.权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，步骤（1）中，对由多聚甲醛固定的生长于二维平面的细胞样品，使用免疫荧光染色，根据荧光，检测观察细胞间粘着连接。

5.权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，步骤（2）的1）中，所述的核酸单链长度为20～30个碱基，单链无二级结构，GC含量在45%～55%。

6.权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，步骤（2）的4）中，用细胞分选仪筛选混合后连接形成的细胞多聚体再进行培养，所述的细胞多聚体具有2-4个细胞。